JP2022539556A

JP2022539556A - ジペプチドリピートタンパク質の阻害

Info

Publication number: JP2022539556A
Application number: JP2021577393A
Authority: JP
Inventors: ジーヴィエイラフェルナンド; プレマシリアラン; ギルアンナ
Original assignee: ALS Therapy Development Institute
Current assignee: ALS Therapy Development Institute
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2022-09-12
Also published as: CN114126651A; AU2020303943A1; MX2021015911A; CA3144344A1; US11607402B2; US20200405689A1; TW202116299A; WO2020263550A1; US20220142974A1; US11857534B2; EP3990021A1; KR20220027216A

Abstract

有効量のＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（Ｉ型ＰＲＭＴ）阻害剤を使用して、ジペプチドリピートタンパク質（ＤＲＰ）によって引き起こされる細胞毒性を減少させることにより、ＡＬＳおよびＦＴＤなどの神経変性疾患を治療するための方法が開示されている。

Description

関連出願

本出願は、２０１９年６月２８日に出願された米国仮出願第６２／８６８，２６７号、および２０２０年５月２２日に出願された米国仮出願第６３／０２８，７５３号の優先権を主張する。両出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）などの神経学的疾患の治療に関する。

ＡＬＳは、脊柱および脳の運動ニューロンの変性に起因する筋線維萎縮を特徴とする進行性の神経学的疾患である。ＦＴＤは、６５歳未満の人において２番目に多い早期発症型認知症（アルツハイマー病に続く）である。

近年、遺伝子９番染色体のオープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ＯＲＦ７２）のヘキサヌクレオチド（ＧＧＧＧＣＣ）リピートの拡張が、ＡＬＳおよびＦＴＤの両方の発症に寄与する可能性のある要因であることが報告されている。Jovicicらの「Modifiers of C9orf72 DRP toxicity implicate nucleocytoplasmic transport impairments in c9FTD/ALS,」、Nat Neurosci 2015 Sep 18（9）1226-1229を参照されたい。拡張されたＧＧＧＧＣＣリピートを含有する変異Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子から転写されたＲＮＡは、非ＡＴＧによって開始されたメカニズム(a non-ATG initiated mechanism)を介して翻訳される。これにより、ジペプチドリピートタンパク質（ＤＲＰ）の形成および細胞内蓄積が促進される。ヘキサヌクレオチドリピートのセンスまたはアンチセンス方向のいずれかで６つのリーディングフレームすべてから翻訳されたＤＲＰは、５つのＤＲＰ：グリシン－アラニン（ＧＡ）、グリシン－アルギニン（ＧＲ）、プロリン－アラニン（ＰＡ）、プロリン－アルギニン（ＰＲ）およびグリシン－プロリン（ＧＰ）の発現をもたらす（ＧＰは特に、センスおよびアンチセンスリーディングフレームの両方から生成され得る）。ただし、作用メカニズムおよび神経変性への各ＤＲＰの貢献は不明なままである。

本発明の目的は、ＤＲＰによって引き起こされる細胞毒性を阻害または減少させることによって、神経変性疾患を治療するための新しいアプローチを提供することである。

ＤＲＰによって引き起こされる細胞毒性を減少させるための方法が開示されている。グリシン－アルギニン（ＧＲ）およびプロリン－アルギニン（ＰＲ）の２種類のＤＲＰは、細胞の生存率に特に有害であり、チェックしなかった場合、特に神経細胞で細胞機能障害を引き起こしたり、細胞死を引き起こしたりし得ることが発見された。理論に拘束されることなく、いくつかの態様において、ＤＲＰによって引き起こされる毒性効果は、内因性タンパク質の異常メチル化によるものというよりはむしろ、ジペプチドリピート内のアルギニン基質の非対称性メチル化によって引き起こされる。

本発明の一態様において、有効量のＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（Ｉ型ＰＲＭＴ）阻害剤を投与して、細胞内のＤＲＰの毒性を減少させること、例えば、ジペプチドリピート内においてアルギニン基質の非対称性メチル化によって生じた毒性を無効にすることを含む方法が開示されている。有用なＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ３、ＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ６、および／またはＰＲＭＴ８の少なくとも１つを阻害できる薬品を含む。Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤の例として、これらに限定されないが、ＭＳ０２３、ＭＳ０４９、ＥＰＺ０２０４１１、ＧＳＫ７１５（ＧＳＫ３３６８７１５またはＥＰＺ０１９９９７とも呼ばれる）、および／またはＴＰ０６４（以下でより詳細に説明）が挙げられる。

Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、アミノ酸アルギニン（Ｒ）、例えば、ポリグリシン－アルギニン（ＧＲ）および／またはポリプロリン－アルギニン（ＰＲ）ジペプチドリピートを含むＤＲＰによって引き起こされる細胞毒性を減少させるのに特に有用である。本発明は、神経細胞、例えば、感覚ニューロン、運動ニューロンおよび／または介在ニューロンをＤＲＰ毒性から保護するのに特に有用であり得る。

特に、上記方法は、神経変性疾患が対象の神経細胞におけるＤＲＰの発現に関連している場合に、そのような疾患を治療するのに役立ち得る。例えば、上記方法は、Ｃ９ＯＲＦ７２連鎖性ＡＬＳまたはＣ９ＯＲＦ７２連鎖性ＦＴＤの治療に使用することができる。

さらに別の態様において、治療方法は、第２の治療薬、例えば、リルゾールおよび／またはエダラボンの投与をさらに含む。あるいは、第２の治療薬は、抗体、またはその抗原結合部位、例えば、ヒトＣＤ４０とヒトＣＤ４０Ｌとの相互作用を遮断する抗体である。

本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および例から明らかになるであろうが、これらは限定的であると解釈されるべきではない。本出願を通して引用されたすべての参考文献、ＧｅｎＢａｎｋエントリー、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

図１Ａ～図１Ｄは、ＷＳＴ－１アッセイによって測定されたＮＳＣ－３４運動ニューロン様細胞において３μＭＧＲ_１５によって誘発された代謝異常を無効にするＭＳ０２３（図１Ａおよび図１Ｂ）ならびにＧＳＫ５９１（図１Ｃおよび図１Ｄ）の活性を比較するグラフである。図２Ａ～図２Ｄは、ＷＳＴ－１アッセイによって測定されたＮＳＣ－３４運動ニューロン様細胞において３μＭＧＲ_１５（図２Ａおよび図２Ｂ）ならびに３μＭＰＲ_１５（図２Ｃおよび図２Ｄ）によって誘発された代謝異常を無効にするＭＳ０２３の活性を比較するグラフである。図３Ａ～図３Ｄは、ＷＳＴ－１アッセイによって測定された３μＭ用量のＧＲ_１５（図３Ａおよび図３Ｂ）またはＰＲ_１５（図３Ｃおよび図３Ｄ）によって誘発された代謝異常を無効にするＭＳ０２３の活性に対する、低用量範囲のＤＲＰ（０．０１～３μＭ）の効果を比較するグラフである。図４Ａ～図４Ｄは、ＬＤＨアッセイによって測定されたＧＲ_１５（３００ｎＭ）（図４Ａおよび図４Ｂ）ならびにＰＲ_１５（３００ｎＭ）（図４Ｃおよび図４Ｄ）によって生成された細胞毒性を無効にするＭＳ０２３（１～６０μＭ）の活性を比較するグラフである。図５Ａ～図５Ｄは、ＬＤＨアッセイによって測定されたＧＲ_１５（３μＭ）（図５Ａおよび図５Ｂ）ならびにＰＲ_１５（３μＭ）（図５Ｃおよび図５Ｄ）によって生成された細胞毒性を無効にするＭＳ０２３（１～６０μＭ）の活性を比較するグラフである。図６Ａ～図６Ｄは、ＬＤＨアッセイによって測定されたＧＲ_１５（３μＭ）（図６Ａおよび図６Ｂ）ならびにＰＲ_１５（３μＭ）（図６Ｃおよび図６Ｄ）によって生成された細胞毒性を無効にするＭＳ０２３（０．０１～３μＭ）の活性を比較するグラフである。図７Ａ～図７Ｄは、カスパーゼ－３アッセイによって測定されたＧＲ_１５（３００ｎＭ）（図７Ａおよび図７Ｂ）ならびにＰＲ_１５（３００ｎＭ）（図７Ｃおよび図７Ｄ）によって誘発されたアポトーシス活性を無効にするＭＳ０２３（１～６０μＭ）の活性を比較するグラフである。図８Ａ～図８Ｄは、カスパーゼ－３アッセイによって測定されたＧＲ_１５（３μＭ）（図８Ａおよび図８Ｂ）ならびにＰＲ_１５（３μＭ）（図８Ｃおよび図８Ｄ）によって誘発されたアポトーシス活性を無効にするＭＳ０２３（０．０１～３μＭ）の活性を比較するグラフである。図９Ａ～図９Ｄは、ＢｒｄＵＥＬＩＳＡによって測定されたＧＲ_１５（３００ｎＭ）（図９Ａおよび図９Ｂ）ならびにＰＲ_１５（３００ｎＭ）（図９Ｃおよび図９Ｄ）によって誘発された増殖阻害を無効にするＭＳ０２３（１～６０μＭ）の活性を比較するグラフである。図１０Ａ～図１０Ｄは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびマウス神経芽細胞腫－脊髄ハイブリッド（ＮＳＣ－３４）細胞、ならびに、アルギニンリッチ：ＧＲ_１５、ＰＲ_１５（図１０Ａおよび図１０Ｂ）および非アルギニンリッチ：ＧＲ_１５、ＰＲ_１５（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）の両方、ＤＲＰ（３０および３μＭ用量で）を使用したＷＳＴ－１アッセイによって測定されたニューロンおよび非ニューロン細胞型におけるＤＲＰ誘発性代謝異常表現型を比較するグラフである。ＬＤＨアッセイによって決定されたＮＳＣ－３４細胞におけるＤＲＰ誘発毒性の用量反応パターンを示すグラフである。カスパーゼ－３アッセイによって決定されたＮＳＣ－３４細胞におけるＤＲＰ誘発アポトーシス活性の用量反応パターンを示すグラフである。ＢｒｄＵＥＬＩＳＡによって決定されたＮＳＣ－３４細胞におけるＤＲＰ誘発性増殖阻害の用量反応パターンを示すグラフである。ＭＳ０２３が、ＮＳＣ－３４細胞の非対称性アルギニンメチル化を減少させることを示すグラフである。図１５Ａおよび図１５Ｂは、合成のＧＲ_１５のインビトロアルギニンメチル化の定量的画像分析を提示する。図１６Ａ～図１６Ｄは、ＬＤＨアッセイによって測定されたＧＲ_１５（３μＭ）（図１６Ａおよび図１６Ｂ）ならびにＰＲ_１５（３μＭ）（図１６Ｃおよび図１６Ｄ）によって生成された細胞毒性を無効にするＭＳ０４９（０．２～１００μＭ）の活性を比較するグラフである。ＭＳ０４９が、ＮＳＣ－３４細胞の非対称性アルギニンメチル化を減少させることを示すグラフである。図１８Ａ～図１８Ｆは、ネガティブコントロールＭＳ０９４（０．２～６０μＭ）を用いて（図１８Ｅおよび図１８Ｆ）、ＷＳＴ－１アッセイによって測定されたＧＲ_１５（３μＭ）（図１８Ａおよび図１８Ｂ）ならびにＰＲ_１５（３μＭ）（図１８Ｃおよび図１８Ｄ）によって生成された代謝異常を無効にするＭＳ０２３（０．２～６０μＭ）の活性を比較するグラフである。図１９Ａ～図１９Ｆは、ネガティブコントロールＭＳ０９４（０．２～６０μＭ）を用いて（図１８Ｅおよび図１８Ｆ）、ＬＤＨアッセイによって測定されたＧＲ_１５（３μＭ）（図１９Ａおよび図１９Ｂ）ならびにＰＲ_１５（３μＭ）（図１９Ｃおよび図１９Ｄ）によって生成された細胞毒性を無効にするＭＳ０２３（０．２～６０μＭ）の活性を比較するグラフである。図２０Ａ～図２０Ｄは、ＬＤＨアッセイによって測定されたＧＲ_１５（３μＭ）（図２０Ａおよび図２０Ｂ）ならびにＰＲ_１５（３μＭ）（図２０Ｃおよび図２０Ｄ）によって生成された細胞毒性を無効にするＭＳ０４９（０．２～１００μＭ）の活性を比較するグラフである。図２１Ａ～図２１Ｄは、ＷＳＴ－１アッセイによって測定されたＧＲ_１５（３μＭ）（図２１Ａおよび図２１Ｂ）ならびにＰＲ_１５（３μＭ）（図２１Ｃおよび図２１Ｄ）によって生成された代謝異常を無効にするＥＰＺ０２０４１１（０．２～２０μＭ）の活性を比較するグラフである。図２２Ａ～図２２Ｄは、ＬＤＨアッセイによって測定されたＧＲ_１５（３μＭ）（図２２Ａおよび図２２Ｂ）ならびにＰＲ_１５（３μＭ）（図２２Ｃおよび図２２Ｄ）によって生成された細胞毒性を無効にするＥＰＺ０２０４１１（０．２～２０μＭ）の活性を比較するグラフである。図２３Ａ～図２３Ｆは、０．１０％ＤＭＳＯコントロールを用いて（図２３Ｅおよび図２３Ｆ）、ＷＳＴ－１アッセイによって測定されたＧＲ_１５（３μＭ）（図２３Ａおよび図２３Ｂ）ならびにＰＲ_１５（３μＭ）（図２３Ｃおよび図２３Ｄ）によって生成された代謝異常を無効にするＧＳＫ３３６８７１５（０．１～１０μＭ）の活性を比較するグラフである。図２４Ａ～図２４Ｄは、ＷＳＴ－１アッセイによって測定されたＧＲ_１５（３μＭ）によって生成された代謝異常を無効にするＧＳＫ３３６８７１５（０．１～１０μＭ）（図２４Ａおよび図２４Ｂ）ならびにＭＳ０２３（０．１～１０μＭ）（図２４Ｃおよび図２４Ｄ）の活性を比較するグラフである。図２５Ａ～図２５Ｄは、ＬＤＨアッセイによって測定されたＧＲ_１５（３μＭ）（図２５Ａおよび図２５Ｂ）ならびにＰＲ_１５（３μＭ）（図２５Ｃおよび図２５Ｄ）によって生成された細胞毒性を無効にするＧＳＫ３３６８７１５（０．１～１０μＭ）の活性を比較するグラフである。図２６Ａ～図２６Ｄは、ＷＳＴ－１アッセイによって測定されたＰＲ_１５（３μＭ）によって生成された代謝異常を無効にするＧＳＫ５９１（３～２００μＭ）（図２６Ａおよび図２６Ｂ）ならびにＭＳ０２３（０．１～６０μＭ）（図２６Ｃおよび図２６Ｄ）の活性を比較するグラフである。図２７Ａ～図２７Ｅは、ＷＳＴ－１アッセイによって測定されたＧＲ_１５および非対称性ジメチル化（ＡＤＭｅ）－ＧＲ_１５によって生成された代謝異常の用量反応パターンを比較するグラフである。図２８Ａ～図２８Ｅは、ＬＤＨアッセイによって測定されたＧＲ_１５および非対称性ジメチル化（ＡＤＭｅ）－ＧＲ_１５によって生成された細胞毒性の用量反応パターンを比較するグラフである。図２９Ａ～図２９Ｄは、ＷＳＴ－１アッセイによって測定され、かつ異なる３つの日に別々に繰り返されたＧＲ_１５およびＡＤＭｅ－ＧＲ_１５によって生成された代謝異常を無効にするＭＳ０２３（０．１～１０μＭ）の活性を比較するグラフである。図３０Ａ～図３０Ｄは、ＷＳＴ－１アッセイによって測定され、かつ異なる３つの日に別々に繰り返されたＧＲ_１５およびＡＤＭｅ－ＧＲ_１５によって生成された代謝異常を無効にするＭＳ０２３（０．１～１０μＭ）の活性を比較するグラフである。図３１Ａ～図３１Ｄは、ＷＳＴ－１アッセイによって測定され、かつ異なる３つの日に別々に繰り返されたＧＲ_１５およびＡＤＭｅ－ＧＲ_１５によって生成された代謝異常を無効にするＭＳ０２３（０．１～１０μＭ）の活性を比較するグラフである。図３２Ａ～図３２Ｄは、ＬＤＨアッセイによって測定されたＧＲ_１５（３μＭ）（図３２Ａおよび図３２Ｂ）ならびにＡＤＭｅ－ＧＲ_１５（３μＭ）（図３２Ｃおよび図３２Ｄ）によって生成された細胞毒性を無効にするＭＳ０２３（０．１～１０μＭ）の活性を比較するグラフである。ジメチル化活性の阻害のためのＩＣ５０、およびＧＲ_１５またはＰＲ_１５チャレンジによって引き起こされた毒性の無効化に対するＥＣ５０、および試験された各化合物の化学構造を要約した表である。本明細書に記載のアッセイの結果を示す概略図である。

本発明は、細胞を有効量のＩ型ＰＲＭＴ阻害剤（例えば、ＭＳ０２３、ＭＳ０４９、ＥＰＺ０２０４１１、ＧＳＫ７１５、ＴＰ０６４、および／またはそれらの誘導体など、ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ３、ＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ６、またはＰＲＭＴ８の少なくとも１つを阻害する薬品）と接触させることによって、細胞内のＤＲＰ誘発毒性を阻害する（例えば、ＧＲおよび／またはＰＲなどのジペプチドリピート内のアルギニン基質の非対称性メチル化によって生じる毒性を無効にする）方法であって、細胞機能障害または細胞死が抑制される方法を提供する。本明細書でさらに提供されるのは、有効量のＩ型ＰＲＭＴ阻害剤を投与することによってＤＲＰ（例えば、ＡＬＳまたはＦＴＤ）の発現に関連する神経変性疾患を治療する方法、ならびに神経変性疾患の治療における、または神経変性疾患の治療に使用するための薬剤の製造のためのＩ型ＰＲＭＴ阻害剤の使用である。

［Ｉ．定義］
以下の略語は、本明細書全体で使用され、当業者に知られている：ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）;ＦＴＤ（前頭側頭型認知症）;Ｃ９ＯＲＦ７２（９番染色体オープンリーディングフレーム７２）;ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ－１）;およびＰＲＭＴ（タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ）。

以下の説明、および参照により組み込まれた文書において、いくつかの用語が広範囲にわたり使用されている。以下の定義は、本明細書に開示された方法および組成物の理解を容易にするために提供される。

本明細書で使用される場合、「ジペプチドリピートタンパク質」（ＤＲＰ）とは、２つのアミノ酸の繰り返し単位からなるペプチドを指す。ＤＲＰの例として、変異Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子（拡張されたＧＧＧＧＣＣリピートを含有する）から転写されたＲＮＡは、非ＡＵＧによって開始されたメカニズム(a non-AUG initiated mechanism)を介して翻訳されるときに形成されるＤＲＰが挙げられる。ヘキサヌクレオチドリピートのセンスまたはアンチセンス方向のいずれかで６つのリーディングフレームすべてから翻訳されたＤＲＰは、５つのＤＲＰ：グリシン－アラニン（ＧＡ）、グリシン－アルギニン（ＧＲ）、プロリン－アラニン（ＰＡ）、プロリン－アルギニン（ＰＲ）およびグリシン－プロリン（ＧＰ；ＧＰは特に、センスおよびアンチセンスリーディングフレームの両方から生成することができる）の発現をもたらす。

ＤＲＰは、例えば、遺伝子（Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子など）の正常な機能を妨害することによって、ならびに細胞タンパク質を妨害することによって、細胞に対して「毒性」を示し、それゆえに、細胞の機能障害、変性および死をもたらすことが示されている。したがって、「有毒な(toxic)」および「毒性(toxicity)」という用語は、交換可能に使用され、ならびに物質（例えば、ＤＲＰまたはＤＲＰの混合物）が細胞（例えば、神経細胞）および／またはその細胞を構成するヒト、動物、細菌などといった生物に損傷を与え得る程度を指す。そのような毒性作用は、例えば、細胞機能の喪失および／または細胞死を含む。

本明細書で使用される場合、「メチルトランスフェラーゼ」という用語は、メチル基を供与体分子から受容体分子、例えば、タンパク質のアミノ酸残基またはＤＮＡ分子の核酸塩基に転移することができる転移酵素のクラスを指す。メチルトランスフェラーゼは通常、メチル供与体としてＳ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の硫黄に結合した反応性メチル基を用いる。メチルトランスフェラーゼの１種の例として、「タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ」（ＰＲＭＴ）が挙げられる。ＰＲＭＴは、アルギニン残基のメチル化（タンパク質の一般的な翻訳後修飾）を触媒する。アルギニンのジメチル化は、中間体ω－ＮＧ－モノメチルアルギニンを介して進行し、対称ω－ＮＧ，Ｎ‘Ｇ－ジメチルアルギニンまたは非対称ω－ＮＧ，ＮＧ－ジメチルアルギニンのいずれかをもたらす。ＰＲＭＴは、最終生成物に応じてＩ型酵素およびＩＩ型酵素に分類される。どちらのクラスも、モノメチル化アルギニンの形成を触媒する。Ｉ型ＰＲＭＴは、中間体ω－ＮＧ－モノメチルアルギニンを非対称ジメチルアルギニンに変換し、一方、ＩＩ型ＰＲＭＴは、中間体ω－ＮＧ－モノメチルアルギニンを対称ジメチルアルギニンに変換する。哺乳類では、Ｉ型ＰＲＭＴは、ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ３、ＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ６、およびＰＲＭＴ８を含む。

ＰＲＭＴの「阻害剤」（例えば、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤）は、ＰＲＭＴ（例えば、Ｉ型ＰＲＭＴ）の活性を「阻害」または「遮断」する分子である。「阻害する」または「遮断する」という用語は、交換可能に使用され、例えば本明細書に記載の方法によって決定されるように、部分的および完全な阻害／遮断の両方を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％包含する。あるいは、阻害剤（例えば、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤）による阻害／遮断は、例えば本明細書に記載の方法によって決定されるように、細胞活性および／または細胞寿命の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％を増加させる結果をもたらす。ＰＲＭＴの阻害剤は、例えば、ＭＳ０２３、ＭＳ０４９、ＥＰＺ０２０４１１、ＧＳＫ７１５、および／またはＴＰ０６４を含む。

「有効量」という用語は、所望の生物学的、治療的および／または予防的結果を提供する薬品の量を指す。上記結果は、疾患の兆候、症状または原因の１つ以上の低減、改善、寛解、軽減、遅延、および／または緩和、あるいは生物学的システムの他の望ましい変化であり得る。組成物の治療有効量は、病状、年齢、性別、および個体の体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する薬剤の能力などの要因に従って変化し得る。治療有効量はまた、薬剤のいかなる毒性または有害な効果よりも治療的に有益な効果の方が上回る量でもある。

細胞の毒性の減少に関して、有効量とは例えば、細胞増殖の速度を、異常増殖していない健康で未処理の細胞の速度に等しくするために十分な量を含む。神経変性疾患（例えばＡＬＳまたはＦＴＤ）の治療に関して、有効量とは、疾患に関連する症状（例えば筋力低下および／または認知障害）を予防または遅延させるのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与で施すことができる。一例では、「有効量」とは、疾患に関連する症状（例えばＡＬＳまたはＦＴＤ）の有意な改善に影響を与えることが臨床的に証明されているＩ型ＰＲＭＴの量である。

本明細書で使用される場合、「固定用量(fixed dose)」、「フラット用量(flat dose)」および「フラット固定用量(flat-fixed dose)」という用語は交換可能に使用され、患者の体重または体表面積（ＢＳＡ）に関係なく該患者に投与される一定の用量を指す。したがって、固定用量またはフラット用量は、ｍｇ／ｋｇ用量としてではなく、薬品の絶対量として提供される（例えば、Ｉ型ＰＲＭＴ）。

「神経細胞」という用語は、神経系の機能単位であり、細胞体とそのプロセス、軸索および樹状突起からなる、特殊なインパルス伝導細胞を指す。神経細胞は、感覚ニューロン、運動ニューロンおよび介在ニューロンを含む。

「神経幹細胞」または「神経前駆細胞」または「神経前駆体細胞」という用語は、神経細胞（神経前駆細胞または成熟ニューロンなど）またはグリア細胞（グリア前駆細胞、成熟星状細胞、または成熟オリゴデンドロサイトなど）のいずれかである子孫(progeny)を生成できる細胞を指す。通常、細胞は、神経系統に特徴的な表現型マーカーのいくつかを発現する。

本明細書で使用される場合、「対象（subject）」という用語は、ヒトまたは他の動物、例えば、神経学的疾患を有するヒトである。いくつかの実施形態において、対象とは哺乳類である。対象の例として、これらに限定されないが、ヒト、馬、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヤギ、およびヒツジが挙げられる。いくつかの実施形態において、「対象」は、一般に、ＡＬＳまたはＦＴＤと診断されたヒト患者である。

「Ｃ９ＯＲＦ７２連鎖性ＡＬＳ」および「Ｃ９ＯＲＦ７２連鎖性ＦＴＤ」という用語は、それぞれ、拡張ヘキサヌクレオチド（ＧＧＧＧＣＣ）リピート変異、例えば上記のＣ９ＯＲＦ７２変異を有する個人を悩ますＡＬＳおよびＦＴＤの形態を指す。一般集団（ＡＬＳまたはＦＴＤの影響を受けない）では、９番染色体のオープンフレーム領域７２は、通常、３～１０回のＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートの束(tract)を示し、ほとんどの場合、２０回未満のリピートを示す。したがって、９番染色体のオープンフレーム領域７２において２０を超えるヘキサヌクレオチドリピートまたは３０を超えるヘキサヌクレオチドリピートを有するＡＬＳまたはＦＴＤに悩まされる個人は、「Ｃ９ＯＲＦ７２連鎖性ＡＬＳ」または「Ｃ９ＯＲＦ７２連鎖性ＦＴＤ」を患う可能性がある。

本明細書で使用される「治療(treatment)」または「治療する(treating)」という用語は、神経変性および／または神経筋疾患などの神経学的疾患の発症の予防、進行の遅延、後退、またはその他の方法での改善を包含することを意図している。

本明細書で使用される「神経変性疾患」という用語は、ニューロンの特定の集団の進行性の機能障害、変性および死を特徴とする状態を指す。神経変性疾患の例として、例えば、ＡＬＳおよびＦＴＤが挙げられ、これらは年齢依存性の浸透度を伴う常染色体優性の様式で遺伝し得る「Ｃ９ＯＲＦ７２連鎖性ＡＬＳ」および「Ｃ９ＯＲＦ７２連鎖性ＦＴＤ」を含む。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他意を示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「分子(a molecule)」へ言及すると、そのような分子の１つ以上を含み、「方法(the method)」へ言及すると、本明細書に記載された方法の代わりに修正または置換することができる当業者に知られた同等のステップおよび方法への言及を含む。

「約(about)」または「おおよそ(approximately)」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定システムの限界、または特定の目的に必要な精度の程度に部分的に依存するだろう。例えば、「約」は、当技術分野の慣行に従って、１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、さらにより好ましくは最大１％の範囲を意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は、特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味すると想定されるべきである。

［ＩＩ．組成物］
さらに、本発明の方法で用いられる組成物、例えば医薬組成物が提供される。そのような組成物は、薬学的に許容される担体と一緒に処方されたＩ型ＰＲＭＴ阻害剤を含有する。Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、例えば、ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ３、ＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ６、および／またはＰＲＭＴ８を阻害する薬品である、例えばＭＳ０２３、ＭＳ０４９、ＥＰＺ０２０４１１、ＧＳＫ７１５、および／またはＴＰ０６４を含む。

１つの例示的なＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、以下の化学式を有するＭＳ０２３として知られる化合物である：

別の例示的なＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、以下の化学式を有するＭＳ０４９として知られる化合物である：

別の例示的なＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、以下の化学式を有するＥＰＺ０２０４１１として知られる化合物である：

別の例示的なＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、以下の化学式を有するＧＳＫ７１５として知られる化合物である：

別の例示的なＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、以下の化学式を有するＴＰ０６４として知られる化合物である：

より一般的には、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤はまた、例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１６／０１３７６０９およびＵＳ２０１９／００７７７９５に記載されている化合物を含み得、これらは両方ともマサチューセッツ州ケンブリッジのエピザイム社に譲渡され、またはＵＳ２０１００１５１５０６は、サウスカロライナ大学に譲渡され、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という句は、化学薬品の運搬または輸送に関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などの薬学的に許容される材料、組成物または媒介物(vehicle)を意味する。薬学的に許容される担体の例は、溶媒、希釈剤、分散媒、懸濁助剤、界面活性剤、防腐剤、固体結合剤、安定剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などで、生理学的に互換性があるものである。医薬組成物の処方に使用される様々な媒介物および担体、ならびにそれらを調製するための既知の技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences（A. Osol et al. eds.、15^th ed. 1975）に開示されている。薬学的に許容される担体は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤などの補助物質をさらに少量含み得、それらは薬剤の貯蔵寿命または有効性を高める。

薬学的に許容される担体はまた、薬学的に許容される塩も含み、「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に記載の化合物に見られる特定の置換基に依存して、比較的に非毒性の酸または塩基で調製される活性化合物の塩を含む。薬学的に許容される塩は、これらに限定されないが、酸性基または塩基性基の塩を含む。本質的に塩基性である化合物は、さまざまな無機酸および有機酸とさまざまな塩を形成することができる。そのような塩基性化合物の薬学的に許容される酸付加塩を調製するために使用できる酸は、非毒性の酸付加塩、すなわち、以下に限定されないが、硫酸、チオ硫酸、クエン酸、マレイン酸、酢酸、シュウ酸、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチス酸塩(gentismate)、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p－トルエンスルホン酸塩、重炭酸塩、マロン酸塩、メシレート、エシレート、ナプシジシフェート、トシレート、ベシレート、オルトホスフェート、トリフルオロアセテート、およびパモエート（すなわち、１，１‘－メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３－ナフトエート））塩を含む薬学的に許容される陰イオンを含有する塩を形成するものである。アミノ部分を含む化合物は、上述した酸に加えて、様々なアミノ酸と薬学的に許容される塩を形成し得る。本質的に酸性である化合物は、さまざまな薬学的に許容されるカチオンと塩基性塩を形成することができる。そのような塩の例として、以下に限定されないが、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、特にカルシウム、マグネシウム、アンモニウム、ナトリウム、リチウム、亜鉛、カリウム、および鉄の塩が挙げられる。本発明はまた、本明細書に記載の化合物の第四級アンモニウム塩も含み、これは、化合物が１つ以上の第三級アミン部分を有する。

上記担体は、本発明の化合物を治療される患者による経口摂取用に、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することを可能にする。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、馬鈴薯デンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物などの充填剤である。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩などの崩壊剤を添加してもよい。一実施形態において、マンニトールおよびステアリン酸マグネシウムが、薬学的に許容される担体として使用される。

いくつかの好ましい実施形態において、本発明の化合物は、アジュバントと共に投与される。「アジュバント」という用語は、単独で投与されても有意な活性を欠くが、別の治療薬の活性を増強することができる化合物となることができる。いくつかの実施形態において、アジュバントは、緩衝液、抗菌性保存剤、界面活性剤、抗酸化剤、強壮調節剤(tonic regulators)、防腐剤、増粘剤および粘度向上剤からなる群から選択される。

本発明の医薬組成物は、様々な形態であり得る。これらは、例えば、液体溶液（例えば、注射可能および注入可能な溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、ピル、粉末、リポソームおよび坐剤などの液体、半固体および固体の剤形を含む。好ましい形態は、意図される投与様式および治療用途に依存する。一実施形態において、好ましい投与様式は経口送達である。

本発明の化合物を投与するために、錠剤、ゲルキャップ、カプセル、カプレット、顆粒、トローチおよびバルク粉末などの固体形態を含む、様々な固体経口剤形を使用することができる。

本発明の化合物を投与するために、水溶液および非水溶液、乳濁液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルを含む、様々な液体経口剤形を使用することもできる。そのような剤形はまた、水などの当技術分野で知られている適切な不活性希釈剤、および防腐剤、湿潤剤、甘味料、香味料などの当技術分野で知られている適切な賦形剤、ならびに本発明の化合物を乳化および／または懸濁するための薬品を含有することもできる。本発明の化合物は、等張性の無菌溶液の形で、例えば静脈内に注射してもよい。

治療用組成物は、通常、製造および保管の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の秩序構造として処方され得る。無菌注射液は、必要な量の活性化合物（すなわち、薬剤）を、必要に応じて上に列挙した成分の１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に組み込んだ後、濾過滅菌することによって調製することができる。

一般に、分散液は、活性化合物を、基礎となる(basic)分散媒および上に列挙したものから必要な他の成分を含有する無菌媒介物に組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌凍結乾燥粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分の粉末に加えて、以前に滅菌濾過された溶液から任意の追加の所望した成分が得られる真空乾燥および噴霧乾燥である。溶液の流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬品、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって引き起こすことができる。

補足的な活性化合物もまた、組成物に組み込むことができる。特定の実施形態において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、薬剤の薬物動態を改善するため、および／または変性疾患を治療するために有用な１つ以上の追加の治療剤と同時処方および／または同時投与される。

［ＩＩＩ．方法］
本明細書で提供されるのは、当技術分野で知られている様々な方法によるＩ型ＰＲＭＴ阻害剤の投与を含む、神経変性疾患を治療するための臨床的方法である。投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的応答）を提供するように調整され得る。例えば、単一のボーラス(bolus)を投与してよく、いくつかの分割された用量を経時的に投与してよく、または治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に低減または増加させてもよい。一実施形態において、最初のボーラス用量とそれに続くより少ない維持用量が投与される。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投与単位形態で組成物を処方することは特に有利である。

本明細書で使用される投与単位形態とは、治療される哺乳類対象に対し単一投与量として適した物理的に個別の単位を指し；各単位は、必要な医薬担体に伴って所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の投与単位形態の仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果または予防的効果、および（ｂ）個人における感受性の扱い方(treatment of sensitivity)に対して上記の活性化合物を配合する技術に内在する制限によって決定、およびそれに直接依存する。

投与量の値は、緩和されるべき状態のタイプおよび重症度によって変化し得ることに留意されたい。さらに、特定の対象について、特定の投与計画は、組成物の投与を管理または監督する人の個々の必要性および専門家の判断に従って経時的に調整されるべきであり、本明細書に記載の投与量範囲は単なる例示であり、請求された組成物の範囲または実施を制限することを意図するものではないことをさらに理解されたい。

ヒト患者の神経変性疾患（例えば、ＡＬＳまたはＦＴＤ）を治療するための適切な治療プロトコルは、例えば、疾患の兆候、症状または原因の１つ以上の低減、改善、寛解、軽減、遅延、および／または緩和（例えば、筋力低下の減少）、あるいは生物学的システムの他の望ましい変化をもたらす有効量のＩ型ＰＲＭＴ阻害剤を患者に投与することを含む。あるいは、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、約０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、または３．０μＭ、好ましくは約１．０μＭまたは３．０μＭのフラット用量で投与される。

他の実施形態において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤の用量は、体重あたり、例えば、ｍｇ／ｋｇ体重で計算される。別の実施形態において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤の用量は、フラット固定用量である。別の実施形態において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤の用量は、時間とともに変化する。例えば、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、最初は高用量で投与されてもよく、そして時間とともに低下され得る。別の実施形態において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤抗体は、最初は低用量で投与され、時間とともに増加させる。

別の実施形態において、投与されるＩ型ＰＲＭＴ阻害剤の量は、各用量に対して一定である。別の実施形態において、投与される阻害剤の量は、各用量によって変化する。例えば、阻害剤の維持（または後続の）用量は、最初に投与される負荷用量よりも高いか同じかであり得る。別の実施形態において、阻害剤の維持用量は、負荷用量よりも低いか同じかであり得る。

以下の実施例は単なる例示であり、本開示を読むと当業者には多くの変形および同等物が明らかになるため、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

本出願を通して引用されたすべての参考文献、ＧｅｎＢａｎｋエントリー、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

本発明は、さらなる限定として解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明される。本出願を通して引用されたすべての図およびすべての参考文献、特許、ならびに公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

［材料および方法］
以下に記載の実施例では、以下の材料と方法を使用した。

ＷＳＴ－１アッセイ：ＷＳＴ－１アッセイは、細胞代謝を測定する比色分析である。代謝の良好な細胞は、特定の分子から水素原子を除去するミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ酵素を含有し、結果として、細胞が重要な反応を実行するために使用できるエネルギーの放出につながる。ＷＳＴ－１アッセイでは、水溶性テトラゾリウム塩基質（ＷＳＴ－１として知られる）が適用され、これは、適用時に細胞およびそのミトコンドリアに容易に侵入する。細胞が生存している場合、それらのミトコンドリアデのヒドロゲナーゼ酵素は反応を触媒して、このＷＳＴ－１基質をホルマザンと呼ばれる着色生成物に変換する。生細胞によるこの着色されたホルマザン生成物の生成は、分光光度計（プレートリーダー）を用いて定量化することができる。吸光度の読み取り値が高いほど、代謝活性／細胞生存率が高くなる。

ＬＤＨアッセイ：ＬＤＨアッセイは、細胞の毒性および死を測定する比色分析である。細胞が細胞毒性化合物にさらされると、ネクローシスと呼ばれる一種の細胞死を起こし得、これは最初に細胞膨潤および細胞膜の完全性の喪失をもたらす。細胞が膜完全性を失うと、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）と呼ばれる生細胞に見られる酵素が、死にかけている細胞を取り巻く溶液に放出される。プログラムされた細胞死、アポトーシス、ならびに他の形態の細胞死もまた、最終的に細胞膜の破壊へとつながり、細胞外空間へのＬＤＨの大量放出をもたらす。したがって、ＬＤＨはネクローシスだけでなく、細胞死のすべての例の優れたマーカーである。ＬＤＨアッセイでは、細胞を取り巻く溶液のサンプルが分離され、ＬＤＨ反応混合物を含むプレートに移される。この反応混合物は、テトラゾリウム塩の中間体および他の反応成分を含有しており、これらはＬＤＨにさらされると、テトラゾリウム塩を、着色されたホルマザン生成物に変換する。このホルマザン生成物は、分光光度法で定量化できる。吸光度の測定値が大きいほど、細胞死が多いこととなる。

カスパーゼ－３／ＣＰＰ３２アッセイ：カスパーゼ－３アッセイは、アポトーシス細胞死を測定する蛍光測定アッセイである。アポトーシスは「プログラムされた」細胞死の一形態であり、細胞内の特定のタンパク質ファミリーが、細胞を自死させる一連の化学反応の引き金となる。このプロセスに関与するタンパク質の１つのファミリーが、カスパーゼタンパク質ファミリーである。カスパーゼタンパク質のうち、カスパーゼ－２、８、９、および１０は、「イニシエーター」として知られ、デスカスケード(death cascade)のトリガーとなり、カスパーゼ－３、６、および７は、「エクスキューショナー」として知られ、実際に細胞を殺す。カスパーゼ－３アッセイでは、試験化合物で処理された細胞が溶解され、ＤＥＶＤ－ＡＦＣとして知られる基質が、溶解物に添加される。活性カスパーゼ－３酵素が溶解物に存在する場合、ＤＥＶＤ－ＡＦＣ基質からＡＦＣを切断し、蛍光マイクロタイタープレートリーダーを用いて定量できる蛍光シグナルをもたらす。したがって、試験化合物で処理された細胞のアポトーシス活性を定量化することができる。蛍光測定値が大きいほど、アポトーシス細胞死がより多いこととなる。

ＢｒｄＵＥＬＩＳＡ：ＢｒｄＵＥＬＩＳＡは、細胞増殖活性を検出するＥＬＩＳＡである。ＢｒｄＵは、ピリミジン類似体であり、細胞内にある場合、チミジンの代わりに新しく合成されたＤＮＡ鎖に組み込まれ得る。ＤＮＡへのチミジンの組み込みによって示されるように、細胞ＤＮＡへのＢｒｄＵの組み込みは、ＤＮＡ合成活性を示し、それは細胞増殖に必要となる。ＢｒｄＵＥＬＩＳＡでは、細胞を試験化合物およびＢｒｄＵ試薬で処理し、試験前に２４時間インキュベートする。試験中、抗ＢｒｄＵ抗体が、細胞増殖活性の代用として、２４時間にわたって発生した細胞ＤＮＡへのＢｒｄＵの組み込みを検出する。次いで、この抗ＢｒｄＵ抗体を、分光光度法で定量できる着色基質でタグ付けされた二次抗体でラベリングする。吸光度の読み取り値が大きいほど、細胞増殖活性が高いこととなる。

ＰＲＭＴ阻害剤：Ｉ型およびＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤を、表１にリストされている実施例において試験した。ジメチル化活性の阻害のためのＩＣ５０、およびＧＲ_１５またはＰＲ_１５チャレンジによって引き起こされる毒性の無効化のためのＥＣ５０、および試験された各化合物の化学構造を要約した図３３も参照されたい。

合成ジペプチドリピートタンパク質（ＤＲＰ）：ＤＲＰ毒性は、ＧＲ、ＰＲ、ＧＰまたはＰＡの１５ｍｅｒジペプチドリピート配列を細胞に投与することによって誘発された。

ＮＳＣ－３４細胞培養：ＮＳＣ－３４細胞（Cedarlane Laboratories、バーリントン、オンタリオ州、カリフォルニア州）を、１０％ＵＳ－起源ウシ胎児血清（Thermo-Fisher Scientific、マサチューセッツ州ケンブリッジ、米国）を添加した高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（Millipore-Sigma、マサチューセッツ州バーリントン、米国）、１％２００ｍＭＬ－グルタミン溶液（Thermo-Fisher Scientific、マサチューセッツ州ケンブリッジ、米国）、および１％１０，０００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Thermo-Fisher Scientific、マサチューセッツ州ケンブリッジ、米国）からなる完全培地で培養した。ＮＳＣ－３４完全培地を調製する前に、Ｌ－グルタミンおよびペニシリン－ストレプトマイシン溶液を分注して－２０℃で保存し、ＤＭＥＭ／高グルコースを４℃で保存した。各継代で、細胞をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水とカルシウムおよびマグネシウム（Thermo-Fisher Scientific、マサチューセッツ州ケンブリッジ、米国）で一度洗浄し、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Thermo-Fisher Scientific、マサチューセッツ州ケンブリッジ、米国）で３７℃、５％ＣＯ_２で５分間処理し、解離させた。調製した完全培地、ＤＰＢＳおよびトリプシンは、使用前に常に３７℃のウォーターバスで加熱し、使用の合間には４℃で保存した。プレーティングのための細胞カウントは、Hausser Scientificセルカウントチャンバー（Thermo-Fisher Scientific、マサチューセッツ州ケンブリッジ、米国）を用いて実施した。

外因性ジペプチドリピートタンパク質溶液の調製：合成タンパク質ＧＲ_１５およびＰＲ_１５（GenicBio Limited、九龍、香港、中国）、ならびにＡＤＭｅ－ＧＲ_１５（Eurogentec、Leige、ベルギー）を凍結乾燥粉末として購入し、再構成前にデシケーター内にて－２０℃で保存した。タンパク質を無菌ＤＭＳＯ（Millipore-Sigma、マサチューセッツ州バーリントン、米国）で再構成し、ストック濃度を１０ｍＭにし、４℃で保存した。

ＰＲＭＴ阻害剤溶液の調製：小分子ＰＲＭＴ阻害剤ＭＳ０２３およびＧＳＫ５９１（Tocris Bioscience、ブリストン、英国）、ＭＳ０４９（ＭＳ０２３の不活性類似体）およびＥＰＺ０２０４１１（Cayman Chemical、ミシガン州アナーバー、米国）、ＧＳＫ３３６８７１５（Medchem Express、ニュージャージー州モンマスジャンクション、米国）、ならびにネガティブコントロールＭＳ０９４（Millipore-Sigma、マサチューセッツ州バーリントン、米国）を購入し、再構成の前後に－２０℃で保存した。表＿に特定された溶媒を用いて再構成した後、ストックを１５～２０μＬに分注し、すぐに－２０℃で保存した。

ＮＳＣ－３４のプレーティングとＤＲＰおよびＰＲＭＴ阻害剤の投与：ＮＳＣ－３４細胞を、透明で平底のフルボリュームの９６ウェル組織培養処理プレート（Thermo-Fisher Scientific,マサチューセッツ州ケンブリッジ、米国）にウェルあたり３．７７×１０^４細胞の密度でプレーティングした。プレートの上下に１列、プレートの両側２段を細胞無しの状態にし、実験ウェルの体積蒸発を最小限に抑えるために培地のみを含有させた。ＤＲＰ／ＰＲＭＴ阻害剤の添加時に、チャレンジ用のＤＲＰおよび治療用の阻害剤の所望の用量を、温かい培地で各ストックのアリコートを希釈することによって達成した。ＰＲＭＴ阻害剤およびＤＲＰの両方を使用した実験においては、ＰＲＭＴ阻害剤を常にウェルに最初に付与し、それに次いでＤＲＰを付与した。媒介物のコントロールは、ＤＲＰ処理、薬物処理またはその両方で処理されたものと同等のＤＭＳＯ濃度で処理されたウェルと同様に含まれていた。阻害剤毒性のコントロールは、実験に望ましい用量の薬物で処理されたウェルと同様に含まれていたが、ＤＲＰは含まれていなかった。ＤＲＰ毒性のコントロールは、チャレンジに使用された用量のＤＲＰでのみ処理されたウェルと同様に含まれた。投与すると、ＷＳＴ－１またはＬＤＨアッセイのエンドポイントを実行する前に、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。各エンドポイントに必要な追加のコントロールは、これら方法の「ＷＳＴ－１アッセイ」および「ＬＤＨアッセイ」のセクションで特定されている。

ＷＳＴ－１アッセイ：これらの方法の「ＮＳＣ－３４のプレーティングとＤＲＰおよびＰＲＭＴ阻害剤の投与」セクションで説明されているステップをもちいて、細胞をプレーティングおよび調製した。この実験の他のコントロールは、培地に細胞のみを含有したウェルおよび培地のみを含んだ。試験時には、培地をウェルから取り出し、カルシウムおよびマグネシウムを含むＤＰＢＳ、ならびに４．５ｇ／ＬのＤ－グルコース（Millipore-Sigma、マサチューセッツ州バーリントン、米国）からなる温めた滅菌濾過溶液と置き換えた。２００μＬのＤＰＢＳ－グルコース溶液を含有するウェルに、２０μＬ／ウェルのＷＳＴ－１試薬（Millipore-Sigma、カリフォルニア州バーリントン）を付与し、次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした後、プレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ３マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、カリフォルニア州サンノゼ、米国）にて４５０ｎｍで読み取った。実験は、条件ごとに３つのリプリケートを含んだ。各実験は２回繰り返した（合計３回実行した）。

ＬＤＨアッセイ：これらの方法の「ＮＳＣ－３４のプレーティングとＤＲＰおよびＰＲＭＴ阻害剤の投与」セクションで説明されているステップをもちいて、細胞をプレーティングおよび調製した。この実験の他のコントロールは、培地に細胞のみを有するウェルの複数のセット（「未処理」に指定された１つのトリプリケート、「溶解した」ポジティブコントロールに指定された１つのトリプリケート）、および培地のみを有するウェルを含む。試験時にトランスファープレートにのみ追加された追加のコントロールは、５μＬＬＤＨのみであった。試験は、製造者の指示通り、比色分析ＬＤＨ－細胞毒性アッセイキットＩＩ（Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）を使用して実施した。４５０ｎｍでの最終読み取り値は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ３マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、カリフォルニア州サンノゼ、米国）で実施した。データ分析は、以下の式を使用したＬＤＨ放出率の計算を含んだ：

実験は、条件ごとに３つのリプリケートを含んだ。各実験は２回繰り返した（合計３回実行した）。

（実施例１．ＷＳＴ－１アッセイで測定されたＮＳＣ－３４運動ニューロン様細胞において３μＭＧＲ_１５によって誘発された代謝異常を無効にするためのＭＳ０２３（Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤）およびＧＳＫ５９１（ＩＩ型ＰＲＭＴ、特にＰＲＭＴ５阻害剤）の比較）
細胞を２つの９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、各ウェルが受けるであろう処理に対応する互い違いの量（staggered volumes）の培地と置き換えた（すべてのウェルの最終容量が処理後２００μＬになるようにするため）。ＭＳ０２３の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を６０、３０、１０、３、および１μＭにした。同じプロトコルに従って、ＧＳＫ５９１の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を２００、１００、３３、１０、および３μＭにした。加えて、ＧＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＲ処理細胞が曝露された量のＤＭＳＯのみで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つでのみ処理された細胞
・３μＭＧＲ_１５およびＧＳＫ５９１のうち：２００μＭ、１００μＭ、３３μＭ、１０μＭ、３μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＧＳＫ５９１のうち：２００μＭ、１００μＭ、３３μＭ、１０μＭ、３μＭの用量のいずれか１つでのみ処理された細胞

プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。試験の直前に、培地を除去し、使用前に３７℃のウォーターバスで４℃から１０分間温めていた２００μＬのＰＢＳ－グルコース溶液（４．５ｇ／Ｌ、滅菌済み）と置き換えた。ＷＳＴ－１試薬のアリコートを－２０℃から解凍し、使用前に室温で平衡化した。２００μＬのＰＢＳ－グルコースを含有するウェルごとに、２０μＬのＷＳＴ－１試薬を添加した。プレートをＷＳＴ－１とともに３７℃、５％ＣＯ_２で１．２５時間インキュベートし、１５分ごとにＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ３）で吸光度の読み取り値（４５０ｎｍ）を取得した。データを、プレートリーダーのＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ７．０ソフトウェアからＥｘｃｅｌファイルにエクスポートした。

図１Ａ～図１Ｄに示されるように、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤ＭＳ０２３は、３μＭの用量で、ＮＳＣ－３４運動ニューロン様細胞におけるＧＲ誘発性代謝異常を無効にした。ＰＲＭＴ５（ＩＩ型ＰＲＭＴ）阻害剤ＧＳＫ５９１は、どの試験用量でもＧＲ誘発性代謝異常を無効にしなかった。

（実施例２．ＭＳ０２３（Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤）は、ＷＳＴ－１アッセイで測定されたＮＳＣ－３４運動ニューロン様細胞において３μＭＧＲ_１５または３μＭＰＲ_１５によって誘発された代謝異常を無効にする）
細胞をプレーティングし、実施例１のように一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＭＳ０２３の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、実施例１のように希釈した。加えて、ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＲおよびＰＲ処理細胞が曝露された量のＤＭＳＯのみで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＰＲのみ（３μＭＰＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＰＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つでのみ処理された細胞

プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。試験の直前に、培地を除去し、使用前に３７℃のウォーターバスで４℃から１０分間温めていた２００μＬのＰＢＳ－グルコース溶液（４．５ｇ／Ｌ、滅菌済み）と置き換えた。ＷＳＴ－１試薬のアリコートを－２０℃で解凍し、使用前に室温で平衡化した。２００μＬのＰＢＳ－グルコースを含有するウェルごとに、２０μＬのＷＳＴ－１試薬を添加した。プレートをＷＳＴ－１とともに３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートし、１５分ごとにＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ３）で吸光度の読み取り値（４５０ｎｍ）を取得した。データを、プレートリーダーのＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ７．０ソフトウェアからＥｘｃｅｌファイルにエクスポートした。

図２Ａ～図２Ｄに示されるように、３μＭおよび１μＭ用量のＭＳ０２３（Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤）は、３μＭ用量のＧＲ_１５またはＰＲ_１５のいずれかによって誘発されたＮＳＣ－３４の代謝異常を完全に無効にした。これらの用量はまた、上述の実験において代謝異常を完全に無効にした（実施例１を参照）。

（実施例３．ＷＳＴ－１アッセイで測定された３μＭ用量のＧＲ_１５またはＰＲ_１５によって誘発された代謝異常の無効化に対するＭＳ０２３（Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤）の低用量範囲（０．０１～３μＭ）の効果）
実施例１のように、細胞を培地にプレーティングした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＭＳ０２３の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を３、１、０．３、０．１、０．０３および０．０１μＭにした。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＲおよびＰＲ処理細胞が曝露された量のＤＭＳＯのみで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭおよび０．０１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＰＲのみ（３μＭＰＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＰＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭおよび０．０１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＭＳ０２３のうち：３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭおよび０．０１μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞

プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。試験の直前に、培地を除去し、使用前に３７℃のウォーターバスで４℃から１０分間温めていた２００μＬのＰＢＳ－グルコース溶液（４．５ｇ／Ｌ、滅菌済み）と置き換えた。ＷＳＴ－１試薬のアリコートを－２０℃から解凍し、使用前に室温で平衡化した。２００μＬのＰＢＳ－グルコースを含有するウェルごとに、２０μＬのＷＳＴ－１試薬を添加した。プレートをＷＳＴ－１とともに３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートし、１５分ごとにＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ３）で吸光度の読み取り値（４５０ｎｍ）を取得した。データを、プレートリーダーのＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ７．０ソフトウェアからＥｘｃｅｌファイルにエクスポートした。

図３Ａ～図３Ｄに示されるように、ＭＳ０２３は、３μＭのＧＲ_１５およびＰＲ_１５によって誘発された代謝異常を用量依存の形式で無効にする。用量依存的な代謝無効プロファイルは、ジペプチドリピートタンパク質によってわずかに異なる：ＧＲ処理細胞での代謝活性の有意な部分的無効化は、０.１μＭ程度の低いＭＳ０２３用量で見られるが、一方、ＰＲ処理細胞では、０.３μＭ程度の低いＭＳ０２３用量で見られた。言い換えれば、ＭＳ０２３は、このアッセイでＧＲ誘発性代謝異常をより強力に無効にした。

（実施例４．ＭＳ０２３（１～６０μＭ）ならびに、ＬＤＨアッセイで測定されたＧＲ_１５およびＰＲ_１５（３００ｎＭ）によって生成された細胞毒性の無効化）
実施例１のように、細胞を培地にプレーティングした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＭＳ０２３の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、実施例１のように希釈した。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３００ｎＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・低コントロール／「０％の毒性」（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＲおよびＰＲ処理細胞が曝露された量のＤＭＳＯのみで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３００ｎＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３００ｎＭＧＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＰＲのみ（３００ｎＭＰＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３００ｎＭＰＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞
・高コントロール／「１００％の毒性」（溶解バッファーで溶解させた細胞）
・ポジティブコントロール（５μＬＬＤＨ溶液）

プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。細胞を試験し、ＬＤＨアッセイによってデータを分析した。

図４Ａ～図４Ｄに示されるように、３００ｎＭ用量のＧＲ_１５で処理されたＮＳＣ－３４細胞に付与される場合、ＭＳ０２３の２つの最高用量（６０、３０μＭ）は、ＬＤＨアッセイにおいて細胞毒性を有意に増幅した。この表現型は、３００ｎＭＰＲ_１５で処理されたＮＳＣ－３４細胞では見られず、ＭＳ０２３のすべての用量において、少なくとも部分的にＰＲ誘発細胞毒性を無効にした。これらの結果は、２つのアルギニンリッチなＤＲＰ間のメカニズムの違いを示唆している。この現象は３００ｎＭでのみ観察され、各タンパク質の３μＭ用量（実験５で示されるデータ）では観察されなかった。

（実施例５．ＭＳ０２３（１～６０μＭ）ならびに、ＬＤＨアッセイで測定されたＧＲ_１５およびＰＲ_１５（３μＭ）によって生成された細胞毒性の無効化）
細胞を２つの９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＭＳ０２３の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、実施例１のように希釈した。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・低コントロール／「０％の毒性」（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＲおよびＰＲ処理細胞が曝露された量のＤＭＳＯのみで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＰＲのみ（３μＭＰＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３００ｎＭＰＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞
・高コントロール／「１００％の毒性」（溶解バッファーで溶解させた細胞）
・ポジティブコントロール（５μＬＬＤＨ溶液）

図５Ａ～図５Ｄに示されるように、ＭＳ０２３は、試験されたすべての用量でＧＲ誘発毒性を部分的に無効にした。ＭＳ０２３は、１０、３０および６０μＭの用量でＰＲ誘発毒性を部分的に無効にし、１および３μＭの用量でＰＲ誘発毒性を完全に無効にした。ＧＲ処理細胞およびＰＲ処理細胞におけるＭＳ０２３の無効化能力の違い（実施例４に見られるように）は、アルギニンリッチなＤＲＰのＧＲおよびＰＲにおけるわずかに異なるメカニズムをさらに示唆している。

（実施例６．ＭＳ０２３（０．０１～３μＭ）ならびに、ＬＤＨアッセイで測定されたＧＲ_１５およびＰＲ_１５（３μＭ）によって生成された細胞毒性の無効化）
細胞を２つの９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＭＳ０２３の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、および３μＭにした。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・低コントロール／「０％の毒性」（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＲおよびＰＲ処理細胞が曝露された量のＤＭＳＯのみで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＰＲのみ（３μＭＰＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＰＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＭＳ０２３のうち：３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞
・高コントロール／「１００％の毒性」（溶解バッファーで溶解させた細胞）
・ポジティブコントロール（５μＬＬＤＨ溶液）

プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。細胞を試験し、ＬＤＨアッセイキットの説明書に記載されている手順を使用して、データを分析した。

図６Ａ～図６Ｄに示されるように、ＭＳ０２３は、強力におよび用量依存的に、ＧＲおよびＰＲ誘発毒性の両方を無効にした。ＭＳ０２３は、０．０１、０．０３、０．１、および０．３μＭの用量でＧＲ誘発毒性を部分的に無効にし、０．３、１および３μＭの用量でＧＲ誘発毒性を完全に無効にした。ＭＳ０２３は、０．０１、０．０３および０．１μＭの用量でＰＲ誘発毒性を部分的に無効にし、０．０３、０．１、０．３、１および３μＭの用量でＰＲ誘発毒性を完全に無効にした。前の実施例と一貫して、ＭＳ０２３は、ＰＲ誘発毒性をより強力に無効にした。

（実施例７．ＭＳ０２３（１～６０μＭ）ならびに、カスパーゼ－３アッセイで測定されたＧＲ_１５およびＰＲ_１５（３００ｎＭ）によって誘発されたアポトーシス活性の無効化）
細胞を２つの９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＭＳ０２３の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、実施例１のように希釈した。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３００ｎＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・未処理／「細胞のみ」（培地中の細胞）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＲおよびＰＲ処理細胞が曝露された量のＤＭＳＯのみで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３００ｎＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＰＲのみ（３００ｎＭＰＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３００ｎＭＰＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞
・ポジティブコントロール（５または１６μＭのＰＡＣ－１カスパーゼ－３アクチベーターで処理された細胞）

プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。細胞を試験し、カスパーゼ－３アッセイキットの説明書に記載されている手順を使用して、データを分析した。

図７Ａ～図７Ｄに示されるように、ＭＳ０２３は、用量依存的にＧＲおよびＰＲ誘発性アポトーシス活性を無効にした。３００ｎＭＧＲによって誘発されたアポトーシス活性に対して、６０、３０、および１０μＭの用量のＭＳ０２３は、部分的に無効にし、３および１μＭの用量のＭＳ０２３は、完全に無効にした。ＭＳ０２３のすべての用量は、ＰＲ誘発性アポトーシス活性を完全に無効にした。

（実施例８．ＭＳ０２３（０．０１～３μＭ）ならびに、カスパーゼ－３アッセイで測定されたＧＲ_１５およびＰＲ_１５（３μＭ）によって誘発されたアポトーシス活性の無効化）
細胞を２つの９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＭＳ０２３の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を３、１、０．３、０．１、０．０３および０．０１μＭにした。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・未処理／「細胞のみ」（培地中の細胞）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＲおよびＰＲ処理細胞が曝露された量のＤＭＳＯのみで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＰＲのみ（３μＭＰＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＰＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＭＳ０２３のうち：３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞
・ポジティブコントロール（５または１６μＭのＰＡＣ－１カスパーゼ－３アクチベーターで処理された細胞）

図８Ａ～図８Ｄに示されるように、ＭＳ０２３は、用量依存的にＧＲおよびＰＲ誘発性アポトーシス活性を無効にした。ＧＲおよびＰＲ処理細胞の両方において、ＭＳ０２３のすべての用量は、ＧＲおよびＰＲ誘発性アポトーシス活性を部分的に無効にし、３μＭ用量のＭＳ０２３は、ＧＲおよびＰＲ誘発性アポトーシス活性を完全に無効にした。

（実施例９．ＭＳ０２３（１～６０μＭ）ならびに、ＢｒｄＵＥＬＩＳＡで測定されたＧＲ_１５およびＰＲ_１５（３００ｎＭ）によって誘発された増殖阻害の無効化）
細胞を２つの９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＭＳ０２３の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、実施例１のように希釈した。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３００ｎＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・培地のみ
・バックグラウンド（ＢｒｄＵ試薬を含まない、培地中の細胞のみ）
・未処理／（ＢｒｄＵ試薬を含む、培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＲおよびＰＲ処理細胞が曝露された量のＤＭＳＯのみで処理された細胞）およびＢｒｄＵ試薬
・ＧＲのみ（３００ｎＭＧＲ_１５およびＢｒｄＵ試薬で処理された細胞）
・３００ｎＭＧＲ_１５、ＢｒｄＵ試薬およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＰＲのみ（３００ｎＭＰＲ_１５およびＢｒｄＵ試薬で処理された細胞）
・３００ｎＭＰＲ_１５、ＢｒｄＵ試薬およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＢｒｄＵ試薬およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞

プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。細胞を試験し、ＢｒｄＵＥＬＩＳＡキットの説明書に記載されている手順を使用して、データを分析した。

図９Ａ～図９Ｄに示されるように、ＭＳ０２３は、試験されたすべての用量において、過剰な増殖を誘発することなく、ＧＲおよびＰＲによって誘発された増殖阻害を無効にした。ＭＳ０２３のすべての用量では、ＧＲ誘発性増殖阻害を部分的に無効にし、３μＭＭＳ０２３の用量では、ＧＲ誘発性増殖阻害を完全に救済した（rescuing）。ＭＳ０２３のすべての用量は、ＰＲ誘発性増殖阻害を完全に無効にした。

（実施例１０．チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびマウス神経芽細胞腫－脊髄ハイブリッド（ＮＳＣ－３４）細胞、ならびにアルギニンリッチ：ＧＲ_１５、ＰＲ_１５と非アルギニンリッチ：ＧＰ_１５、ＰＡ_１５、ＤＲＰ（３０および３μＭ用量）との両方を用いて、ＷＳＴ－１アッセイによって測定された神経細胞型および非神経細胞型におけるＤＲＰ誘発性代謝異常表現型の比較）
細胞を２つの９６ウェルプレートの２００μＬの培地にプレーティングした。プレート１では、ＣＨＯ細胞を１×１０^４細胞／ウェルの密度でプレーティングし、プレート２では、ＮＳＣ－３４細胞を２．５×１０^４細胞／ウェルの密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。以前のアッセイにおいて、ＣＨＯ細胞は、ＮＳＣ－３４細胞よりも２．５倍速く増殖することが立証されていたため、上記２つの細胞タイプには異なる密度を用いた。翌日、ＧＲ_１５、ＰＲ_１５、ＧＰ_１５、およびＰＡ_１５の１０ｍＭストックを室温で平衡化し、温かい培地で希釈して、各タンパク質の濃度を６００μＭ（プレートで３０μＭ）および６０μＭ（プレートで３μＭ）にした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＤＲＰ処理細胞が曝露された量のＤＭＳＯのみで処理された細胞）
ｉ．ＤＭＳＯコントロール１：３０μＭのＤＲＰ用量に対応する０．３％ＤＭＳＯ
ｉｉ．ＤＭＳＯコントロール２：３μＭのＤＲＰ用量に対応する０．０３％ＤＭＳＯ
・３０または３μＭＧＲ_１５で処理された細胞
・３０または３μＭＰＲ_１５で処理された細胞
・３０または３μＭＰＡ_１５で処理された細胞
・３０または３μＭＧＰ_１５で処理された細胞

プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートした。試験の直前に、培地を除去し、使用前に３７℃のウォーターバスで４℃から１０分間温めていた２００μＬのＰＢＳ－グルコース溶液（４．５ｇ／Ｌ、滅菌済み）と置き換えた。ＷＳＴ－１試薬のアリコートを－２０℃から解凍し、使用前に室温で平衡化した。２００μＬのＰＢＳ－グルコースを含有するウェルごとに、２０μＬのＷＳＴ－１試薬を添加した。プレートをＷＳＴ－１とともに３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートし、１５分ごとにＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ３）で吸光度の読み取り値（４５０ｎｍ）を取得した。データを、プレートリーダーのＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ７．０ソフトウェアからＥｘｃｅｌファイルにエクスポートした。

図１０Ａ～図１０Ｄに示されるように、ＤＲＰチャレンジは、非ニューロンＣＨＯおよび運動ニューロン様ＮＳＣ－３４細胞の両方において代謝機能の障害をもたらした。ただし、ＣＨＯと比較した場合、ＮＳＣ－３４では代謝活性の大幅な低下が観察された。これらの観察結果は、もっぱらアルギニンリッチなＤＲＰＧＲ_１５およびＰＲ_１５で処理された細胞でのみ観察され、このことは、運動ニューロン様ＮＳＣ－３４は、ＤＲＰチャレンジに対してより敏感であるだけでなく、特にアルギニンリッチなＤＲＰチャレンジに対してより敏感であることを示唆していた。

（実施例１１．ＬＤＨアッセイによって決定されたＮＳＣ－３４細胞におけるＤＲＰ誘発毒性の用量反応パターン）
細胞を２つの９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり５×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、ＧＲ_１５、ＰＲ_１５、ＧＰ_１５、およびＰＡ_１５の１０ｍＭストックを室温で平衡化し、温かい培地で希釈して、ＤＲＰ濃度を：３０、１０、３、１、０．３、０．１μＭ（プレートで達成される濃度の１０倍）にした。各濃度の１０μＬをプレート内の１００μＬのベース培地に添加して、ＤＲＰの最終濃度を３、１、０．３、０．１、０．０３、および０．０１μＭにした。

以下の条件をデュープリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・低コントロール／「０％の毒性」（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＤＲＰ処理細胞が各濃度で曝露された量のＤＭＳＯのみで処理された細胞）
ｉ．試験されたＤＭＳＯコントロールは以下のとおりであり、開始時のＤＲＰ用量（最高３μＭから最低０．０１μＭ）に対応し、培地で希釈した。
１．０．０３％ＤＭＳＯ
２．０．０１％ＤＭＳＯ
３．０．００３％ＤＭＳＯ
４．０．００１％ＤＭＳＯ
５．０．０００３％ＤＭＳＯ
６．０．０００１％ＤＭＳＯ
・３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つのＧＲ_１５で処理された細胞
・３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つのＰＲ_１５で処理された細胞
・３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つのＧＰ_１５で処理された細胞
・３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つのＰＡ_１５で処理された細胞
・高コントロール／「１００％の毒性」（溶解バッファーで溶解させた細胞）
・ポジティブコントロール（５μＬＬＤＨ溶液）

図１１に示すように、アルギニンリッチなＤＲＰ（ＧＲ_１５、ＰＲ_１５）処理は、２４時間インキュベートした場合、ＮＳＣ－３４細胞に有意な用量依存性毒性をもたらしたが、非アルギニンリッチなＤＲＰ（ＧＰ_１５、ＰＡ_１５）処理はそうではなかった。約１０％のＧＲ_１５およびＰＲ_１５毒性は、３００ｎＭという低い濃度を使用して達成された。ＧＲ_１５およびＰＲ_１５は、ほぼ同一の用量反応プロファイルを示し、ＧＲ_１５およびＰＲ_１５のＥＣ５０は、それぞれ５０±２６ｎＭおよび５６±２０ｎＭとなった。

（実施例１２．カスパーゼ－３アッセイによって決定されたＮＳＣ－３４細胞におけるＤＲＰ誘発性アポトーシス活性の用量反応パターン）
細胞を２つの９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり５×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、ＧＲ_１５、ＰＲ_１５、ＧＰ_１５、およびＰＡ_１５の１０ｍＭストックを室温で平衡化し、温かい培地で希釈して、ＤＲＰ濃度を：３０、１０、３、１、０．３、０．１μＭ（プレートで達成される濃度の１０倍）にした。各濃度の１０μＬをプレート内の１００μＬのベース培地に添加して、ＤＲＰの最終濃度を３、１、０．３、０．１、０．０３、および０．０１μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・未処理／「細胞のみ」（培地中の細胞）
・ＤＭＳＯコントロール（ＤＲＰ処理細胞が各濃度で曝露された量のＤＭＳＯのみで処理された細胞）
ｉ．試験されたＤＭＳＯコントロールは以下のとおりであり、開始時のＤＲＰ用量（最高３μＭから最低０．０１μＭ）に対応し、培地で希釈した。
１．０．０３％ＤＭＳＯ
２．０．０１％ＤＭＳＯ
３．０．００３％ＤＭＳＯ
４．０．００１％ＤＭＳＯ
５．０．０００３％ＤＭＳＯ
６．０．０００１％ＤＭＳＯ
・３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つのＧＲ_１５で処理された細胞
・３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つのＰＲ_１５で処理された細胞
・３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つのＧＰ_１５で処理された細胞
・３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つのＰＡ_１５で処理された細胞
・ポジティブコントロール（５または１６μＭのＰＡＣ－１カスパーゼ－３アクチベーターで処理された細胞）

図１２に示されるように、すべてのＤＲＰは、用量依存の形式でＮＳＣ－３４細胞においてアポトーシス活性を誘発した。アルギニンリッチなＤＲＰＧＲ_１５およびＰＲ_１５は一緒にクラスター化し、最も有意な量のアポトーシス活性を生み出した。非アルギニンリッチなＧＲ_１５およびＰＲ_１５も一緒にクラスター化し、ＤＭＳＯで処理したコントロールと比較した場合、アポトーシス活性のレベルが低くなった。

（実施例１３．ＢｒｄＵＥＬＩＳＡによって決定されたＮＳＣ－３４細胞におけるＤＲＰ誘発性増殖阻害の用量反応パターン）
細胞を２つの９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり５×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、ＧＲ_１５、ＰＲ_１５、ＧＰ_１５、およびＰＡ_１５の１０ｍＭストックを室温で平衡化し、温かい培地で希釈して、ＤＲＰ濃度を：３０、１０、３、１、０．３、０．１μＭ（プレートで達成される濃度の１０倍）にした。各濃度の１０μＬをプレート内の１００μＬのベース培地に添加して、ＤＲＰの最終濃度を３、１、０．３、０．１、０．０３、および０．０１μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・培地のみ
・バックグラウンド（ＢｒｄＵ試薬を含まない、培地中の細胞のみ）
・未処理／（ＢｒｄＵ試薬を含む、培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＢｒｄＵ試薬およびＤＲＰ処理細胞が各濃度で曝露された量のＤＭＳＯで処理された細胞）
ｉ．試験されたＤＭＳＯコントロールは以下のとおりであり、開始時のＤＲＰ用量（最高３μＭから最低０．０１μＭ）に対応し、培地で希釈した。
１．０．０３％ＤＭＳＯ
２．０．０１％ＤＭＳＯ
３．０．００３％ＤＭＳＯ
４．０．００１％ＤＭＳＯ
５．０．０００３％ＤＭＳＯ
６．０．０００１％ＤＭＳＯ
・ＢｒｄＵ試薬および３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つのＧＲ_１５で処理された細胞
・ＢｒｄＵ試薬および３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つのＰＲ_１５で処理された細胞
・ＢｒｄＵ試薬および３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つのＧＰ_１５で処理された細胞
・ＢｒｄＵ試薬および３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のいずれか１つのＰＡ_１５で処理された細胞

図１３に示されるように、非アルギニンリッチなＤＲＰＧＲ_１５およびＰＲ_１５は、ＤＭＳＯで処理されたコントロールと比較して、増殖活性に有意な影響を与えなかった。アルギニンリッチなＤＲＰＧＲ_１５およびＰＲ_１５はどちらも、用量依存の形式で増殖活性を有意に抑制し、ＰＲ_１５が最も強力な阻害剤であった。

（実施例１４．ＭＳ０２３は、ＮＳＣ－３４細胞の非対称性アルギニンメチル化を減少させる）
０日目に、ＮＳＣ－３４細胞を９６ウェルプレートの４８ウェルにプレーティングし、ＣＨＯ細胞を同じ９６ウェルプレートの他の４８ウェルにプレーティングした。ＮＳＣ－３４細胞を、ＤＭＥＭ／高グルコース培地にプレーティングした。ＣＨＯ細胞を、ハムのＦ－１２Ｋ（Kaighn’s）培地にプレーティングした。両方の細胞株を一晩インキュベートして、約５０％の培養密度に到達させた。

１日目に、２４ウェルのＮＳＣ－３４細胞および２４ウェルのＣＨＯ細胞を、１μＭ、３ μＭ、６μＭ、１０μＭ、３０μＭ、および６０μＭ濃度のＭＳ０２３で処理した。次いで、細胞を一晩インキュベートした。

２日目に、１８ウェルの未処理ＮＳＣ－３４細胞および１８ウェルの未処理ＣＨＯ細胞を、１日目と同じ濃度のＭＳ０２３で処理した。これにより、ＭＳ０２３投与を受けたことのない各細胞株が、６ウェルずつ残った。ＭＳ０２３を添加したら、細胞を一晩インキュベートした。

３日目に、９６ウェルプレートのすべての培地を除去し、細胞を３．７％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。次いで、細胞を洗浄し、１×ＰＢＳ／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で透過処理した。

ＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ洗浄液を除去した後、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（ＬＩ－ＣＯＲ、９２７－４０１００）をすべてのウェルに適用し、プレートを室温で９０分間穏やかに振とうした。９０分後、ブロッキングバッファーを除去し、細胞を１：５００希釈の抗非対称性ジメチルアルギニンモチーフ一次抗体（Cell Signaling Technology、＃１３５２２）で処理した。上記一次抗体とのインキュベーションを、摂氏４度で一晩振とうせずに続けた。

４日目に、一次抗体溶液をプレートから除去し、細胞を１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。洗浄後、細胞を、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ抗ウサギ抗体（ＬＩ－ＣＯＲ、９２６－３２２１１）の１：１０００希釈液および、ＣｅｌｌＴａｇ７００Ｓｔａｉｎ（ＬＩ－ＣＯＲ、９２６）の１：５００希釈液を含有する二次抗体混合物に供した。二次抗体混合物を、穏やかに振とうし、かつ光から保護しながら６０分間細胞上に留めた。

６０分後、二次抗体混合物を除去し、細胞を再び１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。次いで、すべての洗浄緩衝液を除去してから、プレートを軽くたたいて乾かし、余分な溶液を除去した。それから、蛍光ベースの結果を提供するＬＩ－ＣＯＲＯｄｙｓｓｅｙＣｌａｓｓｉｃＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍでプレートを読み取った。この実験では、細胞の非対称性アルギニンメチル化の結果として蛍光が発生した。ＭＳ０２３が、細胞の非対称性アルギニンメチル化を低減させることを見込んで、ＭＳ０２３を２４時間または４８時間細胞に供した。ウェルあたりの細胞数を、細胞内の総タンパク質レベルを蛍光標識するＣｅｌｌＴａｇ７００Ｓｔａｉｎを使用して勘定した。この効果について、ウェルあたりの非対称性アルギニンメチル化（８００）からの蛍光を、ウェルあたりの総タンパク質レベル（７００）からの蛍光で割って、８００／７００の結果を生成した。

図１４に示されるように、未処理の細胞と比較した場合、すべての条件は、それらの８００／７００の読み出し情報において有意に減少した。２４時間の処理に伴い、ＭＳ０２３は、ＮＳＣ－３４細胞の非対称性アルギニンメチル化を、１μＭで約１３％、６０μＭで約４５％減少させた。４８時間の処理に伴い、ＭＳ０２３は、ＮＳＣ－３４細胞の非対称性アルギニンメチル化を、１μＭで約３３％、６０μＭで約７５％減少させた。

（実施例１５．合成ＧＲ_１５のインビトロアルギニンメチル化）
ＰＲＭＴ１とＧＲ_１５との間の相互作用を評価するために、インビトロメチル化アッセイシステムを開発した。このシステムは、組換えＰＲＭＴ１酵素、メチル供与体としてのＳ－（５‘－アデノシル）－Ｌ－メチオニンヨウ化物（ＳＡＭ）、およびＰＲＭＴ１活性の潜在的な基質の混合物からなる。この実験では、１１本のチューブを用意し、各チューブにはさまざまな量の以下の成分が含有されていた：
・組換えＰＲＭＴ１タンパク質（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ、Ｃａｔ. ３１４１１）
・Ｓ－（５‘－アデノシル）－Ｌ－メチオニンヨウ化物（ＳＡＭ）（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＣａｔ. Ａ４３７７）
・ＧＲ_１５
・ＰＲ_１５
・ヒト赤血球からのＳＯＤ１（Ｓ９６３６－１ＫＵ）

上記成分を、表４に従って０．５ｍｌのフラットキャップチューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＢ０３５０）で混合した（すべての値はマイクロリットル（μｌ）単位）。

すべてのチューブを準備したら、各チューブを軽くたたいて確実に混合し、チューブを摂氏３７度のインキュベーターに２時間入れた。２時間後、１０μｌのＮｕＰａｇｅＬＤＳサンプルバッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＰ０００７）を添加して、反応混合物を停止させた。チューブを軽くたたいて確実に混合し、９５℃のウォーターバスで５分間煮沸した。次いで、サンプルを４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＰ０３２２ＢＯＸ）でＳＤＳ－ＰＡＧＥ用に処理した。

次いで、ｉＢｌｏｔ装置およびｉＢｌｏｔ２ニトロセルロースミニスタック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＩＢ２３００２）を使用してゲルを転写した。転写後、膜をＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキングバッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３７５１５）に入れ、摂氏４度で一晩遮断した。翌日、ブロッキングバッファーを除去し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０中に、１：５００の割合で抗Ｈｉｓｔｏｎｅ４Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ａ（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ、カタログ３９００６）、および１：１０００の割合で抗Ｃ９ＯＲＦ７２／Ｃ９ＲＡＮＴ（ｐｏｌｙ－ＧＲ）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｍＡＢＮ７７８）となる一次抗体溶液を膜に付与し、室温で６０分間穏やかに振とうした。一次抗体溶液を除去し、膜を１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０中に、１：１０，０００希釈のＩＲＤｙｅ８００ＣＷ抗ウサギ抗体および１：１０，０００希釈のＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ抗ラット抗体（ＬＩ－ＣＯＲ、９２５－６８０７６）を含有する二次抗体溶液を膜に付与し、室温で６０分間穏やかに振とうした。二次抗体を除去し、膜を１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。洗浄ステップに続いて、膜をＬＩ－ＣＯＲＯｄｙｓｓｅｙＣｌａｓｓｉｃＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍで読み取った。

図１５Ａおよび１５Ｂに示されるように、ＧＲ_１５は、ＰＲＭＴ１によって非対称的にメチル化され、ヒストン４抗Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ａ抗体によって検出される。この抗体を、グリシン－アルギニンのペアを含有するヒストン４タンパク質の領域に対して生成した。ＰＲＭＴ１またはメチル供与体ＳＡＭのいずれかが反応混合物から除去される場合、ＧＲ_１５の非対称性メチル化は進行しない（図１５Ａのレーン２および９）。図１５Ｂは、ＧＲ_１５がすべてのウェルに存在し、したがってそのメチル化が、ＰＲＭＴ１との相互作用に依存していることを示している。

（実施例１６．ＭＳ０４９（０．２～１００μＭ）ならびに、ＬＤＨアッセイで測定されたＧＲ_１５およびＰＲ_１５（３μＭ）によって生成された細胞毒性の無効化）
細胞を２つの９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＭＳ０４９の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を０．２、１、２、１０、２０および１００μＭにした。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・低コントロール／「０％の毒性」（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＲおよびＰＲ処理細胞が曝露された量のＤＭＳＯのみで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＭＳ０４９のうち：１００μＭ、２０μＭ、１０μＭ、２μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＰＲのみ（３μＭＰＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＰＲ_１５およびＭＳ０４９のうち：１００μＭ、２０μＭ、１０μＭ、２μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＭＳ０４９のうち：１００μＭ、２０μＭ、１０μＭ、２μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞
・高コントロール／「１００％の毒性」（溶解バッファーで溶解させた細胞）
・ポジティブコントロール（５μＬＬＤＨ溶液）

図１６Ａ～図１６Ｄに示されるように、ＭＳ０４９は、用量依存的に、ＧＲおよびＰＲ両方の誘発毒性を無効にした。ＭＳ０４９は、０．２、１、２、２０、および１００μＭの用量でＧＲおよびＰＲ誘発毒性を部分的に無効にし、２および１０μＭの用量でＧＲおよびＰＲ誘発毒性を完全に無効にした。ＭＳ０４９は、１００および２０μＭの用量で、ＧＲおよびＰＲ処理とは無関係に有意な毒性を引き起こしたが、試験した他の用量では引き起こさなかった。

（実施例１７．ＭＳ０４９は、ＮＳＣ－３４細胞の非対称性アルギニンメチル化を減少させる）
０日目に、ＮＳＣ－３４細胞を９６ウェルプレートの４８ウェルにプレーティングし、ＣＨＯ細胞を同じ９６ウェルプレートの他の４８ウェルにプレーティングした。ＮＳＣ－３４細胞を、ＤＭＥＭ／高グルコース培地にプレーティングした。ＣＨＯ細胞を、ハムのＦ－１２Ｋ（Kaighn’s）培地にプレーティングした。両方の細胞株を一晩インキュベートして、約５０％の培養密度に到達させた。

１日目に、２４ウェルのＮＳＣ－３４細胞および２４ウェルのＣＨＯ細胞を、０．２μＭ、１μＭ、２μＭ、１０μＭ、２０μＭ、および１００μＭ濃度のＭＳ０４９で処理した。次いで、細胞を一晩インキュベートした。

２日目に、１８ウェルの未処理ＮＳＣ－３４細胞および１８ウェルの未処理ＣＨＯ細胞を、１日目と同じ濃度のＭＳ０４９で処理した。これにより、ＭＳ０４９投与を受けたことのない各細胞株が、６ウェルずつ残った。ＭＳ０４９を添加したら、細胞を一晩インキュベートした。

６０分後、二次抗体混合物を除去し、細胞を再び１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。次いで、すべての洗浄緩衝液を除去してから、プレートを軽くたたいて乾かし、余分な溶液を除去した。それから、蛍光ベースの結果を提供するＬＩ－ＣＯＲＯｄｙｓｓｅｙＣｌａｓｓｉｃＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍでプレートを読み取った。この実験では、細胞の非対称性アルギニンメチル化の結果として蛍光が発生した。ＭＳ０４９が、細胞の非対称性アルギニンメチル化を低減させることを見込んで、ＭＳ０４９を２４時間または４８時間細胞に供した。ウェルあたりの細胞数を、細胞内の総タンパク質レベルを蛍光標識するＣｅｌｌＴａｇ７００Ｓｔａｉｎを使用して勘定した。この効果について、ウェルあたりの非対称性アルギニンメチル化（８００）からの蛍光を、ウェルあたりの総タンパク質レベル（７００）からの蛍光で割って、８００／７００の結果を生成した。

図１７に示されるように、未処理の細胞と比較した場合、すべての条件は、それらの８００／７００の読み出しにおいて有意に減少した。２４時間の処理に伴い、ＭＳ０４９は、ＮＳＣ－３４細胞の非対称性アルギニンメチル化を、１μＭで約１７％、１００μＭで約３９％減少させた。

（実施例１８．ＭＳ０２３（０．２～６０μＭ）およびネガティブコントロールＭＳ０９４（０．２～６０μＭ）ならびに、ＷＳＴ－１アッセイで測定されたＧＲ_１５およびＰＲ_１５（３μＭ）によって生成された代謝異常の無効化）
細胞を９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＭＳ０２３およびＭＳ０９４の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を０．２、１、３、１０、３０および６０μＭにした。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＭＳ０９４で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯ、ＭＳ０９４および、ＧＲ_１５もしくはＰＲ_１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯ、またはＧＲ_１５もしくはＰＲ_１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯのいずれかで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・３μＭＧＲ_１５およびネガティブコントロールＭＳ０９４のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＰＲのみ（３μＭＰＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＰＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・３μＭＰＲ_１５およびネガティブコントロールＭＳ０９４のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞
・ネガティブコントロールＭＳ０９４のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞

プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。試験の直前に、培地を除去し、３７℃のウォーターバスで４℃から温めていた２００μＬのＰＢＳ－グルコース溶液（４．５ｇ／Ｌ、滅菌済み）と置き換えた。ＷＳＴ－１試薬のアリコートを－２０℃から解凍し、使用前に室温で平衡化した。２００μＬのＰＢＳ－グルコースを含有するウェルごとに、２０μＬのＷＳＴ－１試薬を添加した。プレートをＷＳＴ－１とともに３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートし、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ３プレートリーダーで、１つの吸光度の読み取り値（４５０ｎｍ）を取得した。データを、プレートリーダーのＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ７．０ソフトウェアからＥｘｃｅｌファイルにエクスポートした。

図１８Ａ～図１８Ｆに示されるように、ＭＳ０２３は、用量依存的にＧＲおよびＰＲ誘発性代謝異常の両方を無効にした。３μＭおよび１μＭ用量のＭＳ０２３は、３μＭＧＲ_１５またはＰＲ_１５チャレンジによって誘発された代謝異常を完全に無効にした。ネガティブコントロールＭＳ０９４のどの用量も、ＧＲ_１５またはＰＲ_１５チャレンジによって誘発された代謝異常を無効にしなかった。試験したネガティブコントロールＭＳ０９４の２つの最高用量である３０および６０μＭは、未処理のコントロールと比較して代謝異常を引き起こしたが、これは、ＤＭＳＯ関連の毒性に起因する可能性があり、該ＤＭＳＯ関連の毒性は、これらの用量（０．３０％および０．６０％ＤＭＳＯ）に対応するＤＭＳＯコントロールでも見られる。

（実施例１９．ＭＳ０２３（０．２～６０μＭ）およびネガティブコントロールＭＳ０９４（０．２～６０μＭ）ならびに、ＬＤＨアッセイで測定されたＧＲ_１５およびＰＲ_１５（３μＭ）によって生成された細胞毒性の無効化）
細胞を９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＭＳ０２３およびＭＳ０９４の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を０．２、１、３、１０、３０および６０μＭにした。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＭＳ０９４で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯ、ＭＳ０９４および、ＧＲ_１５もしくはＰＲ_１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯ、またはＧＲ_１５もしくはＰＲ_１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯのいずれかで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・３μＭＧＲ_１５およびネガティブコントロールＭＳ０９４のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＰＲのみ（３μＭＰＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＰＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・３μＭＰＲ_１５およびネガティブコントロールＭＳ０９４のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞
・ネガティブコントロールＭＳ０９４のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞
・高コントロール／「１００％の毒性」（溶解バッファーで溶解させた細胞）
・ポジティブコントロール（５μＬＬＤＨ溶液）

図１９Ａ～図１９Ｆに示されるように、ＭＳ０２３は、用量依存的に、ＧＲおよびＰＲ誘発細胞毒性（％ＬＤＨ放出として測定される）の両方を無効にした。３μＭおよび１μＭ用量のＭＳ０２３は、３μＭＧＲ_１５またはＰＲ_１５チャレンジによって誘発された細胞毒性を完全に無効にした。ネガティブコントロールＭＳ０９４のどの用量も、ＧＲ_１５またはＰＲ_１５チャレンジによって誘発された細胞毒性を無効にしなかった。ＭＳ０２３の最高用量である６０μＭは、有意な細胞毒性をもたらしたが、これは、ＧＲ_１５またはＰＲ_１５チャレンジによって誘発された細胞毒性を完全に無効にすることが示された用量の１つではなかった。試験したネガティブコントロールＭＳ０９４の３つの最高用量、１０、３０および６０μＭは、未処理のコントロールと比較して細胞毒性を示したが、２つの最高用量では、これはＤＭＳＯ関連の毒性に起因する可能性が高く、これらの用量（０．３０％および０．６０％ＤＭＳＯ）に対応するＤＭＳＯコントロールにも見られる。

（実施例２０．ＭＳ０４９（０．２～１００μＭ）ならびに、ＬＤＨアッセイで測定されたＧＲ_１５およびＰＲ_１５（３μＭ）によって生成された細胞毒性の無効化）
細胞を９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＭＳ０４９の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を０．２、１、２、１０、２０および１００μＭにした。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＲおよびＰＲ処理細胞が曝露された量のＤＭＳＯのみで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＭＳ０４９のうち：１００μＭ、２０μＭ、１０μＭ、２μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＰＲのみ（３μＭＰＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＰＲ_１５およびＭＳ０４９のうち：１００μＭ、２０μＭ、１０μＭ、２μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＭＳ０４９のうち：１００μＭ、２０μＭ、１０μＭ、２μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞
・高コントロール／「１００％の毒性」（溶解バッファーで溶解させた細胞）
・ポジティブコントロール（５μＬＬＤＨ溶液）

細胞を試験し、ＬＤＨアッセイキットの説明書に記載されている手順を使用して、データを分析した。

図２０Ａ～図２０Ｄに示されるように、ＭＳ０４９は、用量依存的にＧＲ_１５およびＰＲ_１５の両方によって誘発された細胞毒性を無効にした。ＭＳ０４９は、１および２０μＭの用量でＧＲ_１５およびＰＲ_１５によって誘発される細胞毒性を部分的に無効にし、２および１０μＭの用量でＧＲ_１５およびＰＲ_１５によって誘発される細胞毒性を完全に無効にした。ＭＳ０４９は、１００および２０μＭの用量で、ＧＲおよびＰＲチャレンジとは無関係に有意な細胞毒性を引き起こしたが、試験した他の用量では引き起こさなかった。

（実施例２１．ＥＰＺ０２０４１１（０．２～２０μＭ）ならびに、ＷＳＴ－１アッセイで測定されたＧＲ_１５およびＰＲ_１５（３μＭ）によって生成された代謝異常の無効化）
細胞を９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＥＰＺ０２０４１１の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を０．２、１、２、１０および２０μＭにした。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＥＰＺ０２０４１１で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯ、ＥＰＺ０２０４１１および、ＧＲ_１５もしくはＰＲ_１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯ、またはＧＲ_１５もしくはＰＲ_１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯのいずれかで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＥＰＺ０２０４１１のうち：２０μＭ、１０μＭ、２μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＰＲのみ（３μＭＰＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＰＲ_１５およびＥＰＺ０２０４１１のうち：２０μＭ、１０μＭ、２μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＥＰＺ０２０４１１のうち：２０μＭ、１０μＭ、２μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞

図２１Ａ～図２１Ｄに示されるように、ＥＰＺ０２０４１１は、用量依存的にＧＲ_１５およびＰＲ_１５の両方によって誘発された代謝異常を無効にした。ＥＰＺ０２０４１１は、２、１０および２０μＭの用量でＧＲ_１５誘発性代謝異常を部分的に無効にし、２０μＭで最大の無効化を示した。加えて、１０および２０μＭの用量でＰＲ_１５誘発性代謝異常を完全に無効にした。ＥＰＺ０２０４１１は、１０および２０μＭの用量でＧＲおよびＰＲチャレンジとは無関係に有意な代謝異常を引き起こしたが、試験した他の用量では引き起こさなかった。このことは、対応するＤＭＳＯコントロール（０．１０％、０．２０％ＤＭＳＯ）が代謝異常を誘発しなかったように、ＤＭＳＯ誘発性代謝異常には起因し得ない。

（実施例２２．ＥＰＺ０２０４１１（０．２～２０μＭ）ならびに、ＬＤＨアッセイで測定されたＧＲ_１５およびＰＲ_１５（３μＭ）によって生成された細胞毒性の無効化）
細胞を９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＥＰＺ０２０４１１の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を０．２、１、２、１０および２０μＭにした。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＥＰＺ０２０４１１で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯ、ＥＰＺ０２０４１１および、ＧＲ_１５もしくはＰＲ_１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯ、またはＧＲ_１５もしくはＰＲ_１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯのいずれかで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＥＰＺ０２０４１１のうち：２０μＭ、１０μＭ、２μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＰＲのみ（３μＭＰＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＰＲ_１５およびＥＰＺ０２０４１１のうち：２０μＭ、１０μＭ、２μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＥＰＺ０２０４１１のうち：２０μＭ、１０μＭ、２μＭ、１μＭ、０．２μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞
・高コントロール／「１００％の毒性」（溶解バッファーで溶解させた細胞）
・ポジティブコントロール（５μＬＬＤＨ溶液）

図２２Ａ～図２２Ｄに示されるように、ＥＰＺ０２０４１１は、用量依存的にＧＲ_１５およびＰＲ_１５の両方によって誘発された細胞毒性を無効にした。ＥＰＺ０２０４１１は、０．２μＭを除くすべての用量でＧＲ_１５およびＰＲ_１５によって誘発された細胞毒性を部分的に無効にし、２０μＭの用量で最大の効果を示した。ＥＰＺ０２０４１１は、１０および２０μＭの用量で、ＧＲおよびＰＲチャレンジとは無関係に有意な細胞毒性を引き起こしたが、試験した他の用量では引き起こさなかった。このことは、ＥＰＺ０２０４１１の最高用量（０．２０％ＤＭＳＯ）に対応するＤＭＳＯコントロールのみがわずかな細胞毒性を発生させたため、ＤＭＳＯによって誘発された細胞毒性に完全には起因し得ない。

（実施例２３．ＧＳＫ３３６８７１５（０．１～１０μＭ）ならびに、ＷＳＴ－１アッセイで測定されたＧＲ_１５およびＰＲ_１５（３μＭ）によって生成された代謝異常の無効化）
細胞を９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＧＳＫ３３６８７１５の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を０．１、０．３、１、３および１０μＭにした。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＳＫ３３６８７１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯ、ＧＳＫ３３６８７１５および、ＧＲ_１５もしくはＰＲ_１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯ、またはＧＲ_１５もしくはＰＲ_１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯのいずれかで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＧＳＫ３３６８７１５のうち：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＰＲのみ（３μＭＰＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＰＲ_１５およびＧＳＫ３３６８７１５のうち：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＧＳＫ３３６８７１５のうち：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞

図２３Ａ～図２３Ｆに示されるように、ＧＳＫ３３６８７１５は、用量依存的にＧＲ_１５およびＰＲ_１５の両方によって誘発された代謝異常を無効にした。ＧＳＫ３３６８７１５は、対応するＤＭＳＯ処理コントロール（０．０６％、０．０３４％ＤＭＳＯ）と比較した場合、１および３μＭの用量でＧＲ_１５およびＰＲ_１５によって誘発された代謝異常を完全に無効にした。試験したＧＳＫ３３６８７１５の最高用量である１０μＭは、ＧＲ_１５およびＰＲ_１５チャレンジとは無関係に低レベルの代謝異常を誘発したが、このことは、対応する０．１０％ＤＭＳＯコントロールが同様のレベルの代謝異常を示したため、溶媒効果に起因する可能性がある。

（実施例２４．ＭＳ０２３（０．１～１０μＭ）およびＧＳＫ３３６８７１５（０．１～１０μＭ）ならびに、ＷＳＴ－１アッセイで測定されたＧＲ_１５（３μＭ）によって生成された代謝異常の無効化）
細胞を９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＭＳ０２３およびＧＳＫ３３６８７１５の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を０．１、０．３、１、３および１０μＭにした。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＳＫ３３６８７１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯ、ＧＳＫ３３６８７１５および、ＧＲ_１５もしくはＰＲ_１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯ、またはＧＲ_１５もしくはＰＲ_１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯのいずれかで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・３μＭＧＲ_１５およびＧＳＫ３３６８７１５のうち：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＭＳ０２３のうち：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞
・ＧＳＫ３３６８７１５のうち：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞

図２４Ａ～図２４Ｄに示されるように、ＧＳＫ３３６８７１５は、ＭＳ０２３と同様のパターンで、ＧＲ_１５およびＰＲ_１５の両方によって誘発された代謝異常を用量依存的に無効にした。ＭＳ０２３およびＧＳＫ３３６８７１５はどちらも、１および３μＭの用量でＧＲ_１５およびＰＲ_１５によって誘発された代謝異常を完全に無効にした。試験されたＧＳＫ３３６８７１５の最高用量である１０および３μＭは、ＧＲ_１５およびＰＲ_１５チャレンジとは無関係に代謝異常を誘発した。試験したＭＳ０２３のどの用量も、ＧＲ_１５－ＰＲ_１５チャレンジとは無関係に代謝異常を誘発することはなかった。

（実施例２５．ＧＳＫ３３６８７１５（０．１～１０μＭ）ならびに、ＬＤＨアッセイで測定されたＧＲ_１５およびＰＲ_１５（３μＭ）によって生成された細胞毒性の無効化）
細胞を９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＧＳＫ３３６８７１５の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を０．１、０．３、１、３および１０μＭにした。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＳＫ３３６８７１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯ、ＧＳＫ３３６８７１５および、ＧＲ_１５もしくはＰＲ_１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯ、またはＧＲ_１５もしくはＰＲ_１５で処理されたウェルと同等のＤＭＳＯのいずれかで処理された細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＧＳＫ３３６８７１５のうち：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＰＲのみ（３μＭＰＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＰＲ_１５およびＧＳＫ３３６８７１５のうち：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＧＳＫ３３６８７１５のうち：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞
・高コントロール／「１００％の毒性」（溶解バッファーで溶解させた細胞）
・ポジティブコントロール（５μＬＬＤＨ溶液）

図２５Ａ～図２５Ｄに示されるように、ＧＳＫ３３６８７１５は、用量依存的にＧＲ_１５およびＰＲ_１５の両方によって誘発された細胞毒性を無効にした。ＧＳＫ３３６８７１５は、１μＭの用量でＧＲ_１５およびＰＲ_１５によって誘発された細胞毒性を完全に無効にした。加えて、３μＭの用量でＰＲ_１５誘発細胞毒性をほぼ完全に無効にした。ＧＳＫ３３６８７１５のすべての用量は、ＧＲ_１５およびＰＲ_１５チャレンジとは無関係に低レベルの細胞毒性を誘発したが、このことは、対応するすべてのＤＭＳＯコントロールが同様の用量依存的なレベルの細胞毒性を示したため、溶媒効果に起因する可能性がある。

（実施例２６．対称性ＰＲＭＴ阻害剤ＧＳＫ５９１（３～２００μＭ）および非対称性ＰＲＭＴ阻害剤ＭＳ０２３（１～６０μＭ）ならびに、ＷＳＴ－１アッセイで測定されたＰＲ_１５（３μＭ）によって生成された代謝異常の無効化）
細胞を９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＧＳＫ５９１およびＭＳ０２３の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を３、１０、３３、１００および２００μＭ（ＧＳＫ５９１）並びに１、３、１０、３０および６０μＭ（ＭＳ０２３）にした。ＰＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＲ_１５またはＰＲ_１５で処理したウェルと同等のＤＭＳＯで処理した細胞）
・ＰＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＰＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・３μＭＰＲ_１５およびＧＳＫ５９１のうち：２００μＭ、１００μＭ、３３μＭ、１０μＭ、３μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＭＳ０２３のうち：６０μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞
・ＧＳＫ５９１のうち：２００μＭ、１００μＭ、３３μＭ、１０μＭ、３μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞

図２６Ａ～図２６Ｄに示されるように、ＭＳ０２３は、用量依存的にＧＲおよびＰＲ誘発性代謝異常の両方を無効にした。３μＭおよび１μＭ用量のＭＳ０２３は、３μＭＰＲ_１５チャレンジによって誘発された代謝異常を完全に無効にした。ＧＳＫ５９１のどの用量も、ＰＲ_１５チャレンジによって誘発された代謝異常を無効にしなかった。試験されたＧＳＫ５９１の３つの最高用量、３３、１００および２００μＭは、未処理のコントロールと比較して、ＰＲ_１５チャレンジとは無関係に代謝異常を引き起こした。試験されたＭＳ０２３のどの用量も、ＰＲ_１５チャレンジとは無関係に代謝異常を引き起こさなかった。

（実施例２７．ＷＳＴ－１アッセイによって測定されたＧＲ_１５および非対称性ジメチル化（ＡＤＭｅ）－ＧＲ_１５によって生成された代謝異常の用量反応パターン）
細胞を９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、ＧＲ_１５およびＡＤＭｅ－ＧＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を１０ｎＭ～３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＲ_１５またはＡＤＭｅ－ＧＲ_１５で処理したウェルと同等のＤＭＳＯで処理した細胞）
・ＧＲ_１５のうち：１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＡＤＭｅ－ＧＲ_１５のうち：１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞

図２７Ａ～図２７Ｅに示されるように、ＧＲ_１５およびＡＤＭｅ－ＧＲ_１５チャレンジは、２４時間後にＮＳＣ－３４において用量依存性の代謝異常を誘発し、ＡＤＭｅ－ＧＲ_１５は、非メチル化ＧＲ_１５よりも一貫してより多くの代謝異常を生じさせた。

（実施例２８．ＬＤＨアッセイによって測定されたＧＲ_１５および非対称性ジメチル化（ＡＤＭｅ）－ＧＲ_１５によって生成された細胞毒性の用量反応パターン）
細胞を９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、ＧＲ_１５およびＡＤＭｅ－ＧＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を１０ｎＭ～３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＲ_１５またはＡＤＭｅ－ＧＲ_１５で処理したウェルと同等のＤＭＳＯで処理した細胞）
・ＧＲ_１５のうち：１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＡＤＭｅ－ＧＲ_１５のうち：１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・高コントロール／「１００％の毒性」（溶解バッファーで溶解させた細胞）
・ポジティブコントロール（５μＬＬＤＨ溶液）

図２８Ａ～図２８Ｅに示されるように、ＧＲ_１５およびＡＤＭｅ－ＧＲ_１５チャレンジは、２４時間後にＮＳＣ－３４において用量依存性の細胞毒性を誘発し、ＡＤＭｅ－ＧＲ_１５は、非メチル化ＧＲ_１５よりも一貫してより多くの細胞毒性を生じさせた。

（実施例２９．ＭＳ０２３（０．１～１０μＭ）ならびに、ＷＳＴ－１アッセイで測定されたＧＲ_１５およびＡＤＭｅ－ＧＲ_１５（３μＭ）によって生成された代謝異常の無効化）
細胞を９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＭＳ０２３の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を０．１、０．３、１、３および１０μＭにした。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＡＤＭｅ－ＧＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＲ_１５またはＰＲ_１５で処理したウェルと同等のＤＭＳＯで処理した細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＡＤＭｅ－ＧＲのみ（３μＭＡＤＭｅ－ＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＡＤＭｅ－ＧＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＭＳ０２３のうち：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞

図２９Ａ～図２９Ｄ、図３０Ａ～図３０Ｄ、および図３１Ａ～図３１Ｄは、３つの異なる日に別々に実施された上記の実験の繰り返しを表す。れらの図に示されているように、ＭＳ０２３は、ＧＲ_１５チャレンジによって誘発された代謝異常を一貫して用量依存的に無効にしたが、ＡＤＭｅ－ＧＲ_１５チャレンジによって誘発された代謝異常は無効にしなかった。

（実施例３０．ＭＳ０２３（０．１～１０μＭ）ならびに、ＬＤＨアッセイで測定されたＧＲ_１５およびＡＤＭｅ－ＧＲ_１５（３μＭ）によって生成された細胞毒性の無効化）
細胞を９６ウェルプレートの培地に、ウェルあたり３．７×１０^４細胞の密度でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を添加する直前に、既存の培地を除去し、実施例１のように互い違いの量の培地と置き換えた。ＭＳ０２３の１０ｍＭストックを室温まで解凍し、温かい培地で希釈して、プレート内の最終濃度を０．１、０．３、１、３および１０μＭにした。ＧＲ_１５の１０ｍＭストックおよびＡＤＭｅ－ＧＲ_１５の１０ｍＭストックを室温に平衡化し、温かい培地で希釈して、ウェル内の最終濃度を３μＭにした。

以下の条件をトリプリケートでプレーティングした。インキュベーション中の実験ウェル内の容量の蒸発を防ぐために、サンプルを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で満たされたプレートの外側の境界ウェルで囲んだ：
・バックグラウンド（培地のみ）
・未処理（培地中の細胞のみ）
・ＤＭＳＯコントロール（ＧＲ_１５またはＰＲ_１５で処理したウェルと同等のＤＭＳＯで処理した細胞）
・ＧＲのみ（３μＭＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＧＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＡＤＭｅ－ＧＲのみ（３μＭＡＤＭｅ－ＧＲ_１５でのみ処理された細胞）
・３μＭＡＤＭｅ－ＧＲ_１５およびＭＳ０２３のうち：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの用量のいずれか１つで処理された細胞
・ＭＳ０２３のうち：１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの用量のいずれか１つのみで処理された細胞
・高コントロール／「１００％の毒性」（溶解バッファーで溶解させた細胞）
・ポジティブコントロール（５μＬＬＤＨ溶液）

図３２Ａ～図３２Ｄに示されるように、ＭＳ０２３は、ＧＲ_１５チャレンジによって誘発された細胞毒性を一貫して用量依存的に無効にしたが、ＡＤＭｅ－ＧＲ_１５チャレンジによって誘発された細胞毒性は無効にしなかった。

（実施例３１．毒性のメカニズム）
上記の実施例に示されているように、ＧＲ_１５およびＰＲ_１５に関連する毒性は、２４時間のインキュベーション後に非対称にジメチル化されるそれらの能力に関連している（図３３のライン１）。Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤（ＭＳ０２３など）を追加すると、発生する正確なメカニズムは不明なままであるが、毒性は無効になる（図３３の２行目）。非対称にジメチル化されたＧＲ_１５で細胞にチャレンジする場合、毒性効果は依然として存在する（図３３の３行目）。ただし、ＡＤＭｅ－ＧＲ_１５チャレンジ中にＭＳ０２３を追加した場合、毒性の無効化は観察されなかった。したがって、ＧＲ_１５はすでにジメチル化されていたため、ＰＲＭＴ阻害は、見られた効果に対して影響を与えなかった（図３４の４行目）。まとめると、結果は、ＧＲ_１５の非対称性ジメチル化が毒性の駆動メカニズムであることを示唆している。

本開示の方法、組成物および実施形態は、網羅的であること、または本開示を本明細書に記載される正確な形態に限定することを意図するものではない。むしろ、組成物および実施例は、当業者が本開示の原理および実践の真価を認め、かつ理解できるように選択される。しかしながら、本開示の精神および範囲を逸脱せずに、多くの変形および修正がなされ得ることを理解されたい。技術的に不可能でない限り、一実施形態に関連して説明される任意の特徴または要素は、他の各実施形態および他のすべての実施形態の、他の特徴または他の要素のいずれかと交換可能に使用できるか、または追加的に組み合わせることができ、そのようなすべての普及が本開示に含まれる。

本明細書におけるすべての刊行物、特許、および特許出願は、この技術が関係する当業者のレベルを示している。すべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が本明細書に具体的かつ個別に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims

ジペプチドリピートタンパク質（ＤＲＰ）によって引き起こされる細胞毒性を減少させる方法であって、有効量のＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（Ｉ型ＰＲＭＴ）阻害剤と細胞を接触させるステップを含む、方法。
前記ＤＲＰが、遺伝子９番染色体のオープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ＯＲＦ７２）のヘキサヌクレオチド（ＧＧＧＧＣＣ）リピートの拡張によって生成される、請求項１に記載の方法。
前記ＤＲＰがアルギニン（Ｒ）を含む、請求項１または２に記載の方法。
前記ＤＲＰが非対称にジメチル化されている、請求項３に記載の方法。
前記ＤＲＰが、少なくとも１つのポリグリシン－アルギニンペプチド（ＧＲ）および／または、少なくとも１つのポリプロリン－アルギニンペプチド（ＰＲ）を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が神経細胞である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記神経細胞が、感覚ニューロン、運動ニューロンまたは介在ニューロンである、請求項６に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、ＰＲＭＴ１阻害剤、ＰＲＭＴ３阻害剤、ＰＲＭＴ４阻害剤、ＰＲＭＴ６阻害剤、およびＰＲＭＴ８阻害剤からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、ＰＲＭＴ１阻害剤である、請求項８に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ１阻害剤が、ＭＳ０２３、ＭＳ０４９、ＧＳＫ７１５、またはＥＰＺ０２０４１１である、請求項９に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、ＰＲＭＴ３阻害剤である、請求項８に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ３阻害剤が、ＭＳ０２３またはＭＳ０４９である、請求項１１に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、ＰＲＭＴ４阻害剤である、請求項８に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ４阻害剤が、ＭＳ０２３、ＭＳ０４９またはＴＰ０６４である、請求項１３に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、ＰＲＭＴ６阻害剤である、請求項８に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ６阻害剤が、ＭＳ０２３、ＭＳ０４９、ＥＰＺ０２０４１１またはＴＰ０６４である、請求項１５に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、ＰＲＭＴ８阻害剤である、請求項８に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ８阻害剤が、ＭＳ０２３、ＭＳ０４９、ＥＰＺ０２０４１１またはＴＰ０６４である、請求項１７に記載の方法。
前記ＤＲＰによって引き起こされる細胞毒性が、細胞膜の漏出の減少、細胞代謝機能の増加、または細胞アポトーシスの減少によって測定される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
前記ＤＲＰによって引き起こされる細胞毒性が、ＷＳＴ－１、ＬＤＨ、カスパーゼ３、またはＢｒｄＵのうちの１つ以上のアッセイによって測定される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
ＧＲおよび／またはＰＲＤＲＰによって引き起こされる細胞毒性を減少させる方法であって、
細胞を有効量のＩ型ＰＲＭＴ阻害剤と接触させるステップであって、該阻害剤が、

上記化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体、

上記化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体、

上記化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体、

上記化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体、および、

上記化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体からなる群から選択される、接触させるステップを含む、方法。
前記ＤＲＰが非対称にジメチル化されている、請求項２０に記載の方法。
対象におけるＤＲＰの発現に関連している神経変性疾患を治療する方法であって、有効量のＩ型ＰＲＭＴ阻害剤を投与するステップを含む、方法。
前記疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）である、請求項２３に記載の方法。
前記疾患がＡＬＳである、請求項２４に記載の方法。
前記疾患がＦＴＤである、請求項２４に記載の方法。
前記ＤＲＰが、Ｃ９ＯＲＦ７２のヘキサヌクレオチド（ＧＧＧＧＣＣ）リピートの拡張により生成される、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
前記ＤＲＰがアルギニン（Ｒ）を含む、請求項２３～２７のいずれか一項に記載の方法。
前記ＤＲＰが非対称にジメチル化されている、請求項２８に記載の方法。
前記ＤＲＰがＧＲおよび／またはＰＲを含む、請求項２８に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、ＰＲＭＴ１阻害剤、ＰＲＭＴ３阻害剤、ＰＲＭＴ４阻害剤、ＰＲＭＴ６阻害剤、およびＰＲＭＴ８阻害剤からなる群から選択される、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、ＰＲＭＴ１阻害剤である、請求項３１に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ１阻害剤が、ＭＳ０２３、ＭＳ０４９、ＧＳＫ７１５、またはＥＰＺ０２０４１１である、請求項３２に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、ＰＲＭＴ３阻害剤である、請求項３１に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ３阻害剤が、ＭＳ０２３、ＧＳＫ７１５またはＭＳ０４９である、請求項３４に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、ＰＲＭＴ４阻害剤である、請求項３１に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ４阻害剤が、ＭＳ０２３、ＭＳ０４９、ＧＳＫ７１５、またはＴＰ０６４である、請求項３６に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、ＰＲＭＴ６阻害剤である、請求項３１に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ６阻害剤が、ＭＳ０２３、ＭＳ０４９、ＥＰＺ０２０４１１、ＧＳＫ７１５、またはＴＰ０６４である、請求項３８に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、ＰＲＭＴ８阻害剤である、請求項３１に記載の方法。
前記Ｉ型ＰＲＭＴ８阻害剤が、ＭＳ０２３、ＭＳ０４９、ＥＰＺ０２０４１１、ＧＳＫ７１５、またはＴＰ０６４である、請求項４０に記載の方法。
ＤＲＰによって引き起こされる細胞毒性が、細胞膜の漏出の減少、細胞代謝機能の増加、または細胞アポトーシスの減少によって測定される、請求項２３～４１のいずれか一項に記載の方法。
ＤＲＰによって引き起こされる細胞毒性が、ＷＳＴ－１、ＬＤＨ、カスパーゼ３、またはＢｒｄＵのうちの１つ以上のアッセイによって測定される、請求項２３～４１のいずれか一項に記載の方法。
第２の治療薬を投与するステップをさらに含む、請求項２３～４３のいずれか一項に記載の方法。
前記第２の治療薬が、リルゾールおよび／またはエダラボンである、請求項４４に記載の方法。
前記第２の治療薬が、抗体、またはその抗原結合部位である、請求項２７に記載の方法。
前記抗体が、ヒトＣＤ４０とヒトＣＤ４０Ｌとの相互作用を遮断する、請求項４６に記載の方法。
対象におけるＣ９ＯＲＦ７２連鎖性ＡＬＳを治療する方法であって、
有効量のＩ型ＰＲＭＴ阻害剤を投与するステップであって、該阻害剤が、

上記化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体、

上記化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体、

上記化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体、および、

上記化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体からなる群から選択される、投与するステップを含む、方法。
対象におけるＣ９ＯＲＦ７２連鎖性ＦＴＤを治療する方法であって、
有効量のＩ型ＰＲＭＴ阻害剤を投与するステップであって、該阻害剤が、

上記化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体、

上記化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体、

上記化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体、および、

上記化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体からなる群から選択される、投与するステップを含む、方法。
前記疾患がＤＲＰの発現に関連している、請求項４８または４９に記載の方法。
前記ＤＲＰが、Ｃ９ＯＲＦ７２のヘキサヌクレオチド（ＧＧＧＧＣＣ）リピートの拡張により生成される、請求項５０に記載の方法。
前記ＤＲＰがアルギニン（Ｒ）を含む、請求項５０に記載の方法。
前記ＤＲＰが非対称にジメチル化されている、請求項５０に記載の方法。