JP2022542745A - 樹状細胞ベースの癌ワクチン及びその調製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
樹状細胞(DC)は、血液や骨髄、または脾臓、リンパ節、扁桃腺、腸のパイエル板や骨髄などの二次リンパ器官から当技術分野で知られている方法で分離または生成することができる。好ましい実施形態では、樹状細胞は、最終的に分化した樹状細胞である。ある実施形態では、樹状細胞はヒト血液単球から分化する。特定の実施形態において、樹状細胞は、本発明の融合細胞が投与される対象に対して自己由来である。代替の実施形態では、樹状細胞は、本発明の融合細胞が投与される対象に対して同種異系である。
本発明の線維芽細胞は、前癌細胞を区別する少なくとも1つの対立遺伝子を有する任意の線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、線維芽細胞、マクロファージ、および癌患者からの脂肪細胞などの様々な供給源から単離できるが、これらに限定されない。線維芽細胞はまた、融合細胞を調製するために使用される樹状細胞の供給源に応じて、患者の自己由来、同種移植または同種由来である初代細胞培養からのものであってもよい。
線維芽細胞は、腫瘍細胞または抗原提示細胞を有する前癌細胞、またはパラフィン包埋腫瘍組織から抽出されたゲノムDNAを含んでいた。ゲノムDNAは、技術者に知られている任意な方法により、異なる供給源から得ることができる。ゲノムDNAは、技術者に知られている任意な方法により、非樹状細胞にトランスフェクトまたはマイクロインジェクションできる。
本開示はまた、樹状細胞と皮膚組織からの線維芽細胞との融合細胞を含む。融合細胞は腫瘍細胞のゲノムDNAを含み、腫瘍細胞のゲノムDNAは少なくとも癌に1つ特異的な抗原をコードする。
本発明は、樹状細胞および皮膚組織からの線維芽細胞を融合した融合細胞を含む組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明の組成物は、細胞傷害性T細胞(CTL)応答および/または体液性応答を刺激或いは誘導できるサイトカインまたは他の分子をさらに含む。好ましい実施形態では、CTL刺激分子は、IL-4、IL-12、IL-15、またはIL-18である。
本発明の融合細胞を使用し予防および治療できる癌腫と発癌性疾患、ならびにそれらの癌腫と発癌性疾患の発症につながる前癌性病変には、以下が含まれる。ただしこれらに限定されない:ヒト肉腫および癌腫、例えば、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫癌、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄質癌、気管支原性癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫。白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病(骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病)、慢性白血病(慢性骨髄性(顆粒球性)白血病および慢性リンパ性白血病)、真性赤血球増加症、リンパ腫(ホジキン病と非ホジキン病)、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖疾患。
本開示も、開示された融合細胞を含む医薬組成物に向けられる。
本発明の組成物製剤は、投与される融合細胞の有効な免疫量を含む。本発明の医薬組成物の融合細胞は、樹状細胞や普遍的な抗原提示細胞などの抗原提示細胞と、皮膚組織からの細胞を融合することによって形成できる。ここで、皮膚組織からの細胞は、癌細胞、前癌病変の細胞、またはパラフィン包埋腫瘍組織から抽出されたゲノムDNAか、cDNAまたはcDNAライブラリーは癌細胞、前癌病変の細胞、またはパラフィン包埋腫瘍組織に由来する物を含む。特定の実施形態において、本発明の融合細胞は、治療または予防される癌に1つ以上の特異的な抗原を発現する。
(1)組換え細胞を調製する方法が以下のステップを含む:
(a)哺乳動物の結合組織から線維芽細胞を提供する。
(b)哺乳動物の腫瘍組織から癌細胞のゲノムDNAを抽出する。ここで、ゲノムDNAは、少なくとも癌に1つ特異的な抗原をコード、哺乳動物の腫瘍組織は新たに単離される物ではない。加えて
(c)癌細胞のゲノムDNAを線維芽細胞に形質転換する。
(2)(1)に記載した方法により、ここでの哺乳動物がヒトである。
(3)(1)に記載した方法により、ここでの結合組織が皮膚組織である。
(4)(1)に記載した方法により、ここでの哺乳動物からの腫瘍組織が新たに単離される物ではない。
(5)(1)に記載した方法により、ここでの哺乳動物由来の腫瘍組織がパラフィンブロックに埋め込まれている。
(6)(3)に記載した方法により、ここでの皮膚組織が皮膚生検輸送および洗浄溶液に
よって維持と洗浄される。
(7)(1)に記載した方法により、ここでの線維芽細胞が皮膚生検培養培地中で維持と
培養され、皮膚生検培養培地が哺乳動物からの血漿を含む。
(8)樹状細胞および組換え細胞を融合する方法は、哺乳動物由来の樹状細胞の集団
および(1)の組換え細胞の集団に細胞融合を促進する条件を含む。
(9)(8)に記載した方法により、ここでの樹状細胞および組換え細胞が哺乳動物に
対して自己由来である。
(10)(8)に記載した方法により、ここでの細胞融合が電気融合によって達成される。
(11)組換え細胞は癌細胞のゲノムDNAを含み、癌細胞のゲノムDNAは少なくとも癌に1つ特異的な抗原をコード、ゲノムDNAはパラフィンブロックに埋め込まれた腫瘍組織から単離される。ここで組換え細胞は、哺乳動物の皮膚組織からの線維芽細胞であり、癌細胞および線維芽細胞は、哺乳動物に対して自己由来である。
(12)(11)に記載した組換え細胞は、組換え細胞が(1)の方法によって調製される。
(13)融合細胞は融合によって得られる:
(a)樹状細胞 と
(b)(1)または(11)に記載した組換え細胞
ここで、樹状細胞および組換え細胞は哺乳動物に対して自己由来であり、融合細胞は少なくとも癌に1つ特異的な抗原を含み、融合細胞はCD83, CD1α, CD40, CD86, CD54, CD80またはMHC class IIを含む。
(14)(13)に記載した融合細胞は、(10)に記載の方法によって調製される。
(15)医薬組成物は(13)に記載した融合細胞および有効量のアジュバントまたは
担体を含む。
(16)(15)に記載した医薬組成物は、さらに、体液免疫応答、細胞傷害性T細胞応答、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される免疫応答を刺激する分子を含む。(17)(16)に記載した医薬組成物には、その分子がサイトカインである。
皮膚生検輸送と洗浄培地及び皮膚生検培養培地の調製
「皮膚生検輸送と洗浄培地」および「皮膚生検培養培地」の両方が調製される。皮膚生検培養培地はパーソナライズされる。
線維芽細胞は皮膚組織から得られた。皮膚組織は、融合細胞の調製に使用される樹状細胞の供給源に応じて、患者にとって自家、同系、または同種異系であり得る。皮膚組織は、皮膚生検輸送および洗浄培地によって維持および洗浄された。皮膚組織はホモジナイザーによって均質化された。線維芽細胞は、皮膚生検培養培地で維持および培養された。線維芽細胞は、Miltenyi biotec(注文番号:130-101-540)のWhole Skin Dissociation Kit(ヒト)を使用して分散させる。
(a)皮膚組織を取得する。
(b)皮膚生検輸送および洗浄培地で皮膚組織を維持および洗浄する。
(c)ホモジナイザーによって皮膚組織を均質化し、線維芽細胞を取得する。
(d)皮膚生検培養培地で線維芽細胞を培養する。
(e)皮膚生検培養培地で線維芽細胞を継代培養する。
(f)線維芽細胞を採取または凍結する。
1.線維芽細胞酵素分散法
(1)酵素分散専用容器(Cチューブ)で酵素液を調製する。
(2)1mLの組織洗浄液を25mLのチューブに分注する。クリニックから受け取った皮膚生検を洗う。
(3)皮膚生検をCチューブに移し、蓋をしっかりと閉める。37℃、5%CO2インキュベーターでの酵素反応処理(3時間から一晩)(3時間反応の場合、皮膚生検を4つに分ける)。
(1)14.5mLの培地を15mLのチューブに注ぐ。
(2)酵素分散容器(Cチューブ)をインキュベーターの15mLチューブから取り出す。
500μLの培地を加え、蓋をしっかりと閉める。
(3)CチューブをgentleMACS(自動組織破壊クラッシャー)に設定、プログラムを開始する。
(4)プログラム終了後、2mLの培地を加える。70μmメッシュフィルターで15mLチューブに収集する。
(5)もう一度2mLの培地を加え、遠心分離(フラッシュ)する。70μmメッシュフィルターで15mLチューブに収集する。
(6)十分に攪拌した後、30μLの細胞溶液を採取、計算用1.5mLチューブと混合する。血球計算盤にロードする。
(7)位相差顕微鏡で細胞数を数える。
(8)遠心分離(1200rpm、5分)。
(9)上清を吸引した後、10mLの培地に懸濁、T25フラスコに移す。
(10)37℃、5%CO2インキュベーターで培養する。
培地、PBS、トリプシンEDTAを室温に戻す。
(1)培養上清10mLをT225cm2フラスコに移す。
(2)5mL PBSを加えて除去、2mLトリプシンEDTAを加え、室温で1分間処理してから、除去する。
(3)30mLの培地をT225cm2フラスコにピペットで入れる。
(4)フラスコをはじいて剥がし、5mLの培地を加えます。一部を15mLチューブに入れる。
(5)染色せずに、オートセルカウンターで細胞数を数える。
(6)細胞溶液全体をT225cm2フラスコに移す。
(7)37℃、5%CO2インキュベーターでインキュベートする。
(1)培養上清を吸引する。
(2)15mLのPBSを加えてから取り除き、次に5mLのトリプシンEDTAを加えた。 室温で1分間保持する。
(3)3フラスコを裏返して剥がし、11mLの培地を加える。50mLチューブに移す。
(4)1mLを検体保存チューブに移し、-20℃で保存する。
(5)染色せずに、オートセルカウンターで細胞数を数える。
(6)凍結保存細胞濃度1x106 cell/mL。
(7)遠心分離(1200rpm、5分)。
(8)必要な数の血清チューブを準備、バーコードラベルを貼り付け、細胞数を入力する。
(9)上清を吸引した後、1mLの凍結細胞保存液で懸濁、溶液を計算する。必要な量まで一時停止する。
(10)血清チューブに注ぎ、バイセルに入れます。
(11)-80℃の冷凍庫で凍結します。
パラフィンブロックに埋め込まれた腫瘍組織は、腫瘍サンプルとして医療機関から入手された。腫瘍サンプルはヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色され、腫瘍組織の抗原性を確認するために医師によって決定された。パラフィンブロックはキシレンで脱ロウされた。腫瘍組織をフェノールとエタノールで処理、腫瘍組織のゲノムDNAを抽出および沈殿させた。ゲノムDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して増幅、-20℃で保存した。
(a)パラフィンブロックに埋め込まれた腫瘍組織を取得
(b)パラフィンブロックをヘマトキシリン・エオシン(H&E)で染色、腫瘍組織の抗原性を確認
(c)キシレンによるパラフィンブロックの脱ロウ
(d)フェノールとエタノールによる腫瘍組織のゲノムDNAの抽出と沈殿
(e)ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用してゲノムDNAを増幅
(f)ゲノムDNAを-20℃で保存
皮膚組織は、癌患者から得られた。皮膚組織を皮膚生検輸送と洗浄培地で洗浄、超音波処理を使用して破壊して皮膚線維芽細胞を得た。皮膚線維芽細胞を皮膚生検培養培地で数時間継代培養した。線維芽細胞は、リポフェクションによってパラフィンブロックに埋め込まれた腫瘍組織から得られたゲノムDNAで形質転換された。形質転換された線維芽細胞をトランスフェクション培地で培養、マイトマイシンで処理して癌細胞の増殖を阻害した。
(2)凍結した細胞を37℃で速やかに溶解、細胞溶液を15mLチューブに移す。
(3)染色されていない状態で、自動セルカウンターで細胞数を数える。
(4)遠心分離(1200rpm、5分、RT)。
(5)上清を捨て、0.1x106細胞/mLと計算された培地量で懸濁する。
(6)6ウェルプレートに各2mLを接種する。(0.2x106細胞/2mL/ウェル)
(7)37℃、5%CO2インキュベーターでインキュベートする。
(2)7.5μLのリポフェクタミン3000を1.5mLチューブ(L1)にピペットで入れる。
(3)4.0μLのP3000試薬を1.5mLチューブ(T1)に注ぐ。
(4)2μgのDNAを1.5 mLチューブ(T1)に加える。
(5)総量1.5mLチューブ(L1)を1.5mLチューブ(T1)に加える。10分間放置する。
(6)細胞板に異常がないかを観察する。
(7)培養上清を捨て、2mLの10%FBS-optiMEMを加える。
(8)静置後、各抗原である線維芽細胞に全量1.5mLチューブ(T1)を加える。
(2)培養上清を取り除き、1mLの10%FBS-RPMIを加える。
(3)マイトマイシン200μL(500μg/mL)(処理濃度100μg/mL)を加える。
(4)37℃、5%CO2インキュベーターで少なくとも10時間に処理する。
(2)細胞板に異常がないかを観察する。
(3)培養上清を回収、1mLのPBSで洗浄した後に細胞を回収する。1mLの0.05%トリプシンEDTAを追加、37℃で5分間放置する。
(4)細胞を剥がし、15mLチューブに回収する。
(5)遠心分離(1200rpm、5分、RT)。
(6)上清を捨て、2mLのPBSで懸濁する。
(7)位相差顕微鏡で視覚的にカウント(トリパン2倍希釈)した後に、細胞数を計算する。
(8)遠心分離(1200rpm、5分、RT)。
(9)上清を捨て、1000μLの凍結細胞保存液に懸濁、クライオチューブに加える。分注してバイセルに入れ、-80℃で凍結する。
-線維芽細胞の播種
-トランスフェクション
-トランスフェクションサンプルの収集と冷凍(-80℃)
-RNA抽出
-マイクロアレイ発現解析
-分析業者:タカラバイオ株式会社
-名前:Agilent Expression Array Analysis
-ラベリング方法:単色法
-CHIPタイプ:対象人種
-アレイ名:SurePrint G3 Human GE v38x60K Microarray
-デザインID:72363
Claims (17)
- 以下のステップを含む組換え細胞を調製する方法であって、
(a)哺乳動物の結合組織から線維芽細胞を提供することと、
(b)哺乳動物の腫瘍組織から癌細胞のゲノムDNAを抽出、ここで、ゲノムDNAは、少なくとも癌に1つ特異的な抗原をコード、哺乳動物の腫瘍組織は新たに単離される物ではないこと、かつ、
(c)癌細胞のゲノムDNAを線維芽細胞に形質転換することを特徴とする組換え細胞を調製する方法。 - 前記哺乳動物がヒトである、請求項1に記載の方法。
- 結合組織が皮膚組織である、請求項1に記載の方法。
- 前記哺乳動物からの腫瘍組織が新たに単離される物ではない、請求項1に記載の方法。
- 前記哺乳動物からの腫瘍組織がパラフィンブロックに埋め込まれている、請求項1に記載の方法。
- 前記皮膚組織が皮膚生検輸送および洗浄培地によって維持および洗浄される、請求項3に記載の方法。
- 前記線維芽細胞が皮膚生検培養培地中で維持および培養され、皮膚生検培養培地が哺乳動物からの血漿を含む請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物由来の樹状細胞の集団、および、請求項1の組換え細胞の集団に細胞融合を促進する条件を含む、樹状細胞および組換え細胞を融合する方法。
- 前記樹状細胞および組換え細胞が哺乳動物に対して自己由来である、請求項8に記載の方法。
- 前記細胞融合が電気融合によって達成される、請求項8に記載の方法。
- 組換え細胞は癌細胞のゲノムDNAを含み、癌細胞のゲノムDNAは少なくとも癌に1つ特異的な抗原をコード、ゲノムDNAはパラフィンブロックに埋め込まれた腫瘍組織から単離され、前記組換え細胞は、哺乳動物の皮膚組織からの線維芽細胞であり、癌細胞および線維芽細胞は、哺乳動物に対して自己由来である、組換え細胞。
- 前記組換え細胞が請求項1に記載の方法によって調製される、請求項11に記載の組換え細胞。
- 融合により得られる融合細胞、
(a)樹状細胞と
(b)請求項1または請求項11に記載された組換え細胞と、
ここで、前記樹状細胞および組換え細胞は哺乳動物に対して自己由来であり、前記融合細胞は少なくとも癌に1つ特異的な抗原を含み、CD83、CD1α、CD40、CD86、CD54、CD80、またはMHC class IIを含む、融合細胞。 - 前記融合細胞が請求項10に記載の方法によって調製される、請求項13に記載の融合細胞。
- 請求項13に記載した融合細胞および有効量のアジュバントまたは担体を含む医薬組成物。
- さらに、体液免疫応答、細胞傷害性T細胞応答、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される免疫応答を刺激する分子を含む、請求項15に記載の医薬組成物。
- 前記分子がサイトカインである、請求項16に記載の医薬組成物。
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