JP2022541761A - タンパク質二量体化の三分子システム及び使用方法 - Google Patents

タンパク質二量体化の三分子システム及び使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、複合体を形成するように小分子に結合することができる標的タンパク質と、この複合体に特異的に結合する結合メンバーとを利用する組成物及び方法を提供するものであり、標的タンパク質は非ヒトタンパク質に由来し、小分子は非ヒトタンパク質の阻害剤である。非ヒトタンパク質は、ウイルス、細菌、真菌又は原生動物タンパク質に由来するものであってよい。これらの組成物及び方法によって、標的タンパク質及び結合メンバーにそれぞれ個々に融合されたポリペプチドの相互作用を制御することが可能となり、これを使用して、スプリット転写因子及びスプリットキメラ抗原受容体などの二量体誘導タンパク質の活性を、小分子を添加することによって制御することができる。本開示は、これらの構成成分に関わる発現ベクター、結合メンバー、二量体誘導タンパク質、核酸、細胞、ウイルス粒子、キット、システム、及び方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容及び要素が全ての目的のために参照によって本明細書に組み込まれる、２０１９年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８７４，０２５号明細書からの優先権を主張する。
本開示は、標的タンパク質及び結合メンバーが融合されたポリペプチドの、制御された相互作用を可能にする組成物及び方法に関する。組成物及び方法は、小分子に結合して複合体を形成する標的タンパク質と、この複合体に特異的に結合する結合メンバーとを利用するものであり、標的タンパク質は非ヒトタンパク質に由来し、小分子は非ヒトタンパク質の阻害剤である。非ヒトタンパク質は、細菌、ウイルス、真菌又は原生動物タンパク質に由来するものであってよい。非ヒトタンパク質はウイルスプロテアーゼに由来するものであってよく、小分子はウイルスプロテアーゼ阻害剤である。本開示は更に、標的タンパク質及び結合メンバーを含む、スプリット転写因子及びスプリットキメラ抗原受容体などの二量体誘導タンパク質に関する。本明細書に記載される方法及び組成物は、例えば、制御されたタンパク質の発現及び／又はタンパク質の活性化に関与する細胞療法及び遺伝子療法における用途が見出される。
タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）とは、複数の生物学的機能を制御する一般的な調節メカニズムを意味する。例えば、遺伝子転写、タンパク質の折り畳み、タンパク質局在化、タンパク質分解及びシグナル伝達は全て、あるタンパク質から別のタンパク質、又は実際には他のいくつかのタンパク質の相互作用に依存するか、又はこれらが近接することに依存する。タンパク質間相互作用を時間的に制御することにより、研究者は複雑な生物学的メカニズムを分析することができ、ＰＰＩの機能的結果を容易に経過観察することができる。更に、この生物学的機能を制御する能力は、治療活性を制御するために細胞療法及び遺伝子療法において利用され、より安全で、より個別化した療法が可能となる。
タンパク質間相互作用を制御するために一般的に使用される技術は、いわゆる二量体化の化学誘導（ＣＩＤ）であり、これは、ＣＩＤの非存在下では相互作用することのない２つのタンパク質を共に結合し、三分子の三元複合体を形成する小分子を使用するものである（非特許文献１）。最も広く使用されているＣＩＤは、タンパク質ＦＫＢＰ１２（１２ｋＤａのＦＫ５０６結合タンパク質）及びＦＲＢ（ｍＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的タンパク質）由来のドメイン）と共にヘテロ二量体複合体を形成する、ラパマイシン（ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）に由来する免疫抑制剤）及びその類似体である（非特許文献２）。植物ホルモンＳ－（＋）－アブシシン酸（ＡＢＡ）及びジベレリン（ＧＡ３－ＡＭ）などの他の天然に存在するＣＩＤと共に、ラパマイシンの魅力的な特徴は、その協同的結合メカニズムにあり、これによってタンパク質２がタンパク質１：ＣＩＤ複合体とだけ結合することができる（非特許文献３）。また、同一又は異なるタンパク質（これらのタンパク質が二量体化タンパク質ペアを構成する）を結合する２つの小分子を化学結合させることで、新規のＣＩＤが生成されている（非特許文献４；非特許文献５）。しかしながら、これらのシステムでは、高濃度の二機能性ＣＩＤにおいて１つのタンパク質パートナーとＣＩＤとの間の非生産的な複合体が三分子複合体の生成を上回り、つまり線形用量反応を得ることができない。
従って、複雑な遺伝回路に用いることが可能な、細胞機能を調節し、多くの直交性システムに展開するために用いることができる、協同的に結合する新規のＣＩＤシステムの緊急性が高まっている。その上、長期的にヒトに使用するのに承認されているＣＩＤは、極めて少ない。近年では、抗体に基づくファージディスプレイ選択法を用いて新規のＣＩＤシステム（ＡｂＣＩＤ）を生成する方法が記載されている（非特許文献６）。その研究に使用されたＣＩＤは、ＡＢＴ－７３７、Ｂｃｌ－２及びＢｃｌ－ｘＬ阻害剤であり、ＢＣＬ－ｘＬは、それ自体がタンパク質パートナーの１つとして使用されている。続いて、第２のタンパク質は、Ｂｃｌ－ｘＬ単体に対してＢｃｌ－ｘＬ：ＡＢＴ－７３７複合体に選択的となるように、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）分子のファージディスプレイライブラリーから選択される。
現存する小分子及びそれらの標的を利用することによって複合体に特異的な分子を識別する非特許文献６及び特許文献１に記載されている手法は、魅力的な手法ではあるが、特定のヒトタンパク質（例えば、抗アポトーシスであるＢｃｌ－ｘＬタンパク質）を過剰発現すること、及び体内でヒト標的と結合する小分子を使用することにリスクがないわけではない。例えば、機能性ヒトタンパク質を過剰発現させると、発現する細胞に影響を与えることとなり、このことが細胞の健康及び生存に影響を及ぼす可能性がある。その上、標的が体内で発現している小分子を使用すると、小分子と内在性標的及び過剰発現した標的との結合が競合するため、結果として投与必要量が増加する可能性がある。更に、内在性標的に小分子が結合すると、そのタンパク質の機能に影響を及ぼすことになるが、標的を発現する細胞にとってこの影響が有害となる可能性がある。
国際公開第２０１８／２１３８４８Ａ１号
Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｃｈｏｒｙ，ａｎｄ Ｃｒａｂｔｒｅｅ ２０１８ Ｓａｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ，Ｌｉｕ，ａｎｄ Ｗａｎｄｌｅｓｓ ２００５ Ｂｅｌｓｈａｗ，Ｈｏ，ｅｔ ａｌ．１９９６ Ｂｅｌｓｈａｗ，Ｓｐｅｎｃｅｒ，ｅｔ ａｌ．１９９６ Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．２０１８
Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌに記載されるようなＡｂＣＩＤシステムの限界を克服することを目標とする手法が本明細書に開示される。第１に、本明細書に記載される小分子は、規制当局の承認に対し、よりスムーズな道筋を促すために、ヒトへの使用がすでに承認されているものである。第２に、更に重要なことに、ヒト標的によって小分子を識別するというよりは、むしろ、非ヒトタンパク質、特にウイルスタンパク質に結合する小分子を選択することに関して利点があることが発明者らによって確認された。例えば、ヒト標的を持たない小分子を使用することによって、ヒトに使用する場合の安全性の向上が期待される。また、ウイルス、細菌、真菌、又は原生動物の標的タンパク質を使用することによって、ヒトに使用したときに、小分子が標的タンパク質に結合し、その上ヒトの内在性標的と結合する場合に、内在性小分子が「シンク」するリスクを取り除くことになることが結論づけられた。更に、ヒト細胞内にウイルス、細菌、真菌、又は原生動物タンパク質を発現させることは、内在性機能を有するヒトタンパク質よりも細胞の細胞生理に影響を与える可能性は低いものとなる。
ウイルス性のポリメラーゼ、インテグラーゼ、転写酵素及びプロテアーゼを含む、様々なウイルスタンパク質に結合してこれらを阻害する抗ウイルス剤が承認されている。本発明者は、特にウイルスプロテアーゼに由来する標的タンパク質が、これらのプロテアーゼが細胞質内に位置し、小型で個々のドメインからなるものであるために有益であることを認識した。
従って、本開示は、
ｉ）標的タンパク質をコードする第１の発現カセットであって、標的タンパク質と小分子との間で複合体（Ｔ－ＳＭ複合体）を形成するように、標的タンパク質が小分子に結合することができる、第１の発現カセットと、
ｉｉ）結合メンバーをコードする第２の発現カセットであって、結合メンバーは、標的タンパク質単体及び小分子単体の両方に結合する結合メンバーよりも高い親和性でＴ－ＳＭ複合体に結合する、第２の発現カセットとを含み、
標的タンパク質は非ヒトタンパク質に由来し、小分子は非ヒトタンパク質の阻害剤である、１つ以上の発現ベクターを提供する。一実施形態では、非ヒトタンパク質はウイルスタンパク質に由来し、小分子はウイルスタンパク質の阻害剤である。一実施形態では、非ヒトタンパク質はウイルスプロテアーゼに由来し、小分子はウイルスプロテアーゼ阻害剤である。一実施形態では、非ヒトタンパク質は細菌タンパク質に由来し、小分子は細菌タンパク質の阻害剤である。一実施形態では、非ヒトタンパク質は真菌タンパク質に由来し、小分子は真菌タンパク質の阻害剤である。一実施形態では、非ヒトタンパク質は原生動物タンパク質に由来し、小分子は原生動物タンパク質の阻害剤である。
本明細書に示されるように、結合メンバーがＴ－ＳＭ複合体に結合することにより、結合メンバー、標的タンパク質、及び小分子から構成される三分子複合体が形成され、この三分子複合体の形成は、小分子の存在によって制御することができる。三分子複合体の形成を制御することは、例えば、標的タンパク質及び結合メンバーが融合されたポリペプチドの相互作用を制御することが可能となるため有利である。
本開示はまた、
ｉ）標的タンパク質と小分子との間の複合体（Ｔ－ＳＭ複合体）を形成するように、標的タンパク質が小分子に結合することができる標的タンパク質と、
ｉｉ）結合メンバーが標的タンパク質単体及び小分子単体の両方に結合するよりも高い親和性でＴ－ＳＭ複合体に結合するように、Ｔ－ＳＭ複合体に特異的に結合する結合メンバーとを含み、
標的タンパク質は非ヒトタンパク質に由来し、小分子は非ヒトタンパク質の阻害剤であるシステムを提供する。一実施形態では、非ヒトタンパク質はウイルスタンパク質に由来し、小分子はウイルスタンパク質の阻害剤である。一実施形態では、非ヒトタンパク質はウイルスプロテアーゼに由来し、小分子はウイルスプロテアーゼ阻害剤である。一実施形態では、非ヒトタンパク質は細菌タンパク質に由来し、小分子は細菌タンパク質の阻害剤である。一実施形態では、非ヒトタンパク質は真菌タンパク質に由来し、小分子は真菌タンパク質の阻害剤である。一実施形態では、非ヒトタンパク質は原生動物タンパク質に由来し、小分子は原生動物タンパク質の阻害剤である。
いくつかの実施形態では、ウイルスプロテアーゼはＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ又はＨＩＶプロテアーゼである。これらのプロテアーゼは、一般的にヒトでの忍容性が良好であり、長期間投与に好適であることが公知であるいくつかの承認された小分子によって標的化されることが知られており、従って本明細書で使用するのに好適な標的タンパク質であることを示している。
いくつかの実施形態では、ウイルスプロテアーゼは配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテアーゼなどのＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼである。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼは、細胞質内に発現することができ、限られた数の内在性ヒト標的を有し、従って理想的な標的タンパク質となる、小型で単量体のタンパク質である。
いくつかの実施形態では、小分子は、シメプレビル、アスナプレビル、バニプレビル、ボセプレビル、ナラプレビル、及びテラプレビルからなる群から選択される。これらの小分子は全て、ヒトの治療に承認されているものである。いくつかの実施形態では、小分子は、シメプレビル、ボセプレビル、及びテラプレビルからなる群から選択される。これらの小分子はヒトの治療に承認されており、一般的にヒトでの忍容性が良好である。
いくつかの実施形態では、小分子はシメプレビルである。シメプレビル（Ｏｌｙｓｉｏ（登録商標））は、経口投与される小分子であり、細胞膜透過性で、一日一回の投与を支持する薬物動態（ＰＫ）プロファイルを有する。シメプレビルは、ＨＣＶ感染症を治療するために、リバビリン及びＰＥＧ化インターフェロンと併用して長期間（最大３９ヵ月）使用され、ＷＨＯ必須医薬品リストに記載されており、忍容性が良好で、広範囲にわたって投与される薬剤であることが示されている。
本発明者によって、ウイルスプロテアーゼの過剰発現によって引き起こされる任意の潜在的な非特異的活性を、ウイルス活性を弱毒化した標的タンパク質を使用することによって、由来するウイルスプロテアーゼと比較して軽減することができることが確認された。従って、いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、由来するウイルスプロテアーゼと比較してウイルス活性が弱毒化されている。
例えば、標的タンパク質は、由来するウイルスプロテアーゼと比較して１つ以上のアミノ酸変異を含んでもよい。ウイルスプロテアーゼがＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼである特定の実施形態では、標的タンパク質は、７２位、９６位、１１２位、１１４位、１５４位、１６０位及び１６４位から選択される１つ以上のアミノ酸にアミノ酸変異を有してもよく、アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応する。例えば、標的タンパク質は、１５４位にアミノ酸変異、例えばアラニンへの変異を有してもよく、アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応する。下記に記載するように、配列番号１の７２位、９６位、１１２位、１１４位、１５４位、１６０位及び１６４位は、配列番号１９９に記載される全長ＮＳ３タンパク質の５７位、８１位、９７位、９９位、１３９位、１４５位及び１４９位にそれぞれ対応する。実施例は、全長ＮＳ３タンパク質のアミノ酸の番号付けによるアミノ酸位置について言及している。例えば、実施例における「Ｓ１３９Ａ」の変異に対する言及は、アミノ酸の番号付けが配列番号１に対応する場合、「Ｓ１５４Ａ」の変異に対応する。
場合によっては、第２の小分子がＴ－ＳＭ複合体内の小分子と異なる場合、競合小分子がＴ－ＳＭ複合体内の小分子を置き換えることができるように、競合小分子がＴ－ＳＭ複合体の標的タンパク質に結合することができることが望ましい場合がある。このように、第２の小分子は、結合メンバー、標的タンパク質、及び小分子の間に形成された三分子複合体の半減期を減少させることができる。例えば、三分子複合体の解離を早めるために、例えば、三分子複合体の形成によって活性化する二量体誘導タンパク質の活性を速やかに阻害するために、第２の小分子を使用することが有用であると考えられる状況において、このことが望ましい場合がある。
本明細書に示されるように、シメプレビルは、標的タンパク質に結合する他の小分子がＴ－ＳＭ複合体からシメプレビルを置き換えることができないように、非常に高い親和性で標的タンパク質ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ（Ｓ１３９Ａ）（配列番号２）に結合する。本発明者らによって、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼに対してシメプレビルの親和性を低下させ、他の小分子をシメプレビルと「競合」させて、形成された三分子複合体を崩壊させることが可能となる、一定の親和性を低下させた変異を標的タンパク質に導入することができるということが判明した。 従って、ウイルスプロテアーゼがＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼであり、小分子がシメプレビルである特定の実施形態では、標的タンパク質は、１５１位及び１８３位から選択される１つ以上のアミノ酸に親和性を低下させたアミノ酸置換を含んでもよく、アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応する。いくつかの実施形態では、１５１位における親和性を低下させたアミノ酸変異は、アスパラギン酸、アスパラギン、又はヒスチジン（例えば、アスパラギン酸又はアスパラギン）への変異であり、１８３位における親和性を低下させた変異は、グルタミン酸、グルタミン、又はアラニン（例えば、グルタミン酸）への変異である。標的タンパク質は、他の本明細書に記載される変異に加えて、７２位、９６位、１１２位、１１４位、１５４位、１６０位及び１６４位から選択される１つ以上のアミノ酸におけるアミノ酸変異などの親和性を低下させたアミノ酸変異を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、結合メンバーは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）又は抗体模倣体、例えばＴｎ３タンパク質などの抗体分子である。特定の実施形態では、結合メンバーはＴｎ３タンパク質又はｓｃＦｖ、例えば、本明細書に定義されるＴｎ３タンパク質及びｓｃＦｖである。Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．に記載されるシステムに使用されている単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）と比較して、Ｔｎ３タンパク質及びｓｃＦｖは共にサイズが小型である。このことは、例えば、ウイルスベクターなどのコード容量に限りがある発現ベクターで発現カセットを送達する場合に有利であり得る。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼとシメプレビルとの間の複合体に結合する特定のＴｎ３タンパク質及びｓｃＦｖの開発及び使用が本明細書に記載され、これらが本開示に関連して結合メンバーとして機能することが示される。これらのＴｎ３タンパク質及びｓｃＦｖは、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ：シメプレビル複合体特異的結合（ＰＲＳＩＭ）分子と称される。
本明細書に記載される手法は、標的タンパク質及び結合メンバーが個別にポリペプチドに融合している（「構成ポリペプチド」と称される）場合に使用することが可能であることが確認された。特に、この手法を実行して、タンパク質の活性を促進するために二量体化又はクラスター化を必要とするタンパク質の活性を制御することが可能であることが確認された。そのようなタンパク質は、本明細書では「二量体誘導タンパク質」と称され、これらには「スプリットタンパク質」、「二量体化欠損タンパク質」、及び「スプリット複合体」が含まれる。スプリットタンパク質は、２つ以上のドメインに分離又は分割されており、この構成部分を機能させないか、又は最低限で活性化させることができる単一のタンパク質を含んでいる。しかしながら、分離した構成ポリペプチドを近接させると、機能又は活性が惹起されたり、又はそれらが復活したりする。例としては、スプリット蛍光タンパク質（例えば、スプリットＧＦＰ）、スプリットルシフェラーゼ（例えば、ＮａｎｏＢｉＴ）及びスプリットキナーゼが挙げられる。更なる例としては、個々の転写因子ドメインが単独で転写を開始することができないように、別個のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び活性化ドメイン（ＡＤ）が分離したスプリット転写因子が記載される。関連する遺伝子の転写活性化を再構成することができるのは、２つのドメインを近接させたときだけである（即ち、２つのドメインが機能的な「転写因子」を形成する）。二量体化欠損タンパク質は、活性化するのに二量体化することが必要となるタンパク質であるが、例えば、二量体化ドメインの変異又は除去によってそれらの内在的な二量体化能力が無効化されている。そのような例の１つにｉＣａｓｐ９分子があり、これは二量体化（ＣＡＲＤ）ドメインが除去されているカスパーゼ９タンパク質である。スプリット複合体とは、それらを近接させる、即ち「クラスター化」させるまで最適に機能しない、又は異なって機能する、単一のタンパク質又は２つ以上の異なるタンパク質のいずれかを意味する。そのような例としては、スプリットキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）がある。ここでは、細胞シグナル伝達の活性化に関与するＣＡＲの特異的細胞内ドメインが物理的に分離しており、これによって完全な細胞活性化が妨げられている。ドメインを近接させると、細胞シグナル伝達が活性化される（即ち、ドメインによって完全に機能的なＣＡＲが形成される）。
従って、いくつかの実施形態では、標的タンパク質は第１の構成ポリペプチドに融合され、結合メンバーは第２の構成ポリペプチドに融合されている。好ましい実施形態では、１つ以上の発現ベクターは、スプリット転写因子又はスプリットＣＡＲなどの二量体誘導タンパク質をコードする。
一実施形態では、（１）第１の構成ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインを含み、標的タンパク質に融合されてＤＢＤ－Ｔ（ＤＢＤ－標的タンパク質）融合タンパク質を形成し、第２の構成ポリペプチドは、転写調節ドメインを含み、結合メンバーに融合されてＴＲＤ－ＢＭ（転写調節ドメイン－結合分子）融合タンパク質を形成し、又は、（２）第１の構成ポリペプチドは、転写調節ドメインを含み、標的タンパク質に融合されてＴＲＤ－Ｔ融合タンパク質を形成し、第２の構成ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインを含み、結合メンバーに融合されてＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質を形成し、第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化すると転写因子を形成する。
別の実施形態では、第１の構成ポリペプチドは、第１の共刺激ドメインを含み、標的タンパク質に融合され、第２の構成ポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメインを含み、結合メンバーに融合されている。第１の構成ポリペプチドは、抗原特異的認識ドメイン及び膜貫通ドメインを更に含んでもよく、第２の構成ポリペプチドは、膜貫通ドメイン及び第２の共刺激ドメインを更に含み、第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化するとキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成する。
或いは、第１の構成ポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメインを含み、標的タンパク質に融合されており、第２の構成ポリペプチドは、第１の共刺激ドメインを含み、結合メンバーに融合されている。第１の構成ポリペプチドは、膜貫通ドメイン及び第２の共刺激ドメインを更に含み、第２の構成ポリペプチドは、抗原特異的認識ドメイン及び膜貫通ドメインを更に含み、第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化するとキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成する。
別の実施形態では、第１の構成ポリペプチドは、第１のカスパーゼ成分を含み、第２の構成ポリペプチドは、第２のカスパーゼ成分を含み、第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化するとカスパーゼを形成する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の発現ベクターは、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターである。
本開示はまた、本明細書に定義されるウイルスベクターで宿主細胞を形質移入することと、ウイルス粒子を宿主細胞内に形成するために必要となるウイルスタンパク質を発現させることと、細胞がウイルス粒子を産生するように形質移入細胞を培地で培養することとを含む、ウイルス粒子のインビトロにおける作製方法を提供する。
本開示はまた、
ｉ）標的タンパク質をコードする第１の発現カセットであって、標的タンパク質と小分子との間で複合体（Ｔ－ＳＭ複合体）を形成するように、標的タンパク質が小分子に結合することができる、第１の発現カセットと、
ｉｉ）結合メンバーをコードする第２の発現カセットであって、結合メンバーが、標的タンパク質単体及び小分子単体の両方に結合するよりも高い親和性でＴ－ＳＭ複合体に結合するように、Ｔ－ＳＭ複合体に特異的に結合する、第２の発現カセットとを含み、
標的タンパク質は非ヒトタンパク質に由来し、小分子は非ヒトタンパク質の阻害剤であり、第１及び第２の発現カセットが１つ以上のウイルス粒子内のウイルスゲノムの一部を形成する、１つ以上のウイルス粒子を提供する。一実施形態では、非ヒトタンパク質はウイルスタンパク質に由来し、小分子はウイルスタンパク質の阻害剤である。一実施形態では、非ヒトタンパク質はウイルスプロテアーゼに由来し、小分子はウイルスプロテアーゼ阻害剤である。別の実施形態では、非ヒトタンパク質は、細菌、真菌、又は原生動物タンパク質に由来する。
１つ以上のウイルス粒子内の発現カセット、標的タンパク質、小分子、結合メンバーは、本明細書に更に記載されるようなものであってよい。標的タンパク質及び結合メンバーは、本明細書に更に記載されるように、（例えば、二量体誘導タンパク質をコードするために）第１及び第２の構成ポリペプチドにそれぞれ融合されていてもよい。
ウイルス粒子はＡＡＶ粒子であってよい。
一態様では、本開示は、ｉ）非ヒトタンパク質に由来する標的タンパク質と、ｉｉ）非ヒトタンパク質の阻害剤である小分子との間の複合体に特異的に結合する結合メンバーであって、標的タンパク質単体及び小分子単体の両方に結合するよりも高い親和性で複合体に結合する、結合メンバーを提供する。一実施形態では、非ヒトタンパク質はウイルスタンパク質に由来し、小分子はウイルスタンパク質の阻害剤である。一実施形態では、非ヒトタンパク質はウイルスプロテアーゼに由来し、小分子はウイルスプロテアーゼ阻害剤である。別の実施形態では、非ヒトタンパク質は、細菌、真菌、又は原生動物タンパク質に由来する。本明細書で記載されるように、そのような複合体に特異的な結合メンバーは、Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．に記載される結合分子の欠点を克服するような形で、結合メンバー、標的タンパク質、及び小分子の間の三分子複合体の形成を制御する方法として有用である。
別の態様では、本開示は、本明細書で定義されるような標的タンパク質及び結合メンバーを含む二量体誘導タンパク質を提供する。二量体誘導タンパク質は、例えば、スプリット転写因子、スプリットＣＡＲ、又はスプリットカスパーゼタンパク質であってよい。
一態様では、本開示は、本明細書に定義される発現カセット、発現ベクター、結合メンバー、標的タンパク質又は二量体誘導タンパク質の１つ以上からなる細胞、例えば幹細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、又は免疫細胞を含む同種細胞又は自家細胞を提供する。細胞は、本明細書に記載される結合メンバー、標的タンパク質、又は二量体誘導タンパク質を発現することができる。本開示はまた、細胞を遺伝子改変し、本明細書に記載される結合メンバー又は二量体誘導タンパク質を発現する細胞を生成する方法であって、発現ベクターを細胞に投与することを含む方法を提供する。本方法は、インビトロ又はエキソビボで行ってもよい。
更に、標的タンパク質及び結合メンバーをスプリット転写因子の構成ポリペプチドに融合する本明細書に記載される手法を、細胞内における所望の発現産物（例えば、所望のポリペプチド）の発現の調節に関与する遺伝子療法に使用することが可能であることが確認された。
従って、一態様では、本開示は、
ｉ）本明細書に定義される二量体誘導タンパク質を細胞内に発現させることであって、第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化すると転写因子を形成し、転写因子が細胞内で所望の発現産物の発現を調節することができるように、細胞内の標的配列にＤＮＡ結合ドメインが結合することと、
ｉｉ）所望の発現産物の発現を調節するために、小分子を細胞に投与することとを含む、細胞内で所望の発現産物の発現を調節する方法を提供する。
本方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインの標的配列は、所望の発現産物のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターに位置する。
方法は、二量体誘導タンパク質をコードする発現カセットの送達に関与して、外因的に細胞に送達される所望の発現産物の発現を制御してもよい。
従って、いくつかの実施形態では、方法は、所望の発現産物をコードし、ＤＮＡ結合ドメインの標的配列を含む、第３の発現カセットを細胞に投与することを含む。
或いは、方法は、二量体誘導タンパク質をコードする発現カセットの送達に関与して、細胞のゲノムの一部としてすでに存在する所望の発現産物（即ち、内在性の所望の発現産物）の発現を制御してもよい。
従って、本方法の他の実施形態では、標的配列は細胞のゲノム内に位置する。
更に、本明細書に記載される手法は、細胞を治療する方法に使用することが可能であることが確認された。そのような方法は、典型的に、個体から細胞（自家細胞）を採取し、この細胞を特定のタンパク質、例えば二量体誘導タンパク質を発現するようにエキソビボで改変し、個体に再度投与することを伴う。
従って、別の態様では、本開示は、
ｉ）本明細書で定義されるような二量体誘導タンパク質をコードする発現カセットを含む細胞を、それを必要とする個体に投与することと、
ｉｉ）小分子を個体に投与することとを含む治療方法を提供する。
一態様では、本開示は、本明細書で定義されるような結合メンバー、標的タンパク質、及び二量体誘導タンパク質をコードする核酸を提供する。
一態様では、本開示は、本明細書で定義されるようなキットを提供する。
更に、追加の小分子（本明細書では「競合小分子」と称される）を利用して、結合メンバー、標的タンパク質、及び小分子の間で形成される三分子複合体の分解を誘導することが可能であることが確認された。このことは、例えば、二量体誘導タンパク質の活性に関わる導入遺伝子発現又は治療活性を遮断するなどの、本明細書で開示される二量体化の化学誘導（ＣＩＤ）を速やかに不活性化することが望ましい場合に有用であり得る。
別の態様では、本開示は、三分子複合体の分解を誘導する方法であって、三分子複合体を含む細胞に競合小分子を投与することを含み、
結合メンバーと、標的タンパク質及び小分子により形成された複合体（Ｔ－ＳＭ複合体）との間で三分子複合体が形成され、結合メンバーが標的タンパク質単体及び小分子単体の両方に結合するよりも高い親和性でＴ－ＳＭ複合体に結合し、
競合小分子がＴ－ＳＭ複合体の標的タンパク質に結合し、Ｔ－ＳＭ複合体から小分子を置き換えることができる方法を提供する。
競合小分子がＴ－ＳＭ複合体の標的タンパク質に結合し、Ｔ－ＳＭ複合体から小分子を置き換えることができるかどうかを判断する方法としては、予め形成した三分子複合体を生成し、結合メンバーがＴ－ＳＭ複合体に結合する能力を、競合小分子の濃度を増加させながら測定するアッセイ（例えば、ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＦＲ）結合アッセイ）が挙げられる。ＨＴＦＲ結合アッセイを使用して測定したときに、結合メンバーがＴ－ＳＭ複合体に結合するのを少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％阻害することができる場合、Ｔ－ＳＭ複合体から競合小分子を置き換えることが可能となり得る。いくつかの実施形態では、競合小分子はアスナプレビル、パリタプレビル、バニプレビル、グラゾプレビル、ダノプレビル又はグレカプレビルである。本方法で使用される結合メンバー、標的タンパク質、及び小分子は、本開示の他の態様に関連して更に本明細書に定義されるようなものであり得る。
特定の実施形態では、標的タンパク質はＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼに由来するものであってよく、Ｔ－ＳＭ複合体内の小分子はシメプレビルであってよく、任意選択により、結合メンバーはＰＲＳＩＭ＿２３であってよい。例えば、標的タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。本明細書に示されるように、シメプレビルは、標的タンパク質に結合する他の小分子がＴ－ＳＭ複合体からシメプレビルに置き換わることができないように、非常に高い親和性で標的タンパク質ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ（Ｓ１３９Ａ）（配列番号２）に結合する。本明細書に更に示されるように、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼに対するシメプレビルの親和性を低下させ、競合小分子がＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ、シメプレビル、及び結合メンバーであるＰＲＳＩＭ＿２３の間に形成された三分子複合体を崩壊させることができる変異をＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼに導入することができる。
従って、標的タンパク質がＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼに由来し、小分子がシメプレビルである実施形態では、標的タンパク質は、１５１位及び１８３位から選択される１つ以上のアミノ酸に親和性を低下させたアミノ酸変異（例えば置換）を有してもよく、アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応する。いくつかの実施形態では、１５１位に親和性を低下させたアミノ酸変異は、アスパラギン酸、アスパラギン、又はヒスチジンへの変異であり、１８３位に親和性を低下させた変異は、グルタミン酸、グルタミン、又はアラニンへの変異である。いくつかの実施形態では、１５１位に親和性を低下させたアミノ酸変異は、アスパラギン酸又はアスパラギンへの変異であり、１８３位に親和性を低下させた変異は、グルタミン酸への変異である。標的タンパク質は、本明細書に記載される別のアミノ酸変異に加えて（例えば、アラニンなどへの１５４位におけるアミノ酸変異に加えて）、親和性を低下させたアミノ酸変異を含んでもよい。
本開示は、そのような組み合わせが明らかに禁忌であるか、又は明示的に回避される場合を除き、記載される態様及び好ましい特徴の組み合わせを含む。
ここで、添付の図面を参照して、本開示の原理を例示する実施形態及び実験を説明する。
例示的なＰＲＳＩＭベースの二量体化の化学誘導（ＣＩＤ）の３つの成分の概略図を示す。Ａは標的タンパク質（例えば、代表的にＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）変異体）を表し、Ｂは小分子（例えば、代表的にシメプレビル）を表し、及びＣは結合メンバー（例えば、シメプレビル及びＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）の複合体に特異的なｓｃＦｖ又はＴｎ３）を表している。 ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲとの複合体におけるシメプレビルの三次元構造体（ＰＢＤコード：３ＫＥＥ；２．４Å）を示し、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲの浅い結合部位と、シメプレビルの大きな表面露出面積とを図示する。 組換えＷＴ及びＳ１３９Ａ ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。Ｓ１３９Ａ ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲは、全長ＮＳ３タンパク質（配列番号１９９）のアミノ酸１３９位に対応する位置に、セリンからアラニンへの変異を含んでいる。このセリンからアラニンに変異した位置は、本明細書で配列番号１として示されるＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼの１５４位に対応する。 ペプチド切断アッセイにおける、ＷＴの対応物と比較したＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲのＳ１３９Ａ変異体のわずかな活性を図示する。 ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲのＷＴ及びＳ１３９Ａバージョンに対するシメプレビルの親和性が同程度であることを立証する等温熱量測定データを示す。 ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：シメプレビル選択的結合分子（ＰＲＳＩＭ）を単離するために採用した選択方法を示す。 ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）単体の存在下で得られた結合シグナルと比較して、シメプレビル存在下におけるＥＬＩＳＡシグナルの倍率変化によって表された、異なる３つのライブラリーのための異なるラウンドの選択からのアウトプットを示す。 ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）単体、又はシメプレビルとの複合体に対するＰＲＳＩＭ分子の結合を測定するために使用した、ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイの概略図を示す。 ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：シメプレビル選択的結合を示すＰＲＳＩＭ分子のパネルによって得られたＨＴＲＦデータを示す。上の行はシメプレビル存在下、及び下の行はシメプレビル非存在下のデータである。 シメプレビル存在下（左）、及びシメプレビル非存在下で有意な結合のない（中央）、図７ＡではＰＲＳＩＭ＿５７、及び図７ＢではＰＲＳＩＭ＿２３に対するＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）の結合に関する、ＢＩＡｃｏｒｅから導出された親和性データを示す。対照としてシメプレビル存在下のＢＳＡを使用した（右）。灰色の曲線は測定されたデータポイントを表し、黒い破線は分析に使用されるグローバルフィットを表している。 ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）／ＰＲＳＩＭ＿５７（左；ＥＣ５０＝４．５７ｎＭ）又はＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）／ＰＲＳＩＭ＿２３（右；ＥＣ５０＝４．０３ｎＭ）のシメプレビルによるヘテロ二量体化の誘導に関する滴定曲線を示す。◇＝４０ｎＭのＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）＋０ｎＭのシメプレビル。 ＬｇＢｉＴドメインとＳｍＢｉＴドメインとを近接させることによってｎａｎｏＬｕｃの機能を再構成することができるＰＲＳＩＭ分子を特定するために使用した、ｎａｎｏＢｉＴシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）の概略図（左）を示す。生成され、検証されたＬｇＢｉＴ融合タンパク質及びＳｍＢｉＴ融合タンパク質の異なる配向も示されている（右）。 シメプレビル非存在下のシグナルに対するシメプレビル存在下の発光シグナルの倍率変化を示し、いくつかのＰＲＳＩＭ結合分子がｎａｎｏＬｕｃ活性を再構成することが可能であることを立証する、ｎａｎｏＢｉＴスクリーニングから得られたデータを示す。 構成部分がＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）及び異なるＰＲＳＩＭ分子に融合されている場合に、シメプレビルがスプリット転写因子を再構成してルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写を活性化する能力を測定するための、一過性トランスフェクションで使用する２つのプラスミドの成分を示す。 Ｔｎ３ベースのＰＲＳＩＭ分子（図１１Ａ）、及びｓｃＦｖベースのＰＲＳＩＭ分子（図１１Ｂ）に関する、スプリット転写因子アッセイから得られた用量反応データを示す。検証されたいくつかのＰＲＳＩＭ分子では、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写を用量依存的に活性化することができる。 ＰＲＳＩＭ＿２３及びＰＲＳＩＭ＿５７に関する、ラパマイシン誘導ＦＲＢ：ＦＫＢＰ１２陽性対照と比較した、スプリット転写因子アッセイから得られた用量反応データであって、それにより優れた倍率変化とＥＣ５０値とが得られたことを示す。 ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤが低い基本的発現レベルを有し、従ってより厳密に調節を受けていることを示す、ラパマイシン誘導ＦＲＢ：ＦＫＢＰ１２陽性対照と比較した、それぞれシメプレビル又はラパマイシン非存在下でのＰＲＳＩＭ＿２３及びＰＲＳＩＭ＿５７に関するスプリット転写因子アッセイから得られたデータを示す。 ＤＢＤが融合された３コピーの分子を使用した場合、より多くのＡＤドメイン及び関連する調節分子をリクルートすることによって、単一コピーと比較して予測される遺伝子発現が増加することを示す。 コピー数の増加が発現の倍率変化に相乗効果を及ぼすことを示す、単一コピーと比較した、ＤＢＤに融合された３コピーのＰＲＳＩＭ＿２３又はＦＫＢＰ１２をコードするプラスミドから得られたデータを示す。 コピー数の増加が発現の倍率変化に相乗効果を及ぼすことを示す、ＤＢＤに融合された様々なコピー数のＰＲＳＩＭ＿２３及びヌルＴｎ３をコードするプラスミドから得られたデータを示す。 ＰＲＳＩＭベースのスプリットキメラ抗原受容体を発現させるために使用するプラスミドと、このプラスミドから発現するタンパク質とを示す。 シメプレビルの添加がＰＲＳＩＭベースのスプリットＣＡＲ成分の結合に及ぼす影響を示し、得られた細胞の活性化が達成されたことを示す。 同等のＦＲＢ：ＦＫＢＰ１２ベースのＣＡＲと比較した、シメプレビル存在下でＰＲＳＩＭベースのスプリットＣＡＲを発現する細胞からのＴ細胞活性化のマーカーとしてのＩＬ－２の放出が、用量依存的に増加することを示す。 ＰＲＳＩＭ＿２３を含むＣＩＤを使用したスプリット転写因子アッセイの再構成により、ＭＥＤＩ８８５２の発現を誘導する際のシメプレビルの用量反応を示す。 誘導ルシフェラーゼ導入遺伝子又はＰＲＳＩＭ＿２３／ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）ベースのスプリット転写因子成分のいずれかをコードする個々のＡＡＶ粒子を生成するのに使用するベクターを示す。両方のＡＡＶ粒子で形質導入した後に発現するタンパク質、及びシメプレビルで処理した後のルシフェラーゼ発現も示されている。 ＰＲＳＩＭ＿２３スイッチ及び誘導ルシフェラーゼ導入遺伝子を別々のＡＡＶ粒子で細胞に送達した場合に、ＰＲＳＩＭ＿２３スイッチがシメプレビル存在下で用量依存的にルシフェラーゼの発現を活性化することができることを示す。 誘導ＩＬ－２導入遺伝子及びＰＲＳＩＭ＿２３／ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）ベースのスプリット転写因子成分の両方をコードするＡＡＶ粒子を生成するのに使用するベクターを示す。これらのＡＡＶ粒子で形質導入した後に発現するタンパク質、及びシメプレビルで処理した後のＩＬ－２発現も示されている。 ＰＲＳＩＭ＿２３スイッチ及び誘導ＩＬ－２導入遺伝子を同一のＡＡＶ粒子で細胞に送達した場合に、ＰＲＳＩＭ＿２３スイッチがシメプレビル存在下で用量依存的にＩＬ－２の発現を活性化することができることを示す。 ＰＲＳＩＭ＿２３スイッチ及び誘導ＩＬ－２導入遺伝子を同一のＡＡＶ粒子で細胞に送達した場合に、ＰＲＳＩＭ＿２３スイッチによって誘導されたＩＬ－２発現レベルが、ＣＡＧプロモーターからＩＬ－２を恒常的に発現するＡＡＶを送達することによって達成されるＩＬ－２発現レベルと同様であることを示す。 シメプレビルがＣＲＩＳＰＲａ手法において内在性遺伝子の発現を調節する能力を測定するのに使用する、ＰＲＳＩＭベースの活性化プラスミド及びＩＬ－２標的ｇＲＮＡプラスミドの両方の成分を示す。 シメプレビル存在下でのみ、ＰＲＳＩＭベースの活性化プラスミド及びＩＬ－２標的ｇＲＮＡプラスミドの両方を発現する細胞からＩＬ－２の発現が誘導されることを示す。 小分子ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤のパネルとの複合体の形成が、用量依存的に誘導されることを示す。 ＨＣＶ ＮＳ３／ＮＳ４Ａのシメプレビルの結合部位の二次元相互作用の図を示す。 変異体ＨＣＶプロテアーゼのパネルがＰＲＳＩＭ＿２３及びシメプレビルと複合体を形成する能力を示す。 ＨＣＶ ＮＳ３／ＮＳ４Ａ「ＷＴ」（Ｓ１３９Ａ）ＰＲ（図２３Ａ）、ＨＣＶ ＮＳ３／ＮＳ４Ａ Ｋ１３６Ｄ ＰＲ（図２３Ｂ）、ＨＣＶ ＮＳ３／ＮＳ４Ａ Ｋ１３６Ｎ ＰＲ（図２３Ｃ）、及びＨＣＶ ＮＳ３／ＮＳ４Ａ Ｄ１６８Ｅ ＰＲ（図２３Ｄ）に結合するシメプレビルに関する、Ｏｃｔｅｔによって導出された親和性データを示す。データは、２～３の独立した実験を代表したデータである。 変異体ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ／ＰＲＳＩＭ＿２３結合分子のシメプレビルによるヘテロ二量体化の誘導に関する滴定曲線を示す；ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ「ＷＴ」（Ｓ１３９Ａ）（●）、ＨＣＶ ＰＲ ＮＳ３／４Ａ Ｋ１３６Ｄ（■）、ＨＣＶ ＰＲ ＮＳ３／４Ａ Ｋ１３６Ｎ（▲）、及びＨＣＶ ＰＲ ＮＳ３／４Ａ Ｄ１６８Ｅ（◇）。 シメプレビル存在下（それぞれ２０、８００、４０、及び２０ｎＭシメプレビル）（左）、及びシメプレビル非存在下で有意な結合のない（右）、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ「ＷＴ」（Ｓ１３９Ａ）（図２４Ｂ）、ＨＣＶ ＰＲ ＮＳ３／４Ａ Ｋ１３６Ｄ（図２４Ｃ）、ＨＣＶ ＰＲ ＮＳ３／４Ａ Ｋ１３６Ｎ（図２４Ｄ）、及びＨＣＶ ＰＲ ＮＳ３／４Ａ Ｄ１６８Ｅ（図２４Ｅ）のＰＲＳＩＭ＿２３に対する結合に関する、ＢＩＡｃｏｒｅから導出された親和性データを示す。灰色の曲線は測定されたデータポイントを表し、黒い破線は分析に使用されるグローバルフィットを表している。データは、３つの独立した実験を代表したデータである。 ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲの小分子阻害剤を添加するとスイッチ複合体の形成が阻害されることを、シメプレビル／ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲのプレインキュベートの有無で比較したものである。 ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲの小分子阻害剤は、１６８位及び１３６位にアミノ酸変異を有するＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ変異体と結合した場合に、シメプレビルと競合することによってスイッチ複合体を崩壊させることができる。 野生型と比較した、ＰＲＳＩＭ＿２３ ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ変異体に関するスプリット転写因子アッセイから得られたデータを示す。 ＰＲＳＩＭ＿２３ ＨＣＶ ＮＳ３／４ ＰＲ ＷＴ及びＣＲＩＳＰＲによるＡＡＶＳ１導入遺伝子のノックインによって得られる変異体の制御下でＧＦＰ－ＰＥＳＴを発現するモノクローナル細胞株を生成するために使用するベクターを示す。発現するタンパク質、及び細胞活性化をもたらすシメプレビルの添加における効果も示されている。 スプリット転写因子ＰＲＳＩＭ＿２３ ＨＣＶ ＮＳ３／４ ＰＲ ｗｔ及び変異体の制御下でＧＦＰ－ＰＥＳＴを発現する細胞株のフローサイトメトリーによって測定されたＧＦＰ蛍光強度を示す、代表的なヒストグラムを示す。モノクローナル細胞株をシメプレビルで２４時間誘導した。 スプリット転写因子ＰＲＳＩＭ＿２３ ＨＣＶ ＮＳ３／４ ＰＲ ＷＴ及び変異体の制御下でＧＦＰ－ＰＥＳＴを発現する細胞株のＧＦＰ蛍光から得られたデータを示す。発現を誘導するため、細胞をシメプレビルで処理した。シメプレビルを除去し、フローサイトメトリーを使用して、除去後の様々な時点でＧＦＰ蛍光を測定した。 ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ（Ｓ１９３Ａ）ＰＲ：ＰＲＳＩＭ＿５７：シメプレビル三元複合体の全体的な構造を示す。上部画像：ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ（Ｓ１９３Ａ）ＰＲ（薄い灰色）及びＰＲＳＩＭ＿５７（濃い灰色）が表面表現で示され、シメプレビル分子は２つのタンパク質の界面に挟まれた球棒形式（黒）で示されている。下部画像：ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ（Ｓ１９３Ａ）ＰＲ（薄い灰色）及びＰＲＳＩＭ＿５７（濃い灰色）が模式的な形式で示されている。シメプレビルは、２σの等高線の２ｍＦｏ－ＤＦｃの電子密度を伴った球棒形式（黒）で示されている。 ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ（Ｓ１９３Ａ）ＰＲ、ＰＲＳＩＭ＿５７、及びシメプレビル間の分子相互作用の詳細を示す。上部パネル：ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ（Ｓ１９３Ａ）ＰＲ及びＰＲＳＩＭ＿５７によってシメプレビルとの間に生じた相互作用の詳細。シメプレビル（球棒、黒）と相互作用するＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ（Ｓ１９３Ａ）ＰＲ残基はこれまでに測定されたものであり（ＰＤＢ ３ＫＥＥ）、球棒形式で側鎖と共に示されている（炭素－薄い灰色、酸素／窒素－黒）。シメプレビルの周囲に疎水性のキャビティを形成するＰＲＳＩＭ＿５７の疎水性残基（Ｐｈｅ７７、Ｉｌｅ７４、Ｉｌｅ１２５、及びＴｒｐ２４９）が球棒形式で示されている（炭素－濃い灰色、酸素／窒素－黒）。Ｐｈｅ７７の側鎖とシメプレビルのキノリンとの間で直接相互作用が生じる。下部パネル：左側のパネルのように着色された、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ（Ｓ１９３Ａ）ＰＲとＰＲＳＩＭ＿５７との間の相互作用の詳細。相互作用している残基を球棒形式で示す。 キルスイッチの設計を示す。図２８Ａ：アポトーシスによる細胞死を誘導するためには、カスパーゼ９（Ｃａｓｐ９）をそのＣＡＲＤ二量体化ドメインによってホモ二量体化することが重要となる。図２８Ｂ：ＣＡＲＤドメインをＰＲＳＩＭスイッチ成分と置換したもの。図２８Ｃ：シメプレビルを添加することによって、ＰＲＳＩＭ２３－ＨＣＶ ＰＲのヘテロ二量体の形成を誘導し、それによってＣａｓｐ９活性ドメインの二量体化が生じ、その後のアポトーシスの誘導がもたらされる。 シメプレビルを添加したときのキルスイッチの機能を示す。図２９Ａ：シメプレビルで処理すると速やかな細胞死が見られる、ｗｔキルスイッチで安定的に形質導入したＨＥＫ２９３細胞の位相差画像。図２９Ｂ：シメプレビルで処理すると速やかな細胞死が見られる、ｗｔキルスイッチで安定的に形質導入したヒト腫瘍細胞株ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９の位相差画像。図２９Ｃ：カスパーゼ３アッセイの模式的な概略。図２９Ｄ：処理済みの非形質導入ＨＥＫ２９３細胞と比較した、ｗｔキルスイッチ形質導入ＨＥＫ２９３＋／－１０ｎＭ シメプレビルにおけるカスパーゼ３の活性。図２９Ｅ：１０ｎＭのシメプレビル存在下の非形質導入ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９と比較した、キルスイッチ形質導入ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９の３つの単一細胞クローンにおけるカスパーゼ３の活性。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ＝有意性なし。 濃度を上昇させたシメプレビルを添加したときの、形質導入されていないＥＳ細胞株Ｓａ１２１、及びシメプレビル誘導ｗｔキルスイッチで形質導入した同細胞株の経時的なコンフルエンシーを示す。 誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）におけるキルスイッチのＢ２Ｍ遺伝子座標的ノックインによって、シメプレビル誘導性の細胞死が促進される。図３１Ａ：キルスイッチのノックイン方法の概略図。ｉＰＳＣの遺伝子座にキルスイッチ（ｉＣａｓｐ９）をノックインした。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して、Ｂ２Ｍ相同性アームに挟まれたｉＣａｓｐ９発現カセットを含むドナー鋳型を送達した。発光の記号は、ＣＲＩＳＰＲ標的部位を示すものであった。ＬＨＡ，左相同性アーム；ＲＨＡ，右相同性アーム；ＥＦ１ａ ｐｒｏｍｔ，ＥＦ１αプロモーター；Ｐ２Ａ，ブタテシオウイルス１型由来の２Ａ自己切断ペプチド；Ｐｕｒｏ，ピューロマイシン耐性遺伝子；ｂｌａｓｔ，ブラストサイジン耐性遺伝子；ｂＧＨ ｐＡ；ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル；ＰｒｉｍｅｒＦ，ジェノタイピングのための順方向プライマー；ＰｒｉｍｅｒＲ，ジェノタイピングのための逆方向プライマー。図３１Ｂ：キルスイッチを含むｉＰＳＣの単一細胞クローンのジェノタイピング。遺伝子ノックイン後、５つの単一細胞ｉＰＳＣクローン（１Ｂ７、１Ｄ６、１Ｄ１２、１Ｇ８及び２Ｄ８）を単離した。これらのクローンからゲノムＤＮＡを抽出した。Ａ）に示されるプライマーを使用して、標的遺伝子座を増幅した。アンプリコンを電気泳動用１．２％ アガロースゲルに負荷した。ジェノタイピングデータによって、単一細胞クローンの１Ｂ７、１Ｄ１２、１Ｇ８及び２Ｄ８が二対立遺伝子型のＢ２Ｍ標的キルスイッチのノックインを有する一方で、クローン１Ｄ６は単一対立遺伝子型のキルスイッチのノックインを有することが示された。ＰＳＣ－ＷＴ，野生型（未改変）ｉＰＳＣ；ＫＩ，ノックイン対立遺伝子のアンプリコン；ＷＴ，野生型対立遺伝子のアンプリコン。図３１Ｃ：ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＴＣＡ）アッセイによって定量した細胞増殖指数。シメプレビル誘導前にｉＰＳＣ単一細胞クローンを１日間培養した。細胞指標を誘導の前後３日間にわたって経過観察した。 シメプレビルを添加したときのキルスイッチＳ１９６Ａ変異体の機能を示す。図３２Ａ：シメプレビルで処理すると速やかな細胞死が見られる、キルスイッチＳ１９６Ａ変異体で安定的に形質導入したＨＥＫ２９３細胞の位相差画像。図３２Ｂ：処理済みの非形質導入ＨＥＫ２９３細胞と比較した、ｗｔ及びＳ１９６Ａ変異体キルスイッチ形質導入ＨＥＫ２９３＋／－１０ｎＭ シメプレビルにおけるカスパーゼ３の活性。＊＊＊ｐ＜０．０００５；ｎｓ＝有意性なし。
ここで、添付の図面を参照して、本開示の態様及び実施形態を説明する。更なる態様及び実施形態は当業者にとって明らかであろう。本文中に記載される全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
発現ベクター及び発現カセット
「発現ベクター」とは、本明細書で使用する場合、外来遺伝子材料を細胞内に発現させるために使用されるＤＮＡ分子のことである。当該技術分野において公知の任意の好適なベクターを使用することができる。好適なベクターとしては、ＤＮＡプラスミド、バイナリーベクター、ウイルスベクター、及び人工染色体（例えば、酵母人工染色体）が挙げられる。ある実施形態では、発現ベクターは、以下でより詳細に記載するようなウイルスベクターである。ある実施形態では、発現ベクターはＤＮＡプラスミドである。
「発現カセット」とは、本明細書で使用する場合、タンパク質であってよい発現産物の転写を生じさせることができるポリヌクレオチド配列のことである。「コード配列」とは、発現産物をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部を意味することが意図される。発現産物がタンパク質である場合は、この配列を「タンパク質コード配列」と称してもよい。タンパク質コード配列は、典型的に、開始コドンによって５’末端で開始し、終止コドンによって３’末端で終了する。発現カセットは、発現ベクターの一部であってもよく、又は、以下でより詳細に記載するように、ウイルス粒子内のウイルスゲノムの一部であってもよい。
発現カセットは、典型的に、タンパク質コード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含んでいる。「作動可能に連結された」という用語には、タンパク質コード配列の発現をプロモーターの影響下又は制御下に置くような方法で、選択されたコード配列及びプロモーターが共有結合されている状況が含まれる。従って、プロモーターがタンパク質コード配列の転写を生じさせることができる場合、プロモーターはタンパク質コード配列に作動可能に連結されている。続いて、得られた転写物を必要に応じて所望のタンパク質に翻訳することができる。
使用される細胞型において機能するのであれば、当該技術分野において公知の任意の好適なプロモーターを発現カセットに使用してもよい。例えば、細胞が哺乳類細胞である場合、プロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであってよい。複数の発現カセットを使用する場合、それぞれのコード配列が、それ自身のプロモーターに独立して作動可能に連結されていてもよい。或いは、発現カセットの１つ以上のコード配列が、同一のプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。
例えば、第１及び第２の発現カセットのように、複数の発現カセットが記載されている場合、それらは同一の又は異なる発現ベクターの一部であってよい。従って、いくつかの実施形態では、第１及び第２の発現カセットが同一の発現ベクターに位置してもよい。他の実施形態では、第１の発現カセットが第１の発現ベクターに位置し、第２の発現カセットが第２の発現ベクターに位置する。
複数の発現カセットが同一の発現ベクターに位置する場合、個々の発現カセット（例えば、第１及び第２の発現カセット）が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）又は２Ａエレメントによって隔てられていてもよい。ＩＲＥＳ又は２Ａエレメントを使用すると、同一のプロモーターを使用して複数の発現産物を発現させることができる。換言すれば、第１及び第２の発現カセットがＩＲＥＳ又は２Ａエレメントによって隔てられている場合、第１及び第２の発現カセットの両方を同一のプロモーターに作動可能に連結することができる。
標的タンパク質及び小分子
本開示の態様及び実施形態は、非ヒトタンパク質に由来する標的タンパク質、即ちヒトに対して内在性のものでないタンパク質に関する。一実施形態では、非ヒトタンパク質は、ウイルス、細菌、真菌、又は原生動物タンパク質に由来する。一実施形態では、非ヒトタンパク質はウイルスタンパク質に由来し、小分子はウイルスタンパク質の阻害剤である。一実施形態では、非ヒトタンパク質は細菌タンパク質に由来し、小分子は細菌タンパク質の阻害剤である。一実施形態では、非ヒトタンパク質は真菌タンパク質に由来し、小分子は真菌タンパク質の阻害剤である。一実施形態では、非ヒトタンパク質は原生動物タンパク質に由来し、小分子は原生動物タンパク質の阻害剤である。一実施形態では、非ヒトタンパク質はウイルスプロテアーゼに由来し、小分子はウイルスプロテアーゼの阻害剤である。
標的タンパク質に関連して「由来する」という用語は、標的タンパク質が由来するタンパク質と類似した、ただし必ずしも同一ではないアミノ酸配列を有し、この標的タンパク質がそれでもなお小分子に結合することができることを意味することが意図される。あるタンパク質に由来する標的タンパク質は、由来するタンパク質と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。あるタンパク質に由来する標的タンパク質は、由来するタンパク質と比較して５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、又は２個未満の配列変異を含んでもよい。例えば、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有する標的タンパク質は、配列番号１に記載された配列を有するウイルスプロテアーゼに由来するものである。更に、標的タンパク質は、由来するタンパク質よりも少ないアミノ酸（即ち、より短いタンパク質）を有し得る。
ウイルスプロテアーゼは、ウイルス性病原体の遺伝子材料によってコードされる酵素である。これらの酵素の通常の機能は、ウイルスポリタンパク質前駆体又は細胞タンパク質における特定のペプチド結合の切断を触媒することである。ウイルスプロテアーゼの例としては、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、及びヒトライノウイルス（ＨＲＶ）ファミリーによってコードされるようなものが挙げられる。特定のウイルスプロテアーゼが、これらのプロテアーゼの小分子阻害剤の例と共に、例えばＰａｔｉｃｋ ａｎｄ Ｐｏｔｔｓ．１９９８に記載されている。
小分子は、典型的には２０００ダルトン以下の分子量を有する有機化合物である。小分子は、合成されていてもよく、又は天然に存在するものであってもよい。
ウイルスプロテアーゼ阻害剤が、ａ）標的タンパク質に結合することができ、及びｂ）ヒトにおける臨床目的のために評価されているのであれば、小分子としてウイルスプロテアーゼ阻害剤を選択することは特に制限されるものではない。ヒトにおける臨床目的のために評価されているウイルスプロテアーゼ阻害剤としては、規制当局によってヒトにおける臨床用途に承認されているもの、例えば、食品医薬品局（ＦＤＡ）及び／又は欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって治療が承認されている阻害剤が挙げられる。また、臨床目的のために評価されているウイルスプロテアーゼ阻害剤としては、ヒトに関する臨床試験において試験中／試験済みのものであり、好ましくは過去に第Ｉ相臨床試験に進んでいるものが挙げられる。ウイルスプロテアーゼ阻害剤は、ヒトにおける臨床用途に承認されていることが好ましい。ウイルスプロテアーゼ阻害剤は、長期間投与（６ヵ月以上毎日）に好適であり、細胞浸透性で、経口投与され、及び／又は一次治療として使用されないことが好ましい。
使用されるウイルスプロテアーゼは、単量体又は多量体（例えば、二量体、三量体、四量体など）であってよい。単量体のウイルスプロテアーゼを使用することが好ましく、例えば、標的タンパク質の融合タンパク質と結合メンバーの融合タンパク質とを厳密に１：１の割合とした場合に、所望の機能活性が誘発される。多量体のウイルスプロテアーゼが好ましい代替的な状況が存在する場合もあってよく、例えば、標的タンパク質がスプリット転写因子内の転写調節ドメインに融合されている場合、多量体のウイルスプロテアーゼを使用すると、標的遺伝子をリクルートする転写調節ドメインの数を増大させることができる。
いくつかの実施形態では、ウイルスプロテアーゼは、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ又はＨＩＶプロテアーゼである。これらのプロテアーゼは、どちらも一般的にヒトでの忍容性が良好であり、長期間投与に好適であることが公知であるいくつかの承認された小分子阻害剤によって標的化されることが知られている。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼを標的化する小分子阻害剤の例は、Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ．２０１４に記載されている。ＨＩＶプロテアーゼを標的化する小分子阻害剤の例は、Ｌｖ ｅｔ ａｌ．２０１５に記載されている。
いくつかの実施形態では、ウイルスプロテアーゼはＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼである。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲは、単量体で比較的サイズが小型であり（２１ｋＤａ）、細胞質内に発現させることができ、ＤＮＡとの会合が見られず、本開示に使用されるウイルスプロテアーゼとして理想的な候補となっている。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼは、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ａ８ＤＧ５０－１（バージョン２の配列；２００８年４月２９日に配列を更新）に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸１０３０～１２０６位のアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼは、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含み得る。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼに由来する標的タンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼに結合することが公知であり、ヒトへの使用が承認されているいくつかの小分子阻害剤が存在する。以下の表にそれらの一部を記載する。
Figure 2022541761000001
それぞれの小分子と複合体を形成する標的タンパク質の構造は、ＰＢＤアクセッション番号として提供されており、タンパク質構造データバンク（ＰＢＤ）から入手可能な結晶構造に対応している。小分子の構造及び化学名もまた、ＰＢＤアクセッション番号として提供される。
小分子は、ペプチド模倣体であってよい。「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ）」、「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」及び「ペプチド類似体」という用語は互換的に用いられ、アミノ酸で構成されていないが、完全にアミノ酸で構成されるペプチド化合物と実質的に同一の特性を有する化合物を意味する。
ヒトに関する臨床試験において試験中／試験済みの他の小分子阻害剤としては、ファルダプレビル、ソバプレビル、ベドロプレビルが挙げられる。
いくつかの実施形態では、小分子は、シメプレビル、ボセプレビル、テラプレビル、アスナプレビル、バニプレビル、ボキシラプレビル、グレカプレビル、パリタプレビル、ナラプレビル、ダノプレビル、ファルダプレビル、グラゾプレビル、ソバプレビル、ベドロプレビル、又は薬理学的に許容される類似体若しくはそれらの誘導体からなる群から選択される。これらの小分子は全てヒトへの使用が承認されており、及び／又はヒトに関する臨床試験で試験されている。いくつかの実施形態では、小分子は、シメプレビル、ボセプレビル、テラプレビル、アスナプレビル、バニプレビル、ボキシラプレビル、グレカプレビル、パリタプレビル、グラゾプレビル、ダノプレビル及びナラプレビル、又は薬理学的に許容される類似体若しくはそれらの誘導体からなる群から選択される。これらの小分子は、ヒトへの使用が承認されている。
特定の実施形態では、小分子は、シメプレビル、ボセプレビル及びテラプレビル、又は薬理学的に許容される類似体若しくはそれらの誘導体からなる群から選択される。これらの小分子（シメプレビル、ボセプレビル及びテラプレビル）は、ヒトでの忍容性が良好であり、ヒトへの長期間の使用が承認されている。特定の実施形態では、小分子は、シメプレビル又は薬理学的に許容される類似体若しくはそれらの誘導体であってよい。シメプレビル（Ｏｌｙｓｉｏ（登録商標））は、経口投与される小分子であり、細胞膜透過性で、一日一回の投与を支持する薬物動態（ＰＫ）プロファイルを有する。シメプレビルは、ＨＣＶ感染症を治療するために、リバビリン及びＰＥＧ化インターフェロンと併用して長期間（最大３９ヵ月）使用され、ＷＨＯ必須医薬品リストに記載されており、忍容性が良好で、広範囲にわたって投与される薬剤であることが示されている。
小分子の薬理学的に許容される類似体及びその誘導体としては、「親」小分子とは異なるが、親小分子と類似した抗ウイルス活性を含む化合物が挙げられ、互変異性体、位置異性体、幾何異性体、並びに適用可能な場合、その光学異性体（エナンチオマー）及び他の立体異性体（ジアステレオマー）を含む立体異性体、並びに適用可能な場合、関連して薬学的に許容される塩及びそれらの誘導体（プロドラッグ形態を含む）が挙げられる。例えば、シメプレビルの類似体としては、国際公開第２００７０１４９２６Ａ１号パンフレットで定義される化学式（Ｉ）によって包含される化合物のようなものが挙げられる。
シメプレビルは、以下の化学構造を有し得る。
Figure 2022541761000002
いくつかの実施形態では、ウイルスプロテアーゼはＨＩＶプロテアーゼである。ＨＩＶプロテアーゼは、２２ｋＤａのホモ二量体として存在しており、各サブユニットは９９個のアミノ酸から構成されている。ＨＩＶプロテアーゼは、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０３３６６－１（バージョン３の配列；２００７年１月２３日に配列を更新）に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸５０１～５９９位のアミノ酸配列を有し得る。ＨＩＶプロテアーゼに由来する標的タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０３３６６－１に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸５０１～５９９位のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。ＨＩＶプロテアーゼに由来する標的タンパク質は、単量体タンパク質であってよい。例えば、標的タンパク質は、ホモ二量体タンパク質を形成する可能性を減少させる１つ以上のアミノ酸変異を含有してもよい。
ＨＩＶプロテアーゼに結合することが知られており、ヒトへの使用が承認されているいくつかの小分子阻害剤が存在する。以下の表にそれらの一部を記載する。
Figure 2022541761000003
ホスアンプレナビルは、アンプレナビルよりも良好な溶解度とバイオアベイラビリティとを有する、アンプレナビルのプロドラッグ形態である。
いくつかの実施形態では、小分子は、アタザナビル、ダルナビル及びホスアンプレナビル、アンプレナビル、インジナビル、ロピナビル／リトナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル及びチプラナビル、又は薬理学的に許容される類似体若しくはそれらの誘導体からなる群から選択される。
特定の実施形態では、小分子は、アタザナビル、ダルナビル及びホスアンプレナビル、又は薬理学的に許容される類似体若しくはそれらの誘導体からなる群から選択される。これらの小分子はヒトでの忍容性が良好であり、良好なバイオアベイラビリティを有する。更に、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤は、典型的に患者に長期間使用するものであり、これらの小分子阻害剤は、長期間にわたる使用に対して忍容性を示すことが期待されている。
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、由来するウイルスプロテアーゼと比較してウイルス活性が弱毒化されている。ここでいう弱毒化されたウイルス活性とは、標的タンパク質が、由来するウイルスプロテアーゼと比較して低い酵素活性、例えば、低いプロテアーゼ活性を有することを意味することが意図される。酵素活性は、例えば、実施例又はＳａｂａｒｉｅｇｏｓ ｅｔ ａｌ．２００９に記載するような蛍光発生ペプチド切断アッセイを使用して検証することができる。要約すると、蛍光発生ペプチド切断アッセイは、ドナー－クエンチャーのペアを含有する蛍光発生プロテアーゼＦＲＥＴ基質と標的タンパク質／ウイルスプロテアーゼをインキュベートすることを用いることを含み、これによって、ペプチドの切断によってドナーがクエンチャーから分離し、特定の波長、例えば４９０ｎｍで検出可能なエネルギーが放出される。
いくつかの実施形態では、蛍光発生ペプチド切断アッセイなどの酵素活性アッセイで測定したときに、標的タンパク質がウイルスプロテアーゼの活性の１０％未満の活性を有する場合、標的タンパク質は由来するウイルスプロテアーゼと比較して弱毒化されたウイルス活性を有するものと見なされる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質が１ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、又は１μＭ未満の濃度である場合、蛍光発生ペプチド切断アッセイなどの酵素活性アッセイで測定したときに、標的タンパク質は任意の検出可能なウイルス活性を示さない。
標的タンパク質は、由来するウイルスプロテアーゼと比較して（例えば、配列番号１と比較して）、１つ以上のアミノ酸変異（例えば、置換／挿入／欠失）を含んでもよい。１つ以上のアミノ酸変異を含む標的タンパク質は、小分子及び結合メンバーと共に三分子複合体を形成する能力を保持している必要があるが、このことは、例えば、実施例に記載するようなホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを使用して判断することができる。
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、由来するウイルスプロテアーゼと比較して１つ以上のアミノ酸変異を含み、１つ以上のアミノ酸変異は、標的タンパク質のウイルス活性を弱毒化するものである。ウイルスプロテアーゼの活性部位に１つ以上のアミノ酸変異が存在していてもよい。
例えば、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼは、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼのアミノ酸残基Ｈ５７、Ｄ８１及びＳ１３９を含む触媒三残基を含有する。例えば、Ｇｒａｋｏｕｉ ｅｔ ａｌ．１９９３；Ｅｃｋａｒｔ ｅｔ ａｌ．１９９３；及びＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９３を参照されたい。これらのアミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸配列のＨ７２位、Ｄ９６位及びＳ１５４位に対応する。従って、標的タンパク質は、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼの７２位、９６位及び１５４位から選択される１つ以上のアミノ酸にアミノ酸変異を含有してもよく、アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応する。ウイルス活性に関与することが知られている他のＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼの残基としては、ＨＣＶ ＮＳ３／４ＡプロテアーゼのＣ９７、Ｃ９９、Ｃ１４５及びＨ１４９が挙げられる（配列番号１のＣ１１２位、Ｃ１１４位、Ｃ１６０位及びＨ１６４位に対応する）。例えば、Ｈｉｋｉｋａｔａ ｅｔ ａｌ．１９９３；及びＳｔｅｍｐｎｉａｋ ｅｔ ａｌ．１９９７を参照されたい。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼの７２位、９６位、１１２位、１１４位、１５４位、１６０位及び１６４位から選択される１つ以上のアミノ酸にアミノ酸変異（例えば置換）を含有し、アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応する。
特定の実施形態では、標的タンパク質は、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼの１５４位にアミノ酸変異、例えばアラニンに対する変異を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応する。ある実施形態では、標的タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
ＮＳ３タンパク質の全長配列を配列番号１９９に示す。本明細書に記載される配列番号１の１５４位のアミノ酸変異は、配列番号１９９の１３９位に対応する。
全長ＮＳ３タンパク質（配列番号１９９）に従って番号が付けられた、上記に記載される潜在的なアミノ酸変異と、配列番号１に記載されるＮＳ３／４Ａプロテアーゼにおけるそれらの対応する位置を明確にした表を以下に提示する。
Figure 2022541761000004
更なる例として、ＨＩＶプロテアーゼは、アミノ酸残基Ｄ２５、Ｔ２６及びＧ２７を含む触媒三残基を含有し、アミノ酸の番号付けは、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０３３６６－１（バージョン３の配列；２００７年１月２３日に配列を更新）に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸５０１～５９９位のアミノ酸配列を有するＨＩＶプロテアーゼによるものである。従って、標的タンパク質は、ＨＩＶプロテアーゼの２５位、２６位及び２７位から選択される１つ以上のアミノ酸にアミノ酸変異を含有してもよく、アミノ酸の番号付けは、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０３３６６－１（バージョン３の配列；２００７年１月２３日に配列を更新）に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸５０１～５９９位のアミノ酸配列を有するＨＩＶプロテアーゼによるものである。
標的タンパク質と小分子とが相互作用して、標的タンパク質と小分子との間で複合体（本明細書ではＴ－ＳＭ複合体と称する）を形成する。この相互作用は、共有結合性相互作用であってもよく、又は非共有結合性相互作用であってもよい。いくつかの実施形態では、例えば、表面プラズモン共鳴法又はバイオレイヤー干渉法を使用して測定したときに、１ｍＭよりも小さい、好ましくは５００ｎＭよりも小さい、より好ましくは２００ｎＭよりも小さい、更により好ましくは１００ｎＭよりも小さい、又は更により好ましくは５０ｎＭよりも小さいｋＤで小分子が標的タンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、例えば、表面プラズモン共鳴法又はバイオレイヤー干渉法を使用して測定したときに、２５ｎＭ～２００ｎＭ、２５ｎＭ～１００ｎＭ、又は２５～７５ｎＭのｋＤで小分子が標的タンパク質に結合する。
標的タンパク質に対する小分子の親和性を低下させ、第２の小分子をＴ－ＳＭ複合体内の小分子と置き換えることができるように、標的タンパク質にアミノ酸変異（例えば置換）を導入することが望ましい場合がある。例えば、本明細書に示されるように、シメプレビルは、標的タンパク質に結合する他の小分子がＴ－ＳＭ複合体からシメプレビルに置き換わることができないように、非常に高い親和性で標的タンパク質ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ（Ｓ１３９Ａ）（配列番号２）に結合する。標的タンパク質にアミノ酸変異を導入することによってＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼに対するシメプレビルの結合親和性を低下させることで、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼの異なる小分子阻害剤を使用して、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ（Ｓ１３９Ａ）、シメプレビル及びＰＲＳＩＭ＿２３の間に形成された三分子複合体を崩壊させることが可能となる。従って、いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、親標的タンパク質に結合する小分子よりも低い親和性で小分子が標的分子に結合するように、由来するウイルスプロテアーゼ（配列番号１）と比較して１つ以上の親和性を低下させたアミノ酸変異（例えば置換）を含む。ここでいう「親標的タンパク質」とは、１つ以上の親和性を低下させたアミノ酸変異を欠損しているが、他の点では標的タンパク質と同一のものである。親標的タンパク質は、標的タンパク質に由来するウイルスプロテアーゼであってもよい（例えば、親標的タンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有してもよい）か、又は親標的タンパク質は、それ自体がウイルスプロテアーゼに由来するものであってよい（例えば、親標的タンパク質は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有してもよい）。
１つ以上の親和性を低下させたアミノ酸変異によって、親標的タンパク質に結合する小分子よりも少なくとも１．５倍低い親和性で標的タンパク質に結合する小分子を生じさせることができる。１つ以上の親和性を低下させたアミノ酸変異によって、親標的タンパク質に結合する小分子よりも１．５倍～１０倍低い、又は親標的タンパク質に結合する小分子よりも１．５倍～５倍低い親和性で標的タンパク質に結合する小分子を生じさせることができる。１つ以上の親和性を低下させたアミノ酸変異によって、任意選択により、バイオレイヤー干渉法を使用して、例えばＯｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４を使用して親和性を測定した場合に、２５ｎＭ～２００ｎＭ、２５～１００ｎＭ、又は２５～７５ｎＭのＫＤで標的タンパク質に結合する小分子を生じさせることができる。
本明細書に示されるように、アミノ酸の番号付けが配列番号１に対応する、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼの１５１位及び１８３位のアミノ酸置換によって、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼに対するシメプレビルの親和性を低下させ、第２の小分子がＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ、シメプレビル、及び結合メンバーであるＰＲＳＩＭ＿２３の間に形成された三分子複合体を崩壊させることができることが分かった。更に、これらの親和性を低下させる変異を含む標的タンパク質は、スプリット転写因子などの二量体誘導タンパク質の機能性を保持することも示された。配列番号１のアミノ酸１５１位及び１８３位は、配列番号９９に記載される全長ＮＳ３タンパク質のアミノ酸１３６位及び１６８位にそれぞれ対応している。
従って、標的タンパク質がウイルスプロテアーゼ、即ちＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼに由来するいくつかの実施形態では、標的タンパク質は、１５１位及び１８３位から選択される１つ以上のアミノ酸に親和性を低下させたアミノ酸変異（例えば置換）を有してもよく、アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応する。いくつかの実施形態では、１５１位に親和性を低下させたアミノ酸変異は、アスパラギン酸、アスパラギン、又はヒスチジンへの変異であり、１８３位に親和性を低下させた変異は、グルタミン酸、グルタミン、又はアラニンへの変異である。いくつかの実施形態では、１５１位における親和性を低下させたアミノ酸変異は、アスパラギン酸又はアスパラギンへの変異であり、１８３位における親和性を低下させた変異は、グルタミン酸への変異である。標的タンパク質は、本明細書に記載される別のアミノ酸変異の他に（例えば、アラニンなどへの１５４位におけるアミノ酸変異の他に）、親和性を低下させたアミノ酸変異を含んでもよい。
ある実施形態では、標的タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、１５４位にアラニン、及び１５１位にアスパラギン酸、アスパラギン又はヒスチジン（例えば、アスパラギン酸又はアスパラギン）を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応する。ある実施形態では、標的タンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するウイルスプロテアーゼに由来し、標的タンパク質は、１５４位にアラニン、１５１位にアスパラギン酸、アスパラギン又はヒスチジン（例えば、アスパラギン酸又はアスパラギン）を含み、任意選択により１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の追加の配列変異（例えば、機能的な保存的置換）を含むという点で、このウイルスプロテアーゼと異なっており、アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応する。ある実施形態では、標的タンパク質は、配列番号２１１及び２１５に記載される配列の任意の１つに対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、標的タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、１５４位にアラニン、及び１８３位にグルタミン酸、グルタミン又はアラニン（例えば、グルタミン酸）を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応する。ある実施形態では、標的タンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するウイルスプロテアーゼに由来し、標的タンパク質は、１５４位にアラニン、及び１５１位にアスパラギン酸、アスパラギン又はヒスチジン（例えば、アスパラギン酸）を含み、任意選択により１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の追加の配列変異（例えば、機能的な保存的置換）を含むという点で、このウイルスプロテアーゼと異なっており、アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応する。ある実施形態では、標的タンパク質は、配列番号２１３に記載される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
結合メンバー
本明細書で使用する場合、「結合メンバー」とは、Ｔ－ＳＭ複合体に特異的に結合するポリペプチド又はタンパク質を意味する。「特異的な」という用語は、結合メンバーがＴ－ＳＭ複合体以外の分子に任意の有意な結合を示すことのない状態を意味し得る。そのような分子は「非標的分子」と称され、標的タンパク質単体及び小分子単体、即ち、Ｔ－ＳＭ複合体の一部でないときの標的タンパク質又は小分子を含む。
いくつかの実施形態では、例えば、等温熱量測定、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、ホモジニアス時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）、マイクロスケール熱泳動法（ＭＳＴ）によって、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定したときに、非標的分子に対する結合の程度が、Ｔ－ＳＭに対する結合メンバーの結合の約１０％未満である場合、結合メンバーを非標的分子に任意の有意な結合を示さないものと見なす。いくつかの実施形態では、非標的分子に対する結合の程度は、Ｔ－ＳＭに対する結合メンバーの結合の約５％未満又は約１％未満である。ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）及びＨＴＲＦを伴う、結合の程度を測定するために使用する方法は、実施例に記載されている。いくつかの実施形態では、結合の程度をＨＴＦＲで測定する場合、本明細書に記載される結合メンバーは、別の非標的分子、例えば、標的タンパク質単体又は小分子単体に対する親和性よりも少なくとも２倍高い親和性でＴ－ＳＭ複合体に結合する。いくつかの実施形態では、結合メンバーは、別の非標的分子に対する親和性よりも少なくとも３倍、５倍、１０倍、２０倍のうちの１つにおける高い親和性でその標的分子に結合する。或いは、結合親和性の点から結合特異性を反映してもよく、本明細書に記載される結合メンバーは、別の非標的分子、例えば、標的タンパク質単体又は小分子単体に対する親和性よりも少なくとも１０倍高い親和性でＴ－ＳＭ複合体に結合する。結合親和性は、表面プラズモン共鳴法、例えばＢｉａｃｏｒｅで測定してもよい。いくつかの実施形態では、結合メンバーは、別の非標的分子に対する親和性よりも少なくとも５０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍のうちの１つにおける高い親和性でその標的分子に結合する。
結合親和性は、典型的にＫｄ（結合メンバーとその標的との間での平衡解離定数）によって測定する。十分に理解されているように、Ｋｄ値が低ければ低いほど、結合メンバーの結合親和性が高くなる。例えば、Ｔ－ＳＭ複合体に１ｎＭのＫｄで結合する結合メンバーは、非標的分子に１００ｎＭのＫｄで結合する結合メンバーよりも高い親和性でＴ－ＳＭ複合体に結合するものと見なされる。
結合メンバーは、５０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ又は１０ｎＭ以下のＫｄを有する親和性でＴ－ＳＭ複合体に結合することができる。結合メンバーは、５００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、又は１ｍＭ以上のＫｄを有する親和性で標的タンパク質単体又は小分子単体に結合することができる。結合親和性は、ＳＰＲ、例えばＢｉａｃｏｒｅで測定してもよい。ＳＰＲで測定する場合は、結合メンバーが標的タンパク質単体及び／又は小分子単体に最小限に結合するか、又は全く結合しないことを示し得る。
いくつかの実施形態では、結合メンバーは、Ｔ－ＳＭ複合体上にのみ存在し、標的タンパク質単体又は小分子単体には存在しないエピトープでＴ－ＳＭ複合体に特異的に結合する。例えば、結合メンバーは、少なくとも小分子の一部及び標的タンパク質の一部からなるＴ－ＳＭ複合体の部位に結合してもよい。或いは、Ｔ－ＳＭ複合体の形成によって標的タンパク質の立体構造の変化が誘導され、それによって結合メンバーが特異的に結合する新しいエピトープの形成が生じてもよい。結合メンバーが特異的エピトープに結合するかどうかを判断する方法としては、Ｘ線結晶構造解析、ペプチドスキャン、部位特異的突然変異誘発マッピング及び質量分析法が挙げられる。
Ｔ－ＳＭ複合体が、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ（例えば、配列番号２）に由来する標的タンパク質と、小分子であるシメプレビルとを含む実施形態では、結合メンバーは、アミノ酸の番号付けが配列番号１に対応する以下の標的タンパク質の残基：Ｔｙｒ７１、Ｇｌｙ７５、Ｔｈｒ７６、Ｖａｌ９３、Ａｓｐ９４のうちの少なくとも１つと相互作用を形成することによって、Ｔ－ＳＭに特異的に結合することができる。結合メンバーは、これらの残基のうちの１、２、３、４つ、又は最も好ましくは５つ全てと相互作用を形成することができる。結合メンバーは更に、シメプレビルのキノリン部分と相互作用を形成することにより、Ｔ－ＳＭ複合体に特異的に結合することができる。これらの相互作用の少なくともいくつかは、疎水性相互作用及び／又は水媒介相互作用によるものであってよい。相互作用は、例えば、実施例に記載するようなＸ線結晶構造解析を使用して測定することができる。
結合メンバーは、単鎖可変フラグメント又は抗体模倣体、例えばＴｎ３タンパク質などの抗体分子であってよい。
抗体分子
本開示の態様及び実施形態は、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）などの抗体分子である結合メンバーに関する。
「抗体分子」という用語は、天然に生成されたのか、又は部分的若しくは完全に合成によって生成されたのかに関わらない免疫グロブリンについて説明するものである。抗体分子は、ヒト又はヒト化抗体分子であってよい。抗体分子は、モノクローナル抗体分子であってよい。抗体の例には、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）などの免疫グロブリンのアイソタイプがあり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４などのそれらのアイソタイプのサブクラス、並びにこれらのフラグメントがある。
抗体分子は、一般的に、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、つまり、可変重（ＶＨ）領域に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）、並びに可変軽（ＶＬ）領域に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）の相補性決定領域（ＣＤＲ）から構成されている。６つのＣＤＲは共に、Ｔ－ＳＭ複合体に結合する抗体分子の一部である抗体分子のパラトープを画定する。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、各ＣＤＲの両側にフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、これによってＣＤＲに足場が提供される。Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＶＨ領域は以下の構造：Ｎ末端－［ＨＦＲ１］－［ＨＣＤＲ１］－［ＨＦＲ２］－［ＨＣＤＲ２］－［ＨＦＲ３］－［ＨＣＤＲ３］－［ＨＦＲ４］－Ｃ末端から構成され、ＶＬ領域は、以下の構造：Ｎ末端－［ＬＦＲ１］－［ＬＣＤＲ１］－［ＬＦＲ２］－［ＬＣＤＲ２］－［ＬＦＲ３］－［ＬＣＤＲ３］－［ＬＦＲ４］－Ｃ末端から構成されている。
抗体のＣＤＲ及びＦＲを定義するための異なる従来法がいくつか存在しており、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）に記載されるもの、ＬｅＦｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１５）４３（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）に記載されるようなＩＭＧＴ番号付け：Ｒｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００５）３３（ｓｕｐｐｌ １）；Ｄ６７１－Ｄ６７４に記載されるようなＤ４１３－２２、及びＶＢＡＳＥ２がある。本明細書に記載される抗体分子のＶＨ領域及びＶＬ領域のＣＤＲ及びＦＲは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ ｅｔ ａｌ（１９９１）に従って定義した。
「抗体分子」という用語は、本明細書で使用する場合、それらが関連する標的分子に結合することが示されるのであれば、抗体フラグメントを含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ２、ダイアボディー、トリアボディー、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ミニボディー及び単一ドメイン抗体（例えば、ＶｈＨ）などが挙げられる。文脈上別の解釈を要する場合を除き、本明細書で使用する場合、「抗体分子」という用語は、従って「抗体分子又はこれらの抗原結合フラグメント」に相当するものである。特定の例示的な実施形態では、抗体分子は単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
抗体分子及びそれらを構築する方法及びその使用は、当該技術分野においてよく知られており、例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ ＆ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（９）：１１２６－１１３６（２００５）に記載されている。元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を生成するために、モノクローナル抗体及び他の抗体分子を入手し、組換えＤＮＡ技術の技法を使用することが可能である。そのような技法には、１つの抗体分子のＣＤＲ又は可変領域を異なる抗体分子に導入することが含まれ得る（欧州特許出願公開第Ａ－１８４１８７号明細書、ＧＢ２１８８６３８Ａ号明細書、及び欧州特許出願公開第Ａ－２３９４００号明細書）。
モノクローナル抗体技術に関連する現在の技法の観点から、大部分の抗原に対する抗体分子を調製することができる。抗原結合ドメインは、抗体の一部（例えば、Ｆａｂフラグメント）であってもよく、又は合成抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）であってもよい。選択された抗原に好適なモノクローナル抗体は、公知の技法、例えば、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｈ Ｚｏｌａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）、及び“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｊ Ｇ Ｒ Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８２）に記載されている技法によって調製してもよい。キメラ抗体は、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８８，８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｐａｒｔ ２，７９２－７９９）で説明されている。
ＰＲＳＩＭ＿５７、ＰＲＳＩＭ＿０１、ＰＲＳＩＭ＿０４、ＰＲＳＩＭ＿６７、ＰＲＳＩＭ＿７２及びＰＲＳＩＭ＿７５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、可変重（ＶＨ）鎖、可変軽（ＶＬ）鎖、及びｓｃＦｖアミノ酸配列の配列識別名（配列番号）を以下の表に記載する。
Figure 2022541761000005
いくつかの実施形態では、抗体分子は、以下の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１～３及び／又は軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む。
ｉ）配列番号１５１、１５２、１５３、１５４、１５５及び１５６にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿５７、
ｉｉ）配列番号１５１、１５２、１９８、１５４、１５５及び１５６にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿０１、
ｉｉｉ）配列番号１５１、１５２、１６３、１５４、１５５及び１６４にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿０４、
ｉｖ）配列番号１６５、１６６、１６７、１６８、１６９及び１７０にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿６７、
ｖ）配列番号１７１、１７２、１７３、１７４、１７５及び１７６にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿７２、又は
ｖｉ）配列番号１７７、１７８、１７９、１８０、１８１及び１８２にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿７５であって、
ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って定義される。
いくつかの実施形態では、結合メンバーは、上記に定義されたＣＤＲのうちの任意の１つ以上に、多数の配列変異、例えば、１、２、３、４、又は５つの配列変異を含む。
いくつかの実施形態では、抗体分子は、以下の可変重（ＶＨ）鎖及び／又は可変軽（ＶＬ）鎖を含む。
ｉ）配列番号１８６及び１８７にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿５７、
ｉｉ）配列番号１８８及び１８９にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿０１、
ｉｉｉ）配列番号１９０及び１９１にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿０４、
ｉｖ）配列番号１９２及び１９３にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿６７、
ｖ）配列番号１９４及び１９５にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿７２、又は
ｖｉ）配列番号１９６及び１９７にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿７５。
特定の実施形態では、抗体分子は単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。典型的には、ｓｃＦｖはペプチドリンカーによって隔てられたＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む。ペプチドリンカーは本明細書で定義されるようなものであってよい。いくつかの実施形態では、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖を隔てるペプチドリンカーは、配列番号２０４のアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、以下のアミノ酸配列と少なくとも、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ｉ）配列番号１２に記載されるＰＲＳＩＭ＿５７、
ｉｉ）配列番号１０に記載されるＰＲＳＩＭ＿０１、
ｉｉｉ）配列番号１１に記載されるＰＲＳＩＭ＿０４、
ｉｖ）配列番号１３に記載されるＰＲＳＩＭ＿６７、
ｖ）配列番号１４に記載されるＰＲＳＩＭ＿７２、又は
ｖｉ）配列番号１５に記載されるＰＲＳＩＭ＿７５。
特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、以下のアミノ酸配列を含む。
ｉ）配列番号１２に記載されるＰＲＳＩＭ＿５７、
ｉｉ）配列番号１０に記載されるＰＲＳＩＭ＿０１、
ｉｉｉ）配列番号１１に記載されるＰＲＳＩＭ＿０４、
ｉｖ）配列番号１３に記載されるＰＲＳＩＭ＿６７、
ｖ）配列番号１４に記載されるＰＲＳＩＭ＿７２、又は
ｖｉ）配列番号１５に記載されるＰＲＳＩＭ＿７５。
抗体模倣体
結合メンバーは抗体模倣体であってもよい。抗体模倣体とは、抗原に特異的に結合することができるが、抗体分子とは構造上異なる有機化合物のことである。抗体模倣体の例としては、Ｔｎ３タンパク質などの足場タンパク質、アフィボディー、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フリノマー（ｆｌｙｎｏｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド、モノボディー及びナノＣＬＡＭＰが挙げられる。
特定の態様及び実施形態では、結合メンバーはＴｎ３タンパク質である。
Ｔｎ３タンパク質は、フィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（ＦｎＩＩＩ）の構造に基づくものであり、ヒトテネイシンＣの３つのＦｎＩＩＩドメインに由来する。Ｔｎ３タンパク質の生成及びその使用は、例えば、国際公開第２００９／０５８３７９号パンフレット、国際公開第２０１１／１３０３２４号パンフレット、国際公開第２０１１１３０３２８号パンフレット、及びＧｉｌｂｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ．２０１４に記載されている。
Ｔｎ３タンパク質及びテネイシンＣ由来の天然ＦｎＩＩＩドメインは、同一の三次元構造、即ち、一方に３つのβストランド（Ａ、Ｂ、及びＥ）と、もう一方に４つのβストランド（Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧ）を有するβサンドイッチ構造が、６つのループ領域によって連結される構造によって特徴付けられる。これらのループ領域は、各ループのＮ末端及びＣ末端に連結されたβストランドに応じて名付けられている。従って、ＡＢループはβストランドＡ及びＢの間に位置し、ＢＣループはストランドＢ及びＣの間に位置し、ＣＤループはβストランドＣ及びＤの間に位置し、ＤＥループはβストランドＤ及びＥの間に位置し、ＥＦループはβストランドＥ及びＦの間に位置し、ＦＧループはβストランドＦ及びＧの間に位置する。ＦｎＩＩＩドメインは、溶媒に暴露される、ランダム化を許容するループを有し、このループによって高い親和性で特定の標的に結合することができるタンパク質足場の多様なプールの生成が促進される。
野生型Ｔｎ３タンパク質は、配列番号１３４の配列を含み得る。野生型Ｔｎ３タンパク質では、ＢＣ、ＤＥ及びＦＧループは、２３～３１位、５１～５６位及び７５～８０位に位置し、アミノ酸の番号付けは配列番号１３４に対応する。Ｔｎ３タンパク質は、Ｉ３２Ｆ、Ｄ４９Ｋ、Ｅ８６Ｉ及びＴ８９Ｋからなるリストから選択される、１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ、更により好ましくは４つの安定化変異を含んでもよく、アミノ酸の番号付けは配列番号１３４に対応する。４つ全ての安定化変異を含む野生型Ｔｎ３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１３５に記載されている。Ｔｎ３タンパク質は、更にＧｉｌｂｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ．２０１４（特に、Ｇｉｌｂｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ．２０１４の表１を参照されたい）に記載される安定化変異の１つ以上を含んでもよい。
Ｔｎ３タンパク質は、抗体可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似した、ループの１つ以上をランダム化するように設計された定向進化を受けることができる。このような定向進化手法により、目的の標的、例えば本明細書に記載されるＴ－ＳＭ複合体に対して高い親和性を有する抗体様結合メンバーの生成がもたらされる。
従って、本明細書に記載されるＴ－ＳＭ複合体に特異的に結合するＴｎ３タンパク質は、ＰＲＳＩＭ＿２３、ＰＲＳＩＭ＿３２、ＰＲＳＩＭ＿３３、ＰＲＳＩＭ＿３６又はＰＲＳＩＭ＿４７のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループを含んでもよい。例えば、Ｔｎ３タンパク質は、配列番号１３４又は配列番号１３５の配列を含んでもよく、２３～３１位、５１～５６位及び７５～８０位にそれぞれ位置するＢＣ、ＤＥ及びＦＧループは、ＰＲＳＩＭ＿２３、ＰＲＳＩＭ＿３２、ＰＲＳＩＭ＿３３、ＰＲＳＩＭ＿３６又はＰＲＳＩＭ＿４７のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループに置換され、アミノ酸の番号付けは配列番号１３４に対応する。
当業者であれば、本明細書に記載されるＰＲＳＩＭクローンのＢＣ、ＤＥ及びＦＧループのアミノ酸配列を容易に決定することができるだろう。例えば、ＰＲＳＩＭクローンのアミノ酸配列を野生型Ｔｎ３タンパク質のアミノ酸配列、例えば、配列番号１３４又は１３５に記載されるアミノ酸配列のものと比較することができる。
Ｔｎ３配列、アミノ酸位置、及びＰＲＳＩＭ＿２３、ＰＲＳＩＭ＿３２、ＰＲＳＩＭ＿３３、ＰＲＳＩＭ＿３６、又はＰＲＳＩＭ＿４７のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループの配列は、以下の表に記載する通りである。
Figure 2022541761000006
いくつかの実施形態では、Ｔｎ３タンパク質は、以下のＢＣ、ＤＥ、及びＦＧループを含む。
ｉ）配列番号１３６、１３７、及び１３８にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿２３、
ｉｉ）配列番号１３９、１４０、及び１４１にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿３２、
ｉｉｉ）配列番号１４２、１４３、及び１４４にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿３３、
ｉｖ）配列番号１４５、１４６、及び１４７にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿３６、又は
ｖ）配列番号１４８、１４９、及び１５０にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿４７。
いくつかの実施形態では、Ｔｎ３タンパク質は、以下のＢＣ、ＤＥ、及びＦＧループを含む。
ｉ）ＢＣループが配列番号５の２３～３２位にアミノ酸を含み、ＤＥループが配列番号５の５２～５７位にアミノ酸を含み、及びＦＧループが配列番号５の７６～８５位にアミノ酸を含むＰＲＳＩＭ＿２３、
ｉｉ）ＢＣループが配列番号６の２３～３４位にアミノ酸を含み、ＤＥループが配列番号６の５４～５９位にアミノ酸を含み、及びＦＧループが配列番号６の７８～８７位にアミノ酸を含むＰＲＳＩＭ＿３２、
ｉｉｉ）ＢＣループが配列番号７の２３～３４位にアミノ酸を含み、ＤＥループが配列番号７の５４～５９位にアミノ酸を含み、及びＦＧループが配列番号７の７８～８７位にアミノ酸を含むＰＲＳＩＭ＿３３、
ｉｖ）ＢＣループが配列番号８の２３～３４位にアミノ酸を含み、ＤＥループが配列番号８の５４～５９位にアミノ酸を含み、及びＦＧループが配列番号８の７８～８７位にアミノ酸を含むＰＲＳＩＭ＿３６、
ｖ）ＢＣループが配列番号９の２３～３１位にアミノ酸を含み、ＤＥループが配列番号９の５１～５６位にアミノ酸を含み、及びＦＧループが配列番号９の７５～８４位にアミノ酸を含むＰＲＳＩＭ＿４７。
いくつかの実施形態では、Ｔｎ３タンパク質は、上記に定義されたＢＣ、ＤＥ及びＥＦループのうちの任意の１つ以上に、多数の配列変異、例えば、１、２、３、４、又は５つの配列変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｔｎ３タンパク質は、上記に定義されたＢＣ、ＤＥ及びＥＦループの外側に、多数の配列変異、例えば、１、２、３、４、又は５つの配列変異を含む。
いくつかの実施形態では、Ｔｎ３タンパク質は、以下のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ｉ）配列番号５に記載されるＰＲＳＩＭ＿２３、
ｉｉ）配列番号６に記載されるＰＲＳＩＭ＿３２、
ｉｉｉ）配列番号７に記載されるＰＲＳＩＭ＿３３、
ｉｖ）配列番号８に記載されるＰＲＳＩＭ＿３６、又は
ｖ）配列番号９に記載されるＰＲＳＩＭ＿４７。
特定の実施形態では、Ｔｎ３タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含む。
ｉ）配列番号５に記載されるＰＲＳＩＭ＿２３、
ｉｉ）配列番号６に記載されるＰＲＳＩＭ＿３２、
ｉｉｉ）配列番号７に記載されるＰＲＳＩＭ＿３３、
ｉｖ）配列番号８に記載されるＰＲＳＩＭ＿３６、又は
ｖ）配列番号９に記載されるＰＲＳＩＭ＿４７。
二量体誘導タンパク質
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は第１の構成ポリペプチドに融合され、結合メンバーは第２の構成ポリペプチドに融合されている。特定の実施形態では、第１及び第２の構成ポリペプチドが二量体誘導タンパク質の一部を形成する。
本明細書で使用する場合、「二量体誘導タンパク質」とは、第１及び第２の構成ポリペプチドを含むタンパク質又は複合体を意味し、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが二量体化すると機能タンパク質を形成する。「二量体誘導タンパク質」という用語は、「スプリットタンパク質」、「二量体化欠損タンパク質」及び「スプリット複合体」を含む。「構成ポリペプチド」という用語は、単鎖ポリペプチドと多鎖ポリペプチドの両方を包含することを意図する。二量体誘導タンパク質内の第１及び第２の構成ポリペプチドは、典型的に、分離されているときは活性がないか又は乏しい活性を有するが、二量体化することによってそれらが近接すると、これによって活性化するか又は活性が増大する。実施例に記載するように、本明細書に記載される特定の結合メンバー、標的タンパク質、及び小分子を組み合わせることで、二量体誘導タンパク質の二量体化を調節することができ、これによって結合メンバーがＴ－ＳＭ複合体と結合するときに、二量体誘導タンパク質単体の別個の成分と比較して活性の著しい増大が観察されるようになる。
二量体誘導タンパク質の例としては、スプリットキメラ抗原受容体（スプリットＣＡＲ；例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２０１５に記載されている）、スプリットキナーゼ（例えば、Ｃａｍａｃｈｏ－Ｓｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２０１４に記載されている）、スプリット転写因子（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．２０１０に記載されている）、スプリットアポトーシスタンパク質（例えば、Ｃｈｅｌｕｒ ｅｔ ａｌ．２００７に記載されているようなスプリットカスパーゼ）、スプリットレポーターシステム（例えば、Ｄｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１６に記載されている）が挙げられる。
二量体誘導タンパク質は、結合メンバーがＴ－ＳＭ複合体と結合するときに活性が増大する。活性の増大は、結合メンバーが（例えば、標的タンパク質、小分子又は結合メンバーの１つ以上が存在しないために）Ｔ－ＳＭ複合体と結合しないときに観察される活性と比較することができる。いくつかの実施形態では、結合メンバーがＴ－ＳＭ複合体に結合するときに観察される活性の増大は、結合メンバーがＴ－ＳＭ複合体と結合しないときに観察される活性と比較して、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１０５倍、１１０倍、１１５倍、又は１２０倍の活性の増大となる。
二量体誘導タンパク質の活性を測定する方法は、試験する特定の二量体誘導タンパク質に応じて異なる。第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化してキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成する場合、ＣＡＲの活性は、免疫細胞の活性及び／又は増殖を測定することによって判断することができる。実施例に記載するように、ＣＡＲの活性は、抗原でＣＡＲを刺激した後のインターロイキン－２（ＩＬ－２）の産生によって、例えばＥＬＩＳＡにより測定することができる。第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化してキナーゼを形成する場合、キナーゼの活性は、Ｃａｍａｃｈｏ－Ｓｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２０１４に記載されるように、ホスフェート、例えば放射性３２Ｐをペプチド基質に組み込むことによって測定することができる。第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化して転写因子を形成する場合、転写活性は、実施例に記載するように、スプリット転写因子によって調節された下流の所望の発現カセットの発現を測定することによって判断することができる。第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化して治療用タンパク質を形成する場合、この活性は、タンパク質の機能活性を判断するのに好適なアッセイを使用して測定することができる。第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化してカスパーゼを形成する場合、カスパーゼ活性は、カスパーゼ活性アッセイを使用して、又はアポトーシス細胞死を測定することによって測定することができる。第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化してレポーターシステムを形成する場合、レポーター活性は、レポーター、例えばルシフェラーゼの発現を測定することによって判断することができる。
第１の構成ポリペプチドは、標的タンパク質又は結合メンバーのＣ末端又はＮ末端に融合されていてもよい。第２の構成ポリペプチドは、標的タンパク質又は結合メンバーのＣ末端又はＮ末端に融合されていてもよい。構成ポリペプチドは、ペプチドリンカーを介して標的タンパク質又は結合メンバーに融合されていてもよい。好適なペプチドリンカーとしては、［Ｇ］ｎ、［ｓ］ｎ、［Ａ］ｎ、［ＧＳ］ｎ、［ＧＧＳ］ｎ、［ＧＧＧＳ］ｎ（配列番号２３９）、［ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２４０）、［ＧＧＳＧ］ｎ（配列番号２４１）、［ＧＳＧＧ］ｎ（配列番号２４２）、［ＳＧＧＧ］ｎ（配列番号２４３）、［ＳＳＧＧ］ｎ（配列番号２４４）、［ＳＳＳＧ］ｎ（配列番号２４５）、［ＧＧ］ｎ、［ＧＧＧ］ｎ、［ＳＡ］ｎ、［ＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ］ｎ（配列番号１８５）及びそれらの組み合わせで表されるものが挙げられ、ｎは１～３０の整数である。例えば、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は最大３０までの任意の数であってよい。構成ポリペプチドは、例えば、第１の構成ポリペプチド－ペプチドリンカー－標的タンパク質の構成で、標的タンパク質又は結合メンバーに直接融合されていてもよい。或いは、構成ポリペプチドは、標的タンパク質又は結合メンバーから第１の構成ポリペプチドを隔てる１つ以上の追加のポリペプチドによって、例えば、第１の構成ポリペプチド－追加のポリペプチド－ペプチドリンカー－標的タンパク質によって、間接的に標的タンパク質又は結合メンバーに融合されていてもよい。
いくつかの実施形態では、第１の構成ポリペプチドは、２つ以上の標的タンパク質又は結合メンバーに融合されている。いくつかの実施形態では、第２の構成ポリペプチドは、２つ以上の標的タンパク質若しくは結合メンバー、又はその両方の組み合わせに融合されている。例えば、第１又は第２の構成ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０つの結合メンバーに融合されていてもよい。いくつかの実施形態では、第１又は第２の構成ポリペプチドは、２～１０つ、又は２～５つの結合メンバーに融合されている。特定の実施形態では、第１又は第２の構成ポリペプチドは、３つの結合メンバーに融合されている。例えば、第１又は第２の構成ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０つの標的タンパク質に融合されていてもよい。いくつかの実施形態では、第１又は第２の構成ポリペプチドは、２～１０つ、又は２～５つの標的タンパク質に融合されている。特定の実施形態では、第１又は第２の構成ポリペプチドは、３つの標的タンパク質に融合されている。複数の結合メンバー又は標的タンパク質が存在する場合、それらは、例えば上記に記載したペプチドリンカーのようなペプチドリンカーによって互いに融合されていてもよい。
スプリット転写因子
二量体誘導タンパク質は、スプリット転写因子であってよい。いくつかの実施形態では、第１の構成ポリペプチドはＤＮＡ結合ドメインを含み、第２の構成ポリペプチドは転写調節ドメインを含み、第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドが二量体化すると転写因子を形成する。「転写因子を形成する」とは、所望の発現産物の転写調節活性を再構成することが可能となるように、第１及び第２の構成ポリペプチドを十分に近接するように近づけることを意味する。二量体誘導タンパク質は、結合メンバーがＴ－ＳＭ複合体と結合するときに転写調節活性が増大するが、この転写調節活性は、結合メンバーがＴ－ＳＭ複合体と結合していないときに観察される転写調節活性と比較して増大している。
転写調節ドメインは、スプリット転写因子が結合している遺伝子の転写を上方制御することができる転写活性化ドメインであり得る。好適な転写活性化ドメインとしては、核内因子κＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ ＆ Ｂａｒｉｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０－５６１８（１９９８）及びＤｏｙｌｅ ＆ Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８：２９３７－２９４２（１９９７））；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３－２８（１９９８））；複製及び転写活性化因子（ＲＴＡ；Ｌｕｋａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７３，９３４８－６１（１９９９））、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，５９５２－５９６２（１９９７）を参照されたい）、核内ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３－３８３（１９９８）を参照されたい）、又はＶＰ６４などの人工キメラ機能ドメイン（Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４６２３－３３）、及びデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊ．１８，６４３９－６４４７）が挙げられる。更なる例示的な活性化ドメインとしては、Ｏｃｔ １、Ｏｃｔ－２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ－２、及びＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４９６１－４９６８（１９９２）、並びにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ及びＥＲＦ－２が挙げられる。例えば、Ｒｏｂｙｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９－３４７；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３：２５５－２７５；Ｌｅｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：１－１１；Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ－Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７－８９；ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３－１２；Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７－２８３；及びＬｅｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９－５０４を参照されたい。更なる例示的な活性化ドメインとしては、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、ＡＲＦ－６、ＡＲＦ－７及びＡＲＦ－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰ、並びにＴＲＡＢ１、並びに改変Ｃａｓ９トランス活性化因子タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：２１－２９；Ｏｋａｎａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：８７－９９；Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２９８－３０９；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：４１９－４２９；Ｕｌｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５８４４－５８４９；Ｓｐｒｅｎｇｅｒ－Ｈａｕｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１－８；Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３－４４；Ｈｏｂｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５，３４８－１５，３５３；及びＰｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９７３－９７６）を参照されたい。転写活性化ドメインは、上記の例示的な活性化ドメインの任意の組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態では、複数の転写活性化ドメインは、例えば、同一のドメインのタンデムリポート（ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｏｒｔ）又は異なるドメインの融合体を使用してもよい。いくつかの実施形態では、転写活性化ドメインはＶＰＲであり、ＶＰ６４、ｐ６５及びＲｔａドメインから構成される三分子活性化ドメインである。ＶＰＲを含むＴＲＤ－Ｔ融合タンパク質の例は、配列番号２２５に記載されている（ＮＳ４Ａ／３ ＰＲ Ｓ１３９Ａ－ＶＰＲ）。転写活性化因子としてのＶＰＲの生成及びその使用は、例えば、Ｃｈａｖｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１５に記載されている。いくつかの実施形態では、転写活性化ドメインはＨＳＦ－１であり、任意選択によりｐ６５と組み合わされる。
或いは、転写調節ドメインは、スプリット転写因子が結合している遺伝子の転写を下方制御することができる転写抑制ドメインであってよい。転写抑制ドメインとしては、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－β誘導初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、及びＭｅＣＰ２が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４５１－４５４；Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４３－４４６；Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４７－４５０；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８－３４２を参照されたい。更なる例示的な抑制ドメインとしては、ＲＯＭ２及びＡｔＨＤ２Ａが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：３０５－３２１；及びＷｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１９－２７を参照されたい。
ＤＮＡ結合ドメインは、配列特異的な様式で標的配列に結合する任意のタンパク質であってよい。例えば、ＤＮＡ結合ドメインは、配列特異的な様式で標的配列に結合する転写因子又はそれらのＤＮＡ結合フラグメントであってもよく、又はそれらを含んでもよい。特異的様式で標的配列に結合可能な任意の転写因子又はそのＤＮＡ結合フラグメントを、本明細書で開示されるスプリット転写因子と共に使用することができることが予期される。ＤＮＡ結合ドメインは、ヒト転写因子由来の結合ドメインなどの、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインであってもよく、又はそれを含んでもよい。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｖａｑｕｅｒｉｚａｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）（例えば、補足情報Ｓ３に列記されているもののいずれか）に記載されるヒト転写因子、又はこれらのＤＮＡ結合フラグメントのいずれかであってよい。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガーファミリー、ホメオドメインファミリー若しくはヘリックス・ループ・ヘリックスファミリー、又はこれらのＤＮＡ結合フラグメントのメンバーであってよい。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーホメオドメイン転写因子１（ＺＦＨＤ１）であってよい。ＺＦＨＤ１は、Ｚｉｆ２６８転写因子及びＯｃｔ－１ホメオドメイン由来のジンクフィンガー１及び２を含んでいる。ＺＦＨＤ１の設計及び構築は、例えば、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．１９９５に記載されている。
ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、メガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＩｓｃｅＩに基づく）、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来のＤＮＡ結合ドメインなどのＤＮＡ結合ドメインであってよいか、又はこれらを含んでもよい。これらの結合ドメインは、選択した標的配列、例えば、細胞内に天然に存在する（内在性の）標的遺伝子の標的配列、又はトランス型でもたらされる標的配列（例えば、第３の発現カセットの一部として）に結合するように改変することができる。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを特定の標的配列に結合するように改変することは、例えば、米国特許第６４５３２４２Ｂ１号明細書に記載されている。一実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインである。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを特定の標的配列に結合するように改変することは、例えば、国際公開第２０１００７９４３０Ａ１号パンフレットに記載されている。一実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、メガヌクレアーゼ由来の改変ＤＮＡ結合ドメインである。メガヌクレアーゼを特定の標的配列に結合するように改変することは、例えば、国際公開第２００７０４７８５９Ａ１号パンフレットに記載されている。メガヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断することがないように改変することができる。一実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来の改変ＤＮＡ結合ドメインである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来のＤＮＡ結合ドメインを特定の配列に結合するように改変することは、例えば、国際公開第２０１３１７６７７２Ａ１号パンフレットに記載されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、一般的に、会合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びその標的配列間の相補性によって特異的ＤＮＡ配列を誘導する、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を必要とする。従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来の改変ＤＮＡ結合ドメインは、典型的に、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９又はその変異体）とガイドＲＮＡとの複合体を含んでいる。Ｃａｓ９の変異体は、エンドヌクレアーゼ活性を欠くものの、ＤＮＡと相互作用する機能を保持するように生成されている。例えば、転写調節方法の中でヌクレアーゼヌル（ｄＣａｓ９）変異体の使用について記載している、Ｃｈａｖｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１５を参照されたい。従って、ＤＮＡ結合ドメインは、標的配列に特異的な特定のｇＲＮＡを加えると、標的配列に結合するヌクレアーゼヌルＣａｓ９変異体を含み得る。ＤＮＡ結合ドメインとしてｄＣａｓ９を含むＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質の例は、配列番号２２７に記載されている（ｓｐｄＣａｓ９－ＰＲＳＩＭ＿２３×３）。ＤＢＤ－ＢＭをヒトＩＬ－２に標的化するガイドＲＮＡの一例は、配列番号２２９に記載されている。ｄＣａｓ９変異体をスプリット転写因子の一部として使用することは、Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．２０１８及び国際公開第２０１８／２１３８４８Ａ１号パンフレットに記載されている。
結合メンバーは、転写調節ドメイン又はＤＮＡ結合ドメインに融合されていてもよい。
いくつかの実施形態では、
（１）第１の構成ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインを含み、標的タンパク質に融合されてＤＢＤ－Ｔ融合タンパク質を形成し、
第２の構成ポリペプチドは、転写調節ドメインを含み、結合メンバーに融合されてＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質を形成し、又は、
（２）第１の構成ポリペプチドは、転写調節ドメインを含み、標的タンパク質に融合されてＴＲＤ－Ｔ融合タンパク質を形成し、
第２の構成ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインを含み、結合メンバーに融合されてＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質を形成し、
ＤＮＡ結合ドメイン、標的タンパク質、転写調節ドメイン、及び結合メンバーは、本明細書に更に定義される通りである。
ある実施形態では、
（１）第１の構成ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインを含み、標的タンパク質に融合されてＤＢＤ－Ｔ融合タンパク質を形成し、標的タンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２の構成ポリペプチドは、転写調節ドメインを含み、結合メンバーに融合されてＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質を形成し、又は、
（２）第１の構成ポリペプチドは、転写調節ドメインを含み、標的タンパク質に融合されてＴＲＤ－Ｔ融合タンパク質を形成し、標的タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、
第２の構成ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインを含み、結合メンバーに融合されてＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質を形成し、
（１）又は（２）のいずれかにおいて、
ａ）結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿２３のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループ、又はＴｎ３配列を含み、
ｂ）結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿３２のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループ、又はＴｎ３配列を含み、
ｃ）結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿３３のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループ、又はＴｎ３配列を含み、
ｄ）結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿３６のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループ、又はＴｎ３配列を含み、
ｅ）結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿４７のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループ、又はＴｎ３配列を含み、
ｆ）結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿５７のＨＣＤＲ及び／若しくはＬＣＤＲ、又はＶＨ配列及び／若しくはＶＬ配列を含み、
ｇ）結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿０１のＨＣＤＲ及び／若しくはＬＣＤＲ、又はＶＨ配列及び／若しくはＶＬ配列を含み、
ｈ）結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿０４のＨＣＤＲ及び／若しくはＬＣＤＲ、又はＶＨ配列及び／若しくはＶＬ配列を含み、
ｉ）結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿６７のＨＣＤＲ及び／若しくはＬＣＤＲ、又はＶＨ配列及び／若しくはＶＬ配列を含み、
ｊ）結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿７２のＨＣＤＲ及び／若しくはＬＣＤＲ、又はＶＨ配列及び／若しくはＶＬ配列を含み、又は
ｋ）結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿７５のＨＣＤＲ及び／若しくはＬＣＤＲ、又はＶＨ配列及び／若しくはＶＬ配列を含む。
ＤＢＤ－Ｔ融合タンパク質は、配列番号４５に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態では、上記（１）に定義されるＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質は、配列番号５７～６７のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
ＴＲＤ－Ｔ融合タンパク質は、配列番号４４に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態では、上記（２）に定義されるＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質は、配列番号４６～５６のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
実施例に記載するように、例示的な結合メンバーの一部は、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写調節ドメインのいずれかとの融合に優先傾向を示し、それによって、特定の結合メンバーがＤＮＡ結合ドメインに結合しているのか、又は転写調節ドメインに融合しているのかに応じて転写調節活性が増大することが観察された。従って、いくつかの実施形態では、
（１）第１の構成ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインを含み、標的タンパク質に融合されてＤＢＤ－Ｔ融合タンパク質を形成し、標的タンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２の構成ポリペプチドは、転写調節ドメインを含み、結合メンバーに融合されてＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質を形成し、
ここで、
ａ）ＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質の結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿２３のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループ、又はＴｎ３配列を含み、
ｂ）ＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質の結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿４７のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループ、又はＴｎ３配列を含み、又は
ｃ）ＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質の結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿０４のＨＣＤＲ及び／若しくはＬＣＤＲ、又はＶＨ配列及び／若しくはＶＬ配列を含み、
ｄ）ＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質の結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿７２のＨＣＤＲ及び／若しくはＬＣＤＲ、又はＶＨ配列及び／若しくはＶＬ配列を含み、
ｅ）ＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質の結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿６７のＨＣＤＲ及び／若しくはＬＣＤＲ、又はＶＨ配列及び／若しくはＶＬ配列を含み、又は
ｆ）ＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質の結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿７５のＨＣＤＲ及び／若しくはＬＣＤＲ、又はＶＨ配列及び／若しくはＶＬ配列を含み、或いは
（２）第１の構成ポリペプチドは、転写調節ドメインを含み、標的タンパク質に融合されてＴＲＤ－Ｔ融合タンパク質を形成し、標的タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、
第２の構成ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインを含み、結合メンバーに融合されてＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質を形成し、
ここで、
ｇ）ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質の結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿２３のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループ、又はＴｎ３配列を含み、
ｈ）ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質の結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿０１のＨＣＤＲ及び／若しくはＬＣＤＲ、又はＶＨ配列及び／若しくはＶＬ配列を含み、
ｉ）ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質の結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿５７のＨＣＤＲ及び／若しくはＬＣＤＲ、又はＶＨ配列及び／若しくはＶＬ配列を含み、
ｊ）ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質の結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿３２のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループ、又はＴｎ３配列を含み、
ｋ）ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質の結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿３３のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループ、又はＴｎ３配列を含み、又は
ｌ）ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質の結合メンバーは、ＰＲＳＩＭ＿３６のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループ、又はＴｎ３配列を含む。
いくつかの実施形態では、結合メンバー又は標的タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に融合されている。他の実施形態では、結合メンバー又は標的タンパク質は、転写調節ドメインのＮ末端に融合されている。結合メンバー又は標的タンパク質は、ペプチドリンカー、例えば、上記で述べた１つ以上のペプチドリンカーを介してＤＮＡ結合ドメイン又は転写調節ドメインに融合されていてもよい。特定の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１８５）又はＳＡを有する。
実施例に記載するように、ＰＲＳＩＭ＿２３は、どちらの配置においても強力な遺伝子発現調節をもたらすことが見出された。従って、いくつかの実施形態では、
（１）第１の構成ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインを含み、標的タンパク質に融合されてＤＢＤ－Ｔ融合タンパク質を形成し、標的タンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２の構成ポリペプチドは、転写調節ドメインを含み、結合メンバーに融合されてＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質を形成し、又は
（２）第１の構成ポリペプチドは、転写調節ドメインを含み、標的タンパク質に融合されてＴＲＤ－Ｔ融合タンパク質を形成し、標的タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、
第２の構成ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインを含み、結合メンバーに融合されてＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質を形成し、
（１）又は（２）のいずれかにおいて、結合メンバーはＰＲＳＩＭ＿２３のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループ又はＴｎ３配列を含む。
特定の実施形態では、
（１）ＤＢＤ－Ｔ融合タンパク質は、配列番号４５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質は、配列番号５７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、又は
（２）ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質は、配列番号４６に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＲＤ－Ｔ融合タンパク質は、配列番号４４に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
また、実施例に示されるように、ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤを、活性化ＣＲＩＳＰＲ（ＣＲＩＳＰＲａ）システムに適用することもできる。これを使用して、例えば内在性遺伝子調節を促進することができる。
従って、いくつかの実施形態では、ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質は、配列番号２２７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＲＤ－Ｔ融合タンパク質は、配列番号２２５に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。前記標的配列に特異的な特定のガイドＲＮＡを使用することによって、ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質を標的配列に誘導することができる。
実施例に示されるように、複数コピーの標的タンパク質又は結合メンバーに融合されたＤＮＡ結合ドメインを含むスプリット転写因子は、単一コピーの標的タンパク質又は結合メンバーに融合されたＤＮＡ結合ドメインを含むスプリット転写因子と比較して、発現が増加したことが示された。
従って、いくつかの実施形態では、
ＤＢＤ－Ｔ融合タンパク質は、複数コピーの標的タンパク質（例えば、２、３、４、５つ以上の標的タンパク質）に融合されたＤＮＡ結合ドメインを含み、又は
ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質は、複数コピーの標的タンパク質（例えば、２、３、４、５つ以上の結合メンバー）に融合されたＤＮＡ結合ドメインを含む。
複数の結合メンバー又は複数の標的タンパク質は、リンカー、例えば、上記で述べたような１つ以上のペプチドリンカーによって隔てられていてもよい。特定の例示的な実施形態では、ＤＢＤ－Ｔ融合タンパク質は、３つの標的タンパク質に融合されたＤＮＡ結合ドメインを含むか、又は、ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質は、３つの結合メンバーに融合されたＤＮＡ結合ドメインを含む。
第１及び／又は第２の構成ポリペプチドは、（例えば、ＳＶ４０中型Ｔ抗原由来などのような）核局在化シグナルを更に含んでもよい。
スプリット転写因子はまた、第３の発現カセットを備えてもよく、第３の発現カセットは所望の発現産物をコードし、転写因子が所望の発現産物の発現を調節することができるように、第３の発現カセット内の標的配列にスプリット転写因子のＤＮＡ結合ドメインが結合する。「発現を調節することができる」とは、ＤＮＡ結合ドメインが標的配列に結合することができ、転写調節ドメインによって転写因子を形成すると（即ち、二量体誘導タンパク質が二量体化すると）、所望の発現産物の発現を調節する（増加又は減少させる）転写調節活性を有するということを意味することが意図される。所望の発現産物はＲＮＡであってもよく、又はペプチド性（ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質）のものであってよい。所望の発現産物は、ペプチド性のものであることが好ましい。所望の発現産物は、治療用タンパク質、即ち、対象において治療効果を発揮するタンパク質であってよい。
標的配列は、所望の発現産物のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターに位置してもよく、又はプロモーターに近接した位置にあってもよい 「近接している」とは、標的配列が、プロモーターに対応する配列の５００ｂｐ以内、２５０ｂｐ以内、１００ｂｐ以内、５０ｂｐ以内、又は２５ｂｐ以内にあることを意味する。
スプリットキメラ抗原受容体
二量体誘導タンパク質は、スプリットキメラ抗原受容体（スプリットＣＡＲ）であってよい。
ＣＡＲは、抗体様認識機能とＴ細胞活性化機能との両方を組み合わせたものである。ＣＡＲは、典型的に、例えば抗体に由来する抗原特異的認識ドメイン、ＣＡＲをＴ細胞に固定する膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及び持続性を誘導し、形質導入Ｔ細胞のエフェクター機能をトラフィッキングする１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインで構成されている。ＣＡＲの設計及びその使用は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１３に記載されている。
スプリットＣＡＲは、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２０１５に記載されているように、ＣＡＲを活性化するために、外来性の、使用者によって提供されるシグナルを必要とするように設計されている。これらのスプリット受容体、抗原結合成分、及び細胞内シグナル伝達成分は、ヘテロ二量体化する小分子の存在下でのみ会合し、それによって使用者がＴ細胞活性化のタイミング、位置、及び投与量を正確に制御することが可能となる。そのようなスプリットＣＡＲは、例えばオフターゲット効果をそれほど誘導しないため、毒性を緩和することが期待されている。
一実施形態では、二量体誘導タンパク質は、
共刺激ドメインを含み、本明細書で定義されるような標的タンパク質に融合されている、第１の構成ポリペプチドと、
細胞内シグナル伝達ドメインを含み、本明細書で定義されるような結合メンバーに融合されている、第２の構成ポリペプチドとを含む。
上記で述べた第１の構成ポリペプチドは、抗原特異的認識ドメイン及び膜貫通ドメインを更に含んでもよく、第２の構成ポリペプチドは、膜貫通ドメイン及び第２の共刺激ドメインを更に含み、第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化するとキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成する。「ＣＡＲを形成する」とは、第１及び第２の構成ポリペプチドを、完全に機能的なＣＡＲを再構成することが可能となるように十分に近接するように近づけることを意味する。
別の実施形態では、二量体誘導タンパク質は、
細胞内シグナル伝達ドメインを含み、本明細書で定義されるような標的タンパク質に融合されている、第１の構成ポリペプチドと、
第１の共刺激ドメインを含み、本明細書で定義されるような結合メンバーに融合されている、第２の構成ポリペプチドとを含む。
上記で述べた第１の構成ポリペプチドは、膜貫通ドメイン及び第２の共刺激ドメインを更に含んでもよく、第２の構成ポリペプチドは、抗原特異的認識ドメイン及び膜貫通ドメインを更に含み、第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化するとキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成する。
スプリットＣＡＲは、結合メンバーがＴ－ＳＭ複合体と結合するときに活性が増大するが、この活性は、結合メンバーがＴ－ＳＭ複合体と結合していないときに観察される活性と比較して増大している。
一実施形態では、第１の構成ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、
ｉ）抗原特異的認識ドメインと、
ｉｉ）膜貫通ドメインと、
ｉｉ）第１の共刺激ドメインとを含み、
第２の構成ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、
ｉ）膜貫通ドメインと、
ｉｉ）第２の共刺激ドメインと、
ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドが二量体化するとＣＡＲを形成する。
いくつかの実施形態では、標的タンパク質及び結合メンバーは、第１及び第２の構成ポリペプチドのＣ末端からそれぞれの膜貫通ドメインにかけての位置で融合されている。例えば、標的タンパク質又は結合メンバーは、第１及び第２の構成ポリペプチドのそれぞれの共刺激ドメインのＮ末端又はＣ末端に融合されていてもよい。特定の実施形態では、標的タンパク質及び結合メンバーのうちの一方が第１の共刺激ドメインのＣ末端に融合され、他方が第２の共刺激ドメインのＣ末端に融合されている。
例えば、一実施形態では、第１の構成ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、
ｉ）抗原特異的認識ドメインと、
ｉｉ）膜貫通ドメインと、
ｉｉｉ）第１の共刺激ドメインとを含み、
第２の構成ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、
ｉ）膜貫通ドメインと、
ｉｉ）第２の共刺激ドメインと、
ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
標的タンパク質は第１の共刺激ドメインのＣ末端に融合され、結合メンバーは第２の共刺激ドメインのＣ末端に融合される。
例えば、別の実施形態では、第１の構成ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、
ｉ）抗原特異的認識ドメインと、
ｉｉ）膜貫通ドメインと、
ｉｉｉ）第１の共刺激ドメインとを含み、
第２の構成ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、
ｉ）膜貫通ドメインと、
ｉｉ）第２の共刺激ドメインと、
ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
結合メンバーは第１の共刺激ドメインのＣ末端に融合され、標的タンパク質は第２の共刺激ドメインのＣ末端に融合される。
標的タンパク質及び／又は結合メンバーは、それぞれの共刺激ドメインを対象にして融合されていてもよい。より好ましくは、標的タンパク質及び結合メンバーは、ペプチドリンカーによってそれぞれの共刺激ドメインから隔てられていてもよい。ペプチドリンカーは、本明細書で更に定義されるようなものであってよい。いくつかの実施形態では、標的タンパク質及び結合メンバーは、配列番号２０４に記載されるアミノ酸配列を含むリンカーによってそれぞれの共刺激ドメインから隔てられている。同様に、ペプチドリンカーによって、第１及び第２の構成ポリペプチドの様々なドメインが隔てられていてもよい。例えば、膜貫通ドメインは、ペプチドリンカー、例えば、アミノ酸配列ＧＳを含むペプチドリンカーによって第２の共刺激ドメインから隔てられていてもよく、及び／又は、第２の共刺激ドメインは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号２０４に記載されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーによって細胞内シグナル伝達ドメインから隔てられていてもよい。
好適な共刺激ドメインの非限定的な例としては、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、及びＨＶＥＭ由来の活性化ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、第１及び第２の共刺激ドメインは、４－１ＢＢ活性化ドメインである。
好適な細胞内シグナル伝達ドメインの非限定的な例としては、抗原受容体の結合後に協調してシグナル伝達を開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び共受容体の細胞質配列、同様にこれらの配列のあらゆる誘導体又は変異体、及び同一の機能的能力を有するあらゆる合成配列が挙げられるが、これらに限定されない。特定の細胞内シグナル伝達ドメインには、免疫受容活性化チロシンモチーフ、即ちＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含むものがある。シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータに由来する。
膜貫通ドメインは、天然源又は合成源のいずれかに由来するものであってよい。供給源が天然である場合、ドメインは任意の膜結合型タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来するものであってよい。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖若しくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来するもの、又はＩｇＧ４などの免疫グロブリンに由来するもの（即ち、少なくともそれらの膜貫通領域を含む）であってよい。或いは、膜貫通ドメインは合成されていてもよく、その場合は、主にロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含むことになる。合成膜貫通ドメインの各末端には、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットが見られる場合がある。任意選択により、好ましくは長さが２～１０個のアミノ酸の短いオリゴペプチド又はポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間の連結部を形成してもよい。特に好適なリンカーは、グリシン－セリンダブレットによってもたらされる。特定の実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ２８に由来するものである。
第１及び第２のポリペプチドは更に、第１及び／又は第２のポリペプチドのＮ末端から膜貫通ドメインにかけて、ＩｇＧ４又はＣＤ８ａヒンジドメインなどのヒンジドメインを含んでもよい。ヒンジドメインの例は、例えば、Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１７に記載されている。特定の実施形態では、ヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインである。
本開示の二量体誘導タンパク質に使用するのに好適な抗原特異的認識ドメインは、任意の抗原結合ポリペプチドであってよく、多種多様な抗原結合ポリペプチドが当技術分野において公知である。場合によっては、抗原結合ドメインは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。他の抗体に基づく認識ドメインであるｃＡｂ ＶＨＨ（ラクダ科の動物の抗体可変ドメイン）及びそのヒト化バージョン、ＩｇＮＡＲ ＶＨ（サメの抗体可変ドメイン）及びそのヒト化バージョン、ｓｄＡｂ ＨＶ（単一ドメイン抗体の可変ドメイン）、並びに「ラクダ化」抗体可変ドメインが、使用するのに好適である。場合によっては、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、ｖ ｖβを含む単鎖２ドメインＴＣＲ）などのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に基づく認識ドメインもまた、使用するのに好適である。
特定の実施形態では、抗原特異的認識ドメインは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。他の箇所に記載されているように、ｓｃＦｖは、ＶＬ鎖からペプチドリンカー、例えば、配列番号２０４に記載されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーによって隔てられているＶＨ鎖を典型的に含む。
本開示の二量体誘導タンパク質に使用するのに好適な抗原特異的認識ドメインは、様々な抗原結合特異性を有し得る。場合によっては、抗原結合ドメインは、癌細胞によって発現した（合成された）抗原、即ち癌細胞関連抗原に存在するエピトープに特異的である。癌細胞関連抗原とは、例えば、乳癌細胞、Ｂ細胞リンパ腫細胞、ホジキンリンパ腫細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫細胞、肺癌細胞（例えば、小細胞肺癌細胞）、非ホジキン性Ｂリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫細胞、肺癌細胞（例えば、小細胞肺癌細胞）、黒色腫細胞、慢性リンパ性白血病細胞、急性リンパ性白血病細胞、神経芽細胞腫細胞、膠腫細胞、神経膠芽腫細胞、髄芽腫細胞、結腸直腸癌細胞などと関連する抗原であってよい。癌細胞関連抗原はまた、非癌性細胞によって発現されたものであってもよい。
特定の例示的な実施形態では、スプリットＣＡＲに使用される標的タンパク質はＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼに由来するものであり、小分子はシメプレビルであり、結合メンバーはＰＲＳＩＭ＿２３に基づくものである（例えば、ＰＲＳＩＭ＿２３のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループ又はＴｎ３配列を含み、任意選択により本明細書に記載される配列同一性及び／又は変異を有する）。
いくつかの実施形態では、第１の構成ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、
ｉ）抗原特異的認識ドメインと、
ｉｉ）膜貫通ドメインと、
ｉｉｉ）第１の共刺激ドメインとを含み、
第２の構成ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、
ｉ）膜貫通ドメインと、
ｉｉ）第２の共刺激ドメインと、
ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
標的タンパク質は、第１の共刺激ドメインのＣ末端に融合され、結合メンバーは、第２の共刺激ドメインのＣ末端に融合され、標的タンパク質に融合された第１の構成ポリペプチドは、配列番号７０に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、結合メンバーに融合された第２の構成ポリペプチドは、配列番号２００に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択により、抗原特異的認識ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、Ｎ末端から配列番号７０に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列にかけて位置する。
いくつかの実施形態では、第１の構成ポリペプチドは、Ｎ末端から抗原特異的認識ドメインにかけて位置する第１のシグナルペプチドを含む。第１のシグナルペプチドは、配列番号２０１又は配列番号２０２に記載されるアミノ酸配列を含んでもよい。例示的な実施形態では、第１のシグナルペプチドは配列番号２０１に記載されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第２の構成ポリペプチドは、Ｎ末端から膜貫通ドメインにかけて位置する第２のシグナルペプチドを含む。第２のシグナルペプチドは、配列番号２０１又は配列番号２０２に記載されるアミノ酸配列を含んでもよい。例示的な実施形態では、第２のシグナルペプチドは配列番号２０２に記載されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第２の構成ポリペプチドは、配列番号２０３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書で開示されるスプリットＣＡＲを含む改変免疫細胞も提供される。一実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。本明細書で開示されるスプリットＣＡＲを発現させるように免疫細胞を遺伝子組換えする方法も提供される。この方法はエキソビボで行うことができる。方法は、免疫細胞の表面にスプリットＣＡＲが発現するように、本明細書に記載される１つ以上の発現ベクターを免疫細胞に投与することを含み得る。
スプリットレポーターシステム
二量体誘導タンパク質は、スプリットレポーターシステムであってよい。スプリットレポーターシステムは、第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化すると、観察可能な表現型を提供する酵素又は蛍光タンパク質であってよい。観察可能な表現型は、比色シグナル、発光シグナル又は蛍光シグナルであってよい。スプリットレポーターシステムの特定の例は、Ｄｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１７に示されている。
いくつかの実施形態では、第１の構成ポリペプチドは、第１のレポーター成分を含み、第２の構成ポリペプチドは、第２のレポーター成分を含み、第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドが二量体化するとレポーターシステムを形成し、任意選択により、レポーターシステムは、結合メンバーがＴ－ＳＭ複合体と結合するときに、比色シグナル、発光シグナル、又は蛍光シグナルの増大をもたらす。
スプリットアポトーシスタンパク質
二量体誘導タンパク質は、スプリットアポトーシスタンパク質であってよい。スプリットアポトーシスタンパク質とは、スプリットアポトーシスタンパク質の第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化するとアポトーシスを誘導することができる、任意のタンパク質である。スプリットアポトーシスタンパク質の一例は、二量体化するとアポトーシスを誘導することができるスプリットカスパーゼ（例えば、スプリットカスパーゼ９又はスプリットカスパーゼ３）であり、従ってスプリットアポトーシスタンパク質を含む特定の細胞（例えば、疾患細胞、又は細胞療法のために投与された治療用細胞）を死滅させるのに使用することができる。スプリットカスパーゼの例は、Ｃｈｅｌｕｒ ｅｔ ａｌ．２００７に示されている。誘導カスパーゼ９自殺遺伝子システムの使用については、例えば、Ｇａｒｇｅｔｔ ｅｔ ａｌ．２０１４に記載されている。
いくつかの実施形態では、第１の構成ポリペプチドは、第１のカスパーゼ成分を含み、第２の構成ポリペプチドは、第２のカスパーゼ成分を含み、第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化するとカスパーゼを形成する。スプリットカスパーゼは、結合メンバーがＴ－ＳＭ複合体と結合するときに、細胞死を誘導することが可能であり得る。
ある実施形態では、第１及び第２のカスパーゼ成分は同一のものであり、例えば、どちらのカスパーゼ成分もカスパーゼ９活性化ドメインを含んでいる。例示的なカスパーゼ９活性化ドメインは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＯ２１１３３．１（バージョン１：最終更新２００９年１２月１日）として提供されるヒトカスパーゼ９アミノ酸配列のアミノ酸残基１５２～４１４として提供されている。第１及び第２のカスパーゼ成分が同一のものである場合、第１及び第２のカスパーゼ成分は同一の発現カセットによりコードされていてもよい。例えば、スプリットアポトーシスタンパク質は、標的タンパク質、結合メンバー、及びカスパーゼ９活性化ドメインをコードする１つ以上の発現カセットによりコードされていてもよく、標的タンパク質及び結合メンバーの両方がカスパーゼ９活性化ドメインに融合されている。発現させると、標的タンパク質、結合メンバー、及びカスパーゼ９活性化ドメインを含む複数のタンパク質が産生され、小分子を添加することによって、カスパーゼ９活性化ドメイン（即ち、少なくとも第１及び第２のカスパーゼ９活性化ドメイン）の二量体化を調節することができる。
ある例示的な実施形態では、スプリットアポトーシスタンパク質は、配列番号２２３と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
他の二量体誘導タンパク質
本開示で使用することが想定される他の二量体化タンパク質としては、スプリット治療用タンパク質、スプリットＴＥＶプロテアーゼ、及びスプリットＣａｓ９が挙げられる。スプリット治療用タンパク質とは、スプリット治療用タンパク質の第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化すると治療効果を発揮することができる、任意のタンパク質のことである。
ウイルスベクター及びウイルス粒子
一実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターである。使用するのに好適なウイルスベクターとしては、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アルファウイルスベクター、フラビウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、ニューカッスル病ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、及びピコルナウイルスベクターが挙げられる。
本明細書で使用する場合、ウイルスベクターとは、ウイルス粒子の会合に必要となる成分と共に細胞内に発現する場合、発現カセットがウイルス粒子内にパッケージングされたウイルスゲノムに転換されるような第１及び第２の発現カセットを含む、ＤＮＡ発現ベクターを意味する。更に、一実施形態では、ウイルスベクターは、所望の発現産物をコードする第３の発現カセットを含む。
特定の実施形態では、発現ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶは、最も盛んに研究された遺伝子療法のビヒクルの１つであり、優れた安全性プロファイルと、幅広い標的組織における高効率の形質導入とを特徴とするものである。遺伝子療法のベクターとしてＡＡＶを使用することについては、例えば、Ｎａｓｏ ｅｔ ａｌ．２０１７及びＣｏｌｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．２０１８に記載されている。
ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．２ＦＦ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ ｒｈ１０を含む様々なＡＡＶ血清型、並びにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５及びＡＡＶ２／６などのシュードタイプ化されたＡＡＶを本開示に従って使用することも可能である。血清型及びそれらの単離の更なる例は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，２００６に記載されている。
ＡＡＶ粒子は、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリー由来の小型の（２５ｎｍ）ウイルスであり、約４．８ｋｂの直鎖状一本鎖ＤＮＡゲノムを含む非エンベロープ型の二十面体のカプシド（タンパク質シェル）から構成されている。ＡＡＶゲノムは、いくつかのタンパク質産物、即ち４つの非構造Ｒｅｐタンパク質、３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１－３）、及びアセンブリー活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードする。ＡＡＶ遺伝子は、ＡＡＶに特異的な回文構造の２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）に挟まれている。
従って、発現ベクターがＡＡＶベクターである場合、ＡＡＶ粒子の会合に必要となる成分と共に細胞内で発現する場合、発現カセットがＡＡＶ粒子内にパッケージングされた一本鎖ゲノムに転換されるように、ＩＴＲによって第１及び第２の発現カセットが挟まれている（例えば、ＩＴＲ－第１の発現カセット－第２の発現カセット－ＩＴＲ）ことを意味し得る。
ＡＡＶベクターは、例えば、それらの機能を向上させるために改変してもよい。臨床遺伝子療法のために改変されたＡＡＶの例は、Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ，２０１４に記載されている。
ＡＡＶベクターは５ｋｂ未満のパッケージング容量を有するが、それによってウイルスゲノムに導入することができる遺伝子材料（例えば、発現カセット）のサイズが制限される可能性がある。本明細書に示されるように、Ｔｎ３タンパク質及びｓｃＦｖなどの比較的サイズの小さい成分を結合メンバーとして使用することによって、三分子複合体（例えば、スプリット転写因子などの二量体誘導タンパク質の一部としての）をコードする発現カセットを単一のＡＡＶベクター内に適合させることができる。更に本明細書に示されるように、三分子複合体をコードする小型のサイズの発現カセットによって、導入遺伝子（例えば、第３の発現カセットの一部としての）をスプリット転写因子の成分と同一のＡＡＶベクターに導入することができ、それによってスプリット転写因子を導入遺伝子と「シス」で送達することが可能となる。
本開示はまた、ウイルス粒子をインビトロで作製する方法を含む。一実施形態では、ウイルス粒子の作製方法は、本明細書で記載されるようなウイルスベクターで哺乳類細胞などの宿主細胞を形質移入することと、粒子を細胞内に形成するために必要となるウイルスタンパク質を発現させることと、細胞がウイルス粒子を産生するように形質移入細胞を培地で培養することとを含む。ウイルス粒子を培地に放出してもよく、或いは、本方法は、粒子を溶解し、細胞溶解物から粒子を単離することを更に含んでもよい。好適な哺乳類細胞の一例は、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞である。
典型的に、ウイルス粒子を生成する様々なタンパク質成分を生成するためには、複数のプラスミド発現ベクターが利用される。ウイルスパッケージング成分を恒常的に発現する細胞株を利用することも可能であり、それによって少ないプラスミドの使用が可能となる。
例えば、ＡＡＶ粒子を構築するには、Ｒｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質、並びにＡＡＶの複製を媒介するアデノウイルス由来の追加の遺伝子が必要となる。ＡＡＶ粒子の作製については、例えば、Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１７に記載されている。
ＡＡＶ粒子を生成する例示的な方法は、Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１７に記載されている。要約すると、この方法は、ＨＥＫ２９３細胞などの哺乳類細胞を、３つのプラスミドで形質移入することを含む。１つのベクターは、それらの内在性プロモーターを使用してＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子（ｐＲｅｐＣａｐ）をコードし、１つのベクター（ｐＨｅｌｐｅｒ）は、ＨＥＫ２９３細胞には存在しない３つの更なるアデノウイルスヘルパー遺伝子（Ｅ４、Ｅ２Ａ及びＶＡ ＲＮＡ）をコードし、１つのベクター（ウイルスベクター）（ｐＡＡＶ－ＧＯＩ）は、２つのＩＴＲによって挟まれた１つ以上の発現カセットを含んでいる。Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．の図２を参照されたい。
ウイルス粒子が放出された後に、ウイルス粒子を含む培地を回収してもよく、任意選択によりウイルス粒子を細胞溶解物から分離してもよい。任意選択により、ウイルス粒子を濃縮してもよい。
生成及び任意選択による濃縮の後、細胞への投与による使用及び／又は療法における使用に備えて、ウイルス粒子を、例えば－８０℃で凍結して保存してもよい。
本開示はまた、例えば、本明細書に記載される方法により生成されるＡＡＶ粒子などのウイルス粒子を提供するものである。本明細書で使用する場合、ウイルス粒子は、細胞、例えば哺乳類細胞に感染することができる、ウイルスエンベロープ内にパッケージングされたウイルスゲノムを含む。
ウイルスゲノムを含む１つ以上のウイルス粒子が本明細書に開示され、ウイルスゲノムは、
ｉ）標的タンパク質と小分子との間で複合体（Ｔ－ＳＭ複合体）を形成するように、標的タンパク質が小分子に結合可能である、標的タンパク質と、
ｉｉ）結合メンバーが標的タンパク質単体及び小分子単体の両方に結合するよりも高い親和性でＴ－ＳＭ複合体に結合するように、Ｔ－ＳＭ複合体に特異的に結合する結合メンバーとをコードし、
標的タンパク質はウイルスプロテアーゼに由来し、小分子はウイルスプロテアーゼ阻害剤である。一実施形態では、標的タンパク質は第１の構成ポリペプチドに融合され、結合メンバーは第２の構成ポリペプチドに融合されている。
また、１つ以上のウイルス粒子が本明細書に開示され、ウイルス粒子は、
ｉ）標的タンパク質をコードする第１の発現カセットであって、標的タンパク質と小分子との間で複合体（Ｔ－ＳＭ複合体）を形成するように、標的タンパク質が小分子に結合することができる、第１の発現カセットと、
ｉｉ）結合メンバーをコードする第２の発現カセットであって、結合メンバーが、標的タンパク質単体及び小分子単体の両方に結合するよりも高い親和性でＴ－ＳＭ複合体に結合するように、Ｔ－ＳＭ複合体に特異的に結合する、第２の発現カセットとを含み、
標的タンパク質は非ヒトタンパク質に由来し、小分子は非ヒト標的タンパク質の阻害剤であり、第１及び第２の発現カセットが１つ以上のウイルス粒子内のウイルスゲノムの一部を形成する。一実施形態では、非ヒトタンパク質はウイルスプロテアーゼに由来し、小分子はウイルスプロテアーゼ阻害剤である。一実施形態では、標的タンパク質は第１の構成ポリペプチドに融合され、結合メンバーは第２の構成ポリペプチドに融合されている。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の発現カセットは、同一のウイルス粒子のウイルスゲノムの一部を形成する。他の実施形態では、第１の発現カセットが第１のウイルス粒子の第１のウイルスゲノムに位置し、第２の発現カセットが第２のウイルス粒子の第２のウイルスゲノムに位置する。
発現カセット、標的タンパク質、結合メンバー、小分子、並びに第１及び第２の構成ポリペプチドは、更に上記に定義される通りのものであってよい。使用されるウイルス粒子に応じて、ウイルスゲノムは一本鎖核酸又は二本鎖核酸であってもよく、ＲＮＡ又はＤＮＡであってもよい。例えば、ウイルス粒子がＡＡＶ粒子である場合、ウイルスゲノムは一本鎖ＤＮＡウイルスゲノムである。ウイルスゲノムは、上記に定義したようなスプリットタンパク質をコードしてもよい。
遺伝子療法
薬剤（即ち、１つ以上の発現ベクター、発現産物又はウイルス粒子、加えて小分子）を、疾患の治療方法又は予防方法の一環として患者に投与してもよい。結合メンバーがＴ－ＳＭ複合体に結合した後に、レシピエント個体が治療を受けた障害又は疾患の症状の低減を経験することがある。このことは、個体の病状に有益な効果を有し得る。
「治療」という用語は、病状の治療に関連して本明細書で使用する場合、一般的に、例えば、病状の進行の抑制などの何らかの所望の治療効果が達成される、ヒトの治療及び療法に関連し、進行速度の低下、進行速度の停止、病状の退行、病状の改善、及び病状の治癒を含む。予防的措置としての治療（即ち、予防、防止）もまた含まれる。
「予防」とは、本明細書との関連では、完全な成功、即ち完全な保護又は完全な防止に限局するものと理解すべきではない。本明細書でいう予防とはむしろ、症候性状態が感知される前に、その特定の病状を遅らせることを促進し、特定の病状を軽減又は回避することによって健康状態を保つことを目的として施される措置を指す。
治療方法は、本明細書に更に定義されるような１つ以上の二量体誘導タンパク質を細胞内に発現させることを含み得る。二量体誘導タンパク質は、例えば、二量体化すると治療用ポリペプチドを形成する、第１の構成ポリペプチド及び第２の構成ポリペプチドを含む。このように、小分子を添加することによって活性の増大した治療用タンパク質をもたらすことができ、例えば、治療用タンパク質を欠損する場合の疾患の治療方法にこれを使用することができる。
細胞内で所望の発現産物の発現を調節する方法が開示され、方法は、
ｉ）細胞内で本明細書に記載される二量体誘導タンパク質を発現することであって、第１及び第２の構成ポリペプチドが二量体化すると転写因子を形成し、転写因子が細胞内で所望の発現産物の発現を調節する（即ち、増加又は減少させる）ことができるようにＤＮＡ結合ドメインが細胞内の標的配列に結合することと、ｉｉ）所望の発現産物の発現を調節するために、小分子を細胞に投与することとを含む。
更に、ヒト対象又は動物対象の細胞内で所望の発現産物の発現を調節する方法に使用される二量体誘導タンパク質が本明細書に開示され、方法は、本明細書に記載される二量体誘導タンパク質を細胞内に発現させることであって、第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化すると転写因子を形成することと、所望の発現産物の発現を調節する（例えば、増加又は減少させる）ために、小分子を細胞に投与することとを含む。また、ヒト対象又は動物対象の細胞内で所望の発現産物の発現を調節する方法に使用される小分子が本明細書に開示され、方法は、本明細書に記載される二量体誘導タンパク質を細胞内に発現させることであって、第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化すると転写因子を形成することと、所望の発現産物の発現を調節する（例えば、増加又は減少させる）ために、小分子を細胞に投与することとを含む。
方法は、二量体誘導タンパク質を細胞内に発現させるために、本明細書に記載されるような１つ以上の発現ベクター又はウイルス粒子を投与することを含み得る。他の実施形態では、方法は、１つ以上の発現ベクター、例えば、二量体誘導タンパク質をコードするｍＲＮＡから産生された発現産物を細胞に投与することを含み得る。個々の投与は、医師に共通する一般知識を用いた用量、及び熟練施術者に公知の投与計画を更に選択する医師の判断に従うものとする。
所望の発現産物はＲＮＡであってもよく、又はペプチド性（ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質）のものであってよい。所望の発現産物は、ペプチド性のものであることが好ましい。所望の発現産物は、治療用タンパク質、即ち、対象において治療効果を発揮するタンパク質であってよい。
所望の発現産物は、標的細胞のゲノムに存在する内在性遺伝子の一部であってよい。例えば、方法がヒト細胞で実行された場合、所望の発現産物はヒト遺伝子の一部であってよい。或いは、所望の発現産物は、標的細胞に送達される導入遺伝子、例えば、治療用導入遺伝子の一部であってよい。疾患の治療方法又は予防方法に、遺伝子発現の調節を用いてもよい。スプリット転写因子を発現させ、小分子を投与した後に、レシピエント個体が治療を受けた障害又は疾患の症状の低減を示すことがある。このことは、個体の病状に有益な効果を有し得る。
標的配列が、細胞に送達される導入遺伝子の一部である場合、方法は、所望の発現産物をコードし、標的配列を含む第３の発現カセットを、細胞に投与することを更に含み得る。導入遺伝子は、所望の発現産物のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含んでもよく、この所望の発現産物は、治療用タンパク質、例えば治療用抗体であってもよい。治療用抗体の一例は、配列番号２０５として記載される重鎖アミノ酸配列と、配列番号２０６として記載される軽鎖アミノ酸配列とを有するＭＥＤＩ８８５２である。第３の発現カセットは、第１及び第２の発現カセットの一方又は両方と同一の発現ベクター又はウイルス粒子の一部であってよい。換言すれば、導入遺伝子は、同一のウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子内などでスプリット転写因子と「シス」で細胞に送達することができる。或いは、第３の発現カセットは、第１及び第２の発現カセットの一方又は両方とは異なる発現ベクター又はウイルス粒子の一部であってよい。換言すれば、導入遺伝子は、別々のウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子内などでスプリット転写因子と「トランス」で細胞に送達することができる。本明細書に示されるように、本開示のスプリット転写因子は、導入遺伝子と「シス」及び「トランス」の両方で送達するのに好適である。
標的配列は、所望の発現産物のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターに位置してもよく、又はプロモーターに近接した位置にあってもよい。「近接している」とは、標的配列が、プロモーターに対応する配列の５００ｂｐ以内、２５０ｂｐ以内、１００ｂｐ以内、５０ｂｐ以内、又は２５ｂｐ以内にあることを意味する。
細胞への投与は、任意の好適な手段によって行ってもよい。例えば、発現カセットを、例えば本明細書に記載されるウイルス粒子の一部としてのウイルス性手段、又は非ウイルス性手段によって送達してもよい。送達のための非ウイルス性手段としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又はポリリピッド：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤により増強されたＤＮＡの取り込みが挙げられる。一実施形態では、発現カセットはｍＲＮＡとして送達される。一実施形態では、発現カセットはＤＮＡプラスミドとして送達される。
本明細書で開示されるインビボにおける方法のいずれかにおいて、小分子をヒト対象に経口投与、例えばカプセル剤、錠剤、水性懸濁液又は溶液などの許容される剤形で投与してもよい。使用量は、治療を受ける宿主及び特定の投与方法による。小分子は、単回用量、複数回用量として、又は確立された期間にわたって投与してもよい。
方法がウイルス粒子を細胞に投与することに関する場合、投与されるウイルス粒子の用量を基準にして単位用量を算出してもよい。ウイルス用量には、特定のウイルス粒子の数、即ちプラーク形成単位（ｐｆｕ）又はウイルスゲノムコピー（ｖｇｃ）が含まれる。ＡＡＶを伴う実施形態の場合、特定の単位用量は、体重ｋｇ当たり１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６ウイルスゲノムコピー（ｖｇｃ）を含む。粒子用量は、感染に対して欠陥のある粒子の存在によって多少高くなる（１０～１００倍）可能性がある。
理論に束縛されるものではないが、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）による細胞の感染及び形質導入は、以下のような一連の連続的な事象によって発生すると考えられている：ウイルスカプシドと標的細胞の表面上の受容体との相互作用、エンドサイトーシスによる内部移行、エンドサイトーシス／プロテアソーム区画を通じての細胞内輸送、エンドソーム脱出、核内移行、ビリオンの脱外被、及びウイルス粒子内のウイルスゲノムによってコードされるタンパク質の転写及び発現をもたらす、ウイルスＤＮＡ二本鎖の転換。
１つ以上の発現ベクター、発現産物、ウイルス粒子、及び小分子を単体で使用する（例えば、投与する）ことが可能である一方で、例えば、薬学的に許容されるキャリア又は希釈剤と共に、個々の成分を組成物又は製剤として提示することが好ましいことが多い。例えば、１つ以上のウイルス粒子は、１つ以上のウイルス粒子と薬学的に許容されるキャリア又は希釈剤とを含む薬学的組成物として投与してもよい。別の例として、小分子は、小分子と薬学的に許容されるキャリア又は希釈剤とを含む医薬組成物として投与してもよい。
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で使用する場合、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー性応答、又はその他の問題又は合併症がなく、妥当なリスク／ベネフィット比に見合った、当該対象（例えば、ヒト）の組織と接触させて使用するのに好適な化合物、原料、材料、組成物、剤形などに関する。各キャリア、希釈剤、賦形剤などもまた、製剤のその他の原料と適合性であるという意味で、「許容される」ものでなければならない。
薬剤（即ち、１つ以上の発現ベクター、ＤＮＡプラスミド又はウイルス粒子、加えて小分子）は、同時投与又は順次投与してもよく、個々に異なる投与スケジュールで投与してもよく、異なる経路で投与してもよい。例えば、順次投与する場合、薬剤を短い間隔で（例えば、５～１０分間の期間にわたって）投与することができ、又はより長い間隔で（例えば、１、２、３、４時間以上隔てて、若しくは必要であれば更により長い期間を隔てて）投与することができ、正確な投与計画は投与する薬剤の特性に見合うものである。一実施形態では、１つ以上の発現ベクター、ＤＮＡプラスミド又はウイルス粒子を投与した後に、小分子を投与する。
細胞療法
また、細胞療法の方法が提供される。細胞療法は、二量体誘導タンパク質などの発現産物を発現するように遺伝子改変された細胞を、患者に投与することを伴う。
細胞療法の方法に、幹細胞などの細胞を使用してもよい。幹細胞の使用に関する１つの潜在的利点は、幹細胞をインビトロで他の細胞型に分化させることができ、それらを骨髄に移植した哺乳類（その細胞のドナーなど）に導入することができることである。好適な幹細胞としては、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、心筋幹細胞及び間葉系幹細胞が挙げられる。
例えば、細胞療法は、細胞によって二量体誘導タンパク質が発現されるように、本明細書に記載される１つ以上の発現ベクターをエキソビボでの方法で細胞（例えば、幹細胞）に投与することと、この細胞を患者に投与することとを含み得る。二量体誘導タンパク質を発現する細胞を投与した後、小分子を個体に投与し、第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとの二量体化を誘導して、二量体化したときにそれらの機能を再構成してもよい。例えば、第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化して転写因子を形成してもよく、又は第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化してＣＡＲを形成してもよい。
本明細書に定義される二量体誘導タンパク質を発現する細胞を患者に投与することを含む治療方法が開示され、方法は、
ｉ）細胞を個体に投与することと、
ｉｉ）小分子を個体に投与することとを含む。
二量体誘導タンパク質は、例えば、スプリット転写因子、スプリットＣＡＲ、スプリットアポトーシスタンパク質、又はスプリット治療用タンパク質であってよい。治療方法は、癌を治療する方法であってよい。
細胞療法は、患者から細胞を単離することと、１つ以上の発現ベクターで細胞をエキソビボで形質移入することと、細胞を患者に投与することとを含み得る。エキソビボでの形質移入に好適な様々な細胞型は、当業者によく知られている（例えば、患者から細胞を単離して培養する方法についての説明は、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ ｅｄ．１９９４）及びそこに引用されている参照文献を参照されたい）。
例えば、細胞療法は、患者から細胞を単離することと、細胞によって二量体誘導タンパク質が発現するように、本明細書に記載される１つ以上の発現ベクターをエキソビボでの方法で細胞に投与することと、この細胞を患者に再度投与することとを含み得る。二量体誘導タンパク質を発現する細胞を投与した後に、小分子を個体に投与し、本明細書で記載されるような第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとの二量体化を誘導してもよい。
一実施形態では、細胞は免疫細胞（Ｔ細胞など）であり、細胞によって発現する二量体誘導タンパク質はスプリットＣＡＲである。ＣＡＲ Ｔ細胞療法に関する治療方法は当技術分野において公知であり、例えば、Ｍｉｌｉｏｔｏｕ ａｎｄ Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｕ，２０１８に記載されている。
第１の構成ポリペプチドと第２の構成ポリペプチドとが二量体化するとＣＡＲを形成する、本明細書に定義される二量体誘導タンパク質を発現する細胞を、それらの患者に投与することを含む治療方法が開示され、方法は、
ｉ）細胞を個体に投与することと、
ｉｉ）小分子を個体に投与することとを含む。
治療方法は、癌を治療する方法であってよい。
核酸
本開示はまた、本明細書に定義される結合メンバー又は二量体誘導タンパク質をコードする核酸分子を提供する。核酸分子は、単離核酸分子であってよい。結合メンバー及び二量体誘導タンパク質をコードする核酸は、発現ベクターに関して本明細書で記載されるような必要とされる特徴と配列同一性とを有し得る。当業者であれば、当該技術分野において公知の方法を使用して、そのような核酸分子を調製することは難しいことではない。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＰＲＳＩＭ＿５７、ＰＲＳＩＭ＿０１、ＰＲＳＩＭ＿０４、ＰＲＳＩＭ＿６７、ＰＲＳＩＭ＿７２、又はＰＲＳＩＭ＿７５のＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインをコードする。それらのＶＨドメイン又はＶＬドメインのアミノ酸配列は、本明細書に定義されている。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＰＲＳＩＭ＿２３、ＰＲＳＩＭ＿３２、ＰＲＳＩＭ＿３３、ＰＲＳＩＭ＿３６、ＰＲＳＩＭ＿４７、ＰＲＳＩＭ＿５７、ＰＲＳＩＭ＿０１、ＰＲＳＩＭ＿０４、ＰＲＳＩＭ＿６７、ＰＲＳＩＭ＿７２、又はＰＲＳＩＭ＿７５の結合メンバーをコードする。それらの結合メンバーのアミノ酸配列は、本明細書に定義されている。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＰＲＳＩＭ＿２３、ＰＲＳＩＭ＿３２、ＰＲＳＩＭ＿３３、ＰＲＳＩＭ＿３６、ＰＲＳＩＭ＿４７、ＰＲＳＩＭ＿５７、ＰＲＳＩＭ＿０１、ＰＲＳＩＭ＿０４、ＰＲＳＩＭ＿６７、ＰＲＳＩＭ＿７２、又はＰＲＳＩＭ＿７５に記載される例示的な核酸配列と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＰＲＳＩＭ＿２３、ＰＲＳＩＭ＿３２、ＰＲＳＩＭ＿３３、ＰＲＳＩＭ＿３６、ＰＲＳＩＭ＿４７、ＰＲＳＩＭ＿５７、ＰＲＳＩＭ＿０１、ＰＲＳＩＭ＿０４、ＰＲＳＩＭ＿６７、ＰＲＳＩＭ＿７２、又はＰＲＳＩＭ＿７５の核酸配列を含む。それらの例示的な結合メンバーの核酸配列を以下の表に記載する。
Figure 2022541761000007
いくつかの実施形態では、核酸分子は、上記に記載したような標的タンパク質又は結合メンバーに融合される、第１の構成ポリペプチド及び／又は第２の構成ポリペプチドをコードする。それらの構成ポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書に定義されている。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、上記に記載したようなＤＢＤ－Ｔ融合タンパク質、ＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質、ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質、及びＴＲＤ－Ｔ融合タンパク質のうちの１つ以上をコードする。それらの融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書に定義されている。
いくつかの実施形態では、ＴＲＤ－Ｔ融合タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１０８に記載される核酸配列と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＴＲＤ－Ｔ融合タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１０８の核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＤＢＤ－Ｔ融合タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１０９に記載される核酸配列と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＤＢＤ－Ｔ融合タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１０９の核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１１０～１２０に記載される核酸配列のいずれか１つと、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１１０～１２０のいずれか１つの核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１２１～１３１に記載される核酸配列のいずれか１つと、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１２１～１３１のいずれか１つの核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、本明細書で定義されるようなスプリットＣＡＲをコードする。いくつかの実施形態では、スプリットＣＡＲをコードする核酸分子は、配列番号１３３に記載される核酸配列及び抗原特異的認識ドメインをコードする核酸配列と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、スプリットＣＡＲをコードする核酸分子は、配列番号１３３の核酸配列及び抗原特異的認識ドメインをコードする核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、スプリットＣＡＲをコードする核酸分子は、６６位と６７位との間に位置する抗原特異的認識ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）をコードする核酸配列を含み、ヌクレオチドの番号付けは配列番号１３３に対応する。
単離核酸分子を使用して、本明細書で開示される結合メンバー又は二量体誘導タンパク質を発現させてもよい。核酸は、例えば、本明細書に記載される発現ベクターの特徴を有する１つ以上の発現ベクターの形で一般的に提供される。
キット
本開示はまた、全て本明細書で定義されるような、１つ以上の発現ベクター、１つ以上のウイルス粒子、細胞、又は１つ以上の核酸を含み、同様に本明細書で定義されるような小分子を備えたキットを提供する。いくつかの実施形態では、小分子はシメプレビルである。１つ以上の発現ベクター又は核酸が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来するＤＮＡ結合ドメインを含有するポリペプチドをコードする場合、キットは、標的配列に特異的なガイドＲＮＡ、又は標的配列に特異的なガイドＲＮＡをコードする核酸を更に含み得る。
配列同一性及び変異
配列同一性は、一般的に、アルゴリズムＧＡＰ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＧＣＧパッケージ、Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＵＳＡ）を参照して定義される。ＧＡＰは、ニードルマン及びブンシュアルゴリズムを使用して、一致する数を最大に、ギャップの数を最小にして２つの完全な配列をアライメントする。一般的に、ギャップ生成ペナルティが１２と等しく、ギャップ伸長ペナルティが４と等しいデフォルトのパラメータを使用する。ＧＡＰを使用することが好ましいこともあるが、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）の方法を使用する）、又はスミス－ウォーターマンアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１））、又は前出のＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）のＴＢＬＡＳＴＮプログラムなどのその他のアルゴリズムを使用してもよく、一般的にデフォルトのパラメータを使用する。特に、ｐｓｉ－Ｂｌａｓｔアルゴリズムを使用してもよい。
本開示で参照アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する特定のアミノ酸配列について言及する場合、参照アミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。
「配列変異」という用語は、本明細書で使用する場合、アミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入を包含することが意図される。従って、参照配列と比較される１つ以上のアミノ酸配列変異を含むタンパク質は、参照配列と比較して、アミノ酸残基の１つ以上の置換、１つ以上の欠失、及び／又は１つ以上の挿入を含んでいる。本明細書における「アミノ酸変異」という用語はまた、文脈上明確に別の意味を特定している場合を除き、「配列変異」と互換的に使用される。
１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されているいくつかの実施形態では、置換は、例えば以下の表に従った保存的置換であってよい。いくつかの実施形態では、中欄の同一のブロック内のアミノ酸が置換され、即ち、例えば非極性のアミノ酸が別の非極性のアミノ酸に置換される。いくつかの実施形態では、右端の欄の同じ行のアミノ酸が置換され、即ち、例えばＧがＡ又はＰに置換される。
Figure 2022541761000008
いくつかの実施形態では、置換は機能的な保存的置換であってよい。即ち、いくつかの実施形態では、置換は、同等の非置換タンパク質と比較して、置換を含むタンパク質の１つ以上の機能的特性（例えば、結合親和性）に影響を与えない（又は実質的に影響を与えない）ものであってよい。
結合メンバーはまた、本明細書で開示されるようなＢＣ、ＤＥ若しくはＦＧループ、Ｔｎ３、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、及び／又はｓｃＦｖ配列の変異体を含んでもよい。好適な変異体は、配列変異、又は突然変異、及びスクリーニングによる方法によって得ることができる。好ましい実施形態では、１つ以上の変異体配列を含む結合メンバーは、Ｔ－ＳＭ複合体に対する結合特異性及び／又は結合親和性などの、親結合メンバーの機能特性の１つ以上を保持する。例えば、１つ以上の変異体配列を含む結合メンバーは、（親）結合メンバーと同一の親和性、又はそれよりも高い親和性でＴ－ＳＭ複合体に結合することが好ましい。親結合メンバーとは、変異体の結合メンバーに組み込まれているアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を含まない結合メンバーのことである。
例えば、結合メンバーは、本明細書に開示されるＢＣ、ＤＥ若しくはＦＧループ、Ｔｎ３、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はｓｃＦｖ配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＢＣ、ＤＥ若しくはＦＧループ、Ｔｎ３、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はｓｃＦｖ配列を含んでもよい。
結合メンバーは、本明細書に開示されるＢＣ、ＤＥ若しくはＦＧループ、Ｔｎ３、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はｓｃＦｖ配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変異（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは２０個以下の変異、１５個以下の変異、１０個以下の変異、５個以下の変異、４個以下の変異、３個以下の変異、２個以下の変異、又は１個の変異を有するＢＣ、ＤＥ若しくはＦＧループ、Ｔｎ３、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はｓｃＦｖ配列を含んでもよい。
＊＊＊
上記の説明、又は以下の請求項、又は添付の図面に開示された特徴は、それらの特定の形態、又は開示された機能を実施するための手段、若しくは開示された結果を得るための方法若しくはプロセスの観点から表現されており、これらを利用して、必要に応じてそのような特徴を個々に又は任意に組み合わせて、本開示をその多様な形態で実現することができる。
上記に記載した例示的な実施形態と共に本開示を説明してきたが、本開示を与えられたとき、当該技術分野の当業者には、多くの同等の変更及びバリエーションが明らかになるであろう。従って、上記に記載された本開示の例示的な実施形態は実例的なものであり、限定するものではないと見なされる。本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、説明された実施形態に様々な変更が加えられてもよい。
いかなる疑問を避けるために、本明細書で提供されるあらゆる理論的説明は、読者の理解を向上させる目的で提供される。本発明者らは、これらの理論的説明のいずれにも拘束されることを望まない。
本明細書で使用されるあらゆる項目の表題は、構成上の目的のためにのみ使用されるものであり、説明される主題を限定するものとして解釈すべきでない。
以下の特許請求の範囲を含む本明細書の全体を通じて、文脈上別の解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という語句、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などのバリエーションは、記載された整数又はステップ又は整数群又はステップ群の包含を含意するが、いかなるその他の整数又はステップ又は整数群又はステップ群の排除も含意しないものと理解されるであろう。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈上明確に指示されない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を含むことに留意すべきである。範囲は、「約」ある特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして本明細書で表現される場合がある。このような範囲が表現されている場合、別の実施形態は、ある特定の値から、及び／又は別の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表現されている場合、先行して「約」を使用することによって、特定の値が別の実施形態を成立させるということが理解されるであろう。数値に関連する「約」という用語は任意選択的であり、例えば、±１０％を意味する。
実施例１－材料及び方法
溶媒露出表面積の計算
ｍｅａｓｕｒｅ ｓａｓａコマンドを組み込んだＶｉｓｕａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（ＶＭＤ）ソフトウェア（イリノイ大学アーバナシャンペーン校）を使用して、タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／）；ＰＤＢコード３ＫＥＥにより利用可能なＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ：シメプレビル複合体の三次元構造から、シメプレビルの溶媒露出表面積（ＳＡＳＡ）を計算した。－ｒｅｓｔｒｉｃｔオプション、及び半径の１．４Åを使用して、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲに結合していないシメプレビルの表面、換言すると溶媒露出表面積を計算した。
ビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼの生成
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ構築物を設計するために使用される配列は、ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＡ８ＤＧ５０（Ｃ型肝炎ウイルスのサブタイプ１ａのゲノムポリタンパク質）に由来するものであり、米国特許第６８００４５６号明細書から更なる変更を組み込んだものである。プロテアーゼドメインは、ポリタンパク質の残基１０３０～１２０６に対応する。ＮＳ３プロテアーゼ（配列番号１）のＮ末端に融合された、ウイルスＮＳ４Ａタンパク質に由来する１１個の残基のペプチドからなる単鎖を使用して、完全に折り畳まれ、活性化されたポリペプチドを生成した。Ｎ末端にヘキサヒスチジン（６Ｈｉｓ）及びＡｖｉＴａｇ（それぞれ、アフィニティー精製及びビオチン化を可能にする）を有するこの配列（配列番号３）を、直鎖状のＤＮＡストリング（ＧｅｎｅＡｒｔ）として購入した。それと並行して、活性部位変異Ｓ１３９Ａ（配列番号４）と同等の配列をコードするＤＮＡストリングを注文した。ギブソンアセンブリーを使用して、ＤＮＡストリングをｐＥＴ－２８ａベクター（細菌発現用）にクローニングした。Ｈｉｓ及びＡｖｉｔａｇタグ化ＷＴ及びＳ１３９プロテアーゼのヒトコドン最適化バージョンをコードする、第２のＤＮＡストリングのセットを注文し、これらをＣＭＶプロモーターを含む哺乳類発現ベクターにクローニングした。最終構築物の配列は、全コード配列のサンガーシーケンシングによって確認した。
細菌発現の場合、ｐＥＴ－２８ａプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）含有プレートで選択を行った。各発現につき、単一コロニーを使用して５ｍｌの２ｘＴＹ＋５０μｇ／ｍｌのカナマイシン培養液に播種し、これを３７℃で一晩増殖させた。この培養液を使用して、５００ｍｌのＴＢ自己誘導培地（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ、１０ｍｌ／Ｌのグリセロール及び１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した）に１：５００希釈で播種した。ＯＤ６００が１．３～１．５になるまで培養液を３７℃で増殖させ、続いて２０℃に移行して２０時間発現を誘導した。遠心分離によって細胞を回収し、ペレットを－８０℃で保存した。
哺乳類発現の場合は、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ ＧｉｇａｐｒｅｐキットによってプラスミドＤＮＡを調製した。形質移入の時点で２．５×１０６細胞／ｍＬの密度における細胞によるＰＥＩ媒介送達によって、Ｇｉｇａｐｒｅｐ ＤＮＡをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に形質移入し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で培養した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２、１４０ｒｐｍ、７０％の湿度で６日間培養した。４，０００ｇで細胞を回収し、ペレットを－８０℃で保存した。
タンパク質を精製するために、５００ｍｌの培養液からそれぞれの細菌ペレットを解凍し、５０ｍｌの溶解バッファー（２×ＤＰＢＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４）に再懸濁した。プローブ超音波処理器を使用して細胞を溶解し、この溶解物を４℃で４０分間、５０，０００ｇの遠心分離によって澄明化した。界面活性剤を含む溶解バッファー（２×ＤＰＢＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ阻害剤であるｃＯｍｐｌｅｔｅ、２５Ｕ／ｍｌ Ｔｕｒｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、及び１％ トリトンＸ－１００、ｐＨ ７．４）中に哺乳動物細胞ペレットを再懸濁することによって溶解し、４℃で２時間、１０ｒｐｍで回転させた。哺乳動物の溶解した試料を、４℃で３０分間、５０，０００ｇで遠心分離した。カラムクロマトグラフィーの前に、全ての試料を０．２２μｍのボトルトップ濾過装置で濾過した。濾過した上清を、５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に５ｍｌ／分の流量で負荷した。カラムを１００ｍｌの洗浄バッファー（２×ＤＰＢＳ、２００ｍＭの追加のＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．４）で洗浄し、２０～４００ｍＭのイミダゾールから５カラム体積にわたるイミダゾール勾配で溶出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって画分を分析し、それらを適切なタンパク質をプールするために濃縮し、バッファーをＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって溶解バッファー（２×ＤＰＢＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に交換した。脱塩したタンパク質画分をプールし、遠心濃縮装置によって濃縮し、２×ＤＰＢＳ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＺｎＣｌ２中で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ２６／６００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって画分を分析し、９５％超の純度の画分をプールして、それらの濃度を紫外吸光度によって測定し、液体窒素中で急速凍結してから－７０℃で保存した。ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ３００，Ｃ４（Ｗａｔｅｒｓ）のＲＰ－ＨＰＬＣによって最終的な試料純度を確認した。
ＡＴＰ及びビオチンの存在下、２２℃で２．５時間試料とインキュベートしたＭＢＰタグ化ＢｉｒＡ酵素を使用して、精製されたタンパク質をそのＡｖｉｔａｇ上でビオチン化した。２×ＤＰＢＳ、２ｍＭ ＤＴＴ、１μＭ ＺｎＣｌ２中のＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のサイズ排除クロマトグラフィーによって、ビオチン化タンパク質を精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって画分を分析し、プロテアーゼを含有する画分をプールし、Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＣＳ ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ）のインタクト質量分析法によってビオチン化の程度を確認した。ビオチン化タンパク質をアリコートに分割し、液体窒素中で急速凍結して－７０℃で保存した。
シメプレビルに対する親和性を低下させるための更なる突然変異を導入したＨｉｓ及びＡｖｉｔａｇタグ化ＮＳ３／４Ａ Ｓ１３９Ａプロテアーゼを生成するために、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的突然変異誘発キットによって部位特異的突然変異を誘発するための鋳型として、プロテアーゼをコードするプラスミドに由来するｐＥＴ－２８ａを使用した。プロテアーゼ構築物の変異型を、発現前に全コード配列のサンガーシーケンシングによって確認した。ＢｉｒＡビオチンタンパク質リガーゼをＩＰＴＧ誘導で過剰発現させるために、プラスミドによって変異タンパク質をＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）派生株に形質転換し、細菌発現中にビオチン化できるようにした。一晩培養液を使用して、５０ｍｌの２ｘＴＹ＋５０μｇ／ｍｌのカナマイシンに１：２０希釈で播種した。ＯＤ６００が０．６になるまで培養液を３７℃で増殖させ、続いて５０μＭのビオチンを補充し、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。誘導された培養液を２５℃に移行し、２０時間発現させた。細胞を遠心分離によって回収し、ペレットを－２０℃で保存した。精製のため、各ペレットを２０ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ阻害剤であるｃＯｍｐｌｅｔｅ）に再懸濁し、４０，０００ｋｐｓｉで細胞破壊器（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を通過させることによって溶解させた。タンパク質をＩＭＡＣの自動化された２段階の処置で精製し、その後脱塩カラムでバッファーを交換した。試料を一度ＩＭＡＣ樹脂に負荷し、２０ｍＭのイミダゾールを補充した溶解バッファーで洗浄し、４００ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーで溶出した。溶出液を自動的に捕捉させ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．５で平衡化した脱塩カラムに負荷した。最終的なタンパク質試料をアリコートに分割し、液体窒素中で急速凍結して－７０℃で保存した。
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲプロテアーゼ活性アッセイ
酵素活性を評価するために、精製されたＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ及びＳ１３９Ａ変異体（ＲＥＴ Ｓ１、ＡｎａＳｐｅｃ）を使用して、ＥＤＡＮＳ－ＤＡＢＣＹＬのドナー－クエンチャーペアを有する蛍光発生ＨＣＶプロテアーゼＦＲＥＴ基質の切断を測定した。近接しているとき（１０～１００Å）、インタクトペプチドの場合のように、ＥＤＡＮＳは３４０ｎｍで励起し、（４９０ｎｍで）ＥＤＡＮＳから放射されたエネルギーがＤＡＢＣＹＬにより消光する。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲによってペプチドが切断されると、ＥＤＡＮＳからＤＡＢＣＹＬが分離し、それによって４９０ｎｍで蛍光を検出することができる。
アッセイバッファー（ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．８）、５ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセリン、０．０１％ ＣＨＡＰＳ）のＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ及び活性部位変異体Ｓ１３９Ａの階段希釈液を、室温で蛍光発生基質とインキュベートした。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（励起３４０ｎｍ、発光４９０ｎｍ）を使用して、蛍光を３時間後に測定した。
等温熱量測定
Ａｕｔｏ－ＩＴＣ ２００（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して、０．４μｌを予備注入し、その後１２０秒間隔でそれぞれ２μｌを１９回注入して等温熱量測定（ＩＴＣ）を実施した。溶液の回転を７５０ｒｐｍに設定し、温度を３７℃に設定した。シメプレビル（１２５μＭ）を、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（ＷＴが８μＭ、及びＳ１３９Ａ変異体が８．２μＭ）又はタンパク質バッファー（対照）に滴定した。タンパク質バッファーは、シメプレビル溶液に存在する量と等しくするために、２．５％のＤＭＳＯで濃縮した。ＷＴでは一度、Ｓ１３９Ａ変異体では二度繰り返して実施した。単一部位結合モデル及びポイント毎のリファレンスサブトラクションを使用して、ＩＴＣ－ＰＥＡＱソフトウェア（Ｍａｌｖｅｒｎ）でデータを分析した。
ファージディスプレイ選択
以下の３つのファージディスプレイライブラリーを使用して、ｓｃＦｖ及びＴｎ３配列をファージディスプレイ選択から単離した。（ｉ）ヒトテネイシンＣにおける第３のＦｎＩＩＩモジュールに基づき、ＦｎＩＩＩの代替足場として開発されたＴｎ３ライブラリーである、ライブラリー１（（Ｌｅａｈｙ ｅｔ ａｌ．１９９２）、（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．２０１３）、（Ｇｉｌｂｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ．２０１４））、（ｉｉ）制限的なフレームワークｓｃＦｖライブラリーである、ライブラリー２、及び（ｉｉｉ）ナイーブｓｃＦｖライブラリーである、ライブラリー３。
これまでに確立されたプロトコル（（Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．１９９６）、（Ｓｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．２０１３））に従って、全てのファージ選択を実行した。ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に捕捉されたビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）を使用して、ファージディスプレイ選択を行った。ビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ及びシメプレビル濃度を減少させて、各ファージライブラリーに対して全体で４ラウンドのファージディスプレイ選択を行った（図４Ａ及び図４Ｂ）。
確実にプロテアーゼが飽和するように、選択を開始する前にビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）抗原を５０倍モル過剰のシメプレビルとプレインキュベートした。各選択の前に、ファージプールをストレプトアビジンビーズ単体とインキュベートし、ライブラリーからストレプトアビジンビーズに対する任意の結合物質を除去した。ファージディスプレイ選択のラウンド１及び２では、シメプレビルの非存在下でビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）の選択解除ステップを行わなかった。しかしながら、ラウンド３及びラウンド４では並行して選択を行い、一方のアームではビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）の選択解除ステップをせず、他方のアームではファージ粒子を２５０ｎＭのビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）と１５分間室温でプレインキュベートし、その後ストレプトアビジン被覆ビーズを使用してプロテアーゼを除去した。続いて、選択プロトコルのために、シメプレビルの存在下で、この得られたファージをストレプトアビジンビーズ上に被覆されたビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）に加えた。
各ラウンドにおいて、以下のビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）の濃度を用いてファージディスプレイ選択を行った。
ラウンド１：２５０ｎＭ ビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）＋１２．５μＭ シメプレビル
ラウンド２：１００ｎＭ ビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）＋５μＭ シメプレビル
ラウンド３：２５ｎＭ ビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）＋１．２５μＭ シメプレビル
ラウンド４：２５ｎＭ ビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）＋１．２５μＭ シメプレビル。
複合体に結合したファージをシメプレビルの存在下でビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）とインキュベートした後に、Ｄ－ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で３回洗浄し、その後トリプシンで溶出した。溶出したファージを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞の中期対数期のファージ培養物に感染させ、寒天平板（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％（ｗ／ｖ）のグルコースを含む）に蒔いた。
ＤＮＡ塩基配列決定のため、ラウンド３及びラウンド４の個々のファージクローンを選択し、ファージＥＬＩＳＡによって抗原結合性をスクリーニングした。ＤＮＡ配列情報を表１に示す。
ファージレスキュー
記載されているように発現を誘導された単一のファージミドｓｃＦｖ又はＴｎ３クローンを使用するファージＥＬＩＳＡによって、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）に対する特異的結合を評価した（Ｏｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．１９９６）。要約すると、ラウンド３及びラウンド４の選択アウトプット由来のファージクローン、及び陰性対照クローンをコードする個々のＴＧ１コロニーを、９６ウェルプレート中で３７℃、２８０ｒｐｍで振盪しながら、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％（ｗ／ｖ）のグルコースを含有する培地で対数期になるまで増殖させた。続いて、ヘルパーファージを各ウェルに加え、プレートを３７℃で１時間、１５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。続いて、プレートを４５００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離にかけ、培地を除去し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する培地で置換した。続いて、プレートを２５℃で一晩、２８０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。翌日、等容積の６％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳（Ｍａｒｖｅｌ）を含む２×ＰＢＳをプレートの各ウェルに添加することによってファージプレップをブロッキングした。
ファージＥＬＩＳＡ
３倍過剰のシメプレビル（５．６μＭ）の存在下及び非存在下で、ビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）を使用して、５μｇ／ｍｌ（１．８７５μＭ）で９６ウェルのストレプトアビジン被覆プレートを被覆した。被覆プレートをＰＢＳで洗浄し、３％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳（Ｍａｒｖｅｌ）を含有するＰＢＳで１時間ブロッキングした。このブロッキングステップの後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、その後ブロッキングしたファージプレップ（ファージレスキューの項で記載したように生成されたもの）を加えた。ファージプレップを、１時間室温で抗原とインキュベートし、その後ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％ ｖ／ｖ）で３回洗浄した。抗Ｍ１３ファージ－ＨＲＰタグ化抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して抗原被覆プレートに特異的に結合したファージを検出し、その後３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｓｉｇｍａ）を使用して検出した。０．５ＭのＨ２ＳＯ４を使用して検出反応を停止し、蛍光プレートリーダーを使用して４５０ｎｍでプレートを読み込んだ。シメプレビルの存在下でビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）に結合する各クローンについて測定した蛍光読み出し値を、シメプレビル非存在下で観察されたシグナルに対してシメプレビル存在下で観察されたシグナルを除算することによって、シメプレビルの非存在下で結合するクローンと比較した。これらのデータをグラフにプロットした（図４Ｂ）。これらのデータでは、ｓｃＦｖ及びＴｎ３クローンのパネルはＰＲＳＩＭ＿ｘｘという名称であり、ｘｘは更なる調査のために選択されたクローン番号を意味する。選択されたクローンは、独自のＤＮＡ配列を有し、ファージＥＬＩＳＡによって測定されたように、シメプレビルの非在下ではＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）に対する結合を示さなかった（シメプレビルの存在下及び非存在下の両方でＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）に対する結合を示した対照ＰＲＳＩＭ ５１、ＰＲＳＩＭ ５４、ＰＲＳＩＭ ５５及びＰＲＳＩＭ ８５を除く）。
ｓｃＦｖ及びＴｎ３ ＰＲＳＩＭ結合分子の発現
ニッケルキレートクロマトグラフィーの後にサイズ排除クロマトグラフィーを使用するこれまでの方法（Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からｓｃＦｖ及びＴｎ３ ＰＲＳＩＭ結合分子を精製した。最も有望なＴｎ３ ＰＲＳＩＭ結合分子の発現レベルを増大させるために、それらをコードするＤＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドＴｎ３＿ｐＥＴＦｗｄ２（５’－ＣＧＡＴＣＡＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＧＴＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＣＧＡＧＣＣＡＧ－３’（配列番号１８３））及びＴｎ３＿ｐＥＴＲｅｖ２（５’－ＡＴＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＴＴＡＡＡＧＧＴＡＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧ－３’（配列番号１８４））を使用してｐＥＴ１６ｂベクターにサブクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の細胞質内に発現させた。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ｐｌｕｓ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で溶解した後、ニッケルキレートクロマトグラフィーの後にサイズ排除クロマトグラフィーを使用してＴｎ３ベースのＰＲＳＩＭ結合分子を精製して均質化すると、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）中に単量体タンパク質が得られた。
ホモジニアス時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）による結合スクリーニング
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）に選択的なｓｃＦｖ及びＴｎ３ ＰＲＳＩＭ結合分子を、シメプレビルの存在下及び非存在下における結合の測定と並行して実施するホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ（登録商標））アッセイで同定した。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）、及び精製したＰＲＳＩＭ結合分子の連続希釈液を、アッセイバッファー（０．４Ｍのフッ化カリウム及び０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ）中で調製した。ストレプトアビジンクリプテート（Ｃｉｓｂｉｏ）を、抗ＦＬＡＧ ＸＬ６６５（Ｔｎ３分子を検出する）又は抗ｃ－ｍｙｃ ＸＬ６６５（ｓｃＦｖ分子を検出する）のいずれかと共にアッセイバッファー中で予め混合した。各アッセイにつき、２．５μｌの試料を、２．５μｌのＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）及び２．５μｌの予め混合した検出試薬に滴加した。また、２．５μｌのシメプレビル又は２．５μｌのＤＭＳＯブランクのいずれかを各ウェルに添加した。試料を全く加えていないウェルを使用することによってバックグラウンドを定義した。アッセイプレートを一晩４℃でインキュベートし、その後ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して６２０ｎｍ及び６６５ｎｍの発光波長の時間分解蛍光を読み出した。各試料に対して％デルタＦ値を計算することによって、データを分析した。デルタＦは、式１に従って求めた。
式１：
％デルタＦ＝（（試料の６６５ｎｍ／６２０ｎｍ比の値）－（バックグラウンドの６６５ｎｍ／６２０ｎｍ比の値）／（バックグラウンドの６６５ｎｍ／６２０ｎｍ比の値））×１００
選択的結合分子とは、シメプレビルとの複合体におけるＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）に結合し、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）に結合しないｓｃＦｖ及びＴｎ３ ＰＲＳＩＭ結合分子であるものとして定義される。
結合カイネティクス解析
ｓｃＦｖ及びＴｎ３ ＰＲＳＩＭ結合分子の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して２５℃で測定した。標準的なアミンカップリング技術を用いて、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中１μｇ／ｍｌの濃度で、ｓｃＦｖ及びＴｎ３ ＰＲＳＩＭ結合分子をＣＭ５チップ表面に共有結合的に固定化した。
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）又はＢＳＡ対照を、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、０．０１％ ＤＭＳＯ中で１：４（１．２５～２０ｎＭ）±１０ｎＭ シメプレビルに希釈し、シメプレビル及びＤＭＳＯの濃度を確実に一定にするようにした。１２０秒で結合し、６００秒で解離するシングルサイクルカイネティクスを使用して、試料を５０μｌ／分でチップの上に流した。１０ｍＭ グリシン－ＨＣｌ（ｐＨ３．０）の２回の２０秒パルスによってチップ表面を再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して最終的なセンサーグラムを分析し、１：１結合モデルを使用して親和定数ＫＤを求めた。ＰＲＳＩＭ＿２３のＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ変異体の親和性を測定するために、わずかな偏差で同じ方法を使用した。変異体を１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、０．０８％ ＤＭＳＯ中で１：４（２．５～４０ｎＭ）±シメプレビルに希釈し、シメプレビル及びＤＭＳＯの濃度を確実に一定にするようにした。１８０秒で結合し、６００秒で解離するシングルサイクルカイネティクスを使用して、試料を５０μｌ／分でチップの上に流した。
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋを使用して、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）／ＰＲＳＩＭ結合分子複合体の形成におけるシメプレビル濃度の影響も測定した。前回と同様、ＣＭ５チップ表面にＰＲＳＩＭ＿５７及びＰＲＳＩＭ＿２３を共有結合的に固定化した。４０ｎＭのＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）の濃度を一定にして、シメプレビルを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、０．３％ ＤＭＳＯ中で１：２（０．０１５２～３００ｎＭ）に希釈した。２４０秒で結合し、６００秒で解離するマルチサイクルカイネティクスを使用して、試料を５０μｌ／分でチップの上に流した。再生条件は上記に記載した通りであった。シメプレビルによるＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）／ＰＲＳＩＭ二量体化の誘導に関する滴定曲線を作成した。２２５秒（結合が終了する１５秒前）における各シメプレビル濃度の応答を、２２５秒における３００ｎＭ シメプレビルの応答の百分率として正規化し、シメプレビル濃度に対してプロットした。各データ点は、個々の３つの実験の平均値±ｓ．ｅ．ｍを示している。非線形回帰曲線近似を使用して、記録されたＥＣ５０を計算した。４０ｎＭ ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）の濃度を一定にして、シメプレビルを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、０．８２％ ＤＭＳＯ中で１：２（０．０４５７～９００ｎＭ又は０．４１２～８，１００ｎＭ）に希釈した以外は、変異体ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼに同一の方法を使用し、各シメプレビル濃度の応答を最も高いシメプレビル濃度に対して正規化した。
Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、２５℃におけるシメプレビルの親和性を測定した。ビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ Ｋ１３６Ｄ ＰＲ、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ Ｋ１３６Ｎ ＰＲ、及びＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ Ｄ１６８Ｅ ＰＲを、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、０．３％ ＤＭＳＯ中、２μｇ／ｍｌの濃度でＨｉｇｈ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＳＡＸ）バイオセンサーに負荷した。シメプレビルを同一のバッファー中で１：１に希釈し（４６．８８～３，０００ｎＭ）、負荷したバイオセンサーをシメプレビル試料に１８０秒間浸漬して結合を測定した。解離のため、バイオセンサーをバッファーに６００秒間浸漬した。このトレースをＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して分析し、１：１結合モデルを用いてグローバルフィットさせた。
スプリットＮａｎｏＬｕｃの再構成アッセイ
ＰＲＳＩＭ結合分子が融合された２つのタンパク質の二量体化を促進する能力は、スプリットＮａｎｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ＮａｎｏＬｕｃ）の再構成、及び細胞をイメージングするＮａｎｏ－Ｇｌｏ ＮａｎｏＬｕｃ基質を供給した時に生じる発光を測定するＮａｎｏＢｉＴシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって評価した（図８）。ＮａｎｏＢｉＴシステムでは、一方の相互作用パートナーが、フレキシブルリンカーを介してＬｇＢｉＴ（「ラージビット」）と称される１８ｋＤａのＮａｎｏＬｕｃのフラグメント（配列番号１６）に融合され、もう一方の相互作用パートナーが、同等のリンカーを介して１．３ｋＤａのペプチドであるＳｍＢｉＴ（「スモールビット」）（配列番号１７）に融合されている。ＬｇＢｉｔ及びＳｍＢｉＴは、相互作用パートナーの非在下では互いに親和性が低く（１９０μＭ）、再構成されて活性のあるルシフェラーゼ酵素を形成することはない。ＣＩＤの相互作用タンパク質と融合させ、誘導因子を供給すると、それらが再構成されて発光を測定することが可能となる。ＮａｎｏＢｉＴシステムでは、ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴに融合した２セットの制御タンパク質、つまり構成的に相互作用するタンパク質であるＰＲＫＡＲ２Ａ：ＰＲＫＡＣＡのセット、及びラパマイシンによって二量体化を誘導することができるＦＲＢ：ＦＫＢＰ１２のペアが提供されている。
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）及びＰＲＳＩＭ成分の最適な配向を確認するために、構築物、従ってＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）をＳｍＢｉＴのＮ末端又はＣ末端のいずれかに融合させ（それぞれ配列番号１８及び１９）、各ＰＲＳＩＭ結合モジュールの構築物の類似したセットをＬｇＢｉＴのＮ末端又はＣ末端のいずれかに融合させた（それぞれ配列番号２０～３０及び３１～４１）。ＮａｎｏＢｉＴキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）では、これらの構築物を生成することができるベクターのセットを提供している。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）及びＰＲＳＩＭ分子をコードするＤＮＡストリングをＧｅｎｅＡｒｔから購入し、ＮａｎｏＢｉＴベクターに適合する制限部位を含む伸長部分を有するプライマーを用いてＰＣＲによって増幅し、ギブソンアセンブリーによってクローニングした。全ての構築物を、全コード配列のサンガーシーケンシングによって確認した。
全てのＮａｎｏＢｉＴのスクリーニングは、９６ウェルプレートで培養された接着性ＨＥＫ２９３細胞で行った。組織培養フラスコから酵素的に解離させた細胞を計数し、２×１０４細胞／ウェルで白色、不透明底の９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３９１７）に蒔いた。プレートを３７℃で一晩、５％ ＣＯ２にてインキュベートし、細胞を接着させた。２日目に、終濃度１００ｎｇ／ウェルでプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって同時形質移入した（５０ｎｇ／プラスミド、一方はＳｍＢｉＴ融合体をコードし、もう一方はＬｇＢｉＴ融合体をコードする）。３日目に、１００ｎＭの適切な小分子誘導剤（ラパマイシン（ＦＲＢ：ＦＫＢＰ１２）若しくはシメプレビル（ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ：ＰＲＳＩＭ））又は溶媒対照でウェルを処理し、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した直後にＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで発光を定量した。
転写調節アッセイ
ｉＤｉｍｅｒｉｚｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎシステム（タカラバイオ株式会社）を使用して、ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤが遺伝子発現を調節する能力について検証した。このシステムは、転写が生じないようにＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び活性化ドメイン（ＡＤ）が分離された、スプリット転写因子の再構成をベースとするシステムである。ＤＢＤ及びＡＤは、ＣＩＤの２つのタンパク質成分に別々に融合されており、小分子誘導剤の存在下でのみＡＤがＤＢＤに近接し、ＤＢＤ認識部位を有するプロモーターに転写機構をリクルートするようになっている。ｉＤｉｍｅｒｉｚｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎシステム（タカラバイオ株式会社）では、２つのベクター、ｐＨｅｔ－Ａｃｔ１－２及びｐＺＦＨＤ１－ルシフェラーゼを提供している。ｐＨｅｔ－Ａｃｔ１－２ベクターは、陽性対照を代表する２つの融合タンパク質をコードしており、一方はＦＲＢ（Ｔ８２Ｌ変異体；ＤｍｒＣ）とヒトｐ６５由来の活性化ドメイン（ＡＤ）（配列番号４２）との融合体であり、他方はＦＫＢＰ１２（ＤｍｒＡ）の３つのタンデムコピーに融合されたＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＨＤ１）（配列番号４３）から構成される融合タンパク質である。これらの配列はＣＭＶプロモーターの前に配置され、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てられている。ＺＦＨＤ１ベクターは、最小ＩＬ－２プロモーターの上流にあるＺＦＨＤ１ ＤＢＤの１２コピーの認識配列からなる誘導性プロモーターの前に配置されるルシフェラーゼをコードする。ＤＢＤがその認識配列に結合し、ＡＤによって転写機構がリクルートされると、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写が開始する。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）をコードするＤＮＡ配列をＧｅｎｅＡｒｔからＤＮＡストリングとして購入し、活性化ドメインに対するＮ末端の融合パートナーとして（配列番号４４）（ＦＲＢを置き換える）、又はＤＮＡ結合ドメインに対するＣ末端の融合パートナーとして（配列番号４５）（ＦＫＢＰ１２を置き換える）、融合パートナーの間のフレキシブルリンカー（それぞれ、ＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１８５）及びＳＡ）と共にｐＨｅｔ－Ａｃｔ１－２ベクターにクローニングした。続いて、１コピーの１２個のＰＲＳＩＭ分子（表２）のパネルをコードする配列をＧｅｎｅＡｒｔからＤＮＡストリングとして購入し、ギブソンアセンブリーを使用して、それぞれＤＢＤ（配列番号４６～５６）又はＡＤ（配列番号５７～６７）のいずれかに対する融合パートナーとして、上記に記載したＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）を含むｐＨｅｔＡｃｔ１－２構築物にクローニングした。同等の構築物を生成し、ｐＨｅｔ－Ａｃｔ１－２内の３コピーのＦＫＢＰ１２を単一コピーのＦＫＢＰ１２で置換した。活性化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質の両方をコードする構築物の配列を、全コード領域のサンガーシーケンシングによって確認した。
ＮａｎｏＬｕｃ－ＰＥＳＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をコードするＤＮＡ配列（配列番号６８）をＧｅｎｅＡｒｔからＤＮＡストリングとして購入し、ギブソンアセンブリークローニングを使用して、ｐＺＦＨＤ１－２ベクター（タカラバイオ株式会社）のＺＦＨＤ１誘導性プロモーターの下流にクローニングした。最終構築物のヌクレオチド配列を、配列決定により確認した。
ＭＥＤＩ８８５２（配列番号２３７及び配列番号２３８、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列によって隔てられている）をコードするＤＮＡ配列をＧｅｎｅＡｒｔからＤＮＡストリングとして購入し、ギブソンアセンブリークローニングを使用して、ｐＺＦＨＤ１－２ベクター（タカラバイオ株式会社）のＺＦＨＤ１誘導性プロモーターの下流にクローニングした。最終構築物のヌクレオチド配列を、配列決定により確認した。
３つのＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）変異体をコードする配列（表６）をＧｅｎｅＡｒｔからＤＮＡストリングとして購入し、ギブソンアセンブリーを使用して、ＡＤに対する融合パートナーとして、上記に記載したｐＨｅｔＡｃｔ１－２ ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）－ＰＲＳＩＭ＿２３（３つのタンデムコピー）構築物にクローニングした（配列番号２１１～２１６）。
全ての転写調節アッセイを、３８４ウェルプレートで培養された接着性ＨＥＫ２９３細胞で行った。組織培養フラスコから酵素的に解離させた細胞を計数し、７．５×１０３細胞／ウェルで３８４ウェルプレートに蒔いた。プレートを３７℃で一晩、５％ ＣＯ２にてインキュベートし、細胞を接着させた。２日目に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ｐＨｅｔ－Ａｃｔ１－２プラスミド（ＦＲＢ：ＦＫＢＰ１２対照融合タンパク質（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）又はＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：ＰＲＳＩＭ融合タンパク質を含む）及びｐＺＦＨＤ１プラスミド（ルシフェラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）又はＮａｎｏＬｕｃ－ＰＥＳＴ（上記に記載したような）のいずれかをコードする）によって細胞を同時形質移入した。３日目に、異なる濃度のＡ／Ｃヘテロダイマライザー（ＦＲＢ：ＦＫＢＰ１２対照用）、シメプレビル、又は溶媒対照のいずれかでウェルを処理し、２４時間後にＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）又はＮａｎｏ－Ｇｌｏ Ｖｉｖａｚｉｎｅルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した直後にＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで発光を定量した。或いは、１日目にリバーストランスフェクションを実行し、２日目にダイマライザーを加え、３日目に２４時間後の発光を定量した。
発光の読み出し値は、シメプレビル存在下のシグナルを、シメプレビル非存在下のシグナルで除算することによって、倍率変化に変換した。
転写調節アッセイを利用して抗体発現（ＭＥＤＩ８８５２）を定量するために、細胞をｐＨｅｔ－Ａｃｔ１－２プラスミド（ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：ＰＲＳＩＭ＿２３）及びｐＺＦＨＤ１プラスミド（ＭＥＤＩ８８５２をコードする）で同時形質移入し、２４時間後に異なる濃度のシメプレビルでウェルを処理した。ＭＳＤキット（Ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ／ＮＨＰ ＩｇＧ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ）を使用して、シメプレビルを添加してから４８時間後の上清内の抗体濃度を測定した。
スプリットキメラ抗原受容体の活性化アッセイ
Ｔ細胞受容体の合成された遺伝子改変バージョンであるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、使用者が定義した標的に応答して、標的特異的認識ドメイン、例えば単鎖可変抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）によって免疫細胞の活性を誘導することができる。これらのマルチドメインの合成タンパク質は、典型的に、標的認識ドメインを膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体共刺激ドメイン、及びＣ末端のＣＤ３ゼータ細胞質活性化ドメインに融合することによって構築されている。スプリットＣＡＲは、標的認識ドメイン／膜貫通ドメイン／共刺激ドメイン、及びＣＤ３ゼータ活性化ドメインを２つの別々のタンパク質として発現させることによって生成することができる。適切なヘテロ二量体スイッチ成分をそれぞれのタンパク質に加えることで、化学的に誘導されたヘテロ二量体化により、標的タンパク質の存在下でＣＡＲを活性化させることができる。
ＦＲＢ：ＦＫＢＰ１２又はＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：ＰＲＳＩＭ＿２３のいずれかのヘテロ二量体化成分を利用して、２つのスプリットＣＡＲをコードする構築物を生成した。両方のスプリットＣＡＲのために、トリシストロン性構築物を生成した。コードされた３つの融合タンパクは、１）Ｎ末端からＣ末端にかけて、シグナルペプチド配列、標的抗原を認識するｓｃＦｖフラグメント、ヒトＩｇＧ４由来のヒンジドメイン、ＣＤ２８由来の膜貫通ドメイン、共刺激タンパク質である４－１ＢＢ活性化ドメインの細胞内ドメイン、及びＦＫＢＰ１２又はＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）のいずれか、２）Ｎ末端からＣ末端にかけて、シグナルペプチド配列、ヒトＩｇＧ４由来のヒンジドメイン、ＣＤ２８由来の膜貫通ドメイン、共刺激タンパク質である４－１ＢＢ活性化ドメインの細胞内ドメイン、ＦＲＢ又はＰＲＳＩＭ＿２３のいずれか、続いてＣＤ３ゼータドメイン、並びに３）形質移入細胞のマーカーとして使用した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であった（図１５Ａ）。融合タンパク質１及び２は、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドを介して連結し、タンパク質２及び３は、更にＴ２Ａ自己切断ペプチドを介して連結した。ＦＲＢ：ＦＫＢＰ１２ベースのスプリットＣＡＲと、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１２９Ａ）：ＰＲＳＩＭ＿２３ベースのスプリットＣＡＲとをコードするトリシストロン性ＤＮＡ配列をＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入してｐＣＤＨ発現レンチウイルスベクター（Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にクローニングし、配列をサンガーシーケンシングによって確認した。ＦＲＢ：ＦＫＢＰ１２スプリットＣＡＲのトリシストロン性ＤＮＡ配列（標的抗原を認識するｓｃＦｖフラグメントを含まない）を配列番号１３２として示し、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：ＰＲＳＩＭ＿２３のトリシストロン性ＤＮＡ配列（こちらも標的抗原を認識するｓｃＦｖフラグメントを含まない）を配列番号１３３として示す。標的抗原を認識するｓｃＦｖフラグメントをコードするＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号１３２及び１３３の６６位のヌクレオチドと６７位のヌクレオチドとの間に挿入した。
それぞれのスプリットＣＡＲをコードするレンチウイルス粒子は、ｐＰＡＣＫＨ１ ＨＩＶレンチウイルスベクターパッケージングキット（Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、製造元のプロトコルに従って生成した。８μｇ／ｍｌ ポリブレンの存在下で２４時間、レンチウイルス粒子でジャーカット細胞を形質導入し、その後に細胞を新鮮な増殖培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ウシ胎児血清）に移し変え、５日間増殖させた。ＦＫＢＰ１２：ＦＲＢ及びＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：ＰＲＳＩＭ＿２３ ＣＡＲの両方において同等の発現レベルを達成するため、機能検査の前に、スプリットＣＡＲを形質導入したジャーカット細胞のプールを、ＧＦＰ蛍光に基づいてＦＡＣＳソートした。スプリットＣＡＲ発現ジャーカット細胞の活性は、ＣＡＲを刺激した後に産生されるインターロイキン－２（ＩＬ－２）によって測定することができる（Ｓｍｉｔｈ－Ｇａｒｖｉｎ，Ｋｏｒｅｔｚｋｙ，ａｎｄ Ｊｏｒｄａｎ ２００９）。ＣＡＲの活性化を促進するために、ＣＡＲ発現ジャーカット細胞をＨｅｐＧ２（抗原陽性）細胞又はＡ３７５（抗原陰性）細胞のいずれかと１：１の比率で混合する共培養アッセイを使用した。細胞混合物に異なる濃度のシメプレビル又は溶媒対照（ＤＭＳＯ）を添加し、２４時間インキュベートした。インキュベート後に、細胞を遠心分離によってペレット化し、市販のＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって、製造元のプロトコルに従って上清をＩＬ－２の発現について検査した。
ＡＡＶ形質導入実験
５’ＩＴＲの下流のＣＭＶプロモーターが除去され、ＷＰＲＥエレメント及びＳＶ４０ポリＡ配列が３’ＩＴＲの上流に挿入されたｐＡＡＶ－ＣＭＶ（タカラバイオ株式会社）に由来する中間ベクターに、特異的プロモーター及び導入遺伝子エレメントをサブクローニングすることによって、ＡＡＶ発現ベクターを生成した。
誘導ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするＡＡＶを生成するために、ｉＤｉｍｅｒｉｚｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎシステム（タカラバイオ株式会社）で提供されるｐＺＦＨＤ１－ルシフェラーゼから、ＺＨＦＤ１－ルシフェラーゼカセットをＰＣＲによって増幅させ、中間ＡＡＶベクターにサブクローニングした。恒常的に発現するｈｕＩＬ－２をコードするＡＡＶを生成するために、ヒトＩＬ－２（配列番号２１０）をコードする遺伝子を、中間ＡＡＶベクターのＣＡＧプロモーターの下流にサブクローニングした（図１８Ａ）。スプリット転写因子に関連するＰＲＳＩＭ＿２３ ＣＩＤをコードするＡＡＶを生成するために、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド（配列番号２０８）によって隔てられた２つの融合タンパク質（３コピーのＰＲＳＩＭ＿２３と融合したＺＦＨＤ１のＤＮＡ結合ドメイン、及びＡＤと融合したＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ））をコードするカセットを、中間ＡＡＶベクターのハイブリッドＥＦ１α－ＨＴＬＶ－１プロモーターの下流にサブクローニングした。ＰＲＳＩＭ＿２３ ＣＩＤスプリット転写因子に加えて、誘導ＩＬ－２導入遺伝子をコードするＡＡＶを生成するために、ルシフェラーゼ導入遺伝子の代わりにヒトＩＬ－２をＺＦＨＤ１－ルシフェラーゼベクターにサブクローニングし、ＺＦＨＤ１－ｈｕＩＬ－２カセットをＰＣＲによって増幅してＰＲＳＩＭ＿２３ ＣＩＤスプリット転写因子構築物をコードするＡＡＶベクター内の５’ＩＴＲのすぐ下流に挿入した（図１８Ｃ）。全ての構築物を、サンガーシーケンシングによって確認した。
標準的なヘルパーフリー手法を用いて、８０％コンフルエンシーのＨＥＫ２９３ Ｔ－１７細胞を含む４０ Ｔ－１７５ｃｍ２フラスコのトリプルトランスフェクションにより、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を生成した。要約すると、４０ｋＤの直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）９０μｇを使用して、ヘルパープラスミド（アデノウイルスＥ２Ａ及びＥ４を含むプラスミド）１５μｇ、ＡＡＶのＩＴＲを保持し、導入遺伝子をコードするプラスミド７．５μｇ、及びＡＡＶカプシドプラスミド（ＡＡＶ８カプシド及び対応するＲｅｐ遺伝子を含む）７．５μｇで各フラスコを形質移入した。形質移入して５日後、全てのフラスコから培地を回収し、２０００単位のＢｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼで処理し、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、培地を０．２２μｍのフィルターに通して濾過し、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって８０ｍｌの容積となるまで濃縮した。この容積を更に濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ １５ｍｌ １００ｋＤａフィルターを使用してバッファーをＰＢＳと交換した後に、段階的なイオジキサノール勾配（１５％／２５％／４０％／６０％）に負荷し、Ｔｉ７０ローターを備える超遠心機で、１８℃にて１．５時間、６９０００ｒｐｍで回転させた。ｕｌｔｒａｃｌｅａｒ遠心チューブから、ウイルスを示す透明なバンドの下の６０％の層に１９ゲージのシリンジでチューブを突き刺すことによって画分を採取し、各画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及びその後のＳｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ分析によって各画分の純度を評価した。純粋な画分を混ぜ合わせ、Ａｍｉｃｏｎ １５ｍｌ １００ｋＤａフィルター内でバッファーをＰＢＳに交換し、最終容量の１５０μｌとなるまで濃縮し、凍結／融解の繰り返しを避けるため、アリコートで－８０℃にて保存した。デジタルドロップレットＰＣＲ及びＩＴＲに特異的なＴａｑＭａｎプローブを使用して、このウイルスの力価を測定した。典型的な力価は、１～３×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍｌの範囲であった。
全てのｒＡＡＶ形質導入アッセイを、９６ウェルプレートで培養された接着性ＨＥＫ２９３細胞で行った。組織培養フラスコから酵素的に解離させた細胞を計数し、２．５×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに蒔いた。プレートを３７℃で一晩、５％ ＣＯ２にてインキュベートし、細胞を接着させた。２日目に、２．５～５×１０９ＧＣ／ｍｌ（１～２×１０５の感染多重度（ＭＯＩ）に相当する）の関連するｒＡＡＶで細胞を形質導入した。４８～７２時間インキュベートした後、細胞を異なる濃度のシメプレビル又は溶媒対照で処理し、更に２４時間インキュベートした。発光アッセイでは、ＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで発光を定量した。発光の読み出し値は、シメプレビル存在下のシグナルを、シメプレビル非存在下のシグナルで除算することによって、倍率変化に変換した。 ＩＬ－２アッセイでは、上清を採取し、製造元のプロトコルに従って、Ｖ－ＰＬＥＸ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用してＩＬ－２を定量した。
内在性遺伝子調節アッセイ
ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤによって内在性遺伝子が調節されることを立証するために、活性化ＣＲＩＳＰＲ（ＣＲＩＳＰＲａ）手法を使用した。ＣＲＩＳＰＲａは、エンドヌクレアーゼ活性のない不活性型Ｃａｓ９酵素（ｄＣａｓ９）を使用することに依拠するものであり、シングルガイドＲＮＡを介して内在性遺伝子のプロモーター領域内の標的部位に結合する。転写活性化因子がリクルートされると、内在性遺伝子の転写が開始される。
この手法では、転写が起こらないようにｄＣａｓ９とＶＰＲ活性化ドメイン（ＡＤ）とが分離されている。ｄＣａｓ９及びＡＤはＣＩＤの２つのタンパク質成分に別々に融合されており、小分子誘導剤の存在下でのみＡＤがｄＣａｓ９に近接し、内在性遺伝子のプロモーター領域にシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を介して転写機構をリクルートすることができるようになっている。本実施例では、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）に融合したＡＤ（配列番号２２６）と、ＰＲＳＩＭ－２３の３つのタンデムコピーに融合したｄＣａｓ９（配列番号２２８）との２つの機能ユニットからなる活性化プラスミドを生成した。この配列はＣＭＶプロモーターの前に配置され、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てられている。ｇＲＮＡプラスミドは、ＢｓａＩを利用して、ゴールデンゲートアセンブリーによって生成した。このｇＲＮＡプラスミドは、ヒトＵ６プロモーター、インターロイキン－２（ＩＬ－２）標的配列（ＧＴＴＡＣＡＴＴＡＧＣＣＣＡＣＡＣＴＴ、配列番号２２９）、及びＣａｓ９の結合を可能にする足場ＲＮＡ配列をコードしている（図１９Ａ）。
転写調節アッセイを、９６ウェルプレートで培養された接着性ＨＥＫ２９３細胞で行った。組織培養フラスコから酵素的に解離させた細胞を計数し、２．５×１０４細胞／ウェルで蒔いた。プレートを３７℃で一晩、５％ ＣＯ２にてインキュベートし、細胞を接着させた。２日目に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ｇＲＮＡ：活性化プラスミドＤＮＡの比率を２：１にして、細胞を活性化プラスミド及びｇＲＮＡプラスミドで同時形質移入した。３日目に、ウェルを３００ｎＭ シメプレビル又は溶媒対照とインキュベートした。処置から７２時間後（６日目）、細胞上清を採取し、Ｖ－ＰＬＥＸ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して、製造元のプロトコルに従ってＩＬ－２を定量した。
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ３／４Ａプロテアーゼに対するシメプレビルの親和性を低下させることが予測される変異を同定するための分子シミュレーション
最初に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｗｉｚａｒｄ（Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３）を使用して、シメプレビルとの複合体におけるＨＣＶの共結晶構造体を調製し、水素原子を付加して側鎖の欠落を充填し、生理学的ｐＨでアミノ酸及びシメプレビルの両方に適切な電離状態を付与した。続いて、ＯＰＬＳ３ｅ力場によるＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ２０１９－２（Ｍｏｒａｃａ ｅｔ ａｌ，２０１９）リリースにおけるＦＥＰ＋（モジュール）を使用して、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲの残基Ｈ５７、Ｋ１３６、Ｓ１３９、及びＲ１５５を変異させたときの相対的な結合自由エネルギーを予測した。シメプレビルに対するＨＣＶプロテアーゼの親和性を低下させることが予測される変異を表４に列記した。
スプリット転写因子の制御下でＧＦＰ－ＰＥＳＴを発現する安定発現株の生成
ＡＡＶＳ１遺伝子座に導入遺伝子を組み込むためのＣＲＩＳＰＲ媒介ノックインシステム（ＯＲＩＧＥＮＥ）を使用して、製造元の指示書に従ってモノクローナル細胞株を生成した（図２６Ｂ）。最初に、予め線状化したｐＨｅｔ－ＺＦＨＤ１－ＧＦＰ－ＰＥＳＴプラスミドによる一過性トランスフェクションによって、誘導性プロモーター（最小ＩＬ－２プロモーター）の制御下でＧＦＰ－ＰＥＳＴ（配列番号２３２、２３３）を発現するＨＥＫ２９３細胞を得た。増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清＋１％非必須アミノ酸）に８００μｇ／ｍｌのジェネテシンを添加することで形質移入細胞を選択した。その後、ポリクローナル細胞をｐＨｅｔ－Ａｃｔ１－２－ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）－ＰＲＳＩＭ２３（３つのタンデムコピー）プラスミドで形質移入し、シメプレビル処理に応答したＧＦＰ蛍光強度に基づいてＦＡＣＳソートし、単一細胞クローンを単離した。スプリット転写因子であるＰＲＳＩＭ＿２３ ＨＣＶ ＮＳ３／４ ＰＲ ＷＴ及び変異体の制御下でＧＦＰ－ＰＥＳＴを発現するＨＥＫ２９３細胞を更に生成するためのベースとして、最終的なモノクローナル細胞株を使用した。
ＡＡＶＳ１セーフハーバーＣＲＩＳＰＲ媒介ノックインシステムでは、ＣＲＩＳＰＲオールインワンベクターであるｐＣＡＳ－Ｇｕｉｄｅ－ＡＡＶＳ１ベクターと、ＡＡＶＳ１相同性アーム（配列番号２３４、２３５）を有するドナーベクター（ｐＡＡＶＳ１－ＤＮＲ－ピューロマイシン）との２つのプラスミドを使用する。ＡＡＶＳ１標的化配列（配列番号２３６）を、予めｐＣＡＳ－Ｇｕｉｄｅプラスミドにクローニングした。ギブソンアセンブリーにより、ＳｂｆＩ及びＨｐａＩ制限酵素部位を追加することによってドナーベクターを改変し、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）及び変異体：ＰＲＳＩＭ＿２３のヘテロ二量体化成分を更にサブクローニングできるようにした。その後、ｐＨｅｔ－Ａｃｔ１－２－ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）－ＰＲＩＳＭ２３（３つのタンデムコピー）プラスミドを、ＳｂｆＩ及びＨｐａＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化してＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９）－ＰＲＩＳＭ２３のＤＮＡを得、更にこれをギブソンアセンブリーによってドナーベクターにサブクローニングした。ＨＣＶ ＮＳ３／４ ＰＲ（Ｋ１３６Ｄ）（配列番号２１１）、ＨＣＶ ＮＳ３／４ ＰＲ（Ｄ１６８Ｅ）（配列番号２１３）及びＨＣＶ ＮＳ３／４ ＰＲ（Ｋ１３６Ｎ）（配列番号２１５）を含むＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ変異体を、ＳｂｆＩ及びＡｆｅＩ制限酵素部位を使用して、ギブソンアセンブリーによってｐＨｅｔ－Ａｃｔ１－２－ＨＣＶ ＮＳ３／４ ＰＲ（Ｋ１３６Ｄ／Ｄ１６８Ｅ又はＫ１３６Ｎ）－ＰＲＩＳＭ２３からｐＡＡＶＳ１－ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）－ＰＲＩＳＭ２３－ピューロマイシンプラスミドにサブクローニングした。このヌクレオチド配列を、サンガーシーケンシングによって確認した。
誘導性プロモーターの制御下のみでＧＦＰ－ＰＥＳＴを発現する安定的な細胞を、ｐＡＡＶＳ１－ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ；Ｋ１３６Ｄ；Ｄ１６８Ｅ；Ｋ１３６Ｎ）－ＰＲＩＳＭ２３－ピューロマイシンドナーベクター及びｐＣＡＳ－Ｇｕｉｄｅ－ＡＡＶＳ１によって同時形質移入し、ＡＡＶＳ１遺伝子座に標的組み込みができるようにした。形質移入して４８時間後の増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清＋１％非必須アミノ酸＋８００μｇ／ｍｌ ジェネテシン）に１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加することによって形質移入細胞を選択した。選択期間の１４日後、５００ｎＭのシメプレビルによってポリクローナル細胞株を誘導し、ＧＦＰ蛍光強度に基づいてＦＡＣＳソートして、単一細胞クローンを単離した。最終的なモノクローナル細胞株（図２６Ｃ）を、５００ｎＭのシメプレビル処理に応答するＧＦＰシグナルに基づいてＦＡＣＳにより特性決定した。
シメプレビル誘導スイッチからＧＦＰ－ＰＥＳＴ発現のカイネティクスを測定するためのフローサイトメトリー
スプリット転写因子システムの制御下でＧＦＰ－ＰＥＳＴを発現するモノクローナル細胞株を組織培養フラスコから酵素的に除去し、９６ウェルのコラーゲン被覆プレートに蒔いた。翌日、細胞を１００ｎＭのシメプレビルで処理した。処理してから２４時間後、シメプレビルを含まない増殖培地内で細胞を２回洗浄し、更にシメプレビルを含まない培地で細胞を維持した。シメプレビルを除去した後の様々な時点における細胞のＧＦＰ蛍光を、Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のフローサイトメトリーによって測定した。分析のため、未処理の細胞のＧＦＰ蛍光（相対蛍光単位＝ＲＦＵ）を、全ての実験値から差し引いた。更に、シメプレビルを除去した時に取得された時点「０時間」にＲＦＵ値を正規化した。
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：ＰＲＳＩＭ５７複合体の構造決定
単鎖ＨＣＶプロテアーゼ構築物（Ｓ１３９Ａ変異を有するＮＳ３プロテアーゼのＮ末端に融合したウイルスＮＳ４Ａタンパク質由来の１１残基のペプチド）を、Ｎ末端のヘキサヒスチジン（６Ｈｉｓ）、次にタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位（それぞれアフィニティー精製及びタグの除去ができるようにするため）によって再設計した（配列番号２１８）。周辺質への分泌を誘導するＮ末端のｐｅｌＢリーダー、並びにＣ末端のＴＥＶ部位及び６Ｈｉｓタグを備えるＰＲＳＩＭ＿５７のｓｃＦｖを発現させるために、第２の構築物を設計した（配列番号２２１）。両方の配列を直線状ＤＮＡストリング（ＧｅｎｅＡｒｔ）として購入し、ギブソンアセンブリーを使用してｐＥＴ－２８ａベクター（細菌発現用）にクローニングした。最終構築物の配列は、全コード配列のサンガーシーケンシングによって確認した。
発現のため、ｐＥＴ－２８ａプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）含有プレートで選択を行った。各発現につき、単一コロニーを使用して５ｍｌの２ｘＴＹ＋５０μｇ／ｍｌのカナマイシン培養液に播種し、これを３７℃で一晩増殖させた。この培養液を使用して、５００ｍｌのＴＢ自己誘導培地（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ、１０ｍｌ／Ｌのグリセロールと１００μｇ／ｍｌのカナマイシンとを補充した）に１：５００希釈で播種した。ＯＤ６００が１．３～１．５になるまで培養液を３７℃で増殖させ、続いて２５℃（ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ））又は３０℃（ＰＲＳＩＭ＿５７）に移行して２０時間発現を誘導した。遠心分離によって細胞を回収し、ペレットを－８０℃で保存した。
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）のタンパク質を精製するために、５００ｍｌの培養液からそれぞれの細菌ペレットを解凍し、５０ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ ８．０）に再懸濁した。細胞を３０，０００ｋｐｓｉで細胞破壊器を通過させることで溶解し、この溶解物を４℃で３０分間、５０，０００ｇの遠心分離によって澄明化した。清澄化した上清を、５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に５ｍｌ／分の流量で負荷した。カラムを洗浄バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０、及び５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、４０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）で順次洗浄し、４０～４００ｍＭ イミダゾールから５カラム体積にわたるイミダゾール勾配で溶出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって画分を分析し、それらを正確なタンパク質をプールするために濃縮し、ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってバッファーを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．３ｍＭ ＴＣＥＰ、１０μＭ ＺｎＣｌ２、ｐＨ７．５（保存バッファー）と交換した。脱塩したタンパク質画分を、４℃で一晩、１：１００ｗ／ｗのＨｉｓタグ化ＴＥＶプロテアーゼによって処理した。ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムに試料を通してＴＥＶプロテアーゼを除去し、得られた素通り画分の材料を、保存バッファーで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ２６／６００カラムに負荷することで研磨した。
細胞ペレットの浸透圧ショックによって、ペリプラズムからＰＲＳＩＭ－５７のＨｉｓタグ化ｓｃＦｖ試料を放出させた：最初に、細胞を３００ｍｌの５０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％スクロース、ｐＨ８．０に再懸濁し、続いてペレット化して水中に再懸濁し、浸透圧ショックを与えてペリプラズムの内容物を放出させた。この試料をＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌカラムに負荷し、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）構築物に使用したものと同一のバッファーで洗浄及び溶出することによって精製した。溶出したタンパク質を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５中のＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラムに負荷することによってバッファーを交換し、１：５０ｗ／ｗの比率のＴＥＶプロテアーゼで４℃で一晩処理した。ＴＥＶ消化物を、プロテアーゼと同様にＩＭＡＣ及びサイズ排除ステップによって更に精製し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５中に保存した。
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）、ＰＲＳＩＭ＿５７、及びシメプレビルの三元複合体を形成するために、５０μＭの濃度のＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）を１．１倍過剰のＰＲＳＩＭ＿５７と混合し、３％のＤＭＳＯを含む終濃度１００μＭの最終溶液中にシメプレビルを添加した。試料を室温で６０分間インキュベートして平衡化させ、続いて２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５中、０．７５ｍｌ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６００カラムに負荷した。複合体を含む画分をプールし、１２ｍｇ／ｍｌとなるまで濃縮してアリコートに分割し、液体窒素中で急速凍結した後に－７０℃で保存した。複合体のアリコートを解凍してＨＰ－ＳＥＣカラムにかけ、結晶化する前の複合体の一体性と単分散度とを確認した。
シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して三元複合体を結晶化した。多数の登録商標の結晶化スクリーンを２７７Ｋ及び２９３Ｋに設定した。これらのスクリーニングによりヒットしたものを、必要に応じてシッティングドロップ及びハンギングドロップ蒸気拡散実験を使用して最適化した。２０～２５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００、１００～３００ｍＭ 塩化マグネシウム、及びＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０～８．０）から構成されるリザーバー溶液から、２９３Ｋにおいて最終的な結晶が得られた。結晶を２０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールを補充したリザーバーの凍害防止溶液に晒し、続いて液体窒素中で直接凍結した。
データ収集は、極低温でＤｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ、ビームラインｉ０４にて行った。構造を解析及び精緻化するためにＣＣＰ４及びａｕｔｏＢＵＳＴＥＲソフトウェアパッケージを使用し、モデルを手動で構築するためにプログラムＣｏｏｔを使用した。たんぱく質構造データバンクからのＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ（Ｓ１３９Ａ）のモデルを使用した分子置換によって構造を解析した。
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１９３）変異体の安定性についてのインシリコ予測
変異におけるＨＣＶタンパク質の安定性の変化を、Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｓｃａｎｎｉｎｇツール（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０２０－２；ＳｉｔｅＭａｐ，Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２０２０）を使用して算出した。
陰溶媒項を有するＰｒｉｍｅ ＭＭ／ＧＢＳＡエネルギー関数を計算に使用した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，２０１１）。変異周辺のタンパク質の精緻化に６Åのカットオフを使用した。安定性の変化における負の値は、変異体の安定性の増大とリンクしている。
ＰＲＩＳＭベースのキルスイッチクローニング
ＰＲＳＩＭ２３、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ、及びΔＣＡＲＤカスパーゼ９のキルスイッチ融合タンパク質をコードする配列であって、この３つのフラグメントの間に短いＧＧＧＳＧを有する配列（配列番号２２３）を、ベクターのｐｃＤＮＡ３．１内にクローニングされる遺伝子として、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入した。この融合タンパク質を、ギブソンアセンブリークローニングを使用して、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ消化レンチウイルスベクターであるｐＣＤＨ－ＥＦ１α－ＭＣＳ－（ＰＧＫ－ＧＦＰ－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ）（Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にサブクローニングした。カスパーゼ９ Ｓ１９６Ａ変異を生じさせるために、キルスイッチ構築物における同等のＳｅｒ３７１をＡｌａに変更したＤＮＡフラグメントをＧｅｎｅａｒｔで合成し、ＣｌａＩ／ＮｏｔＩ切断キルスイッチベクター（配列番号２３０）にクローニングした。遺伝子配列をＤＮＡ塩基配列決定法によって確認した。
ＰＲＩＳＭベースのキルスイッチ細胞株の生成
キルスイッチ融合タンパク質（配列番号２２３）又はキルスイッチＳ１９６Ａ変異体融合タンパク質（配列番号２３０）をコードするレンチウイルス粒子を、ｐＰＡＣＫＨ１ ＨＩＶレンチウイルスパッケージングキット（Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、製造元の指示書に従って生成した。８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下でＨＥＫ２９３細胞を２４時間形質導入し、その後、細胞を新鮮な増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清＋１％非必須アミノ酸）に移し変えた。２４時間後、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを５日間添加することによって形質導入細胞を選択した。機能性試験の前に、形質導入細胞のプールをＧＦＰ蛍光に基づいてＦＡＣＳソートし、高発現の細胞株プール及び単一細胞クローンを単離した。
増殖培地としてマッコイ５Ａ培地＋１０％ウシ胎児血清を使用し、形質導入細胞を選択するために２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを補充したことを除いて、同一のプロトコルに従ってＨＣＴ１１６及びＨＴ２９形質導入細胞を生成した。
また、ｈＥＳＣ系統のＳａ１２１（ＴａｋａｒａＢｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を、上記に記載したＰＲＳＩＭベースのキルスイッチ融合タンパク質をコードするレンチウイルス粒子で形質導入した（配列番号２２３）。細胞（継代数１９）をＤＥＦ－ＣＳ培養システムに３．５×１０５細胞／ｃｍ２で蒔き、３０時間後に細胞を形質導入した。形質導入してから２４時間後、ピューロマイシン選択を開始し、安定した細胞プールが得られるまで抗生物質選択を維持した。
ＰＲＳＩＭベースのキルスイッチを発現する安定的なｉＰＳ細胞株の生成
β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座に標的を組み込むための鋳型としてＡＡＶをコードするＤＮＡを使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術によって、シメプレビル誘導キルスイッチを安定的に発現する安定的な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）系統（Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ社のＲｅｓｅａｒｃｈ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍからの健康なヒトドナーの線維芽細胞に由来する単一クローン（Ｂ－３／１Ｆ１）を生成した。
ＰＲＳＩＭベースのキルスイッチ（配列番号２２３）をコードするドナー構築物（図３３Ａ）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｉｎｃ．から合成したものを購入し、ＡＡＶシャトルプラスミドのバックボーンにサブクローニングした。ドナー構築物をアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子にパッケージングした。要約すると、ＡＡＶ複製及びＡＡＶ２複製（ｒｅｐ）／ＡＡＶ６カプシド（ｃａｐ）タンパク質に必須のアデノウイルス成分をそれぞれコードする２つのヘルパープラスミド、ｐＡｄ５Ｈｅｌｐｅｒ及びｐＲ２Ｃ６でドナープラスミドを同時形質移入した。７２時間後に細胞を回収し、凍結融解によって細胞を破壊した。細胞溶解物をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（１００Ｕ／ｍｌ）によって３７℃で１時間消化し、遠心分離した。ベクターを含む上清を回収してイオジキサノール勾配を適用し、その後超遠心分離した。超遠心分離後、ベクターを含む溶液を回収し、遠心濃縮チューブ内で２０ｍＬのＰＢＳによって３回洗浄した。最終的に、溶液を１ｍＬとなるまで濃縮した。溶液に含まれるベクターのゲノムコピーをｑＰＣＲで測定した。
ビトロネクチン被覆６ウェルプレートに５０～７０％コンフルエンシーで播種したｉＰＳＣ細胞（約１．２×１０６細胞）を、形質移入／形質導入のために使用した。１×ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む２ｍＬの新鮮なＳｔｅｍＦｌｅｘ培地で細胞を維持した。各ウェルに、２２０ｎＭのＣＲＩＳＰＲ－リボヌクレオタンパク質及び１２μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む２００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地を適用した。一方、ＡＡＶベクターを５０，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で適用した。２４時間インキュベートした後、ＲＮＰ／ＡＡＶを含む培地を新鮮なＳｔｅｍＦｌｅｘ培地で置換した。
形質移入してから４８時間後に、培地を５μｇ／ｍＬのブラストサイジンＳ ＨＣｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む新鮮なＳｔｅｍＦｌｅｘ培地で置換した。培地を更に３～４日間、新鮮なブラスチジンを含むＳｔｅｍＦｌｅｘ培地で毎日置換した。続いて、通常のＳｔｅｍＦｌｅｘ培地で細胞を再び維持した。
Ｂ２Ｍ陰性であり、従ってＰＲＳＩＭベースのキルスイッチをコードする細胞を同定するため、ＦＡＣＳを実施した。ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してプレートから細胞を剥離し、５％のＡＰＣ標識抗ヒトＢ２Ｍ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．）溶液を含むＦＡＣＳバッファー（１％ ＰＢＳ及び１×ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌを含むＨＢＢＳ）に１×１０７細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。１０分間インキュベートした後、１０倍量のＦＡＣＳバッファーを使用して２回洗浄し、２×１０７細胞／ｍＬの密度でＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＡｒｉａ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってＢ２Ｍ陰性細胞を回収し、これを更なる実験のために培養した。
続いて、単一細胞プリンティングを使用して単一細胞クローンを単離した。ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してプレートから細胞を剥離し、ＳＣＰバッファー（１×ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌを含むＨＢＢＳ）に１．６×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。細胞懸濁液をＣｙｔｅｎａ ＣｌｏｎｅＳｅｌｅｃｔ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｐｒｉｎｔｅｒ（Ｃｙｔｅｎａ）のカートリッジに負荷した。マトリゲル、又は２００μＬの新鮮なｍＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むビトロネクチン被覆９６ウェルプレート、又は１×ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＳｔｅｍＦｌｅｘ培地に、細胞を１ウェル当たり１細胞で播種した。ＳＣＰの翌日に、培地を新鮮なＳｔｅｍＦｌｅｘ培地で置換した。
５つの単一細胞クローンを回収し、９６ウェルプレートからビトロネクチン被覆２４ウェルプレートに拡張し、更にビトロネクチン被覆６ウェルプレートに拡張して維持した。各単一細胞クローンにつき、約５×１０５細胞を回収した。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ゲノムＤＮＡを単離した。下記のプライマーを使用し、ＳｕｐｅｒＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ヒトＢ２Ｍ遺伝子の標的領域を増幅した。ＰＣＲ産物を、電気泳動用１．２％ アガロースゲルに負荷した。アンプリコンのサイズによって単一細胞クローンの遺伝子ノックイン状態を同定するために、ゲルを可視化した（図３３Ｂ）。クローン１Ｂ７、１Ｄ１２、１Ｇ８、及び２Ｄ８は、Ｂ２Ｍ遺伝子座で二対立遺伝子であることが分かり、これらをキルスイッチ活性の機能を分析するために使用した。
Figure 2022541761000009
キルスイッチ細胞の生存率及びカスパーゼ３機能アッセイ
ＰＲＳＩＭベースのキルスイッチ融合タンパク質（配列番号２２３）を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞、ＨＣＴ１１６細胞若しくはＨＴ２９細胞、又はＰＲＳＩＭキルスイッチのＳ１９６Ａ変異体融合タンパク質（配列番号２３０）を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞をコラーゲン被覆９６ウェルプレートに蒔き、２４時間後に１００ｎＭのシメプレビルで処理した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍ（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の１０倍又は２０倍の対物レンズを使用して、様々な時点で位相差画像を取得した。
機能的なカスパーゼ９によってカスパーゼ３が活性化するが、このタンパク質分解活性は、非蛍光基質であるＤＥＶＤ－ＡＭＣが、切断産物であるＤＥＶＤ及び蛍光性のＡＭＣに切断されることによって測定することができ、それによって４３０ｎｍのＡＭＣの蛍光シグナルがカスパーゼ３の活性に比例することが測定された。カスパーゼ３アッセイでは、細胞を６ウェルの組織培養処理済みプレートに二度繰り返して蒔いた。２４時間後、デュプリケイトウェルの１つを１０ｎＭのシメプレビルで３時間処理した。総タンパクインプット量をＢＣＡアッセイ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって５０μｇに正規化して修正し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのカスパーゼ３アッセイを使用して、製造元の指示書に従って細胞溶解物を３回繰り返して分析した。蛍光をＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって測定すると、Ｅｘ：３８０ｎｍ、Ｅｍ：４３０ｎｍであった。定量のため、アッセイ基質のみを含むウェルのＲＦＵ（生の蛍光値）を、アッセイ試料から導出された全てのＲＦＵから差し引いた。形質導入されていない、シメプレビルで処理した細胞に結果を正規化した。Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）で解析を実施し、一元配置分散分析の後に多重比較を使用した。
ＥＳＣ細胞におけるＰＲＳＩＭベースのキルスイッチ活性
Ｓａ１２１ ＥＳ細胞におけるキルスイッチの誘導を検証するために、細胞を３．５×１０５／ｃｍ２で蒔き、その２日後に１０ｎｍ～１μＭの濃度のシメプレビルで処理することによってキルスイッチ活性を誘導した。１０～２０分の範囲の間隔でＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して細胞を画像化し、コンフルエンシーを画像解析することでキルスイッチ効率を定量した。
ｉＰＳ細胞のシメプレビル誘導キルスイッチ活性を検出するためのリアルタイム細胞解析（ＲＴＣＡ）アッセイ
上記に記載した単一細胞クローンのそれぞれの細胞を、ビトロネクチン被覆９６ウェル電子マイクロタイタープレート（Ｅ－Ｐｌａｔｅ（登録商標）９６、ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）に、１ウェル当たり４０，０００細胞の密度で蒔いた。このプレートをｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅモジュールと接続して設定し、通常の細胞増殖を妨げることなく細胞増殖指数を経過観察することができるように、５％ ＣＯ２の加湿インキュベーター内で３７℃にてインキュベートした。細胞増殖指数を測定し、２４時間で１５分毎に記録した。続いて、異なる濃度のシメプレビルを添加し、細胞増殖指数を８時間で５分毎に測定し、続いて更に４０時間で１５分毎に測定した。各クローン、且つ各状態に対して、全ての実験をトリプリケートウェルで実施した。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐｒｏ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して平均細胞指数を定量した。
実施例２－二量体化の化学誘導（ＣＩＤ）モジュールのベースとしてのシメプレビル及びＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲの同定
新規の二量体化の化学誘導を生成するために、小分子誘導剤が臨床的に承認されている小分子であり、タンパク質成分のうちの１つが小分子の標的（標的タンパク質）である手法を採用した。第２のタンパク質成分（結合メンバー）は、結合分子（Ｔｎ３又はｓｃＦｖ）のライブラリーに由来するものであり、非結合の標的タンパク質と比較すると、低分子に結合した標的タンパク質に対して優れた選択性を示す（図１）。この小分子がすでに適切な用量でヒトに使用することが安全であると見なされていることを考慮して、本発明者らは、承認された小分子に着目することによって、規制当局の承認までの道のりが大幅にスムーズになるものと結論づけた。ヒトタンパク質を標的にした小分子を使用するのではなく、代わりに抗ウイルス化合物などの非ヒトタンパク質に結合する小分子に着目することにした。本発明者らは、この手法の利点は、（非感染症の）患者に標的タンパク質が存在せず、その薬物動態に影響を与える可能性のある小分子の結合に競合が存在しないため、小分子が有害となる可能性のある任意のオンターゲットの薬理作用を誘発することがないことにあると結論づけた。好ましい小分子／標的タンパク質のペアを決定するために、以下の基準を考慮した。
理想的な小分子の基準としては、
・承認済みであること
・長期間投与に好適であること（６ヵ月超で毎日）
・細胞浸透性であること
・経口投与であること
・抗ウイルスの一次治療として使用されていないこと
理想的な標的タンパク質の基準としては、
・単量体であること
・小型であること（≦３０ｋＤａ）
・標的タンパク質（若しくはそのドメイン）が過剰発現しても非毒性であるか、又は、標的タンパク質を不活性にすることができるが、ただしＳＭ結合を保持すること
・細胞質内に発現させることができること（即ち、膜と一体となっていない、又はＤＮＡに結合していない）
小分子：標的タンパク質複合体の基準としては、
・結合した標的タンパク質が、非結合の標的タンパク質とは異なるエピトープを有するであろうと考えられる理由が存在すること。
大規模な分析を行い、特定された好ましい小分子／標的タンパク質のペアの１つが、シメプレビルと、その標的であるＣ型肝炎ウイルス由来のＮＳ３／４Ａプロテアーゼ（ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ）であった。シメプレビル（Ｏｌｙｓｉｏ（登録商標））は、経口投与される小分子であり、細胞膜透過性で、一日一回の投与を支持する薬物動態（ＰＫ）プロファイルを有する。シメプレビルは、ＨＣＶ感染症を治療するために、リバビリン及びＰＥＧ化インターフェロンと併用して長期間（最大３９ヵ月）使用され、ＷＨＯ必須医薬品リストに記載されており、忍容性が良好で、広範囲にわたって投与される薬剤であることが示されている。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲは、単量体で比較的サイズが小型であり（２１ｋＤａ）、細胞質内に発現させることができ、ＤＮＡとの会合が見られない。更に、複合体（ＰＤＢコード：３ＫＥＥ）の３次元Ｘ線結晶構造解析によって、シメプレビルが、３６４Åの露出した表面積を有するＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲの浅い基質結合溝内で結合していることが明らかになった（図２）。本発明者らは、この比較的大きな露出面積は、非結合のＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲとは十分に異なるものであり、これによって複合体に特異的な結合分子を特定することが可能であると結論づけた。
実施例３－変異体ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）は活性が著しく低下するにもかかわらずシメプレビルへの結合を保持する
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲは、ＨＣＶポリタンパク質前駆体の４つの接合部で切断を行う酵素であり、限られた数の内在性のヒト標的を切断することが知られている（Ｌｉ，Ｓｕｎ，ｅｔ ａｌ．２００５；Ｌｉ，Ｆｏｙ，ｅｔ ａｌ．２００５）。本発明者らは、ヒト細胞内でこの活性を制限するために、酵素的に不活性ではあるがシメプレビルとの結合を保持する、変異型のＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲを特定することが必要であると結論づけた。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲの活性部位変異体（Ｓ１３９Ａ）は、野生型の対応物よりも著しい活性の低さを示すことがこれまでに分かっている（Ｓａｂａｒｉｅｇｏｓ ｅｔ ａｌ．２００９）。このことを確認し、変異体ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲがシメプレビルとの結合を保持するかどうかを調査するために、組換えタンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現させ、これを均質になるまで精製した。Ｎ末端にヘキサヒスチジン及びＡｖｉＴａｇを有するＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲのＷＴ（配列番号３）とＳ１３９Ａ変異体（配列番号４）との両方を、自己誘導によって誘導されたＢＬ２１（ＤＥ３）の１リットルの培養液中で別々に発現させた。培養液を回収し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを組み合わせることによってタンパク質を精製した。最終的にプールされた試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価すると、９９％超の純度レベルが示された（図３Ａ）。精製されたタンパク質のアリコートを、ＢｉｒＡ酵素を使用してＡｖｉＴａｇにおいて部位特異的にビオチン化し、サイズ排除クロマトグラフィーで再精製した。質量分析で確認すると、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲのＷＴ及びＳ１３９Ａの両方でビオチン化の組み込みが１００％であった。
蛍光発生ペプチド切断アッセイで、これらの組換えＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲのＷＴ及びＳ１３９Ａタンパク質の酵素活性について試験すると、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲのＳ１３９Ａ変異体の活性が著しく低下していることが確認された。ほとんどの濃度試験において酵素活性を検出することができず、ｎＭ～μＭの高濃度でのみ最小限の活性が観察された（図３Ｂ）。
ＷＴ及びＳ１３９ＡのＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲタンパク質に対するシメプレビルの結合親和性を評価するために、等温熱量測定を行った。どちらのタンパク質においても非常に類似した結果が得られ、同一の化学量論比（約０．６ シメプレビル／ＮＳ３結合部位）及びΔＨ値（約２２ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であった（図３Ｃ）。計算された解離定数は非常に低い（約１ｐＭ）ものであったが、関連誤差が非常に大きく（１０ｎＭ）、このことは、競合するリガンドを使用せずにこの手法を使用して正確に測定するには親和性が高すぎることを示唆している。それにもかかわらず、化学量論比及びΔＨの値が同一であるため、ＷＴとＳ１３９ＡのＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲタンパク質との間で結合親和性に大きな差異がないという可能性は非常に高い。
これらのデータに基づいて、本発明者らは、Ｓ１３９Ａ変異体タンパク質をベースとしたＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ：シメプレビル複合体特異的結合（ＰＲＳＩＭ）分子の選択を進めることを決定した。
実施例４－ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：シメプレビル複合体特異的結合（ＰＲＳＩＭ）分子の選択
シメプレビル存在下のビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）に、４ラウンドのファージディスプレイ選択を行った。ラウンド３及びラウンド４の選択アウトプットから、シメプレビル存在下及び非存在下の両方におけるビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）にファージＥＬＩＳＡを実施し、蛍光シグナルを測定することによって結合を測定した（図４Ａ及び図４Ｂ）。ファージＥＬＩＳＡの結合データを、同一クローンのＤＮＡ配列データと比較し、シメプレビルの存在下でビオチン化ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）に選択的に結合することを示す独自の配列を有する３４個のｓｃＦｖクローン及び２８個のＴｎ３クローンのパネルを選択し、更なる生化学的研究のために発現させた（表１Ａ及び表１Ｂ）。加えて、更なる生化学的研究のために、シメプレビルの存在下及び非存在下の両方でビオチン化ＨＣＶ Ｎ３／４Ａプロテアーゼ（Ｓ１３９Ａ）への結合を示した１つのｓｃＦｖクローン（ＰＲＳＩＭ＿５１）及び３つのＴｎ３クローン（ＰＲＳＩＭ＿５４、ＰＲＳＩＭ＿５５、及びＰＲＳＩＭ＿８５）も選択した。
Figure 2022541761000010
Figure 2022541761000011
＊全てのデータは、シメプレビルの非在下で測定された括弧内のデータを除き、シメプレビルの存在下で記録されたものである。
実施例５－ＰＲＳＩＭ分子のパネルはＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：シメプレビル複合体に特異的である
ファージディスプレイ選択から複合体特異的であると特定されたＰＲＳＩＭ結合タンパク質を、更なる分析のための十分な材料を提供するために、より大きなスケールで発現及び精製した。全てのＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：シメプレビル複合体特異的ＰＲＳＩＭ分子にホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）結合スクリーニング（図５）を行い、８つのＴｎ３ベースの分子、及び１４個のｓｃＦｖベースの分子のパネルが複合体特異的であり、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）タンパク質単体への結合が検出できなかったことを確認した（表１（太字）、図６）。
ＰＲＳＩＭ結合分子を更に特性決定するために、５つのｓｃＦｖ分子（ＰＲＳＩＭ＿４、ＰＲＳＩＭ＿５７、ＰＲＳＩＭ＿６７、ＰＲＳＩＭ＿７２、及びＰＲＳＩＭ＿７５）、並びに５つのＴｎ３分子（ＰＲＳＩＭ＿２３、ＰＲＳＩＭ＿３２、ＰＲＳＩＭ＿３３、ＰＲＳＩＭ＿３６、ＰＲＳＩＭ＿４７）を選択し、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋを使用して、シメプレビルの存在下又は非存在下におけるＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）プロテアーゼ結合のカイネティクスを測定した（表２）。試験したＰＲＳＩＭ結合分子は全て、シメプレビルが結合したＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）に対して選択性を示し、３つだけがＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）単体にわずかな非特異的結合を示した。更に特性決定するために、ＰＲＳＩＭ＿５７（図７Ａ）及びＰＲＳＩＭ＿２３（図７Ｂ）を選択した。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）は、ＰＲＳＩＭ＿５７（ｓｃＦｖ）に対して１５．０ｎＭの親和性を有し、ＰＲＳＩＭ＿２３（Ｔｎ３）に対して６．３ｎＭの親和性を有していた。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）／ＰＲＳＩＭ５７／２３複合体の形成におけるシメプレビル濃度の影響も評価した（図７Ｃ）。シメプレビルは、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）との複合体ではＰＲＳＩＭ＿５７及びＰＲＳＩＭ＿２３とほとんど同等のＥＣ５０を有し、それぞれ４．５７ｎＭ及び４．０３ｎＭであった。
表２：シメプレビル存在下又は非存在下のＰＲＳＩＭ結合分子に対するＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）の結合に関する結合定数及びカイネティクス定数を測定した。対照としてシメプレビル存在下のＢＳＡを使用した。
Figure 2022541761000012
実施例６－ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤはスプリットタンパク質の再構成を調節することができる
シメプレビル：ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）複合体に特異的に結合するＰＲＳＩＭ結合分子を単離することで、本発明者らはこのシステムを使用してスプリットタンパク質の再構成を調節することが可能であると結論づけた。細胞内のタンパク質二量体化の時間的及び空間的な制御を提供することによって、ＣＩＤを翻訳後の状況の範囲内に適用し、所望のタンパク質相互作用又は活性を制御することが可能となる。再構成すると活性を獲得するスプリットタンパク質の多数の例が存在するが、そのうちの１つは、ＮａｎｏＢｉＴシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で提供されているようなスプリットＮａｎｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅである（図８）。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）をＳｍＢｉＴに融合し、ＰＲＳＩＭ結合メンバーをＬｇＢｉＴに融合することで、このシステムをＰＲＳＩＭベースのＣＩＤに適用させた。スクリーニングを実施して、ＬｇＢｉＴへのＮ末端及びＣ末端融合体と、ＳｍＢｉＴに融合されたＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）の同等のＮ末端及びＣ末端融合体との両方を使用して、ファージ選択プロセスから生じた５つのＴｎ３及び６つのｓｃＦｖのＰＲＳＩＭ結合モジュールを試験した。細胞を適切なプラスミドで形質移入して２４時間インキュベートし、続いて１００ｎＭのシメプレビル若しくは溶媒対照（又は、キットに同梱されたＦＲＢ：ＦＫＢＰ１２対照の場合は１００ｎＭのラパマイシン）で処理した。発光を測定し、シメプレビルの非存在下で得られたシグナルに対するシメプレビル存在下のシグナルの倍率変化を算出した（図９）。全体的な傾向を観察すると、一般的に、ＬｇＢｉＴをＰＲＳＩＭ結合モジュールのＣ末端に融合させた場合にのみ、発光の大幅な倍率変化が観察された。以下のＰＲＳＩＭ結合モジュールに、関連するバックグラウンドを上回る有意なシグナルが観察された：ＰＲＳＩＭ＿２３（３１倍）、ＰＲＳＩＭ＿３３（９倍）、ＰＲＳＩＭ＿０１（１６倍）、ＰＲＳＩＭ＿０６（１１倍）、ＰＲＳＩＭ＿５７（１４倍）、及びＰＲＳＩＭ＿７５（５１倍）。この結果は、シメプレビルの存在下の多数の単離したＰＲＳＩＭ結合モジュールが、ＮａｎｏＢｉＴシステム由来のスプリットＮａｎｏＬｕｃの二量体化を特異的に誘導することができることを示している。
実施例７－ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤはスプリット転写因子の再構成によって遺伝子発現を調節することができる
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）及びＰＲＳＩＭ分子をスプリットＮａｎｏＬｕｃ酵素の別個の成分に融合させることによって、ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤがスプリットタンパク質の活性を再構成することができるということが立証されたため、本発明者らは、スプリット転写因子の２つのドメインに融合することによって、同ＣＩＤが導入遺伝子の発現を調節することが可能であると結論づけた。このことを立証するため、本発明者らは、２つの別個のベクターが提供されているｉＤｉｍｅｒｉｚｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎシステム（タカラバイオ株式会社）を使用した：一方のベクター（ｐＨｅｔ－Ａｃｔ１－２）では、ＩＲＥＳ配列によって隔てられ、恒常的プロモーターのＣＭＶの前に配置されている、活性化ドメイン（ＡＤ）ｐ６５に融合されたＦＲＢと、３コピーのＦＫＢＰ１２に融合されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）ＺＦＨＤ１とをコードしており、他方のベクター（ｐＺＦＨＤ１＿Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）では、最小ＩＬ－２プロモーターの上流に１２コピーのＺＦＨＤ１認識配列を含む誘導性プロモーター制御下のルシフェラーゼをコードしている。両方のプラスミドを細胞に形質移入すると、ＦＲＢ－ＡＤタンパク質とＤＢＤ－ＦＫＢＰ１２タンパク質とが発現し、ＤＢＤが誘導性プロモーター上の標的部位を認識するが、プロモーターに近接したＡＤが存在しないため、転写開始が起こらない。ラパログ誘導剤の「Ａ／Ｃヘテロダイマライザー」を加えたときだけ、ＡＤがルシフェラーゼ遺伝子の上流のプロモーターに結合したＤＢＤをリクルートして、発現が開始する。
ＦＲＢ及びＦＫＢＰ１２のコード配列を、１コピーのＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）、及び活性化ドメインのＮ末端又はＤＮＡ結合ドメインのＣ末端のいずれかに融合された、下記に記載される１１個のＰＲＳＩＭ分子の１つをコードする配列と交換した（図１０）。ｐＨｅｔ－Ａｃｔ１－２（ＰＲＳＩＭ）及びｐＺＦＨＤ１＿Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ構築物で細胞を形質移入した後、ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤが、濃度を上昇させたシメプレビルの存在下でルシフェラーゼ遺伝子の発現を調節する能力を評価した。異なるＰＲＳＩＭベースのＣＩＤ構築物は、１．４～１４６倍の範囲の用量依存的な遺伝子発現調節を示し（図１１Ａ、図１１Ｂ、表３）、６つのＴｎ３ベースのＰＲＳＩＭ分子及び５つのｓｃＦｖベースのＰＲＳＩＭ分子では、遺伝子発現が１０倍以上増加したことを示した。活性化ドメインに融合したＰＲＳＩＭ＿２３をベースとした、Ｔｎ３ベースのクローンで達成された最大倍率変化は１０６倍であった。興味深いことに、ＰＲＳＩＭクローンの大部分は、ＡＤ又はＤＢＤのいずれかへの融合に優先傾向があることが示されたが、ＰＲＳＩＭ＿２３は、どちらに対しても強力な遺伝子発現調節をもたらすことができるという点でユニークである（ＡＤに融合する場合は１０６倍、及びＤＢＤに融合する場合は８８倍）。また、ＰＲＳＩＭ＿２３は最も低いＥＣ５０（２ｎＭ）を示しており、転写を活性化するにはより低濃度のシメプレビルが必要であることを意味している。シメプレビルを添加したときに最も高い倍率変化を示したクローンは、ＤＢＤに融合したｓｃＦｖベースのＰＲＳＩＭ＿５７であり、１４６倍の誘導と低いＥＣ５０値（３ｎＭ）を達成した。
Figure 2022541761000013
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）－ＡＤ及びＤＢＤ－ＰＲＳＩＭ＿２３又はＤＢＤ－ＰＲＳＩＭ＿５７ベースの構築物がシメプレビルの存在下でルシフェラーゼの発現を調節する能力を、ＦＲＢ：ＦＫＢＰ１２：ラパログ陽性対照と直接比較すると、ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤ（１００倍の増加）がＦＲＢ：ＦＫＢＰ１２ベースのＣＩＤ（３０倍の増加）を上回った（図１２Ａ）。誘導剤（即ち、シメプレビル又はラパログ）の非存在下で得られた発光値を分析すると、ＦＲＢ：ＦＫＢＰ１２：ラパログベースのＣＩＤでレベルが高いことが明らかとなり、このことは、ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤにおいて漏れレベルが向上したことを示唆している（図１２Ｂ）。
実施例８－ＤＢＤに融合したＰＲＳＩＭのタンデムコピーを増加させると遺伝子調節が向上する
ＤＮＡ結合ドメインに融合した標的タンパク質のコピー数の影響を評価するために、ＦＲＢ－ＡＤ又はＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）－ＡＤ及びＤＢＤ－ＦＫＢＰ１２又はＤＢＤ－ＰＲＳＩＭ＿２３（ＤＢＤに融合したタンパク質は、単一コピー又は短いペプチドリンカーによって隔てられた３つのタンデムコピーのいずれかとして含まれている）をコードするｐＨｅｔ－Ａｃｔ１－２ベースの構築物を生成した（図１３）。ＰＲＳＩＭ＿２３ベースのＣＩＤがシメプレビルの存在下でＮａｎｏＬｕｃ－ＰＥＳＴタンパク質の発現を調節する能力を、ＦＲＢ：ＦＫＢＰ１２：ラパログ陽性対照と比較すると、１コピーのＤＢＤ融合パートナー又は３コピーのＤＢＤ融合パートナーのいずれかを使用した場合、ＰＲＳＩＭ＿２３ベースのＣＩＤがＦＲＢ：ＦＫＢＰ１２ベースのＣＩＤよりも優れている（１コピーでは５５倍対１３倍、３コピーでは１００倍対５５倍）ことが分かった（図１４Ａ）。
更に、ＤＢＤに融合した１、２、又は３つのタンデムコピーのＰＲＳＩＭ＿２３の影響を同一のスプリット転写因子アッセイで評価し、ホタルルシフェラーゼの発現誘導を測定すると、段階的な応答が観察された；１コピーのＰＲＳＩＭ＿２３では、３６４．５の最大倍率変化が得られた一方で、２タンデムのＰＲＳＩＭ＿２３分子では２４３６の最大倍率変化が得られ、更に３タンデムのＰＲＳＩＭ＿２３分子では４８６２倍に増加した（図１４Ｂ）。
このデータは、より多くの活性化ドメインのコピーをリクルートすることによって、誘導性プロモーターによる遺伝子発現の調節を向上させることができ、且つ、このことは一般的な現象であって、使用したＣＩＤに依存するものではないことを示唆している。
実施例９－ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤは、スプリットキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の活性を調節することができる
化学的に誘導されるヘテロ二量体化によってＣＡＲ活性を調節することは、ＣＡＲの機能を調節するための有効な方法であることがこれまでに示されている（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２０１５）；（Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．２０１８）。本発明者らは、ヘテロ二量体化するＰＲＳＩＭ成分をＣＡＲに適用すれば、同様の方法でＣＡＲの調節が促進されるのではないかという仮説を立てた。ＣＡＲの機能を調節するための比較対象として、前述のＦＫＢＰ１２：ＦＲＢシステム（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２０１５）を使用した。このことを検証するために、レンチウイルス発現システムを使用して、ＰＲＳＩＭ及びＦＫＢＰ１２：ＦＲＢによって調節を受けるＣＡＲを発現するようにジャーカットＴ細胞を改変した（図１５Ａ）。抗原結合してＣＡＲが活性化すると、ラパマイシン類似体ＡＰ２１９６（ＦＫＢＰ１２：ＦＲＢのダイマライザー）又はシメプレビル（ＰＲＳＩＭのダイマライザー）のいずれかの存在下で、ＩＬ－２が用量依存的な様式で分泌される結果となった（図１５Ｂ）。ＩＬ－２の発現は、ＩＬ－２特異的ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって迅速に定量することができる。これらのシステムの設計では、適切なダイマライザーの存在下で、抗原結合時にのみＴ細胞の活性化を促進する必要がある。ＰＲＳＩＭ及びＦＫＢＰ１２：ＦＲＢの両方によって調節を受けるＣＡＲシステムでは、シメプレビル又はＡＰ２１９６をそれぞれ添加すると、ＩＬ－２の産生を測定したときに、抗原陽性のＨｅｐＧ２細胞の存在下でＣＡＲ発現ジャーカット細胞が用量依存的に活性化される結果となった（図１６）。重要なことに、抗原陰性のＡ３７５細胞の存在下では、いずれのＣＡＲも活性化されなかったことが観察された（図１６）。ＦＫＢＰ１２：ＦＲＢ及びＰＲＳＩＭシステムはいずれも用量依存的に活性化することを示したが、ＰＲＳＩＭシステムではＣＡＲ活性をより厳密に制御していることが示されており、このことは、バックグラウンドのＩＬ－２レベルがより低く、ＣＡＲ活性のダイナミックレンジがより大きかったことによって証明される（図１６）。どちらのシステムも、同程度の最大のＩＬ－２発現レベルを示した。これらのデータは、ＣＡＲによって開始される細胞内シグナル伝達経路をシメプレビルを媒介して調節するために、ＰＲＳＩＭヘテロ二量体化システムを使用することが可能であることを示している。
実施例１０－ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤは、抗体（ＭＥＤＩ８８５２）の遺伝子発現を調節することができる
ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤを使用して、２つの組換え細胞内タンパク質（ルシフェラーゼ（実施例７）及びＮａｎｏＬｕｃ－ＰＥＳＴ（実施例８））の遺伝子調節を立証することに加え、分泌型抗体（ＭＥＤＩ８８５２；配列番号２０５及び配列番号２０６）の遺伝子発現の調節についても調査した。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）－ＡＤ及びＤＢＤ－ＰＲＳＩＭ＿２３（３つのタンデムコピー）をコードするｐＨｅｔ－Ａｃｔ１－２ベースの構築物と、ｐＺＦＨＤ１＿ＭＥＤＩ８８５２をコードする構築物とを生成した。これらの２つの構築物で細胞を形質移入した場合に、Ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ／ＮＨＰ ＩｇＧ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ）を使用して測定すると、ＭＥＤＩ８８５２の発現はシメプレビルの用量に依存することが示された（図１７）。
実施例１１－ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤは、アデノ随伴ウイルスによってタンパク質の遺伝子発現を調節することができる
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターとは、ＰＲＳＩＭ＿２３／ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）ベースのＣＩＤをコードするＤＮＡを細胞に送達し、遺伝子療法を制御するために使用することができる、十分に研究されたプラットフォームであることを意味する。そのような１つの用途としては、実施例７に記載されたＰＲＳＩＭ＿２３／ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）ベースのスプリット転写因子成分をＡＡＶ粒子と共に又は別々に細胞に送達して、外来性導入遺伝子を調節することである。本明細書に記載されているシステムとの関連では、ＡＡＶのパッケージング容量により、同一のＡＡＶベクターで送達することができる導入遺伝子のサイズは約５５０ｂｐに制限され、又は別々のＡＡＶ粒子で送達することができる導入遺伝子のサイズは約３．６ｋｂに制限される。
ＣＩＤをコードするＤＮＡと誘導性導入遺伝子とを「トランス」で送達することを立証するために、２つの異なるＡＡＶベクターを生成した。一つは、ＰＲＳＩＭ＿２３／ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）ベースのスプリット転写因子成分をコードし、恒常的ＥＦ１／ＨＴＬＶハイブリッドプロモーターによって発現が誘発されるベクターと、二つ目は、誘導性ＺＦＨＤ１プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするベクターである（図１８Ａ）。これらのベクターからＡＡＶ粒子を生成し、続いて２つの別々のＡＡＶ８調製物でＨＥＫ２９３細胞を形質導入すると、両方のＡＡＶ８粒子プレップを加えた場合にのみ、ＰＲＳＩＭ＿２３／ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）ベースのＣＩＤによるルシフェラーゼ遺伝子発現のシメプレビル用量依存的調節が観察され、ルシフェラーゼ活性が２２８倍に誘導された（図１８Ｂ）。
ＣＩＤと誘導性導入遺伝子とを「シス」で送達できることを立証するために、ＰＲＳＩＭ＿２３／ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）ベースの転写因子成分と誘導ＩＬ－２導入遺伝子との両方をコードするＡＡＶ８ベクターを生成した（図１８Ｃ）。このＡＡＶベクターを使用して生成したＡＡＶ８粒子でＨＥＫ２９３細胞を形質導入した後に、ＰＲＳＩＭ＿２３／ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）をベースとしたＩＬ－２遺伝子発現のシメプレビル用量依存的調節が観察され、最大レベルで約３５００ｐｇ／ｍｌのＩＬ－２が観測された（図１８Ｄ）。試験されたシメプレビルの最高濃度でのＰＲＳＩＭ＿２３／ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）ベースのＣＩＤによって誘導されたＩＬ－２発現レベル（３５０６＋／－８１７ｐｇ／ｍｌ）は、恒常的ＣＡＧプロモーターの制御下でＩＬ－２導入遺伝子をコードする対照のＡＡＶ８ベクターから得られたＩＬ－２発現レベル（２６０６＋／－１８９ｐｇ／ｍｌ）と同程度であった（図１８Ｅ）。
このように、単一のＡＡＶをベースとしたシステム又は二重ＡＡＶをベースとしたシステムのいずれかを使用して、ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤがＡＡＶ形質導入によって遺伝子発現を制御する能力が立証された。
実施例１２－ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤは、内在性遺伝子の転写を調節することができる
ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤが、スプリット転写因子の２つのドメインに融合することによって導入遺伝子の発現を調節することができることが立証されたため、本発明者らは、ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤが内在性遺伝子の発現も調節することが可能であると結論づけた。化学的に誘導されるヘテロ二量体化システムを使用して内在性遺伝子の活性を調節することは、遺伝子調節の有効な方法であることがこれまでに分かっている（Ｆｏｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．２０１９）。従って、本発明者らは、ヘテロ二量体化するＰＲＳＩＭ成分を活性化ＣＲＩＳＰＲ（ＣＲＩＳＰＲａ）システムに適用すれば、同様の方法で内在性遺伝子の調節を促進することができるのではないかという仮説を立てた。
このことを立証するために、不活性型のストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９酵素（ｄＣａｓ９）と、３つの転写活性化因子（ＶＰ６４、ｐ６５、及びＲｔａ、つまりＶＰＲ）の融合体からなる活性化ドメイン（ＡＤ）とを、ＣＩＤの２つのタンパク質成分（それぞれ３コピーのＰＲＳＩＭ＿２３及びＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ））と別々に融合させ、小分子誘導剤の存在下でのみＡＤがｄＣａｓ９に近接するようにした。ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤと、インターロイキン－２（ＩＬ－２）のプロモーターを標的としたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを同時形質移入することによって、ｄＣａｓ９がＩＬ－２のプロモーター上の標的部位に結合することが可能となる。ＰＲＳＩＭのダイマライザー（シメプレビル）を投与すると、続いてＡＤ及び関連する転写機構が内在性のＩＬ－２遺伝子のプロモーター領域にリクルートされ、転写を開始することが可能となる（図１９Ａ）。従って、システムの活性化は、ＩＬ－２の産生によって測定することができ、且つＩＬ－２特異的サイトカインアッセイ（ＭＳＤ）によって定量することができる。
ＰＲＳＩＭによって調節を受けるスプリットｄｃａｓ９／ＡＤカセットと、ＩＬ－２を標的としたｇＲＮＡとを一過性に発現させたＨＥＫ２９３細胞では、シメプレビルを添加するとＩＬ－２の分泌が生じた。（図１９Ｂ）。重要なことに、このシステムの一部だけ（ｇＲＮＡのみ、又はＰＲＩＳＭ－ｄＣａｓ９のみ）を発現させた細胞や、又はＩＬ－２を標的としないｇＲＮＡを発現させた細胞では、ＩＬ－２が検出されなかった。
これらのデータは、内在性遺伝子の発現をシメプレビルを媒介して調節するために、ＰＲＳＩＭヘテロ二量体化システムを使用することが可能であることを示している。
実施例１３－ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：ＰＲＳＩＭ＿２３及びＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：ＰＲＳＩＭ ５７複合体は、シメプレビルに特異的である
活性化スイッチ複合体の形成がシメプレビルの存在に依存していることが立証されたため、ＨＣＶプロテアーゼの代替的な小分子阻害剤に対してこの相互作用の特異性を検証することが望まれた。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼに結合することが公知であり、ヒトへの使用が承認されているいくつかの小分子阻害剤が存在する。そのような小分子のパネルを、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）とＰＲＳＩＭ＿２３又はＰＲＳＩＭ＿５７との間の複合体形成を誘導する能力について評価した。それらの小分子とは、グレカプレビル、ボセプレビル、テラプレビル、アスナプレビル、パリタプレビル、バニプレビル、ナラプレビル、グラゾプレビル、及びダノプレビルであった。
ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）結合アッセイ（図２０）を実施し、シメプレビルをその代替となるＨＣＶ ＰＲ阻害剤の小分子によって置換したときに形成されるＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：ＰＲＳＩＭ＿２３複合体と、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：ＰＲＳＩＭ＿５７複合体とのレベルを測定した。どちらのＨＣＶ ＰＲ阻害剤もＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）及びＰＲＳＩＭ＿２３と複合体を形成することができず、またＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：ＰＲＳＩＭ＿５７とも複合体を形成することができないため、複合体形成の誘導はシメプレビルに特異的であったことが分かった。
このデータは、ＨＣＶ感染者の場合に投与されるような、他のＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ阻害剤の小分子を投与しても、活性なＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：ＰＲＳＩＭ＿２３複合体を形成することができず、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：ＰＲＳＩＭ＿２３複合体がシメプレビルに絶妙に特異的であることを示唆している。
実施例１４－シメプレビルに対する親和性を低下させることが予測されるＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲの残基
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲに対するシメプレビルの親和性は非常に高く（実施例３、図３Ｂ）、この親和性の高さは、シメプレビルの投与を停止したときに複合体が解離し得る速度に影響を与える可能性がある。シメプレビルに対する親和性を低下させたＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ変異体を同定することによって、複合体の半減期をある程度柔軟に調節することができ、必要であれば、例えば有害事象に直面して活性を早急に回復させることが必要となる場合、そのようなＰＲＳＩＭベースのＣＩＤをより早急に不活性化させることが可能となる。
シメプレビルの結合を低下させるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）プロテアーゼタンパク質の変異を同定するために、最初に、シメプレビルとの複合体におけるＨＣＶ ＮＳ３／ＮＳ４Ａの共結晶構造（ＰＤＢ：３ＫＥＥ、分解能：２．４Å）を分析した。この分析によって、ＨＣＶ ＮＳ３／ＮＳ４Ａ：シメプレビルの界面が２５個のＨＣＶの残基から構成されており、６個の残基が水素結合と塩橋との相互作用に寄与し、１２個の残基が表面に露出していることが分かった（図２１）。次の２つの基準で選択を行うことによって、詳細な変異分析に含めるための残基を選別した：第１に、変異導入がＰＲＳＩＭ分子の複合体に対する結合に及ぼすあらゆる悪影響を避けるために、溶媒に暴露された残基を排除し、第２に、アラニンに変異するときの自由エネルギーの変化が１ｋｃａｌ／ｍｏｌを上回ると予測されることが示された残基を含めた。続いて、自由エネルギー摂動計算を使用して、相互作用するこれらの残基（Ｈ５７、Ｋ１３６、Ｓ１３９、及びＲ１５５）の側鎖を変異させたときの相対的な結合自由エネルギーを予測した。シメプレビルに対するＨＣＶプロテアーゼの親和性を低下させることが予測される変異を表４に列記した。ＦＥＰ＋アラニンスキャニング解析では、Ｄ１６８の予測結合自由エネルギーにおいて比較的小さな変化が予測されたにすぎなかったが、その公表されているシメプレビルへの耐性における役割から、この位置で更に３つの変異（Ｄ１６８Ａ、Ｄ１６８Ｅ、及びＤ１６８Ｑ）を実験的に評価した。
Figure 2022541761000014
実施例１５－ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲの変異はＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：シメプレビル：ＰＲＳＩＭ＿２３複合体の形成に影響を与える
シメプレビルに対するＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲの親和性を低下させると予測される変異体のパネルが特定されたため、本発明者らは、変異がシメプレビルに対するＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲの親和性に予測した通りに影響を与えるのであれば、このことがＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：シメプレビル：ＰＲＳＩＭ＿２３複合体の形成に影響することになると結論づけた。これらの変異がＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：シメプレビル：ＰＲＳＩＭ＿２３複合体の形成に及ぼす影響を評価するために、濃度を増加させたシメプレビルの存在下で、ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）結合アッセイ（図２２）で複合体形成物の量を測定した。
Ｒ１５５位、Ｈ５７位、及びＳ１３９位に生じさせた変異は耐性がなく、複合体が形成されないことが分かった。Ｋ１３６位に生じさせた変異では、複合体に適したＨＣＶ ＰＲ変異体が生じ、複合体形成の程度がＨＣＶ ＰＲの「ｗｔ」で観察されたものと同様の最大値に達した。残基Ｄ１６８における変異も耐性がないが、同等のＨＣＶ ＰＲ濃度において形成された複合体の量が減少した。シメプレビルに関して観察されたＥＣ５０は、Ｋ１３６Ｎ及びＫ１３６Ｄ変異体、並びにＤ１６８位の全ての変異体で増加しており、これらの変異体の複合体内に異なる親和性が存在することを示している。
実施例１６－いくつかのＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ変異体は、シメプレビルに対する親和性の低下を示す
Ｋ１３６位及びＤ１６８位の変異によって、複合体に適したＨＣＶ ＰＲ変異体が生じることが特定されたため、更に特性決定するために、３つの変異体（Ｋ１３６Ｄ、Ｋ１３６Ｎ、及びＤ１６８Ｅ）を選択した。シメプレビルの親和性に対する影響を評価するため、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４を使用して、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ「ＷＴ」Ｓ１３９プロテアーゼ及び３つの変異体に結合するシメプレビルのカイネティクスを測定した（図２３、表５）。Ｋ１３６Ｄ変異はシメプレビルの親和性に対して最も大きな影響があり、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ「ＷＴ」（Ｓ１３９Ａ）と比較して親和性が約３．５倍低下した。Ｋ１３６Ｎ及びＤ１６８Ｅでは、親和性が約２倍低下する結果となった。主に解離速度（Ｋｏｆｆ）が増加することで、親和性の変化が促進された。
Figure 2022541761000015
実施例１７－ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）の変異によって生じるシメプレビルの親和性の変化により、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：シメプレビル：ＰＲＳＩＭ＿２３複合体の形成が影響を受ける
３つの変異プロテアーゼを更に特性決定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋを使用して、変異体ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）／ＰＲＳＩＭ＿２３複合体の形成におけるシメプレビル濃度の影響も評価した（図２４Ａ、表６）。シメプレビルの親和性の低下に伴い（表５）、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ Ｋ１３６Ｄ／シメプレビル／ＰＲＳＩＭ＿２３複合体におけるシメプレビルのＥＣ５０は１３１．５ｎＭに増加し、ｗｔ複合体よりも約３０倍高かった。Ｋ１３６Ｎ変異はまた、影響はＫ１３６Ｄ変異よりも低いものの、「ｗｔ」と比較してシメプレビルのＥＣ５０が高くなるという結果となった。しかしながら、Ｄ１６８Ｅ変異は、「ｗｔ」複合体と比較してほとんど同等のＥＣ５０を有し、それぞれ３．６９及び４．５３ｎＭであった。
シメプレビルの存在下又は非存在下でＰＲＳＩＭ＿２３に結合するＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ変異体も、同様にＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋを使用して測定した（図２４Ｂ～Ｅ）。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ「ＷＴ」（Ｓ１３９Ａ）においてこれまでに示されているように、検証された全てのプロテアーゼ変異体は、ＰＲＳＩＭ＿２３単体に対する同様の弱い非特異的結合を示した（表２、図７Ｂ）。シメプレビルの親和性が異なり、変異がＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ／シメプレビル／ＰＲＳＩＭ＿２３複合体の形成に及ぼす影響が異なるため（図２４Ａ）、各々のＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲに異なる固定濃度のシメプレビルを使用して、複合体をＢｉａｃｏｒｅチップ上に形成した。各々の変異体のシメプレビル濃度は、シメプレビルのそれぞれのＥＣ５０の５～６倍となるように決定した（表６）。変異体ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲを含む複合体は、全てＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ「ＷＴ」（Ｓ１３９Ａ）複合体よりも低い親和性を有していた（表７）。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ「ＷＴ」（Ｓ１３９Ａ）は、ＰＲＳＩＭ＿２３に対して５．４ｎＭの親和性を有する（図２４Ｂ）一方で、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ Ｋ１３６Ｄ（図２４Ｃ）及びＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ Ｋ１３６Ｎ（図２４Ｄ）の親和性は、「ｗｔ」と比較して約６～７倍低下した（表７）。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ Ｄ１６８Ｅは、ＰＲＳＩＭ＿２３に対して１４．７ｎＭの親和性を有し（図２４Ｅ）、「ｗｔ」プロテアーゼよりも約３倍低い親和性を有していた。
Figure 2022541761000016
Figure 2022541761000017
実施例１８－ＨＣＶ ＰＲの小分子阻害剤は、ＨＣＶ ＰＲ「ｗｔ」ではなくＨＣＶ ＰＲ変異体と結合する場合にシメプレビルと競合することによってＰＲＳＩＭ＿２３複合体を崩壊させることができる
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：ＰＲＳＩＭ＿２３複合体形成がシメプレビルに特異的であったことが立証されたため（実施例１３）、本発明者らは、小分子のＨＣＶ ＰＲ阻害剤のパネルがＨＣＶ ＰＲと結合する場合にシメプレビルと競合することによってＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：シメプレビル：ＰＲＳＩＭ＿２３複合体を崩壊させることができるかどうかについての調査を続行した。ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）結合アッセイにおいて小分子阻害剤をシメプレビルと同時に添加したときに、これらの小分子のサブセットによってＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：ＰＲＳＩＭ＿２３複合体の形成を阻害することができることが分かった。しかしながら、シメプレビルをＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）とプレインキュベートした後に小分子阻害剤を添加する場合では、有意な複合体の阻害は観察されなかった（図２５Ａ）。
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲに生じさせた変異を更に特性決定するため、予め形成された変異体ＨＣＶ ＰＲ：シメプレビル：ＰＲＳＩＭ＿２３複合体を小分子が崩壊させることができるかどうかを調査した。１３６位に変異を生じさせた場合、小分子阻害剤（アスナプレビル、パリタプレビル、バニプレビル、グラゾプレビル、ダノプレビル、及びグレカプレビル）のサブセットによって、変異体ＨＣＶ ＰＲ：シメプレビル：ＰＲＳＩＭ＿２３複合体の明らかな更なる阻害が観察されたが、その他のサブセット（ナラプレビル、ボセプレビル、及びテラプレビル）では観察されなかった（図２５Ｂ）。阻害の程度は、特異的な変異が生じたかどうかに依存する。Ｋ１３６Ｈでは約７５％の阻害が観察されたが、それにもかかわらずＨＣＶ ＰＲ「ｗｔ」と同様のシメプレビルのＥＣ８０を有していた。完全に近い阻害がＫ１３６Ｎに見られ、完全な阻害はＫ１３６Ｄで観察された。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：シメプレビル：ＰＲＳＩＭ＿２３複合体の完全な阻害は、１６８位に変異を有する全てのＨＣＶ ＰＲ変異体で観察された。
他の小分子阻害剤（アスナプレビル、パリタプレビル、バニプレビル、グラゾプレビル、ダノプレビル、及びグレカプレビル）がシメプレビルと「競合」し、ＰＲＳＩＭ＿２３とＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲの変異体バージョンとの間の複合体を崩壊させる能力によって、任意のＰＲＳＩＭベースのＣＩＤを早急に不活性化する機会が提供され、導入遺伝子発現又は治療活性が無効化される。更に、他の阻害剤（ナラプレビル、ボセプレビル、及びテラプレビル）がＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲと結合するシメプレビルと競合することができないことで、これらの小分子によって誘導される、直交性のＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲベースの分子スイッチを開発する機会が提供される。
実施例１９－スプリット転写因子システムに組み込まれたＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲの変異体は、遺伝子発現を調節する能力を保持している
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲの変異が遺伝子調節に及ぼす影響を評価するために、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）－ＡＤ変異体及びＤＢＤ－ＰＲＳＩＭ＿２３（３つのタンデムコピー）をコードするｐＨｅｔ－Ａｃｔ１－２ベースの構築物を生成した。これらのｐＨｅｔ－Ａｃｔ１－２（ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）－ＡＤ変異体及びＤＢＤ－ＰＲＳＩＭ＿２３（３つのタンデムコピー））構築物、又はレポーター構築物であるｐＺＦＨＤ１＿Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを有する「ＷＴ」構築物（ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）－ＡＤ及びＤＢＤ－ＰＲＳＩＭ＿２３（３つのタンデムコピー））によって細胞を形質移入した後、遺伝子発現を評価した。濃度を上昇させたシメプレビルの存在下における、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を調節する能力を測定した。全てのＰＲＳＩＭ ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）－ＡＤ変異体は、「ＷＴ」のＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）－ＡＤに対して最大倍率変化がわずかに低下し、ＥＣ５０が増加したものの、用量依存的なルシフェラーゼの遺伝子発現を示した（図２６及び表８）。
実施例１４～１９から総合したデータは、「競合」小分子であるＨＣＶ ＰＲ阻害剤を投与することでＣＩＤベースの活性を早急に回復させることが必要とされる状況において、変異体ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲを含有するＰＲＳＩＭベースのＣＩＤが、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ（Ｓ１３９Ａ）の「ｗｔ」ベースのＣＩＤの代替物となることが可能であることを示唆している。
Figure 2022541761000018
ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）変異体（Ｋ１３６Ｄ、Ｄ１６８Ｅ、Ｋ１３６Ｎ）の低下した親和性／増加した解離速度が、シメプレビルを除去したときに遺伝子発現をオフに切り替えることができる速度に影響するかどうかを評価するために、生細胞タイムコースアッセイを使用して細胞ベースアッセイを実施した。ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）－ＡＤ変異体及びＤＢＤ－ＰＲＳＩＭ＿２３（３つのタンデムコピー）で構成されるスプリット転写因子の制御下で短命の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ－ＰＥＳＴ、半減期は約２時間）の発現を入れたモノクローナル安定発現株を生成した。シメプレビルで２４時間処理することによってＧＦＰ発現を誘導した後、シメプレビルを除去し、除去後の時点でＧＦＰ蛍光を測定した。「ＷＴ」のＳ１３９Ａは、２４時間にわたって高いＧＦＰ蛍光を保持していた。このことは、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）を含有する転写因子複合体が、シメプレビル依存的な方法で形成されると、長期間にわたって安定性を維持し、継続してＧＦＰ－ＰＥＳＴの発現を促進するため、培地中に過剰なシメプレビルを継続して存在させる必要がないことを示している。しかしながら、同期間にわたり、全ての３つの変異体（Ｋ１３６Ｄ、Ｋ１３６Ｎ、Ｄ１６８Ｅ）は、シメプレビルを除去して１５～２４時間以内に天然の非発現状態に戻ってしまう。このことは、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）－ＡＤ「ＷＴ」及びＤＢＤ－ＰＲＳＩＭ＿２３（３つのタンデムコピー）と比較して、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）－ＡＤ変異体及びＤＢＤ－ＰＲＳＩＭ＿２３（３つのタンデムコピー）を使用して形成される転写因子複合体の安定性が低下することを示している。
このデータは、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ変異体に対するシメプレビルの親和性を低下させることによって遺伝子発現のカイネティクスを変化させることが可能であり、「ｗｔ」のＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲベースのＣＩＤを使用する場合よりも、スプリット転写構成において早急に遺伝子発現を停止させることができることを示唆している。
実施例２０－ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）：シメプレビル：ＰＲＳＩＭ＿５７複合体の結晶構造により、二量体化を引き起こす小分子のメカニズムが明らかとなる
シメプレビルは、プロテアーゼの表面上のポケットに結合し、ＰＲＳＩＭ＿５７によって特異的に認識される新しいエピトープを生成することによって、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）とｓｃＦｖ分子のＰＲＳＩＭ＿５７とのヘテロ二量体の形成を誘導する。このヘテロ二量体化事象の根底にある分子メカニズムを理解するために、プロテアーゼ、ｓｃＦｖ、及びシメプレビルの間の複合体の結晶構造を測定した。この構造を得るために、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）によって切断可能なＨｉｓタグを含む、プロテアーゼ及びＰＲＳＩＭ＿５７ ｓｃＦｖの形態で、両方を別々にＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現させた。固定化金属アフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとを組み合わせることによってタンパク質を均質になるように精製し、ＴＥＶプロテアーゼで処理することによってタグを除去した。三元複合体を形成するために、プロテアーゼを過剰量のＰＲＳＩＭ＿５７及びシメプレビルとインキュベートし、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、複合体化されていない材料から、得られた複合体を精製した。純粋な複合体を含有する画分をプールして１２ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、結晶試験のための準備をした。複合体をシッティングドロップ蒸気拡散によって結晶化し、シンクロトロンＸ線源における結晶からＸ線回折データを収集した。探索モデルとして、ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）のアポ形態の構造と分子置換することによって構造を解析した。
三元複合体の３つの成分の全ては、電子密度ではっきりと視認することができる（図２７Ａ）。シメプレビルは、これまでに観察された同様の相互作用によって、同じ形態でＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）に結合している（ＰＤＢ ｉｄ ３ＫＥＥ）。この構造によって、ＰＲＳＩＭ＿５７ ｓｃＦｖによって生じた相互作用の大部分が、シメプレビルと限定的に接触しながらプロテアーゼの残基を誘導することによるものであるということが分かる。ｓｃＦｖは、最初にシメプレビルの周囲に疎水性ポケットを形成し（Ｐｈｅ７７、Ｉｌｅ７４、Ｉｌｅ１２５、及びＴｒｐ２４９の側鎖を含む）、その一方の側を固定してプロテアーゼに結合する。この結合は、ｓｃＦｖの相補性決定領域（ＣＤＲ）ループのＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及びＬＣＤＲ３によって決まる。
ＰＲＳＩＭ＿５７及びＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）の間で、以下の相互作用があることを特定することができる（図２７Ｂ）。１）Ａｓｐ９４（ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ）の側鎖のカルボキシル基が、Ｉｌｅ１２５及びＴｈｒ１２６（ＰＲＳＩＭ＿５７）の主鎖の窒素原子、及びＴｈｒ１２６の側鎖のヒドロキシル基と相互作用を生じる。２）Ｔｙｒ７１（ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ）の側鎖のカルボキシル基が、Ｈｉｓ２５１及びＴｒｐ２４９（ＰＲＳＩＭ＿５７）の側鎖と相互作用を生じる。３）Ｖａｌ９３（ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ）とＴｒｐ２４９（ＰＲＳＩＭ＿５７）の側鎖との間で疎水性相互作用が生じる。４）Ｇｌｕ２５４（ＰＲＳＩＭ＿５７）と、Ｇｌｙ７５及びＴｈｒ７６（ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ）の主鎖の窒素原子との間の水媒介相互作用。ＰＲＳＩＭ＿５７とシメプレビルとの間の主な相互作用は、シメプレビルのキノリン部分とＨＣＤＲ２のＰｈｅ７７（ＰＲＳＩＭ＿５７）の側鎖との相互作用である。
実施例２１－ＰＲＳＩＭベースのＣＩＤは、アポトーシスタンパク質の活性を調節して細胞死を制御することができる
治療用細胞を投与したときに、それらを「遠隔制御する」能力によって、コントロール不良な増殖又は有害事象が発生した際に安全策が提供される。そのような細胞を制御するための１つの方法は、その機能の実行が完了していたり、安全性リスクをもたらしたりしたときに、それらを自在に除去することができるように、それらにいわゆる「キルスイッチ」を与えることである。従って、ＰＲＳＩＭベースの、シメプレビル応答性カスパーゼ９ベースのキルスイッチを生成し、インビトロでの検証を行った。カスパーゼ９のホモ二量体化ＣＡＲＤドメインを、短いリンカーで隔てられたＰＲＳＩＭ２３ドメイン及びＨＣＶ ＮＳ３／４Ａ ＰＲ（Ｓ１３９Ａ）ドメインの両方と置換した。これにより、シメプレビルを添加することによって活性なカスパーゼ９ホモ二量体を再構成することができる（図２８）。ＰＲＳＩＭベースのキルスイッチ構築物によって安定的に形質導入されたＨＥＫ２９３細胞、ＨＣＴ１１６細胞、及びＨＴ２９細胞にシメプレビルを添加すると、１００ｎＭのシメプレビルを添加したときに、細胞の顕微鏡検査により速やかな細胞死が見られた（図２９Ａ、Ｂ）。活性なカスパーゼ９は、タンパク質分解的切断によって下流のカスパーゼ３を活性化する。カスパーゼ３の活性は、蛍光発生基質のＡｃ－ＤＥＶＤ－ＡＭＣが切断されることによって検出する（図２９Ｃ）。シメプレビルで処理されたキルスイッチ形質導入ＨＥＫ２９３細胞（図２９Ｄ）、又はキルスイッチ形質導入ヒト腫瘍細胞株であるＨＣＴ１１６及びＨＴ２９（図２９Ｅ）では、カスパーゼ３の活性は有意に上方制御されている（ｐ＜０．０００１）。
ＰＲＳＩＭベースのキルスイッチが治療に関連する細胞を除去することができることを立証するために、胚幹（ＥＳ）細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の両方の安定発現株を作製した。ＥＳ細胞では、細胞コンフルエンシーを測定したときに、高用量のシメプレビル（１μＭ）によって４時間以内に最大９５％の細胞が速やか且つ効率的に除去され（図３０）、これが約１５分で生じたことから、シメプレビルに対する用量反応を観察することができる。より低用量においては遅発性の細胞死が引き起こされた。１００ｎＭのシメプレビルでは、４時間以内に約９０％の細胞死を誘導することができる一方で、１０ｎＭでは実験の４時間の時間枠内で最大の細胞死に達することはなかった。対照的に、ｗｔのＳａ１２１細胞は、シメプレビルによる処理に応答しなかった。
ｉＰＳＣ細胞におけるＰＲＳＩＭベースのキルスイッチの有効性を立証するために、ＰＲＳＩＭベースのキルスイッチがＢ２Ｍ遺伝子座で二対立遺伝子となっている４つの別々のｉＰＳＣ細胞クローンを生成した。これらの細胞を親ｉＰＳＣ細胞と共に１ｎＭのシメプレビルとインキュベートし、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐｒｏ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して細胞増殖指数を経時的に測定した。ＰＲＳＩＭベースのキルスイッチをコードする細胞クローンは、全て５時間後に細胞増殖指数の劇的な低下を示し、実験の過程にわたって（シメプレビルを添加して約６０時間後）この低下を維持した一方で、親細胞は増殖し続けた。
これらのデータは、ＰＲＳＩＭベースのキルスイッチが広範囲の細胞型をインビトロで効果的に除去することができ、患者における治療用細胞を早急に除去する手段を提供することができることを示している。
カスパーゼ９は、Ｓｅｒ１９６におけるＡｋｔのキナーゼ媒介性リン酸化反応によって活性化する可能性がある。このことは、カスパーゼ９融合タンパク質のＳｅｒ１９６のリン酸化反応を受けた細胞によって、カスパーゼ９媒介性ポトーシスから「回避」するリスクをもたらす。このリスクを軽減するために、Ｓｅｒ１９６からＡｌａへの置換を含む、ＰＲＳＩＭベースのキルスイッチ融合タンパク質をコードする安定したＨＥＫ細胞株を生成した。１００ｎＭのシメプレビルをキルスイッチＳ１９６Ａ細胞に添加すると、ｗｔのキルスイッチに匹敵する時間枠で速やかな細胞死が見られた（図３２Ａ）。下流のカスパーゼ３の活性は、非形質導入細胞と比較して、ｗｔ及びＳ１９６Ａ変異体キルスイッチ細胞の両方で有意に上方制御されていた（ｐ＜０．０００５）。同一のアッセイでは、ｗｔ及びＳ１９６Ａキルスイッチ細胞の間に有意差が見出されなかった（図３２Ｂ）。このことは、ＰＲＳＩＭベースのキルスイッチ融合タンパク質のＳ１９６Ａバージョンが、野生型カスパーゼ９ベースのキルスイッチと同程度に活性であり、これをＡｋｔ媒介性細胞回避メカニズムを妨げるためのメカニズムとして使用することが可能であることを示している。
参考文献
本開示及び本開示に関係する最新技術をより詳細に説明するために、多数の刊行物が上記で引用されている。これらの参考文献の完全な引用を以下に示す。これらの参考文献のそれぞれの全体が本明細書に組み込まれている。
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Ｆｏｉｇｈｔ ＧＷ，Ｗａｎｇ Ｚ，Ｗｅｉ ＣＴ，ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉ－ｉｎｐｕｔ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｇｒａｄｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９；３７（１０）：１２０９－１２１６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０１９－０２４２－８
Ｇａｒｇｅｔｔ Ｔ，Ｂｒｏｗｎ ＭＰ．２０１４．‘Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃａｓｐａｓｅ－９ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｓ ａ“ｓａｆｅｔｙ ｓｗｉｔｃｈ”ｔｏ ｌｉｍｉｔ ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ，ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ．’Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：２３５．
Ｇｉｌｂｒｅｔｈ，Ｒ．Ｎ．，Ｂ．Ｍ．Ｃｈａｃｋｏ，Ｌ．Ｇｒｉｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．Ｓｗｅｒｓ，ａｎｄ Ｍ．Ｂａｃａ．２０１４．‘Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｉｎｉｍａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ’，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ，２７：４１１－８．
Ｇｒａｋｏｕｉ Ａ，ＭｃＣｏｕｒｔ ＤＷ，Ｗｙｃｈｏｗｓｋｉ Ｃ，Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ ＳＭ，Ｒｉｃｅ ＣＭ．１９９３‘Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ．’Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，６７（５）：２８３２－２８４３）
Ｈｉｊｉｋａｔａ Ｍ，Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ Ｈ，Ａｋａｇｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．１９９３‘Ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ．’Ｊ Ｖｉｒｏｌ．；６７（８）：４６６５－４６７５．
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Ｌｉ Ｊ，Ａｂｅｌ Ｒ，Ｚｈｕ Ｋ，Ｃａｏ Ｙ，Ｚｈａｏ Ｓ，Ｆｒｉｅｓｎｅｒ ＲＡ．Ｔｈｅ ＶＳＧＢ ２．０ ｍｏｄｅｌ：ａ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．２０１１；７９（１０）：２７９４－２８１２．
Ｌｉ，Ｋｕｉ，Ｅｉｌｅｅｎ Ｆｏｙ，Ｊｏｓｅｐｈｉｎｅ Ｃ．Ｆｅｒｒｅｏｎ，Ｍｉｔｓｕｙａｓｕ Ｎａｋａｍｕｒａ，Ａｌｌａｎ Ｃ．Ｍ．Ｆｅｒｒｅｏｎ，Ｍａｓａｎｏｒｉ Ｉｋｅｄａ，Ｓｔｕａｒｔ Ｃ．Ｒａｙ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｇａｌｅ，ａｎｄ Ｓｔａｎｌｅｙ Ｍ．Ｌｅｍｏｎ．２００５．‘Ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３／４Ａ ｐｒｏｔｅａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＲＩＦ’，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０２：２９９２－９７．
Ｌｉ，Ｘｉａｏ－Ｄｏｎｇ，Ｌｉｊｕｎ Ｓｕｎ，Ｒａｓｈｕ Ｂ．Ｓｅｔｈ，Ｇａｂｒｉｅｌ Ｐｉｎｅｄａ，ａｎｄ Ｚｈｉｊｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｎ．２００５．‘Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ ＮＳ３／４Ａ ｃｌｅａｖｅｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆｆ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｔｏ ｅｖａｄｅ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ’，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０２：１７７１７－２２．
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Ｍｏｒａｃａ，Ｆ．，Ｎｅｇｒｉ，Ａ．，ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｃ．＆ Ａｂｅｌ，Ｒ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｒｅｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ（ＦＥＰ＋）ｔｏ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ：Ａ Ｃａｓｅ Ｓｔｕｄｙ ｔｏ Ａｓｓｅｓｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｐａｉｒｓ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅｓ（ＰＤＥ’ｓ）．Ｊ Ｃｈｅｍ Ｉｎｆ Ｍｏｄｅｌ ５９，２７２９－２７４０（２０１９）．
Ｎａｓｏ ＭＦ，Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚ Ｂ，Ｐｅｒｒｙ ＷＬ ３ｒｄ，Ｓｔｒｏｈｌ ＷＲ．２０１７’Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ａｓ ａ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．’ＢｉｏＤｒｕｇｓ，３１（４）：３１７－３３４
Ｏｇａｎｅｓｙａｎ，Ｖ．，Ａ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｌ．Ｇｒｉｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｐｈｉｐｐｓ，Ｂ．Ｃｈａｃｋｏ，Ｓ．Ｄｒａｂｉｃ，Ｔ．Ｔｈｉｓｔｅｄ，ａｎｄ Ｍ．Ｂａｃａ．２０１３．‘Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｄｏｍａｉｎｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｂｉｎｄ ＣＤ４０Ｌ：ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｘ－ｒａｙ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｗｏ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ’，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｓｅｃｔ Ｆ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔ Ｃｏｍｍｕｎ，６９：１０４５－８．
Ｏｓｂｏｕｒｎ，Ｊ．Ｋ．，Ａ．Ｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｗｉｌｔｏｎ，Ｅ．Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ，Ｊ．Ｃ．Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｐ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ａｌｌｅｎ，ａｎｄ Ｊ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ．１９９６．‘Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｎｅｌ ｏｆ ｒｅｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｃＦｖ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ＣＥＡ’，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２：１８１－９６．
Ｐａｔｉｃｋ ＡＫ，Ｐｏｔｔｓ ＫＥ．１９９８．’Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｓ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔｓ．’Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１１（４）：６１４－２７
Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ＪＬ，Ｓｈａｒｐ ＰＡ，Ｐａｂｏ ＣＯ．１９９５．’Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．’Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６７（５１９４）：９３－６
Ｓａｂａｒｉｅｇｏｓ，Ｒｏｓａｒｉｏ，Ｆｅｒｎａｎｄｏ Ｐｉｃａｚｏ，Ｂｅａｔｒｉｚ Ｄｏｍｉｎｇｏ，Ｓａｎｄｒａ Ｆｒａｎｃｏ，Ｍｉｇｕｅｌ－Ａｎｇｅｌ Ｍａｒｔｉｎｅｚ，ａｎｄ Ｊｕａｎ Ｌｌｏｐｉｓ．２００９．‘Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ－Ｂａｓｅｄ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＮＳ３－４Ａ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ’，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，５３：７２８－３４．
Ｓａｂｅｒｓ，Ｃ．Ｊ．，Ｍ．Ｍ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｊ．Ｂｒｕｎｎ，Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆ．Ｊ．Ｄｕｍｏｎｔ，Ｇ．Ｗｉｅｄｅｒｒｅｃｈｔ，ａｎｄ Ｒ．Ｔ．Ａｂｒａｈａｍ．１９９５．‘Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｔｈｅ ＦＫＢＰ１２－ｒａｐａｍｙｃｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ’，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７０：８１５－２２．
Ｓａｄｅｌａｉｎ Ｍ，Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ Ｒ，Ｒｉｖｉｅｒｅ Ｉ．２０１３’Ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ．’Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．，３（４）：３８８－９８
Ｓａｓｔｒｙ，Ｇ．Ｍ．，Ａｄｚｈｉｇｉｒｅｙ，Ｍ．，Ｄａｙ，Ｔ．，Ａｎｎａｂｈｉｍｏｊｕ，Ｒ．＆ Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｗ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｌｉｇａｎｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｖｉｒｔｕａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｓ．Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ Ｄｅｓ ２７，２２１－２３４（２０１３）．
Ｓｍｉｔｈ－Ｇａｒｖｉｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｇ．Ａ．Ｋｏｒｅｔｚｋｙ，ａｎｄ Ｍ．Ｓ．Ｊｏｒｄａｎ．２００９．‘Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ’，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２７：５９１－６１９．
Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ａ．２０１６．’Ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｉｓｓｕｅ－ｔｒｏｐｉｓｍ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．’Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２１：７５－８０
Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｂ．Ｚ．，Ｅ．Ｊ．Ｃｈｏｒｙ，ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ．２０１８．‘Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ’，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５９．
Ｓｔｅｍｐｎｉａｋ Ｍ，Ｈｏｓｔｏｍｓｋａ Ｚ，Ｎｏｄｅｓ ＢＲ，Ｈｏｓｔｏｍｓｋｙ Ｚ．１９９７‘Ｔｈｅ ＮＳ３ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｓ ａ ｚｉｎｃ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ．’Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，７１（４）：２８８１－２８８６．
Ｓｗｅｒｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｌ．Ｇｒｉｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｆｅｎｇ，Ｋ．Ｌｅｋｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｃａｒｒａｓｃｏ，Ｚ．Ｘｉａｏ，Ｉ．Ｉｎｉｇｏ，Ｃ．Ｃ．Ｌｅｏｗ，Ｈ．Ｗｕ，Ｄ．Ａ．Ｔｉｃｅ，ａｎｄ Ｍ．Ｂａｃａ．２０１３．‘Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｆ ＴＲＡＩＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ’，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，１２：１２３５－４４．
Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．，Ａ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｋ．Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ｊ．Ｋ．Ｏｓｂｏｕｒｎ，Ａ．Ｒ．Ｐｏｐｅ，Ｊ．Ｃ．Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｊ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｒ．Ａ．Ｈｏｄｉｔｓ，Ｊ．Ｗｉｌｔｏｎ，ａｎｄ Ｋ．Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ．１９９６．‘Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｓｕｂ－ｎａｎｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｌａｒｇｅ ｎｏｎ－ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ’，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１４：３０９－１４．
Ｗｕ，Ｃ．Ｙ．，Ｋ．Ｔ．Ｒｏｙｂａｌ，Ｅ．Ｍ．Ｐｕｃｈｎｅｒ，Ｊ．Ｏｎｕｆｆｅｒ，ａｎｄ Ｗ．Ａ．Ｌｉｍ．２０１５．‘Ｒｅｍｏｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－ｇａｔｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ’，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５０：ａａｂ４０７７．
標準的な分子生物学手法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．３ ｅｄ．２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
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Claims (113)

  1. ｉ）標的タンパク質をコードする第１の発現カセットであって、前記標的タンパク質と小分子との間で複合体（Ｔ－ＳＭ複合体）を形成するように、前記標的タンパク質が前記小分子に結合することができる、第１の発現カセットと、
    ｉｉ）結合メンバーをコードする第２の発現カセットであって、前記結合メンバーが、前記標的タンパク質単体及び前記小分子単体の両方に結合するよりも高い親和性で前記Ｔ－ＳＭ複合体に結合するように、前記Ｔ－ＳＭ複合体に特異的に結合する、第２の発現カセットとを含み、
    前記標的タンパク質は非ヒトタンパク質に由来し、前記小分子は前記非ヒトタンパク質の阻害剤である、１つ以上の発現ベクター。
  2. 前記標的タンパク質がウイルスプロテアーゼに由来し、前記小分子阻害剤がウイルスプロテアーゼ阻害剤である、請求項１に記載の１つ以上の発現ベクター。
  3. 前記ウイルスプロテアーゼがＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ又はＨＩＶプロテアーゼである、請求項２に記載の１つ以上の発現ベクター。
  4. 前記ウイルスプロテアーゼがＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼである、請求項３に記載の１つ以上の発現ベクター。
  5. 前記小分子がシメプレビル、ボセプレビル、テラプレビル、アスナプレビル、バニプレビル、ボキシラプレビル、グレカプレビル、パリタプレビル、及びナラプレビルからなる群から選択され、任意選択により、前記小分子がシメプレビル、ボセプレビル、及びテラプレビルからなる群から選択される、請求項１に記載の１つ以上の発現ベクター。
  6. 前記小分子がシメプレビルである、請求項５に記載の１つ以上の発現ベクター。
  7. 前記標的タンパク質が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  8. 前記標的タンパク質が、由来するタンパク質と比較して弱毒化された活性を有し、任意選択により、前記標的タンパク質が、由来するウイルスタンパク質と比較して弱毒化されたウイルス活性を有する、請求項２～７のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  9. 前記標的タンパク質が、由来するタンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸変異を含み、前記１つ以上のアミノ酸変異が、前記標的タンパク質の前記活性を弱毒化するものであり、任意選択により、前記標的タンパク質が、由来するウイルスタンパク質と比較して弱毒化されたウイルス活性を有する、請求項８に記載の１つ以上の発現ベクター。
  10. 前記標的タンパク質が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記標的タンパク質が、７２位、９６位、１１２位、１１４位、１５４位、１６０位及び１６４位から選択される１つ以上のアミノ酸にアミノ酸変異を含み、前記アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応する、請求項９に記載の１つ以上の発現ベクター。
  11. 前記標的タンパク質が１５４位にアミノ酸変異を含み、任意選択により、１５４位の前記アミノ酸変異がアラニンへの変異である、請求項１０に記載の１つ以上の発現ベクター。
  12. 前記標的タンパク質が、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  13. 前記標的タンパク質が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、１５１位及び１８３位から選択される１つ以上のアミノ酸に親和性を低下させたアミノ酸変異を含み、前記アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応し、任意選択により、１５１位の前記アミノ酸変異は、アスパラギン酸、アスパラギン、又はヒスチジンへの変異であり、１８３位の前記アミノ酸変異は、グルタミン酸、グルタミン、又はアラニンへの変異である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  14. 前記結合メンバーが、前記標的タンパク質単体及び／又は前記小分子単体のいずれかに結合するよりも、
    ｉ）少なくとも１０倍高い親和性で、
    ｉｉ）少なくとも５０倍高い親和性で、
    ｉｉｉ）少なくとも１００倍高い親和性で、又は
    ｉｖ）少なくとも１０００倍高い親和性で、
    前記Ｔ－ＳＭ複合体と結合する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  15. 前記結合メンバーが、
    ｉ）５００ｎＭ、
    ｉｉ）１μＭ、
    ｉｉｉ）１０μＭ、
    ｉｖ）１００μＭ、又は
    ｖ）１ｍＭよりも高いＫＤ値を有する親和性で前記標的タンパク質又は前記小分子に結合し、
    任意選択により、親和性は表面プラズモン共鳴を使用して測定される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  16. 前記結合メンバーが、前記標的タンパク質単体及び／若しくは前記小分子単体に有意な結合を示さず、又は
    前記結合メンバーが、前記標的タンパク質単体及び／若しくは前記小分子単体に全く結合を示さないか、若しくは検出可能な結合を示さない、請求項１～１５のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  17. 前記Ｔ－ＳＭ複合体にのみ存在し、前記標的タンパク質単体又は前記小分子単体には存在しないエピトープで、前記結合メンバーが前記Ｔ－ＳＭ複合体に特異的に結合する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  18. 前記Ｔ－ＳＭ複合体の形成が前記標的タンパク質の立体構造の変化を誘導し、それによって前記結合メンバーが特異的に結合する前記エピトープの形成が生じる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  19. 前記結合メンバーが、
    ｉ）５０ｎＭ、
    ｉｉ）２５ｎＭ、
    ｉｉｉ）２０ｎＭ、
    ｉｖ）１５ｎＭ、又は
    ｖ）１０ｎＭよりも低いＫＤ値を有する親和性で前記Ｔ－ＳＭ複合体と結合し、
    任意選択により、親和性は表面プラズモン共鳴を使用して測定される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  20. 前記結合メンバーがＴｎ３タンパク質又は抗体分子である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  21. 前記結合メンバーがＴｎ３タンパク質である、請求項２０に記載の１つ以上の発現ベクター。
  22. 前記Ｔｎ３タンパク質が、
    ｉ）配列番号１３６、１３７、及び１３８にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿２３、
    ｉｉ）配列番号１３９、１４０、及び１４１にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿３２、
    ｉｉｉ）配列番号１４２、１４３、及び１４４にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿３３、
    ｉｖ）配列番号１４５、１４６、及び１４７にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿３６、又は
    ｖ）配列番号１４８、１４９、及び１５０にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿４７のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループを含み、
    任意選択により、前記Ｔｎ３タンパク質が、前記ＢＣ、ＤＥ、及び／又はＥＦループに３、２、又は１つの配列変異を含む、請求項２１に記載の１つ以上の発現ベクター。
  23. 前記Ｔｎ３が、
    ｉ）配列番号５に記載されるＰＲＳＩＭ＿２３、
    ｉｉ）配列番号６に記載されるＰＲＳＩＭ＿３２、
    ｉｉｉ）配列番号７に記載されるＰＲＳＩＭ＿３３、
    ｉｖ）配列番号８に記載されるＰＲＳＩＭ＿３６、又は
    ｖ）配列番号９に記載されるＰＲＳＩＭ＿４７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の１つ以上の発現ベクター。
  24. 前記Ｔｎ３が、
    ｉ）配列番号５に記載されるＰＲＳＩＭ＿２３、
    ｉｉ）配列番号６に記載されるＰＲＳＩＭ＿３２、
    ｉｉｉ）配列番号７に記載されるＰＲＳＩＭ＿３３、
    ｉｖ）配列番号８に記載されるＰＲＳＩＭ＿３６、又は
    ｖ）配列番号９に記載されるＰＲＳＩＭ＿４７のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の１つ以上の発現ベクター。
  25. 前記Ｔｎ３が、配列番号５に記載されるＰＲＳＩＭ＿２３の前記アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の１つ以上の発現ベクター。
  26. 前記Ｔｎ３が、配列番号５に記載されるＰＲＳＩＭ＿２３のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の１つ以上の発現ベクター。
  27. 前記結合メンバーが単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項２０に記載の１つ以上の発現ベクター。
  28. 前記ｓｃＦｖが、
    ｉ）配列番号１５１、１５２、１５３、１５４、１５５及び１５６にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿５７、
    ｉｉ）配列番号１５１、１５２、１９８、１５４、１５５及び１５６にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿０１、
    ｉｉｉ）配列番号１５１、１５２、１６３、１５４、１５５及び１６４にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿０４、
    ｉｖ）配列番号１６５、１６６、１６７、１６８、１６９及び１７０にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿６７、
    ｖ）配列番号１７１、１７２、１７３、１７４、１７５及び１７６にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿７２、又は
    ｖｉ）配列番号１７７、１７８、１７９、１８０、１８１及び１８２にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿７５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１～３及び軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含み、
    前記ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って定義され、
    任意選択により、前記ｓｃＦｖが前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３に３、２、又は１つの配列変異を含む、請求項２７に記載の１つ以上の発現ベクター。
  29. 前記ｓｃＦｖが、
    ｉ）配列番号１２に記載されるＰＲＳＩＭ＿５７、
    ｉｉ）配列番号１０に記載されるＰＲＳＩＭ＿０１、
    ｉｉｉ）配列番号１１に記載されるＰＲＳＩＭ＿０４、
    ｉｖ）配列番号１３に記載されるＰＲＳＩＭ＿６７、
    ｖ）配列番号１４に記載されるＰＲＳＩＭ＿７２、又は
    ｖｉ）配列番号１５に記載されるＰＲＳＩＭ＿７５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の１つ以上の発現ベクター。
  30. 前記ｓｃＦｖが、
    ｉ）配列番号１２に記載されるＰＲＳＩＭ＿５７、
    ｉｉ）配列番号１０に記載されるＰＲＳＩＭ＿０１、
    ｉｉｉ）配列番号１１に記載されるＰＲＳＩＭ＿０４、
    ｉｖ）配列番号１３に記載されるＰＲＳＩＭ＿６７、
    ｖ）配列番号１４に記載されるＰＲＳＩＭ＿７２、又は
    ｖｉ）配列番号１５に記載されるＰＲＳＩＭ＿７５のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の１つ以上の発現ベクター。
  31. 前記ｓｃＦｖが、配列番号１２に記載されるＰＲＳＩＭ＿５７の前記アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の１つ以上の発現ベクター。
  32. 前記ｓｃＦｖが、配列番号１２に記載されるＰＲＳＩＭ＿５７のアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の１つ以上の発現ベクター。
  33. 前記標的タンパク質が、第１の構成ポリペプチドに融合されており、
    前記結合メンバーが、第２の構成ポリペプチドに融合されている、請求項１～３２のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  34. 前記１つ以上の発現ベクターが、二量体誘導タンパク質をコードする、請求項３３に記載の１つ以上の発現ベクター。
  35. （１）前記第１の構成ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメインを含み、前記標的タンパク質に融合されてＤＢＤ－Ｔ融合タンパク質を形成し、
    前記第２の構成ポリペプチドが、転写調節ドメインを含み、前記結合メンバーに融合されてＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質を形成し、又は、
    （２）前記第１の構成ポリペプチドが、転写調節ドメインを含み、前記標的タンパク質に融合されてＴＲＤ－Ｔ融合タンパク質を形成し、
    前記第２の構成ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメインを含み、前記結合メンバーに融合されてＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質を形成し、
    前記第１の構成ポリペプチドと前記第２の構成ポリペプチドとが二量体化すると転写因子を形成する、請求項３４に記載の１つ以上の発現ベクター。
  36. 前記転写調節ドメインが転写活性化ドメインであり、又は前記転写調節ドメインが転写抑制ドメインである、請求項３５に記載の１つ以上の発現ベクター。
  37. 所望の発現産物をコードする第３の発現カセットを更に含み、前記転写因子が前記所望の発現産物の発現を調節することができるように、前記第３の発現カセット内の標的配列に前記ＤＮＡ結合ドメインが結合し、任意選択により、前記標的配列が、前記所望の発現産物のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターに位置する、請求項３５又は請求項３６に記載の１つ以上の発現ベクター。
  38. 前記所望の発現産物が治療用タンパク質であり、任意選択により、前記治療用タンパク質が治療用抗体である、請求項３７に記載の１つ以上の発現ベクター。
  39. 前記ＤＢＤ－Ｔ融合タンパク質が、２つ以上の標的タンパク質に融合された前記ＤＮＡ結合ドメインを含み、又は
    前記ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質が、２つ以上の結合メンバーに融合された前記ＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  40. （１）前記第１の構成ポリペプチドが、共刺激ドメインを含み、前記標的タンパク質に融合されており、
    前記第２の構成ポリペプチドが、細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記結合メンバーに融合されており、又は
    （２）前記第１の構成ポリペプチドが、細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記標的タンパク質に融合されており、
    前記第２の構成ポリペプチドが、第１の共刺激ドメインを含み、前記結合メンバーに融合されている、請求項３４に記載の１つ以上の発現ベクター。
  41. 前記第１の構成ポリペプチドが、抗原特異的認識ドメイン及び膜貫通ドメインを更に含み、
    前記第２の構成ポリペプチドが、膜貫通ドメイン及び第２の共刺激ドメインを更に含み、
    前記第１の構成ポリペプチドと前記第２の構成ポリペプチドとが二量体化するとキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成し、
    任意選択により、前記標的タンパク質が前記第１の共刺激ドメインのＣ末端に融合され、及び／又は前記結合メンバーが前記第２の共刺激ドメインのＣ末端に融合されている、請求項４０の（１）に記載の１つ以上の発現ベクター。
  42. 前記第１の構成ポリペプチドが、膜貫通ドメイン及び第２の共刺激ドメインを更に含み、
    前記第２の構成ポリペプチドが、抗原特異的認識ドメイン及び膜貫通ドメインを更に含み、
    前記第１の構成ポリペプチドと前記第２の構成ポリペプチドとが二量体化するとキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成し、
    任意選択により、前記結合メンバーが前記第１の共刺激ドメインのＣ末端に融合され、及び／又は前記標的タンパク質が前記第２の共刺激ドメインのＣ末端に融合されている、請求項４０の（２）に記載の１つ以上の発現ベクター。
  43. 前記標的タンパク質に融合された前記第１の構成ポリペプチドが、配列番号７０に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    前記結合メンバーに融合された前記第２の構成ポリペプチドが、配列番号２００に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    任意選択により、前記抗原特異的認識ドメインが、Ｎ末端から配列番号７０に記載される前記アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列にかけて位置する、請求項４１に記載の１つ以上の発現ベクター。
  44. 前記第１の構成ポリペプチドが、第１のカスパーゼ成分を含み、
    前記第２の構成ポリペプチドが、第２のカスパーゼ成分を含み、
    前記第１の構成ポリペプチドと前記第２の構成ポリペプチドとが二量体化するとカスパーゼを形成し、任意選択により、前記第１及び前記第２のカスパーゼ成分が、カスパーゼ９活性化ドメインを含む、請求項３４に記載の１つ以上の発現ベクター。
  45. （１）前記第１及び前記第２の発現カセットが同一の発現ベクターに位置し、任意選択により、前記第３の発現カセットが同一の発現ベクター若しくは別の発現ベクターに位置し、又は
    （２）前記第１の発現カセットが第１の発現ベクターに位置し、前記第２の発現カセットが第２の発現ベクターに位置し、任意選択により、前記第３の発現カセットが、前記第１の発現ベクター若しくは前記第２の発現ベクター、若しくは第３の発現ベクターに位置する、請求項１～４４のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  46. 前記１つ以上の発現ベクターの各々がＤＮＡプラスミドである、請求項１～４５のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  47. 前記１つ以上の発現ベクターの各々がウイルスベクターである、請求項１～４５のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  48. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アルファウイルスベクター、フラビウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、ニューカッスル病ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、及びピコルナウイルスベクターからなるリストから選択される、請求項４７に記載の１つ以上の発現ベクター。
  49. 前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項４８に記載の１つ以上の発現ベクター。
  50. ウイルス粒子をインビトロで作製する方法であって、
    請求項４７～４９のいずれか一項に記載のウイルスベクターで宿主細胞を形質移入し、前記宿主細胞内にウイルス粒子を形成するために必要となるウイルスタンパク質を発現させることと、
    前記細胞がウイルス粒子を産生するように、前記形質移入細胞を培地で培養することとを含み、
    任意選択により、前記ウイルス粒子を前記培地から分離し、任意選択により、前記ウイルス粒子を濃縮することを更に含む方法。
  51. ｉ）非ヒトタンパク質由来の標的タンパク質と、ｉｉ）前記非ヒトタンパク質の阻害剤である小分子との間の複合体に特異的に結合する結合メンバーであって、前記結合メンバーが、前記標的タンパク質単体及び／又は前記小分子単体に結合するよりも高い親和性で前記複合体に結合し、
    任意選択により、前記非ヒトタンパク質がウイルスプロテアーゼであり、任意選択によりＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼであり、更に任意選択により、前記ウイルスプロテアーゼは、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、
    更に任意選択により、前記小分子がシメプレビルである結合メンバー。
  52. 前記結合メンバーがＴｎ３タンパク質であり、任意選択により、前記Ｔｎ３タンパク質が、
    ｉ）配列番号１３６、１３７、及び１３８にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿２３、
    ｉｉ）配列番号１３９、１４０、及び１４１にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿３２、
    ｉｉｉ）配列番号１４２、１４３、及び１４４にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿３３、
    ｉｖ）配列番号１４５、１４６、及び１４７にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿３６、又は
    ｖ）配列番号１４８、１４９、及び１５０にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿４７のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループを含み、
    任意選択により、前記Ｔｎ３タンパク質が、前記ＢＣ、ＤＥ、及び／又はＥＦループに３、２、又は１つの配列変異を含む、請求項５１に記載の結合メンバー。
  53. 前記Ｔｎ３が、
    ｉ）配列番号５に記載されるＰＲＳＩＭ＿２３、
    ｉｉ）配列番号６に記載されるＰＲＳＩＭ＿３２、
    ｉｉｉ）配列番号７に記載されるＰＲＳＩＭ＿３３、
    ｉｖ）配列番号８に記載されるＰＲＳＩＭ＿３６、又は
    ｖ）配列番号９に記載されるＰＲＳＩＭ＿４７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の結合メンバー。
  54. 前記Ｔｎ３が、
    ｉ）配列番号５に記載されるＰＲＳＩＭ＿２３、
    ｉｉ）配列番号６に記載されるＰＲＳＩＭ＿３２、
    ｉｉｉ）配列番号７に記載されるＰＲＳＩＭ＿３３、
    ｉｖ）配列番号８に記載されるＰＲＳＩＭ＿３６、又は
    ｖ）配列番号９に記載されるＰＲＳＩＭ＿４７のアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載の結合メンバー。
  55. 前記結合メンバーがｓｃＦｖであり、任意選択により、前記ｓｃＦｖが、
    ｉ）配列番号１５１、１５２、１５３、１５４、１５５及び１５６にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿５７、
    ｉｉ）配列番号１５１、１５２、１９８、１５４、１５５及び１５６にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿０１、
    ｉｉｉ）配列番号１５１、１５２、１６３、１５４、１５５及び１６４にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿０４、
    ｉｖ）配列番号１６５、１６６、１６７、１６８、１６９及び１７０にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿６７、
    ｖ）配列番号１７１、１７２、１７３、１７４、１７５及び１７６にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿７２、又は
    ｖｉ）配列番号１７７、１７８、１７９、１８０、１８１及び１８２にそれぞれ記載されるＰＲＳＩＭ＿７５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１～３及び／又は軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１～３を含み、
    前記ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従って定義され、
    任意選択により、前記ｓｃＦｖが前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３に３、２、又は１つの配列変異を含む、請求項５１に記載の結合メンバー。
  56. ｉ）配列番号１２に記載されるＰＲＳＩＭ＿５７、
    ｉｉ）配列番号１０に記載されるＰＲＳＩＭ＿０１、
    ｉｉｉ）配列番号１１に記載されるＰＲＳＩＭ＿０４、
    ｉｖ）配列番号１３に記載されるＰＲＳＩＭ＿６７、
    ｖ）配列番号１４に記載されるＰＲＳＩＭ＿７２、又は
    ｖｉ）配列番号１５に記載されるＰＲＳＩＭ＿７５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載の結合メンバー。
  57. ｉ）配列番号１２に記載されるＰＲＳＩＭ＿５７、
    ｉｉ）配列番号１０に記載されるＰＲＳＩＭ＿０１、
    ｉｉｉ）配列番号１１に記載されるＰＲＳＩＭ＿０４、
    ｉｖ）配列番号１３に記載されるＰＲＳＩＭ＿６７、
    ｖ）配列番号１４に記載されるＰＲＳＩＭ＿７２、又は
    ｖｉ）配列番号１５に記載されるＰＲＳＩＭ＿７５のアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載の結合メンバー。
  58. 前記結合メンバーが、次の前記標的タンパク質の残基：Ｔｙｒ７１、Ｇｌｙ７５、Ｔｈｒ７６、Ｖａｌ９３、Ａｓｐ９４のうちの少なくとも１つと相互作用を形成することによって前記Ｔ－ＳＭに特異的に結合し、前記アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応し、任意選択により、前記結合メンバーは、更にシメプレビルのキノロン部分と相互作用を形成する、請求項５１～５７のいずれか一項に記載の結合メンバー。
  59. 二量体誘導タンパク質であって、
    標的タンパク質に融合された第１の構成ポリペプチドと、
    結合メンバーに融合された第２の構成ポリペプチドとを含み、
    前記標的タンパク質と小分子との間で複合体（Ｔ－ＳＭ複合体）を形成するように、前記標的タンパク質が前記小分子に結合することができ、前記結合メンバーが、前記標的タンパク質単体及び／又は前記小分子単体の両方に結合するよりも高い親和性で前記Ｔ－ＳＭ複合体に結合するように、前記Ｔ－ＳＭ複合体に特異的に結合し、
    前記標的タンパク質が非ヒトタンパク質に由来し、前記小分子が前記非ヒトタンパク質の阻害剤であり、任意選択により、前記非ヒトタンパク質がウイルスプロテアーゼであり、前記小分子がウイルスプロテアーゼ阻害剤である、二量体誘導タンパク質。
  60. 前記ウイルスプロテアーゼがＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼであり、任意選択により、前記ウイルスプロテアーゼが配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項５９に記載の二量体誘導タンパク質。
  61. 前記小分子がシメプレビルであり、
    任意選択により、前記標的タンパク質が、配列番号１に記載される配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１と比較して１５１位及び１８３位から選択される１つ以上のアミノ酸にアミノ酸変異を含み、前記アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応する、請求項５９又は請求項６０に記載の二量体誘導タンパク質。
  62. 前記結合メンバーが、請求項５１～５８のいずれか一項において定義される通りである、請求項５９～６１のいずれか一項に記載の二量体誘導タンパク質。
  63. （１）前記第１の構成ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメインを含み、前記標的タンパク質に融合されてＤＢＤ－Ｔ融合タンパク質を形成し、
    前記第２の構成ポリペプチドが、転写調節ドメインを含み、前記結合メンバーに融合されてＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質を形成し、又は、
    （２）前記第１の構成ポリペプチドが、転写調節ドメインを含み、標的タンパク質に融合されてＴＲＤ－Ｔ融合タンパク質を形成し、
    前記第２の構成ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメインを含み、前記結合メンバーに融合されてＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質を形成し、
    前記第１の構成ポリペプチドと前記第２の構成ポリペプチドとが二量体化すると転写因子を形成する、請求項５９～６２のいずれか一項に記載の二量体誘導タンパク質。
  64. 前記ＤＢＤ－Ｔ融合タンパク質が、２つ以上の標的タンパク質に融合された前記ＤＮＡ結合ドメインを含み、又は
    前記ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質が、２つ以上の結合メンバーに融合された前記ＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項６３に記載の二量体誘導タンパク質。
  65. 前記ＤＲＤ－Ｔ融合タンパク質が、配列番号４５に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    前記ＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質が、配列番号５７～６７のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    前記ＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質が、配列番号４６～５６のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は
    前記ＴＲＤ－Ｔ融合タンパク質が、配列番号４４のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６３又は６４に記載の二量体誘導タンパク質。
  66. （１）前記第１の構成ポリペプチドが、共刺激ドメインを含み、前記標的タンパク質に融合されており、
    前記第２の構成ポリペプチドが、細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記結合メンバーに融合されており、又は
    （２）前記第１の構成ポリペプチドが、細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記標的タンパク質に融合されており、
    前記第２の構成ポリペプチドが、第１の共刺激ドメインを含み、前記結合メンバーに融合されている、請求項５９～６２のいずれか一項に記載の二量体誘導タンパク質。
  67. 前記第１の構成ポリペプチドが、抗原特異的認識ドメイン及び膜貫通ドメインを更に含み、
    前記第２の構成ポリペプチドが、膜貫通ドメイン及び第２の共刺激ドメインを更に含み、
    前記第１の構成ポリペプチドと前記第２の構成ポリペプチドとが二量体化するとキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成し、
    任意選択により、前記標的タンパク質が前記第１の共刺激ドメインのＣ末端に融合され、及び／又は前記結合メンバーが前記第２の共刺激ドメインのＣ末端に融合されている、請求項６６の（１）に記載の二量体誘導タンパク質。
  68. 前記第１の構成ポリペプチドが、膜貫通ドメイン及び第２の共刺激ドメインを更に含み、
    前記第２の構成ポリペプチドが、抗原特異的認識ドメイン及び膜貫通ドメインを更に含み、
    前記第１の構成ポリペプチドと前記第２の構成ポリペプチドとが二量体化するとキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成し、
    任意選択により、前記結合メンバーが前記第１の共刺激ドメインのＣ末端に融合され、及び／又は前記標的タンパク質が前記第２の共刺激ドメインのＣ末端に融合されている、請求項６６の（２）に記載の二量体誘導タンパク質。
  69. 前記標的タンパク質に融合された前記第１の構成ポリペプチドが、配列番号７０に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    前記結合メンバーに融合された前記第２の構成ポリペプチドが、配列番号２００に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    任意選択により、前記抗原特異的認識ドメインが、Ｎ末端から配列番号７０に記載される前記アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列にかけて位置する、請求項６７に記載の二量体誘導タンパク質。
  70. 前記第１の構成ポリペプチドが、第１のカスパーゼ成分を含み、
    前記第２の構成ポリペプチドが、第２のカスパーゼ成分を含み、
    前記第１の構成ポリペプチドと前記第２の構成ポリペプチドとが二量体化するとカスパーゼを形成し、
    任意選択により、前記第１及び前記第２のカスパーゼ成分が、カスパーゼ９活性化ドメインを含む、請求項５９～６２のいずれか一項に記載の二量体誘導タンパク質。
  71. 請求項５９～７０のいずれか一項に記載の二量体誘導タンパク質を発現する細胞。
  72. 前記細胞が幹細胞又は免疫細胞である、請求項７１に記載の細胞。
  73. 請求項７１又は７２に記載の細胞を産生するために細胞を遺伝子組換えする方法であって、前記細胞に請求項３３～４４のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクターを投与することを含み、任意選択により、前記方法がインビトロ又はエキソビボで実行される方法。
  74. ｉ）標的タンパク質をコードする第１の発現カセットであって、前記標的タンパク質と小分子との間で複合体（Ｔ－ＳＭ複合体）を形成するように、前記標的タンパク質が前記小分子に結合することができる、第１の発現カセットと、
    ｉｉ）結合メンバーをコードする第２の発現カセットであって、前記結合メンバーが、前記標的タンパク質単体及び／又は前記小分子単体の両方に結合するよりも高い親和性で前記Ｔ－ＳＭ複合体に結合するように、前記Ｔ－ＳＭ複合体に特異的に結合する、第２の発現カセットとを含む、１つ以上のウイルス粒子であって、
    前記標的タンパク質が非ヒトタンパク質に由来し、前記小分子が前記非ヒトタンパク質の阻害剤であり、任意選択により、前記非ヒトタンパク質がウイルスプロテアーゼに由来し、前記小分子がウイルスプロテアーゼ阻害剤であり、
    前記第１及び前記第２の発現カセットが、前記１つ以上のウイルス粒子内のウイルスゲノムの一部を形成し、
    任意選択により、前記ウイルス粒子がＡＡＶ粒子である、１つ以上のウイルス粒子。
  75. 前記第１及び前記第２の発現カセットが、同一のウイルスゲノムの一部を形成するか、又は前記第１の発現カセットが第１のウイルス粒子の第１のウイルスゲノムの一部を形成し、前記第２の発現カセットが第２のウイルス粒子の第２のウイルスゲノムの一部を形成する、請求項７４に記載の１つ以上のウイルス粒子。
  76. 前記ウイルスプロテアーゼがＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼであり、任意選択により、前記ウイルスプロテアーゼが配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、更に任意選択により、前記標的タンパク質が配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有し、及び／又は
    前記小分子がシメプレビルである、請求項７４又は請求項７５のいずれか一項に記載の１つ以上のウイルス粒子。
  77. 前記結合メンバーが、請求項５１～５６のいずれか一項において定義される通りである、請求項７４～７６のいずれか一項に記載の１つ以上のウイルス粒子。
  78. 前記標的タンパク質が、第１の構成ポリペプチドに融合されており、
    前記結合メンバーが、第２の構成ポリペプチドに融合されており、
    前記１つ以上の発現ベクターが、二量体誘導タンパク質をコードする、請求項７４～７７のいずれか一項に記載の１つ以上のウイルス粒子。
  79. （１）前記第１の構成ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメインを含み、前記標的タンパク質に融合されてＤＢＤ－Ｔ融合タンパク質を形成し、
    前記第２の構成ポリペプチドが、転写調節ドメインを含み、前記結合メンバーに融合されてＴＲＤ－ＢＭ融合タンパク質を形成し、又は、
    （２）前記第１の構成ポリペプチドが、転写調節ドメインを含み、前記標的タンパク質に融合されてＴＲＤ－Ｔ融合タンパク質を形成し、
    前記第２の構成ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメインを含み、前記結合メンバーに融合されてＤＢＤ－ＢＭ融合タンパク質を形成し、
    前記第１の構成ポリペプチドと前記第２の構成ポリペプチドとが二量体化すると転写因子を形成し、
    任意選択により、所望の発現産物をコードする第３の発現カセットを更に含み、前記転写因子が前記所望の発現産物の発現を調節することができるように、前記第３の発現カセット内の標的配列に前記ＤＮＡ結合ドメインが結合し、
    更に任意選択により、前記第３の発現カセットが、前記第１及び／若しくは前記第２の発現カセットと同一のウイルスゲノムの一部を形成するか、又は前記第３の発現カセットが、第３のウイルス粒子の第３のウイルスゲノムの一部を形成する、請求項７８に記載の１つ以上のウイルス粒子。
  80. （１）前記第１の構成ポリペプチドが、第１の共刺激ドメイン、抗原特異的認識ドメイン、及び膜貫通ドメインを含み、前記標的タンパク質に融合されており、
    前記第２の構成ポリペプチドが、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び第２の共刺激ドメインを含み、前記結合メンバーに融合されており、又は
    （２）前記第１の構成ポリペプチドが、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び第２の共刺激ドメインを含み、前記標的タンパク質に融合されており、
    前記第２の構成ポリペプチドが、第１の共刺激ドメイン、抗原特異的認識ドメイン、及び膜貫通ドメインを含み、前記結合メンバーに融合されており、
    前記第１の構成ポリペプチドと前記第２の構成ポリペプチドとが二量体化するとキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形成する、請求項７８に記載の１つ以上のウイルス粒子。
  81. 請求項５１～７０のいずれか一項に記載の結合メンバー又は二量体誘導タンパク質をコードする１つ以上の核酸。
  82. 請求項５９～７０のいずれか一項に記載の二量体誘導タンパク質の前記標的タンパク質及び／又は前記結合ドメインに融合された、前記第１及び／又は前記第２の構成ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸。
  83. 人体又は動物体の治療方法に使用される、請求項１～４９のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター。
  84. 人体又は動物体の治療方法に使用される、請求項７４～８０のいずれか一項に記載の１つ以上のウイルス粒子。
  85. 細胞内で所望の発現産物の発現を調節する方法であって、
    ｉ）請求項６３～６５のいずれか一項に記載の二量体誘導タンパク質を前記細胞内に発現させることであって、前記転写因子が前記細胞内で前記所望の発現産物の発現を調節することができるように、前記細胞内の標的配列に前記ＤＮＡ結合ドメインが結合することと、
    ｉｉ）前記所望の発現産物の発現を調節するために、前記小分子を前記細胞に投与することとを含み、
    任意選択により、前記方法が、前記所望の発現産物をコードし、前記標的配列を含む、第３の発現カセットを前記細胞に投与することを含み、更に任意選択により、前記標的配列が、前記所望の発現産物のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターに位置する方法。
  86. 前記細胞がヒト患者の一部であり、前記方法がインビボで実行される、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記第１の構成ポリペプチドと前記第２の構成ポリペプチドとが二量体化すると転写因子を形成する、ヒト対象又は動物対象の細胞内で所望の発現産物の発現を調節する方法に使用される、請求項６３～６５のいずれか一項に記載の二量体誘導タンパク質であって、前記方法が、
    ｉ）請求項６３～６５のいずれか一項に記載の二量体誘導タンパク質を前記細胞内に発現させることであって、前記転写因子が前記細胞内で前記所望の発現産物の発現を調節することができるように、前記細胞内の標的配列に前記ＤＮＡ結合ドメインが結合することと、
    ｉｉ）前記所望の発現産物の発現を調節するために、小分子を前記細胞に投与することとを含み、
    任意選択により、前記方法が、前記所望の発現産物をコードし、前記標的配列を含む、第３の発現カセットを前記細胞に投与することを含み、更に任意選択により、前記標的配列が、前記所望の発現産物のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターに位置する二量体誘導タンパク質。
  88. ヒト対象又は動物対象の細胞内で所望の発現産物の発現を調節する方法に使用される小分子であって、前記方法が、
    ｉ）請求項６３～６５のいずれか一項に記載の二量体誘導タンパク質を前記細胞内に発現させることであって、前記転写因子が前記細胞内で前記所望の発現産物の発現を調節することができるように、前記細胞内の標的配列に前記ＤＮＡ結合ドメインが結合することと、
    ｉｉ）前記所望の発現産物の発現を調節するために、前記小分子を前記細胞に投与することとを含み、
    任意選択により、前記方法が、前記所望の発現産物をコードし、前記標的配列を含む、第３の発現カセットを前記細胞に投与することを含み、更に任意選択により、前記標的配列が、前記所望の発現産物のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターに位置する小分子。
  89. 前記二量体誘導タンパク質が、請求項３５～３９に記載の１つ以上の発現ベクター、又は請求項７９に記載の１つ以上のウイルス粒子を前記細胞に投与することによって前記細胞内に発現する、請求項８５又は８６に記載の方法、請求項８７に従って使用される二量体誘導タンパク質、又は請求項８８に従って使用される小分子。
  90. 請求項７１又は７２に記載の細胞を、それを必要とする個体に投与することを含む治療方法であって、
    ｉ）前記細胞を前記個体に投与することと、
    ｉｉ）前記小分子を前記個体に投与することとを含む方法。
  91. 人体又は動物体の治療方法に使用される、請求項７１又は７２に記載の細胞であって、前記方法が、
    ｉ）前記細胞を個体に投与することと、
    ｉｉ）前記小分子を前記個体に投与することとを含む細胞。
  92. 人体又は動物体の治療方法に使用される小分子であって、前記方法が、
    ｉ）請求項７１又は７２に記載の細胞を個体に投与することと、
    ｉｉ）前記小分子を前記個体に投与することとを含む小分子。
  93. 人体又は動物体を治療するための薬剤を製造するための、請求項７１又は７２に記載の細胞の使用であって、前記治療が、
    ｉ）前記細胞を個体に投与することと、
    ｉｉ）前記小分子を前記個体に投与することとを含む使用。
  94. 人体又は動物体を治療するための薬剤を製造するための小分子の使用であって、前記治療が、
    ｉ）請求項７１又は７２に記載の細胞を個体に投与することと、
    ｉｉ）前記小分子を前記個体に投与することとを含む使用。
  95. 前記細胞が免疫細胞であり、任意選択により、前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項９０に記載の方法、請求項９１に従って使用するための細胞、請求項９２に従って使用するための小分子、請求項９３に記載の細胞の使用、又は請求項９４に記載の小分子の使用。
  96. 前記第１の構成ポリペプチドと前記第２の構成ポリペプチドとが二量体化するとＣＡＲを形成する、請求項９５に記載の方法、使用するための細胞、使用するための小分子、細胞の使用、又は小分子の使用。
  97. 請求項１～４９のいずれか一項に記載の１つ以上の発現ベクター及び前記小分子を含むキット。
  98. 請求項７１又は７２に記載の細胞及び前記小分子を含むキット。
  99. 請求項７４～８０のいずれか一項に記載の１つ以上のウイルス粒子及び前記小分子を含むキット。
  100. 請求項８１又は８２に記載の１つ以上の核酸及び前記小分子を含むキット。
  101. 前記小分子がシメプレビルである、請求項９７～１００のいずれか一項に記載のキット。
  102. ｉ）標的タンパク質と小分子との間で複合体（Ｔ－ＳＭ複合体）を形成するように、前記標的タンパク質が前記小分子に結合することができる標的タンパク質と、
    ｉｉ）結合メンバーが前記標的タンパク質単体及び前記小分子単体の両方に結合するよりも高い親和性で前記Ｔ－ＳＭ複合体に結合するように、前記Ｔ－ＳＭ複合体に特異的に結合する結合メンバーとを含むシステムであって、
    前記標的タンパク質が非ヒトタンパク質であり、前記小分子が前記非ヒトタンパク質の阻害剤であり、任意選択により、前記非ヒトタンパク質がウイルスプロテアーゼに由来し、前記小分子がウイルスプロテアーゼ阻害剤であるシステム。
  103. 三分子複合体を含む細胞に競合小分子を投与することを含む、前記三分子複合体の分解を誘導する方法であって、
    前記三分子複合体は、標的タンパク質及び小分子により形成された複合体（Ｔ－ＳＭ複合体）に特異的に結合する結合メンバーの間で形成され、前記結合メンバーは、前記標的タンパク質単体及び前記小分子単体の両方に結合するよりも高い親和性で前記Ｔ－ＳＭ複合体に結合し、
    前記競合小分子は、前記Ｔ－ＳＭ複合体の前記標的タンパク質に結合し、前記Ｔ－ＳＭ複合体から前記小分子を置き換えることができる方法。
  104. 前記細胞がヒト患者の一部であり、前記方法がインビボで実行される、請求項１０３に記載の方法。
  105. 人体内で三分子複合体の分解を誘導する方法に使用される競合小分子であって、前記方法が、前記三分子複合体を含む細胞に前記競合小分子を投与することを含み、
    前記三分子複合体は、標的タンパク質及び小分子の複合体（Ｔ－ＳＭ複合体）に特異的に結合する結合メンバーの間で形成され、前記結合メンバーは、前記標的タンパク質単体及び前記小分子単体の両方に結合するよりも高い親和性で前記Ｔ－ＳＭ複合体に結合し、
    前記競合小分子は、前記Ｔ－ＳＭ複合体の前記標的タンパク質に結合し、前記Ｔ－ＳＭ複合体から前記小分子を置き換えることができる競合小分子。
  106. 前記標的タンパク質が、配列番号１に記載される配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記小分子がシメプレビルである、請求項１０３若しくは請求項１０４に記載の方法、又は請求項１０５に従って使用される競合小分子。
  107. 前記標的タンパク質が、１５１位及び１８３位から選択される１つ以上のアミノ酸に親和性を低下させたアミノ酸変異を含み、前記アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応し、任意選択により、１５１位の前記アミノ酸変異は、アスパラギン酸、アスパラギン、又はヒスチジンへの変異であり、１８３位の前記アミノ酸変異は、グルタミン酸、グルタミン、又はアラニンへの変異である、請求項１０６に従って使用される方法又は競合小分子。
  108. 前記競合小分子が、アスナプレビル、パリタプレビル、バニプレビル、グラゾプレビル、ダノプレビル、及びグレカプレビルからなるリストから選択される、請求項１０３～１０７のいずれか一項に従って使用される方法又は競合小分子。
  109. 前記標的タンパク質及び前記結合メンバーが、二量体誘導タンパク質の一部を形成し、任意選択により、前記二量体誘導タンパク質が、請求項５９～７０のいずれか一項において定義される通りである、請求項１０３～１０８のいずれか一項に従って使用される方法又は競合小分子。
  110. ＨＣＶ ＮＳ３／４Ａプロテアーゼに由来する標的タンパク質であって、前記標的タンパク質が、配列番号１に記載される配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１と比較して１５１位及び１８３位から選択される１つ以上のアミノ酸にアミノ酸変異を含み、前記アミノ酸の番号付けは配列番号１に対応し、シメプレビルは、前記標的タンパク質に結合することができる標的タンパク質。
  111. １５１位の前記アミノ酸変異は、アスパラギン酸、アスパラギン、又はヒスチジンへの変異であり、１８３位の前記アミノ酸変異は、グルタミン酸、グルタミン、又はアラニンへの変異である、請求項１１０に記載の標的タンパク質。
  112. 前記標的タンパク質が更に、配列番号１と比較して１５４位にアミノ酸変異を含み、任意選択により、１５４位の前記アミノ酸変異がアラニンへの変異である、請求項１１０又は請求項１１１に記載の標的タンパク質。
  113. 前記標的タンパク質が、配列番号２１１、２１３、及び２１５のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１１０～１１２のいずれか一項に記載の標的タンパク質。
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