JP2022540806A - 免疫調節抗体およびその使用方法 - Google Patents

免疫調節抗体およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

【解決手段】本明細書には、抗体およびその使用方法が提供される。本明細書に開示される抗体は、マクロファージなどの細胞上でＣＤ１６３＋に結合する。これら抗体は、癌の処置方法などの処置方法に使用可能である。【選択図】図２

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年７月１９日出願の米国仮出願第６２／８７６，５８０号、２０１９年７月１９日出願の米国仮出願第６２／８７６，５７９号、および２０１９年７月２４日出願の米国仮出願第６２／８７８，２６５号に基づく優先権、およびその利益を主張するものであり、これらそれぞれの内容はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書には、癌および他の障害の処置に有用な抗体が提供され、該抗体は、抗原結合フラグメントおよび他の抗原結合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｍ２およびＭ２様免疫抑制マクロファージに特異的に結合するが、Ｍ１およびＭ１様抗腫瘍マクロファージには結合しない。開示された抗体は、Ｍ２およびＭ２様腫瘍関連マクロファージに結合し、腫瘍関連Ｍ２およびＭ２様マクロファージの物理的かつ機能的特徴を調節して、腫瘍微小環境の免疫抑制を緩和し、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化と増殖を増加させるものであり、これにより腫瘍細胞の死滅を促進する。本開示の抗体分子は、Ｍ２およびＭ２様マクロファージの表面に発現されるヒトＣＤ１６３に特異的に結合する。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗体または組換え抗体が開示される。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗体または組換え抗体が開示される。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗体または組換え抗体が開示される。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗体または組換え抗体が開示される。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗体または組換え抗体が開示される。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）が開示される。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体または組換え抗体が開示される。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体または組換え抗体が開示される。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体または組換え抗体が開示される。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体または組換え抗体が開示される。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含む。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む抗体または組換え抗体が開示される。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖配列と、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖配列とを含む抗体または組換え抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖配列を含む。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖配列を含んでいる抗体または組換え抗体が、開示される。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖配列を含んでいる抗体または組換え抗体が、開示される。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖配列を含んでいる抗体または組換え抗体が、開示される。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖配列を含んでいる抗体または組換え抗体が、開示される。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖配列を含んでいる抗体または組換え抗体が、開示される。
いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ Ｌ１は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｌ２は、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｌ３は、配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ Ｌ１は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｌ２は、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｌ３は、配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ Ｌ１は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｌ２は、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｌ３は、配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ Ｌ１は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｌ２は、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｌ３は、配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖配列を含んでいる抗体または組換え抗体が、開示される。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖配列を含んでいる抗体または組換え抗体が、開示される。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖配列を含んでいる抗体または組換え抗体が、開示される。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖配列を含んでいる抗体または組換え抗体が、開示される。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖配列を含んでいる抗体または組換え抗体が、開示される。
いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ Ｈ１は、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｈ２は、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｈ３は、配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ Ｈ１は、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｈ２は、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｈ３は、配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ Ｈ１は、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｈ２は、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｈ３は、配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ Ｈ１は、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｈ２は、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有し、ＣＤＲ Ｈ３は、配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、ヒト重鎖定常領域またはヒト軽鎖定常領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、あるいはそれらのフラグメントである。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１０のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１２のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１１のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１３のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、ヒト可変フレームワーク領域およびマウス定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、マウス重鎖定常領域またはマウス軽鎖定常領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体またはマウス重鎖定常領域は、ＩｇＧ２Ａである。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１５のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号１４のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、単一重鎖、単一軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、可変ＮＡＲドメイン、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、単鎖結合ポリペプチド、ｄＡｂフラグメント、またはダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）を含む抗体フラグメントである。
いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、免疫抑制性ヒト骨髄細胞上に発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合し、骨髄細胞への抗体または組換え抗体の結合は、（ｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、および（ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖のうち１つあるいは両方により測定されるように、免疫細胞機能を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、またはパーフォリン、あるいはこれらの任意の組合せのレベルの増加として測定される。いくつかの実施形態では、免疫抑制性ヒト骨髄細胞は、マクロファージまたは骨髄由来抑制細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞機能は、腫瘍微小環境にある。いくつかの実施形態では、免疫細胞機能は、ｉｎ ｖｉｖｏにある。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、ヒトマクロファージ上に発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合し、マクロファージへの抗体の結合は、腫瘍微小環境における免疫刺激活性を増大させる。いくつかの実施形態では、腫瘍微小環境は、ｉｎ ｖｉｖｏにある。いくつかの実施形態では、マクロファージへの抗体または組換え抗体の結合は、マクロファージの免疫抑制活性を低下させる。いくつかの実施形態では、マクロファージへの抗体または組換え抗体の結合は、マクロファージの活性を促進する腫瘍を減少させる。いくつかの実施形態では、マクロファージは、腫瘍関連マクロファージである。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、マクロファージ上での少なくとも１つのマーカーの発現を改質する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質は、ＣＤ１６３のグリコ型である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質は、ＣＤ１６３の１５０ｋＤａグリコ型である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトマクロファージにより発現されるＣＤ１６３の１３０ｋＤａグリコ型に特異的に結合しない。
いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、Ｆｃ受容体への結合を可能にする定常ドメインを有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、マクロファージ上で発現される。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、単一重鎖、単一軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、可変ＮＡＲドメイン、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、単鎖結合ポリペプチド、ｄＡｂフラグメント、またはダイアボディを含む抗体フラグメントを有する。いくつかの実施形態では、ヒトマクロファージ上の少なくとも１つのマーカーは、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である。いくつかの実施形態では、ヒトマクロファージは、Ｍ２マクロファージまたはＭ２様マクロファージである。いくつかの実施形態では、ヒトマクロファージは、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃ、またはＭ２ｄマクロファージである。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質は、マクロファージにより発現される少なくとも１つの他のタンパク質を含む細胞表面複合体の成分である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの他のタンパク質は、ガレクチン－１タンパク質、ＬＩＬＲＢ２タンパク質、カゼインキナーゼＩＩタンパク質、またはこれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質との結合に際し、抗体または抗体は、ヒトマクロファージにより内在化される。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、マクロファージに対して細胞傷害性ではない。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖、またはＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化と増殖の両方を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはこれらの任意の組合せの発現を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化と増殖の両方を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはこれらの任意の組合せの発現を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、腫瘍微小環境中で免疫抑制を低下させる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、腫瘍微小環境中で腫瘍細胞死滅を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、細胞傷害性リンパ球を媒介とした癌細胞死滅を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、ＮＫ細胞を媒介とした腫瘍細胞死滅を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、Ｔ細胞によるＩＬ－２の発現を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ１９６－Ｔ細胞、ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞、ＣＣＲ４－Ｔ細胞、またはこれらの任意の組み合わせを増加させる。
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３への結合は、マクロファージにより引き起こされる腫瘍微小環境中での免疫抑制を低下させる。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、ヒトマクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合し、結合の結果、次の効果：（ａ）マクロファージによる、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーの発現の低下、（ｂ）マクロファージによる抗体の内在化、（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、（ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖、および（ｅ）腫瘍微小環境での腫瘍細胞死の促進のうち、少なくとも１つがもたらされる。いくつかの実施形態では、結合の結果、（ａ）～（ｅ）の２つ以上、（ａ）～（ｅ）の３つ以上、（ａ）～（ｅ）の４つ以上、または（ａ）～（ｅ）のすべてがもたらされる。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、腫瘍微小環境中でＣＤ１６３＋免疫抑制性骨髄細胞に特異的に結合し、この結合により、腫瘍微小環境中での腫瘍細胞の細胞傷害性Ｔ細胞媒介死滅の抑制が低下する。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、癌の処置方法に使用するために、ヒト腫瘍関連マクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合して、マクロファージによるＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、Ｓｉｇｌｅｃ－１５、またはこれらの任意の組合せの発現を低下させる。いくつかの実施形態では、マクロファージへの抗体または組換え抗体の結合は、腫瘍微小環境中で細胞の免疫機能を調節する。いくつかの実施形態では、マクロファージへの抗体または組換え抗体の結合は、抗腫瘍免疫機能を促進する。
いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤ１６３エピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤ１６３エピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤ１６３エピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０それぞれを含むＣＤ１６３エピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、１ｎＭ～１００ｎＭのＫＤをもってＣＤ１６３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、１ｎＭ～５０ｎＭのＫＤをもってＣＤ１６３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、１ｎＭ～１０ｎＭのＫＤをもってＣＤ１６３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体またはＣＤ１６３は、ヒトＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、１ｎＭ～１００ｎＭのＫＤをもってＭ２ｃマクロファージに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、１ｎＭ～５０ｎＭのＫＤをもってＭ２ｃマクロファージに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、１ｎＭ～１０ｎＭのＫＤをもってＭ２ｃマクロファージに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、Ｍ２ｃマクロファージは、ヒトＭ２ｃマクロファージである。
本明細書の特定の実施形態では、抗体または組換え抗体と賦形剤とを含む組成物が開示される。
本明細書の特定の実施形態では、前述の実施形態のうちいずれか１つに記載の抗体または組換え抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が開示される。
本明細書の特定の実施形態では、ヒト対象の癌を処置するための薬剤の製造における、前述の実施形態のうちいずれか１つに記載の抗体または組換え抗体の使用が開示される。
本明細書の特定の実施の形態では、癌のヒト対象において腫瘍関連マクロファージによる免疫抑制を低下させる薬剤の製造における、前述の実施形態のうちいずれか１つに記載の抗体または組換え抗体の使用が開示される。
本明細書の特定の実施の形態では、癌のヒト対象においてＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅を促進する薬剤の製造における、前述の実施形態のうちいずれか１つに記載の抗体または組換え抗体の使用が開示される。
本明細書の特定の実施形態では、免疫細胞機能を促進する方法が開示され、該方法は、前述の実施形態のうちいずれか１つに記載の抗体または組換え抗体を、必要とする個体に投与する工程と、次のパラメータ：（ｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、および（ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せのうち１つあるいは両方により測定されるように、免疫細胞機能を促進する工程とを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、またはパーフォリン、あるいはこれらの任意の組合せのレベルの増加として測定される。いくつかの実施形態では、免疫抑制性ヒト骨髄細胞は、マクロファージである。いくつかの実施形態では、免疫抑制性ヒト骨髄細胞は、骨髄由来抑制細胞である。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は、前述の実施形態のうちいずれか１つに記載の抗体または組換え抗体である。
本明細書の特定の実施形態では、必要とする個体の癌を処置する方法が開示され、該方法は、前述の実施形態のうちいずれか１つに記載の抗体または組換え抗体を治療上有効量で個体に投与する工程を含み、これにより個体の癌を処置する。
本明細書の特定の実施形態では、必要とする個体の癌を処置する方法が開示され、該方法は、前述の実施形態のうちいずれか１つに記載の抗体または組換え抗体を治療上有効量で個体に投与する工程を含み、これにより、個体における腫瘍関連マクロファージによる免疫抑制は、低下される。
本明細書の特定の実施形態では、必要とする個体の癌を処置する方法が開示され、該方法は、前述の実施形態のうちいずれか１つに記載の抗体または組換え抗体を治療上有効量で個体に投与する工程を含み、これにより、個体におけるＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅が増大される。
本明細書の特定の実施形態では、必要とする個体における腫瘍関連マクロファージの腫瘍促進活性を低下させる方法が開示され、該方法は、腫瘍微小環境中でＣＤ４＋Ｔ細胞活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、またはこれらの任意の組合せを調節するのに有効な前述の実施形態のうちいずれか１つに記載の医薬組成物を一定量で個体に投与する工程を含む。
本明細書の特定の実施形態では、必要とする個体におけるリンパ球媒介性腫瘍細胞死滅を促進する方法が開示され、該方法は、前述の実施形態のうちいずれか１つに記載の抗体または組換え工程、あるいは前述の実施形態のうちいずれか１つに記載の医薬組成物を有効量で個体に投与する工程を含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、腫瘍微小環境中で腫瘍細胞死滅を促進する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、癌は、肺癌または肉腫である。いくつかの実施形態では、肺癌は、肺癌腫または肺腺癌である。いくつかの実施形態では、方法は、追加の抗癌治療薬または抗癌療法を個体に投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の抗癌療法は、外科療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法、およびサイトカイン療法、ならびにこれらの組合せである。いくつかの実施形態では、追加の抗癌療法は、免疫療法である。いくつかの実施形態では、免疫療法は、チェックポイント阻害剤を含む組成物である。
本明細書の特定の実施形態では、腫瘍微小環境中での腫瘍関連マクロファージの活性を調節する方法が開示され、該方法は、腫瘍関連マクロファージを抗体または組換え抗体に接触させる工程を含み、この抗体または組換え抗体は、ＣＤ１６３発現ヒトマクロファージに結合し、かつ、次の効果：（ａ）抗体の結合は、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーのマクロファージ上での発現を低下させる、（ｂ）抗体とＣＤ１６３タンパク質との結合に際して、抗体はヒトマクロファージにより内在化される、（ｃ）抗体の結合は、マクロファージに対して細胞傷害性ではない、（ｄ）抗体または組換え抗体の結合は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せによりＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、パーフォリン、またはこれらの任意の組合せを産生する、（ｅ）抗体または組換え抗体の結合は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化を促進する、（ｆ）抗体または組換え抗体の結合は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖を促進する、および（ｇ）抗体または組換え抗体の結合は、腫瘍微小環境中で細胞死滅を促進する、のうち少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、結合の結果、（ａ）～（ｇ）の２つ以上、（ａ）～（ｇ）の３つ以上、（ａ）～（ｇ）の４つ以上、（ａ）～（ｇ）の５つ以上、（ａ）～（ｇ）の６つ以上、または（ａ）～（ｆ）のすべてがもたらされる。
いくつかの実施形態では、方法は、腫瘍微小環境中で行われる。いくつかの実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。いくつかの実施形態では、マクロファージへの抗体または組換え抗体の結合は、腫瘍微小環境中で細胞の免疫機能を調節する。いくつかの実施形態では、マクロファージへの抗体または組換え抗体の結合は、抗腫瘍免疫機能を促進する。いくつかの実施形態では、抗体または組換え抗体は定常ドメインを含み、該定常ドメインはＦｃ受容体に結合する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、マクロファージ上で発現される。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ１６３タンパク質との結合に際してヒトマクロファージにより抗体または組換え抗体を内在化する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、ヒトマクロファージに対して細胞傷害性ではない。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはこれらの任意の組合せの発現を促進する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはこれらの任意の組合せの発現を促進する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、腫瘍微小環境中で免疫抑制を低下させる工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞傷害性リンパ球を媒介とした癌細胞死滅を促進する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＮＫ細胞を媒介とした腫瘍細胞死滅を促進する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、Ｔ細胞によるＩＬ－２の発現を促進する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法、は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ１９６－Ｔ細胞、ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞、ＣＣＲ４－Ｔ細胞、またはこれらの任意の組み合わせを増加させる工程を含む。
本明細書の特定の実施形態では、免疫抑制性ヒト骨髄細胞上に発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合する抗体が開示され、骨髄細胞への抗体の結合は、（ｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、および（ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖のうち１つあるいは両方により測定されるように、免疫細胞機能を促進する。いくつかの実施形態では、免疫抑制性ヒト骨髄細胞は、マクロファージまたは骨髄由来抑制細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、パーフォリン、またはこれらの任意の組合せの産生の増加として測定される。
本明細書の特定の実施形態では、ヒトマクロファージ上に発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合する抗体が開示され、マクロファージへの抗体の結合は、（ｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、および（ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖のうち１つあるいは両方により測定されるように、免疫細胞機能を促進する。いくつかの実施形態では、免疫細胞機能は、腫瘍微小環境にある。いくつかの実施形態では、免疫細胞機能は、ｉｎ ｖｉｖｏにある。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、パーフォリン、またはこれらの任意の組合せの産生の増加として測定される。
本明細書の特定の実施形態では、ヒトマクロファージ上に発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合する抗体が開示され、マクロファージへの抗体の結合は、腫瘍微小環境における免疫刺激活性を増大させる。いくつかの実施形態では、腫瘍微小環境は、ｉｎ ｖｉｖｏにある。いくつかの実施形態では、マクロファージへの抗体の結合は、マクロファージの免疫抑制活性を低下させる。いくつかの実施形態では、マクロファージへの抗体の結合は、マクロファージの活性を促進する腫瘍を低下させる。いくつかの実施形態では、マクロファージは、腫瘍関連マクロファージである。いくつかの実施形態では、抗体は、マクロファージ上での少なくとも１つのマーカーの発現を改質する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質は、ＣＤ１６３のグリコ型である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質は、ＣＤ１６３の１５０ｋＤａグリコ型である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトマクロファージにより発現されるＣＤ１６３の１３０ｋＤａグリコ型に特異的に結合しない。 いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆｃ受容体への結合を可能にする定常ドメインを有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、マクロファージ上で発現される。いくつかの実施形態では、抗体フラグメントは、単一重鎖、単一軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、可変ＮＡＲドメイン、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、単鎖結合ポリペプチド、ｄＡｂフラグメント、またはダイアボディを含む。いくつかの実施形態では、ヒトマクロファージ上の少なくとも１つのマーカーは、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である。いくつかの実施形態では、ヒトマクロファージは、Ｍ２マクロファージまたはＭ２様マクロファージである。いくつかの実施形態では、ヒトマクロファージは、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃ、またはＭ２ｄマクロファージである。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質は、マクロファージにより発現される少なくとも１つの他のタンパク質を含む細胞表面複合体の成分である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの他のタンパク質は、ガレクチン－１タンパク質、ＬＩＬＲＢ２タンパク質、カゼインキナーゼＩＩタンパク質、またはこれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質との結合に際し、抗体は、ヒトマクロファージにより内在化される。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、マクロファージに対して細胞傷害性ではない。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖、またはＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化と増殖の両方を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはこれらの任意の組合せの発現を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化と増殖の両方を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはこれらの任意の組合せの発現を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、腫瘍微小環境中で免疫抑制を低下させる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、腫瘍微小環境中で腫瘍細胞死滅を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、細胞傷害性リンパ球を媒介とした癌細胞死滅を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、ＮＫ細胞を媒介とした腫瘍細胞死滅を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、Ｔ細胞によるＩＬ－２の発現を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ１９６－Ｔ細胞、ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞、ＣＣＲ４－Ｔ細胞、またはこれらの任意の組み合わせを増加させる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３への結合は、マクロファージにより引き起こされる腫瘍微小環境中での免疫抑制を低下させる。
本明細書の特定の実施形態では、ヒトマクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合する抗体が開示され、結合の結果、次の効果：（ａ）マクロファージによる、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーの発現の低下、（ｂ）マクロファージによる抗体の内在化、（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、（ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖、および（ｅ）腫瘍微小環境での腫瘍細胞死の促進のうち、少なくとも１つがもたらされる。いくつかの実施形態では、結合の結果、（ａ）～（ｅ）の２つ以上、（ａ）～（ｅ）の３つ以上、（ａ）～（ｅ）の４つ以上、または（ａ）～（ｅ）のすべてがもたらされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、パーフォリン、またはこれらの任意の組合せの産生の増加として測定される。
本明細書の特定の実施形態では、腫瘍微小環境中でＣＤ１６３＋免疫抑制性骨髄細胞に特異的に結合する抗体が開示され、この結合により、腫瘍微小環境中での腫瘍細胞の細胞傷害性Ｔ細胞媒介死滅の抑制が低下する。
本明細書の特定の実施形態では、癌の処置方法に使用するために、ヒト腫瘍関連マクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合して、マクロファージによるＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、Ｓｉｇｌｅｃ－１５、またはこれらの任意の組合せの発現を低下させる抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、マクロファージへの抗体の結合は、腫瘍微小環境中で細胞の免疫機能を調節する。いくつかの実施形態では、マクロファージへの抗体の結合は、抗腫瘍免疫機能を促進する。
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に開示されるような実施形態による抗体と、賦形剤とを含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示されるような実施形態による抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体の使用は、ヒト対象の癌を処置するための薬剤の製造のためのものである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体の使用は、癌のヒト対象における腫瘍関連マクロファージによる免疫抑制を低下させる薬剤の製造のためのものである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体の使用は、癌のヒト対象におけるＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅を促進する薬剤の製造のためのものである。
本明細書の特定の実施形態では、免疫細胞機能を促進する方法が開示され、該方法は、免疫抑制性ヒト骨髄細胞上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に抗体を特異的に結合させる工程と、次のパラメータ：（ｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、および（ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せのうち１つあるいは両方により測定されるように、免疫細胞機能を促進する工程とを含む。いくつかの実施形態では、免疫抑制性ヒト骨髄細胞は、マクロファージである。いくつかの実施形態では、免疫抑制性ヒト骨髄細胞は、骨髄由来抑制細胞である。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に開示される任意の実施形態である。
本明細書の特定の実施形態では、必要とする個体の癌を処置する方法が開示され、該方法は、本明細書に開示される実施形態のうちいずれか１つに記載の抗体を治療上有効量で個体に投与する工程を含み、これにより個体の癌を処置する。
本明細書の特定の実施形態では、必要とする個体の癌を処置する方法が開示され、該方法は、本明細書に開示される実施形態のうちいずれか１つに記載の抗体を治療上有効量で個体に投与する工程を含み、これにより、個体における腫瘍関連マクロファージによる免疫抑制は、低下される。
本明細書の特定の実施形態では、必要とする個体の癌を処置する方法が開示され、該方法は、本明細書に開示される実施形態のうちいずれか１つに記載の抗体を治療上有効量で個体に投与する工程を含み、これにより、個体におけるＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅が増大される。いくつかの実施形態では、癌は、肺癌または肉腫である。いくつかの実施形態では、肺癌は、肺癌腫または肺腺癌である。
本明細書の特定の実施形態では、必要とする個体における腫瘍関連マクロファージの腫瘍促進活性を低下させる方法が開示され、該方法は、腫瘍微小環境中でＣＤ４＋Ｔ細胞活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、またはこれらの任意の組合せを調節するのに有効な請求項４３に記載の医薬組成物を一定量で個体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、腫瘍微小環境中で腫瘍細胞死滅を促進する工程をさらに含む。
本明細書の特定の実施形態では、必要とする個体におけるリンパ球媒介性腫瘍細胞死滅を促進する方法が開示され、該方法は、本明細書に開示される実施形態のうちいずれか１つに記載の医薬組成物を有効量で個体に投与する工程を含む。
本明細書の特定の実施形態では、腫瘍微小環境中での腫瘍関連マクロファージの活性を調節する方法が開示され、該方法は、腫瘍関連マクロファージを抗体に接触させる工程を含み、この抗体は、ＣＤ１６３発現ヒトマクロファージに結合し、かつ、次の効果：（ａ）抗体の結合は、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーのマクロファージ上での発現を低下させる、（ｂ）抗体とＣＤ１６３タンパク質との結合に際して、抗体はヒトマクロファージにより内在化される、（ｃ）抗体の結合は、マクロファージに対して細胞傷害性ではない、（ｄ）抗体の結合は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化を促進する、（ｅ）抗体の結合は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖を促進する、および（ｆ）抗体の結合は、腫瘍微小環境中で細胞死滅を促進する、のうち、少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、結合の結果、（ａ）～（ｆ）の２つ以上、（ａ）～（ｆ）の３つ以上、（ａ）～（ｆ）の４つ以上、（ａ）～（ｆ）の５つ以上、または（ａ）～（ｆ）のすべてがもたらされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、パーフォリン、またはこれらの任意の組合せの産生の増加として測定される。いくつかの実施形態では、方法は、腫瘍微小環境中で行われる。いくつかの実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。いくつかの実施形態では、マクロファージへの抗体の結合は、腫瘍微小環境中で細胞の免疫機能を調節する。いくつかの実施形態では、マクロファージへの抗体の結合は、抗腫瘍免疫機能を促進する。いくつかの実施形態では、抗体は定常ドメインを含み、該定常ドメインはＦｃ受容体に結合する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、マクロファージ上で発現される。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ１６３タンパク質との結合に際してヒトマクロファージにより抗体を内在化する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への結合は、ヒトマクロファージに対して細胞傷害性ではない。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはこれらの任意の組合せの発現を促進する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはこれらの任意の組合せの発現を促進する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、腫瘍微小環境中で免疫抑制を低下させる工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞傷害性リンパ球を媒介とした癌細胞死滅を促進する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＮＫ細胞を媒介とした腫瘍細胞死滅を促進する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、Ｔ細胞によるＩＬ－２の発現を促進する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法、は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ１９６－Ｔ細胞、ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞、ＣＣＲ４－Ｔ細胞、またはこれらの任意の組み合わせを増加させる工程を含む。
本開示の新規な特徴は、特に添付の特許請求の範囲に記載される。本開示の特徴と利点は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および次の添付図面を参照することにより、より良く理解されるであろう。
ヒトＭＤＳＣ集団に結合するＡＢ１０１抗体を示す図である。 ＡＢ１０１とＣＤ１６３Ｈｉ細胞との結合を示す図である。 ヒトＭ２Ｃ、Ｍ１、およびＭ０へのＡＢ１０１結合を、アイソタイプ対照と比較した図である。 ヒト末梢血Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、単球、および樹状細胞へのＡＢ１０１結合を示す図であり、アイソタイプ対照は灰色、ＡＢ１０１結合は黒色で示される 小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）、腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）、肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）、臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、大動脈平滑筋細胞（ＡＯＳＭＣ）、およびケラチノサイトを含むヒト初代細胞のパネルへのＡＢ１０１の結合がないことを示す図である。 免疫沈降後の試料の質量解析に基づく、ＡＢ１０２に対する上位２０の標的を示す図である。 免疫沈降後の試料の質量解析に基づく、ＡＢ１０２に対する上位細胞表面標的を示す図である。 免疫沈降後のＡＢ１０２およびＩＳＯ試料の質量解析に基づく、ＩＳＯ（アイソタイプ陰性対照）と比較したＡＢ１０２の上位細胞表面標的を示す図である。 ＡＢ１０２が、ＣＤ１６３の別個の高分子量グリコ型を共免疫沈降させることを示す図である。 ＡＢ１０１、ＡＢ１０２、および対照ＣＤ１６３抗体が、ｈｕＣＤ１６３に結合し、一方でアイソタイプ対照は明らかな結合を示さなかったことを示す図である。 ＡＢ１０１も対照抗ｈｕＣＤ１６３も、マウスＣＤ１６３に結合しなかった市販の抗ｍｕＣＤ１６３抗体と比較して組換えマウスＣＤ１６３に結合しなかったことを示す図である。 ポリクローナル抗ＣＤ１６３抗体によるＭ２ｃマクロファージの前処置が、ＡＢ１０１の結合を遮断しなかったヤギ対照ポリクローナル抗体による処置と比較してＡＢ１０１抗体の結合を遮断したことを示す図である。 ポリクローナル抗ＣＤ１６３抗体によるＭ２ｃマクロファージの前処置が、対照モノクローナル抗ｈｕＣＤ１６３抗体の結合を遮断しなかったヤギ対照ポリクローナル抗体による処置と比較して対照モノクローナル抗ｈｕＣＤ１６３抗体の結合を遮断したことを示す図である。 ＣＤ１６３に対するｓｉＲＮＡでの極性化Ｍ２Ｃマクロファージの処置が、スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＳｃｒａｍｂ）またはｓｉＲＮＡなしで処置したＭ２Ｃマクロファージと比較してＡＢ１０２抗体の結合を実質的に減少させたことを示す図であり、３つの複製物を表す。 ＣＤ１６３のｓｉＲＮＡノックダウンが、ＡＢ１０２抗体の結合を減少させ、ＦＣＧＲ２Ａ＋ＦＣＧＲ３Ａ（ドナー３例中１例）、ＦＣＧＲ２Ｃ、またはＦＣＧＲ３Ａに対するｓｉＲＮＡでのノックダウン後にＡＢ１０２抗体結合のわずかな減少を認め、ｓｉＣＤ２０６、ｓｉＣＤ１６３Ｌ１、ｓｉＰＰＩＡ、ｓｉＬＧＡＬＳ１、ｓｉＬＧＡＬＳ３、ｓｉＬＩＬＲＢ２、およびｓｉＵＰＡＲでのノックダウン後にＡＢ１０２結合の減少を認めなかったことを示す図である。 ＬＰＳでの培養Ｍ２マクロファージの処置の結果、ＡＢ１０１抗体と対照抗ＣＤ１６３抗体の両方による結合の喪失が生じたことを示す図である。 ＡＢ１０１抗体での骨髄細胞の処置後のＩＬ－２産生の増加を示す図である。 ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を促進した極性化中のＡＢ１０１抗体処置を示す図である。 ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を促進した極性化中のＡＢ１０１抗体処置を示す図である。 極性化中（グラフ上で「ｐｒｅ」とラベル付けされる）、極性化後（グラフ上で「ｐｏｓｔ」とラベル付けされる）、または極性化中と極性化後の組合せ（グラフ上で「ｐｒｅおよびｐｏｓｔ」とラベル付けされる）でのＡＢ１０１抗体による処理の結果、アイソタイプ抗体処置と比較してＩＬ－２産生を増強したことを示す図である。 ＡＢ１０１抗体でのＭ２マクロファージの処置が、ＣＤ１６、ＣＤ６４、カルレチクリン、およびＳｉｇｌｅｃ－１５の発現を低下させたことを示す図である。 ＡＢ１０１でのＭ２ｃ細胞の処置が、アイソタイプ対照と比較してＴｈ１／Ｔｈ２比を増加させたことを示す図である。 ＡＢ１０１でのＭ２ｃ細胞の処置が、アイソタイプ対照と比較してＣＤ４Ｔ細胞上でのＣＤ６９の発現を増加させたことを示す図である。 ＡＢ１０１でのＭ２ｃ細胞の処置が、アイソタイプ対照と比較してＣＤ４Ｔ細胞上でのＩＣＯＳの発現を増加させたことを示す図である。 ＡＢ１０１でのＭ２ｃ細胞の処置が、アイソタイプ対照と比較してＣＤ４Ｔ細胞上でのＯＸ４０の発現を増加させたことを示す図である。 Ｂｉｔｅの存在下でのＣＴＬの増加の結果、アイソタイプ対照と比較してＲａｊｉ腫瘍細胞死滅が増加したことを示す図である。 ＡＢ１０２抗体が、市販の抗ＣＤ１６３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＡＢ１６０７－１００）とほぼ同様に内在化され、市販のＣＤ１６３抗体より約２倍多くのＡＢ１０１抗体が内在化されたことを示す図である。 Ａ５４９腫瘍に対して３０日間にわたりプロットされた腫瘍体積を示す図である。矢印は、抗体治療による注射を示す。各点は、マウス７匹の平均測定値を表す。エラーバーは、平均標準誤差（ＳＥＭ）を示す。統計的有意差は、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して算出された。 Ｈ１９７５腫瘍に対して３０日間にわたりプロットされた腫瘍体積を示す図である。矢印は、抗体治療による注射を示す。各点は、マウス７匹の平均測定値を表す。エラーバーは、平均標準誤差（ＳＥＭ）を示す。統計的有意差は、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して算出された。 Ｔ細胞増殖およびＩＬ－２産生に対するＡＢ１０１処置の効果を評価するための、Ｍ２ｃ／Ｔ細胞共培養アッセイの実験デザインを示す図である。 Ｍ２ｃマクロファージ極性化中のＡＢ１０１での処置が、Ｍ２ｃ／Ｔ細胞共培養アッセイにおいてＴ細胞増殖を回復させたことを示す図である。 Ｍ２ｃマクロファージ極性化中のＡＢ１０１での処置が、Ｍ２ｃ／Ｔ細胞共培養アッセイにおいてＯＫＴ３活性化Ｔ細胞によるＩＬ－２分泌を増強したことを示す図である。 レジメン前、レジメン前／後、およびレジメン後のＡＢ１０１での処置が、Ｍ２ｃ／Ｔ細胞共培養アッセイにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を増加させたことを示す図である。 レジメン前、レジメン前／後、およびレジメン後のＡＢ１０１での処置が、個々の対象に対するＭ２ｃ／Ｔ細胞共培養アッセイにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を増加させたことを示す図である。 ＡＢ１０１での処置が、複数の対象のＭ２ｃ／共培養においてＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を増強したことを示す図である。 ＡＢ１０１での処置が、複数の対象のＭ２ｃ／共培養においてＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を増強したことを示す図である。 ＡＢ１０１での処置が、Ｍ２ｃ／共培養中に複数のヒトＴ細胞によるＩＬ－２産生を増強したことを示す図である。 ＡＢ１０１が、Ｍ２ｃ／Ｔ細胞共培養アッセイにおけるＴ細胞増殖の増強において、ＡＢ１０４およびＡＢ１０２アイソタイプよりも強力であることを示す図である。 ＡＢ１０４ではなくＡＢ１０１が、レジメン前／後およびレジメン後に、Ｍ２ｃ媒介性免疫抑制からＣＤ８＋Ｔ細胞増殖をレスキューしことを示す図である。 ＡＢ１０１が、Ｍ２ｃ／Ｔ細胞共培養アッセイにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン応答を回復させたことを示す図である。 ＡＢ１０１が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびパーフォリン応答をＭ２ｃマクロファージ媒介性免疫抑制からレスキューしたことを示す図である。 ＡＢ１０１での処置が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を増強したことを示す図である。 ＡＢ１０１での処置が、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＢｉＴＥ（登録商標）補助型細胞傷害活性を増強したことを示す図である。 ＡＢ１０１での処置が、非ＨＬＡ制限型ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を増強したことを示す図である。 ＡＢ１０１での処置が、Ｍ２ｃ細胞媒介性免疫抑制を緩和し、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞により固有の発現パターンを誘導することを示す図である。 ＡＢ１０１での処置が、Ｍ２ｃマクロファージ免疫抑制を緩和し、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を増強することを示す図である。 活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＸＣＲ３発現を示す図である。 Ｍ２ｃマクロファージの極性化中のＡＢ１０１での処置が、Ｍ２ｃマクロファージによるＣＤ１６、ＣＤ６４、Ｓｉｇｌｅｘ－１５、およびＴＬＲ２の発現を低下させたことを示す図である。 ｈｕＣＤ１６３に結合したＡＢ１０１のペプシン消化に基づく変化の概要を示す図である。 ｈｕＣＤ１６３に結合したＡ Ｂ１０１のネペンテシンＩＩ消化に基づく変化の概要を示す図である。 ＨＤＸ－ＭＳ試験に基づくヒトＣＤ１６３ ＥＣＤへのＡＢ１０１結合の概要を示す図である。 ＡＢ１０１が、ＳＲＣＲドメイン１～５で構成されるトランケート型ＣＤ１６３ ＥＣＤに結合することを示す図である。 カニクイザルＣＤ１６３に対するヒトＣＤ１６３のアライメントを示す図である。シグナル配列。黒色バーの下にある配列は、９つのＳＲＣＲドメインを示し、配列の上にある灰色の線は、コンセンサス配列を示す。保護および露出された領域は、ＨＤＸ－ＭＳにおいて観察された保護により判定されるように、ＡＢ１０１結合エピトープに基づき示される。配列の下の実線は、ネペンテシンＩＩ保護領域を示す。配列の下の白抜きボックスは、ペプシン保護領域を示す。配列の下の斜線ボックスは、ペプシン露出領域を示す。配列の下の垂直線を付けたボックスは、ネペンテシンＩＩ露出領域を示す。ヒトＣＤ１６３の３２３位のリジン（Ｋ）およびカニクイザルＣＤ１６３のグルタミン酸（Ｅ）は、ボックスで示される。 ＡＢ１０１が、ヒトおよびカニクイザルＥ３２３Ｋ変異体に結合するが、野生型カニクイザルＣＤ１６３ ＥＣＤには結合しないことを示す図である。 ヒトＣＤ１６３へのＡＢ１０１の結合のＳＰＲ検出を示す図である。ＡＢ１０１は、（Ａ）ＥＤＴＡまたは（Ｂ）カルシウム含有泳動用緩衝液を用いて様々な濃度に連続希釈された。次いで、ＧＨＩ／６１が、３０μｌ／分の流量、６．２５／１２．５／２５／５０／１００／２００μｇ／ｍｌの濃度、３００ｓの接触時間、および６００ｓの解離時間でフローセル２に注射された。 ヒトＣＤ１６３へのＧＨＩ／６１の結合のＳＰＲ検出を示す図である。抗ＣＤ１６３クローンＧＨＩ／６１は、（Ａ）ＥＤＴＡまたは（Ｂ）カルシウム含有泳動用緩衝液を用いて様々な濃度に連続希釈された。次いで、ＧＨＩ／６１が、３０μｌ／分の流量、３．１２５／６．２５／１２．５／２５／５０／１００μｇ／ｍｌの濃度、３００ｓの接触時間、および６００ｓの解離時間でフローセル２に注射された。 ＡＢ１０１へのＣＤ１６３の結合のＳＰＲ検出を示す図である。ヒトＣＤ１６３タンパク質は、カルシウム含有泳動用緩衝液を用いて様々な濃度に連続希釈された。次いで、ＣＤ１６３タンパク質が、３０μｌ／分の流量、１．２５／２．５／５．０／１０．０／２０．０／４０．０μｇ／ｍｌの濃度、３００ｓの接触時間、および６００ｓの解離時間でフローセル２に注射された。 ＡｌｐｈａＬｉｓａアッセイにおける可溶性ＣＤ１６３へのＡＢ１０１の結合を示す図である。ＡＢ１０１（円形）またはアイソタイプ対照（三角形）は、示された濃度で１時間、７５０ｎＭ ＣＤ１６３－Ｈｉｓを用いてインキュベートした。結合は、ビオチン化抗ｈＩｇＧ１ ｍＡｂ、ストレプトアビジン受容体、およびニッケルドナービーズを用いたＡｌｐｈａＬｉｓａにより定量化された。記号は、５つの独立した測定値の平均±標準誤差を表す。曲線適合は、１および２部位飽和結合モデル（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）で行われた。（Ｒ２＝０．９２）。（Ａ）線形、および（Ｂ）対数ｘ軸スケール。 Ｍ１ｃマクロファージへのＡＢ１０１結合を示す図である。Ｍ２ｃマクロファージは、０．５ｍｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１を含有する厳密なＦＡＣＳ遮断緩衝液で遮断され、次いで、示された濃度で３０分間、ＡＢ１０１（円形）またはアイソタイプ対照（三角形）を用いて染色された。Ｍ２ｃマクロファージへのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ＡＢ１０１およびアイソタイプ対照の結合は、蛍光強度により定量され、ｇＭＦＩとして報告された。記号は、４つの試験対象の平均±標準誤差を表す。曲線適合は、２部位飽和結合モデル（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）で行われた。（Ｒ２＝０．９９）。（Ａ）線形、および（Ｂ）対数ｘ軸スケール。
本明細書には、ＣＤ１６３＋細胞に特異的に結合する抗体が開示される。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３＋細胞は、免疫抑制性骨髄細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３＋細胞は、骨髄系を発現するヒトＣＤ１６３である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３＋細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３＋免疫抑制性骨髄系細胞は、ヒトマクロファージである。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ１６３＋免疫抑制マクロファージは、Ｍ２またはＭ２様マクロファージである。いくつかの実施形態では、免疫抑制性骨髄細胞は、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）である。いくつかの実施形態では、ヒトマクロファージは、高レベルのＣＤ１６３（ＣＤ１６３Ｈｉ）を発現する。対照的に、他のヒト造血細胞または原発性非免疫ヒト細胞は、ＣＤ１６３を発現しない。例えば、Ｍ１およびＭ１様マクロファージは、ＣＤ１６３を発現しない。
特定の炎症性サイトカインまたは微生物関連分子パターンに曝される単球およびマクロファージは、炎症促進性（Ｍ１またはＭ１様）あるいは抗炎症性Ｍ２またはＭ２様マクロファージに分化する。Ｍ１およびＭ２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化されたマクロファージを、それぞれ炎症促進性（ＩＦＮ－γおよびリポ多糖で古典的に活性化されたとき）または抗炎症性（ＩＬ－４またはＩＬ－１０で代替的に活性化されたとき）として定義するために使用される分類であり、Ｍ１またはＭ２表現型を伴うｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏマクロファージは、Ｍ１様またはＭ２様マクロファージとして定義される。いくつかの実施形態では、Ｍ２マクロファージは、これらを特定のサイトカインへ曝露することにより生成される。いくつかの実施形態では、Ｍ２マクロファージは、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、またはこれらの組合せにより分化される。
Ｍ２マクロファージのサブタイプには、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃ、およびＭ２ｄサブタイプが含まれる。Ｍ２ａマクロファージは、ＣＤ１６３の上方調節発現、アルギナーゼー１、マンノース受容体ＭＲＣ１（ＣＤ２０６）、ＭＨＣ ＩＩシステムによる抗原提示、ならびにＩＬ－１０およびＴＧＦ－βの産生を誘発するＩＬ－４およびＩＬ－１３により誘導され、これにより、組織再生および炎症促進分子の阻害が生じ、炎症反応が妨げられる。Ｍ２ｂマクロファージは、免疫複合体への応答としてＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－αを産生する。Ｍ２ｃマクロファージは、ＩＬ－１０により誘導され、成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）およびグルココルチコイド暴露を形質転換し、ＩＬ－１０およびＴＧＦ－βを産生して、炎症反応を抑制する。Ｍ２ｄサブタイプは、ＩＬ－６およびアデノシンへの応答として活性化される。
Ｍ２マクロファージは、Ｍ２マクロファージおよびそのサブタイプに対応する機能と表現型を有している。Ｍ２様マクロファージは、Ｍ２マクロファージの機能的または表現型特徴のサブセットを有するｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのマクロファージである。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、免疫抑制性骨髄細胞に対して、具体的にはＭ２およびＭ２様マクロファージなどの腫瘍関連マクロファージに対して高結合活性および特異的結合を有している。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト原発性肺腫瘍由来のＭ２およびＭ２様ＴＡＭに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、Ｍ１またはＭ１様マクロファージに対する顕著な結合を有していない。Ｍ１活性化マクロファージは、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ５）、カッパ光ポリペプチド遺伝子エンハンサの核因子（ＮＦ－κＢ）、活性化タンパク質（ＡＰ－１）、およびＳＴＡＴ１などの転写因子を発現する。Ｍ１マクロファージは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、およびＴＮＦαなどの炎症促進性サイトカインを分泌する。Ｍ１マクロファージは、Ｍ１マクロファージに対応する機能および表現型を有している。Ｍ１様マクロファージは、Ｍ１マクロファージの機能的または表現型特徴のサブセットを有するｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのマクロファージである。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、原発性ヒト細胞に結合しない。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、造血幹細胞、白血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および顆粒球に結合しない。
腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、固形腫瘍の微小環境中に多くの数が存在するマクロファージ細胞の異種分類である。大半の証拠より、ＴＡＭは、腫瘍促進表現型を有しており、腫瘍細胞増殖、腫瘍血管新生、運動性、浸潤、転移、抗癌薬耐性、および腫瘍免疫回避に関与していることが明らかであることが示唆されている。
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）間の細胞傷害性Ｔ細胞による直接腫瘍細胞死滅は、免疫系の抗腫瘍機能において主要な役割を果たす。しかし、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中のＴＡＭは、Ｔ細胞媒介性抗腫瘍免疫応答を抑制する。ＴＡＭは、免疫抑制性転写プロファイルを有しており、ＩＬ－１０および形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）を含む因子を発現する。ヒトにおけるＴＡＭは、それぞれＴ細胞上でプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）を活性化する、肝細胞癌でのプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、および卵巣癌でのＢ７－ホモログの表面提示を介して、Ｔ細胞機能を直接抑制することが認められている。ＰＤ－１およびＣＴＬＡ４への阻害シグナルは、免疫チェックポイントであり、これら阻害受容体のリガンドによる結合は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達とＴ細胞毒性機能を阻害し、Ｔ細胞アポトーシスを促進する。ＨＩＦ－１αは、ＴＡＭを誘導してＴ細胞機能を抑制する。ＣＤ１６３は、ＴＡＭ上でのみ発現される免疫抑制分子として特定されており、癌免疫療法の候補となる治療標的になる可能性がある。
ＴＡＭは、一般的にＴｈ１およびＴｈ２型Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋）に対する関係を含む機能特徴に基づき、２つのカテゴリとしてＭ１様抗腫瘍およびＭ２様免疫抑制マクロファージに属する。Ｍ１マクロファージは、「古典的」モデルであり、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）（例えば、リポ多糖（ＬＰＳ））または損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）のほか、炎症性サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α））などの自然免疫活性化因子とともにＩＦＮ－γを用いて生成可能である。さらに、ＣＤ４０－ＣＤ４０リガンド経路を介したＴ細胞依存性マクロファージ活性化は、Ｍ１分化を誘導する。Ｍ１マクロファージは、炎症性、殺菌性、および細胞傷害性機能を有している。これらマクロファージは、Ｔｈ１細胞の抗原依存性誘導、ならびにＴｈ１およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を促進する。Ｍ１様抗腫瘍マクロファージによるＴ細胞傷害活性の促進は、腫瘍細胞除去に重要なものである。いくつかの実施形態では、Ｍ１様抗腫瘍マクロファージは、フローサイトメトリーにより測定された表面マーカー発現を特徴とするものであり、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＣＤ１６３Ｌｏ／－、またはＣＤ２０６Ｌｏ／－いずれかの表現型を有している。Ｍ１マクロファージは、ＩＬ－１２、ならびに低レベルのＩＬ－１０および／またはＴＧＦ－γを分泌する。
対照的に、Ｍ２様免疫抑制マクロファージは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ－４またはＩＬ－１０により生成可能な「代替的」または「非古典的」活性化のモデルであり、抗炎症性であり、かつ、創傷治癒および組織修復を促進する。いくつかの実施形態では、Ｍ２様免疫抑制マクロファージは、単球由来マクロファージから極性化され、腫瘍により分泌される因子によって動員される。Ｍ２様免疫抑制マクロファージが、腫瘍増殖、転移、および免疫回避の促進を含むＴＡＭの腫瘍促進機能に関与する主なマクロファージ細胞型である。Ｍ２様マクロファージは、フローサイトメトリーにより判定される表面マーカーＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３Ｈｉ、ＣＤ２０４Ｈｉ、ＣＤ２０６Ｈｉ、および／または他のＭ２マクロファージマーカーを発現する。Ｍ２マクロファージは、高レベルのＩＬ－１０およびＴＧＦ－ｂｅｔａ１、ならびに低レベルのＩＬ－１２を分泌する。
多くの腫瘍型では、ＴＡＭ浸潤レベルは、顕著な予後値を有している。ＴＡＭは、多種多様な腫瘍における予後不良と関連している。例えば、より多くのＭ２様腫瘍関連マクロファージを有する乳癌患者は、より高悪性度の腫瘍、より大きな微小血管密度、およびより低い全生存率を有することが見出されている。より多くのＭ１様抗腫瘍ＴＡＭを有する患者は、相反効果を示した。
したがって、癌治療の免疫療法的処置を改善するための化合物と方法を特定する必要が、依然として残っている。
ＣＤ１６３（スカベンジャー受容体システインリッチ１型タンパク質Ｍ１３０、ヘモグロビンスカベンジャー受容体）は、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体のスカベンジャー受容体として作用して、遊離ヘモグロビン媒介性の酸化的損傷から組織を保護する細胞表面タンパク質である。分子量が１２５、４５１、１２５，９８２、１２１，６０９、および１２４，９５８Ｄａである、ＣＤ１６３タンパク質の４つのアイソフォームが報告されている。アイソフォーム１は、ＣＤ１６３の最も一般的なアイソフォームであり、分子量は１２５，４５１Ｄａであり、細胞外ドメイン、膜貫通セグメント、および細胞質尾部を含む１１１５のアミノ酸残基ポリペプチドからなる。細胞外ドメインは、９つのシステインリッチリピートドメインからなる。ＣＤ１６３タンパク質のアイソフォーム１には４つのＮ結合グリコシル化部位があり、Ｍ２マクロファージ中のＣＤ１６３タンパク質は、還元条件下にあるＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて、最大１５０ｋＤａおよび最大１３０ｋＤａで２つの異なる帯域を示す。
ＣＤ１６３ｍＲＮＡ発現は、一般的に骨髄細胞に限定されるが、特定のヒト癌によっても発現される。ＴＡＭ上でのＣＤ１６３発現は、癌における不良臨床転帰と相関すると認められている免疫抑制性Ｍ２様表現型に関連付けられている。ＣＤ１６３は、ヒトおよびマウス肉腫におけるマクロファージの腫瘍性活性化に必要なものである。ＣＤ１６３はまた、マクロファージスカベンジャー受容体であるとともに、免疫抑制を促進することが報告されている。いくつかの実施形態では、ヘモグロビンーハプトグロビン複合体とＣＤ１６３との相互作用は、免疫抑制性サイトカインＩＬ－１０および発現ヘムーオキシゲナーゼー１（ＨＯ－１）の分泌を誘導する。ＨＯ－１は、炎症抑制の代謝物Ｆｅ２＋、ＣＯ、およびビリベルジンを産生する。
可溶性ＣＤ１６３は、エキトドメイン脱落を介してヒトに生じるものであり、フィトヘマアグルチニン（ＰＨＡ）または１２－Ｏ－テトラデカノイルホルボールー１３－アセテート（ＴＰＡ）により刺激されるリンパ球増殖を含むＴ細胞応答をダウンレギュレートするなど、抗炎症特性を有していると報告されている。
ＣＤ１６３を標的とする抗体は、マクロファージを発現するＣＤ１６３の自然免疫応答を調節すると認められている。例えば、ＣＤ１６３に対する抗体であるＲＭ３／１抗体は、ヒト単球に対して産生されたマウスモノクローナルＩｇｇ１（κ軽鎖）である。ＲＭ３／１抗体は、ヒトＣＤ１６３のシステインリッチドメイン９に結合して、ＬＰＳ誘導型ＴＮＦαを減少させ、マクロファージによるＩＬ－１０分泌を増強する。
特定の用語
別段の定めのない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、特許請求される主題が属する技術分野の当業者により共通して理解されているものと同じ意味を有する。一般的に、本明細書に記載される免疫学、腫瘍学、細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法と、それらの技法は、当技術分野でよく知られ、一般的に使用されるものである。前述の一般的な記述および以下の詳細な説明は、例示的かつ説明的なものに過ぎず、特許請求される主題に制限されるものではないことを理解されたい。本明細書で使用される章の見出しは、構成のみを目的とするものであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上特に明記されていない限り複数の指示対象を含む。このため、例えば「抗体」への言及は、複数の抗体を含むものであり、いくつかの実施形態では、「抗体」への言及は、多数の抗体などを含むものである。
本明細書で使用するとき、すべての数値または数値範囲は、文脈上特に明記されていない限り、かかる値の範囲内にあるかこれを包含する全整数および分数、または、範囲内にあるかこれを包含する整数を含む。このため、例えば９０～１００％の範囲に対する言及は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％などのほか、９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％など、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％などを含む。別の例では、１～５，０００倍の範囲に対する言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍などのほか、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５倍など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５倍などを含む。
「約」の付く数は、本明細書で使用するとき、その数を含むとともに、その数より１０％低いものから１０％高いものに及ぶ範囲を指す。「約」の付く範囲は、その範囲の下限より１０％低く、その範囲の上限より１０％高いことを指す。
「パーセント同一性」および「％同一性」は、２つの配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸）がアライメント中の同じ位置に同じ残基を有している程度を指す。例えば、「アミノ酸配列は、配列番号Ｙに対してＸ％同一である」とは、配列番号Ｙに対するアミノ酸配列の％同一性を指し、詳細には、アミノ酸配列中の残基のＸ％が配列番号Ｙに開示される配列の残基と同一であるとされる。一般的に、このような計算にはコンピュータプログラムが利用される。配列の対を比較して位置合わせする例示的なプログラムとして、ＡＬＩＧＮ（Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ．１９８８ Ｍａｒ；４（１）：１１－７）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８８ Ａｐｒ；８５（８）：２４４４－８；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０；１８３：６３－９８）、およびギャップドＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７ Ｓｅｐ １；２５（１７）：３３８９－４０）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、またはＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８４ Ｊａｎ １１；１２（１ Ｐｔ １）：３８７－９５）が挙げられる。
本明細書中で使用するとき、「抗体」は、抗原に結合するタンパク質を指す。抗体は、重鎖および軽鎖のそれぞれに可変ドメインおよび定常ドメインを含むことが多い。したがって、大半の抗体は、一体となって抗原に結合する抗体部分を形成する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有している。各可変ドメイン内には、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）中にループを形成して、抗原の表面に接触する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）がある。「抗体」には、ポリクローナル、モノクローナル、単特異性、多特異性（例えば二重特異性抗体）、天然、ヒト化、ヒト、キメラ、合成、組換え、ハイブリット、突然変異、グラフト、抗体フラグメント（例えば、完全長抗体の一部、一般的には、抗原結合またはその可変領域、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント）、および抗原結合活性を有するｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。この用語はまた、一本鎖抗体、例えば、可変重鎖および可変軽鎖が（直接またはペプチドリンカーを介して）一体的に結合して連続ポリペプチドを形成する一本鎖ＦＶ（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）抗体も含む。
本明細書で使用するとき、「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、特異的抗原に結合する抗体における可変鎖の部分を指す。ＣＤＲを定義するために複数の方法が使用される場合がある。現在の技術は、ＣＤＲの長さと位置の様々な定義を用いる様々なナンバリングスキームを利用する。例えば、Ｋａｂａｔナンバリングスキームは、配列アライメントに基づくものであり、所与のアミノ酸位置の「可変パラメータ」（所与の位置での異なるアミノ酸の数を、その位置で最も多く生じるアミノ酸の頻度で割ったもの）を使用して、ＣＤＲを予測する。一方、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームは、抗体の結晶構造がＣＤＲとしてループ構造を定義するようにアライメントされる構造ベースのナンバリングスキームである。Ｍａｒｔｉｎナンバリングスキームは、非定型の長さの異なるフレームワーク領域の構造アライメントに焦点を当てたものである。ＩＭＧＴナンバリングスキームは、免疫グロブリンスーパーファミリー全体を含む完全な参照遺伝子データベースからの配列のアライメントに基づく、標準化ナンバリングシステムである。Ｈｏｎｎｅｇｅｒナンバリングスキーム（ＡＨｏ’ｓ）は、可変領域の３Ｄ構造の構造的アライメントに基づくものであり、構造的に保存されたＣα位置を使用してフレームワークとＣＤＲの長さを推定する。当業者は、使用される方法に基づきＣＤＲの定義が変わることに留意されたい。ＣＤＲを定義するあらゆる方法が、本明細書に開示される配列を用いて企図される。
「受容者」、「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用されるものであり、診断、処置、または治療が望まれる哺乳動物対象、具体的にはヒトを指す。処置目的のための「哺乳動物」とは、ヒト、飼育動物、および家畜、ならびにイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルといった、実験室、動物園、スポーツ、またはペット動物を含む哺乳動物として分類される動物を指す。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。
本明細書で使用するとき、「処置」、「処置すること」などの用語は、場合により、効果を得る目的で薬剤を投与すること、または処置を実行することを指す。いくつかの実施形態では、効果は、疾患またはその症状を完全または部分的に予防するという点で予防的であり、ならびに／あるいは、疾患および／またはその症状の部分的または完全な治癒をもたらすという点で治療的である。本明細書で使用するとき、「処置」には、哺乳動物、具体的にはヒトの疾患または障害（例えば癌）の処置が含まれ、（ａ）疾患またはその症状が、疾患（例えば、原発性疾患に関連するかそれにより引き起こされる疾患を含む）に罹患する傾向はあるが依然として疾患を抱えていると診断されていない対象に生じるのを防ぐこと、（ｂ）疾患を阻害、すなわち疾患の進行を止めること、ならびに（ｃ）疾患を緩和、すなわち疾患の退行を引き起こすことが含まれる。いくつかの実施形態では、処置することとは、癌の処置、改善、または予防が成功したことを指すものであり、軽減、寛解、症状の減少または病状が患者に対してより忍容可能となること、変性または衰退の速度が遅くなること、変性の最終地点がより衰弱すること（ｄｅｂｉｌｉｔａｔｉｎｇ）などの客観的または主観的なパラメータが含まれる。症状の治療または改善は、医師による診察結果を含む、１つ以上の客観的または主観的パラメータに基づくものである。したがって、「処置すること」という用語は、疾患（例えば、癌）に関連する症状または状態を予防または遅延させるため、軽減するため、あるいは先の症状または状態の発症を阻止または阻害するための、本開示の化合物または薬剤の投与を含む。「治療効果」という用語は、対象における疾患、疾患の症状、または疾患の副作用の低減、根絶、または予防を指す。本開示の抗体の治療量を投与した後、疾患または障害のパラメータまたは症状において観察可能および／あるいは測定可能な変化、例えば、癌治療の場合、ｅｘ ｖｉｖｏで評価されるような腫瘍細胞死滅活性の増加、血中の免疫抑制性分泌因子レベルの低下、腫瘍体積または腫瘤の低下、腫瘍生検における細胞障害性リンパ球およびＴｈ１様Ｔ細胞数の増加、病的状態または死亡率の低下、クオリティオブライフ因子の改善、あるいは疾患もしくは障害のパラメータまたは症状に関連する任意の客観的適応症の改善を患者が示す場合、対象は、疾患または障害を「処置」される。いくつかの実施形態では、パラメータは、例えば、腫瘍生検において細胞傷害性リンパ球細胞数ならびにＴ細胞活性化のマーカー（ＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０など）を増加させることにより、または腫瘍生検においてＴＡＭ上でのＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、Ｓｉｇｌｅｃ－１５の発現を減少させることにより、冷たい免疫腫瘍を温かい免疫腫瘍に変換することを含む。
いくつかの実施形態では、「応答を誘導する」とは、対象の病気の徴候または症状の緩和あるいは軽減を指すものであり、具体的には生存の延長を含むがこれに限定されるものではない。
「結合活性」という用語は、２つ以上の薬剤の複合体の希釈後の解離に対する耐性を指す。
いくつかの実施形態では、抗体「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列ＦＣ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因し、抗体アイソタイプにより変動する生物学的活性を指す。
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を指す。
「ヒトエフェクター細胞」は、本明細書で使用するとき、１つ以上のＦｃＲを発現してエフェクター機能を実施する白血球を指す。例えば、細胞は、少なくともＦｃ γＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実施する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、細胞傷害性Ｔ細胞、および好中球が含まれるが、これらに限定されるものではない。
「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、その同族抗原に結合している（適切なサブクラスの）抗体に対する補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分の結合により、開始される。補体活性化を評価するには、例えばＣＤＣアッセイが実施される。
「内在化する」抗体は、哺乳動物細胞上の抗原（例えば、細胞表面ポリペプチドまたは受容体）への結合に際して細胞に取り込まれる（すなわち、細胞に入る）抗体である。内在化抗体は、抗体フラグメント、ヒトまたはキメラ抗体、および抗体コンジュゲートを含む。場合により、（例えば、本明細書に開示されるものなどの）抗体の内在化は、細胞の生物学を改質し、その機能を変化させる。
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、または「抗原結合部位」は、抗原と相互作用して抗原に対する抗体の特異性と親和性に寄与するアミノ酸残基（または他の部分）を包含する抗体の一部である。その抗原に特異的に結合する抗体の場合、これは、そのＣＤＲドメインの少なくとも１つの少なくとも一部を含む。
抗体の抗原結合領域は、抗原決定基である抗原の「エピトープ」、すなわち抗体により結合可能な抗原分子の一部に結合する「パラトープ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、抗原物質は、抗体により認識可能な１つ以上の部分、すなわち、１より多くのエピトープを有しており、このため、単一の抗原物質は、それぞれが異なるエピトープに対する特異性を有する様々な抗体により特異的に結合される。いくつかの実施形態では、エピトープは、抗原の非近接部分を含む。例えば、ポリペプチドでは、ポリペプチド一次配列において近接していないが、ポリペプチドの三次および四次構造の状況では、抗原結合タンパク質により結合されるほど互いに接近しているアミノ酸残基は、エピトープを構成する。
「抗体フラグメント」は、無傷の抗体の一部を含む。いくつかの実施形態では、抗体フラグメントは、無傷の抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。
「抗体の抗原結合部分」、「抗原結合フラグメント」、「抗原結合ドメイン」、「抗体フラグメント」という用語は、本明細書では互換的に使用されるものであり、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。かかる用語内に含まれる抗体フラグメントの非限定的な例として、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわちヒンジ領域でのジスルフィド架橋により結合される２つのＦａｂフラグメントを包含する二価フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ-ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一腕のＶＬおよびＶＨドメインを包含するＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインを包含するｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１（６２４２）：５４４－６（１９８９））、および（ｖｉ）単離されたＣＤＲが挙げられるが、これらに限定されるものではない。単一重鎖および単一軽鎖を含む「半分」抗体も含まれる。ダイアボディなどの他の一本鎖抗体の形態も、本明細書に包含される。
「機能的抗体フラグメント」は、本明細書で使用するとき、文脈の中で、抗体の抗原に結合するだけでなく、無傷の抗体を特徴付ける機能的属性も有する抗体フラグメントを指す。例えば、抗体の機能が、ＡＤＣＣなどのエフェクター機能を可能にするＦｃドメインを有することに依存する場合、機能性フラグメントは、このような機能を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）またはＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）などのマクロファージＦｃ受容体に結合するＦｃ部分を含むとき、腫瘍関連マクロファージの機能状態を調節する、またはＭ２状態マクロファージを再配向または減衰させるのに有効であると仮定されている。
抗体の「機能フラグメントまたはアナログ」という語句は、完全長抗体と共通の定性的な生物学的活性を有する化合物である。例えば、抗ＩｇＥ抗体の機能フラグメントまたはアナログは、ＩｇＥ免疫グロブリンに結合して、かかる分子が、高親和性受容体であるＦｃγＲＩへの結合能を有するのを妨げるか実質的に減らすというものである。
「抗原結合タンパク質」とは、抗体の抗原結合部分を含む部分を含んでいるタンパク質であり、任意選択で、抗原への抗原結合タンパク質の結合を促進する立体配座を抗原結合部分が適用するのを可能にするスキャホールドまたはフレームワーク部分も含んでいる。
「無傷の」抗体とは、抗原結合部位のほか、ＣＬ、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む抗体である。いくつかの実施形態では、定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体である。
本明細書で使用するとき、「組換え抗体」という用語は、例えば、ＣＤＲ、ＶＨ領域、または無傷の軽鎖などの第１の抗体の抗原結合ドメイン、および１つ以上の他の抗体またはタンパク質由来のドメインを含む抗体を表す。キメラ抗体、ハイブリッド抗体、およびヒト化抗体は、組換え抗体の例である。
「ＣＤＲグラフト抗体」とは、１つの種またはアイソタイプの抗体に由来する１つ以上のＣＤＲ、および同じまたは異なる種あるいはアイソタイプの別の抗体のフレームワークを含む抗体である。
「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１つ以上の可変領域および定常領域を有する抗体をすべて含む。一実施形態では、抗体の可変ドメインおよび定常ドメインはすべて、ヒト免疫グロブリン配列（「完全ヒト抗体」と称される）に由来する。
本明細書で使用するとき、「親和性」という用語は、２つの薬剤同士の可逆的結合に対する平衡定数を指し、ＫＤで表される。一実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、１０－６Ｍ以下の範囲、または１０－１６Ｍ以下までの範囲（例えば、約１０－７、１０－８、１０－９、１０－１０、１０－１１、１０－１２、１０－１３、１０－１４、１０－１５、１０－１６Ｍ以下）で、ＣＤ１６３に対するＫＤ（平衡解離定数）により測定されるような結合親和性を呈する。ある実施形態では、本明細書に記載の抗体は、１０－４Ｍ以下、約１０－５Ｍ以下、約１０－６Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、または１０－８Ｍ以下のＫＤをもって、ｈｕＣＤ１６３ポリペプチドに特異的に結合する。
「優先的に結合する」または「特異的に結合する」という用語は、抗体またはそのフラグメントが、関連しないアミノ酸配列に結合するよりも高親和性でエピトープに結合し、このエピトープを含有する他のポリペプチドに対し交差反応する場合、ヒトへの投与用に製剤化されるレベルでは毒性ではないことを意味する。いくつかの実施形態では、このような親和性は、未関連のアミノ酸配列に対する抗体またはそのフラグメントの親和性よりも、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍高い。
「特異的」という用語は、抗体が、抗体により認識されるエピトープを含有する抗原以外の分子に優先的に結合する状況を指す。この用語はさらに、例えば、抗原結合ドメインが、多数の抗原により運ばれる特定のエピトープに対し特異的であるという状況にも当てはまるものであり、この場合、抗原結合ドメインを運ぶ抗体またはその抗原結合フラグメントは、エピトープを運ぶ様々な抗原に結合可能となる。
本明細書で使用するとき、抗体は、抗原で検出可能なレベルで、好ましくは約１０４Ｍ－１以上、約１０５Ｍ－１以上、約１０６Ｍ－１以上、約１０７Ｍ－１以上、または１０９Ｍ－１以上の親和性定数Ｋａで抗体が反応する場合に、抗原に対して「免疫特異的」または「特異的」、あるいは「特異的に結合する」と言われる。
「単一特異的」という用語は、本明細書で使用するとき、１つの特定のエピトープに対して優先的な親和性を呈する抗体を含有する抗体組成物を指す。いくつかの実施形態では、単一特異的抗体調製物は、特定の抗原に対する特異的な結合活性を有する約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または９９．９％の抗体で構成される。
「ポリペプチド」という用語は、その従来の意味で、すなわちアミノ酸の配列として使用される。ポリペプチドは、生成物の特定の長さに限定されるものではない。ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれるものである、これらの用語は、別段の定めのない限り、本明細書で互換的に使用される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化などのほか、当該技術分野で知られる自然発生と非自然発生両方の他の修飾を表すものでも、除外するものでもない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、タンパク質全体、またはそのサブ配列である。本開示の抗体に照らして目的の特定のポリペプチドは、ＣＤＲを含むとともに、このような細胞により発現されるヒトＭ２マクロファージまたはＣＤ１６３タンパク質に結合可能なアミノ酸サブ配列である、
本明細書で使用するとき、「実質的に純粋」および「実質的に含まない」とは、例えば、約２０％以下の外来物質、約１０％以下の外来物質、約５％以下の外来物質、約４％以下の外来物質、約３％以下の外来物質、約２％以下の外来物質、または約１％以下の外来物質しか含有していない溶液あるいは懸濁液を指す。
「単離された」という用語は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まないタンパク質（例えば抗体）、核酸、または他の物質を指す。いくつかの実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメント、および核酸は、単離される。いくつかの実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメント、および核酸は、実質的に純粋である。
「単離された」は、ポリペプチドに適用されるとき、一般的に、それが天然に生じる他のタンパク質および核酸から分離されているポリペプチドを意味する。好ましくは、ポリペプチドはまた、それを精製するために使用される抗体またはゲルマトリクス（ポリアクリルアミド）などの物質からも分離される。場合により、この用語は、その起源または操作に起因して、（ｉ）発現ベクターの一部の発現産物として宿主細胞に存在する、（ｉｉ）自然に結合されるもの以外のタンパク質または他の化学部分に結合される、あるいは（ｉｉｉ）自然に生じない、ポリペプチドまたはその一部、例えば、少なくとも１つの疎水性部分をタンパク質に付加または添加して、そのタンパク質が自然に見出されない形態にあるようにすることにより化学的に操作されるタンパク質を意味する。「単離された」とは、さらに、（ｉ）化学的に合成される、または（ｉｉ）宿主細胞中で発現されて関連タンパク質および汚染タンパク質から精製分離されるタンパク質を意味する。
「有効量」という用語は、本明細書で使用するとき、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分が、反応を誘導する、例えば、対象に投与したときに、本明細書に記載されるようなマクロファージ活性またはＴＡＭ活性に関連する疾患の処置、予後、または診断を達成するのに十分な量を指す。本明細書で提供する抗体の治療上有効な量は、単独または組み合わせて使用されるとき、（例えば、腫瘍細胞成長の阻害における）抗体および併用物の相対的活性に応じて、ならびに、処置される対象および病状、対象の体重と年齢、病状の重症度、場合により当業者が容易に決定する投与様式などに応じて変動する。
「治療上有効な量」という用語は、概して、対象または哺乳動物の疾患または障害を「処置する」のに有効な抗体または薬物の量を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、あらゆる医学的処置に適用可能な合理的なベネフィット・リスク比で本明細書に記載の疾患または障害を阻害することにより一部の所望の治療効果を産み出すのに有効な量で、対象に投与される。治療的有効な量は、器官または組織において少なくとも部分的に所望の治療効果または予防効果を達成する量である。疾患または障害の予防および／あるいは治療的処置を行うのに必要な抗体の量は、それ自体固定されていない。いくつかの実施形態では、投与される抗体の量は、疾患の種類、疾患の拡張性、および疾患または障害を患う哺乳動物の大きさにより変動する。「治療上有効な」という用語は、対象が疾患または疾病の症状を発症した後の治療薬の投与を必要とする治療方法と組み合わせて使用されるとき、処置後に、疾患または障害の１つ以上の兆候または症状が改善あるいは排除されることを意味する。
「薬学的に許容可能な」という語句は、ヒトに投与したときに、生理学的に忍容可能であり、一般的に胃の不調や目眩などのアレルギー反応または同様の有害反応を生じさせない分子実体および組成物を表す。
「接触させる」という用語は、本明細書では、本明細書中で提供される組成物を、本明細書に記載の細胞、器官、組織、または流体と物理的に接近させる手段として定義される。
免疫調節抗体
本明細書の特定の実施形態では、ヒトＣＤ１６３＋細胞上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合する抗体が開示される。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３＋細胞は、免疫抑制性骨髄細胞である。いくつかの実施形態では、免疫抑制性ヒト骨髄細胞は、ヒトマクロファージである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体の結合は、ヒトマクロファージ上での少なくとも１つのマーカーの発現を改質する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ヒトＭ２またはＭ２様免疫抑制性マクロファージ上で発現されるヒトＣＤ１６３（ｈｕＣＤ１６３）タンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ｈｕＣＤ１６３の約１４０ｋＤａグリコ型であるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ｈｕＣＤ１６３の細胞外ドメイン３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ｈｕＣＤ１６３の細胞外ドメイン４に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ｈｕＣＤ１６３の細胞外ドメイン３および細胞外ドメイン４に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ｈｕＣＤ１６３に特異的に結合し、その結果、ｈｕＣＤ１６３の立体構造に変化が生じる。いくつかの実施形態では、ｈｕｍＣＤ１６３に対する立体配座の変化は、ｈｕｍＣＤ１６３の細胞外ドメイン２、５、および９を暴露させる。いくつかの実施形態では、抗体は、ｈｕＣＤ１６３の低分子量（約１１５ｋＤａ）グリコ型に特異的に結合しない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ヒトＣＤ１６３＋免疫抑制性骨髄細胞に結合して、Ｍ２またはＭ２様免疫抑制性マクロファージ（Ｍ２ｃマクロファージなど）を特徴付ける特定の細胞マーカーの発現に変化を生じさせる。このことは、非免疫抑制性または低免疫抑制性のほか、より抗腫瘍性の状態へのマクロファージの機能的分化を示している。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、Ｍ２またはＭ２様免疫抑制性マクロファージに結合して、Ｍ２またはＭ２様免疫抑制性マクロファージを特徴付ける特定の細胞マーカーの発現を減少させる。このことは、改質された分化状態へのマクロファージの機能的分化を示している。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ＣＤ１６３＋免疫抑制性骨髄細胞によるＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、およびＳｉｇｌｅｃ－１５の１つ以上の発現を低下させる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体のＣＤ１６３＋免疫抑制性骨髄細胞への結合は、ＣＤ１６３＋免疫抑制性骨髄細胞に機能的変化をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体のＣＤ１６３＋免疫抑制性骨髄細胞への結合は、Ｍ２またはＭ２様免疫抑制性マクロファージに変化をもたらす。いくつかの実施形態では、抗体に結合したＣＤ１６３＋免疫抑制性骨髄細胞の機能的変化は、エフェクター Ｔ細胞などの他の細胞との相互作用の修飾をもたらし、後に、標的腫瘍細胞に対する効果と相互作用を修飾する。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、腫瘍微小環境中で腫瘍関連マクロファージにより引き起こされる免疫抑制を低下させる。いくつかの実施形態では、腫瘍微小環境中での腫瘍関連マクロファージによる免疫抑制の低下は、免疫刺激、例えば、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、ＮＫ細胞活性化、ＮＫ細胞増殖、またはこれらの任意の組合せの促進産生の増加に相当する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化および／またはＮＫ細胞活性化は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞によるＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、パーフォリン、またはこれらの組合せの産生増加をもたらす。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、免疫刺激、例えば、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、ＮＫ細胞活性化、ＮＫ細胞増殖、またはこれらの任意の組合せの促進産生を増加させる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化および／またはＮＫ細胞活性化は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞によるＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、パーフォリン、またはこれらの組合せの産生増加をもたらす。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒトマクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合し、ヒトマクロファージは、抗体と結合前の第１の免疫抑制活性、および抗体と結合後の第２の免疫抑制活性を有しており、第２の免疫抑制活性は、第１の免疫抑制活性よりも低い。様々な実施形態では、第１および第２の免疫抑制活性は、それぞれゼロではない。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、Ｔ細胞の活性化と増殖を促進する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｔ細胞集団を抗腫瘍Ｔ細胞表現型へと歪ませる。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｔ細胞活性化の骨髄細胞抑制を低下または遮断する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＡＭによるＴ細胞活性化抑制能を低下させ、より大きなＴ細胞刺激とＩＬ－２産生を生じさせる。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＡＭによるＴ細胞活性化抑制能を遮断し、より大きなＴ細胞刺激とＩＬ－２産生を生じさせる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、Ｔ細胞増殖の骨髄抑制を低下させる。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＡＭがＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および増殖を抑制する能力を低下させる。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｔｈ１細胞増殖のＴＡＭ抑制を低下させる。増殖したＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上での活性化マーカーの発現強化を示す。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、Ｍ２マクロファージが、Ｍ２マクロファージの免疫抑制効果を軽減するＭ１様表現型を呈するように、Ｍ２極性化マクロファージを改質する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、単球由来マクロファージに影響を及ぼして、免疫抑制性が低く、より抗腫瘍性の分化状態へと分化する。
いくつかの実施形態では、本明細書には、ヒトマクロファージ上で発現されて、マクロファージによるＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５のうち少なくとも１つの発現を低下させるヒトＣＤ１６３タンパク質（ｈｕＣＤ１６３）に特異的に結合する工程が、提供される。いくつかの実施形態では、ヒトマクロファージは、腫瘍関連免疫抑制性マクロファージである。いくつかの実施形態では、ヒトマクロファージは、Ｍ２様免疫抑制性マクロファージである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、マクロファージにより発現される少なくとも１つの他のタンパク質を含む複合体の成分としてマクロファージにより発現されるＣＤ１６３タンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、複合体は細胞表面複合体である。いくつかの実施形態では、複合体は、ガレクチン－１タンパク質、ＬＩＬＲＢ２タンパク質、およびカゼインキナーゼＩＩタンパク質から選択される少なくとも１つの他のタンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、マクロファージ上でＣＤ１６３タンパク質に結合し、マクロファージにより内在化される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、それが結合しているマクロファージに対し細胞傷害性ではない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性または増殖を促進する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４の発現を促進する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性または増殖を促進する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４の発現を促進する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性または増殖を促進することにより、腫瘍微小環境中で腫瘍細胞死滅を促進する。いくつかの実施形態では、抗体は、細胞傷害性リンパ球を媒介とした癌細胞死滅を促進する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＮＫ細胞を媒介とした腫瘍細胞死滅を促進する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、Ｔ細胞によるＩＬ－２の発現を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質への本開示の抗体の結合は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ１９６－Ｔ細胞、ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞、ＣＣＲ４－Ｔ細胞、またはこれらの任意の組み合わせを増加させる。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤ４＋ＣＤ１９６－ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ４－Ｔ細胞を増加させる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、マクロファージ上で発現されるＦｃ受容体に結合する定常ドメインを有する。いくつかの実施形態では、抗体はｈｕＣＤ１６３に特異的に結合し、Ｆｃ受容体に結合する定常ドメインを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）またはＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）などのＣＤ１６３＋免疫抑制性骨髄細胞上で発現されるＦｃ受容体に結合する定常ドメインを有する。いくつかの実施形態では、ｈｕＣＤ１６３およびＦｃ受容体は、同じ細胞上で発現される。いくつかの実施形態では、ｈｕＣＤ１６３およびＦｃ受容体は、異なる細胞上で発現される。いくつかの実施形態では、抗体可変ドメインは、ｈｕＣＤ１６３、およびＦｃ受容体に同時に結合する抗体定常ドメインに特異的に結合する。
本明細書の特定の実施形態では、ヒトＭ２およびＭ２様マクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合する抗体が開示され、前記結合は、以下の効果：
（ａ）ヒトマクロファージによる、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーの発現の低下、
（ｂ）ヒトマクロファージによる抗体の内在化、
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、
（ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖、ならびに
（ｅ）腫瘍微小環境中での腫瘍細胞死滅の促進
のうち少なくとも１つをもたらす。
本明細書の特定の実施形態では、ヒトＭ２およびＭ２様マクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合する抗体が開示され、前記結合は、以下の効果：
（ａ）ヒトマクロファージによる、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーの発現の低下、
（ｂ）ヒトマクロファージによる抗体の内在化、
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、
（ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖、ならびに
（ｅ）腫瘍微小環境中での腫瘍細胞死滅の促進
のうち少なくとも２つをもたらす。
本明細書の特定の実施形態では、ヒトＭ２およびＭ２様マクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合する抗体が開示され、前記結合は、以下の効果：
（ａ）ヒトマクロファージによる、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーの発現の低下、
（ｂ）ヒトマクロファージによる抗体の内在化、
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、
（ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖、ならびに
（ｅ）腫瘍微小環境中での腫瘍細胞死滅の促進
のうち少なくとも３つをもたらす。
本明細書の特定の実施形態では、ヒトＭ２およびＭ２様マクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合する抗体が開示され、前記結合は、以下の効果：
（ａ）ヒトマクロファージによる、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーの発現の低下、
（ｂ）ヒトマクロファージによる抗体の内在化、
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、
（ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖、ならびに
（ｅ）腫瘍微小環境中での腫瘍細胞死滅の促進
のうち少なくとも４つをもたらす。
本明細書の特定の実施形態では、ヒトＭ２およびＭ２様マクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合する抗体が開示され、前記結合は、以下の効果：
（ａ）ヒトマクロファージによる、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーの発現の低下、
（ｂ）ヒトマクロファージによる抗体の内在化、
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、
（ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖、ならびに
（ｅ）腫瘍微小環境中での腫瘍細胞死滅の促進
のうち少なくとも５つをもたらす。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）集団においてヒトＣＤ１６３＋免疫抑制性骨髄細胞に選択的に結合し、このとき、抗体は、Ｍ２マクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合し、ＴＡＭ集団の免疫抑制活性を低下させる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、腫瘍微小環境においてヒトＣＤ１６３＋免疫抑制性骨髄細胞に選択的に結合し、このとき、抗体は、Ｍ２マクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合し、Ｍ２マクロファージ媒介性抑制を低下させる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ヒト、ヒト化、またはキメラである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、記載されるように結合するその抗原結合フラグメントである。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、例えばヒト抗体などの無傷の免疫グロブリン分子、ならびに、抗原結合部位（すなわちパラトープ）または単一重鎖および単一軽鎖を含有するヒト化Ｉｇ分子の部分であり、この部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、可変ＮＡＲドメイン、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、単鎖結合ポリペプチド、ｄＡｂフラグメント、ダイアボディ、およびその他抗原結合フラグメントと称されるものとして、当該技術分野で既知の部分を含む。免疫グロブリン分子またはそのフラグメントを構築するとき、様々な領域またはその部分は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体またはそのフラグメントのうちいずれかを産生するために、１つ以上の定常領域またはその部分に融合、接続、またはその他の方法により結合される。このため、いくつかの実施形態では、上述の抗体のうちいずれか１つの抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｄ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、一本鎖結合ポリペプチド（例えば、Ｆｃ部分を有するｓｃＦｖ）、またはその他本明細書に記載されるような機能フラグメントである。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、任意の免疫グロブリンクラスのものであり、したがって、いくつかの実施形態では、γ、μ、α、δ、またはεの重鎖を有している。いくつかの実施形態では、γ鎖は、γ１、γ２、γ３、またはγ４である。いくつかの実施形態では、α鎖は、α１またはα２である。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ＩｇＧ免疫グロブリンである。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、任意のＩｇＧサブクラスの抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧ１である。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、κまたはλのいずれかである可変軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、λ鎖は、例えば、λ１、λ２、λ３、およびλ４を含むサブタイプのうちいずれかのものである。いくつかの実施形態では、軽鎖はκである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ヒト可変フレームワーク領域およびヒト定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト軽鎖可変フレームワーク領域およびヒト軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト重鎖可変フレームワーク領域およびヒト重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト軽鎖可変フレームワーク領域、ヒト軽鎖定常領域、ヒト重鎖可変フレームワーク領域、およびヒト重鎖定常領域を含む。
いくつかの実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、あるいはそれらのフラグメントである。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１である。ＩｇＧ１を有する抗体の一例は、ＡＢ１０１である。ＡＢ１０１は、以下の実施例１に記載されるように、配列番号９を含む軽鎖、および配列番号１０を含む重鎖を含んでいる。
いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、ＡＤＣＣ機能が低下したヒトＩｇＧ１（すなわちＦｃ－ヌル抗体）である。本開示の例示的なＦｃ－ヌル抗体は、ＡＢ１０２である。ＡＢ１０２は、配列番号９を含む軽鎖と、ＡＢ１０１の可変領域を含有するとともに重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１のＦｃ－ヌル型である配列番号１１を含む重鎖とを含んでいる。ＡＢ１０２は、後述の実施例でさらに記述される。
いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、ＡＤＣＣ機能を増強するように修飾されたヒトＩｇＧ１である。ＡＤＣＣ機能が増強された本開示の例示的な抗体は、ＡＢ１０３である。ＡＢ１０３は、配列番号９を含む軽鎖と、ＡＢ１０１の可変領域を含有するとともに重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１の増強されたＡＤＣＣ形態である配列番号１２を含む重鎖とを含んでいる。
いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４である。ＩｇＧ４を有する本開示の例示的な抗体は、ＡＢ１０４である。ＡＢ１０４は、配列番号９を含む軽鎖と、ＡＢ１０１の可変領域を含有するとともに重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４である配列番号１３を含む重鎖とを含んでいる。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒト可変フレームワーク領域およびマウス定常領域を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒト重鎖可変フレームワーク領域およびマウス重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒト軽鎖可変フレームワーク領域、マウス軽鎖定常領域、ヒト重鎖可変フレームワーク領域、およびマウス重鎖定常領域を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、マウスＩｇＧ２Ａである。マウスＩｇＧ２Ａを有する抗体の一例は、ＡＢ２１１である。ＡＢ２１１は、配列番号１４を含む軽鎖と、ＡＢ１０１のヒト可変領域を含有するとともに重鎖定常領域がマウスＩｇＧ１のＦｃ－ヌル型であり、軽鎖定常領域がマウスκである配列番号１５を含む重鎖とを含んでいる。ＡＢ２１１は、後述の実施例でさらに記述される。
いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、マウスＩｇＧ２Ａである。マウスＩｇＧ２Ａの重鎖を有する抗体の一例は、ＡＢ２１２である。ＡＢ２１１は、配列番号１４を含む軽鎖と、ＡＢ１０１のヒト可変領域を含有するとともに重鎖定常領域がマウスＩｇＧ２ａであり、軽鎖定常領域がマウスκである配列番号１６を含む重鎖とを含んでいる。ＡＢ２１２は、後述の実施例でさらに記述される。
Ｍ２マクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質への抗体または抗原結合フラグメントの結合は、いくつかの実施形態におけるＭ２マクロファージの生物学的機能を部分的（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはその中の任意の数）あるいは完全に調節する。抗体または抗原結合フラグメントの活性は、例えば、本明細書に記載、またはその他の方法で、当技術分野で知られるものなどの当技術分野で認識されているアッセイを使用する、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏアッセイを用いて求められる。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、必要に応じて、所望の機能性を保持しながら、抗体の特異的特性を改質するようさらに修飾される。例えば、一実施形態では、本開示の抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、溶解性、バイオアベイラビリティ、または半減期を含むがこれらに限定されない抗体の薬物動態特性を改質するよう修飾される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体の解離定数（Ｋｄ）は、約１～約１０ｐＭ、約１０～約２０ｐＭ、約１～約２９ｐＭ、約３０～約４０ｐＭ、約１０～約１００ｐＭ、または約２０～約５００ｐＭである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体の解離定数（Ｋｄ）は、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約７５ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２５ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１８ｐＭ未満、約１５ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約７５．ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、約２．５ｐＭ未満、または約１ｐＭ未満である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体のｈｕＣＤ１６３タンパク質またはペプチドに対する親和性は、約１０－９～約１０－１４、約１０－１０～約１０－１４、約１０－１１～約１０－１４、約１０－１２～約１０－１４、約１０－１３～約１０－１４、約１０－１０～約１０－１１、約１０－１１～約１０－１２、約１０－１２～約１０－１３、または１０－１３～約１０－１４である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、１より多くの結合部位を有する。いくつかの実施形態では、複数の結合部位は、互いに同一である。いくつかの実施形態では、複数の結合部位は、互いに異なる。自然発生のヒト免疫グロブリンは、一般的に２つの同一の結合部位を有しているが、操作された抗体は、例えば２つ以上の異なる結合部位を有している。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、二重特異性または多特異性である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、いくつかの実施形態では、単一抗原の２つの異なるエピトープに結合する。他のこのような抗体は、いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部位を、第２の抗原に対する結合部位と組み合わせている。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに結合し、Ｆｃ受容体に結合する定常ドメインを有している。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の１つ以上のエピトープの結合は、Ｆｃ受容体に対する二重特異性抗体の定常ドメインの結合と同時に生じる。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、多価とも称される２つ以上の価数を有している。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、三重特異性である。いくつかの実施形態では、多価抗体は、抗体の結合対象である抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも速やかに内在化（および／または異化）される。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、３つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（例えば、四価抗体）である。いくつかの実施形態では、本開示の多価抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により産生される。いくつかの実施形態では、多価抗体は、二量体化ドメインおよび３つ以上の抗原結合部位を含む。いくつかの実施形態では、二量体化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（または、これらからなる）。このシナリオでは、抗体は、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域に対するアミノ末端の３つ以上の抗原結合部位とを含むことになる。いくつかの実施形態では、本明細書の多価抗体は、約３～約８、好ましくは４つの抗原結合部位を含む。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（および好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、ポリペプチド鎖は、２つ以上の可変領域を含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１－（Ｘ１）ｎ－ＶＤ２－（Ｘ２）ｎ－Ｆｃを含み、ここで、ＶＤ１は第１の可変領域であり、ＶＤ２は第２の可変領域であり、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１とＸ２は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは、０または１である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド鎖は、それぞれ独立してＶＨ－ＣＨ１－フレキシブルリンカー－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ領域鎖、またはＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ領域鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の多価抗体は、少なくとも２つ（好ましくは４つ）の軽鎖可変領域ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書中の多価抗体は、約２～約８つの軽鎖可変領域ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の軽鎖可変領域ポリペプチドは、軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の軽鎖可変領域ポリペプチドは、ＣＬドメインをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、多価形態へと折り畳まれるように構築され、これにより、いくつかの実施形態では、結合親和性、特異性、および／または血中半減期が改善される。抗体の多価形態は、例えば、当技術分野で知られる技法により調製される。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、標的タンパク質に特異的なＳＭＩＰまたは結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。これら構築物は、抗体エフェクター機能を実行するのに必要な免疫グロブリンドメインに融合される抗原結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、重鎖可変領域、および／または、本明細書に開示されるエピトープに結合し、任意選択で免疫グロブリンＦｃ領域を有している軽鎖可変領域を有している一本鎖結合ポリペプチドを含む。このような分子は、任意選択でエフェクター機能を有するか、または免疫グロブリンＦｃ領域の存在により半減期が増加している単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
抗ＣＤ１６３抗体
本明細書の特定の実施形態では、ＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３結合抗体は、少なくとも１つの重鎖および少なくとも１つの軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３結合抗体は、重鎖可変ドメイン（Ｖ Ｈ）を含む少なくとも１つの重鎖、および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む少なくとも１つの軽鎖を含む。各ＶＨとＶＬは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＶＨおよびＶＬ、ならびにＣＤＲのアミノ酸配列は、抗体の抗原結合特異性および抗原結合強度を決定する。ＶＨおよびＶＬドメインは、表１に要約する。軽鎖および重鎖は、表２に要約する。ＣＤＲのアミノ酸配列は、表３に要約する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、全免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはジスルフィド結合Ｆｖから選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ＩｇＧまたはＩｇＭである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ヒト化される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ヒト、ヒト化、またはキメラである。
Figure 2022540806000002
本明細書の特定の実施形態では、配列番号７として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号７として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号７として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号８として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号７として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、配列番号８として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号７として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有しており、ＶＨは、配列番号８として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号７として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有しており、ＶＨは、配列番号８として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
Figure 2022540806000003
Figure 2022540806000004
本明細書の特定の実施形態では、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号１０として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１０として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１０として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号１１として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１１として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１１として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号１２として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１２として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１２として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号１３として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１３として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１３として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１０として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１０として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１０として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１１として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１１として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１１として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１２として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１２として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１２として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１３として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１３として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１３として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号１５として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１５として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１５として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号１６として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１６として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１６として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１５として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１５として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１５として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１６として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１６として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１６として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
Figure 2022540806000005
本明細書の特定の実施形態では、配列番号１として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む抗体が開示される。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に結合する抗体は、配列番号１として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に結合する抗体は、配列番号１として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号６として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む抗体が開示される。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に結合する抗体は、配列番号４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号６として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に結合する抗体は、配列番号４として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号６として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む。
本明細書の特定の実施形態では、配列番号１として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、配列番号３として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、配列番号４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号６として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む抗体が開示される。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に結合する抗体は、配列番号１として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、配列番号３として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、配列番号４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号６として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３に結合する抗体は、配列番号１として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、配列番号３として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、配列番号４として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号６として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む。
結合親和性と免疫反応性
抗体またはその抗原結合フラグメントの結合親和性および／または結合活性は、フレームワーク領域を修飾することにより改善される。フレームワーク領域の修飾のための任意の適切な方法は、当該技術分野で公知であり、本明細書で企図される。改質を行うための１つ以上の関連フレームワークアミノ酸位置の選択は、様々な基準に左右される。例えば、ドナーとアクセプター分子間のアミノ酸フレームワーク残基の相対的な差異が、変更を行うための関連フレームワークアミノ酸を選択する基準の１つである。この手法を使用して改質を行うための関連フレームワーク位置の選択には、残基決定における主観的バイアス、または残基によるＣＤＲ結合親和性の寄与における任意のバイアスを回避するという利点がある。
結合相互作用は、いくつかの実施形態における１つ以上のＣＤＲの１つ以上のアミノ酸残基との分子間接触として明らかにされる。抗原結合は、例えば、ＣＤＲまたはＣＤＲ対、あるいは場合により、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の最大６つのＣＤＲすべての相互作用を必要とする。
抗体または抗原結合フラグメントの結合親和性および結合活性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定、ＡｌｐｈａＬｉｓａアッセイ、または平衡解離定数（ＫＤ）のフローサイトメトリーにより測定可能である。
本明細書には、０．１ｎＭ～１０００ｎＭのＫＤをもってヒトＣＤ１６３に特異的に結合する抗体が、開示される。本明細書には、０．１～約５００ｎＭ、約０．１～約１００ｎＭ、約０．１～約５０ｎＭ、約０．１～約２０ｎＭ、約０．１～約１０ｎＭ、約０．１～約５ｎＭ、約０．１～約２ｎＭ、約０．１～約１ｎＭ、約０．１～約０．５ｎＭ、約０．５～約１０００ｎＭ、約０．５～約５００ｎＭ、約０．５～約１００ｎＭ、約０．５～約５０ｎＭ、約０．５～約２０ｎＭ、約０．５～約１０ｎＭ、約０．５～約５ｎＭ、約０．５～約２ｎＭ、約０．５～約１ｎＭ、約１～約１０００ｎＭ、約１～約５００ｎＭ、約１～約１００ｎＭ、約１～約５０ｎＭ、約１～約２０ｎＭ、約１～約１０ｎＭ、約１～約５ｎＭ、約１～約２ｎＭ、約２～約１０００ｎＭ、約２～約５００ｎＭ、約２～約１００ｎＭ、約２～約５０ｎＭ、約２～約２０ｎＭ、約２～約１０ｎＭ、約２～約５ｎＭ、約５～約１０００ｎＭ、約５～約５００ｎＭ、約５～約１００ｎＭ、約５～約５０ｎＭ、約５～約２０ｎＭ、約５～約１０ｎＭ、約１０～約１０００ｎＭ、約１０～約５００ｎＭ、約１０～約１００ｎＭ、約１０～約５０ｎＭ、約１０～約２０ｎＭ、約２０～約１０００ｎＭ、約２０～約５００ｎＭ、約２０～約１００ｎＭ、約２０～約５０ｎＭ、約５０～約１０００ｎＭ、約５０～約５００ｎＭ、約５０～約１００ｎＭ、約１００～約５００ｎＭ、約１００～約１０００ｎＭ、約５００～約１０００ｎＭのＫＤをもって、ヒトＣＤ１６３に特異的に結合する抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、抗体は、１．８ｎＭ、１２ｎＭ、４５ｎＭ、または８９ｎＭのＫＤをもって、ヒトＣＤ１６３に特異的に結合する。
本明細書に開示される抗体は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）上で高度に発現されるとともに、異なる起源の様々な腫瘍細胞上で検出される骨髄スカベンジャー受容体（ｍｙｅｌｏｉｄ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ＣＤ１６３に結合する。腫瘍組織でのＣＤ１６３の発現は、予後不良に関連する。本明細書に開示される抗体とＩＬ－１０極性化Ｍ２ｃマクロファージとの結合親和性は、フローサイトメトリーアッセイにより測定される。
本明細書には、０．１ｎＭ～１０００ｎＭのＫＤをもってＭ２ｃマクロファージに特異的に結合する抗体が、開示される。本明細書には、０．１～約５００ｎＭ、約０．１～約１００ｎＭ、約０．１～約５０ｎＭ、約０．１～約２０ｎＭ、約０．１～約１０ｎＭ、約０．１～約５ｎＭ、約０．１～約２ｎＭ、約０．１～約１ｎＭ、約０．１～約０．５ｎＭ、約０．５～約１０００ｎＭ、約０．５～約５００ｎＭ、約０．５～約１００ｎＭ、約０．５～約５０ｎＭ、約０．５～約２０ｎＭ、約０．５～約１０ｎＭ、約０．５～約５ｎＭ、約０．５～約２ｎＭ、約０．５～約１ｎＭ、約１～約１０００ｎＭ、約１～約５００ｎＭ、約１～約１００ｎＭ、約１～約５０ｎＭ、約１～約２０ｎＭ、約１～約１０ｎＭ、約１～約５ｎＭ、約１～約２ｎＭ、約２～約１０００ｎＭ、約２～約５００ｎＭ、約２～約１００ｎＭ、約２～約５０ｎＭ、約２～約２０ｎＭ、約２～約１０ｎＭ、約２～約５ｎＭ、約５～約１０００ｎＭ、約５～約５００ｎＭ、約５～約１００ｎＭ、約５～約５０ｎＭ、約５～約２０ｎＭ、約５～約１０ｎＭ、約１０～約１０００ｎＭ、約１０～約５００ｎＭ、約１０～約１００ｎＭ、約１０～約５０ｎＭ、約１０～約２０ｎＭ、約２０～約１０００ｎＭ、約２０～約５００ｎＭ、約２０～約１００ｎＭ、約２０～約５０ｎＭ、約５０～約１０００ｎＭ、約５０～約５００ｎＭ、約５０～約１００ｎＭ、約１００～約５００ｎＭ、約１００～約１０００ｎＭ、約５００～約１０００ｎＭのＫＤをもって、Ｍ２ｃマクロファージに特異的に結合する抗体が、開示される。いくつかの実施形態では、抗体は、７．７ｎＭのＫＤをもってＭ２ｃマクロファージに特異的に結合する。
結合エピトープ
抗体エピトープは、線形ペプチド配列（すなわち「連続」）であるか、非連続アミノ酸配列（すなわち「立体配座」または「不連続」）で構成されてもよい。いくつかの実施形態では、抗体は、１つ以上のアミノ酸配列を認識し、ゆえにエピトープは、１より多くの別個のアミノ酸配列を定義する。抗体により認識されるエピトープは、例えば、当業者に周知のペプチドマッピングおよび配列解析の技法により求められる。結合相互作用は、ＣＤＲの１つ以上のアミノ酸残基との分子間接触として明らかにされる。
ヒトＣＤ１６３タンパク質は、ヒトにおいてＣＤ１６３遺伝子によりコードされるタンパク質である。ヒトＣＤ１６３のアミノ酸配列は、ＭＳＫＬＲＭＶＬＬＥＤＳＧＳＡＤＦＲＲＨＦＶＮＬＳＰＦＴＩＴＶＶＬＬＬＳＡＣＦＶＴＳＳＬＧＧＴＤＫＥＬＲＬＶＤＧＥＮＫＣＳＧＲＶＥＶＫＶＱＥＥＷＧＴＶＣＮＮＧＷＳＭＥＡＶＳＶＩＣＮＱＬＧＣＰＴＡＩＫＡＰＧＷＡＮＳＳＡＧＳＧＲＩＷＭＤＨＶＳＣＲＧＮＥＳＡＬＷＤＣＫＨＤＧＷＧＫＨＳＮＣＴＨＱＱＤＡＧＶＴＣＳＤＧＳＮＬＥＭＲＬＴＲＧＧＮＭＣＳＧＲＩＥＩＫＦＱＧＲＷＧＴＶＣＤＤＮＦＮＩＤＨＡＳＶＩＣＲＱＬＥＣＧＳＡＶＳＦＳＧＳＳＮＦＧＥＧＳＧＰＩＷＦＤＤＬＩＣＮＧＮＥＳＡＬＷＮＣＫＨＱＧＷＧＫＨＮＣＤＨＡＥＤＡＧＶＩＣＳＫＧＡＤＬＳＬＲＬＶＤＧＶＴＥＣＳＧＲＬＥＶＲＦＱＧＥＷＧＴＩＣＤＤＧＷＤＳＹＤＡＡＶＡＣＫＱＬＧＣＰＴＡＶＴＡＩＧＲＶＮＡＳＫＧＦＧＨＩＷＬＤＳＶＳＣＱＧＨＥＰＡＩＷＱＣＫＨＨＥＷＧＫＨＹＣＮＨＮＥＤＡＧＶＴＣＳＤＧＳＤＬＥＬＲＬＲＧＧＧＳＲＣＡＧＴＶＥＶＥＩＱＲＬＬＧＫＶＣＤＲＧＷＧＬＫＥＡＤＶＶＣＲＱＬＧＣＧＳＡＬＫＴＳＹＱＶＹＳＫＩＱＡＴＮＴＷＬＦＬＳＳＣＮＧＮＥＴＳＬＷＤＣＫＮＷＱＷＧＧＬＴＣＤＨＹＥＥＡＫＩＴＣＳＡＨＲＥＰＲＬＶＧＧＤＩＰＣＳＧＲＶＥＶＫＨＧＤＴＷＧＳＩＣＤＳＤＦＳＬＥＡＡＳＶＬＣＲＥＬＱＣＧＴＶＶＳＩＬＧＧＡＨＦＧＥＧＮＧＱＩＷＡＥＥＦＱＣＥＧＨＥＳＨＬＳＬＣＰＶＡＰＲＰＥＧＴＣＳＨＳＲＤＶＧＶＶＣＳＲＹＴＥＩＲＬＶＮＧＫＴＰＣＥＧＲＶＥＬＫＴＬＧＡＷＧＳＬＣＮＳＨＷＤＩＥＤＡＨＶＬＣＱＱＬＫＣＧＶＡＬＳＴＰＧＧＡＲＦＧＫＧＮＧＱＩＷＲＨＭＦＨＣＴＧＴＥＱＨＭＧＤＣＰＶＴＡＬＧＡＳＬＣＰＳＥＱＶＡＳＶＩＣＳＧＮＱＳＱＴＬＳＳＣＮＳＳＳＬＧＰＴＲＰＴＩＰＥＥＳＡＶＡＣＩＥＳＧＱＬＲＬＶＮＧＧＧＲＣＡＧＲＶＥＩＹＨＥＧＳＷＧＴＩＣＤＤＳＷＤＬＳＤＡＨＶＶＣＲＱＬＧＣＧＥＡＩＮＡＴＧＳＡＨＦＧＥＧＴＧＰＩＷＬＤＥＭＫＣＮＧＫＥＳＲＩＷＱＣＨＳＨＧＷＧＱＱＮＣＲＨＫＥＤＡＧＶＩＣＳＥＦＭＳＬＲＬＴＳＥＡＳＲＥＡＣＡＧＲＬＥＶＦＹＮＧＡＷＧＴＶＧＫＳＳＭＳＥＴＴＶＧＶＶＣＲＱＬＧＣＡＤＫＧＫＩＮＰＡＳＬＤＫＡＭＳＩＰＭＷＶＤＮＶＱＣＰＫＧＰＤＴＬＷＱＣＰＳＳＰＷＥＫＲＬＡＳＰＳＥＥＴＷＩＴＣＤＮＫＩＲＬＱＥＧＰＴＳＣＳＧＲＶＥＩＷＨＧＧＳＷＧＴＶＣＤＤＳＷＤＬＤＤＡＱＶＶＣＱＱＬＧＣＧＰＡＬＫＡＦＫＥＡＥＦＧＱＧＴＧＰＩＷＬＮＥＶＫＣＫＧＮＥＳＳＬＷＤＣＰＡＲＲＷＧＨＳＥＣＧＨＫＥＤＡＡＶＮＣＴＤＩＳＶＱＫＴＰＱＫＡＴＴＧＲＳＳＲＱＳＳＦＩＡＶＧＩＬＧＶＶＬＬＡＩＦＶＡＬＦＦＬＴＫＫＲＲＱＲＱＲＬＡＶＳＳＲＧＥＮＬＶＨＱＩＱＹＲＥＭＮＳＣＬＮＡＤＤＬＤＬＭＮＳＳＧＧＨＳＥＰＨ（配列番号１７）である。
本明細書には、ヒトＣＤ１６３中でエピトープに特異的に結合する抗体が開示される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、非連続アミノ酸配列を含むエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、アミノ酸配列ＩＧＲＶＮＡＳＫＧＦＧＨＩＷＬＤＳＶＳＣＱＧＨＥＰＡＩ（配列番号１８）を含むヒトＣＤ１６３のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、アミノ酸配列ＶＶＣＲＱＬＧＣＧＳＡ（配列番号１９）を含むヒトＣＤ１６３のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、アミノ酸配列ＷＤＣＫＮＷＱＷＧＧＬＴＣＤ（配列番号２０）を含むヒトＣＤ１６３のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８～２０のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ１６３のエピトープに結合する。
また本明細書には、本明細書に開示されるエピトープに特異的に結合する追加の抗体も開示される。本明細書に開示されるエピトープに特異的に結合するこれら追加の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、当技術分野で知られる技法を用いて特定可能である。例えば、エピトープ特異的抗体をデザインするための計算手法が、使用される。Ｎｉｍｒｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｅｐｉｔｏｐｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２５，２１２１－２１３１，Ｎｏｖ．２０，２０１８（参照により本明細書に組み込まれる）。先ず非標準アミノ酸（ｎｃＡＡｓ）ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＢｐａ）およびｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡｚＦ）を標的エピトープに組み込み、次いでＵＶ照射後に組み込んだｎｃＡＡエピトープと交差反応する抗体を選択するといった、抗原に結合する抗体のライブラリの特異的なエピトープに結合する抗体を特定する別の手法も、使用可能である。架橋は、抗体とエピトープとの距離が十分に近いときにのみ生じるため、この方法は、標的エピトープに特異的に結合する抗体を効率的に選択することができる。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｐｉｔｏｐｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．６，ｎｏ．１４，ｅａａｚ７８２５，０１ Ａｐｒ ２０２０（参照により本明細書に組み込まれる）。
抗体の修飾
抗体またはその抗原結合フラグメントは、場合により、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加などの様々な目的のために当技術分野で知られる技法を使用して修飾される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾（ＰＥＧ化）は、循環時間の改善、溶解性の改善、タンパク質分解に対する忍容性の改善、抗原性および免疫原性の低下、バイオアベイラビリティの改善、毒性の低下、安定性の改善、ならびに製剤化の容易化のうち、１つ以上をもたらす。
場合により、抗原結合フラグメントがＦｃ部分を含有しない場合、Ｆｃ部分は、このフラグメントに（組換えにより）添加されて、例えば対象へ投与したときに血中循環における抗原結合フラグメントの半減期を増加させる。適切なＦｃ領域の選択、およびかかるフラグメントを組み込む方法は、当該技術分野で知られている。その循環半減期を増加させるが、その生物学的活性を失わないように目的のポリペプチドへとＩｇＧのＦｃ領域を組み込むことは、例えば、当該技術分野における従来技法を用いて達成される。いくつかの実施形態では、抗体のＦｃ部分は、被験体に投与されると、血中循環における抗原結合フラグメントの半減期を増加させるようにさらに修飾される。修飾は、例えば当該技術分野における従来手段を用いて判定される。
加えて、いくつかの実施形態では、抗体およびその抗原結合フラグメントは、それらの複合体であるＮ－グリコシド結合糖鎖上にフコースを含有しないように産生または発現される。複合体Ｎ－グリコシド結合糖鎖からフコースを取り除くことは、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）、補体依存性傷害活性（ＣＤＣ）を含むがこれらに限定されない、抗体および抗原結合フラグメントのエフェクター機能を増大させることが知られている。同様に、エピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、場合により、そのＣ末端にて、抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、およびＩｇＭ、ならびにアイソタイプサブクラス、具体的にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のいずれかに由来する免疫グロブリン重鎖のすべてまたは一部に付けられる。
加えて、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントは、いくつかの実施形態においてそれらが血液脳関門を通過可能となるようにも修飾される。このような本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントの修飾により、多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）などの脳疾患の処置が可能となる。抗体または抗原結合フラグメントなどのタンパク質が血液脳関門を通過するのを可能にするための例示的な修飾は、米国特許出願公開第２００７／００８２３８０号に記載されている。
免疫グロブリンのグリコシル化は、それらのエフェクター機能、構造安定性、および抗体産生細胞からの分泌速度に対して顕著な効果を有することが認められている。これら特性を担う炭水化物基は、一般的に抗体の定常（Ｃ）領域に付着される。例えば、ＣＨドメイン中のアスパラギン２９７におけるＩｇＧのグリコシル化は、補体依存性細胞溶解の古典的経路を活性化するためにＩｇＧの全能力に対して必要とされる（Ｔａｏ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４３：２５９５（１９８９））。ＣＨ３ドメイン中のアスパラギン４０２におけるＩｇＭのグリコシル化は、抗体の適切なアセンブリおよび細胞溶解活性に対して必要とされる（Ｍｕｒａｏｋａ ａｎｄ Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４２：６９５（１９８９））。ＩｇＡ抗体のＣＨ１およびＣＨ３ドメイン中の１６２位と４１９位としてのグリコシル化部位の除去は、細胞内分解および分泌の少なくとも９０％の分泌阻害を生じさせた（Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｗａｌｌ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８：４１９７（１９８８））。加えて、いくつかの実施形態では、抗体およびその抗原結合フラグメントは、それらの複合体であるＮ－グリコシド結合糖鎖上にフコースを含有しないように産生または発現される。複合体Ｎ－グリコシド結合糖鎖からフコースを取り除くことは、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）、補体依存性傷害活性（ＣＤＣ）を含むがこれらに限定されない、抗体および抗原結合フラグメントのエフェクター機能を増大させることが知られている。これら「脱フコシル化」抗体および抗原結合フラグメントは、いくつかの実施形態では、複合体Ｎ－グリコシド結合糖鎖にフコースを含めるのに必要な酵素および生物化学経路をこれ以上含有しないように遺伝的に操作されている遺伝子導入動物、遺伝子導入植物、または細胞株（フコシルトランスフェラーゼノックアウト動物、植物、または細胞としても知られる）を含む、当該技術分野で知られる分子クローニング技法を利用する様々なシステムにより産生される。フコシルトランスフェラーゼノックアウト細胞となるように操作される細胞の非限定的な例には、ＣＨＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ０細胞、およびＹＢ２／０細胞が含まれる。
可変（Ｖ）領域での免疫グロブリンのグリコシル化も、観察されている。ＳｏｘおよびＨｏｄは、ヒト抗体の約２０％がＶ領域でグリコシル化されることを報告した（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６６：９７５（１９７０））。Ｖドメインのグリコシル化は、Ｖ領域配列におけるＮ結合グリコシル化シグナルＡｓｎ－Ｘａａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒの偶発的発生から生じると考えられており、当該技術分野では免疫グロブリン機能にて役割を果たすと認識されていない。
可変ドメインフレームワーク残基でのグリコシル化は、場合により、抗体と抗原との結合相互作用を改質する。本開示は、ヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワークまたはＣＤＲにおいて数が制限されているアミノ酸が、抗体の親和性を増加させるべく突然変異（例えば、残基の置換、欠失、または付加による）されるように選択される基準を含む。
いくつかの実施形態では、システイン残基は、除去されるか、抗体またはＦｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域に導入され、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を排除するか増加させる。このような方法を用いて生成されるホモ二量体特異的結合剤または抗体は、いくつかの実施形態では、内在化能の改善、ならびに／または補体媒介性細胞死滅および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増加を呈する。
ＣＤＲ内の配列は、抗体をＭＨＣクラスＩＩに結合させ、場合により望ましくないヘルパーＴ細胞応答を誘発することが認められている。いくつかの実施形態では、保存的置換により、抗体は結合活性を保持することが可能となるが、望ましくないＴ細胞応答の誘発能が低下してしまう。一実施形態では、重鎖または軽鎖のＮ末端２０アミノ酸の１つ以上が、除去される。
いくつかの実施形態では、抗体分子は、ＡＤＣＣ活性の改善を呈するフコシル化が存在しないか減少した抗体分子を含む、エフェクター活性の改質をもたらす炭水化物構造の改質により産生される。これを達成するための様々な方法が、当該技術分野で知られている。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、ＦｃγＲＩＩＩ受容体への抗体分子の結合により媒介され、このことは、ＣＨ２ドメインのＡｓｎ－２９７におけるＮ結合グリコシル化の炭水化物構造に左右されることが認められている。非フコシル化抗体は、増加した親和性をもってこの受容体に結合し、天然フコシル化抗体よりも効率的にＦｃγＲＩＩＩ媒介性エフェクター機能を誘発する。一部の宿主細胞株、例えばＬｅｃ１３またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、フコシル化レベルが低い抗体を自然に産生する。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞中で抗体を組換えにより産生することによる二等分糖の濃度の増加も、ＡＤＣＣ活性を増加させることが認められている。いくつかの実施形態では、２つのフコース残基のうち一方のみが存在しないことは、ＡＤＣＣ活性の増加に十分である。
抗体の共有結合修飾も、本明細書に含まれる。いくつかの実施形態では、共有結合修飾は、適用可能な場合、化学合成により、あるいは抗体の酵素的または化学的切断により作製される。いくつかの実施形態では、他の種類の共有結合修飾は、標的化アミノ酸残基を、選択された側鎖あるいはＮ末端またはＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化薬剤と反応させることにより、導入される。
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα－ハロアセテート（および対応するアミン）と反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α－ブロモ－β－（５－イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ－アルキルマレイミド、３－ニトロ－２－ピリジルジスルフィド、メチル２－ピリジルジスルフィド、ｐ－クロロメルクリベンゾエート、２－クロロメルクリ－４－ニトロフェノール、またはクロロ－７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾールとの反応により、誘導体化される。
いくつかの実施形態では、ヒスチジル残基はｐＨ５．５～７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応により誘導体化される。この薬剤が、ヒスチジル側鎖に対し比較的特異的であるためである。いくつかの実施形態では、パラ－ブロモフェナシルブロミドも有用である。いくつかの実施形態では、反応はｐＨ６．０で０．１Ｍカコジル酸ナトリウムにおいて行われる。
いくつかの実施形態では、リシニル残基およびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応される。これら薬剤による誘導体化には、リシニル残基の電荷を逆転させる効果がある。α－アミノ含有残基を誘導体化するのに適切な他の試薬としては、メチルピコリニミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、０－メチルイソ尿素、２，４－ペンタンジオン、およびグリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応などの、イミドエステルが挙げられる。
いくつかの実施形態では、アルギニル残基が、フェニルグリオキサール、２，３－ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンなどの１つ以上の従来の試薬との反応により、修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基のｐＫａが高いため、反応をアルカリ性条件下で行う必要がある。さらに、これら試薬は、いくつかの実施形態では、リジンの基、ならびにアルギニンε－アミノ基と反応する。
いくつかの実施形態では、チロシル残基の特異的修飾は、特に芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によりスペクトラルラベルをチロシル残基に導入することを目的に、行われる。最も一般的には、Ｎ－アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンは、いくつかの実施形態では、それぞれＯ－アセチルチロシル種および３－ニトロ誘導体を形成するために使用される。チロシル残基は、放射免疫測定に使用するための標識タンパク質を調製するために、１２５Ｉまたは１３１Ｉを使用してヨウ素化される。
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－Ｒ’）との反応により特異的に修飾され、ＲおよびＲ’は、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル－４－エチル）カルボジイミドまたは１－エチル－３－（４－アゾニア－４，４－ジメチルペンチル）カルボジイミドなどの様々なアルキル基である。さらに、アスパルチル残基とグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル残基とグルタミニル残基に変換される。
いくつかの実施形態では、グルタミニル残基とアルパラギニル残基は、それぞれ対応するグルタミル残基とアルパルチル残基へと脱アミド化される。これらの残基は、中性または塩基性条件下で脱アミド化される。
他の修飾には、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα－アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
別の種類の共有結合修飾は、グリコシドを特異的結合剤または抗体に化学的または酵素的に結合させることを含む。これらの手順は、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞におけるポリペプチドまたは抗体の産生を必要としない。使用される結合様式に応じて、いくつかの実施形態では、糖は、（ａ）アルギニンとヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのものなどの芳香族残基、あるいは（ｆ）グルタミンのアミド基に付着される。
ポリペプチドまたは抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、いくつかの実施形態では、化学的または酵素的に達成される。化学的な脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物への抗体の暴露を含む。この処置は、連結糖（ｌｉｎｋｉｎｇ ｓｕｇａｒ）（Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン）を除く大半またはすべての糖の切断をもたらしつつ、抗体を無傷で残す。いくつかの実施形態では、抗体上での炭水化物部分の酵素的切断は、様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成される。
別の種類の共有結合修飾は、様々な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレン、またはデキストランなどのポリサッカライドポリマーのうち１つに抗体を結合させることを含む。このような方法は、当該技術分野で公知である。
予め判定したポリペプチド抗原への結合親和性は、一般的に、典型的には１つ以上のＣＤＲに隣接する領域および／または１つ以上のフレームワーク領域において、１つ以上の突然変異をＶ領域フレームワークに導入することにより、調節される。典型的に、このような突然変異は、グリコシル化部位配列を破壊または作製するが、ポリペプチドの疎水性構造特性に実質的に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換の導入を伴う。典型的に、プロリン残基を導入する突然変異は、避けられる。
エフェクター機能
抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方調節、およびＢ細胞活性化が含まれる。一般的に、Ｆｃ媒介性機能は、その機能が影響を受ける細胞により発現される特殊化された受容体分子、「Ｆｃ受容体」、または「ＦｃＲ」による抗体のＦｃ部分の結合を含む。
ＩｇＧは、いくつかの実施形態では、免疫グロブリン分子のすべての機能を実行するので、最も汎用性の高い免疫グロブリンと考えられている。ＩｇＧは、血清中の主要なＩｇであり、胎盤を渡る唯一のＩｇクラスである。ＩｇＧは補体も固定するが、ＩｇＧ４サブクラスは補体を固定しない。マクロファージ、単球、多形核白血球（ＰＭＮ）、および一部のリンパ球は、ＩｇＧのＦｃ領域に対する受容体を有している。すべてのサブクラスが同じように結合するわけではない。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、Ｆｃ受容体に結合しない。ＰＭＮ、単球、およびマクロファージ上でのＦｃ受容体への結合の結果、細胞は、場合により抗原をより良好に内在化する。ＩｇＧは、食作用を増強するオプソニンである。他の種類の細胞上でのＦｃ受容体へのＩｇＧの結合は、他の機能の活性化をもたらす。
ある実施形態では、ＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ（「γ」）受容体）に結合するとともに、ＦｃγＩ、ＦｃγＩＩ、およびＦｃγＩＩＩサブクラスの受容体、ならびにこれら受容体の対立遺伝子変異体および代替的にスプライシングされた形態を含むＦｃＲである。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有している。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン内に免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を包含している。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン内に免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を包含している。
「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」または「ＡＤＣＣ」とは、特定の細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌Ｉｇにより、これら細胞毒性エフェクター細胞が、抗原を持つ標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させるのを可能にする細胞毒性の形態を表す。抗体は細胞傷害性細胞を「武装」させ、かかる死滅に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方で単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイが実施される。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。
代替的に、または付加的に、いくつかの実施形態では、目的分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば動物モデルを対象に評価される。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、Ｍ２様マクロファージの表面膜タンパク質に結合し、Ｍ２様マクロファージにより内在化される。この内在化プロセスは、これらの細胞を死滅またはその増殖を阻害することなく、細胞の機能的免疫抑制特徴に対して観察された変化、すなわち、Ｍ２状態から微妙に活性化した状態への細胞の分化に関与していると考えられる。いくつかの実施形態では、内在化に際して抗体は、免疫抑制性可溶性因子の発現を低下させ、一方で、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性リンパ球を含むＴ細胞の活性または増殖を刺激または促進する可用性因子の発現を増加させる。
ある治療用途では、内在化プロセスは、ＣＤ１６３タンパク質を発現する標的細胞を死滅させるかその活性または増殖を低下させる目的のために利用される。内在化される抗体分子の数は、細胞、特に癌細胞を死滅させるか、またはその増殖を阻害するのに十分であるか、または適切である。抗体または抗体コンジュゲートの効力に応じて、いくつかの例では、細胞への単一抗体分子の取込みは、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分なものである。例えば、特定の毒素は、抗体にコンジュゲートされる毒素の１分子の内在化が、標的化細胞を死滅させるのに十分であるような死滅において、非常に強力である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体または抗原結合フラグメントは、治療部分、画像化もしくは検出可能部分、または親和性タグにコンジュゲートあるいは結合される。ポリペプチドをコンジュゲートまたは結合する方法は、当該技術分野で周知である。化合物とラベルとの会合（結合）には、共有結合および非共有結合相互作用、化学結合、ならびに組換え技法を含むがこれらに限定されない当技術分野で知られるあらゆる手段が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、親和性タグ（例えば、精製タグ）にコンジュゲートされるか、これを用いて組換えにより操作される。例えばポリヒスチジン（例えば、Ｈｉｓ６）タグなどの親和性タグが、当技術分野における従来のタグである。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、検出可能部分をさらに含む。検出は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで達成される。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントを用いてマクロファージにより発現されるｈｕＣＤ１６３タンパク質の検出および／または判定のためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（定量化、資格化（ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）など）は、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、およびウェスタンブロットを含むがこれらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗体の抗原の検出、診断、またはモニタリングは、例えば、標準ＥＬＩＳＡアッセイにおいて対象から試料（例えば、血液試料）を取得し、この試料を試験することにより、行われる。
また本明細書の特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体と担体とを含む組成物も開示される。
医薬組成物
本明細書の特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物が開示される。
このような組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの解析に、または医薬組成物の場合、開示された抗体で対象を処置するためにｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの対象への投与に有用である。
いくつかの実施形態では、賦形剤は、担体、緩衝液、安定化剤、または当業者に知られる他の適切な材料である。このような材料は、非毒性でなければならず、活性成分の有効性を妨げるものであってはならない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に左右される。
本明細書に記載の方法により特定される、抗体または抗原結合フラグメントを含む医薬製剤は、いくつかの実施形態では、保管のために、所望の純度を有するタンパク質を任意選択の生理学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤と混合することにより（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）を参照）、凍結製剤または水溶液の形態で調製される。許容可能な担体、または安定剤は、利用される用量と濃度でレシピエントに対して無毒であるとともに、リン酸塩、クエン酸塩、その他の有機酸などの緩衝液、アスコルビン酸やメチオニンなどの酸化防止剤、防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール、メチルやプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、およびｍ－クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）、ならびに／あるいはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むものである。ある実施形態では、医薬組成物は、５～２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０～１００ｍｇ／ｍＬの濃度で抗体を含む。
許容可能な担体は、投与される対象に対して生理学的に許容可能であり、これが投与される化合物の治療特性を保持する。許容可能な担体およびその製剤は、概して、例えば、上述のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。例示的な担体の１つは、生理食塩水である。「薬学的に許容可能な担体」という語句は、本明細書で使用するとき、１つの器官または身体部分の投与部位から別の器官または身体部分への対象化合物の搬送または輸送、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系に必要な、液体または固形充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤、封入材料などの薬学的に許容可能な材料、組成物、または溶媒を意味する。各担体は、他の製剤の成分と適合可能であり、それが投与される対象に有害ではないという意味で許容可能である。許容可能な担体は、対象化合物の特異的活性を改質するものでもない。
別の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、組成物中の化合物の安定性を改善するため、および／または組成物の放出速度を制御するために、許容可能な添加物をさらに含む。許容可能な添加物は、対象化合物の特異的活性を改質するものではない。例示的な許容可能な添加物には、マンニトール、ソルビトール、グルコース、キシリトール、トレハロース、ソルボース、スクロース、ガラクトース、デキストラン、デキストロース、フルクトース、それらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、許容可能な添加物は、デキストロースなどの許容可能な担体および／または賦形剤と組み合わされる。代替的に、例示的な許容可能な添加物には、ペプチドの安定性を増加させ、溶液のゲル化を低下させるためのポリソルベート２０やポリソルベート８０などの界面活性剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、溶液の０．０１％～５％の量で組成物に添加される。このような許容可能な添加物の添加は、保管中の組成物の安定性と半減期を増大させる。
一実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、リン酸塩、酢酸塩、またはＴＲＩＳなどの等張性緩衝液を、ポリオール、ソルビトール、スクロース、または塩化ナトリウムなどの等張化および安定化を行う等張化剤と組み合わせて含有している。いくつかの実施形態では、等張化剤は、組成物中に約５％の量で存在する。
別の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、凝集を防ぎ、０．０１～０．０２％ｗｔ／ｖｏｌで安定化するために界面活性剤を含む。
別の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物のｐＨは、４．５～６．５または４．５～５．５の範囲である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物はまた、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つ化合物など、処置される適応症に対して必要に応じて１より多くの活性化合物も含有している。例えば、処置方法は、免疫抑制剤をさらに提供する。このような分子は、意図した目的のために有効な量で組み合わせて適切に存在する。
いくつかの実施形態では、活性成分は、例えばコアセルベーション技法または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれコロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中にあるヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセルおよびポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封じ込められる。このような技法は、上述のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに開示されている。
抗体の懸濁液および結晶形態も、本明細書で企図される。懸濁液および結晶形態を作製する方法は、当業者に知られている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、無菌である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、従来の周知の滅菌技法により滅菌される。例えば、滅菌は、滅菌濾過膜を介した濾過により容易に達成される。いくつかの実施形態では、結果生じる溶液は、使用のために包装されるか、無菌条件下で濾過されて凍結乾燥される。凍結乾燥された調製物は、滅菌溶液と組み合わせてから投与される。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドが液体組成物中で比較的不安定であるときなど、長期保存のためにポリペプチドを安定化させる凍結乾燥が利用される。
いくつかの実施形態では、例えば、ポリオール（マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールを含む）、糖（グルコースおよびショ糖を含む）、ならびにアミノ酸（アラニン、グリシン、およびグルタミン酸を含む）などの一部の賦形剤は、凍結乾燥製品用の安定剤として作用する。いくつかの実施形態では、ポリオールおよび糖も、ポリペプチドを凍結および乾燥による損傷から保護し、乾燥状態で保管中の安定性を増強させるために使用される。いくつかの実施形態では、糖は、凍結乾燥プロセスおよび保管中の両方において有効である。単糖類、二糖類、およびＰＶＰなどのポリマーを含む他のクラスの分子も、凍結乾燥製品の安定剤として報告されている。
いくつかの実施形態では、注射において、本明細書に開示される医薬組成物は、上述のような適切な溶液との再構成に適した粉末である。これらの例として、凍結乾燥、回転乾燥、または噴霧乾燥粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物、あるいは微粒子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。注射において、組成物は、安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調整剤、およびこれらの組合せを任意選択で含有している。
いくつかの実施形態では、徐放性調製物が調製される。徐放性調製物の適切な例として、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、このマトリクスは、成形品、例えばフィルムやマイクロカプセルの形態にある。徐放性マトリクスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（例えば、米国特許第３，７７３，９１９号を参照）、Ｌ－グルタミン酸とｙエチル－Ｌ－グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（商標）などの分解性乳酸－グリコール酸コポリマー（乳酸－グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドで構成される注射用ミクロスフェア）、ならびにポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン－酢酸ビニルや乳酸－グリコール酸などのポリマーは、１００日以上にわたり分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、それよりも短い期間にわたりタンパク質を放出する。いくつかの実施形態では、封入された抗体は体内に長期間残存するが、３７℃で水分に曝露させると変性または凝集し、生物学的活性の損失、および場合により免疫原性の変化をもたらす。安定化のために考案された合理的な方策は、場合により、関与する機構に左右される。例えば、凝集機構がチオ－ジスルフィド交換による分子間Ｓ－Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化は、場合により、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を調節し、適切な添加物を使用し、特定のポリマーマトリクス組成物を開発することにより達成される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、本明細書に記載されるような短時間作用型、即時放出型、長時間作用型、または徐放型となるようにデザインされる。一実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、制御放出または徐放のために製剤化される。
医薬組成物は、例えば、皮下、硝子体内、皮内、静脈内、動脈内、腹腔内、脳脊髄内、または筋肉内注射を含むがこれらに限定されない注射により、投与される。それぞれの種類の注射用組成物の製剤化に使用される賦形剤および担体は、本明細書で企図される。以下の説明は、単なる例であり、組成物の範囲を制限することを意味するものではない。注射用組成物には、水溶液（水溶性の場合）または分散液、ならびに滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられるが、これらに限定されるものではない。静脈内投与において、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する溶剤または分散媒である。流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散の場合に必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持される。抗菌剤および抗真菌剤として、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールが挙げられる。いくつかの実施形態では、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトール、および塩化ナトリウムなどのポリアルコール類が、組成物中に含まれる。いくつかの実施形態では、結果生じる溶液は、そのまま使用するために包装されるか、凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、凍結乾燥した調製物は、後に滅菌溶液と組み合わせてから投与される。静脈内注射、または苦痛を伴う部位での注射において、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性、および安定性を有する非経口投与に許容可能な水溶液の形態にある。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンガー注射、および乳酸リンガー注射などの等張ビヒクルを使用して、適切な溶液を調製することができる。いくつかの実施形態では、必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤、および／または他の添加剤が含まれる。いくつかの実施形態では、滅菌注射溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性成分を、上記で列挙した成分の１つまたは組合せとともに組み込み、続いて必要に応じて滅菌濾過を行うことにより、調製される。一般的に、分散液は、塩基性分散媒および上記で列挙したものから必要な他の成分を含有する滅菌溶媒へと活性成分を組み込むことにより、調製される。注射用滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、先に滅菌濾過した溶液の所望の追加成分を加えた活性成分の粉末が得られる。
いくつかの実施形態では、組成物は従来、例えば単位用量の注射などにより静脈投与される。注射において、いくつかの実施形態では、活性成分は、実質的に発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性、および安定性を有する非経口投与に許容可能な水溶液の形態にある。いくつかの実施形態では、例えば、塩化ナトリウム注射、リンガー注射、乳酸リンガー注射などの等張溶媒を使用して、適切な溶液が調製される。いくつかの実施形態では、必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤、および／または他の添加剤が含まれる。加えて、組成物は、いくつかの実施形態ではエアロゾル化を介して投与される（Ｌａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３４：４９－５５（２００４））。
非経口投与において、抗体は、薬学的に許容可能な非経口溶媒とともに単位用量注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で製剤化される。かかる溶媒の例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンである。固定油やオレイン酸エチルなどの非水性溶媒も、使用される。リポソームは担体として使用される。溶媒は、等張性および化学的安定性を高める物質、例えば緩衝液および防腐剤などの添加剤を少量含有する。抗体は、一般的に約１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの濃度でこのような溶媒中で製剤化される。
一実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、例えば保管中の貯蔵寿命を増加させるために凍結乾燥される。組成物が、本明細書に提供される薬剤または方法での使用に考慮されるとき、いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト対象に投与したときに炎症反応または危険なアレルギー反応を引き起こさないように発熱物質を実質的に含んでいない。発熱物質に関する組成物の試験、および発熱物質を実質的に含まない組成物の調製は、当業者に対し十分に理解されており、いくつかの実施形態では、市販のキットを用いて達成される。
いくつかの実施形態では、許容可能な担体は、吸収またはクリアランスを安定化、増加、または遅延させる化合物を含有する。このような化合物には、例えば、グルコース、スクロース、デキストランスなどの炭水化物、低分子量タンパク質、ペプチドのクリアランスまたは加水分解を低下させる組成物、あるいは賦形剤または他の安定化剤および／もしくは緩衝液が含まれる。吸収を遅延させる薬剤として、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、リポソーム担体を含む医薬組成物の吸収を安定化、増加、または減少させるために、清浄剤も使用される。いくつかの実施形態では、消化から保護するために、化合物は、酸性および酵素加水分解に対する耐性を付与するべく組成物と複合体化され、またはいくつかの実施形態では、化合物は、リポソームなどの適切な耐性を呈する担体中で複合体化される。化合物を消化から保護する手段は、当該技術分野で知られている。
いくつかの実施形態では、組成物は、投薬製剤と適合可能な形で、および治療上有効な量で投与される。投与される量は、処置される対象、活性成分を利用する対象の免疫系の能力、および所望の結合能の程度に左右される。投与に必要な活性成分の正確な量は、医療従事者の判断に左右され、各個人に特有である。初期投与およびブースターショットに適切なレジメンも変動可能なものであるが、初期投与、続いて後の注射または他の投与による１時間以上の間隔での反復投与を特色とする。代替的に、血液中の濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入が、企図される。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の疾病、疾患、または障害を処置するための薬剤を作製するための、本明細書に記載の組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、処置を必要とする対象の物理的特徴に基づき製剤化され、疾病、疾患、または障害の段階に基づき単一または複数の製剤中で製剤化される。いくつかの実施形態では、薬剤は、病院および診療所への配布のために適切なラベルを伴う適切なパッケージに包装され、ラベルは、本明細書に記載の疾患を抱える対象の処置の指示に関するものである。いくつかの実施形態では、薬剤は、単一または複数の単位として包装される。組成物の用量および投与に関する指示は、いくつかの実施形態では、後述のようなパッケージとともに含まれる。本開示はさらに、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと、および薬学的に許容可能な担体とを含む薬剤を対象とする。
いくつかの実施形態では、組成物（本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメント）は、処置対象である疾病に依存して、単独で、あるいは第２の組成物と組み合わせて同時または連続的に投与される。一実施形態では、第２の治療的処置は、抗癌療法または抗癌治療薬である。２つ以上の組成物が投与されるとき、組成物は、例えば組み合わせて（連続的または同時に）投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、単回投与または複数回投与で投与される。
いくつかの実施形態では、ヒト対象への投与のために製剤化されるとき、組成物は、発熱物質を含まないように製剤化される。発熱物質に関する組成物の試験、および発熱物質を含まない医薬組成物の調製は、当業者に対して十分に理解されている。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、注射を含むがこれに限定されない、対象に対する任意の適切な投与経路のために製剤化される。注射には、例えば、皮下注射、腹膜注射、静脈内注射、筋肉内注射、または脳脊髄液（ＣＳＦ）への脊髄注射が含まれる。いくつかの実施形態では、投与は、１、２、３、４、５、６、７、またはそれより多くの注射部位で行われる。一実施形態では、投与は、６つの注射部位を介して行われる。
ｉｎ ｖｉｖｏでの適用において、接触は、例えば、任意の適切な手段による対象への（本明細書に記載されるような）組成物の投与を介して行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、脳脊髄内投与、肺内投与、および鼻腔内投与を含む全身投与または局所投与といった適切な手段、および必要な場合は、局所処置、病巣内投与により投与される。非経口経路には、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、硬膜外投与、筋肉内投与、および髄腔内投与が含まれる。いくつかの実施形態では、このような投与は、ボーラス注入、連続注入、またはパルス注入として行われる。いくつかの実施形態では、組成物は、部分的に投与が短期間または慢性であるかに依存して、注射により投与される。局所投与、特に経皮投与、経粘膜投与、直腸投与、経口投与、または局所投与、例えば所望の部位の近くに配したカテーテルを介した投与を含む、他の投与方法が、企図される。
処置および使用の方法
本明細書の特定の実施形態では、必要とする個体の癌を処置する方法が開示され、該方法は、本明細書に開示される抗体を個体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、ヒト対象の癌を処置するための薬剤の製造における、本明細書に開示されるような抗体の使用を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト腫瘍関連マクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合し、マクロファージによるＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５のうち少なくとも１つの発現を低下させる。
本明細書の特定の実施形態では、必要とする対象の免疫活性を調節する方法が開示され、該方法は、本明細書に記載の抗体を前記対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト腫瘍関連マクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合し、マクロファージによるＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５のうち少なくとも１つの発現を低下させる。
本明細書の特定の実施形態では、Ｍ２マクロファージのレベルが病理学的または不適切に上昇した（例えば、対象における免疫媒介性腫瘍細胞死滅を促進するのに有用なレベルと比較して不適切に上昇した）対象を処置する方法が開示され、該方法は、本明細書に記載の抗体を前記対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト腫瘍関連マクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合し、マクロファージによるＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５のうち少なくとも１つの発現を低下させる。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号６として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号６として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号４として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号６として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、配列番号３として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、配列番号４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号６として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む抗体が開示される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、配列番号３として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、配列番号４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号６として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、配列番号３として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、配列番号４として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号６として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３のうち、少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号７として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号７として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、配列番号８として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号７として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有しており、ＶＨは、配列番号８として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号７として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有しており、ＶＨは、配列番号８として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１０として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１０として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１０として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１１として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１１として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１１として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１２として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１２として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１２として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１３として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１３として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１３として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１０として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１０として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１０として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１１として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１１として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１１として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１２として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１２として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１２として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１３として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１３として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号９として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１３として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１５として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１５として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１５として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１６として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１６として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、重鎖は、配列番号１６として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
またいくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１５として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１５として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１５として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１６として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１６として記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有している。いくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号１４として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有しており、重鎖は、配列番号１６として記載のアミノ酸配列に対して１００％同一のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態では、本開示は、癌のヒト対象における腫瘍関連マクロファージによる免疫抑制を低下させる薬剤の製造における、本明細書に記載の抗体の使用を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、癌のヒト対象におけるＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅を促進する薬剤の製造における、本明細書に記載の抗体の使用を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、癌のヒト対象を処置する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の抗体を治療上有効量で対象に投与する工程を含み、それにより、対象の腫瘍関連マクロファージによる免疫抑制が低下される。
いくつかの実施形態では、本開示は、癌のヒト対象を処置する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の抗体を治療上有効量で対象に投与する工程を含み、それにより、対象のＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅が増加される。
本明細書の特定の実施形態では、癌患者における免疫抑制を低下させるために腫瘍関連マクロファージを機能的に再配向する方法が開示され、該方法は、腫瘍微小環境中でのＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞活性または増殖を改善するのに有効な本明細書に記載の抗体を含む医薬組成物を一定量で患者に投与する工程を含む。
本明細書の特定の実施形態では、必要とするヒト対象におけるリンパ球媒介性腫瘍細胞死滅を促進する方法が開示され、該方法は、本明細書に記載の抗体を含む医薬組成物を有効量で対象に投与する工程を含む。
本明細書の特定の実施形態では、腫瘍微小環境中での腫瘍関連マクロファージの活性を調節する方法が開示され、該方法は、腫瘍関連マクロファージを本明細書に開示される抗体と接触させる工程を含み、前記方法は、以下の効果：
（ａ）ヒトマクロファージによる、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーの発現の低下、
（ｂ）ヒトマクロファージによる抗体の内在化、
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、
（ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖、ならびに
（ｅ）腫瘍微小環境中での腫瘍細胞死滅の促進
のうち少なくとも１つをもたらす。
本明細書の特定の実施形態では、腫瘍微小環境中での腫瘍関連マクロファージの活性を調節する方法が開示され、該方法は、腫瘍関連マクロファージを本明細書に開示される抗体と接触させる工程を含み、前記方法は、以下の効果：
（ａ）ヒトマクロファージによる、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーの発現の低下、
（ｂ）ヒトマクロファージによる抗体の内在化、
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、
（ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖、ならびに
（ｅ）腫瘍微小環境中での腫瘍細胞死滅の促進
のうち少なくとも２つをもたらす。
本明細書の特定の実施形態では、腫瘍微小環境中での腫瘍関連マクロファージの活性を調節する方法が開示され、該方法は、腫瘍関連マクロファージを本明細書に開示される抗体と接触させる工程を含み、前記方法は、以下の効果：
（ａ）ヒトマクロファージによる、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーの発現の低下、
（ｂ）ヒトマクロファージによる抗体の内在化、
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、
（ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖、ならびに
（ｅ）腫瘍微小環境中での腫瘍細胞死滅の促進
のうち少なくとも３つをもたらす。
本明細書の特定の実施形態では、腫瘍微小環境中での腫瘍関連マクロファージの活性を調節する方法が開示され、該方法は、腫瘍関連マクロファージを本明細書に開示される抗体と接触させる工程を含み、前記方法は、以下の効果：
（ａ）ヒトマクロファージによる、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーの発現の低下、
（ｂ）ヒトマクロファージによる抗体の内在化、
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、
（ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖、ならびに
（ｅ）腫瘍微小環境中での腫瘍細胞死滅の促進
のうち少なくとも４つをもたらす。
本明細書の特定の実施形態では、腫瘍微小環境中での腫瘍関連マクロファージの活性を調節する方法が開示され、該方法は、腫瘍関連マクロファージを本明細書に開示される抗体と接触させる工程を含み、前記方法は、以下の効果：
（ａ）ヒトマクロファージによる、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーの発現の低下、
（ｂ）ヒトマクロファージによる抗体の内在化、
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、
（ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖、ならびに
（ｅ）腫瘍微小環境中での腫瘍細胞死滅の促進
のうち少なくとも５つをもたらす。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化および増殖の骨髄細胞抑制を低下させる。
Ｍ２からＭ１へのマクロファージの極性化は、結果生じるマクロファージがＭ１またはＭ１様マクロファージに関連する特定の機能的または表現型特質を有するように、本開示のＭ２またはＭ２様マクロファージが改質されるプロセスを指す。いくつかの実施形態では、Ｍ２またはＭ２様マクロファージは、ＣＤ１６３をこれ以上発現しないときに極性化される。
いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤ８ Ｔ細胞によるＲａｊｉ細胞のＣＤ１９－ＣＤ３ ＢｉＴＥ媒介性死滅の骨髄細胞抑制を低下させる。
いくつかの実施形態では、抗体は、癌細胞のＣＡＲ Ｔ細胞媒介性死滅の骨髄細胞抑制を低下させる。
いくつかの実施形態では、抗体は、ＡＤＣＣによるＮＫ細胞媒介性癌細胞死滅の骨髄細胞抑制を低下させる。
本明細書に開示される方法のいずれかは、いくつかの例では、追加の抗癌療法を前記対象に施す工程をさらに含む。抗癌療法には、外科療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法、およびサイトカイン療法、ならびにこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメント、および抗癌療法は、同時または連続的に投与される。
いくつかの実施形態では、追加の抗癌療法は、免疫療法である。いくつかの実施形態では、免疫療法は、チェックポイント阻害剤を含む組成物である。いくつかの実施形態では、追加の抗癌療法は、免疫チェックポイント阻害剤である。
いくつかの実施形態では、本開示は、ｈｕＣＤ１６３発現マクロファージを含む疑いがある細胞試料中のｈｕＣＤ１６３発現マクロファージを特定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法を提供し、該方法は、細胞試料を本明細書に記載の抗体と接触させる工程と、試料中のｈｕＣＤ１６３発現マクロファージの存在を示す陽性シグナルである試料中の細胞への結合を測定する工程とを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞試料中のヒトＭ２ｃマクロファージを特定するための方法を提供し、該方法は、ヒトＭ２ｃマクロファージを含む疑いのある血液細胞を含む細胞試料を、本明細書に記載の抗体と接触させる工程と、試料中のヒトＭ２ｃ発現マクロファージの存在を示す陽性シグナルである試料中の細胞への結合を測定する工程とを含む。いくつかの実施形態では、細胞試料は、ヒト対象から得た細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞試料は、培養細胞を含む。いくつかの実施形態では、試料中のＭ２細胞を検出するための方法は、検出を容易にするために、結合に際して細胞により内在化されないが細胞の外部に結合したまま残る抗体またはフラグメントを使用する工程を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞試料中のｈｕＣＤ１６３発現癌細胞を特定するための方法を提供し、該方法は、ｈｕＣＤ１６３発現癌細胞を含む疑いのある細胞を含む細胞試料を、本明細書に記載の抗体と接触させる工程と、試料中のｈｕＣＤ１６３発現癌細胞の存在を示す陽性シグナルである試料中の細胞への結合を測定する工程とを含む。いくつかの実施形態では、細胞試料は、ヒト対象から得た細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞試料は、培養細胞を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｍ２ｃマクロファージ上での細胞表面マーカーの発現を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、Ｓｉｇｌｅｃ－１５、およびＴＬＲ２のうち少なくとも１つの発現が、低下される。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６、ＣＤ６４、Ｓｉｇｌｅｃ－１５、およびＴＬＲ２の発現が、低下される。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｔ細胞活性化の骨髄細胞抑制を低下させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、Ｔ細胞によるＩＬ－２産生の増加を誘導する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｔｈ１細胞増殖を増加させるための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｔ細胞の増殖におけるＴｈ１細胞の割合を増加させるための方法を提供する。これら態様のそれぞれにおいて、方法は、本明細書に記載の抗体をｉｎ ｖｉｖｏで投与する工程、あるいは、抗体をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで複合免疫細胞系と接触させる工程を含み、これにおいて、マクロファージ、エフェクターＴ細胞、および任意選択の腫瘍標的細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでの相互作用を再現またはモデル化する方法で相互作用することが可能となる。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｔ細胞増殖の骨髄細胞抑制を低下させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ４＋細胞増殖またはＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、あるいはその両方を増加させる方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、必要とする患者におけるＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、およびＣＴＬＡ４のうち少なくとも１つのＴ細胞発現を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、およびＣＴＬＡ４のうちの少なくとも１つの発現を増加させる。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、およびＣＴＬＡ４のうちの少なくとも１つの発現を増加させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、癌細胞死滅を増加させるための方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）による癌細胞死滅が、増加される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣミスマッチ癌細胞（ＭＨＣ－ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ）のＴ細胞媒介性死滅が、増加される。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化またはＣＤ８＋Ｔ細胞増殖のマクロファージ媒介性抑制を低下させるために、骨髄細胞を本明細書に記載の抗体と接触させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｍ０マクロファージを含む骨髄細胞と接触される。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｍ２マクロファージを含む骨髄細胞と接触される。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｍ０およびＭ２マクロファージを含む骨髄細胞と接触される。
いくつかの実施形態では、本開示は、肺癌のヒト患者を処置する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の抗体を有効量で患者に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、肺癌は、癌腫または腺癌である。いくつかの実施形態では、肺癌は、非小細胞肺癌である。
本開示の有効な応答は、対象が、病気の徴候もしくは症状の部分的または全体的な緩和あるいは減少を経験するときに達成され、癌の処置の場合、具体的には、治癒、寛解、生存の延長、または他の他覚的応答を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、予想される無増悪生存期間は、再発の回数、疾患の段階、および他の因子を含む予後因子に応じて、数か月から数年で測定される。生存の延長には、少なくとも１か月（ｍｏ．）、少なくとも約２ｍｏｓ．、少なくとも約３ｍｏｓ．、少なくとも約４ｍｏｓ．、少なくとも約６ｍｏｓ．、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年などの時間が挙げられるが、これらに限定されるものではない。全生存率も、例えば数か月から数年で測定される。代替的に、いくつかの実施形態では、有効な応答は、対象の症状が静的なままであることである。適応症の処置のさらなる指標は、以下で詳述される。
いくつかの実施形態では、予防方法での治療薬の投与は、望ましくない疾患または障害の症状が現れる前に行われ、それにより、疾患または障害は、予防されるか、または代替的にその進行が遅延される。このため、予防方法と併せて使用するとき、「治療上有効な」という用語は、処置後に、（平均して）より少数の対象が、望ましくない疾患または障害を発症するか、症状の重症度を進行させることを意味する。
いくつかの実施形態では、組成物中の活性成分の量、組成物製剤、および投与形態は、対象に対し過度に毒性となることなく、各対象に対する望ましい治療応答を達成するのに有効な量の活性成分を提供するように変動される因子の中にある。選択された用量値は、利用する特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、利用する特定の化合物の***または代謝の速度、処置の持続時間、利用する特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、処置される対象の年齢、性別、体重、状態、全身健康、食事、および既往歴、ならびに医療分野で周知の同様の因子を含む様々な因子に左右される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体および抗原結合フラグメントは、様々な投与量で様々な時間枠にわたり、対象に投与される。非限定的な用量として、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約１２５ｍｇ／ｋｇ、約１５０ｍｇ／ｋｇ、約１７５ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ、またはこれらの間の任意の整数が挙げられる。加えて、抗体または抗原結合フラグメントの投与は、いくつかの実施形態では、週２回、毎週、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、６週間ごと、８週間ごと、１２週間ごと、またはこれらの中の週の組合せで行われる。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントを４週間にわたり週１回または２回投与し、続いて２週間治療を行わないといった投与サイクルも、企図される。例えば、本明細書に記載の用量および毎週のサイクルの異なる組み合わせを含む追加の投与サイクルも、本開示の範囲内で企図される。
いくつかの実施形態では、組成物の治療有効な量は、疾患の重篤度、ならびに処置される対象の体重および全身状態により変動し、左右されるが、一般的に、適用ごとに約１．０μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲にある。投与は、障害または状態に対する応答、および対象の処置に対する忍容性に応じ、必要に応じて、毎日、隔日、毎週、月２回、毎月、あるいはこれよりも多いか少ない頻度で行われる場合がある。いくつかの実施形態では、４、５、６、７、８、１０、１２週以上などの長期間にわたる維持投与が、所望の障害の症状の抑制が生じるまで必要とされ、用量は必要に応じて調整される。この療法の進捗は、従来技法およびアッセイにより容易にモニタリングされる。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で毎日～毎週～毎月（例えば、毎日、隔日、３日ごと、または週２、３、４、５、または６回）の頻度、好ましくは０．１～４５ｍｇ／ｋｇ、０．１～１５ｍｇ／ｋｇ、または０．１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で週２または３回、あるいは最大４５ｍｇ／ｋｇを月に１回、生理溶液中で静脈内投与される。
応答は、対象が、病気の徴候または症状の部分的または全体的な緩和あるいは減少を経験するときに達成され、具体的には生存の延長が挙げられるが、これに限定されるものではない。予想される無増悪生存期間は、例えば、再発の回数、疾患の段階、および他の因子を含む予後因子に応じて、数か月から数年で測定される。生存の延長には、少なくとも１か月（ｍｏ）、少なくとも約２か月（ｍｏｓ．）、少なくとも約３ｍｏｓ．、少なくとも約４ｍｏｓ．、少なくとも約６ｍｏｓ．、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、またはそれより長い時間などの時間が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、全生存率はまた、数か月から数年で測定される。いくつかの実施形態では、対象の症状は、静的なままであるか、または低下する。
場合により、当業者を含む医師または獣医師は、必要な組成物の有効量（ＥＤ５０）を容易に判定かつ処方する。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低レベルで組成物中に利用される化合物の投与を開始し、所望の効果を達成するまで用量を段階的に増やすことができる。代替的に、いくつかの実施形態では、用量は一定のままである。
いくつかの実施形態では、他の抗体、小分子治療薬、および／または他の薬剤は、同時または連続投与のために別々の組成物中で組み合わされる。一実施形態では、同時投与は、同時に、または互いに３０分以内に投与される１つ以上の組成物を含む。いくつかの実施形態では、投与は、同じ部位または異なる部位で行われる。
いくつかの実施形態では、このような成分の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）とＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を求めるために、細胞培養物または実験動物を対象とする標準の薬学的手順により求められる。いくつかの実施形態では、毒性効果と治療効果との用量比が治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表される。いくつかの実施形態では、毒性の副作用を呈する化合物が使用されるが、健康な細胞に対して起こり得る損傷を最小限に抑え、それにより副作用を減少させるために、影響を受けた組織部位に対してこのような化合物を標的とする送達系をデザインすることに、注意を払う必要がある。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、いくつかの実施形態では、ヒトを対象とする使用のための用量範囲を製剤化するのに使用される。このような化合物の用量は、毒性がほとんどまたはまったく無いＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。いくつかの実施形態では、投与量は、利用される剤形および使用される投与経路に依存して、この範囲内で変動する。本開示の方法で使用されるあらゆる化合物において、治療上有効用量は、いくつかの実施形態では、細胞培養アッセイから最初に推定される。いくつかの実施形態では、用量は、細胞培養物において判定されるように、ＩＣ５０を含む循環血漿中濃度配列（すなわち、最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を達成するために動物モデルにおいて製剤化される。血漿中の値は、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定される。場合により、このような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に判定するために使用される。
いくつかの実施形態では、本開示は、癌患者を処置する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の抗体を治療上有効量で患者に投与する工程を含み、さらに、外科療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法、またはサイトカイン療法から選択される抗癌療法で対象を処置する工程を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメント、および別の抗癌療法は、同時または連続的に施される。
診断製品および方法
いくつかの実施形態では、本明細書には、患者の処置状態を評価するために、あるいは、本明細書に記載の疾患および障害など、Ｍ２マクロファージまたはＴＡＭの活性に関連もしくは相関される疾患または障害を診断するために、試料または対象におけるｈｕＣＤ１６３タンパク質またはＭ２マクロファージを検出する方法が、開示される。
可溶性ｈｕＣＤ１６３タンパク質、細胞または組織によるｈｕＣＤ１６３タンパク質の発現、あるいはＭ２マクロファージの存在または活性を対象とするｉｎ ｖｉｖｏでの検出、診断、またはモニタリングでは、対象は、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントを投与され、抗体または抗原結合フラグメントは、検出可能部分に結合されている。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、限定されないが、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、蛍光、ラジオイメージング、内視鏡、腹腔鏡、または血管内カテーテルにより（すなわち、光活性剤の検出を介して）供給される光源、光走査、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）走査、全身核磁気共鳴（ＮＭＲ）、ラジオシンチグラフィー、単一光子放射コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、標的近赤外領域（ＮＩＲ）走査、Ｘ線、超音波などの当技術分野で認識されている方法を用いて、可視化される。このような方法を使用して化合物を検出するためのラベルも、当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、検出可能な部分の可視化により、Ｍ２マクロファージ活性またはｈｕＣＤ１６３タンパク質を発現する別の細胞の活性に関連する疾病または疾患の検出、診断、および／またはモニタリングが可能となる。所望の標的タンパク質、すなわちｈｕＣＤ１６３タンパク質に特異的な抗体を利用する追加の診断アッセイは、当該技術分野で知られており、本明細書でも企図される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出法では、対象から得られる試料には、血液、組織生検試料、およびこれらに由来する流体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
このため、本開示は、疾患または障害に関連するＭ２マクロファージまたはＴＡＭマクロファージのレベルを検出または診断するのに有用であり、治療的処置の必要性を示す場合のある抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。他の実施形態では、抗体は、第２の薬剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、このような薬剤は、例えばレポーター分子または検出可能なラベルなどの分子あるいは部分である。かかる検出方法のための検出可能なラベル／部分は、当該技術分野で知られており、以下に詳述される。レポーター分子は、例えばアッセイを使用して検出される任意の部分である。ポリペプチドにコンジュゲートされているレポーター分子の非限定的な例として、酵素、放射性標識、ハプテン、蛍光ラベル、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、ビオチンなどの着色粒子またはリガンドが挙げられる。いくつかの実施形態では、検出可能なラベルは、その特異的な機能的特性、および／または化学的特性に起因して検出される化合物および／または要素を含み、その使用により、それらが付着されるポリペプチドが、所望される場合に検出および／またはさらに定量化されることが可能となる。多くの適切な検出可能な（画像化）薬剤は、当該技術分野で知られており、同じくそれらのポリペプチドへの付着方法も知られている。
ポリペプチドは、いくつかの実施形態では、フルオレセイン、Ｒ－フィコエリトリン、およびビオチンなどの広範な蛍光色素、クエンチャー、およびハプテンにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションは、ポリペプチド合成中、またはポリペプチドが合成および精製された後のいずれかに行われる。
代替的に、抗体、抗原結合フラグメント、または結合タンパク質は、いくつかの実施形態では、蛍光部分とコンジュゲートされる。蛍光部分（例えば、Ｒ－フィコエリトリン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）など）でポリペプチドをコンジュゲートすることは、例えば、当該技術分野で認識される技法を使用して達成される。多数の市販の蛍光色素および色素コンジュゲーションキットは、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの特定用途のために市販されている。
非限定的な一実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＭ２マクロファージ、あるいは可溶性または結合型ｈｕＣＤ１６３への抗体の結合を可視化するのに使用される抗原への結合の免疫検出のために、放射性核種、染料、造影剤、または蛍光薬剤などの検出可能なラベルに付随（コンジュゲート）される。
放射性標識の非限定的な例として、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７１Ｇｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７７Ａｓ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ／８１ｍＫｒ、８７ｍＳｒ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１００Ｐｄ、１０１Ｒｈ、１０３Ｐｂ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１９Ｓｂ、１２１Ｓｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２８Ｂａ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３１Ｃｓ、１４３Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９１Ｏｓ、１９３Ｐｔ、１９４Ｉｒ、１９７Ｈｇ、１９９Ａｕ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、および２１３Ｂｉが挙げられる。いくつかの実施形態では、放射性標識は、抗体イメージングの技術分野で知られる従来の化学を使用して化合物に付着される。放射性標識化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断技法、ｉｎ ｖｉｖｏ放射撮像技法、および放射免疫療法において有用である。
本明細書に記載の抗体および抗原結合フラグメントの組成物は、いくつかの実施形態では、非治療薬（例えば、親和性精製剤）としても使用される。
抗体技術
当業者により理解されるように、本明細書中の抗体、ならびにこれを調製および使用する方法の全体的な記述は、個々の抗体ポリペプチド成分および抗体フラグメントにも適用される。
本開示の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。しかし、好ましい実施形態では、これらはモノクローナルである。特定の実施形態では、本開示の抗体は、ヒト抗体である。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は、当該技術分野で知られている。
抗体、抗原結合フラグメント、およびＭ２マクロファージにより発現されるｈｕＣＤ１６３に結合する他のタンパク質は、このような方法を用いて生成され、いくつかの実施形態では、それらの結合親和性、結合活性、および調節能の１つ以上を試験される。
いくつかの実施形態では、従来の方法は、ｈｕＣＤ１６３タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを特定するために利用される。いくつかの実施形態では、抗体および抗原結合フラグメントは、結合親和性、会合速度、解離速度、および結合活性のうちの１つ以上を評価される。このようなパラメータの測定は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ、スキャッチャード解析、表面プラズモン共鳴（例えばＢＩＡＣＯＲＥ）分析などを含むがこれらに限定されない結合アッセイ、競合結合アッセイなどを使用して達成される。非限定的な一実施形態では、ｈｕＣＤ１６３タンパク質に結合する特異的な抗体または抗原結合フラグメントの結合能を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイが使用される。表面プラズモン共鳴技術は、Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７：３２３－９（２０００）に記載されている。
いくつかの実施形態では、本開示による抗体は、以下に詳述されるように、当該技術分野で利用可能なベクターおよび方法を用いて組換えにより産生される。いくつかの実施形態では、ヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化されたＢ細胞によっても産生される（米国特許第５，５６７，６１０号および５，２２９，２７５号を参照）。
いくつかの実施形態では、ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の全レパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）において産生される。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異マウスの抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失は、完全な内因性抗体産生の阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移行は、抗原チャレンジに際してヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５－５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）、米国特許第５，５４５，８０６号、５，５６９，８２５号、５，５９１，６６９号、５，５４５，８０７号、およびＷＯ９７／１７８５２を参照されたい。いくつかの実施形態では、このような動物は、本開示のポリペプチドを含むヒト抗体を産生するように遺伝子操作される。
抗体は、例えば、飽和硫酸アンモニウム沈殿法、オイグロブリン沈殿法、カプロン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２）、あるいは抗ＩｇカラムまたはプロテインＡ、Ｇ、もしくはＬカラムを用いた親和性クロマトグラフィーなどの、当業者に公知の方法を用いて、培養上清または腹水（動物中で産生される場合）から単離かつ精製される。
上述のように、本開示は、抗体フラグメントをさらに提供する。特定の状況では、抗体全体ではなく、抗体フラグメントを使用するという利点が存在する。例えば、より小さなサイズのフラグメントでは、速やかなクリアランスが可能となり、これにより、いくつかの実施形態では、固形腫瘍などの特定の組織へのアクセスが改善される。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、ダイアボディ、線形抗体、一本鎖抗体、ならびに抗体フラグメントから形成される多特異性抗体が挙げられる。
抗体フラグメントを産生するために様々な技法が開発されてきた。従来、これらのフラグメントは、無傷の抗体のタンパク質分解消化を介して得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９２ ２４（１－２）：１０７－１７、およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８５ ２２９：８１を参照）。しかし、これらフラグメントは、いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞により直接産生されるようになった。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＳｃｆｖ抗体フラグメントはすべて、大腸菌の中で発現されるとともにそこから分泌されるため、これらフラグメントを大量に容易に産生することができる。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメントは、大腸菌から直接回収され、化学的に結合されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成する（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２））。別の手法によれば、いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離される。ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ受容体結合エピトープを含み、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が増加したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントが、米国特許第５，８６９，０４６号および６，１２１，０２２号に記載されている。他の抗体フラグメントの産生技法は、当業者に明白である。
他の実施形態では、選択対象の抗体は、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号と５，５８７，４５８号を参照されたい。ＦｖとｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の結合部位を備える唯一の種である。このため、これらは、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用中の非特異的結合の低下に適している。いくつかの実施形態では、ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおいてエフェクタータンパク質の融合をもたらすように構築されている。上述のＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋを参照されたい。いくつかの実施形態では、抗体フラグメントは、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるような「線形抗体」でもある。いくつかの実施形態では、このような線形抗体フラグメントは、単特異性または二重特異性である。
二重特異性またはその他多重特異性抗体の作製方法は、当該技術分野で公知であり、化学的架橋、ロイシンジッパーの使用（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：１５４７－５３（１９９２））、ダイアボディ技術（ｄｉａｂｏｄｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：６４４４－８（１９９３））、ｓｃＦｖ二量体（Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５２：５３６８（１９９４））、線形抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ８：１０５７－６２（１９９５））、およびキレート化組換え抗体（Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４６：３６７－７３（１９９５））が挙げられる。
従来の完全長二重特異性抗体の産生は、２つの鎖の特異性が異なる、２つの免疫グロブリン重鎖と軽鎖との対の共発現に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７－９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖と軽鎖の無作為な分類に起因して、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は、可能性として１０個の異なる抗体分子の混合物を産生し、そのうち１つだけが正確な二重特異性構造を有する。正確な分子の精製は、例えば、親和性クロマトグラフィーにより行われる。同様の手順が、ＷＯ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ １０：３６５５－９（１９９１）に開示されている。
別の手法によれば、所望の結合特異性を持つ抗体可変領域（抗体－抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。好ましくは、この融合は、ヒンジの少なくとも一部、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインに対して行われる。軽鎖結合に必要な部位を伴う第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、融合物の少なくとも１つに存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物および必要に応じて免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクターに挿入され、適切な宿主細胞へと共トランスフェクトされる。これにより、構築物に使用される４つのポリペプチド鎖の不均等比が最適収量の所望の二重特異性抗体をもたらす実施形態では、４つのポリペプチドフラグメント相互の比率の調整に際する柔軟性がより高くなる。しかし、均等比にある少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収量をもたらすとき、またはこの比には所望の鎖の組合せの収量に対して顕著な効果がないとき、２つまたは４つすべてのポリペプチド鎖に対するコーディング配列を、単一発現ベクターに挿入することが可能である。
二重特異性抗体は、例えば、一方の腕に第１の二重特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方の腕にハイブリッド免疫グロブリン重鎖－軽鎖の対（第２の結合特異性をもたらす）で構成されている。二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することで容易な分離方法が得られるため、この非対称的な構造は、不要な免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にする。この手法は、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体生成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
米国特許第５，７３１，１６８号に記載される別の手法によれば、いくつかの実施形態では、抗体分子対間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大限にするように操作される。好ましいインターフェースは、ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面の１つ以上の小アミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置き換えられる。第２の抗体分子の界面には、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）と置き換えることにより、大きな側鎖と同一または類似の大きさの代償的「空洞」が形成される。これにより、ホモ二量体などの他の不要な最終産物よりもヘテロ二量体の収率を増加させるための機構が提供される。
二重特異性抗体は、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体のうち一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合される。このような抗体は、例えば、不要な細胞に対する免疫系細胞の標的化（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染症の処置（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２０３７３、およびＥＰ０３０８９）のために提唱されている。いくつかの実施形態では、ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる都合の良い架橋方法を使用して作製される。適切な架橋剤は、当技術分野で周知であり、多くの架橋技法とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。別の方法は、ｓｃＦｖのＣ末端にてストレプトアビジンコード配列を付加することにより四量体を作製するようにデザインされている。ストレプトアビジンは４つのサブユニットで構成されているため、ｓｃＦｖ－ストレプトアビジンが折り畳まれると、４つのサブユニットが会合して四量体を形成する（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６（３）：９３－１０１（１９９５））。
二重特異性抗体を作製する別の手法によれば、いくつかの実施形態では、抗体分子対間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大限にするように操作される。１つの界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を備えている。この方法では、第１の抗体分子の界面の１つ以上の小アミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置き換えられる。第２の抗体分子の界面には、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）と置き換えることにより、大きな側鎖と同一または類似の大きさの代償的「空洞」が形成される。これにより、ホモ二量体などの他の不要な最終産物よりもヘテロ二量体の収率を増加させるための機構が提供される。ＷＯ９６／２７０１１を参照されたい。
抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技法も、この文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学的結合を使用して調製される。Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）には、無傷の抗体をタンパク分解により切断してＦ（ａｂ’）２フラグメントを産生する手順が記載されている。これらフラグメントは、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、ビシナルジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を妨げる。次いで、生成されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’－ＴＮＦ誘導体のうち１つは、メルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’－チオールに再変換され、等モル量の他のＦａｂ’－ＴＮＦ誘導体と混合されて、二重特異性抗体を形成する。いくつかの実施形態では、産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用される。
近年の進歩により、大腸菌からのＦａｂ’－ＳＨフラグメントの直接回収が容易となり、このフラグメントは、例えば化学的に結合されて二重特異性抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７５：２１７－２５（１９９２）には、ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生が記載されている。各Ｆａｂ’フラグメントは、大腸菌から別々に分泌され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの指向性化学結合に晒されて、二重特異性抗体を形成した。このように形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体および正常なヒトＴ細胞を過剰発現する細胞に結合するほか、ヒト***腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
組換え細胞培養物から直接二重特異性抗体フラグメントを作製して単離するための様々な技法も、記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８（５）：１５４７－５３（１９９２）を参照されたい。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。抗体ホモ二量体は、ヒンジ領域で還元されて単量体を形成し、次いで再酸化されて、抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、いくつかの実施形態では、抗体ホモ二量体を産生するために使用される。
抗体の特定と調製
抗体、その可変領域、または抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列は、いくつかの実施形態では、従来のシーケンシング技法を用いて判定され、抗体の組換え産生のために発現ベクターへとサブクローン化される。これは、対象、例えば癌患者の血液から単核細胞を取得し、この単核細胞からＢ細胞クローンを産生し、Ｂ細胞を誘導して抗体産生プラズマ細胞とし、このプラズマ細胞により産生される上清をスクリーニングして抗体が含有されているかどうか判定することにより、達成される。本開示の抗体の特異性を有する他の抗体の特定は、いくつかの実施形態では、同様の方法を用いて達成される。例えば、抗体を産生するＢ細胞クローンが一旦特定されると、抗体の可変領域またはその一部をコードするＤＮＡをクローン化するために、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が実施される。次いで、これら配列は、ヒト抗体の組換え産生に適した発現ベクターへとサブクローン化される。いくつかの実施形態では、結合特異性は、抗体または組換え抗体の、Ｍ２細胞またはＭ２細胞により発現されるヒトＣＤ１６３ポリペプチドを発現する他の細胞への結合能を判定することにより確認される。
本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、末梢血またはリンパ節から単離されたＢ細胞は、例えば、ＣＤ１９陽性であることに基づき選別され、例えば９６、３８４、または１５３６ウェルの構成で、例えばウェルごとの単一細胞特異性と同程度の低さで播種される。細胞は、抗体産生細胞、例えばプラズマ細胞に分化するよう誘導され、培養上清は採取され、例えばＦＭＡＴまたはＦＡＣＳ分析を使用して、その表面上に標的ポリペプチドを発現する細胞への結合を試験される。次いで、陽性ウェルは、全ウェルＲＴ－ＰＣＲに晒されて、クローン娘プラズマ細胞により発現されるＩｇＧ分子の重鎖および軽鎖可変領域を増幅する。結果生じるＰＣＲ産物は、重鎖および軽鎖可変領域、またはその一部をコードするものであり、組換え発現のためにヒト抗体発現ベクターへサブクローン化される。次いで、結果生じる組換え抗体は、その本来の結合特異性を確認するために試験され、さらにいくつかの実施形態では、他の細胞またはタンパク質に対する交差反応性を試験される。
このため、一実施形態では、抗体を特定する方法は、以下のように実施される。先ず、完全長またはほぼ完全長のＣＤ１６３ｃＤＮＡが、ＣＤ１６３ポリペプチドの発現のために細胞株へとトランスフェクトされる。次に、個々のヒト血漿または血清試料が、細胞発現ポリペプチドに結合する抗体について試験される。そして最後に、血漿または血清陽性の個体から得たＭＡｂは、同じ細胞発現ＣＤ１６３ポリペプチドへの結合を特徴づけられる。いくつかの実施形態では、ＭＡｂの細密な特異性に対するさらなる定義が、この時点で実施される。
本開示の抗体またはその部分をコードするポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、当該技術分野で利用可能および本明細書に記載の方法により、抗体を発現する細胞から単離される。この方法には、ヒト抗体ポリペプチドの保存領域に特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応による増幅が挙げられる。例えば、軽鎖および重鎖可変領域は、ＷＯ９２／０２５５１、米国特許第５，６２７，０５２号、またはＢａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：７８４３－４８（１９９６）に記載される分子生物学的技法により、Ｂ細胞からクローン化される。ある実施形態では、抗体を発現するクローン娘プラズマ細胞により発現されるＩｇＧ分子の重鎖および軽鎖の両可変領域のすべてまたは１つの領域をコードするポリヌクレオチドが、サブクローン化され、配列決定される。いくつかの実施形態では、コードされたポリペプチドの配列は、ポリヌクレオチド配列から容易に判定される。
本開示のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、発現ベクターへとサブクローン化されて、当該技術分野で知られ本明細書に記載の手順を用いて、本開示の抗体およびポリヌクレオチドを組換えにより産生する。
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６３ポリペプチドまたはＭ２細胞に対する抗体（またはそのフラグメント）の結合特性は、一般的に、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）および／または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの免疫蛍光ベースのアッセイを含む免疫検出法を用いて、判定および評価される。いくつかの実施形態では、免疫測定法は、抗体がＣＤ１６３ポリペプチドまたはＭ２マクロファージに特異的に結合するかどうかを判定するための制御と手順を含むが、対照細胞、例えばＭ１細胞、または対照タンパク質を発現するようトランスフェクトされる宿主細胞を認識も交差反応もしない。
ＣＤ１６３ポリペプチドまたはＭ２マクロファージに対する抗体を産生する患者を特定するための血清の事前スクリーニングに従い、本開示の方法は、一般的に、事前に患者または対象から得られる生物学的試料からのＢ細胞の単離または精製を含む。いくつかの実施形態では、患者または対象は、目的の癌や特定の疾患を抱える疑いがある、もしくは抱えていると現在診断されているか既に診断されている、あるいは、癌や疾患がないと考えられる。一般的には、患者または対象は、哺乳動物であり、特定の実施形態ではヒトである。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、リンパ節またはリンパ節組織、胸水、末梢血、腹水、腫瘍組織、または脳脊髄液（ＣＳＦ）を含むがこれらに限定されない、Ｂ細胞を含有する試料である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、腫瘍生検または特定の疾患により影響を受ける他の生物学的試料といった異なる種類の生物学的試料から単離される。しかし、いくつかの実施形態では、Ｂ細胞を含むあらゆる生物学的試料は、本開示の実施形態のいずれかに使用されることが理解される。
一旦単離されると、Ｂ細胞は、例えば、形質細胞、形質芽細胞、またはプラズマ細胞へのＢ細胞の増殖あるいは発達を支持する条件下で、Ｂ細胞を培養することにより抗体を産生するよう誘導される。次に、抗体は、標的抗原、例えば特定の組織、細胞、またはポリペプチドに特異的に結合する抗体を特定するために、一般的に高スループット技法を使用してスクリーニングされる。ある実施形態では、特異的抗原、例えば抗体に結合した細胞表面ポリペプチドは知られていないが、他の実施形態では、抗体に特異的に結合した抗原が知られている。
本開示によれば、Ｂ細胞は、いくつかの実施形態では、生物学的試料、例えば腫瘍、組織、末梢血、またはリンパ節試料から、当該技術分野で知られかつ利用可能な任意の手段により単離される。Ｂ細胞は、一般的にその表面上でのＢ細胞特異的マーカー、例えばＣＤ１９、ＣＤ１３８、および／または表面ＩｇＧの存在に基づきＦＡＣＳにより選別される。しかし、いくつかの実施形態では、例えばＣＤ１９磁気ビーズまたはＩｇＧ特異的磁気ビーズを用いたカラム精製、その後のカラムからの溶出など、当該技術分野で知られる他の方法が、利用される。しかし、いくつかの実施形態では、任意のマーカーを利用するＢ細胞の磁気単離は、特定のＢ細胞の損失をもたらす。それゆえ、ある実施形態では、単離された細胞は選別されず、代わりに、腫瘍から単離されたＦｉｃｏｌｌ精製単核細胞は、ウェルごとの適切または所望の数の特異性に直接播種される。
抗体を産生するＢ細胞を特定するために、Ｂ細胞は、一般的に低密度（例えば、ウェルごとの単一細胞特異性、ウェルごとに１～１０の細胞、ウェルごとに１０～１００の細胞、ウェルごとに１～１００の細胞、ウェルごとに１～１００の細胞、ウェルごとに１０未満の細胞、またはウェルごとに１００未満の細胞）で、マルチウェルプレートまたはマイクロタイタープレートの中、例えば、９６、３８４、または１５３６のウェル構成で播種される。最初にＢ細胞がウェルごとに１より多くの細胞密度で播種されると、本開示の方法は、ウェルごとの単一細胞特異性が達成されるまで抗原特異的抗体を産生すると特定されるウェルにおいて引き続き細胞を希釈する工程を含み、それにより、いくつかの実施形態では、抗原特異的抗体を産生するＢ細胞の特定を容易にする。いくつかの実施形態では、細胞上清またはその一部、および／あるいは細胞は、今後の試験および後の抗体ポリヌクレオチドの回収のために冷凍保存される。
ある実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞による抗体の産生に有利な条件下で培養される。例えば、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の増殖と分化に有利な条件下で培養されて、抗体産生形質芽細胞、形質細胞、またはプラズマ細胞をもたらす。特定の実施形態では、Ｂ細胞は、リポ多糖（ＬＰＳ）またはＣＤ４０リガンドなどのＢ細胞マイトジェンの存在下で培養される。特異的な一実施形態では、Ｂ細胞は、フィード細胞、および／またはＣＤ４０リガンドなどの他のＢ細胞活性化因子で培養されることにより、抗体産生細胞に分化される。
細胞培養上清、またはそこから得られる抗体は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のものを含む当技術分野で利用可能な慣例的方法を使用して、標的抗原への結合能を試験される。特定の実施形態では、培養上清は、高スループット方法を用いて、標的抗原に結合する抗体の存在を試験される。例えば、Ｂ細胞は、複数の細胞上清を同時にサンプリングして、標的抗原に結合する抗体の存在を試験するために、ロボティックプレートハンドラー（ｒｏｂｏｔｉｃ ｐｌａｔｅ ｈａｎｄｌｅｒ）が使用されるようなマルチウェルマイクロタイターディッシュ中で培養される。特定の実施形態では、抗原は、抗体／抗原複合体の捕捉を容易にするために、ビーズ、例えば常磁性ビーズまたはラテックスビーズに結合される。他の実施形態では、抗原および抗体は（異なるラベルで）蛍光標識され、標的抗原に結合する抗体の存在を特定するためにＦＡＣＳ解析が実施される。一実施形態では、抗体結合は、ＦＭＡＴ（商標）解析および計測手段を用いて判定される（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）。ＦＭＡＴは、高スループットスクリーニング用の蛍光マクロ共焦点プラットフォームであり、これにより、生きた細胞またはビーズを使用したミックスアンドリード（ｍｉｘ－ａｎｄ－ｒｅａｄ）非放射性アッセイが可能となる。
特定の標的抗原（例えば、癌組織または細胞、感染性物質などの生体試料）に対する抗体の結合を、対照試料（例えば、正常細胞、別の種由来の比較対象細胞、異なる癌組織または細胞、異なる感染性物質などの生物学的試料）に対する抗体の結合を比較する場合、いくつかの実施形態では、対照試料に結合する量と比較して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍多く抗体が、特定の標的抗原に結合する場合に、抗体は特定の標的抗原に優先的に結合すると考えられる。
抗体鎖、その可変領域、またはフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、当該技術分野で利用可能な任意の手段を利用して細胞から単離される。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば、当該技術分野で利用可能な慣例的手順を用いて、ポリメラーゼ配列またはその補体をコードする重鎖あるいは軽鎖に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマーを使用する逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＴ）を用いて単離される。一実施形態では、陽性ウェルは、全ウェルＲＴ－ＰＣＲに晒されて、クローン娘プラズマ細胞により発現されるＩｇＧ分子の重鎖および軽鎖可変領域を増幅する。いくつかの実施形態では、これらのＰＣＲ産物は配列決定され、次いで、重鎖および軽鎖可変領域またはその部分をコードする産物が、ヒト抗体発現ベクターへとサブクローン化され、当該技術分野における慣例的手順により組換え発現される（例えば、米国特許第７，１１２，４３９号を参照）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＭ２マクロファージに特異的な抗体またはそのフラグメントをコードする核酸分子は、伝播され、核酸の切断、ライゲーション、形質転換、およびトランスフェクションに対する様々な周知の手順により発現される。このため、ある実施形態では、抗体フラグメントの発現は、大腸菌などの原核生物宿主細胞に好ましい（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １７８：４９７－５１５（１９８９）を参照）。他の特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントの発現は、酵母菌などの真核生物宿主細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、動物細胞（哺乳動物細胞を含む）、または植物細胞に好ましい。適切な動物細胞の例として、骨髄腫、ＣＯＳ、ＣＨＯ、またはハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。植物細胞の例として、タバコ、トウモロコシ、大豆、およびコメ細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、当業者に知られる、および本開示に基づく方法により、核酸ベクターは、特定の宿主系に異質配列を発現させるためにデザインされ、次いで、腫瘍特異的抗体（またはそのフラグメント）をコードするポリヌクレオチド配列が挿入される。規制要素は、特定の宿主に応じて変動する。
いくつかの実施形態では、可変および／または定常領域をコードするポリヌクレオチドを含有する１つ以上の複製可能な発現ベクターが調製され、適切な細胞株、例えば、マウスＮＳＯ株などの非産生骨髄細胞株や、大腸菌などの細菌を形質転換するために使用され、その中で抗体の産生が生じる。効率的な転写と翻訳を得るために、各ベクター中のポリヌクレオチド配列は、適切な規制配列、具体的には、可変領域配列に操作可能に結合されるプロモーターおよびリーダー配列を含む必要がある。
このように抗体を産生するための特定の方法は、一般的に周知であり、慣例的に使用される。例えば、分子生物学手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（２００１））も参照されたい。必要ではないが、特定の実施形態では、組換え抗体をコードするポリヌクレオチドの領域が、配列決定される。ＤＮＡシーケンシングは、例えば、当技術分野で知られる任意の方法で、または任意のシステムを使用して実施される。基本的なシーケンシング技術は、例えば、Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４：５４６３（１９７７））、およびｔｈｅ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋとその改訂版に記載されている。
特定の実施形態では、結果生じる組換え抗体またはそのフラグメントは、その後、その元の特異性を確認するために試験され、いくつかの実施形態では、例えば関連するポリペプチドとの交差反応をさらに試験される。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従い特定または産生される抗体は、従来の方法を使用して、他のエフェクター機能を内在化する能力を試験される。
パッケージ、キット、および事前充填容器
本明細書にはまた、上述の１つ以上の化合物を含有するキットも提供される。いくつかの実施形態では、このキットは、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを適切な容器手段に入れて含んでいる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物を含む容器手段が、提供される。いくつかの実施形態では、この容器手段は、例えば液体または凍結乾燥組成物を収容する任意の適切な容器であり、バイアル、シリンジ、ボトル、静脈内（ＩＶ）バッグ、またはアンプルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、シリンジは、０．５ｃｃ、１ｃｃ、２ｃｃ、５ｃｃ、１０ｃｃ、またはそれより多くを含むがこれらに限定されない任意の体積にある、対象への注射に適した液体を保持する。
本明細書には、本明細書に記載の一組成物または複数の組成物を含むキットが、提供される。いくつかの実施形態では、本明細書には、本明細書に記載の抗体および抗癌療法薬を含む、癌の対象を処置するためのキットが提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書には、本明細書に記載の抗体と、容器に添付または包装されるラベルとを含む癌処置用のキットが提供され、ラベルには、抗体と抗癌療法薬との併用が記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書には、抗癌療法薬と、容器に添付または包装されるラベルとを含む癌処置用のキットが提供され、ラベルには、抗癌療法薬と本明細書に記載の抗体との併用が記載されている。
いくつかの実施形態では、キットの容器手段は、一般的に少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、アンプル、シリンジ、静脈内（ＩＶ）バッグ、および／または他の容器手段を含み、その中に少なくとも１つのポリペプチドが配され、および／または好ましくは適当に等分される。本明細書には、本明細書に記載の組成物を含む容器手段が提供される。
いくつかの実施形態では、キットは、市販のために、少なくとも１つの融合タンパク質、検出可能な部分、レポーター分子、および／または任意の他の試薬を厳重に閉じ込めた状態で含んでいる。いくつかの実施形態では、このような容器は、所望のバイアルが保持される注射容器および／または吹付け成型されたプラスチック容器を含む。いくつかの実施形態では、キットはまた、キット中の材料の使用に関する印刷物を含む。
パッケージおよびキットはさらに、いくつかの実施形態では、医薬製剤中の緩衝化剤、防腐剤、および／または安定化剤を含む。いくつかの実施形態では、キットの各構成要素は、個々の容器内に封入されており、様々な容器はすべて、１つのパッケージ内にあってもよい。いくつかの実施形態では、本開示のキットは、低温貯蔵または室温貯蔵のためにデザインされる。
加えて、いくつかの実施形態では、調製物は、キットの貯蔵寿命を増加させる安定剤を含有し、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。組成物が凍結乾燥される場合、キットは、いくつかの実施形態では、凍結乾燥された調製物を再構成するためにさらなる溶液の調製物を含有する。許容可能な再構成溶液は、当該技術分野で周知であり、例えば、薬学的に許容可能なリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、パッケージおよびキットはさらに、例えばＥＬＩＳＡアッセイなどのアッセイ用の１つ以上の構成要素を含む。本出願中の試験対象である試料として、例えば、血液、血漿、組織切片、および分泌物、尿、リンパ液、ならびにそれらの産物が挙げられる。いくつかの実施形態では、パッケージおよびキットは、試料収集のための１つ以上の構成要素（例えば、シリンジ、カップ、綿棒など）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、パッケージおよびキットは、ＵＳ ＦＤＡまたは同様の規制当局により求められる情報、例えば、製品説明、投与量、投与形態、および／または処置の適応症を特定するラベルを含む。本明細書で提供されるパッケージは、本明細書に記載される任意の組成物を含んでもよい。
「包装材料」という用語は、キットの構成要素を収容する物理的構造を指す。いくつかの実施形態では、包装材料は、構成要素を滅菌状態で維持するものであり、かかる目的のために一般的に使用される材料（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプルなど）で作製される。いくつかの実施形態では、ラベルまたはパッケージインサートは、適切な書面の説明書を含む。このため、キットは、いくつかの実施形態では、本開示の任意の方法でキット構成要素を使用するためのラベルまたは説明書をさらに含んでいる。いくつかの実施形態では、キットは、パックまたはディスペンサ中に、本明細書に記載の方法で化合物を投与するための説明書とともに化合物を含む。
またさらなる実施形態では、キットは、抗癌治療薬用の容器手段をさらに含む。
説明書には、いくつかの実施形態では、処置方法を含む本明細書に記載の任意の方法を実施するための説明書が挙げられる。さらに説明書には、良好な臨床評価項目の適応症または発生するあらゆる有害症状、あるいはいくつかの実施形態では、ヒト対象での使用のために米国食品医薬品局などの規制機関により求められる追加の情報が含まれる。
いくつかの実施形態では、説明書は、「印刷物」上に、例えば、キット内またはキットに貼り付けられた紙または厚紙上に、キットまたは包装材料に貼り付けられたラベル上に、あるいはキットの構成要素を含有するバイアルまたはチューブに取り付けられて存在する。いくつかの実施形態では、説明書はさらに、例えばＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリデバイス、ソリッドステートメモリ、磁気ディスクおよびディスクデバイス、磁気テープ、クラウドコンピューティングデバイスおよびサービスなどのコンピュータ可読媒体に含まれる。場合により、プログラムおよび命令は、媒体上で永久的に、ほぼ永久的に、半永久的に、または非一時的にコードされる。
本明細書には、本明細書に記載の組成物を含む容器手段が提供される。いくつかの実施形態では、この容器手段は、液体または凍結乾燥組成物を収容する任意の適切な容器であり、バイアル、シリンジ、ボトル、静脈内（ＩＶ）バッグ、またはアンプルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。シリンジは、０．５ｃｃ、１ｃｃ、２ｃｃ、５ｃｃ、１０ｃｃ、またはそれより多くを含むがこれらに限定されない任意の体積にある、対象への注射に適した液体を保持する。
本明細書には、本明細書に記載の組成物を含むキットが、提供される。いくつかの実施形態では、本明細書には、本明細書に記載の抗体を抗癌療法薬と組み合わせてを含む、癌を処置するためのキットが提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書には、本明細書に記載の抗体と、容器に添付または包装されるラベルとを含む癌処置用のキットが提供され、ラベルには、抗体またはその抗原結合フラグメントと抗癌療法薬との使用が記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書には、抗癌療法薬と、容器に添付または包装されるラベルとを含む癌処置用のキットが提供され、ラベルには、抗癌療法薬と本明細書に記載の抗体との併用が記載されている。
本開示は、例示目的のみのために提供されるが本開示をあらゆる方法で制限することを意図するものではない以下の実施例において、さらに例示される。
実施例１－特定とクローニング
チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ－１処置に応答する患者により産生されるヒト骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）に特異的に結合する抗体を、単離してクローン化する。ＭＤＳＣの免疫抑制効果を標的とし、これを逆転させる治療上の可能性を有する抗体を特定し、これにより腫瘍除去を向上させることを目的として、これらモノクローナル抗体の免疫調節特性をさらに調べた。
免疫チェックポイント阻害剤に対する部分的または完全な応答を少なくとも６か月間達成した癌患者を特定し、Ｉ－ＳＴＡＲプラットフォームを介したメモリーＢ細胞レパートリー解析のために選択した。このプラットフォームでは、短期間Ｂ細胞培養システムを利用して、メモリーＢ細胞レパートリーを調べた。ＣＤ１９およびＩｇＧ表面発現に基づき１５，０００を超えるメモリーＢ細胞を、各ドナー患者の１０００万個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。次に、これらメモリーＢ細胞を、Ｂ細胞の活性化、増殖、末端分化、および抗体分泌を促進した条件下、約１細胞／ウェルで４０個の３８４ウェルマイクロタイタープレートに蒔いた。１細胞／ウェルの播種密度により、単一Ｂ細胞クローンの拡張が可能となり、これにより真正の抗体重鎖と軽鎖の対は、各培養ウェルから再構築することができた。高スループットおよび小型化された多重フローサイトメトリーアッセイを用いて、各ウェル中の分泌ＩｇＧ抗体を、ＭＤＳＣへの結合についてスクリーニングした。４９個の陽性Ｂ細胞クローンを特定した。ＭＤＳＣ結合プロファイルおよび抗体可変領域配列に基づき優先付けを行った抗体の選択サブセットを、配列決定し、クローン化し、さらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ特徴化のために組換えＩｇＧ１として発現させた。
ＭＤＳＣ特異的抗体を産生するＢ細胞クローン由来の免疫グロブリン遺伝子の重（ＶＨ）および軽（ＶＬ）可変領域を、ファミリー特異的プライマーセットを用いたＲＴ－ＰＣＲ増幅により増幅した。陽性ファミリー特異的ＰＣＲ反応から、ＶＨまたはＶＬ領域クローンのプールを、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン配列に対して上流の発現ベクターへとクローン化し、その結果、そのＢ細胞クローンにより産生される抗体と同じ結合特徴を持つ機能的抗体を得た。ＤＮＡプラスミドをデザインし、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＮＪ，ＵＳＡにおいて定常領域中の遺伝子合成のために要求した。これらプラスミドを、すべての起こり得る重鎖および軽鎖ファミリー特異的対において組み合わせ、これを使用してＨＥＫ２９３細胞を一時的にトランスフェクトした。分泌された組換え抗体を含むすべてのトランスフェクタント上清を、フローベースＭＤＳＣ結合アッセイにおいてスクリーニングした。ウェルごとに１より多くのＢ細胞クローンを包含するウェルにおいて、複数のＶＨおよびＶＬドメイン配列を増幅させ、前述のように発現させた。次いで、ＭＤＳＣスクリーンを使用して、混合培養物に見出される抗体で観察されるような結合活性を再現する重鎖と軽鎖を組み合わせたプールを特定した。全結合ｍＡｂに対するＶＨ可変領域およびＶＬ可変領域のＤＮＡ配列を、ｍａｘｉｐｒｅｐｓ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ由来、およびＭａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌで増幅したプラスミド）から精製したＤＮＡを用いた複数のシーケンシング反応により確認した。
１つのＢ細胞クローン（重鎖ＶＨ３．３０－３／ＩＧＨＧ１および軽鎖ＶＫ１．Ｏ１２に対するＧｅｒｍｌｉｎｅ ＩＤ）をＭＤＳＣスクリーンから特定し、配列番号９を含む軽鎖および配列番号１０を含む重鎖を含んだＡＢ１０１と命名した。クローンを入手するドナーは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と診断された患者であった。この患者は、化学療法に対する進行性疾患を抱えており、抗ＰＤ－１処置時には完全寛解を認めていたが採血時には依然として処置を受けていた。Ｂ細胞クローンウェルは、シーケンシングから１つの重鎖と１つの軽鎖しか有していないことを確認した。単一Ｂ細胞クローンから分泌されたＩｇＧ抗体で観察されるように、再現された抗体はさらに、ＭＤＳＣ上に別個の二峰性結合を有しており、このことから、抗体標的がＭＤＳＣの選択亜集団上で高度に発現されることを認めた。図１を参照されたい。緩和ブロック（組換えＦｃブロック１０μｇ／ｍＬ（Ａｂｃａｍ））および厳格ブロック（組換えＦｃブロック１０μｇ／ｍＬ＋１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ１６、抗ＣＤ３２、および抗ＣＤ６４）条件での２つのＭＤＳＣドナー上の再現スクリーンからの結果から、緩和ブロック条件下で約１０ｎｍのＩＣ５０でのヒトＭＤＳＣへのＡＢ１０１の用量依存的飽和結合を認めた。厳格ブロック条件下では、ＭＦＩの低下により裏付けられるように、全体的なＡＢ１０１の結合低下を認めた。
ＣＤ１６３は、単球／マクロファージ系列由来の細胞のマーカーである。ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＭＤＳＣ上でのＣＤ１６３の発現は、二峰性であると報告されている。ＡＢ１０１の二峰性結合は、ＣＤ１６３発現と相関する可能性があると仮定した。この仮説を試験するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＭＤＳＣを作製し（実施例１１を参照）、実施例８に記載のように抗ＣＤ１６３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３３３６１１）およびＡＦ６４７コンジュゲートＡＢ１０１と共染色し、ＦＡＣＳにより結合を解析した。先ず、細胞をＣＤ１６３高または低としてゲート化し（ｇａｔｅｄ）、次いで、様々な濃度のＡＢ１０１またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照との結合を調べた。ＡＢ１０１抗体が結合していた細胞の亜集団は、ＣＤ１６３Ｈｉ細胞であった。図２を参照されたい。
実施例２－自己単球およびＴ細胞の単離
本実施例は、自己単球およびＴ細胞の単離を示す。当該技術分野で一般的に使用される技法を使用して、ヒト単球およびＴ細胞を入手した。血小板アフェレーシス収集プロセス中に、ＬｅｕｋｏＲｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＲＳ）チャンバとして知られる統合チャンバ内に白血球（ＷＢＣ）を捕捉し、そこからヒト単球およびＴ細胞を単離した。標準密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ（商標）Ｐａｑｕｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ １．０７３，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｎｏ．１７－５４４９－５２）により、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＬＲＳ試料から精製した。上清は廃棄し、ペレットを２０ｍＬ Ｅａｓｙｓｅｐ（商標）緩衝液（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎｏ．２０１４４）の中で再懸濁して、ＰＢＭＣを列挙し、単球およびＴ細胞をさらに単離した。
製造業者の指示に従い、ＥａｓｙＳｅｐヒト単球単離キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｎｏ．１９３５９）を使用して、単球を単離した。
製造業者の指示に従い、それぞれヒトＣＤ３＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ １９０５１）、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｎｏ．１７９５２）、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｎｏ．１７９５３）を使用して、ＣＤ３、ＣＤ４、またはＣＤ８の全Ｔ細胞を単離した。これら陰性選択キットでは抗体を使用し、除去の対象である望ましくない細胞型を標識し、所望の標的細胞を試料から単離することを可能にした。
実施例３－免疫抑制性骨髄細胞へのＡＢ１０１特異的結合
特異性を評価するために、遠赤蛍光色素ＡＦ６４７にコンジュゲートした本発明の抗体、抗体ＡＢ１０１の結合を、ＭＤＳＣ、実施例１１および以下に記載するように生成した免疫抑制性Ｍ２ｃおよび炎症促進性Ｍ１マクロファージを含む異なる細胞型に対して試験した。加えて、健康なドナーのＰＢＭＣから得た別個の免疫集団を、抗体結合について評価した。これら試験それぞれにおいて、少なくとも３つの個別ドナーを使用した。標準手順を用いたＦｉｃｏｌｌ勾配を使用して、ＰＢＭＣを血液から単離した。次いで、免疫細胞集団を鑑別するために、ＰＢＭＣ細胞を造血系統マーカー（ＣＤ４５－ＢＶ４２１（ＢＤ６４２２７５）、ＣＤ３－ＢＶ５１０（ＢＤ５６３１０９）、ＣＤ１１ｃ－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ５６１３５６）、ＣＤ１４－ＦＩＴＣ（ＢＤ３４７４９３）、ＣＤ２０－ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢＤ５６２６４３）、ＣＤ５６－ＰＥ（ＢＤ３４７７４７）、およびＣＤ６６ｃ（ＢＤ５５１４７８））で染色した。別個の系統集団は、以下の発現パターンをさらに特徴とするものであり、これをＡＢ１０１への結合について評価した：Ｔ細胞ＣＤ４５＋ＣＤ３＋、Ｂ細胞ＣＤ４５＋ＣＤ２０＋、単球ＣＤ４５＋ＣＤ１４＋、ＮＫ細胞ＣＤ４５＋ＳＳＣｌｏｗＣＤ１４－ＣＤ３－ＣＤ５６＋、顆粒球ＣＤ４５＋ＳＳＣＨｉＣＤ１４－ＣＤ６６＋、および樹状細胞ＣＤ４５＋ＣＤ１４－ＣＤ６６－ＣＤ１１ｃ＋。小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ、＃ＣＣ－２５４７）、腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ、＃ＣＣ－２５５３）、肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ、＃ＣＣ－２５２７）、臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、＃Ｃ２５１９Ａ）、大動脈平滑筋細胞（ＡＯＳＭＣ、＃ＣＣ２５７１）、およびケラチノサイト（＃００１９２６２７）を含む、原発性ヒト非免疫細胞（Ｌｏｎｚａ）への結合抗体も評価した。これらの細胞を、細胞型特異的培地および製造業者の指示に従う条件で、集密度６０～７０％になるまで培養し、これを採取して、フローサイトメトリーにより抗体結合を試験した（図４および図５）。
標準の方法により単離した単球から、ｉｎ ｖｉｔｒｏ単球ＭＤＳＣを生成した。０日目、単球をＲＰＭＩ１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３００２７．０２、無血清）の中１．５×１０５／ｃｍ２で播種し、５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートし、次いで、予め温めたＲＰＭＩで洗浄してから、ＭＤＳＣ培地（ＲＭＰＩ＋１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３００７０．０３）＋５０ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２１５－ＧＭ－０１０）＋５０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２０６－ＩＬ－０１０）、Ｔ７５フラスコごとに２０ｍＬ）を細胞に添加した。次いで、細胞を５％ＣＯ２、３７℃で７日間、培地を変更することなく培養した。７日後、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３００２８．０３）＋２ｍＭ ＥＤＴＡで２回洗浄し、次いでＴ７５フラスコごとに１ ５ｍＬで冷たいマクロファージ剥離用試薬（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ Ｃ－４１３３０）を添加し、続いて２～８℃で４０分間インキュベーションを行うことにより、細胞を採取した。フラスコを手のひらで軽く叩いて細胞を取り出し、これを集めてＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡで１：１に希釈した。円錐管の中、４５０ｘｇで１５分間遠心分離を行い細胞をペレット状にし、ＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡで１回洗浄し、計数し、ＦＡＣＳブロッキング緩衝液（緩和染色条件ではＰＢＳ＋１％ ＦＢＳ＋０．１μｇ／ｍＬ Ｆｃブロック（Ａｂｃａｍ Ａｂ９０２８５）、または厳格染色条件ではＰＢＳ＋１％ＦＢＳ＋Ｆｃブロックおよび＋０．０１μｇ／ｍＬ ＣＤＲブロック（ＦｃＲ ＣＤ１６、ＣＤ３２、およびＣＤ６４に対する抗体、それぞれＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５６６１７、５５７３３３、および５５５５２５））の中、１×１０７／ｍＬで再懸濁した。細胞をＦＡＣＳブロッキング緩衝液の中、室温（Ｒ Ｔ）で２０分間（ｍｉｎ）インキュベートし、次いで４℃で３０分間インキュベートした。その後、ＦＡＣＳ緩衝液＋５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａ３０５９）で細胞を１×１０６細胞／ｍＬに希釈し、細胞４０μＬ（４×１０４の細胞）をウェルに等分して染色を行った。一次抗体（２０、６、２、０．７５、０．２５、０．０８、および０．０２μｇ／ｍＬでのＡＢ１０１、または６μｇ／ｍＬでのヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照）を細胞に加え、室温で９０分間インキュベートした。２５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液＋５％ＢＳＡで細胞を３回洗浄した。二次ＡＰＣヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩＲ１０９－１３６－０９７）抗体を、（１：１０００の希釈で）ＦＡＣＳ緩衝液＋ＢＳＡ＋ｅ７８０生体色素中、１：２５０で調製し、細胞に添加した（ウェルごとに５０μＬ）。４℃で４５分間のインキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液２５０μＬ中で３回洗浄した。次いで、細胞をウェルごとに１００μＬの４％ＰＦＡ中、室温で１０～１５分間固定し、ＦＡＣＳ緩衝液２５０μＬで１回洗浄し、６５０ｘｇで５分間ペレット状にし、次いでＦＡＣＳ緩衝液１００μＬ中で再懸濁して、フローサイトメトリーにより解析した。
図３に示すように、ＡＢ１０１抗体は、ヒト免疫抑制性骨髄細胞（Ｍ２ｃマクロファージおよび単球性ＭＤＳＣ）に結合する。この図は、ＡＢ１０１またはアイソタイプ染色のＭＦＩをＭ２ｃ、Ｍ１、およびＭ０上にプロットする図である。ＡＢ１０１抗体は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、単球、および樹状細胞の染色（黒色の曲線）とアイソタイプ対照（灰色の曲線）との比較を示す図４に示すようにＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および顆粒球には結合せず、ならびに、ＡＢ１０１抗体は、図５に示すようなＳＡＥＣ、ＲＰＴＥＣ、ＨＭＶＥＣ、ＨＵＶＥＣ、ＡＯＳＭＣ、およびケラチノサイトなどの非免疫細胞には結合しない。このため、ＡＢ１０１抗体は、他の免疫細胞または非免疫細胞に影響を及ぼすことなくＣＤ１６３発現免疫抑制性骨髄細胞に特異的に結合する。
実施例４－ＡＢ１０１ ＦｃＮｕｌｌ抗体によるＣＤ１６３ポリペプチドの免疫沈降
本実施例は、配列番号９を含む軽鎖と配列番号１１を含む重鎖とを含むＡＢ１０２と命名されたＦｃ受容体（Ｆｃヌル）への抗体の結合を実質的に低下させるよう修飾されたＩｇＧ１配列中にＡＢ１０１可変ドメインを含むＦｃＮｕｌｌ抗体を用いた、ＣＤ１６３の免疫沈降を示す。Ｋｌｏｃｋｅｎｂｕｓｃｈ ａｎｄ Ｋａｓｔ，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９２７５８５（２０１０）に基づき、免疫沈降（ＩＰ）を行った。より古典的な架橋ＩＰ手法でパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定液の前に、またはビス（スルホクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）架橋、続いてＩＰの前に、抗体を追加した。
ＰＦＡ手法を用いた架橋を含むＩＰにおいて、単球をヒト血液から単離し、次いで実施例２と実施例１１のプロトコルを用いてＭ２細胞に極性化させ、Ｍ２マクロファージを、マクロファージ剥離用試薬（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＤＸＦ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｎｏ．Ｃ－４１３３０）により３７℃で最大１０分間インキュベーションを行った後にプレートから剥離し、その間、細胞は寄せ集まって剥離し始めていた。フラスコをしっかりと叩き、細胞剥離を促した。剥離後、細胞にＦＡＣＳ緩衝液を添加することにより、マクロファージ剥離試薬を急冷した。細胞を３００ｘｇで１０分間かけてペレット状にし、上清を取り除いた。５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）および１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０を含有する３０ｍＬのＰＢＳ中で細胞ペレットを再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。
細胞をアリコートごとに１５×１０６細胞（アリコートごとに５ｍＬ）の６つのアリコートに分割し、それぞれにビオチン化抗体を添加した。２つのアリコートにマウスＩｇＧ１抗ｈＣＤ１６３をそれぞれ５０μｇ投与し（Ｒ＆Ｄ，Ｎｏ．ＭＡＢ１６０７）、２つのアリコートにアイソタイプ対照抗体ＩＳＯ２（Ｆｃヌルフレームワーク中）をそれぞれ１００μｇ投与し、残り２つのアリコートには試験抗体ＡＢ１０２（Ｆｃ受容体（Ｆｃヌル）への結合を大幅に低下させるよう修飾されたＩｇＧ１配列にＡＢ１０１可変ドメインを含む）をそれぞれ１００μｇ投与した。細胞を４℃で１時間（ｈｒ）インキュベートし、時折、管を反転させることにより軽く混合を行った。細胞を３００ｘｇで５分間かけてペレット状にし、ＰＢＳ－ＥＤＴＡで３回洗浄し、次いで、５ｍＬのＰＢＳ（マグネシウムまたはカルシウムなし、ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｎｏ．ＳＨ３００２８．０２）中で再懸濁した。パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、０．８％の５ｍＬ）を各管に添加し、最終ＰＦＡ濃度を０．４％とした。細胞をＰＦＡ中、室温で５分間、軽く揺動させながらインキュベートした。細胞を８００ｘｇで５分間の遠心分離によりペレット状にし、上清を取り除いた。１．２５Ｍグリシンを含有する１０ｍＬの氷冷ＰＢＳ中で細胞を再懸濁し、急冷した。細胞を８００ｘｇで５分間かけてペレット状にし、氷冷ＰＢＳ中で再懸濁した。細胞を８００ｘｇで５分間かけてペレット状にし、１ｘプロテアーゼ阻害剤を含有する１．０ｍＬのＲＩＰＡ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｏ．８９９００）中で再懸濁した。細胞を氷上で２時間インキュベートし、次いで２ｍＬのＤｏｕｎｃｅホモジナイザーを１５回通過させた。
細胞溶解物をハンギングバケット遠心分離機で回転させて核をペレット状にし、上清をＩＰに使用した。タンパク質溶解物（５０μＬ）を入力画分として取っておき、１ｘプロテアーゼ阻害剤を含有する２．０ｍＬの冷たいＰＢＳを残りの上清に添加した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（２５０μＬ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｏ．６５６０１）を各試料に添加し、これらを４℃で一晩回転させた。翌日、ＳｔｅｍＣｅｌｌマグネットでビーズを集め、上清を取り除いた。５ｍＬのＰａｒｏ緩衝液Ｉ、５ｍＬのＰａｒｏ緩衝液ＩＩ、および５ｍＬのＰａｒｏ緩衝液ＩＩＩを用いて、ビーズを４℃で５分間、連続洗浄した（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７； ８（７）：１１１０５－１１１１３）。次いで、ビーズを冷たいＰＢＳで３回洗浄し、最後に１００μＬのＰＢＳ中で再懸濁し、－８０℃で冷凍した。
ビーズを質量分析により解析した。この解析は、一般的に、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １０（３）：Ｍ１１０．００５６１１（２０１１）に記載される方法に従い実施した。この方法では、ホルムアルデヒド架橋の逆転、およびストレプトアビジンビーズからのタンパク質溶出を、６Ｍグアニジン、１５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．３）を用いて６０℃で３時間、一定の撹拌を行いながら実施した。上清を変性させ、還元し、１０ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）－ホスフィン（ＴＣＥＰ）および５０ｍＭクロロアセトアミド（ＣＡＡ）と同じ緩衝液中、９５℃で１０分間かけてアルキル化した。次いで、試料を１０倍に希釈し、３７℃で一晩かけてトリプシン１．３μｇで消化した。ペプチドをＣ１８カートリッジにより浄化した。ＡＢ１０２ＩＰの複製物１つ、および抗ＣＤ１６３ＩＰの複製物１つを、直接ＭＳ／ＭＳ解析のためにＣ１８カートリッジから溶出した。ＡＢ１０２ＩＰの複製物１つ、および抗ＣＤ１６３の複製物１つを、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．５において０．１Ｍホルムアルデヒド－ｄ２、０．４Ｍシアノ水素化ナトリウムでインキュベートして、重ジメチル化（ｄ４）で標識した。ＩＳＯ２（Ｆｃヌル）ＩＰの両複製物を、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．５において０．１Ｍホルムアルデヒド、０．４Ｍシアノ水素化ナトリウムで１時間インキュベートして、Ｃ１８カートリッジ上で軽ジメチル化（ｄ０）で標識した。次いで、Ｃ１８カートリッジを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で洗浄し、８０％アセトニトリル（ＡＣＮ）で溶出した。ｄ０／ｄ４ジメチル化ペプチドを緩衝液Ａ（２０％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡ）中で再懸濁し、混合した。室内で調製したマイクロキャピラリーＨＰＬＣ強カチオン交換カラム（ＳＣＸ）（２００ｍｍ×２０ｃｍ、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｘ ＳＣＸ３μｍ、Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ペプチドを分画した。緩衝液Ａの中で平衡化したマイクロキャピラリーカラムにペプチドを充填し、緩衝液Ａで洗浄した。３０％、５０％の緩衝液Ｂ（ギ酸アンモニウム８００ｍＭ、２０％ＡＣＮ、ｐＨ２．８）を含有する２０μＬの緩衝液Ａで結合ペプチドを溶出し、続いて緩衝液Ｄ（０．５Ｍ酢酸アンモニウム、５０％ＡＣＮ）で２０μＬを溶出した。Ｓｐｅｄｅ－Ｖａｃによりすべての試料を乾燥し、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｏｒｉｔｒａｐ－Ｆｕｓｉｏｎにより直接解析した。Ｃｏｍｅｔ検索エンジンによりヒトＵｎｉＰｒｏｔデータベースに対してスペクトルを検索した（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｏｍｅｔ－ｍｓ／）。脱メチル化ラベルにおいて、Ｎ末端およびＬｙｓ側鎖上での２８．０３Ｄａ（ｄ０ジメチル化に対する）および３２．０６Ｄａ（ｄ４ジメチル化に対する）の差動修飾を使用した。
強カチオン交換カラム（２００ｍｍ×２０ｃｍ、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｘ ＳＣＸ ３μｍ、Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、重／軽試料をインラインＨＰＬＣカラムに通し、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｏｒｉｔｒａｐ－Ｆｕｓｉｏｎを使用してＭＳ／ＭＳに晒した。重および軽標識試料では、完全にメチル化されたスペクトルのみを含めた。すべてのペプチドが重同位体を包含していた場合に、８９個のタンパク質を特定した。これにより、タンパク質は陰性対照ではなくＡＢ１０２ＩＰにおいて特定されたことを認めた。ＡＢ１０２ＩＰに固有の８９個のタンパク質のうち１２個、すなわちＣＤ１６３、ＲＩＰＫ１、ＮＥＵＡ、ＳＬＣ３１、ＬＲＰ８、ＳＬＩＴ１、ＲＡＦ１、ＩＬＫ、ＡＴＲＮ１、ＭＣＡ３２、ＦＮＢＰ２、およびＬＲＲＮ３を、細胞表面上にもっともらしく存在すると考えた。１つの追加のタンパク質としてＴＮＲ５は、２つの重メチル化ペプチドと１つの非メチル化ペプチド（ＩＰ由来不明）を有していたことが分かった。これにより、ＡＢ１０２ＩＰに対して排他的である可能性が裏付けられた。
ＡＢ１０２ＩＰの複製物１つおよび対照抗ＣＤ１６３ＩＰの複製物１つに由来するペプチドを、質量分析により個別に解析した。ＡＢ１０２ＩＰ中で特定した３６０個のタンパク質のうち４５個を、膜結合または分泌された可能性があるとして精選した。他のデータセット中で特定したタンパク質のうち、ＣＤ１６３、ガレクチン－１、ガレクチン－３、およびペプチジループロリルシス－トランスイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）を、ＡＢ１０２ＩＰに見出した。ＣＤ１６３と直接相互作用すると報告されているカゼインキナーゼＩＩｂも、このデータセット中で特定した。
ＢＳ３手法を使用する架橋によるＩＰでは、上清をフラスコから２５０ｍＬ遠心分離管へと集めることにより、マクロファージを採取した。冷たいマクロファージ剥離用試薬（３０ｍＬ）を各フラスコに加え、４℃で４５分間インキュベートした。次いで、フラスコをスクレーパーで掻き取り、細胞を２５０ｍＬ遠心分離管の中に集め、６５０ｘｇで１０分間遠心分離した。培地を吸引し、細胞ペレットは管の中に残した。次いで、細胞を２０ｍｌの冷たいＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡの中で再懸濁した。
次いで、ＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡで細胞を１×１０７細胞／ｍＬに希釈し、３つの体積として４０％、４０％、および２０％総体積に分割した。ＡＢ１０２（２．５ｍｇ）を４０％画分の１つに添加した。ＦｃＮｕｌｌフレームワーク（２．５ｍｇ）中の抗ＰＤＬ１抗体を、陽性対照であった他の４０％画分に添加した。アイソタイプ対照（ＦｃＮｕｌｌフレームワーク中のＩＳＯ２、１．２５ｍｇ）を、陰性対照であった２０％画分に添加した。各画分を４℃で２時間、軽く混合しながらインキュベートした。次いで、これらを６５０ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を慎重にデカントした。ペレットをそれぞれ１５ｍＬ ＰＢＳ＋ＥＤＴＡ中で再懸濁し、次いで６５０ｘｇで１０分間遠心分離した。次いで、この洗浄工程を繰り返した。次に、ペレットを壊さずに洗浄緩衝液を慎重に取り除いた。４０％画分のペレットを、架橋緩衝液２ｍＬ中で再懸濁した。４０％画分のペレットを、架橋緩衝液１ｍＬ中で再懸濁した。５０ｍＭ ＢＳ３のストック濃度を、各８ｍｇバイアルごとに超純水７０μＬに溶かした。ＢＳ３（６０μｌ／ｍＬの細胞）を、再懸濁した各細胞画分に添加して最終濃度を３ｍＭ ＢＳ３とし、各細胞画分を軽く旋回させることにより混合した。次いで、細胞画分を氷の上で１時間インキュベートし、旋回させて１０分毎に混合した。ＢＳ３インキュベーションの後、クエンチ溶液１５ｍＬを細胞に直接添加し、室温で１５分間インキュベートした。細胞を１２００ｘｇで１５分間遠心分離し、クエンチ緩衝液を慎重にデカントした。先述のように、ペレットをＰＢＳ＋ＥＤＴＡで１回洗浄した。次いで、溶解緩衝液２０ｍＬ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＩＰ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ＃８７７８８）を各４０％画分に添加し、１０ｍＬを２０％画分に添加することにより細胞を溶解し、続いて氷の上で１５分間インキュベートした。次いで、細胞溶解物を１３，０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離した。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅレジン（ＧＥ Ｈ Ｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏ．１７５４３８０１）を、調製した細胞のＩＰおよびタンパク質精製に使用するために調製した。滅菌Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅを、２０カラム体積（ＣＶ）の滅菌ＰＢＳで平衡化した。ＡＢ１０２および陽性対照試料には１５０μｌのＭａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅを使用し、ＩＳＯ試料には７５μｌを使用した。次いで、滅菌および平衡化Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅレジンを、５０ｍＬ円錐管に移した。遠心分離後、調製したＭａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅレジンとともに上清を管に加えた。試料を４℃で回転混合しながら一晩かけてインキュベートした。翌日、試料を氷の上で１０分間沈降させた。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅレジンをピペットにより使い捨てドリップカラムに移した。レジンを２０カラム体積の滅菌ＰＢＳで洗浄した。溶出前に、カラムを回収管に入れ、エッペンドルフベンチトップマイクロ遠心分離機の中９，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離して、過剰な液体を取り除いた。カラムの底にはストッパーを配した。ストッパーを配したカラムに溶出緩衝液として１カラム体積の５０ｍＭグリシンｐＨ２．５を加え、ピペットで混合し、次いで混合物を室温で８分間インキュベートすることにより、細胞を溶出した（全体積（レジンおよび溶出緩衝液）の１０分の１を各試料から取り除き、ウェスタンブロット解析による架橋判定のために取っておいた。以下を参照）。残りの試料は、１／１０体積の２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を添加することにより中和した。カラムの底からストッパーを取り外し、直ちに滴下カラムを１．８ｍＬエッペンドルフ遠心分離管に入れることにより、溶出液を回収した。カラムアセンブリを９，０００ｒｐｍで３０秒間、ベンチトップ微小遠心分離ユニット中で遠心分離した。１／１０体積の滅菌２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を溶出画分に加えることにより、溶出液を中和した。溶出プロトコルを繰り返し、完全なタンパク質除去を確実にした。溶出液画分は、ウェスタンブロットにより架橋を認めるまで－８０℃で保存した。
架橋の確認のためのウェスタンブロット解析
保存した溶出画分をＬａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｎｏ．１６１－０７４７）＋１０％２－メルカプトエタノールと混合した。試料を９０℃で１０分間加熱した。試料を４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ勾配ポリアクリルアミドゲルに充填した。ゲルを２００Ｖで８０分間流した。充填後、ゲルをＰＶＤＦウェスタンブロット膜に移し、４℃、２５Ｖで一晩流した。翌朝、ブロットをＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｏ．３７５１５）により室温で３時間遮断した。遮断後、膜をＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋの中、１回洗浄した。ウェスタンブロットを１：１０００の抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰにより４℃で一晩かけてプロービングした。翌日、１回につき１０分のＰＢＳＴで、ブロットを４回洗浄した。ウェスタンブロットをＰＢＳで１回、１０分間洗浄した。次いで、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｏ．３４０７６）を用いてウェスタンブロットを発達させた。曝露に際して、ウェスタンブロットにより、ＡＢ１０２の陽性架橋を表す明白な過度に推移した帯（ｓｕｐｅｒ－ｓｈｉｆｔｅｄ ｂａｎｄ）を認めた。陽性対照抗体についても架橋帯を観察した。予想どおり、ＩＳＯでは分子量推移を観察しなかった。
次いで、残りの試料をアセトン沈殿させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で流し、次いで、架橋帯を切除し、質量分析評価のために調製した。溶出試料（ＡＢ１０１、ＩＳＯ、および上記からの陽性対照）を解凍した。冷たい（－２０℃）アセトンの４倍溶出液体積を、各試料に添加した。次いで、試料を激しくボルテックスし、－２０℃で１時間インキュベートした。試料を１５，０００ｘｇで１０分間遠心分離した。ペレットを破壊しないように注意しながら、上清をデカントした。ペレットを速度ｖａｃで５分間、または液体が蒸発するまで乾燥させた。ペレットを管ごとに１５μｌの中で再懸濁し、溶解するまで混合した。溶出液を各条件ごとに組み合わせた。試料を充填した緩衝液＋１０％２－メルカプトエタノールを添加し、試料を９０℃で５分間加熱した。各試料５マイクロリットルを、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｏ．Ｓ１２０００）解析のために保存した。残りの試料の全体積を、４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ勾配ポリアクリルアミドゲルに充填し、ゲルの上で８０分間、２００Ｖで流した。ゲルをカセットから取り除き、質量分析等級の水で３×１０分間洗浄した。次いで、ゲルをＳａｆｅ Ｓｔａｉｎ ｂｌｕｅで１時間染色した。染色をデカントし、次いでゲルを１回につき３０分間、２回洗浄することにより、質量分析等級の水で脱染色した。メスおよびピンセットの広範囲にエタノール（Ｅｔｏｈ）を噴霧してから、架橋帯をゲルから切除し、滅菌エッペンドルフ管に入れた。ゲル切片を覆うのに十分な滅菌超純水で管を満たし、湿った氷の上に充填し、ＭＳ Ｂｉｏｗｏｒｋｓに送った。
ＭＳ Ｂｉｏｗｏｒｋｓが質量分析を行った。質量分析において、提出した各試料をすべて、先ず２５ｍＭ重炭酸アンモニウム、続いてアセトニトリルで洗浄することによりＰｒｏＧｅｓｔロボット（ＤｉｇｉＬａｂ）を用いたトリプシンでのゲル内消化を行い、６０℃で１０ｍＭジチオトレイトールによる還元、続いて室温で５０ｍＭヨードアセトアミドでのアルキル化を行い、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）により３７℃で４時間消化した後、ギ酸で急冷し、消化物をプールし、さらに処理することなく解析することにより、処理した。次いで、各消化試料を、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｆｕｓｉｏｎ ＬｕｍｏｓにインターフェースしたＷａｔｅｒｓ Ｍ－Ｃｌａｓｓ ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＨＰＬＣシステムを用いたｎａｎｏ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより解析した。ペプチドを捕捉カラム上に充填し、７５μｍ解析カラム上で３５０ｎＬ／分で溶出し、両カラムにＬｕｎａ Ｃ１８レジン（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｎｏ．００Ｃ－４０４１－Ｅ０）を充填した。質量分析計をデータ依存モードで作動させ、Ｏｒｂｉｔｒａｐは、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳに対して６０，０００ＦＷＨＭと１５，０００ＦＷＨＭで、３ｓサイクル時間で作動した。高度なピーク判定が可能になった。４時間の器具時間を使用／サンプリングした。ＭＳ Ｂｉｏｗｏｒｋｓによるデータ処理では、以下のパラメータとともにＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）のローカルコピーを使用してデータを検索した：酵素：トリプシン／Ｐ、データベース：Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ Ｈｕｍａｎ（連鎖状のフォワードおよびリバースと、一般的に起こり得る汚染）、固定修飾：カルバミドメチル（Ｃ）、可変修飾：酸化（Ｍ）、アセチル（Ｎ－ｔｅｒｍ）、Ｐｙｒｏ－Ｇｌｕ（Ｎ－ｔｅｒｍ Ｑ）、脱アミド化（Ｎ／Ｑ）、質量値：モノアイソトピック、ペプチド質量許容値：１０ｐｐｍ、フラグメント質量許容値：０．０２Ｄａ、Ｍａｘ Ｍｉｓｓｅｄ Ｃｌｅａｖａｇｅｓ：２。検証、フィルタリング、およびサンプルごとの非冗長リストの作成のために、Ｍａｓｃｏｔ ＤＡＴファイルをＳｃａｆｆｏｌｄ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）へと構文解析した（ｐａｒｓｅｄ）。データを１％タンパク質およびペプチドＦＤＲでフィルタリング氏、タンパク質ごとに少なくとも２つの固有のペプチドが必要であった。スペクトル豊富因子（ＳＡＦ）を正規化スペクトル豊富因子（ＮＳＡＦ）に変換し、これを使用して、所与の試料内のタンパク質の相対的存在量、および試料間の所与のタンパク質の相対的存在量を近似させた。
ＭＳ ＢｉｏｗｏｒｋｓからのＢＳ３架橋データに観察したタンパク質の検査は、ＰＦＡを含む上記ＩＰで特定された標的の完全な列記を裏付けるものではなかった。ガレクチン－３を重および軽データセットの両方に見出し、表現は軽データセットの方が大きかった。ガレクチン－１を重および軽データセットの両方に見出し、３／５のペプチドのみを重アイソトープで標識した。ＬＩＬＲＢ２は観察されず、ｕＰＡＲも観察されなかった。ＰＰＩＡを重データと軽データの両方で見出し、ともに表現はほぼ等しかった。図６Ａは、ＡＢ１０２の上位２０個の標的を示す。図６Ｂは、ＡＢ１０２の上位細胞表面標的を示す。図６Ｃは、アイソタイプ陰性対照（ＩＳＯ）と比較したＡＢ１０２の上位細胞表面標的を示す。ＢＳ３架橋剤を使用してＡＢ１０２により免疫沈降した細胞表面タンパク質のうち、ＣＤ１６３のスペクトル豊富因子（ＳＡＦ）は、最高であった。ＣＤ１６３は、ＰＦＡおよびＢＳ３両方の方法によりＡＢ１０２で免疫沈降させた。ＳＡＦは、各標的のタンパク質サイズ（分子量）に正規化したスペクトル数であり、図６Ａと６ＢのＳＡＦ値は、各標的のアイソタイプ対照についてＳＡＦから減算したＡＢ１０２の値である。
実施例５－ＦｃＮｕｌｌフレームワーク中のＡＢ１０１抗体によるＣＤ１６３のグリコ型の免疫沈降
グリコシル化は、タンパク質の立体配座、安定性、および機能に影響を及ぼす高度に調節された翻訳後修飾であり、タンパク質間相互作用（すなわち、その同族受容体へのリガンドの結合）を確立する上で重要な役割を果たす。ＡＢ１０２抗体、および拡張によりＡＢ１０１は、ＣＤ１６３の明確な高分子量グリコ型に対する特異性を有しており、免疫抑制性マクロファージの活性に必要な他のタンパク質とＣＤ１６３との相互作用に影響を及ぼす可能性がある。
ＡＢ１０１ ＦｃＮｕｌｌ抗体は、Ｆｃ受容体（Ｆｃヌル）への抗体の結合を大幅に低下させるように修飾したＩｇＧ１配列にＡＢ１０１可変ドメインを含み、ＡＢ１０２と称される。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔおよびＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎによる解析では、１２μｌの４ｘ ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｎｏ．ＮＰ０００７）を１０％２－メルカプトエタノールと共に、実施例４のＰＢＳビーズの２５μＬのアリコートに加え、９５℃で２５分間インキュベートした。試料を４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ勾配ポリアクリルアミドゲルに流した。直接可視化のために、製造業者の指示に従いＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎでゲルを染色した。ウェスタンブロットのために、タンパク質を４℃で一晩かけて、２０ＶでＰＶＤＦ膜に移した。翌朝、膜を５．０ｍＬのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｎｏ．３７５１５、Ｔｗｅｅｎ ２０なし）の中で１時間遮断した。一次抗ＣＤ１６３抗体（ヤギＩｇＧポリクローナル、Ｒ＆Ｄ，Ｎｏ．ＡＦ１６０７）を、１μｇ／ｍＬの濃度で膜に添加した。一次Ａｂにおいて約３時間インキュベーション（室温で揺動）した後、膜を約５ｍＬのＰＢＳＴで３回洗浄し、１回につき５分間洗浄した。洗浄後、１：１０，０００（ｖ／ｖ）ＨＲＰコンジュゲート抗ヤギＦ（ａｂ’）２特異的二次Ａｂ（様々なベンダー）を含有する５ｍＬのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｔｗｅｅｎ２０なし）を膜に添加し、室温で約１時間インキュベートした。二次Ａｂでインキュベーションした後、膜を５ｍＬ ＰＢＳＴで３回洗浄し、１回につき約５分間洗浄した。製造業者の指示に従い、ＦｏｔｏＤｙｎｅ Ａｎａｌｙｓｔ Ｌｕｍｉｎａｒｙ Ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ ＦＸ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを備えたＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを使用して、膜を撮像した。
図７に示すように、ＡＢ１０２は、ＣＤ１６３の明確な高分子量グリコ型を免疫沈降させる。矢印で示す二重項の帯はともに、おそらくＣＤ１６３の明確なグリコ型である。
実施例６－マウスではなくヒト組換えＣＤ１６３タンパク質に対するＡＢ１０１の結合
本実施例は、ＡＢ１０１が、マウスではなくヒト組換えＣＤ１６３タンパク質に結合することを示す。Ｈｉｓタグを付けた組換えヒトＣＤ１６３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｏ．１６０７－ＣＤ－０５０）および組換えマウスＣＤ１６３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｏ．７４３５－ＣＤ－０５０）タンパク質へのＡＢ１０１結合は、ＥＬＩＳＡを用いて判定した。組換えタンパク質をＰＢＳ中で５μｇ／ｍＬに希釈し、３８４ウェルの高結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ，Ｎｏ．７８１０６１）に２５μＬ／ウェルで添加し、４℃で一晩インキュベートした。Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬｘ４０５ Ｓｅｌｅｃｔマイクロプレートウォッシャー（洗浄プログラムＥＬＩＳＡ＿３８４＿ＰＢＳ＿３ｘ＿ｗａｓｈ）を使用して、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、９０μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（２％非脂肪、ドライミルク／ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて室温で１時間遮断した。
遮断後、ウェルごとに一次抗体２５μＬをプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。試験抗体はＡＢ１０１であった。対照抗ｈｕＣＤ１６３抗体は、マウスＩｇＧ１フレームワーク（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃ＭＡＢ１６０７）中にある市販の抗体であり、アイソタイプ対照は、既知の特異性を持つヒトＩｇＧ１、ヒトＦｃＮｕｌｌ、およびマウスＩｇＧ１フレームワーク中にある専売のｍＡｂであった。一次抗体の結合後、ＥＬ４０５Ｘ（洗浄プログラムＥＬＩＳＡ＿３８４＿ＰＢＳ＿３Ｘ＿ｗａｓｈ）を使用して、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。抗ｈｕＣＤ１６３の二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ）’２ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｏ．１１５－０３５－０７２）であり、ＡＢ１０１およびＡＢ１０２の二次抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ）’２ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｏ．１０９－０３５－０９７）であった。二次抗体は、２％非脂肪、ドライミルク／ＰＢＳの中で１：２５００に希釈し、ウェルごとに２５μＬをそれぞれのプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。ＥＬ４０５ｘ（洗浄プログラムＥＬＩＳＡ＿３８４＿ＰＢＳ＿４ｘ＿ｗａｓｈ）を使用して、プレートをＰＢＳで４回洗浄した。最終洗浄を取り除いた後、２５μＬ／ウェルの清浄なＵｌｔｒａ－ＴＭＢを添加し、プレートを室温で１０～１５分間インキュベートし、光から保護した。発達後、０．３Ｍ ＨＣｌをウェルごとに２５μＬ添加することにより反応を止め、プレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅ機器を用いて４５０ｎｍで読み取った。
図８に示すように、ＡＢ１０１、ＡＢ１０２、および対照ＣＤ１６３抗体は、本アッセイにおいてｈｕＣＤ１６３に結合したが、アイソタイプ対照では顕著な結合を認めなかった。ＡＢ１０１も対照抗ｈｕＣＤ１６３抗体も、組換えマウスＣＤ１６３に結合しなかったが、市販の抗ｍｕＣＤ１６３抗体は予想どおりに結合した（図９）。
実施例７－ポリクローナル抗ＣＤ１６３抗体による、Ｍ２ｃマクロファージへのＡＢ１０１の結合の遮断
本実施例は、ポリクローナル抗ＣＤ１６３抗体がＭ２ｃ細胞へのＡＢ１０１の結合を遮断することを示す。Ｍ２ｃ細胞上でのＣＤ１６３へのＡＢ１０１の結合の特異性を調べるために、ヒトＣＤ１６３に対する市販のポリクローナル抗体を用いて、遮断実験を行った。
採取したＭ２ｃ細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｎｏ．１５５７５－０３８）の中で再懸濁し（１００μＬにつき１００万個の細胞）、適切な体積のヒトＦｃ－ブロック（細胞１００万個につき組換えヒトＦｃブロック１０μｇ）を添加した。細胞を室温で２０分間インキュベートした。ヤギ抗ｈｕＣＤ１６３ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ，＃ＡＦ１６０７）およびヤギ対照ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ，＃ＰＰ４０）を最終濃度２００μｇ／ｍＬで添加し、室温で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で希釈して最終体積を１００万細胞／ｍＬにし、４０μＬ／ウェルをｖ底ポリプロピレン不透明９６ウェルプレートに移した。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識したＡＢ１０１およびＡＰＣで標識した抗ｈｕＣＤ１６３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃ＦＡＢ１６０７Ａ）抗体を添加し、４℃で９０分間インキュベートした。マルチドロップを用いて、５％ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ緩衝液２５０μＬを各ウェルに添加することにより細胞を洗浄し、３５０ｘｇで５分間遠心分離し、緩衝液を取り除いた。洗浄工程は、洗浄体積３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回繰り返した。生体色素ｅ７８０を含むＦＡＣＳ緩衝液５０μＬ（１：１０００の希釈）を各ウェルに添加し、プレートを室温で２０分間インキュベートした。次いで、マルチドロップを使用してＦＡＣＳ緩衝液２５０μＬを各ウェルに添加することにより細胞を洗浄し、３５０ｘｇで５分間遠心分離し、緩衝液を取り除いた。ＦＡＣＳ緩衝液（７５μＬ）を各ウェルに添加し、ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターを用いて試料解析を行った。
ポリクローナル抗ＣＤ１６３抗体でのＭ２ｃマクロファージの前処理により、Ｍ２ｃマクロファージへのＡＢ１０１抗体（図１０）および対照モノクローナル抗ｈｕＣＤ１６３抗体（図１１）の結合を遮断した。ヤギ対照ポリクローナル抗体でのＭ２ｃマクロファージの前処理では、Ｍ２ｃマクロファージへのＡＢ１０１抗体（図１０）および対照モノクローナル抗ｈｕＣＤ１６３抗体（図１１）の結合は遮断されなかった。

実施例８－極性化後のヒトＭ２ｃマクロファージにおけるＣＤ１６３のｓｉＲＮＡノックダウンはＡＢ１０２の結合を減少させる
この実施例は、極性化後のヒトＭ２ｃマクロファージにおけるＣＤ１６３のｓｉＲＮＡノックダウンがＡＢ１０２の結合を減少させることを示す。この実施例で使用されている方法は、Ｔｒｏｅｇｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９２：６９９－７０８（２０１４）に基づいている。
単離された単球（３人のドナーから）は、６ウェルプレートにおいてウェルあたり１．５×１０６細胞で別々にプレーティングした。４日目に、培地を除去し、１０％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏｔｅｃｈＮｏ．３００－２５）、および５０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１０（ＰｅｐｒｏｔｅｃｈＮｏ．２００－１０）を含む新鮮なＸ－ＶＩＶＯ培地を各ウェルに添加した。６日目に培地を除去し、細胞は１０％ＦＢＳを含む温かいＸ－ＶＩＶＯ培地で２回洗浄した。１ミリリットルのＸ－ＶＩＶＯ培地＋１０％ＦＢＳを各ウェルに添加し、細胞をインキュベーターに戻し、ｓｉＲＮＡトランスフェクション溶液を調製した。
以下のヒトＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓｓｉＲＮＡ－ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を試験した：ＣＤ１６３（カタログ番号Ｌ－００７８４７－００－０００５）、ＳＣＲＡＭ（カタログ番号Ｄ－００１８１０－１０－０５）、ＣＤ２０６（カタログ番号Ｌ－０１１７３０－００－０００５）、ＣＤ１６３Ｌ１（カタログ番号Ｌ－００８０２４－００－０００５）、ＰＰＩＡ（カタログ番号Ｌ－００４９７９－０４－０００５）、ＦＣＧＲ２Ａ（カタログ番号Ｌ－０１４１５２－００－０００５）、ＦＣＧＲ３Ａ（カタログ番号Ｌ－０１６３０８－００－０００５）、ＬＧＡＬＳ１（カタログ番号Ｌ－０１１７１８－００－０００５）、ＬＧＡＬＳ３（カタログ番号Ｌ－０１０６０６－００－０００５）、ＬＩＬＲＢ２（カタログ番号Ｌ－０２００１７－００－０００５）、ＦＣＧＲ２Ｃ（カタログ番号Ｌ－０２７３４０－０２－０００５）、およびＵＰＡＲ（カタログ番号Ｌ－００６３８８－００－０００５）。
ｓｉＲＮＡトランスフェクションを調製するために、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓＳＭＡＲＴ ｓｉＲＮＡプールを使用して、２００μＭのマスターストックを作製した。凍結乾燥オリゴヌクレオチド（各５ｎｍｏｌ）を２５μＬの１×Ｔｈｅｒｍｏ ｓｉＲＮＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｎｏ．Ｂ００２０００）に再懸濁した。アリコートは－８０℃で保存した。次に、これらのマスターストックを細胞グレードの超純水（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｎｏ．ＳＨ３０５２９０２）で希釈して、２０μＭのワーキングストックを作製した。マスターミックス（６ウェルプレートの６つのウェルに十分）を作製するために、以下の試薬を混合した：１２０μＬ ２０μＭ ｓｉＲＮＡプール（最終濃度２００ｎＭ）、２７０μＬのＨｉＰｅｒＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｎｏ．３０１７０５）、および２．６４ｍＬの温かいＲＰＭＩ（ＦＢＳまたはその他の添加剤なし）。ｓｉＳＣＲＡＭ（スクランブルｓｉＲＮＡ）のためのマスターミックスには、７２０μＬ ２０μＭ ｓｉＳＣＲＡＭ、１．２３ｍＬ ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ、および１２．１ｍＬ ＲＰＭＩが含まれていた。混合物を合わせ、反転により定期的に混合しながら、室温で１５分間インキュベートした。使用直前に、チューブを短時間遠心分離し、ｓｉＲＮＡミックス（４９５μＬ／ウェル）を細胞に滴下した。プレートを軽くゆすって混合し、次に３７℃で６時間インキュベートした。インキュベーション後、１０％ＦＢＳおよびＩＬ－１０（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）およびＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｎｏ．３００－２５、最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を含む２ｍＬのＸ－ＶＩＶＯ培地を添加した。翌日、培地を交換して（ＩＬ－１０およびＭ－ＣＳＦ中に保持）、トランスフェクション試薬および死滅しつつある細胞をすべて除去した。
８日目に、フローサイトメトリーのために、マクロファージを拾い上げて抗体で染色するか、またはＲＴ－ｑＰＣＲ用に溶解した。
フローサイトメトリーに使用されるこれらのマクロファージについては、以下の方法が使用された。ｓｉＲＮＡで処理したＭ２マクロファージをマクロファージ剥離液を用いて採取し、剥離液中で４℃にて４５分間インキュベートし、次いでプレートを穏やかにこすり落とした。マクロファージ剥離溶液を、０．２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％ＨＳＡを含む冷ＰＢＳ－／－（カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｎｏ．ＳＨ３００２８．０２）と交換した。細胞を６５０×ｇで５分間スピンダウンし、次いで、１００万細胞あたり０．５ｍＬのコールドブロック溶液（ＦＡＣＳ緩衝液＋１０％ＮＧＳ＋１０μｇのヒトＩｇＧ Ｆｃフラグメントタンパク質（Ａｂｃａｍ Ｎｏ．ａｂ９０２８５））に再懸濁した。細胞を計数し、さらなる計算のために１ｍＬあたり平均１×１０６を使用した。細胞を室温で１５分間インキュベートし（ＦｃＲ結合を増加させるため）、続いて完全なブロッキングのために氷上で３０分間インキュベートした。未染色の細胞のアリコートをコンペンセーション対照のために取っておいた。ｅ７８０生存率色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｏ．６５－０８６５－１８）を、最終希釈率１：１０００で残りに添加した。細胞を９６ウェルプレートに等分し（ウェルあたり４０μＬ）、１０μＬの抗体溶液を各ウェルに添加した。抗体は、ＦＡＣＳ緩衝液中１００μｇ／ｍＬの開始濃度で調製し、ＦＡＣＳ緩衝液で段階希釈した。抗体の添加後、細胞の各セットを抗体パネル（ＡＦ６４７にコンジュゲートしたＦｃＮｕｌｌフレームワーク中のＡＢ１０１およびＢＶ４２１にコンジュゲートした市販の抗ＣＤ１６３ ［ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｎｏ．３３３６１２］）およびアイソタイプパネル（ＡＦ６４７にコンジュゲートしたＦｃＮｕｌｌフレームワーク中のＩＳＯ２およびＢＶ４２１にコンジュゲートした市販のｍＩｇＧ１）を用いてテストした。最終抗体濃度は２０μｇ／ｍＬから０．３μｇ／ｍＬの範囲であった。細胞を一次抗体中４℃で１時間インキュベートし、次いで４５０×ｇでペレット化し、１５０μＬ ＰＢＳ－ＥＤＴＡで３回洗浄した。ペレット化後、細胞を１００μＬ ４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ－／－中）に再懸濁し、室温で１５分間インキュベートした（光から保護した）。固定後、細胞を６５０×ｇで５分間スピンダウンし、ＰＢＳ－ＥＤＴＡで１回洗浄した。細胞を１００μＬのＰＢＳ－ＥＤＴＡに再懸濁し、週末をまたいで４℃で保存した（光から保護した）。次に、ＢＤ ＣａｎｔｏＩＩマシン上のフローサイトメトリーによって細胞を分析した。
細胞の第２のセットは、以下のように、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイにおける使用のために採取した。細胞を緩衝液ＲＬＴ中で採取し、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒｓ（Ｑｉａｇｅｎ Ｎｏ．７９６５４）を含むＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｎｏ．７４１０４）を使用して、ＲＮＡを単離した。溶出後、ＲＮＡを使用して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩファーストストランド合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｏ．１８０８００５１）を使用してｃＤＮＡを作製した。１．５μｇ ＲＮＡに、ＲＮａｓｅを含まない水を加えて最終容量を１０μＬにした。これに、５μＬのＤｎａｓｅＩマスターミックス（（試料あたり）＝１．５μＬ １０×ＤｎａｓｅＩ緩衝液＋２μＬ ＲＮａｓｅを含まない水＋１．５μＬ ＤｎａｓｅＩ酵素）を添加した。試料を十分に混合し、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、１．５μＬ ＥＤＴＡ溶液を加えて反応を停止し、試料を６５℃で１０分間インキュベートし（酵素を死滅させるため）、次いで氷に戻して冷却した。ｄＮＴＰ（１．５μＬ）およびオリゴ－ｄＴ（１．５μＬ）を各試料に加え、十分に混合した。試料を６５℃で５分間インキュベートし、次いで氷に２分間戻した。試料を冷却した後、１３μＬの試料を新鮮なチューブに移し、それぞれに＋ＲＴマスターミックス（７μＬ）を加えた。残りの７．５μＬの試料に、陰性対照試料用の－ＲＴマスターミックス（３．５μＬ）を添加した。＋ＲＴマスターミックスの場合（試料あたり）：４μＬ ５×ファーストストランド緩衝液、１μＬ ０．１Ｍ ＤＴＴ、１μＬ ＲＮａｓｅＯＵＴ、および１μＬ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（上記に言及されたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩシステムのすべての部分）。－ＲＴマスターミックスでは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ酵素をＲＮａｓｅを含まない水に置き換えた。
試料を十分に混合し、２５℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を５０℃で３０分間インキュベートし、続いて５５℃で３０分間のインキュベーション、次いで７０℃で１５分間のインキュベーションを行った。次いで、試料を４℃に冷却し、その後引き続いて氷上に保持した。使用前に、２０μＬのＲＮａｓｅを含まない水を＋ＲＴ試料に添加し、１０μＬのＲＮａｓｅを含まない水を－ＲＴ試料に添加して、ＲＴ－ｑＰＣＲ用のｃＤＮＡを希釈した。
ｑＰＣＲのために、２μＬの希釈されたｃＤＮＡを、０．２μＬの各プライマー（１０μＭのストック濃度）、２．６μＬのＲＮａｓｅを含まない水、および５μＬの２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ Ｎｏ．１７２５２７１）と混合した。未処理の対照細胞の希釈系列を使用して標準曲線を作成した。試料は、温度融解曲線を含むデフォルト設定を使用して、ＳｔｅｐＯｎｅ ｑＰＣＲ装置で実行した。試料は、内在性対照としてのＲｐｌ１７ａの増幅に対して正規化した。
図１２に示すように、（３つの複製物に代表的な）ＣＤ１６３に対するｓｉＲＮＡを用いての、極性化Ｍ２ｃマクロファージの処理は、スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＣＲＡＭ）またはｓｉＲＮＡで処理されていないＭ２ｃマクロファージと比較して、ＡＢ１０２抗体の結合が大幅に減少した。
実施例９－ｓｉＲＮＡノックダウン後の極性化ヒトＭ２ｃマクロファージへのＡＢ１０２結合
この実施例は、様々なｓｉＲＮＡを使用するｓｉＲＮＡノックダウン後の極性化ヒトＭ２ｃマクロファージへのＡＢ１０２の結合を示す。
単球を全血から単離し、ウェルあたり１．５×１０６細胞でプレーティングし（６ウェルプレート）、上記の実施例８に記載されるようにＭ２極性化条件下で培養した。６日目に、培地を交換し、１００ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦおよび５０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１０を添加した。
ｓｉＲＮＡ処理は、以前に記載されたように（実施例８を参照のこと）様々なｓｉＲＮＡを用いて８日目に行われた。翌日、培地を吸引してトランスフェクション試薬および死滅しつつある細胞をすべて除去し、新鮮な培地を加えた（ＩＬ－１０およびＭ－ＣＳＦをまだ含んでいる）。１０日目に、ＦＡＣＳ分析をｓｉＲＮＡ処理細胞で実施し、細胞の第２のセットを、ＲＴ－ｑＰＣＲのためにＲＬＴ緩衝液中で採取した（実施例８を参照）。データは、ｓｉＳＣＲＡＭ処理Ｍ２ｃへのＡＢ１０２結合幾何学的ＭＦＩを１００％として、未処理Ｍ２ｃへのアイソタイプ対照抗体結合幾何学的ＭＦＩを０％として使用して正規化した。
ＣＤ１６３のｓｉＲＮＡノックダウンは、ＡＢ１０２抗体の結合を減少させた。対照的に、図１３に示すような、ＦＣＧＲ２Ａ＋ＦＣＧＲ３Ａ（ドナー３例のうち１例で）、ＦＣＧＲ２Ｃ、またはＦＣＧＲ３Ａに対するｓｉＲＮＡのいくつかのわずかな減少を除いて、ｓｉＣＤ２０６、ｓｉＣＤ１６３Ｌ１、ｓｉＰＰＩＡ、ｓｉＬＧＡＬＳ１、ｓｉＬＧＡＬＳ３、ｓｉＬＩＬＲＢ２、またはｓｉＵＰＡＲを用いるノックダウン後のＡＢ１０２結合の減少の証拠は見られなかった。実際、ＡＢ１０２の結合強度はいくつかのｓｉＲＮＡ条件で増加した。ＲＴ－ｑＰＣＲは、標的の強力なノックダウンを示した。
実施例１０－Ｍ２ｃマクロファージの細胞表面上でのＣＤ１６３発現のＬＰＳ誘導性減少は、マクロファージへのＡＢ１０１結合を減少させる
この実施例は、ＬＰＳ誘導性のＣＤ１６３の脱落後のＭ２ｃマクロファージへのＡＢ１０１の結合の減少を示す。単球を実施例２に記載されるように単離し、１０％ＦＢＳ、５０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ、および５０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１０を含むＸ－ＶＩＶＯ培地を１００μＬ／ウェルで含む平底の組織培養処理した９６ウェルプレート中、１×１０４細胞／ウェルでプレーティングした。７日目に、細胞の半分を１０ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４由来のリポ多糖、Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．Ｌ５２９３－２ＭＬ）で２４時間処理した。細胞は、２００ｎＭから開始して、それぞれの８つの連続５倍希釈を使用して、前述の方法に従って、非コンジュゲート一次抗体、抗ＣＤ１６３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＡＢ１６０７－１００）およびＡＢ１０１のタイトレーションを用いて標識した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体を二次抗体として使用した（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ １０９－６０６－００６）。細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
図１４に示すように、培養されたＭ２ｃマクロファージのＬＰＳによる処理は、ＡＢ１０１抗体と対照抗ＣＤ１６３抗体の両方による結合の喪失を生じた。
実施例１１－ＡＢ１０１によるＴ細胞活性化（ＩＬ－２産生）および増殖の骨髄細胞抑制の遮断
この実施例は、ＡＢ１０１がＴ細胞活性化（ＩＬ－２産生）および増殖の骨髄細胞抑制を遮断することを示す。
Ｔ細胞活性化のＭ２マクロファージ媒介性抑制を軽減する能力を評価するために、Ｍ０、Ｍ１およびＭ２ｃマクロファージがヒト単球から生成された。Ｍ０マクロファージは、３つの処理プロトコルの下でＡＢ１０１またはアイソタイプ対照とともに培養された：１）Ｍ０からＭ２ｃマクロファージへの極性化中のＡＢ１０１（またはアイソタイプ対照抗体）の存在下（５～７日目、「前」条件）、２）極性化後のＡＢ１０１（またはアイソタイプ抗体）の存在下（７日目以降、「後」条件）、または３）条件１と２の組み合わせ（「前」および「後」極性化）。
Ｍ０マクロファージの生成。０日目に、個々のドナー（実施例２に記載されるように単離）からの単球を、Ｍ０培地（Ｘ－ＶＩＶＯ培地＋１０％ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ）中の９６ウェル組織培養プレートの２．５×１０５細胞／ウェルでプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。
Ｍ０マクロファージのＭ１またはＭ２ｃマクロファージへの極性化。５日齢のＭ０マクロファージは、Ｍ０培地１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｎｏ．２００－１０）中で細胞を培養することによりＭ２ｃに、Ｍ０培地＋１００ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－ガンマ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｎｏ．２００－１０）で培養することによりＭ１に極性化された。Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｎｏ．３００－０３）。ＡＢ１０１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照で処理された細胞については、これらの抗体はＭ２ｃ培地中２０μｇ／ｍＬで添加された。６日目に、Ｍ１マクロファージについては、培地を廃棄し、新鮮なＭ０培地＋１００ｎｇ／ｍＬＩＦＮ－ガンマ＋１ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４由来のリポ多糖、Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．Ｌ５２９３－２ＭＬ）を添加した。
自己ドナーからのＰＢＭＣを使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した（実施例２に記載されているように）。マクロファージとの共培養の日（７日目）まで、Ｔ細胞をＸ－ＶＩＶＯ＋１０％ＦＢＳ中で一晩Ｔ７５フラスコにプレーティングした。
フローサイトメトリーによる色素希釈を使用して複数世代の追跡を可能にするＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット増殖色素キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｎｏ．Ｃ３４５５７）を使用して、共培養の前にＴ細胞を染色した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）染色は、メーカーのプロトコルに従って実施した。
７日目に、プレーティングされたマクロファージから上清を除去し、培地を１００μＬのＸ－ＶＩＶＯ培地＋１０％ＦＢＳ＋０．５μｇ／ｍＬのＯＫＴ３と交換した。マクロファージを３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。Ｔ細胞をフラスコから採取し、「Ｐｒｅ／Ｐｏｓｔ極性化」および「後極性化」処理のために、ＡＢ１０１（２０μｇ／ｍＬ）またはアイソタイプ対照（２０μｇ／ｍＬ）の非存在下または存在下で、平底９６ウェルプレート中、１００μＬ／ウェル（１１５万／ｍＬ）で１１５，０００Ｔ細胞にて再懸濁した。Ｔ細胞を１００μＬの容量でマクロファージに添加して、２００μＬ／ウェルの最終容量および０．２５μｇ／ｍＬのＯＫＴ３の最終濃度を得た。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。８日目に、上清を採取した。ＩＬ－２レベルは、ＣｉｓＢｉｏ ＨＴＲＦ ＩＬ－２キット（Ｎｏ．６２ＨＩＬ０２ＰＥＧ）を使用して、製造元のプロトコルに従って、次の変更を加えて測定した。アッセイは、少量の３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ Ｎｏ．７８４０７５）で実施し、すべての容量を半分にし、そしてプレートを短時間回転させて泡を表面に移動させた。
図１５に示すように、ＡＢ１０１抗体は、Ｔ細胞の刺激および増殖のマーカーであるＩＬ－２産生の増加によって証明されるように、骨髄細胞がＴ細胞の活性化を抑制する能力を遮断した。細胞は、「前」条件である、極性化の間（ＩＬ－１０を用いる）、ＡＢ１０１またはアイソタイプ対照で処理された。
１０日目に、各９６ウェルプレートからの共培養されたＴ細胞を、Ｖ底の９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｎｏ．２４９９４６）に移し、３００×ｇで２分間遠心分離することによりペレット化した。ペレットをＰＢＳ（０．５μＬ／ｍＬ）中の１００μＬのｅ７８０生存率色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｎｏ．６５－０８６５－１４）に再懸濁し、暗所にて室温で１０分間インキュベートした。
ｅ７８０染色に続いて、１５０μＬ ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ＋１％ＦＢＳ）を加えることによって細胞を洗浄し、３００×ｇで２分間遠心分離した。上清を除去した。細胞ペレットを５０μＬ／ウェル ＦＡＣＳブロック（ＦＡＣＳ緩衝液中の５μＬ／１００μＬのヒトＴｒｕＳｔａｉｎＦｃＸ（商標）［Ｆｃ受容体ブロッキング溶液、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｎｏ．４２２３０２］）に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。
抗体カクテル（２×）は、１：５０希釈（最終濃度は１：１００）のＡＰＣ標識抗ＣＤ８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｎｏ．５６１９５３）および１：５０希釈のＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１４（最終濃度は１：１００）（ＢＤ Ｎｏ．３４７４９３）を含むＦＡＣＳブロックを使用して作製した。この抗体カクテルを５０μＬ／ウェルで添加し、暗所にて氷上で３０分間インキュベートした。染色液を１５０μＬ／ウェルＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。細胞を３００×ｇで２分間ペレット化した。上清を除去し、細胞を２５μＬの４％ＰＦＡで１５分間、暗所にて氷上で固定した。フローサイトメーターでの分析前に、７５μＬ／ウェルのＰＢＳを添加した。
図１６および図１７に示されるように、ＡＢ１０１抗体は、極性化の間のＡＢ１０１処理により、それぞれ、ＯＫＴ３誘導性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を可能にした。さらに、図１８に示されるように、極性化後、ＣＤ３＋Ｔ細胞との共培養の間のもの（グラフ上で「Ｐｏｓｔ」と表示）、または極性化の間および後（グラフで「ＰｒｅおよびＰｏｓｔ」と表示）を組み合わせたものである、ＡＢ１０１抗体を用いる処理は、アイソタイプ抗体処理と比較した場合の、ＩＬ－２産生の増強をもたらした。これらの結果は、ＡＢ１０１のＭ２ｃマクロファージへの結合が、Ｍ２ｃ媒介Ｔ細胞増殖とＩＬ－２産生の抑制を緩和することを示す。ＡＢ１０１処理は、ＩＬ－１０を用いる極性化中に有効であり、構成的に抑制シグナルを克服し、Ｍ２ｃ極性化後に有効であり、これは、インビボでの腫瘍微小環境における抑制性ＴＡＭに代表的である。
実施例１２－Ｍ２ｃ表面マーカー発現の減少
この実施例は、ＡＢ１０１での処理後のＭ２ｃ表面メーカー発現の減少を示す。
単球を単離し（実施例２に記載）、ＡＢ１０１またはアイソタイプ対照抗体の存在下でＭ２ｃマクロファージ（実施例１１に記載）に極性化した。次いで、実施例１１に記載のプロトコルに従って、表現型抗体の表面マーカー発現について細胞を染色した。Ｍ２ｃマクロファージのＡＢ１０１またはアイソタイプ対照抗体での処理後のマクロファージ表面発現について、正規化中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を下のグラフに表示する。生細胞は、ｅ７８０固定可能生存率色素を使用してゲートした。正規化されたＭＦＩは、ＡＢ１０１で処理された細胞のＭＦＩをアイソタイプ対照で処理されたＭ２ｃ細胞のＭＦＩで除算することによって計算した。次に、試料をＭ２ｃ対照のパーセントに正規化して、表面マーカーの発現の相対的な変化を示した。７人のドナーからのデータを平均し、２元配置分散分析を使用して統計を実行した。
図１９に示すように、極性化の間のＡＢ１０１抗体によるＭ２マクロファージの「Ｐｒｅ」処理は、ＣＤ１６、ＣＤ６４、カルレティキュリン、およびＳｉｇｌｅｃ－１５の発現を減少させた。低親和性ＩｇＧ受容体であるＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）は、Ｍ２抑制マクロファージで高度に発現している。高親和性ＩｇＧ受容体であるＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）もＭ２で高発現している。Ｓｉｇｌｅｃ－１５は、免疫抑制に関与するＩＴＩＭを含む膜貫通型タンパク質であり、これは抑制性マクロファージ上で特異的に発現する。
これらのマーカーの変化は、アイソタイプ対照抗体で処理されたＭ２ｃ細胞では見られなかった。同様に、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ３２、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ２０４、ＣＤ３３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ４８、ＭＡＲＣＯ、ＬＩＬＲＢ２、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）、ＩＬ１０ＲおよびＩＬ１８Ｒの表面発現を評価したが、これらのマーカーの発現の変化はＡＢ１０１処理では見られなかった。
実施例１３－ＡＢ１０１で処理されたＭ２ｃマクロファージは、ＯＫＴ－３活性化Ｔ細胞をＴｈ１表現型に向けて歪める
この実施例は、ＡＢ１０１で処理されたＭ２ｃマクロファージが、ＯＫＴ３で刺激されたＴ細胞によるＴｈ１関連表面マーカーの発現を誘導することを示す。データは、Ｍ２ｃ細胞のＡＢ１０１処理が、Ｍ２ｃを媒介した免疫抑制を阻害し、抗腫瘍Ｔｈ１細胞の活性化を調節することを示唆する。
腫瘍微小環境中の骨髄細胞である腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、腫瘍の増殖を促進する弱められた免疫応答を調整することが示されている。頻繁に、この効果は、Ｔ細胞をより低い比率のＴｈ１／Ｔｈ２に歪めることとして見ることができる（例えば、Ｔ細胞をＴｈ２表現型に歪める）。したがって、本発明者らは、ＡＢ１０１がＴＡＭと腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）との間のクロストークに影響を及ぼし、ＴＩＬに対するＴＡＭの抑制効果を緩和すると仮定した。
Ｔｈ１対Ｔｈ２ヘルパー細胞の比率は、ＡＢ１０１およびアイソタイプ対照の存在下または非存在下で評価した。Ｍ２ｃマクロファージは、５日目（「前」＝極性化中）および７日目（「後」極性化、共培養中）にＡＢ１０１またはアイソタイプ対照で処理された。７日目に開始して、処理されたＭ２ｃマクロファージをＯＫＴ３で刺激されたＣＤ３＋Ｔ細胞と３日間共培養して、Ｔ細胞の増殖を可能にする。Ｔ細胞増殖に続いて、１０日目に、Ｔ細胞を共培養から取り出し、細胞表面マーカー抗体パネルで染色して、Ｔｈ１対Ｔｈ２の比率の歪みを決定した。表面マーカーおよび細胞生存率染色に続いて、Ｔ細胞を固定し、フローサイトメトリーによってＴｈ１またはＴｈ２マーカーの存在を分析した。パネル１は、Ｔｈ１／Ｔｈ２、Ｔｈ１７、およびＴｒｅｇの比率を決定するために使用されたのに対して、パネル２は、Ｔ細胞の活性化および消耗を決定するために使用された。
単球が得られ、マクロファージに培養され、マクロファージは、前の実施例に記載されたように極性化された。
ＣＤ３＋Ｔ細胞は、製造業者の指示に従って、ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＣＤ３＋陰性選択キットを使用して、実施例２に記載されるように得られた。
マクロファージおよびＴ細胞は、実施例１１に記載されるように、３日間共培養された。
１０日目に、細胞は、実施例１１に記載された方法に従って、以下の表４に記載された抗体カクテルを使用して標識された。
抗体カクテルは、残りの５０μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液を使用して２倍で作製され、パネル１抗体は１：５０（最終濃度は１：１００）であり、パネル２抗体は１：５０（最終濃度は１：１００）である。
Figure 2022540806000006
インビトロ骨髄性細胞、Ｍ２ｃ細胞は、共培養において活性化されたＴ細胞に対して免疫抑制効果を有し、ここでは、Ｍ２ｃは、Ｔ細胞増殖を阻害し、Ｔ細胞をＴｈ２表現型に歪めた。
ＡＢ１０１での処理は、Ｍ２ｃ細胞の抑制効果を軽減し、刺激されたＴ細胞がＩＬ－２を産生し、増殖し（実施例１１に示されるように）、それらを活性化Ｔｈ１、炎症誘発性、表現型に向けて歪める能力を生じた。図２０は、ＡＢ１０１でのＭ２ｃ細胞の処理がアイソタイプ対照と比較してＴｈ１／Ｔｈ２比を増加させたことを示し、このことは、Ｍ２ｃ細胞のＡＢ１０１処理がＴ細胞をＴｈ１表現型に向けて歪ませたことを示した。さらに、図２１は、ＡＢ１０１でのＭ２ｃ細胞の処理は、アイソタイプ対照と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ６９の発現が増加させたことを示し、このことは、Ｍ２ｃ細胞がＡＢ１０１で処理されたときに、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴｈ１表現型に歪むことを引き起こすことを示す。図２２および図２３は、ＡＢ１０１でのＭ２ｃ細胞の処理が、アイソタイプ対照と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞上で、それぞれＩＣＯＳおよびＯＸ４０の発現を増加させたことを示し、このことは、Ｍ２ｃ細胞のＡＢ１０１処理が、増殖したＣＤ４＋Ｔ細胞に活性化マーカーの発現の増強を引き起こすことを示す。
実施例１４－ＣＤ８ Ｔ細胞によるＲａｊｉ細胞のＣＤ１９－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー媒介殺傷の骨髄細胞抑制の低下
この実施例は、ＡＢ１０１処理が、ＣＤ８ Ｔ細胞によるＣＤ１９－ＣＤ３ ＢｉＴＥ媒介性のＲａｊｉ細胞の殺傷の骨髄細胞抑制を減少させることを示す。腫瘍細胞殺傷は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）抗体（ヒトＣＤ１９およびヒトＣＤ３に対する二重特異性抗体、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ Ｂｉｍａｂ－ｈｃｄ１９ｃｄ３）を使用して、アイソタイプ対照抗体に対して、ＡＢ１０１について評価した。Ｍ２ｃマクロファージは、共培養中の５日目の極性化前（「前」）および７日目の極性化後（「後」）にＡＢ１０１またはアイソタイプ対照で処理した。Ｔ細胞の増殖を可能にするために、Ｔ細胞との共培養を７日目から開始して３日間続けた。１０日目に、Ｔ細胞をマクロファージとの共培養から取り出し、続いて腫瘍細胞＋／－ＢｉＴＥ抗体上でインキュベートして、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と腫瘍細胞との接触を促進した。ＢｉＴＥ抗体での処理後、フローサイトメトリーによって腫瘍細胞を生存率について染色した。
単球を培養し、マクロファージを実施例１１に記載のように極性化させた。ＣＤ８＋Ｔ細胞を実施例１１に記載のように得た。マクロファージ（２５，０００細胞／ウェル）は、記載された方法を使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞（１１５，０００細胞／ウェル）とともに３日間共培養した。
１０日目に、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ－８６）およびＫ５６２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ－２４３）細胞を、実施例１１に記載の方法を使用してＣｅｌｌＴｒａｃｅｓ Ｖｉｏｌｅｔで染色した。次いで、腫瘍細胞を、平底９６ウェル組織培養プレート中のＭ０培地に１００ｋ細胞／ウェルで再懸濁した。いくつかの未染色および染色された細胞は、フロー分析のための単一染色対照のために取っておかれた。
１０日目に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＣＤ８陰性選択キットを使用して、Ｔ細胞／マクロファージ共培養から単離した。回収したＴ細胞をＲａｊｉおよびＫ５６２細胞プレートにウェルあたり１００μＬでプレーティングした。二重特異性抗体を各ＲａｊｉおよびＫ５６２プレートに最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ、最終容量２２０μＬ／ウェルで添加した（いくつかのウェルは対照としてＢｉＴＥを含まない）。細胞をＢｉＴＥ処理で３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。
１１日目に、細胞を新しいＶ底プレートに配置し、３００×ｇで２分間遠心分離した。上清をすべてのプレートから採取し、新しいＶ底９６ウェルプレートに移し、その後密封し、後のサイトカイン分析のために－８０℃で保存した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ）に再懸濁し、実施例１１に記載されるように、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１４（非標的細胞を除外するため）、およびｅ７８０生存率色素で染色した。染色後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液ですすぎ、４％ＰＦＡを使用して固定し、フローサイトメトリー分析のためにＰＢＳに再懸濁した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット標識腫瘍細胞は、細胞内にＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０を含めることにより、腫瘍細胞死について評価した。ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０色素について陽性の細胞は、ＢｉＴＥなしの対照ウェルと比較した死滅率としてプロットした。
ＡＢ１０１での処理は、アイソタイプ対照と比較してＴ細胞増殖の増加を可能にする、Ｍ２ｃマクロファージの抑制効果を軽減した。図２４に示されるように、ＢｉＴＥの存在下でのＣＴＬの増加は、アイソタイプ対照と比較して、Ｒａｊｉ腫瘍細胞殺傷の増加をもたらした。Ｋ５６２は陰性対照として使用され、殺傷＋ＢｉＴＥ抗体の増加は示さなかった。
実施例１５－ヒト初代Ｍ２ｃマクロファージによる抗体の内在化
０日目に、単球（実施例２を参照）を、１００μＬ（１×１０６／ｍＬ）のＭ０培地中１×１０５／ウェルで、光学的に透明な底の９６ウェル組織培養プレートにプレーティングして、マクロファージに分化させた。５日目に、プレートを回転させて浮遊細胞を取り除き、培地を穏やかに吸引した。以前の実施例に記載したように、マクロファージは１００μＬ／ウェルのＭ２ｃ培地中でＭ２ｃに極性化された。
６日目に、抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７抗体標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｏ．Ａ２０１８６）を使用して標識した。各抗体（１００μｇ）を５０μＬ ＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬに希釈した。テストした抗体は以下の通りであった：ＡＢ１０１ ｈｕＩｇＧ１およびＡＢ１０２ ｈｕＩｇＧ１ＡＤＣＣ－Ｎｕｌｌ、ＣＤ１６３マウスモノクローナルＩｇＧ１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＡＢ１６０７－１００）、およびアイソタイプ対照：ＩＳＯ１ ｈｕＩｇＧ１またはＩＳＯ２ヒトＦｃ－ｎｕｌｌフレームワーク。
キットからのＡ－６４７カルボン酸スクシンイミジルエステルのバイアル全体を１５０μＬ ＰＢＳに再懸濁した。Ａ－６４７溶液のアリコート（５０μＬ）を希釈抗体の各チューブに１ｍｇ／ｍＬで添加し、混合物を暗所にて室温で４５分間インキュベートした。
Ｚｅｂｒａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ ８７７６６）を、最初に底部を切り取り、４，１００ｒｐｍで１分間遠心分離して貯蔵緩衝液を除去することにより洗浄した。次に、カラムを３００μＬのＰＢＳで２回（４，１００ｒｐｍで１分間スピン）、３００μＬのＰＢＳで１回（４，１００ｒｐｍで２分間スピン）洗浄した。カラムを新しい琥珀色のチューブに入れ、抗体を個別にロードした。次に、カラムを４，１００ｒｐｍで２分間遠心分離し、Ａｌｅｘａ－６４７標識抗体を１ｍｇ／ｍＬで溶出した。
７日目に、培養プレートをはじくことによってＦＢＳ含有培地を培養プレートから除去し、プレートを２５０μＬの冷ＰＢＳで２回洗浄し、続いて、標識ＡＢ１０１、ＩＳＯ１、および抗ＣＤ１６３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＡＢ１６０７－１００）で染色するための、Ｆｃ受容体をブロックする、２０μｇ／ｍＬの非標識ＩＳＯ１ ＩｇＧ１抗体、またはＡＢ１０２およびＩＳＯ２で染色するための非標識ＩＳＯ１ブロックを伴わない培地を含む９０μＬのＸ－ＶＩＶＯ培地を添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした後、最終濃度が５μｇ／ｍＬの標識抗体を添加した。１時間のインキュベーション後、培地を除去し、細胞を２５０μＬの冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、続いて４％ＰＦＡ（ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｎｏ．５５４７２２）を暗所にて室温で１０分間添加した。細胞成分の対比染色は、１ｍＬあたり２滴／ｍＬのＮｕｃＢｌｕｅ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｎｏ．Ｒ３７６０５）およびＡｃｔｉｎＧｒｅｅｎ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｎｏ．Ｒ３７１１０）を１×Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ Ｎｏ．５５４７２３、水中１：１０で希釈）を添加することによって調製した。プレートをはじいて固定液を取り除き、対比染色液（２０μＬ／ウェル）を加えた。染色は暗所にて室温で２０分間進行した。次いで、細胞を２５０μＬ／ウェル ＰＢＳを加えることにより洗浄し、これを除去して５０μＬ／ウェル ＰＢＳと置き換えた。セロミクス（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）機器を使用して細胞を画像化した。
これらのデータは、セロミクスによって決定された細胞内の平均蛍光値（ＡＦ６４７における平均リング平均強度）である。細胞は、ＤＡＰＩ染色された核（ＮｕｃＢｌｕｅ）およびＦＩＴＣ標識細胞骨格（ＡｃｉｎＧｒｅｅｎ）によって規定および検出される。図２５は、少なくとも４人の個々のドナーの代表的な結果を示す。すべての場合において、アイソタイプ対照抗体は内在化せず、ＡＢ１０２抗体は市販の抗ＣＤ１６３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＡＢ１６０７－１００）と同程度まで内在化した。ＡＢ１０１（ＩｇＧ１）抗体は、ＡＢ１０２（ＦｃＮｕｌｌ）または市販のＣＤ１６３抗体よりも約２倍多く内在化した。
実施例１６－ＡＢ１０１はヒト肺癌異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する
ＡＢ１０１は、ヒト肺癌異種移植モデルにおいてインビボでの腫瘍増殖阻害について試験した。ＡＢ１０１処理後、腫瘍のサイズと重量は対照群と比較して有意に減少し、脾臓のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の割合、ならびにＴ細胞活性化マーカーであるＩＣＯＳおよびＯＸ４０の表面発現が対応して増加した。ＣＤ４＋Ｔ細胞については違いは観察されなかった。これらの結果は、ＡＢ１０１がＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および増殖を促進することを示唆しており、以前の実施例で示したインビトロ研究と一致している。さらに、ＣＤ１１ｂ＋細胞の割合が増加した。ＣＤ１１ｂは、単球、マクロファージ、顆粒球、樹状細胞、およびナチュラルキラー細胞に存在する。まとめると、これらの知見は、ＡＢ１０１が腫瘍量を制御するために免疫応答を増強するための処置的応用を有しているかもしれないことを示唆している。
ＡＢ１０１の処置可能性を決定するために、インビボでの腫瘍増殖の減少におけるＡＢ１０１の有効性を、ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞の生着および多系統免疫細胞集団の再構成を使用して試験した。
Ａ５４９（ヒト肺癌、ｐ５３野生型）およびＮＣＩ－Ｈ１９７５（ヒト肺腺癌、ｐ５３変異、ｐ．Ｒ２７３Ｈ、）の凍結アリコートをＡＴＣＣから購入した（それぞれ、カタログ番号ＣＣＬ－１８５およびＣＲＬ－５９８０）。Ａ５４９細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５－０１０－ＣＶ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＶ３００１０）を補充したＦ－１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３０－２００４）で培養した。Ｈ１９７５細胞は、１０％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００９６．０２）で培養した。マウスへの皮下注射の前に、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で複数回継代して増殖させた。
ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスに２つのヒト臍帯血ユニットを移植し、これは、Ｓｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７（２）：１１８－３０（２００７）［ＰｕｂＭｅｄ：１７２５９９６８］； Ｓｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２（１１）：７８６－９８（２０１２）［ＰｕｂＭｅｄ：２３０５９４２８］；Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２４：８７－９４（２００８）［ＰｕｂＭｅｄ：１８４８１４５４］；Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ；Ｃｈａｐｔｅｒ １５：Ｕｎｉｔ １５．２１（２００８）［ＰｕｂＭｅｄ：１８４９１２９４］において以前に記載されたように、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって実施された。これらのマウスのうちの２匹は病気になり安楽死させられた。施設に到着すると、これらのマウスは５日間順応させられた。各マウスの左右の脇腹を６日目に剃毛した。
７日目に、Ａ５４９およびＨ１９７５細胞を培養物から採取し、ＰＢＳ（Ｃａ２＋またはＭｇ２＋を含まないリン酸緩衝生理食塩水、ＨｙＣｌｏｎｅ Ｎｏ． ＳＨ３００２８．０２）で３回洗浄し、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）メンブレンマトリックス（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎｏ．ＣＢ－４０２３４Ｃ）中に５×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。Ａ５４９細胞を右脇腹に注射し、Ｈ１９７５細胞を１００μＬマトリゲル中の５×１０５細胞の用量で各マウスの左脇腹に注射した。
注射の５日後、腫瘍をデジタルノギス（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎｏ．ＮＣ０６４９２３２）によって測定した。腫瘍が５０～７５ｍｍ３（腫瘍体積＝（Ｗ（２）×Ｌ）／２）に達したら、Ｗｅｂベースのランダマイザーアプリケーション（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒａｎｄｏｍｉｚｅｒ．ｏｒｇ／）を使用してマウスを無作為化し、１群あたり７匹のマウスを含む２つの群（以下に表示）に分けた：
（１）アイソタイプ対照抗体（ＩＳＯ１ Ｈｕ ＩｇＧ１）、
（２）ＡＢ１０１抗体（Ｈｕ ＩｇＧ１）。
マウスは、無作為化の日から開始し、その後３日ごとに抗体処置を受けた。各マウスは、腹腔内注射を介して、１００μＬのＰＢＳ中の処置ごとに２００μｇのアイソタイプ対照またはＡＢ１０１を受けた。腫瘍サイズは、２６日目まで、月曜日、水曜日、および金曜日に測定した。致命的な病的状態の兆候を示したマウスはすべて記録され、すぐに安楽死させられた。２６日目にマウスを屠殺した。さらなる分析のために腫瘍および脾臓を採取した。
単離された腫瘍は、脂肪、線維性、および壊死性の領域を除去し、２～４ｍｍの小片に切断することによって、秤量し、処理した。処理された腫瘍は、腫瘍解離酵素混合溶液（Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎキット、マウス、ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｎｏ．１３０－０９６－７３０）を含むｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃチューブ（ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｎｏ．１３０－０９６－３３４）に添加した。細胞は、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離剤（ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｎｏ．１３０－０９３－２３５）を使用して解離し、５％ＣＯ２および９５％湿度で３０分間インキュベートした。細胞をペレット化し、ＰＢＳに再懸濁し、１００μｍセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｎｏ．３５２３６０）を使用して濾した。解離した単一細胞をフローサイトメトリーで分析した。
脾臓は、セルストレーナーを通して圧搾することによって処理され、単一の細胞に解離された。１０ｍＬシリンジプランジャーヘッドを使用して、脂肪および線維組織を除去した。フローサイトメトリーによる分析のために、脾臓細胞をペレット化し、ＰＢＳに再懸濁した。
腫瘍および脾臓からの骨髄およびＴ細胞は、以下の表５に示される抗体カクテルパネルを用いたフローサイトメトリーを使用して定量化された。細胞生存率は、ｅ７８０生存率色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｎｏ．６５－０８６５－１４、ＰＢＳ中１：５００）を使用して評価した。一次抗体またはアイソタイプ対照抗体で染色する前に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎｏ．１５５７５－０３８））中のｅ７８０とともに４℃で１０分間インキュベートした。次に、細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、２５μＬ Ｆｃブロック（ＦＡＣＳ緩衝液＋５μＬ／ｍＬのＦｃブロック（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｎｏ．４２２３０２））で４℃にて３０分間ブロックした。抗体染色液（下記の表５を参照）を細胞に添加し（２５μＬ）、暗所でさらに３０分間４℃でインキュベートした。ＦＡＣＳ分析の前に細胞を３回洗浄した。
Figure 2022540806000007
ＡＢ１０１処置は、アイソタイプ対照抗体と比較して、Ａ５４９およびＨ１９７５腫瘍増殖を有意に減少させる。図２６および図２７は、Ａ５４９とＨ１９７５のそれぞれについて、プロットされた３０日間にわたる腫瘍を示す。矢印は、抗体処置による注射を示す。各点は、マウス７匹の平均測定値を表す。エラーバーは、平均標準誤差（ＳＥＭ）を示す。統計的有意差は、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して算出した。
アイソタイプ対照において、Ａ５４９およびＨ１９７５腫瘍の体積は、時間とともに増加した。しかし、ＡＢ１０１処置を受けたマウスでは、Ａ５４９腫瘍は、アイソタイプ対照と比較して遅い成長を示したが、一方、Ｈ１９７５腫瘍は、１７日目に退縮を示し、その後増殖は一定のままであった。Ｄ５での無作為化において、アイソタイプ対照とＡＢ１０１の平均腫瘍体積はそれぞれ６３．６ｍｍ３および６３ｍｍ３であり、Ｄ２６ではアイソタイプ対照の平均腫瘍体積は３７８ｍｍ３であったのに対して、ＡＢ１０１の平均腫瘍体積は１９８ｍｍ３であった。Ｄ５のＨ１９７５腫瘍体積はアイソタイプ対照およびＡＢ１０１でそれぞれ５７．８と３４．２であり、Ｄ２６ではアイソタイプ対照の平均腫瘍体積は１６４．４ｍｍ３であったのに対して、ＡＢ１０１の平均腫瘍体積は５７．４ｍｍ３であった。
ＡＢ１０１処置は、Ａ５４９およびＨ１９７５腫瘍の両方の腫瘍サイズを有意に減少させた。腫瘍はＤ２６で切除され、重量が測定された。ＡＢ１０１は、アイソタイプ対照と比較して、Ａ５４９腫瘍のサイズを４９％縮小し（平均腫瘍重量：アイソタイプ対照で５３８．２ｍｇ、ＡＢ１０１で２７３．０ｍｇ、ｐ＝０．００３）、Ｈ１９７５腫瘍を６０％縮小した（平均腫瘍重量：アイソタイプ対照で２１７．２ｍｇおよびＡＢ１０１で８５．６ｍｇ、ｐ＝０．０００９）。
ＡＢ１０１処置は、脾臓中の全生細胞中のＣＤ８＋Ｔ細胞および骨髄性細胞の割合を有意に増加させた。ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均パーセントはアイソタイプ対照の１．３からＡＢ１０１の３．３に増加し、ＣＤ１１ｂ＋細胞の平均パーセントはアイソタイプ対照の２．１からＡＢ１０１の４まで大幅に増加した。
ＡＢ１０１処置はまた、脾臓におけるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞上の活性化マーカーの発現を有意に増強した。ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＩＣＯＳ発現の平均ＭＦＩは、アイソタイプ対照の３１８からＡＢ１０１の８４１まで増加し、ＯＸ４０発現の平均ＭＦＩは、アイソタイプ対照の５８６からＡＢ１０１の１５６１まで増加した。
実施例１７－ＡＢ１０１は、Ｍ２ｃ／Ｔ細胞共培養アッセイにおけるＴ細胞のＭ２ｃ媒介免疫抑制を緩和する
ＡＢ１０１がＴＭＥにおける癌媒介性免疫回避を調節することができるかどうかを評価するために、ヒトＰＢＭＣ由来Ｔ細胞を自己免疫抑制Ｍ２ｃマクロファージと共に培養した。Ｍ２ｃ媒介免疫抑制から抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）活性化Ｔ細胞をレスキューするＡＢ１０１免疫調節活性は、処置効果の読み取りとしてＴ細胞増殖およびＩＬ－２産生を用いて、３つの処置レジメンの下で評価された。図２８は実験計画を示す。
ＡＢ１０１がＭ２様腫瘍関連マクロファージの生成を妨害するかどうかを決定するために、Ｍ０マクロファージを、ＡＢ１０１またはアイソタイプ対照の存在下で（「Ｐｒｅ」レジメン）Ｍ２ｃマクロファージに極性化した。Ｔ細胞との共培養前に処置抗体を洗い流した。ＡＢ１０１処置がＭ２ｃ媒介免疫抑制からＴ細胞をレスキューするどうかを評価するために、Ｔ細胞を、Ｍ２ｃマクロファージおよびＡＢ１０１の存在下で抗ＣＤ３、またはＭ２ｃ／Ｔ細胞共培養中のアイソタイプ対照の存在下で（「Ｐｏｓｔ」レジメン）活性化した。インビボ免疫療法を模倣するために、ＰｒｅおよびＰｏｓｔのレジメンを組み合わせた（Ｐｒｅ／Ｐｏｓｔ）。
実験の最初のセットにおいて、Ｍ２ｃ極性化に対するＡＢ１０１の効果は、３人の健康な対象からのヒト単球由来マクロファージおよびＴ細胞を用いて評価された。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＡＢ１０１またはアイソタイプ対照で処理された自己Ｍ２ｃマクロファージの存在下でＯＫＴ３を用いて活性化された。Ｍ２ｃマクロファージ単独と共培養されたＯＫＴ３刺激Ｔ細胞を使用して、Ｍ２ｃ媒介免疫抑制を評価した。ＩＦＮ－γ＋ＬＰＳ極性化Ｍ１マクロファージとのＴ細胞共培養は、最適なＴ細胞活性化の尺度を提供した。ＯＫＴ３活性化を伴わないＭ２ｃ／Ｔ細胞共培養は、静止Ｔ細胞に似ていた。図２９は、ＡＢ１０１処理が、アイソタイプ対照よりもＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖をそれぞれ***細胞の７～５４％（ｐ＜０．０１）および２１～８３％（ｐ＜０．０５）有意に増強したことを示す。Ｍ１マクロファージおよびＡＢ１０１で処理されたＭ２ｃマクロファージは、同様のレベルの増殖を誘発した。加えて、図３０は、ＡＢ１０１処理または未処理Ｍ２ｃ群からの活性化Ｔ細胞によるＩＬ－２分泌と比較した場合、Ｍ２ｃマクロファージのＡＢ１０１前処理が３つの研究対象すべてからの活性化Ｔ細胞によるＩＬ－２産生を有意に増加させたことを示す。ＡＢ１０１で処理されたＭ２ｃマクロファージとの共培養からのＩＬ－２レベルは、Ｍ１マクロファージとの共培養で達成されたものと同等かそれ以上であった。予想通り、ＯＫＴ３活性化なしでＭ２ｃと共培養したＴ細胞は、検出可能なレベルのＩＬ－２を産生しなかった。
次に、Ｐｒｅレジメン、Ｐｒｅ／ＰｏｓｔレジメンおよびＰｏｓｔレジメンの下でのＣＤ８＋Ｔ細胞／Ｍ２ｃ共培養に対するＡＢ１０１処理の効果を評価した。実験は、３人の健康な対象からのＰＢＭＣを使用して実行した。３人の研究対象からのＣＤ３＋Ｔ細胞は、Ｍ２ｃマクロファージの存在下、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、０．２５μｇ／ｍＬ）で活性化された。Ｍ２ｃマクロファージは、極性化の間、ＡＢ１０１（２０μｇ／ｍＬ）、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（２０μｇ／ｍＬ）、または培地単独で処理された（前、共培養前）。抗ＣＤ３刺激の７２時間後にＴ細胞を採取し、フローサイトメトリーによって増殖を定量化した。Ｐ値は、Ｍ２ｃ、ＡＢ１０１、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照処置群についてのダネットのＴ３多重比較検定によって計算した（ｐ＜０．０５、＊、ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊）。
図３１は、アイソタイプ対照群と比較した場合、ＡＢ１０１処置が、ＰｒｅレジメンおよびＰｏｓｔレジメンのＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を有意に増強したことを示す（ｐ＜０．０５）。ＡＢ１０１のＰｒｅレジメンとＰｏｓｔレジメンは、対応するアイソタイプ対照群の値と比較した場合、***したＣＤ８＋Ｔ細胞の割合をそれぞれ２３から４２％と２６から４７％に増加させた。ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の最大の増加は、ＡＢ１０１ Ｐｒｅ／Ｐｏｓｔ群で観察され、アイソタイプ対照Ｐｒｅ／Ｐｏｓｔ対照群の２２％***ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、４９％***ＣＤ８＋Ｔ細胞であった（ｐ＝０．０６２）。
図３２は、個々の研究対象に対応するＩＬ－２データを示す。ＡＢ１０１処置群の３人の対象はすべて、Ｍ２ｃ単独およびアイソタイプ対照群と比較した場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＬ－２産生を有意に増加させた。最高のＩＬ－２分泌は、Ｍ２ｃ／Ｔ細胞共培養の前後の併用処置で達成された。３つのＡＢ１０１処置レジメンの増殖およびＩＬ－２データは、ＡＢ１０１がＭ２ｃ細胞の極性化に影響を与えるだけでなく、Ｔ細胞／Ｍ２ｃ共培養の間のＭ２ｃ媒介免疫抑制を緩和することを示した。
図３３および図３４は、前およびＰｒｅ／Ｐｏｓｔ ＡＢ１０１処置の編集された増殖データを示す。ＡＢ１０１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖よりもＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に大きな影響を及ぼした。ＡＢ１０１処置は、それぞれ前（ｎ＝１６、ｐ＜０．００１）およびＰｒｅ／Ｐｏｓｔレジメン（ｎ＝１３、ｐ＜０．００１）で、対応するアイソタイプ対照値よりもＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を有意に増強した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＡＢ１０１ＰｒｅレジメンおよびＰｒｅ／Ｐｏｓｔレジメンに応答して増殖し、アイソタイプ処理されたＭ２ｃマクロファージと比較した場合、***した細胞の割合が３１から４４％（前、ｎ＝１８、ｐ＜０．０１）および４２から４９％（Ｐｒｅ／Ｐｏｓｔ、ｎ＝１４、ｐ＜０．０５）の増加であった。
図３５は、Ｍ２ｃ細胞の極性化中のＡＢ１０１での処理がまた、Ｍ２ｃ／Ｔ細胞共培養アッセイにおいてＴ細胞のＩＬ－２産生を有意に増強したことを示す。前処理ＡＢ１０１群のＴ細胞は有意に高いレベルのＩＬ－２を産生し、中央値は２９２ｎｇ／ｍＬであり、対応するアイソタイプ対照処置群のＴ細胞からの１０４ｎｇ／ｍＬよりもほぼ３倍高かった（ｎ＝２１、ｐ＜０．０００１）。ＡＢ１０１ Ｐｒｅ／Ｐｏｓｔ処理は、３３３ｎｇ／ｍＬのＴ細胞によるＩＬ－２応答を生成し、これは、アイソタイプ対照で処理されたＭ２ｃ／Ｔ細胞共培養からの２２７ｎｇ／ｍＬよりも５０％大きかったが、しかし、この違いは有意さに到達しなかった。
実施例１８－ＡＢ１０１は、Ｍ２ｃマクロファージと共培養されたＴ細胞によるＴ細胞増殖およびサイトカイン応答の回復においてＡＢ１０４よりも強力である
ＡＢ１０１媒介性の免疫抑制の軽減が、Ｍ２ｃマクロファージによって発現されるＦｃ受容体との相互作用を必要とするかどうかを決定するために、本発明者らは、Ｍ２ｃ／Ｔ細胞共培養アッセイにおいてＡＢ１０１－ＩｇＧ４（ＡＢ１０４）およびＡＢ１０１－ＩｇＧ１Ｆｃヌル（ＡＢ１０２）アイソタイプを評価した。ＡＢ１０１ ＩｇＧ１－Ｆｃ領域は、Ｍ２ｃマクロファージ上のＣＤ６４、ＣＤ３２、およびＣＤ１６に結合するが、ＩｇＧ１ＦｃヌルアイソタイプのＦｃγ受容体への結合は最小限である。ＩｇＧ１ Ｆｃ領域と同様に、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域はＣＤ６４に対してナノモル濃度の親和性を有しているが、通常はＣＤ３２またはＣＤ１６Ｆｃ受容体に結合しない。ＡＢ１０１、ＡＢ１０２、およびＡＢ１０４アイソタイプがＴ細胞増殖に対するＭ２ｃ媒介免疫抑制を緩和する能力を、５人の研究対象からの細胞と比較した。
４人（ＣＤ８＋Ｔ細胞）および５人（ＣＤ４＋Ｔ細胞）のヒト対象から単離されたＴ細胞を、Ｍ２ｃマクロファージの存在下、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、０．２５μｇ／ｍＬ）で活性化した。Ｍ２ｃ／Ｔ細胞共培養は、Ｐｒｅ／Ｐｏｓｔレジメンの下で、２０μｇ／ｍＬの示されたＡＢ１０１のアイソタイプで処理された。Ｍ２／Ｔ細胞共培養単独を、Ｍ２ｃ媒介免疫抑制の対照として使用した。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３刺激の７２時間後に採取し、増殖をフローサイトメトリーによって定量化した。記号は個々の研究対象を表する。Ｐ値は、示された処置群を比較する、対応のある両側ｔ検定によって計算された（ｐ＜０．０５、＊、ｎｓ、有意ではない）。
図３６は、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（５２～７８％ＣＤ８＋Ｔ細胞、４６～６５％ＣＤ４＋Ｔ細胞）と比較した場合、およびＡＢ１０２（５２～７８％ＣＤ８＋Ｔ細胞、４２～６５％ＣＤ４＋Ｔ細胞）と比較した場合、ＡＢ１０１Ｐｒｅ／Ｐｏｓｔレジメンが抗ＣＤ３活性化ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の平均増殖を有意に（ｐ＜０．０５）増強したことを示す。ＡＢ１０４およびＡＢ１０２処理は、それぞれのアイソタイプ対照と比較した場合、Ｔ細胞の増殖応答をわずかにしか増強しなかった。ＡＢ１０４処置群のＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖反応のみが、ＩｇＧ４アイソタイプ対照群よりも有意差に達した（３９～４７％の***細胞、ｐ＜０．０５）。
図３７は、ＡＢ１０１ Ｐｒｅ／Ｐｏｓｔレジメンが、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（４０％***細胞、ｐ＜０．０５）およびＡＢ１０４処理（４１％***細胞、ｐ＜０．０５）と比較した場合、ＯＫＴ３媒介ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖（７０％***細胞）に対して強力かつ有意な刺激効果を有したことを示す。さらに、ＡＢ１０１Ｐｏｓｔレジメンは、アイソタイプ対照（２７％***細胞、ｐ＜０．０５）またはＡＢ１０４処理（２０％***細胞、ｐ＜０．０５）と比較した場合、有意に増強されたＣＤ８＋Ｔ細胞増殖（５４％分割細胞）を示した。ＡＢ１０４処置は、Ｐｒｅ／ＰｏｓｔレジメンまたはＰｏｓｔレジメンのＩｇＧ４アイソタイプ対照よりも増殖反応を有意に改善しなかった。
Ｍ２ｃ／Ｔ細胞共培養（Ｐｏｓｔレジメン）中のＡＢ１０１処置は、Ｍ２ｃ媒介免疫抑制を軽減し、抗ＣＤ３活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞による強力なサイトカイン応答を誘導した。３人の研究対象から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｍ２ｃマクロファージの存在下で、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、０．２５μｇ／ｍＬ）で活性化された。Ｍ２ｃ／Ｔ細胞共培養は、Ｐｏｓｔレジメンの下で、２０μｇ／ｍＬのＡＢ１０１、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ＡＢ１０４、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照、および培地のみ（Ｍ２ｃ）で処理された。抗ＣＤ３刺激の７２時間後に上清を採取し、サイトカイン分泌を、磁気ビーズベースのイムノアッセイによって定量化した。Ｐ値は、示された処置群を比較する、対応のある両側ｔ検定によって計算した（ｐ＜０．０５、＊、ｐ＜０．０１、＊＊、ｐ＜０．００１、＊＊＊、ｎｓ、有意ではない）。
図３８は、ＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した場合、ＡＢ１０１が、すべての研究対象においてＩＦＮγおよびパーフォリンレベルを有意に増強したことを示す。表６は、ＡＢ１０１処置群の平均ＩＦＮ－γ、パーフォリン、およびＩＬ－６レベルが、ＩｇＧ１アイソタイプ対照値と比較して、５３０から１６００ｐｇ／ｍＬ（ＩＦＮ－γ）、２１０から１９００ｐｇ／ｍＬ（パーフォリン）、および２０３から６９０ｐｇ／ｍＬ（ＩＬ－６）に増加したことを示す。さらに、ＡＢ１０１処置は、３人の研究対象のうち２人で、ＴＮＦ－α分泌を回復し、対応するＩｇＧ１アイソタイプ対照値に対して、６０ｐｇ／ｍＬから８３０ｐｇ／ｍＬまで、および１ｐｇ／ｍＬから１２０ｐｇ／ｍＬまで、大幅な増加を伴った。表１に示すように、ＡＢ１０１ Ｐｒｅ／Ｐｏｓｔレジメンは、パーフォリンおよびテストされたサイトカインについての同様のサイトカインレベルを誘導することにより、Ｐｏｓｔレジメン群を用いて観察された結果を確認した。ＡＢ１０４は、どの処置群においてもＭ２ｃ媒介免疫抑制を緩和しなかった。評価されたＭ２ｃ共培養におけるＩＬ－１０レベルは、すべての処理条件下でアッセイの検出下限にあった。
Figure 2022540806000008
ＡＢ１０１ＰｏｓｔレジメンおよびＰｒｅ／ＰｏｓｔレジメンＭ２ｃ／ＣＤ４＋Ｔ細胞共培養についての対応するサイトカインおよびパーフォリンの結果を図３９および表２に示す。３人の健康な研究対象から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｍ２ｃマクロファージの存在下、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、０．２５μｇ／ｍＬ）で活性化した。Ｍ２ｃ／Ｔ細胞共培養は、Ｐｏｓｔレジメン下、ＡＢ１０１（２０μｇ／ｍＬ）、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（２０μｇ／ｍＬ）、ＡＢ１０４（２０μｇ／ｍＬ）、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照（２０μｇ／ｍＬ）、および培地単独（Ｍ２ｃ）で処理した。抗ＣＤ３刺激の７２時間後に上清を採取し、磁気ビーズベースのイムノアッセイによってサイトカイン分泌を定量化した。Ｐ値は、示された処置群を比較する、対応のある両側ｔ検定によって計算された（ｐ＜０．０５、＊、ｐ＜０．０１、＊＊、ｎｓ：有意ではない）。
ＡＢ１０１は、ＩｇＧ１アイソタイプ対照およびＡＢ１０４と比較した場合、すべての研究対象においてＩＦＮγ、ＴＮＦ－αおよびパーフォリンレベルを有意に増強した。ＡＢ１０１処置群の平均ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、パーフォリンおよびＩＬ－６レベルは、ＩｇＧ １アイソタイプ対照値と比較して、７７０から１７００ｐｇ／ｍＬまで（ＩＦＮ－γ）、４２０から１４００ｐｇ／ｍＬまで（ＴＮＦ－α）、２２０から７８０ｐｆ／ｍＬまで（パーフォリン）、および１３００～５１００ｐｇ／ｍＬまで（ＩＬ－６）増加した。ＡＢ１０１ Ｐｒｅ／Ｐｏｓｔレジメンは、パーフォリンおよびテストされたサイトカインについて同様のサイトカインレベルを誘導することにより、Ｐｏｓｔレジメン群で観察された結果を確認した。ＡＢ１０４は、ＩｇＧ４アイソタイプ対照群の対応するレベルと比較した場合、サイトカインまたはパーフォリン応答を増強しなかった。
Figure 2022540806000009
結論として、Ｍ２ｃ媒介免疫抑制からのＡＢ１０１によるＴ細胞サイトカイン応答のレスキューおよびＡＢ１０４アイソタイプによる効力の欠如は、ＡＢ１０１ Ｆｃ受容体相互作用がＡＢ１０１機能に必要とされ得ることを示唆している。
実施例１９－ＡＢ１０１処理はＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性活性を増強した
ＡＢ１０１がＴＭＥ中のＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍細胞殺傷を増強するかどうかを決定するために、Ｍ２ｃマクロファージの存在下、抗ＣＤ３抗体で刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性活性を評価した。この研究では、腫瘍抗原特異的、Ｔ細胞媒介性の腫瘍細胞の殺傷が、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））技術に置き換えられた。ＢｉＴＥ抗体は、２つのモノクローナル抗体の可変ドメインからなる融合タンパク質であり、癌細胞をＣＴＬに橋渡しするように設計されている。一方の可変ドメインは癌細胞表面上の抗原を標的とし、他方の可変ドメインはＴ細胞の表面のＣＤ３と結合する。ＢｉＴＥ（登録商標）抗体の両アームが結合すると、Ｔ細胞と癌細胞は互いに近接するように強制される。その結果、Ｔ細胞と癌細胞の間に細胞溶解性シナプスが形成され、Ｔ細胞からパーフォリンおよびグランザイムが放出され、腫瘍細胞死が起こる。
ＣＤ１９－ＣＤ３ ＢｉＴＥ抗体を使用して、ＢｉＴＥのＣＤ１９標的を発現するＲａｊｉＢ細胞リンパ腫細胞のＴ細胞媒介腫瘍細胞死滅におけるＡＢ１０１の有効性を評価した。Ｍ２ｃ／ＣＤ８＋Ｔ細胞共培養のＡＢ１０１処理は、Ｍ２ｃ媒介免疫抑制を緩和し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解活性を拡大および増強する可能性がある。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＢｉＴＥの非存在下で同種ＨＬＡ制限細胞溶解によってＲａｊｉ細胞を殺傷する可能性もある。ＣＤ８＋Ｔ細胞による非ＨＬＡ制限細胞死の評価のために、ＢｉＴＥまたはＨＬＡを発現しないＫ５６２細胞（慢性骨髄性白血病細胞株）を含めた。
Ｍ２ｃマクロファージおよび自己ヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞の共培養は、抗ＣＤ３で活性化され、３日間増殖された。共培養は、ＡＢ１０１（２０μｇ／ｍＬ）、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（２０μｇ／ｍＬ）、または培地単独で、Ｐｒｅレジメン、Ｐｒｅ／Ｐｏｓｔレジメン、およびＰｏｓｔレジメンで処理した。ＰｒｅレジメンおよびＰｏｓｔレジメンでは、処置用抗体は、それぞれＭ２ｃ極性化の間、およびＭ２ｃＴ細胞共培養の間にのみ添加した。Ｐ値は、ＡＢ１０１をＭ２ｃおよびアイソタイプ対照処置群とそれぞれ比較する、対応のある両側ｔ検定によって計算された（ｐ＜０．０５、＊；ｐ＜０．０１、＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊；ｐ＜０．０００１、＊＊＊＊；ｎｓ：有意ではない）。細胞毒性の読み出しを伴うＭ２／Ｔ細胞共培養アッセイのワークフローを図２８に示す。
エラー！参照元が見つかりません。図４０は、アイソタイプ対照と比較した場合、Ｍ０からＭ２マクロファージへの極性化の間、またはＭ２ｃ／Ｔ細胞共培養の間のＡＢ１０１処理が、ＣＤ１９－ＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体の存在下で、Ｒａｊｉ細胞の殺傷を有意に増強したことを示す。Ｒａｊｉ細胞死の割合は、Ｐｒｅでは６６から７７％（ｐ＜０．０１）、Ｐｒｅ／Ｐｏｓｔでは６４から８３％（ｐ＜０．００１）、Ｐｏｓｔレジメンでは６５から８２％（ｐ＜０．０１）に増加した。Ｒａｊｉ ＢｉＴＥ（登録商標）殺傷アッセイは、ダイナミックレンジが小さく、バックグラウンドが高く、静止ＣＤ８＋Ｔ細胞（灰色のバー、黒丸）をＭ２ｃ細胞とともに培養してＲａｊｉ細胞の７１％を殺傷した。
特に、ＡＢ１０１処置はまた、Ｋ５６２癌細胞を標的とする非ＨＬＡ制限性ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性活性を増加させた。Ｍ２ｃマクロファージおよびＴ細胞のＰｒｅ／ＰｏｓｔおよびＰｏｓｔＡＢ１０１処置は、関連するアイソタイプ対照値と比較して、腫瘍細胞の殺傷をＰｒｅ／Ｐｏｓｔで１２から４１％まで（ｐ＜０．０１）、Ｐｏｓｔ条件下で１３から３６％まで（ｐ＜０．０５）増強した。
次に、ヒト対象のパネルからのＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性活性に対するＡＢ１０１の効果を評価した。８人の研究対象からのＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、０．２５μｇ／ｍＬ）を含む自己Ｍ２ｃマクロファージの存在下で増殖させた。Ｍ２ｃマクロファージ単独、および共培養物を、ＡＢ１０１（２０μｇ／ｍＬ）、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（２０μｇ／ｍＬ）、または培地単独で、Ｐｒｅレジメン、Ｐｒｅ／Ｐｏｓｔレジメン、およびＰｏｓｔレジメンで処理した。抗ＣＤ３刺激の７２時間後にＴ細胞を採取し、ＣＤ１９－ＣＤ３ＢｉＴＥ抗体の存在下または非存在下でＲａｊｉ細胞とともに培養した。Ｒａｊｉ細胞の細胞死は、細胞溶解アッセイのセットアップの１８時間後にフローサイトメトリーによって決定された。Ｐ値は、ＡＢ１０１をＭ２ｃおよびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照処置群とそれぞれ比較する、対応のある両側ｔ検定によって計算した（ｐ＜０．０１、＊＊；ｐ＜０．００１、＊＊＊）。
エラー！参照元が見つかりませんに示されるように、ＡＢ１０１Ｐｒｅ／Ｐｏｓｔ処理は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照群と比較した場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介ＢｉＴＥ（登録商標）支援Ｒａｊｉ細胞殺傷を４９．５％から６３．５％まで（ｐ＜０．００１）に顕著に増加させた。ＢｉＴＥがない場合、ＡＢ１０１群のＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｒａｊｉ細胞の細胞溶解を３５％から４３％まで増強した（ｐ＜０．０１）。
次に、非ＨＬＡ制限性ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性活性に対するＡＢ１０１の効果を評価した。８人の研究対象からのＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、０．２５μｇ／ｍＬ）を含む自己Ｍ２ｃマクロファージの存在下で増殖させた。Ｍ２ｃマクロファージ単独および共培養物を、ＡＢ１０１（２０μｇ／ｍＬ）、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（２０μｇ／ｍＬ）、または培地単独で、Ｐｒｅレジメン、Ｐｒｅ／Ｐｏｓｔレジメン、およびＰｏｓｔレジメン下で処理した。抗ＣＤ３刺激の７２時間後にＴ細胞を採取し、Ｋ５６２細胞とともに培養した。Ｋ５６２細胞の細胞死は、アッセイ設定の１８時間後にフローサイトメトリーによって決定した。Ｐ値は、ＡＢ１０１をＭ２ｃおよびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照処置群とそれぞれ比較する、対応のある両側ｔ検定によって計算された（ｐ＜０．０１、＊＊）。
図４２は、ＡＢ１０１処理がＫ５６２殺傷アッセイで細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞活性に最も強い影響を及ぼしたことを示す。ＡＢ１０１処置群の平均細胞死はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照群の２倍高く、平均Ｋ５６２殺傷はそれぞれ１４％から２９％まで増加した（ｐ＜０．０１）。
実施例２０－ＡＢ１０１は、Ｍ２ｃマクロファージと共培養されたＴ細胞上のケモカイン受容体の発現を調節する
ＡＢ１０１がＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化状態を変化させるかどうかを決定するために、ケモカイン受容体の発現、および活性化または消耗のマーカーを、図２８に示すようにＭ２ｃ／Ｔ細胞共培養アッセイで評価した。
抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞を、極性化の間にＡＢ１０１またはアイソタイプ対照で処理された自己Ｍ２ｃ細胞とともに共培養した。未処理Ｍ２ｃまたはＩＦＮ－γＬＰＳ活性化Ｍ１マクロファージとともに共培養された抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞は、それぞれ免疫抑制および免疫活性化の対照として含まれていた。静止Ｔ細胞は、抗ＣＤ３活性化なしでＭ２ｃマクロファージとともに共培養された。抗ＣＤ３活性化の３日後、Ｔ細胞をフローサイトメトリーで分析した。フローサイトメトリー染色パネル１（表８）には、活性化マーカー（ＣＤ２５およびＣＤ６９）、静止Ｔ細胞マーカーＣＤ１２７、ならびに、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットを分化させるために通常使用されるケモカイン受容体ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１９４）およびＣＣＲ６（ＣＤ１９６）に対する抗体が含まれていた。フローサイトメトリー抗体パネル２（表８）には、Ｔ細胞活性化および消耗マーカーＬＡＧ３、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、およびＣＴＬＡ－４が含まれていた。
３人の研究対象から単離されたＴ細胞は、Ｍ２ｃマクロファージの存在下、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、０．２５μｇ／ｍＬ）で活性化された。Ｍ２ｃ／Ｔ細胞の共培養は、Ｍ２ｃ極性化の間、ＡＢ１０１（２０μｇ／ｍＬ）、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（２０μｇ／ｍＬ）、または培地単独で処理された。Ｍ１／Ｔ細胞共培養は陽性対照として含まれていた。フローサイトメトリーのために、抗ＣＤ３刺激の７２時間後に上清を採取した。ヒートマップは、すべての研究対象の組み合わせた処置群のＦｌｏｗＳＯＭクラスター分析を表す。
ＣＤ４＋Ｔ細胞の表現型は、フローサイトメトリーパネル１およびバイアスのないクラスタリングのためのＦｌｏｗＪｏ ＦｌｏｗＳＯＭプラグインを使用して評価した。図４３に示すように、すべてのＭ２ｃ／Ｔ細胞共培養群からのＣＤ４＋Ｔ細胞のＦｌｏｗＳＯＭクラスタリングは、表面マーカーについて示差的な発現レベルを有する８つのクラスター（０～７の番号）を特定した。クラスター１は静止Ｔ細胞を表し、クラスター６は活性化されたＴｈ１様Ｔ細胞に似ている。
Figure 2022540806000010
ＡＢ１０１処理がＣＤ４＋Ｔ細胞の比率にどのように影響したかについての視覚化された代表的な例を表９および図４３に示す。抗ＣＤ３活性化なしでＭ２ｃ細胞とともに共培養されたＴ細胞の大部分（平均＝７４％）がクラスター１で見出された（３人の研究対象のうち３人から）。クラスター１細胞は、ＣＤ６９、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ４、もしくはＣＤ２５の発現が低いかまったくない、またはＣＤ１２７の発現が上昇している、静止表現型を有していた。免疫活性化Ｍ１極性化マクロファージの存在下で、Ｔ細胞の大部分（５７％、３人の対象すべての平均）は、ＣＸＣＲ３の高発現と、ＣＣＲ４、ＣＤ１２７、ＣＣＲ６、および活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の低発現とを特徴とする活性化表現型を採用する（クラスター２）。Ｍ１共培養はまた、ＣＤ２５、ＣＸＣＲ３、およびＣＣＲ４の発現の上昇を伴う独自のより小さなサブセットも誘導する（クラスター７、Ｍ１とともに共培養されたＴ細胞の２１％）。Ｍ２ｃ細胞は、静止表現型クラスター１のＴ細胞の４６％との共培養において、抗ＣＤ３活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して免疫抑制効果を有した。さらに、Ｍ２ｃ単独群のＴ細胞の３２％が活性化Ｔ細胞表現型クラスター２において見出された。
Figure 2022540806000011
図４３は、アイソタイプ対照処置群の抗ＣＤ３活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞が、対応するＭ２ｃ単独群のＴ細胞と同様の分布プロファイルを有し、クラスター１のＴ細胞の平均５１％、クラスター２のＴ細胞の２７％を示す（表９）。
対照的に、ＡＢ１０１での処置は、Ｍ２ｃ極性化マクロファージの抑制効果を軽減した。ＡＢ１０１は、アイソタイプ対照アイソタイプ対照と比較して、クラスター２の活性化表現型を共有するＴ細胞の割合を２７～４０％有意に増強した（ｐ＜０．０５）。さらに、ＡＢ１０１は、静止細胞の表現型を共有する細胞の割合を５１％から１３％に顕著に減少した（クラスター１、ｐ＜０．０００１）。この分布は、Ｍ１マクロファージの存在下で刺激されたＴ細胞の表現型パターンに似ていた。
クラスター３、４および６もまた、アイソタイプ対照群と比較した場合、ＡＢ１０１での処置によって上昇した。図４３に示すように、３つのクラスターの違いは、それぞれのＭ２ｃ対照およびアイソタイプ対照に関連する３つの評価された対象のうち２つで有意性に達した（ｐ＜０．０００１）。
クラスター３および４は、ＣＸＣＲ３の高発現、ＣＣＲ４の中程度の発現、および活性化マーカーＣＤ６９の高発現（Ｃｌ．３）または低発現（Ｃｌ．４）発現を伴うＣＤ１２７の存在によって定義される。クラスター３の表現型は、Ｍ１細胞または静止Ｔ細胞のいずれとも共有されておらず、ＡＢ１０１処置に特有であるように見える。
クラスター６は、ＣＸＣＲ３およびＣＤ６９の高発現およびＣＣＲ４およびＣＣＲ６の最小発現を伴う活性化Ｔｈ１様Ｔ細胞の表現型を表す。ＡＢ１０１処理により、クラスター６のＴ細胞の割合の平均パーセンテージがアイソタイプ処理群の４．４％から９．３％まで増加した（表９）。
結論として、Ｍ２ｃ共培養によって拡大されたＣＤ４＋Ｔ細胞表現型のＦｌｏｗＳＯＭ分析は、ＡＢ１０１処置がＭ２ｃ媒介免疫抑制を軽減し、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ４の発現によって強調される独特のＴ細胞表現型の発現を誘導することを示す。ＡＢ１０１処理はまた、Ｍ２ｃ共培養における活性化Ｔｈ１様ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞の割合も増加させた。
Ｔ細胞の増強された活性化をもたらすＭ２ｃ媒介抑制を遮断するＡＢ１０１の能力をさらに調べるために、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、活性化および消耗のマーカー、ＬＡＧ３、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳおよびＣＴＬＡ－４について評価した。ＦｌｏｗＳＯＭによるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のクラスタリングにより、５つのＣＤ４＋（０～４の番号）および４つのＣＤ８＋（０～３の番号）クラスターが特定された。
クラスター０（ＣＤ４＋Ｔ細胞）およびクラスター３（ＣＤ８＋Ｔ細胞）におけるＬＡＧ３、ＯＸ４０、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４の低発現は、静止表現型を示す。ＰＤ－１およびＩＣＯＳの発現の増加はクラスター１（ＣＤ４＋Ｔ細胞）にあり、クラスター３（ＣＤ８＋Ｔ細胞）はこの研究で活性化された表現型を表す（図４４）。
クラスター０（ＩＣＯＳ＋ＰＤ－１－ＬＡＧ３－ＣＴＬＡ４－ＯＸ４０－）は、刺激されていないＣＤ４＋Ｔ細胞の９０％を表し、クラスター３（ＩＣＯＳｌｏ ＰＤ－１－ＬＡＧ３－ＣＴＬＡ４－ＯＸ４０－）は、抗ＣＤ３活性化なしでＭ２ｃマクロファージとともに培養された、静止状態のＣＤ８＋Ｔ細胞の９３％を表す（図４４）。Ｍ２ｃ極性化マクロファージと共培養するか、アイソタイプ対照で処理すると（抗ＣＤ３活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は主に対応する静止クラスター０（ＣＤ４＋Ｔ細胞の６５％である）およびクラスター３（ＣＤ８＋Ｔ細胞の６４％）に分類され、Ｍ２ｃ細胞媒介免疫抑制を確認する。
ＡＢ１０１は、Ｍ２ｃ単独またはアイソタイプ対照処置群と比較した場合、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を有意に増強する。ＡＢ１０１処置群のＣＤ４＋Ｔ細胞の８２％およびＣＤ８＋Ｔ細胞の９３％は、Ｍ１極性化マクロファージと共培養されたＴ細胞と共有される、それぞれの活性化Ｔ細胞表現型クラスター１（ＩＣＯＳｈｉ ＰＤ－１＋ＬＡＧ３－ＣＴＬＡ４－ＯＸ４０ｌｏ）およびクラスター０（ＩＣＯＳｈｉ ＰＤ－１＋ＬＡＧ３ｌｏ ＣＴＬＡ４－ＯＸ４０ｌｏ）において見出される。
実施例２１－ＡＢ１０１はｍ２ｃ表面マーカーの発現を調節した
Ｍ０からＭ２ｃマクロファージへの極性化の間のＡＢ１０１処理は、Ｍ２ｃ／Ｔ細胞共培養アッセイにおいて、Ｍ２ｃ媒介免疫抑制から抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞をレスキューした。ＡＢ１０１がＭ２ｃの表面マーカーおよび免疫チェックポイントの発現を調節するかどうかを判断するために、５日齢のＭ０マクロファージをＡＢ１０１またはアイソタイプ対照（２０μｇ／ｍＬ）の存在下でＩＬ－１０からＭ２ｃマクロファージに極性化し、マクロファージ表現型抗体のパネルで染色した。フローサイトメトリープロファイルを、ナイーブ未処理Ｍ２ｃ細胞およびＬＰＳ＋ＩＦＮ－γ極性化Ｍ１マクロファージと比較した。Ｍ２ｃマクロファージは、Ｍ２ｃマーカーＣＤ１６３、ＣＤ２０６およびＭｅｒ－ＴＫ、Ｆｃγ受容体ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、パターン認識受容体ＴＬＲ２、ＴＮＦＲファミリーメンバーＣＤ４０を発現する。予想されたように、ＩＦＮ－γ処理後、Ｍ１マクロファージは、Ｍ２ｃマクロファージと比較した場合、より高いレベルのＨＬＡ－ＣｌａｓｓＩＩおよびチェックポイントリガンドＰＤ－Ｌ１を発現した。対照的に、Ｍ２ｃマクロファージは、Ｍ１マクロファージよりも高いレベルの免疫抑制リガンドＳｉｇｌｅｃ－１５およびＬＩＬＲＢ２を示した。評価された表面マーカー、共刺激分子、および受容体ＣＤ８６、ＣＤ９１、ＣＤ１５０、カルレティキュリン、デクチン－１、ＴＩＭ４およびＴＬＲ４はＭ２ｃ細胞では発現されない。
活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＸＣＲ３発現をさらに分析するために、ＦｌｏｗＳＯＭクラスター３から６は、それらのＣＸＣＲ３＋ＣＤ６９＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞表現型に基づいて組み合わされた。得られた表現型の比率は、図４５に円グラフとして示され、図４５の表の表現型を表す。
ＡＢ１０１処置は、アイソタイプ処置群と比較した場合、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５を発現する活性化ＣＸＣＲ３＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を１８％から４０％まで増加させた。ＯＲ２５７２およびＭ２ｃ単独の処置群は、同等の分布プロファイルを示した。
表面マーカー発現に対するＡＢ１０１の調節効果を定量化するために、ＡＢ１０１処理Ｍ２ｃ細胞上の表現型抗体のｍＭＦＩ値を、最大１０人の研究対象からの、アイソタイプ対照（ｎＭＦＩｉｓｏ）または未処理のナイーブＭ２ｃマクロファージ（ｎＭＦＩＭ２ｃ）上の対応するマーカーに正規化した（図４６）。ＡＢ１０１は、アイソタイプ対照処理されたＭ２ｃ細胞と比較して、ＣＤ１６（３４％ｎＭＦＩｉｓｏ、ｐ＜０．０００１）およびＣＤ６４（３０％ｎＭＦＩｉｓｏ、ｐ＜０．０００１）の非常に有意な減少、ならびにＴＬＲ２（６６％ｎＭＦＩｉｓｏ、ｐ＜０．０５）の有意な減少を誘導した。ＡＢ１０１ Ｍ２ｃ表面マーカーＭＦＩがナイーブＭ２ｃマクロファージに正規化された場合にも、同様の傾向が観察された。ＡＢ１０１処理マクロファージからの表面マーカーのｎＭＦｉＭ２ｃは、ＣＤ１６（４４％ｎＭＦＩＭ２ｃ、ｐ＜０．００１）、ＣＤ６４（３０％ｎＭＦＩＭ２ｃ、ｐ＜０．０００１）、ＴＬＲ２（６３％ｎＭＦＩＭ２ｃ、ｐ＜０．０５）およびＳｉｇｌｅｃ－１５（６６％ｎＭＦＩＭ２ｃ、ｐ＜０．０５）について有意に減少した。ＡＢ１０１処置は、Ｍ２ｃマクロファージ対照と比較した場合、ＨＬＡクラスＩＩの発現を増強し、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＭｅｒｋＴＫ、ＬＩＬＲＢ２、およびＰＤ－Ｌ１の発現には有意な影響を与えなかった。
要約すると、Ｍ２ｃマクロファージの極性化の間のＡＢ１０１処理は、固有の受容体ＴＬＲ２およびチェックポイントリガンドＳｉｇｌｅｃ－１５の発現を減少させた。さらに、それは、Ｍ２ｃ細胞上のＣＤ１６およびＣＤ６４のＩＬ－１０誘導性アップレギュレーションを阻害した。
実施例２２－ＡＢ１０１結合は、ＣＤ１６３のＳＲＣＲドメイン３および４の領域の保護を増加し（低速ＨＤ交換）、ドメイン２、５、および９の領域を露出させた（高速ＨＤ交換）
ＣＤ１６３に対するＩｇＧ結合の効果を調べるために、比較ＨＤＸ研究を実施した。複合体に存在する過剰なＡｂに由来する多数のペプチドのために、多くのペプチドが、ｍ／ｚおよび保持時間で重複する多くのペプチドをもたらした。最終的に、ノイズの多い重複ペプチドを除外した後、ペプシンデータ内の１０７ペプチドの最終セットは、平均冗長性１．２８で７４％のカバレッジに対応する。ネペンテシンＩＩデータセットについては、最終的なフィルター処理されたペプチド計数は２３０で、８７％のカバレッジに対応し、平均冗長性は２．８であった。データセットを両方のプロテアーゼと組み合わせる場合、合計配列カバレッジは９３％で、平均冗長性は４．１である。
質量分析による水素／重水素交換：組換えヒトＣＤ１６３（ｒｈＣＤ１６３）の出発ストック溶液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２中０．３６ｍｇ／ｍＬに希釈した。内部交換レポーター：テトラペプチドＰＰＰＦまたはトリペプチドＹＰＩを、最終濃度を１μＭで各溶液に添加した。抗体複合体化試料は同じ方法で作成されたが、１．３８ｍｇ／ｍＬのＡＢ１０１を含んでおり、これは、ｒｈＣＤ１６３の３倍モル過剰に相当する。これらの作業溶液を２２℃でインキュベートし、重水素交換反応を開始する前に４℃で１日間保存した。１０μＬの作業用タンパク質溶液を、９０μＬの重水素化ＨＢＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、９５％Ｄ２Ｏ）で１０倍に希釈し、２２℃にて、３秒間、１５秒間、１分間、５分間、３０分間、４時間、または２０時間インキュベートした。重水素化ＨＢＳはまた、０．２μｇ／ｍＬのブラジキニンも含まれており、逆交換をモニターするために、すべての実験で完全に重水素化された参照化合物を提供した。高度に重水素化された試料として、追加の試料を３７℃で２０時間インキュベートした。交換した試料を等量（１００μＬ）の氷冷クエンチ緩衝液（１Ｍ ＴＣＥＰ、０．２％ギ酸（ＦＡ））に加え、最終ｐＨを２．５にした。試料をエタノールドライアイスバス（－６０℃）中で瞬間冷凍し、続いて、ＬＣ－ＭＳ分析まで－８０℃で保存した。重水素化されていない参照試料は、水性ＨＢＳ緩衝液で希釈したことを除いて同じように調製した。
固定化ペプシンプロテアーゼを用いた試料処理：凍結試料を５℃ブロックで４分間解凍した後、ローディングループに注入した。ロードした試料を、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および２％アセトニトリル（ＡＣＮ）の流れを用いて、１２℃、２００μＬ／分に維持されたカスタムパックペプシンカラム（ＰＯＲＯＳ２０－ＡＬレジンに固定化されたブタペプシン、２．１×５０ｍＭカラム）に通した。消化されたペプシン断片は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８ ＸＰ ＶａｎＧｕａｒｄカートリッジ（２．１×５ｍｍ、２．５μｍ）にトラップされた。５分間のローディング、消化、およびトラッピングの後、ペプチドは分析カラム（Ｗａｔｅｒｓ ＣＳＨ １×１００ｍｍ、１．７μｍ、１３０Å）で３％から４０％の溶媒Ｂのグラジエントを９分間使用して分離された（Ａ：０．１％ ＦＡ、０．０２５％ＴＦＡ、２％ＡＣＮ、Ｂ）ＡＣＮ中０．１％ＦＡ）。ＬＣシステムはＷａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓｉに接続され、イオン移動度分離を有効にして、３００～２０００のｍ／ｚ範囲でフルスキャンを実行した。ソース条件は、脱溶媒和の間の重水素の損失を最小限に抑えるように最適化された。重水素化されていない試料は、すべてのＬＣ－ＭＳ分析の前と最後に分析された。分析分離工程では、一連の２５０μＬ注入を使用して、ペプシンカラムを洗浄した。１）０．１％ＴＦＡを含む０．１％Ｆｏｓ－１２、２）０．１％ＴＦＡ中の２Ｍ ＧｎｄＨＣｌ、３）１０％酢酸、１０％アセトニトリル、５％イソプロパノール。各グラジエントの後、トラッピングカラムを一連の２５０μＬ注入で洗浄した。１）１０％ＦＡ、２）３０％トリフルオロエタノール、３）８０％メタノール、４）６６％イソプロパノール、３４％ＡＣＮ、５）８０％ＡＣＮ。トラップ洗浄中に、分析カラムを３つの急速なグラジエントで洗浄した。これらの洗浄工程は、分析される各ペプチドのキャリーオーバーのレベルが５％未満であることを保証するために必要であった。
固定化ネペンテシンＩＩプロテアーゼを用いた試料処理：ＰＯＲＯＳ ２０－ＡＬに固定化されたネペンテシンＩＩプロテアーゼがオンライン消化ステップのために使用されたことを除いて、上記の試料処理が繰り返された。
最初に、交換およびサンプリング条件が非結合状態および抗体結合状態について同一であることを確実にするために、本発明者らは最初に内部標準ペプチドの交換プロファイルを調べた。両方のデータセットについて、ＰＰＰＩおよびＹＰＩ標準は、非リガンドデータセットと抗体結合データセットの間で一貫しており、条件が一貫しており、微妙な変化でさえタンパク質構造および／またはダイナミクスの変化に起因すると解釈できることを保証する。さらに、重水素化緩衝液に組み込まれた完全に重水素化されたブラジキニンペプチドは、同一の重水素レベルを示し、各データセット内の試料間で逆交換のレベルが変動しないことを保証した。
抗体結合非結合状態間のＨＤＸ動態の比較を使用して、抗体結合に応答した抗原全体の変化を評価した。ペプシンおよびネペンテシンＩＩデータセットの変化の要約を図５０および５１に示す。変化は、抗体結合に応答したＨＤＸ動態に小さな変化（単一の時点での小さな変化）であったか、または大きな変化（２つの標準偏差を超えるまたはいくつかの時点で見られる）であったかによって一次配列で色分けされる。これらの比較では、ほぼ同じ領域をカバーするすべての重複ペプチドが一致していることを確認するとともに、複製間の標準偏差によって評価される統計的に有意な変化のみを本発明者らが利用したことに本発明者らは注目している。これらの基準により、データセットから最も保存的な推論のみを作成することが保証される。
図４７に示されるペプシンデータセットにおいて、抗体結合時に保護の増加を示した２つの部位が存在した。１つの部位には、いくつかの時点で保護の劇的な増加を示した糖ペプチド２７１－２８５、および交換速度の大幅な低下もまた示すＣ末端に隣接する領域２８６－２９９をカバーするいくつかのペプチドが含まれる。２番目の部位は、保護のわずかな増加を示す残基４０５－４１８内の３つのペプチドを含む。多数のペプチドは、抗体結合の際に柔軟性の増加（より速い交換）を示した。最も顕著なものは残基１２５－１３９および４７９－４８８であったが、より微妙な増加が残基８８７－９１０と９１８－９３３で観察された。
図４８に示されるネペンテシンＩＩデータセットは、全体では、ペプシンで観察されたものと同様の変化を示した。保護の最大の増加は残基２７９－２８６において明らかであり、これのちょうどＮ末端の領域（２７１－２７８）はわずかな増加を示す。残基４０８－４１５もまた、抗体結合時に保護のわずかな増加を示した。ペプシンデータと同様に、タンパク質の大部分で柔軟性が増加した。柔軟性の最大の増加は残基４７１－４８３で観察され、タンパク質のより多くの部分で小さな変化が見られた。これらのデータセットとの整合性は、ＯＲ２８０５のエピトープが残基２７９－２８５内にあり、隣接する配列（２７９－２９９）ならびに残基４０５－４１８も含む可能性があることを強く示す。ＨＤＸ－ＭＳでは観察されなかった他の領域も関与している可能性がある。
ペプシンデータと同様に、ネペンテシンＩＩデータセットのタンパク質の大部分にわたって柔軟性も増加した。柔軟性の最大の増加は残基４７１－４８３で観察され、タンパク質のより多くの部分での変化は小さかった（図４９）。全体として、提案されたエピトープの遠位にある大きな変化は、抗体結合に対する大規模なアロステリック効果と一致している。エピトープの遠位にあるすべての変化がより露出しているという事実は、おそらく隣接するタンパク質ドメインとの相互作用に影響を与えることによって、抗体結合がタンパク質全体のいくつかの二次構造を緩めることを示す。非常にＮ末端側であるドメインと非常にＣ末端側であるドメインの両方で変化が見られるという事実は、このタンパク質がそのネイティブな（リガンドなし）コンフォメーションでいくつかのドメイン間相互作用を有することを示す。
図４９は、ヒトＣＤ１６３ ＥＣＤへのＡＢ１０１結合の効果の模式的概略を示す。ＡＢ１０１の存在下では、ドメインＳＲＣＲ３および４内の領域は水素－重水素交換から保護されていた。ドメイン３および４での交換の減少に伴い、ＳＲＣＲドメイン２、５、および９は交換の増加を示し、ＡＢ１０１結合時の溶媒への曝露が多いことを示す。
実施例２３－ＡＢ１０１は切断されたヒトＣＤ１６３ＥＣＤ ＳＲＣＲドメイン１－５フラグメントに結合する
ヒトＣＤ１６３の細胞外ドメインは、ＳＲＣＲドメイン５の後で切断され、Ｃ末端ヒスチジンタグを保持した。このＣＤ１６３ＥＣＤフラグメントは、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞で発現され、図５０に示すようにＩＭＡＣ法を使用して精製された。ＡＢ１０１は、表１０に示すように、切断されたＥＣＤをナノモル以下のＥＣ５０に結合するが、しかし、予想どおりＲＭ３／１は結合しない。ＲＭ３／１結合エピトープはＳＲＣＲドメイン８および９にマッピングされている。切断されたＣＤ１６３ＥＣＤ ＳＲＣＲ １－５には、ＨＤＸ－ＭＳによってＡＢ１０１結合エピトープを含むことが同定されたドメイン３および４が含まれている。ＡＢ１０１がＳＲＣＲ１－５への結合を維持することは、ＨＤＸ－ＭＳ研究からのエピトープ同定結果をさらにサポートする。
Figure 2022540806000012
実施例２４－ＡＢ１０１はヒトＣＤ１６３ ＥＣＤタンパク質に結合するが、カニクイザル組換えＣＤ１６３ ＥＣＤタンパク質には結合せず、カニクイザルＣＤ１６３ ＥＣＤの単一点突然変異Ｅ３２３Ｋは、ヒトＣＤ１６３ＥＣＤと同等のＡＢ１０１結合を付与する。
実施例６において、プラスチックに固定化された組換えＣＤ１６３タンパク質を用いたＥＬＩＳＡアッセイを使用して、組換えヒトへのＡＢ１０１結合は、２６の別個の実験における１４点用量反応曲線から、０．５２ｎＭの幾何平均ＥＣ５０値を有すると決定された。ＡＢ１０１は組換えマウスＣＤ１６３への結合を示さなかったが、市販のラット抗ｍｕＣＤ１６３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃１４－１６３１－８２）抗体は予想通りに結合した。
ＡＢ１０１がマウスＣＤ１６３に結合することに失敗し、およびヒトＣＤ１６３との低アミノ酸配列同一性（７２．９％）の結果として、焦点は、前臨床毒物学研究でしばしば使用される第２の種、すなわち非ヒト霊長目（ＮＨＰ）カニクイザルに向けられた。カニクイザルＣＤ１６３は、ヒトＣＤ１６３と９６．５％のアミノ酸配列同一性を共有している。ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞におけるＣ末端８ヒスチジンタグを伴うヒトおよびカニクイザルＣＤ１６３ ＥＣＤの生成により、７日目の一過性トランスフェクションＣＭのＬあたり約１～２ｍｇの精製タンパク質が得られた。図５１は、ヒトおよびカニクイザルのＣＤ１６３タンパク質のアラインメントを示す。
ＣＤ１６３上の結合エピトープおよびヒトとカニクイザルＣＤ１６３との間の有意な配列同一性を同定し、ＡＢ１０１がカニクイザルＣＤ１６３に結合しないというＨＤＸ－ＭＳ結果の知識を武器に、ＡＢ１０１結合に関与するＳＲＣＲドメイン３の重要な残基の同定を可能にした。ヒトＣＤ１６３の３２３位のリジン残基は、毒物学研究で検討されているすべての潜在的な非ヒト種のグルタミン酸残基である（図５１）。この位置は、ＨＤＸ－ＭＳによって規定されたＳＲＣＲドメイン３のＡＢ１０１結合エピトープ内の中心にある。３２３位のカニクイザルグルタミン酸のリジンへの部位特異的変異誘発は、ＡＢ１０１のシノモルグスＣＤ１６３ ＥＣＤへの結合を付与し、これは、ＡＢ１０１のヒトＣＤ１６３ ＥＣＤへの結合に近いＥＣ５０を伴う（図５２）。この機能の向上は、ＡＢ１０１結合エピトープの３２３位のリジンを強く示唆している。
実施例２５－ＳＰＲによるヒトＣＤ１６３へのＡＢ１０１の結合親和性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を使用して、異なるランニング緩衝液条件でのヒトＣＤ１６３へのＡＢ１０１および抗ＣＤ１６３クローンＧＨＩ／６１結合（ＡＢ１０１アビディティ測定）を決定した。
ＡＢ１０１および抗ＣＤ１６３クローンＧＨＩ／６１のヒトＣＤ１６３への結合のＳＰＲ分析を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。精製された組換えＣＤ１６３タンパク質は、アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、チップ（Ｓｅｒｉｅ Ｓ－ｔｙｐｅ ＣＭ５）に直接固定化された。アミンカップリング固定化に適した濃度とｐＨを決定するために、ｐＨスカウティング（１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５／５．０／４．５／４．０）を実行した。センサーチップＣＭ５へのＣＤ１６３カップリングの最良の条件として、酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．５）を選択した。ＣＭ５チップに結合するＣＤ１６３タンパク質の量は８０ＲＵ（０．０８ｎｇ／ｍｍ２）であった。
実験のために使用されたランニング緩衝液：緩衝液（１）１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．０ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４または緩衝液；緩衝液（２）１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．０ｍＭ ＣａＣｌ２、１．０ｍＭ ＥＧＴＡ、および０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４。
ＭＡｂをランニング緩衝液に溶解した。ＡＢ１０１の場合、センサーグラムは、３０μｌ／分の流速、６．２５／１２．５／２５／５０／１００／２００μｇ／ｍＬの濃度、３００秒の接触時間、および６００秒の解離時間を使用して生成された。ＧＨＩ／６１の場合、センサーグラムは、３０μｌ／分の流速、３．１２５／６．２５／１２．５／２５／５０／１００μｇ／ｍＬの濃度、３００秒の接触時間、および６００秒の解離時間を使用して生成された。フローセルは、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ ３．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で再生された。データ分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００コンピュータ上でとＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価ソフトウェアを使用して実行された。
ＧＨＩ／６１および他の抗ＣＤ１６３抗体のヒトＣＤ１６３への結合は、遊離カルシウムに依存することが示されている。ＧＨＩ／６１は、カルシウム含有緩衝液よりもカルシウムを含まない緩衝液の方がＣＤ１６３に対して高い親和性を示した。ＡＢ１０１結合がカルシウム依存性であるかどうかを判断するために、２ｍＭカルシウム含有緩衝液またはカルシウムを含まないＥＤＴＡ緩衝溶液中液で固定化されたヒトＣＤ１６３へのＡＢ１０１結合のＳＰＲ測定を実行した。表１１および図５３に示されるように、ＡＢ１０１は、カルシウムを含まないＥＤＴＡ緩衝液（ＫＤ＝８９ｎＭ）での２倍弱いアビディティに関連して、カルシウム含有緩衝液で４５ｎＭのＫＤでより強い結合アビディティを有した。対照的に、ＳＰＲ測定は、カルシウム含有およびＥＤＴＡ緩衝液中のＣＤ１６３へのＧＨＩ／６１結合について、それぞれ６３ｎＭおよび１２ｎＭのＫＤ値を観察した（図５４および表１１）。
Figure 2022540806000013
ＳＰＲの結果は、以前に報告されたＧＨＩ／６１の知見を確認し、ＡＢ１０１がヒトＣＤ１６３への最適な結合のために生理学的カルシウム濃度を必要とし得ることを示した。
次に、本発明者らは、カルシウム含有緩衝液中の固定化されたＡＢ１０１へのＣＤ１６３結合親和性のＳＰＲ測定を実施し、１２ｎＭのＫＤを観察した（図５５および表１２）。固定化されたＡＢ１０１へのＣＤ１６３の結合は、固定化されたＣＤ１６３へのＡＢ１０１結合の対応するＫａ（１．６７８×１０４Ｍ－１ｓ－１）と比較して、６．２１３×１０４（Ｍ－１ｓ－１）の３．７倍高いｋａを有していた。
Figure 2022540806000014
要約すると、ＳＰＲ測定は、２ｍＭの遊離カルシウムの存在下でのＣＤ１６３に対する１２ｎＭの結合親和性および４５ｎＭのアビディティを決定した。
実施例２６－ＡｌｐｈａＬＩＳＡによる溶液中のヒトＣＤ１６３タンパク質へのＡＢ１０１結合
溶液中のヒトＣＤ１６３へのＡＢ１０１の結合親和性は、ＡｌｆａｌＬｉｓａアッセイによって決定された。
アッセイは、Ｃ末端に１０－ヒスチジンタグを有するヒト可溶性ＣＤ１６３、ビオチン化抗ｈＩｇＧ１、ストレプトアビジンアクセプタービーズおよびニッケルドナービーズからなる。
アッセイは、１５００ｎＭの開始タイトレーション濃度で、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まない１×ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ中でＡＢ１０１およびアイソタイプ対照の段階希釈を行うことによって実施した。ＣＤ１６３を同じ緩衝液で１５００ｎＭの濃度に希釈した。
ＡＢ１０１のヒトＣＤ１６３への結合。ＡＢ１０１またはアイソタイプ対照の段階希釈液を５μｌ／ウェルから５μｌ／ウェルのヒトＣＤ１６３の容量で添加し、アルミニウムプレートシーラーで密封し、穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。
ＡＢ１０１の検出：ＡＢ１０１は、１０μｌの結合ミックスに対して５μｌ／ウェルの容量で、１×ＡｌｆａＬＩＳＡイムノアッセイアッセイ緩衝液中の２．５ｎＭのビオチン化抗ヒトＩｇＧ１抗体を使用して検出された。プレートを密封し、穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。
アクセプタービーズの結合：抗体検出工程に続いて、１×ＡｌｐｈａＬＩＳＡイムノアッセイアッセイ緩衝液中の１００μｇ／ｍＬストレプトアビジンアクセプタービーズ５μｌを各ウェルに添加し、続いてプレートを密封し、穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。
ドナービーズの結合：次に、１× ＡｌｐｈａＬＩＳＡイムノアッセイアッセイ緩衝液中の１００μｇ／ｍＬニッケルドナービーズ５μｌをウェルごとに添加し、続いてプレートを密封し、穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。
プレートは、製造業者のプロトコルに従ってＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して読み取られ、データは、Ｋｄを計算するために、ＧｌａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して分析された。
ＣＤ１６３に結合するＡＢ１０１のＡｌｐｈａＬｉｓａ測定は、ＡＢ１０１の３０ｎＭで飽和に達した（図５６）。１．８ｎＭのＫｄは、５つの独立した測定値を組み合わせた１部位飽和結合モデルによって決定された（表１３）。２部位飽和結合モデルは、より低いＡＢ１０１濃度に対してより良いカーブフィットを提供した。
Figure 2022540806000015
実施例２７－ＡＢ１０１のＭ２ｃマクロファージへの結合
細胞上で発現されるＣＤ１６３へのＡＢ１０１の結合動態を決定するために、本発明者らは、４人の研究対象からの免疫抑制Ｍ２ｃマクロファージを用いて結合研究を実施した。
Ｍ２ｃマクロファージへのＡＢ１０１結合は、４人の健康なヒト対象（３９歳の女性、２４歳の男性、３９歳の男性および５４歳の男性）から評価された。単球は、ＢｌｏｏｄＷｏｒｋｓから購入したＬｅｕｋｏＰａｋｓから単離された。
７日目に、Ｍ２ｃ細胞を、マクロファージ解離溶液ＤＸＦ中で室温にて１５分間インキュベートし、フラスコからＸ－ＶＩＶＯ－１５（商標）培地から移した。遠心分離後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、Ｚｏｍｂｉｅ ＵＶライブ／デッドステイン（１：５００）に室温で２０分間再懸濁させた。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳブロック（１０％ＦＢＳおよび０．５ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ１を含有するＦＡＣＳ緩衝液）に室温で２０分間再懸濁した。ブロッキング緩衝液中の細胞を２．５×１０４細胞／ウェルで３８４ウェルプレートに移し、滴定した抗体を２×最終アッセイ濃度で各ウェルに直接添加した。細胞を抗体とともに室温で２０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、次いで、Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での取得のためにＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
Ｍ２ｃマクロファージへのＡＢ１０１結合は、二峰性結合曲線（図５７）を示し、これは、Ｆｃ受容体へのＡＢ１０１結合が、Ｍ２ｃ細胞上で発現されるＣＤ１６３への結合に影響を及ぼし得ることを示唆している。１部位特異的飽和結合曲線におけるＡＢ１０１について計算されたＫｄ値を表１４に示す。１部位モデルによって計算されたＣＤ１６３へのＡＢ１０１の結合のＫｄ値は７．７ｎＭで、Ｂｍａｘは４６１０３ｇＭＦＩ（Ｒ２＝０．９１）であった。２部位カーブフィットモデリングは、より良いカーブフィットを提供した（Ｒ２＝０．９８）。
Figure 2022540806000016
本開示およびその利点は詳細に説明されてきたが、添付の特許請求の範囲で定義される開示の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換、および変更が本明細書で行われることを理解されるべきである。

Claims (226)

  1. 配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む抗体または組換え抗体。
  2. 配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載の抗体または組換え抗体。
  3. 配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載の抗体または組換え抗体。
  4. 配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載の抗体または組換え抗体。
  5. 配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載の抗体または組換え抗体。
  6. 配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載の抗体または組換え抗体。
  7. 配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  8. 配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  9. 配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  10. 配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  11. 配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  12. 配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖配列と、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖配列とを含む抗体または組換え抗体。
  13. 前記ＣＤＲ Ｌ１が、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ２が、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ３が、配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％の同一性を有する、請求項１２に記載の抗体または組換え抗体。
  14. 前記ＣＤＲ Ｌ１が、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ２が、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ３が、配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１２に記載の抗体または組換え抗体。
  15. 前記ＣＤＲ Ｌ１が、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ２が、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ３が、配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１２に記載の抗体または組換え抗体。
  16. 前記ＣＤＲ Ｌ１が、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ２が、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ３が、配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１２に記載の抗体または組換え抗体。
  17. 前記ＣＤＲ Ｌ１が、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ２が、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ３が、配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する、請求項１２に記載の抗体または組換え抗体。
  18. 前記ＣＤＲ Ｈ１が、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ２が、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ３が、配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも８５％の同一性を有する、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  19. 前記ＣＤＲ Ｈ１が、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ２が、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ３が、配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  20. 前記ＣＤＲ Ｈ１が、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ２が、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ３が、配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  21. 前記ＣＤＲ Ｈ１が、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ２が、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ３が、配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  22. 前記ＣＤＲ Ｈ１が、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ２が、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ３が、配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  23. 配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、抗体または組換え抗体。
  24. 前記重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％同一である、請求項２３に記載の抗体または組換え抗体。
  25. 前記重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％同一である、請求項２３に記載の抗体または組換え抗体。
  26. 前記重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％同一である、請求項２３に記載の抗体または組換え抗体。
  27. 前記重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％同一である、請求項２３に記載の抗体または組換え抗体。
  28. 配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  29. 配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  30. 配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  31. 配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  32. 配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  33. 配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体または組換え抗体。
  34. 前記軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％同一である、請求項３３に記載の抗体または組換え抗体。
  35. 配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含む、請求項３３から３４のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  36. 配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含む、請求項３３から３４のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  37. 配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含む、請求項３３から３４のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  38. 配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含む、請求項３３から３４のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  39. 配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含む、請求項３３から３４のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  40. 配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む、抗体または組換え抗体。
  41. 配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む、請求項４０に記載の抗体または組換え抗体。
  42. 配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む、請求項４０に記載の抗体または組換え抗体。
  43. 配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む、請求項４０に記載の抗体または組換え抗体。
  44. 配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む、請求項４０に記載の抗体または組換え抗体。
  45. 配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖配列をさらに含む、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  46. 前記ＣＤＲ Ｌ１が、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ２が、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ３が、配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する、請求項４５に記載の抗体または組換え抗体。
  47. 前記ＣＤＲ Ｌ１が、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ２が、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ３が、配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する、請求項４５に記載の抗体または組換え抗体。
  48. 前記ＣＤＲ Ｌ１が、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ２が、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ３が、配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する、請求項４５に記載の抗体または組換え抗体。
  49. 前記ＣＤＲ Ｌ１が、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ２が、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｌ３が、配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する、請求項４５に記載の抗体または組換え抗体。
  50. 配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  51. 軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する、請求項４５から４９のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  52. 配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項４０から５１のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  53. 配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖配列を含んでいる抗体または組換え抗体。
  54. 配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｌ１、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ２、および配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有するＣＤＲ Ｌ３を含む軽鎖配列を含んでいる抗体または組換え抗体。
  55. 配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ Ｈ３を含む重鎖配列をさらに含む、請求項５３から５４のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  56. 前記ＣＤＲ Ｈ１が、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ２が、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ３が、配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有する、請求項５５に記載の抗体または組換え抗体。
  57. 前記ＣＤＲ Ｈ１が、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ２が、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ３が、配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する、請求項５５に記載の抗体または組換え抗体。
  58. 前記ＣＤＲ Ｈ１が、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ２が、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ３が、配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の同一性を有する、請求項５５に記載の抗体または組換え抗体。
  59. 前記ＣＤＲ Ｈ１が、配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ２が、配列番号５のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有し、前記ＣＤＲ Ｈ３が、配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも１００％の同一性を有する、請求項５５に記載の抗体または組換え抗体。
  60. 配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含む、請求項５３から５４のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  61. 前記重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する、請求項５５から５９のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  62. 前記軽鎖配列が、配列番号７のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項５３から５９のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  63. ヒト重鎖定常領域、またはヒト軽鎖定常領域をさらに含む、請求項１から６２のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  64. 前記ヒト重鎖定常領域が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、あるいはそれらのフラグメントである、請求項６３に記載の抗体または組換え抗体。
  65. 前記重鎖が、配列番号１０のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１から６４のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  66. 前記軽鎖が、配列番号９のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１から６５のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  67. 前記重鎖が、配列番号１２のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１から６４または６６のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  68. 前記重鎖が、配列番号１１のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１から６５または６６のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  69. 前記重鎖が、配列番号１３のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１から６４のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  70. ヒト可変フレームワーク領域およびマウス定常領域を含む、請求項１から６９のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  71. マウス重鎖定常領域またはマウス軽鎖定常領域をさらに含む、請求項７０に記載の抗体または組換え抗体。
  72. 前記マウス重鎖定常領域がＩｇＧ２Ａである、請求項７１に記載の抗体または組換え抗体。
  73. 前記重鎖が、配列番号１５のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する、請求項７２に記載の抗体または組換え抗体。
  74. 前記重鎖が、配列番号１６のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する、請求項７２に記載の抗体または組換え抗体。
  75. 前記軽鎖が、配列番号１４のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する、請求項７２に記載の抗体または組換え抗体。
  76. 単一重鎖、単一軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、可変ＮＡＲドメイン、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、単鎖結合ポリペプチド、ｄＡｂフラグメント、またはダイアボディを含む抗体フラグメントである、請求項１から７５のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  77. 免疫抑制性ヒト骨髄細胞上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合し、前記骨髄細胞への前記抗体または組換え抗体の結合は、以下のパラメータ
    （ｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、および
    （ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖
    のうち１つまたは両方により測定されるような免疫細胞機能を促進する、請求項１から７６のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  78. ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、またはパーフォリン、あるいはこれらの任意の組合せのレベルの増加として測定される、請求項７７に記載の抗体または組換え抗体。
  79. 前記免疫抑制性ヒト骨髄細胞が、マクロファージまたは骨髄由来サプレッサ細胞である、請求項７７に記載の抗体または組換え抗体。
  80. 前記免疫細胞機能が腫瘍微小環境にある、請求項７７に記載の抗体または組換え抗体。
  81. 前記免疫細胞機能がｉｎ ｖｉｖｏにある、請求項７７から８０のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  82. ヒトマクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合し、前記マクロファージへの前記抗体または組換え抗体の結合は、腫瘍微小環境中で免疫刺激活性を増加させる、請求項１から７６のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  83. 前記腫瘍微小環境がｉｎ ｖｉｖｏにある、請求項８２に記載の抗体または組換え抗体。
  84. 前記マクロファージへの前記抗体または組換え抗体の結合が、前記マクロファージの免疫抑制活性を低下させる、請求項７９から８３のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  85. 前記マクロファージへの前記抗体または組換え抗体の結合が、前記マクロファージの腫瘍促進活性を低下させる、請求項７９から８４のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  86. 前記マクロファージが腫瘍関連マクロファージである、請求項７９から８５のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  87. マクロファージ上で少なくとも１つのマーカーの発現を改質する、請求項７９から８５のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  88. 前記ＣＤ１６３タンパク質が、ＣＤ１６３のグリコ型である、請求項７７から８６のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  89. 前記ＣＤ１６３タンパク質が、ＣＤ１６３の１５０ｋＤａグリコ型である、請求項７７から８７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  90. 前記ヒトマクロファージにより発現されるＣＤ１６３の１３０ｋＤａグリコ型に特異的に結合しない、請求項７９から８９のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  91. Ｆｃ受容体への結合を可能にする定常ドメインを有する、請求項１から９０のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  92. 前記Ｆｃ受容体がマクロファージ上で発現される、請求項９１に記載の抗体または組換え抗体。
  93. 単一重鎖、単一軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、可変ＮＡＲドメイン、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、単鎖結合ポリペプチド、ｄＡｂフラグメント、またはダイアボディを含む抗体フラグメントを有する、請求項１から９２のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  94. 前記ヒトマクロファージ上の少なくとも１つのマーカーが、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である、請求項７９から９３のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  95. 前記ヒトマクロファージが、Ｍ２マクロファージまたはＭ２様マクロファージである、請求項７９から９３のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  96. 前記ヒトマクロファージが、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃ、またはＭ２ｄマクロファージである、請求項７９から９３のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  97. 前記ＣＤ１６３タンパク質が、前記マクロファージにより発現される少なくとも１つの他のタンパク質を含む細胞表面複合体の成分である、請求項７９から９６のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  98. 前記少なくとも１つの他のタンパク質が、ガレクチン－１タンパク質、ＬＩＬＲＢ２タンパク質、カゼインキナーゼＩＩタンパク質、またはこれらの任意の組合せである、請求項９７に記載の抗体または組換え抗体。
  99. 前記ＣＤ１６３タンパク質との結合に際して、前記ヒトマクロファージにより内在化される、請求項７９から９８のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  100. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、前記マクロファージに対して細胞傷害性ではない、請求項７９から９９のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  101. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖、またはＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化と増殖の両方を促進する、請求項７９から１００のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  102. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはこれらの任意の組合せの発現を促進する、請求項７７から１０１のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  103. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化と増殖の両方を促進する、請求項７７から１０２のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  104. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはこれらの任意の組合せの発現を促進する、請求項７７から１０３のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  105. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、腫瘍微小環境中で免疫抑制を低下させる、請求項７７から１０４のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  106. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、腫瘍微小環境中で腫瘍細胞死滅を促進する、請求項７７から１０５のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  107. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、細胞毒性リンパ球を媒介とする癌細胞死滅を促進する、請求項７７から１０６のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  108. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、ＮＫ細胞を媒介とする腫瘍細胞死滅を促進する、請求項７７から１０７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  109. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、Ｔ細胞によるＩＬ－２の発現を促進する、請求項７７から１０８のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  110. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ１９６－Ｔ細胞、ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞、ＣＣＲ４－Ｔ細胞、またはこれらの任意の組合せを増加させる、請求項７７から１０９のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  111. ＣＤ１６３への結合が、マクロファージにより引き起こされる腫瘍微小環境中での免疫抑制を低下させる、請求項７７から１１０のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  112. ヒトマクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合し、結合は、以下の効果
    （ａ）マクロファージによる、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーの発現の低下、
    （ｂ）マクロファージによる抗体の内在化、
    （ｃ）ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびパーフォリンの分泌、
    （ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、
    （ｅ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖、ならびに
    （ｆ）腫瘍微小環境中での腫瘍細胞死滅の促進
    のうち少なくとも１つをもたらす、請求項１から１１１のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  113. 前記結合が、（ａ）～（ｅ）の２つ以上、（ａ）～（ｅ）の３つ以上、（ａ）～（ｅ）の４つ以上、または（ａ）～（ｅ）のすべてをもたらす、請求項１１２に記載の抗体または組換え抗体。
  114. 腫瘍微小環境中でＣＤ１６３＋免疫抑制性骨髄細胞に特異的に結合し、この結合により、前記腫瘍微小環境中での腫瘍細胞の細胞傷害性Ｔ細胞媒介死滅の抑制が低下する、請求項１から１１３のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  115. 癌の処置方法に使用するために、ヒト腫瘍関連マクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合して、前記マクロファージによるＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、Ｓｉｇｌｅｃ－１５、またはこれらの任意の組合せの発現を低下させる、請求項１から１１４のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  116. 前記マクロファージへの前記抗体または組換え抗体の結合が、腫瘍微小環境中で細胞の免疫機能を調節する、請求項７９から１１５のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  117. 前記マクロファージへの前記抗体または組換え抗体の結合が、抗腫瘍免疫機能を促進する、請求項７９から１１５のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  118. 配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤ１６３エピトープに特異的に結合する、請求項１から１１７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  119. 配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤ１６３エピトープに特異的に結合する、請求項１から１１７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  120. 配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤ１６３エピトープに特異的に結合する、請求項１から１１７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  121. 配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０のアミノ酸配列それぞれを含むＣＤ１６３エピトープに特異的に結合する、請求項１から１１７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  122. １ｎＭ～１００ｎＭのＫＤをもってＣＤ１６３に特異的に結合する、請求項１から１２１のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  123. １ｎＭ～５０ｎＭのＫＤをもってＣＤ１６３に特異的に結合する、請求項１２２に記載の抗体または組換え抗体。
  124. １ｎＭ～１０ｎＭのＫＤをもってＣＤ１６３に特異的に結合する、請求項１２３に記載の抗体または組換え抗体。
  125. １ｎＭ～１００ｎＭのＫＤをもってヒトＭ２ｃマクロファージに特異的に結合する、請求項１から１２１のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  126. １ｎＭ～５０ｎＭのＫＤをもってヒトＭ２ｃマクロファージに特異的に結合する、請求項１２５に記載の抗体または組換え抗体。
  127. １ｎＭ～１０ｎＭのＫＤをもってヒトＭ２ｃマクロファージに特異的に結合する、請求項１２６に記載の抗体または組換え抗体。
  128. 請求項１から１２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体と、賦形剤とを含む組成物。
  129. 請求項１から１２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
  130. ヒト対象の癌を処置するための薬剤の製造における、請求項１から１２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体の使用。
  131. 癌のヒト対象において腫瘍関連マクロファージによる免疫抑制を低下させる薬剤の製造における、請求項１から１２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体の使用。
  132. 癌のヒト対象においてＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅を促進する薬剤の製造における、請求項１から１２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体の使用。
  133. 必要とする対象の免疫細胞機能を促進する方法であって、
    請求項１から１３２のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体を、必要とする個体に投与する工程と、
    以下のパラメータ
    （ｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、および
    （ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖
    のうち１つまたは両方により測定されるような免疫細胞機能を促進させる工程と
    を含む、方法。
  134. ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化が、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、またはパーフォリン、あるいはこれらの任意の組合せのレベルの増加として測定される、実施形態１３３に記載の方法。
  135. 前記免疫抑制性ヒト骨髄細胞がマクロファージである、請求項１３３に記載の方法。
  136. 前記免疫抑制性ヒト骨髄細胞が骨髄由来サプレッサ細胞である、請求項１３５に記載の方法。
  137. 前記抗体が、請求項７６から１２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体である、請求項１３６に記載の方法。
  138. 必要とする個体の癌を処置する方法であって、請求項１から１２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体を治療上有効量で個体に投与する工程を含み、これにより個体の癌を処置する、方法。
  139. 必要とする個体の癌を処置する方法であって、請求項１から１２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体を治療上有効量で個体に投与する工程を含み、これにより、個体の腫瘍関連マクロファージによる免疫抑制が低下される、方法。
  140. 必要とする個体の癌を処置する方法であって、請求項１から１２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体を治療上有効量で個体に投与する工程を含み、これにより、個体のＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅が増加される、方法。
  141. 必要とする個体の腫瘍関連マクロファージの腫瘍促進活性を低下させる方法であって、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、またはこれらの任意の組合せを調節するのに有効な請求項１から１２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体を治療上有効量で前記個体に投与する工程を含む、方法。
  142. 必要とする個体のリンパ球媒介性腫瘍細胞死滅を促進する方法であって、請求項１から１２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体を治療上有効量で個体に投与する工程を含む方法。
  143. 前記癌が肺癌または肉腫である、請求項１３８から１４２のいずれか一項に記載の方法。
  144. 前記肺癌が肺癌腫または肺腺癌である、請求項１４３に記載の方法。
  145. 前記抗体または組換え抗体が、腫瘍微小環境中でマクロファージに結合する、請求項１３８から１４２のいずれか一項に記載の方法。
  146. 追加の抗癌療法を前記個体に施す工程をさらに含む、請求項１３８から１４２のいずれか一項に記載の方法。
  147. 前記追加の抗癌療法が、外科療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法、およびサイトカイン療法、ならびにこれらの組合せである、請求項１４６に記載の方法。
  148. 前記追加の抗癌療法が免疫療法である、請求項１４７に記載の方法。
  149. 前記免疫療法が、チェックポイント阻害剤を含む組成物である、請求項１４８に記載の方法。
  150. 腫瘍微小環境中の腫瘍関連マクロファージの活性を調節する方法であって、ＣＤ１６３発現ヒトマクロファージに結合するとともに、以下の効果
    （ａ）抗体の結合が、マクロファージ上での、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーの発現を低下させる、
    （ｂ）前記抗体とＣＤ１６３タンパク質との結合に際して、前記抗体がヒトマクロファージにより内在化される、
    （ｃ）前記抗体の結合が、マクロファージに対して細胞傷害性ではない、
    （ｄ）前記抗体の結合が、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびパーフォリンのレベルを増加させる、
    （ｅ）前記抗体の結合が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化を促進する、
    （ｆ）前記抗体の結合が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖を促進する、ならびに
    （ｇ）前記抗体の結合が、前記腫瘍微小環境中で腫瘍細胞死滅を促進する
    のうち少なくとも１つを含む請求項１から１２７のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体に前記腫瘍関連マクロファージを接触させる工程を含む、方法。
  151. 前記結合は、（ａ）～（ｇ）の２つ以上、（ａ）～（ｇ）の３つ以上、（ａ）～（ｇ）の４つ以上、（ａ）～（ｇ）の５つ以上、（ａ）～（ｇ）の６つ以上、または（ａ）～（ｇ）のすべてをもたらす、請求項１５０に記載の方法。
  152. 免疫抑制性ヒト骨髄細胞上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記骨髄細胞への前記抗体の結合は、以下のパラメータ
    （ｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、および
    （ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖
    のうち１つまたは両方により測定されるような免疫細胞機能を促進する、方法。
  153. 前記免疫抑制性ヒト骨髄細胞が、マクロファージまたは骨髄由来サプレッサ細胞である、請求項１５２に記載の抗体。
  154. ヒトマクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記マクロファージへの前記抗体の結合は、以下のパラメータ
    （ｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、および
    （ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖
    のうち１つまたは両方により測定されるような免疫細胞機能を促進する、抗体。
  155. 前記免疫細胞機能が腫瘍微小環境にある、請求項１５２から１５４のいずれか一項に記載の抗体。
  156. 前記免疫細胞機能がｉｎ ｖｉｖｏにある、請求項１５２から１５５のいずれか一項に記載の抗体。
  157. ヒトマクロファージ上に発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合する抗体であって、前記マクロファージへの前記抗体の結合は、腫瘍微小環境における免疫刺激活性を増大させる、抗体。
  158. 前記腫瘍微小環境がｉｎ ｖｉｖｏにある、請求項１５７に記載の抗体。
  159. 前記マクロファージへの前記抗体の結合が、前記マクロファージの免疫抑制活性を低下させる、請求項１５３から１５８のいずれか一項に記載の抗体。
  160. 前記マクロファージへの前記抗体の結合が、前記マクロファージの腫瘍促進活性を低下させる、請求項１５３から１５９のいずれか一項に記載の抗体。
  161. 前記マクロファージが腫瘍関連マクロファージである、請求項１５０から１６０のいずれか一項に記載の抗体。
  162. 前記抗体が、前記マクロファージ上での少なくとも１つのマーカーの発現を改質する、請求項１５３から１６１のいずれか一項に記載の抗体。
  163. 前記ＣＤ１６３タンパク質が、ＣＤ１６３のグリコ型である、請求項１５２から１６２のいずれか一項に記載の抗体。
  164. 前記ＣＤ１６３タンパク質が、ＣＤ１６３の１５０ｋＤａグリコ型である、請求項１５２から１６３のいずれか一項に記載の抗体。
  165. 前記ヒトマクロファージにより発現されるＣＤ１６３の１３０ｋＤａグリコ型に特異的に結合しない、請求項１５３から１６４のいずれか一項に記載の抗体。
  166. Ｆｃ受容体への結合を可能にする定常ドメインを有する、請求項１５２から１６５のいずれか一項に記載の抗体。
  167. 前記Ｆｃ受容体がマクロファージ上で発現される、請求項１６６に記載の抗体。
  168. 単一重鎖、単一軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、可変ＮＡＲドメイン、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、単鎖結合ポリペプチド、ｄＡｂフラグメント、またはダイアボディを含む抗体フラグメントを有する、請求項１５２から１６７のいずれか一項に記載の抗体。
  169. 前記ヒトマクロファージ上の少なくとも１つのマーカーが、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である、請求項１５３から１６８のいずれか一項に記載の抗体。
  170. 前記ヒトマクロファージが、Ｍ２マクロファージまたはＭ２様マクロファージである、請求項１５３から１６９のいずれか一項に記載の抗体または組換え抗体。
  171. 前記ヒトマクロファージが、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃ、またはＭ２ｄマクロファージである、請求項１７０に記載の抗体。
  172. 前記ＣＤ１６３タンパク質が、前記マクロファージにより発現される少なくとも１つの他のタンパク質を含む細胞表面複合体の成分である、請求項１５３から１７１のいずれか一項に記載の抗体。
  173. 前記少なくとも１つの他のタンパク質が、ガレクチン－１タンパク質、ＬＩＬＲＢ２タンパク質、カゼインキナーゼＩＩタンパク質、またはこれらの任意の組合せである、請求項１７２に記載の抗体。
  174. 前記ＣＤ１６３タンパク質との結合に際して、前記ヒトマクロファージにより内在化される、請求項１５３から１７３のいずれか一項に記載の抗体。
  175. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、前記マクロファージに対して細胞傷害性ではない、請求項１５３から１７４のいずれか一項に記載の抗体。
  176. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖、またはＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化と増殖の両方を促進する、請求項１５２から１７５のいずれか一項に記載の抗体。
  177. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはこれらの任意の組合せの発現を促進する、請求項１５２から１７６のいずれか一項に記載の抗体。
  178. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化と増殖の両方を促進する、請求項１５２から１７７のいずれか一項に記載の抗体。
  179. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはこれらの任意の組合せの発現を促進する、請求項１５２から１７８のいずれか一項に記載の抗体。
  180. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、腫瘍微小環境中で免疫抑制を低下させる、請求項１５２から１７９のいずれか一項に記載の抗体。
  181. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、腫瘍微小環境中で細胞死滅を促進する、請求項１５２から１８０のいずれか一項に記載の抗体。
  182. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、細胞毒性リンパ球を媒介とする癌細胞死滅を促進する、請求項１５２から１８１のいずれか一項に記載の抗体。
  183. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、ＮＫ細胞を媒介とする腫瘍細胞死滅を促進する、請求項１５２から１８２のいずれか一項に記載の抗体。
  184. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、Ｔ細胞によるＩＬ－２の発現を促進する、請求項１５２から１８３のいずれか一項に記載の抗体。
  185. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ１９６－Ｔ細胞、ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞、ＣＣＲ４－Ｔ細胞、またはこれらの任意の組合せを増加させる、請求項１５２から１８４のいずれか一項に記載の抗体。
  186. ＣＤ１６３への結合が、マクロファージにより引き起こされる腫瘍微小環境中での免疫抑制を低下させる、請求項１５２から１８５のいずれか一項に記載の抗体。
  187. ヒトマクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合する抗体であって、結合は、以下の効果
    （ａ）マクロファージによる、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーの発現の低下、
    （ｂ）マクロファージによる抗体の内在化、
    （ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、
    （ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖、ならびに
    （ｅ）腫瘍微小環境中での腫瘍細胞死滅の促進
    のうち少なくとも１つをもたらす、抗体。
  188. 前記結合が、（ａ）～（ｅ）の２つ以上、（ａ）～（ｅ）の３つ以上、（ａ）～（ｅ）の４つ以上、または（ａ）～（ｅ）のすべてをもたらす、請求項１８７に記載の抗体。
  189. 腫瘍微小環境中でＣＤ１６３＋免疫抑制性骨髄細胞に特異的に結合する抗体であって、この結合により、腫瘍微小環境中での腫瘍細胞の細胞傷害性Ｔ細胞媒介死滅の抑制が低下する、抗体。
  190. 癌の処置方法に使用するために、ヒト腫瘍関連マクロファージ上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に結合して、マクロファージによるＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、Ｓｉｇｌｅｃ－１５、またはこれらの任意の組合せの発現を低下させる抗体。
  191. 前記マクロファージへの前記抗体の結合が、腫瘍微小環境中で細胞の免疫機能を調節する、請求項１５３から１９０のいずれか一項に記載の抗体。
  192. 前記マクロファージへの前記抗体の結合が、抗腫瘍免疫機能を促進する、請求項１５３から１９１のいずれか一項に記載の抗体。
  193. 請求項１５２から１９２のいずれか一項に記載の抗体と賦形剤とを含む組成物。
  194. 請求項１５２から１９２のいずれか一項に記載の抗体と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
  195. ヒト対象の癌を処置するための薬剤の製造における、請求項１５２から１９２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
  196. 癌のヒト対象において腫瘍関連マクロファージによる免疫抑制を低下させる薬剤の製造における、請求項１５２から１９２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
  197. 癌のヒト対象においてＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅を促進する薬剤の製造における、請求項１５２から１９２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
  198. 免疫細胞機能を促進する方法であって、
    免疫抑制性ヒト骨髄細胞上で発現されるＣＤ１６３タンパク質に特異的に抗体を結合させる工程と、
    以下のパラメータ
    （ｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化、および
    （ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖
    のうち１つまたは両方により測定されるような免疫細胞機能を促進させる工程と
    を含む、方法。
  199. 前記免疫抑制性ヒト骨髄細胞がマクロファージである、請求項１９８に記載の方法。
  200. 前記免疫抑制性ヒト骨髄細胞が骨髄由来サプレッサ細胞である、請求項１９８に記載の方法。
  201. 前記抗体が、請求項１５２から１９２のいずれか一項に記載の抗体である、請求項１９８に記載の方法。
  202. 必要とする個体の癌を処置する方法であって、請求項１５２から１９２のいずれか一項に記載の抗体を治療上有効量で個体に投与する工程を含み、これにより個体の癌を処置する、方法。
  203. 必要とする個体の癌を処置する方法であって、請求項１５２から１９２のいずれか一項に記載の抗体を治療上有効量で個体に投与する工程を含み、これにより、個体の腫瘍関連マクロファージによる免疫抑制が低下される、方法。
  204. 必要とする個体の癌を処置する方法であって、請求項１５２から１９２のいずれか一項に記載の抗体を治療上有効量で個体に投与する工程を含み、これにより、個体のＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅が増加される、方法。
  205. 前記癌が肺癌または肉腫である、請求項１９８から２０４のいずれか一項に記載の方法。
  206. 前記肺癌が肺癌腫または肺腺癌である、請求項２０５に記載の方法。
  207. 必要とする個体における腫瘍関連マクロファージの腫瘍促進活性を低下させる方法であって、腫瘍微小環境中でＣＤ４＋Ｔ細胞活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、またはこれらの任意の組合せを調節するのに有効な請求項１９４に記載の医薬組成物を一定量で個体に投与する工程を含む、方法。
  208. 前記腫瘍微小環境中で腫瘍細胞死滅を促進する工程をさらに含む、請求項２０７に記載の方法。
  209. 必要とする個体におけるリンパ球媒介性腫瘍細胞死滅を促進する方法であって、請求項１９４に記載の医薬組成物を有効量で前記個体に投与する工程を含む方法。
  210. 腫瘍微小環境中の腫瘍関連マクロファージの活性を調節する方法であって、ＣＤ１６３発現ヒトマクロファージに結合するとともに、以下の効果
    （ａ）抗体の結合が、マクロファージ上での、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＴＬＲ２、またはＳｉｇｌｅｃ－１５である少なくとも１つのマーカーの発現を低下させる、
    （ｂ）前記抗体とＣＤ１６３タンパク質との結合に際して、前記抗体がヒトマクロファージにより内在化される、
    （ｃ）前記抗体の結合が、マクロファージに対して細胞傷害性ではない、
    （ｄ）前記抗体の結合が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの活性化を促進する、
    （ｅ）前記抗体の結合が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの任意の組合せの増殖を促進する、ならびに
    （ｆ）前記抗体の結合が、前記腫瘍微小環境中で腫瘍細胞死滅を促進する
    のうち少なくとも１つを含む抗体に前記腫瘍関連マクロファージを接触させる工程を含む、方法。
  211. 前記結合は、（ａ）～（ｆ）の２つ以上、（ａ）～（ｆ）の３つ以上、（ａ）～（ｆ）の４つ以上、（ａ）～（ｆ）の５つ以上、または（ａ）～（ｆ）のすべてをもたらす、請求項２１０に記載の方法。
  212. 前記方法が腫瘍微小環境中で行われる、請求項１９８から２１１のいずれか一項に記載の方法。
  213. 前記方法がｉｎ ｖｉｖｏで行われる、請求項１９８から２１２のいずれか一項に記載の方法。
  214. 前記マクロファージへの前記抗体の結合が、腫瘍微小環境中で細胞の免疫機能を調節する、請求項１９８から２１３のいずれか一項に記載の方法。
  215. 前記マクロファージへの前記抗体の結合が、抗腫瘍免疫機能を促進する、請求項１９８から２１４のいずれか一項に記載の方法。
  216. 前記抗体が定常ドメインを含み、前記定常ドメインがＦｃ受容体に結合する、請求項１９８から２１５のいずれか一項に記載の方法。
  217. 前記Ｆｃ受容体がマクロファージ上で発現される、請求項２１６に記載の方法。
  218. 前記ＣＤ１６３タンパク質との結合に際して前記ヒトマクロファージにより抗体を内在化する工程をさらに含む、請求項１９８から２１７のいずれか一項に記載の方法。
  219. 前記ＣＤ１６３タンパク質への結合が、前記ヒトマクロファージに対して細胞傷害性ではない、請求項１９８から２１８のいずれか一項に記載の方法。
  220. ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＤ６９、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはこれらの任意の組合せの発現を促進する工程をさらに含む、請求項１９８から２１９のいずれか一項に記載の方法。
  221. ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、またはこれらの任意の組合せの発現を促進する工程をさらに含む、請求項１９８から２２０のいずれか一項に記載の方法。
  222. 腫瘍微小環境中の免疫抑制を低下させる工程をさらに含む、請求項１９８から２２１のいずれか一項に記載の方法。
  223. 細胞傷害性リンパ球媒介性癌細胞死滅を促進する工程を含む、請求項１９８から２２２のいずれか一項に記載の方法。
  224. ＮＫ細胞媒介性腫瘍細胞死滅を促進する工程を含む、請求項１９８から２２３のいずれか一項に記載の方法。
  225. Ｔ細胞によるＩＬ－２の発現を促進する工程を含む、請求項１９８から２２４のいずれか一項に記載の方法。
  226. ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ１９６－Ｔ細胞、ＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞、ＣＣＲ４－Ｔ細胞、またはこれらの任意の組合せを増加させる工程を含む、請求項１９８から２２５のいずれか一項に記載の方法。
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