JP2022539178A - Ｉｌ１ｒａｐ結合タンパク質 - Google Patents

Ｉｌ１ｒａｐ結合タンパク質 Download PDF

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Abstract

本発明は、一般に、ヒトの疾患の治療および治療に関連する有害事象の低下における抗体に関する。より具体的には、本発明は、IL1RAP(インターロイキン-1受容体アクセサリータンパク質)結合タンパク質(抗IL1RAPアンタゴニスト抗体を含む)の使用ならびにヒトの疾患を治療および予防するためのそれらの使用に関する。

Description

(配列表)
本出願は、ASCIIフォーマットにてコンピューター可読形式で提出された配列表を含んでおり、その全てを参照により本明細書に組み込む。前記ASCIIのコピーは、2020年6月18日に作成されたファイル名「PU66378_SL.txt」であり、サイズは約54,788バイトである。
本発明は、一般に、ヒトの疾患の治療および治療に関連する有害事象を軽減する抗体に関する。より具体的には、本発明は、IL1RAP(インターロイキン-1受容体アクセサリータンパク質)結合タンパク質(抗IL1RAPアンタゴニスト抗体を含む)の使用およびヒト疾患の治療および予防としてのその使用に関する。
急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)および骨髄異形成症候群(MDS)は、未熟な骨髄系前駆体の異常なクローン増殖および拡散により、造血細胞の分化不全に至ることが特徴である。AMLは、成人にて最も多く診断される白血病であり、欧米での発症率は100,000人あたり3～5人である。AMLの発症率は、年齢とともに上昇し、全生存期間は、6ヶ月から12年である。治癒的処置には、高用量の細胞毒性化学療法および/または骨髄移植が含まれるが、この処置は、レジメンの毒性および高齢者の疾患に関する相対化学療法抵抗性を理由として、主に、若年患者(60歳未満)に限定されている。その為、高齢者のAMLは、重大なアンメットメディカルニーズであって、リスク／ベネフィットプロファイルが改善されたAMLについての治療方法が望まれている(Khwaja 2016, Nature Reviews Disease Primers vol.2)。CMLは、フィラデルフィア(Ph)染色体の染色体転座により、融合遺伝子BCR-ABLが生じることを特徴とする。その結果、融合タンパク質であるBCR-ABLプロテインキナーゼが、構成的に活性化され、制御不能な増殖を引き起こす。CMLの発症率は、10万人あたり1.75人であり、年齢に従い増加することも判っている。多くのCML患者は、チロシンキナーゼ阻害剤により効果的に制御されているが、市販薬に反応しないか、または耐性を獲得する患者も存在しているため、アンメットメディカルニーズである(Storey 2009 Nat Rev Drug Disc 8：447； Chen et al., 2013, Leukemia & Lymphoma 54：1411)。MDSは、末梢血細胞減少および機能的血球欠損をもたらす慢性骨髄性新生物群であり、AMLに進行する場合もある(Steensa 2015, Mayo Clin Proc 90：969)。
AMLに対する化学療法レジメンの目標は、疾患を、長期持続的寛解に導くことである。しかし、多くの場合、数ヶ月から数年の間に病気が再発する。白血病の再発は、造血幹細胞に似たゆっくりと***する細胞である白血病幹細胞(LSC)が残存し、それにより変異した白血病細胞クローンが提供されるためであると考えられている。LSCは、いくつかの細胞表面分子、例えばCD123、CD33およびCLL-1を高いレベルで発現することが示されており、LSC表面マーカーに結合するモノクローナル抗体(mAb)を用いて、LSCを標的として、枯渇させることにより、病気を根絶することが提案されている(Pollya 2017, Blood 23：1627)。IL-1、IL-33およびIL-36の共受容体であるインターロイキン-1受容体アクセサリータンパク質(IL1RAP)は、LSCで上昇する細胞表面マーカーとして同定された(Jaras 2010, PNAS 107：16280； Barreyro 2012, Blood 120：1290； Jiang 2014, Cancer Res 2014；74(19 Suppl)：Abstract 662)。さらに、IL1RAPに対するモノクローナル抗体は、抗体依存性の細胞毒性(ADCC)によってin vitroでAML細胞を殺傷し、マウス異種移植モデルにおいてAMLおよびCML細胞の生着を阻害することが示されている(Askmyr 2013, Blood 121：3709； Agerstam 2015, PNAS 112： 10786； Agerstam 2016, Blood 128：2683 )。
IL1RAPは、IL-1による増殖促進シグナル伝達を増進させることで、血液悪性腫瘍においても重要な機能的役割を担っている。最近の研究では、IL-1は、正常な前駆細胞の増殖を抑制する一方で、殆どの原発性AML患者サンプルの増殖を刺激した(Carey 2017, Cell Reports 18, 3204-3218)。さらに、IL-1は、CMLの白血病発症環境を促進し、CML幹細胞の拡散を促進したが、健康な造血幹細胞の拡散は促進しなかった(Aegerstam 2016, Blood 128：2683)。さらに、CML細胞の増殖は、IL-1受容体拮抗タンパク質(IL-1RA)により遮断され、IL-1を中和するIL1RAP mAbが同様の活性を持つことが示唆された(Zhang 2016, Blood 128：2671)。白血病におけるIL1RAPの役割は、高いIL1RAP発現を示すAML患者の生存率を低下させることを示唆する臨床データのレトロスペクティブ試験によっても支持されており、AML疾患の進行にIL1RAPが強く関与していることが示唆された(Barreyro 2012, Blood 120：1290)。さらに、IL-1機能を阻害することにより、in vitroでのAMLおよびCML細胞の増殖またはコロニー形成が低下した(Cohen 1991, Cozzolina 1989, Sissolak 1992, Rambaldi 1991, Estrov 1992, Estrov 1994, Stosic-Grujicic 1995, Estrov 1991, Bagby 1988, Schiro 1993)。これらのデータをまとめると、IL1RAP特異的抗体は、様々な血液学的悪性腫瘍において細胞増殖を阻害できることが示唆される。
血液癌におけるその役割だけで無く、IL-1は、複数の固形癌(例えば、NSCLC、乳癌、メラノーマ)の増殖、転移および免疫抑制に関与している(Apte 2017, Journal of Leukocyte Biology 102：293に総説されている)。The Cancer Genome Atlas(TCGA, http：//cancergenome.nih.gov/)およびCancer Cell Line Encyclopedia(CCLE, www.broadinstitute.org/ccle)から得たデータから、IL1RAPは、複数の固形腫瘍で発現しており、IL1RAP標的mAbsは、固形腫瘍細胞株で強力なin vitroのADCC活性を示し、固形腫瘍の複数のマウス異種移植モデル(例えば、メラノーマ、NSCLC)にて効果が実証されている(図4、WO12098407、US2017121420)。遺伝子操作またはIL-1受容体アンタゴニスト(IL-1RA)の使用によるIL-1経路の遮断は、固形腫瘍の増殖および転移を阻害し、キナーゼ阻害剤の耐性を克服し、化学療法の効果を増強する(Bruchard 2013, Nat Med 19： 57-64, Guo 2016, Scientific Reports 6：srep36107, Holen 2016, Oncotarget 7：75571-75584, Song 2005, The Journal of Immunology 175：8200, Stanam 2016, Oncotarget 7：76087-76100, Watari 2014, PLOS ONE 9：e99568)。
複数の研究により、IL-1は、骨髄由来の抑制細胞(MDSC)を介して腫瘍微小環境を促進することが示されており(Guo 2016, Scientific Reports 6：srep36107, Song 2005, The Journal of Immunology 175：8200, Mager 2016, Frontiers in Oncology 6, doi：10.3389)、がん患者の血中MDSCを枯渇させ得るIL1RAP-CD3二重特異性mAbが、NSCLC異種移植モデルにおいて有効であることが実証されている(US2017121420)。重要な点は、IL-1の阻害と肺がんとの相関が、最近、大規模な第3相の動脈硬化試験(CANTOS)患者において実証され、がんサブセット分析により、IL-1ブロッキングmAbであるカナキヌマブが、肺がんの発生率および死亡率を低下させることが実証されたことである(Ridker 2017, The Lancet, doi：10.1016)。IL-1ブロッキングmAbとは異なり、受容体レベルでIL-1シグナルを阻害するFc増強型IL1RAP mAbは、IL-1およびIL-1の両方を阻害し、さらにADCCによってIL1RAPを発現しているがん細胞またはMDSCを死滅させるという利点を有すると考えられる。
(発明の要約)
本発明は、一般に、ADCCおよび／またはCDCを介してIL1RAP発現腫瘍細胞を直接死滅させること、癌細胞に対するIL-1の増殖促進効果を阻害すること、およびIL-1のMDSC促進効果を阻害するか、またはIL1RAPを発現するMDSCを直接死滅させることによって増強された腫瘍特異性の免疫応答を促進することにより、AMLならびに複数の固形癌(癌、例えば、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、メラノーマ、膀胱癌、脳腫瘍、頸部癌、上咽頭癌、胃癌、頭頸部癌、腎癌、肝癌、卵巣癌、リンパ腫、膵臓癌および肉腫などを含むが、これらに限定するものではない)において、治療効果を示すADCCが可能なIL-1中和IL1RAP抗体に関する。
一実施形態では、以下の各々の重鎖および軽鎖可変配列：配列番号2および7；配列番号12および17；配列番号22および27；配列番号32および37；配列番号42および47；配列番号51および52；または配列番号63および68を含む、重鎖および軽鎖可変領域を有するIL1RAP抗体のいずれか1つと、IL1RAPタンパク質への結合に競合するIL1RAP結合タンパク質(抗IL1RAP抗体を含む)が提供される。
一実施形態では、以下の各々の重鎖および軽鎖可変配列：配列番号2および7；配列番号12および17；配列番号22および27；配列番号32および37；配列番号42および47；配列番号51および52；または配列番号63および68を含む、重鎖および軽鎖可変領域を有するIL1RAP抗体のいずれか1つと、IL1RAPタンパク質への結合に競合するIL1RAP結合タンパク質(抗IL1RAP抗体を含む)が提供され、またさらに前記IL1RAP結合タンパク質は、ADCCおよび／またはCDCを介してIL1RAP発現腫瘍細胞を直接死滅させる能力、癌細胞に対するIL-1の増殖促進効果を抑制する能力、およびIL-1のMDSC促進効果を阻害するか、またはIL1RAP発現MDSCを直接死滅させることにより増強された腫瘍特異性の免疫応答を促進する能力を有している。
一実施形態では、X線結晶構造解析によって決定された配列番号59のヒトIL1RAPのGln165およびAsn166の片方または両方のアミノ酸でヒトIL1RAPに結合するIL1RAP結合タンパク質(抗IL1RAP抗体を含む)が提供される。
一実施形態では、X線結晶構造解析によって決定された配列番号59のヒトIL1RAPのGln165およびAsn166の片方または両方のアミノ酸でヒトIL1RAPと、5オングストロームの範囲内で接触するIL1RAP結合タンパク質(抗IL1RAP抗体を含む)が提供される。
本発明の一実施形態において、IL1RAP結合タンパク質は、下記：配列番号33に記載のCDRH1；配列番号34に記載のCDRH2；配列番号35に記載のCDRH3；配列番号38に記載のCDRL1；配列番号39に記載のCDRL2および／または配列番号40に記載のCDRL3；または各CDRの直接同等物(ここで、直接同等物とは、前記CDR内に最大2つのアミノ酸の保存的置換を有するもの；または任意のCDR内に最大2つのアミノ酸の欠失または付加を有するもの)のうちの1つ以上を含むものが提供される。
本発明の1つの実施形態では、配列番号59のヒトIL1RAPに特異的に結合するIL1RAP結合タンパク質が提供され、前記IL1RAP結合タンパク質は、配列番号51に記載のアミノ酸配列と少なくとも85、90、95、98または99％同一のアミノ酸配列を含むVHドメインおよび／または配列番号52に記載のアミノ酸配列と少なくとも85、90、95、98または99％同一のアミノ酸配列を含むVLドメインを含んでいる。
本発明の一実施形態では、配列番号59のヒトIL1RAPに特異的に結合するIL1RAP結合タンパク質が提供され、前記IL1RAP結合タンパク質は、配列番号73に記載のアミノ酸配列と少なくとも85、90、95、98または99％同一のアミノ酸配列を含むVHドメインおよび／または配列番号74に記載のアミノ酸配列と少なくとも85、90、95、98または99％同一のアミノ酸配列を含むVLドメインを含んでいる。
一実施形態では、配列番号33；配列番号34；および配列番号35に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDRならびに配列番号38；配列番号39；および配列番号40に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDRを含む、ヒト化モノクローナル抗体が提供される。一実施形態では、配列番号51に記載のアミノ酸配列を含むVHドメイン；および配列番号52に記載のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、ヒト化モノクローナル抗体が提供される。一実施形態では、配列番号55に記載のアミノ酸配列を含む全長重鎖；および配列番号56に記載のアミノ酸配列を含む全長軽鎖を含む、ヒト化モノクローナル抗体が提供される。
一実施形態では、本発明は、抗体GSK3903371Aを提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号73および74のVHおよびVLポリペプチド配列を各々有する抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)および骨髄異形成症候群(MDS)；ならびにヒトにおける前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、メラノーマ、膀胱癌、脳腫瘍、子宮頸癌、上咽頭癌、胃癌、頭頚部癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、リンパ腫、膵臓癌および肉腫からなる群から選択される固体腫瘍癌を治療する方法であって、治療上有効量の上記IL1RAP結合タンパク質(抗IL1RAP抗体を含む)のいずれか一つを投与することを特徴とする、治療方法に関する。
一実施形態では、本発明は、炎症性サイトカイン(例えば、IL1α、IL1β、IL33、IL36など)に関連がある疾患、例えば、ヒトにおける関節リウマチ、痛風、乾癬、化膿性汗腺炎、アレルギー性炎症、喘息、アトピー性皮膚炎を治療する方法に関するものであって、治療有効量の上記IL1RAP結合タンパク質(抗IL1RAP抗体を含む)のいずれか1つを投与することを特徴とする、治療方法に関する。
本発明の1つの実施形態では、IL1RAP結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供され、前記結合タンパク質は、以下：配列番号33に記載のCDRH1；配列番号34に記載のCDRH2；配列番号35に記載のCDRH3；配列番号38に記載のCDRL1；配列番号39に記載のCDRL2および／または配列番号40に記載のCDRL3または各CDRの直接同等物(ここで、直接同等物とは、前記CDRにおいて2つ以下のアミノ酸置換を有するもの)のうちの1つまたは複数を含む。
本発明の1つの実施形態では、IL1RAP結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供され、前記結合タンパク質は、配列番号59のヒトIL1RAPに特異的に結合しており、前記ILrap結合タンパク質は、配列番号51に記載のアミノ酸配列と少なくとも85、90、95、98または99％同一のアミノ酸配列を含むVHドメインおよび／または配列番号52に記載のアミノ酸配列と少なくとも85、90、95、98または99％同一のアミノ酸配列を含むVLドメインを含んでいる。
一実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドが提供され、前記抗体は、配列番号33、配列番号34および配列番号35に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDRならびに配列番号38、配列番号39および配列番号40に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDRを含んでいる。一実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドが提供され、前記抗体は、配列番号51に記載のアミノ酸配列を含むVHドメインならびに配列番号52に記載のアミノ酸配列を含むVLドメインを含んでいる。一実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドが提供され、前記抗体は、配列番号55に記載のアミノ酸配列を含む全長重鎖ならびに配列番号56に記載のアミノ酸配列を含む全長軽鎖を含んでいる。
一実施形態では、配列番号53、54、57、58または72のポリヌクレオチドに対して少なくとも85、90、95、98または99％の同一性を有するポリヌクレオチドを含んでいるポリヌクレオチドが、提供される。
一実施形態では、配列番号53、54、57、58または72を含むポリヌクレオチドが提供される。
一実施形態では、配列番号53、54、57、58または72のポリヌクレオチドに対して少なくとも85、90、95、98または99％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む宿主細胞およびベクターが提供される。
一実施形態では、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)および骨髄異形成症候群(MDS)；ならびに前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、メラノーマ、膀胱癌、脳腫瘍、子宮頸癌、上咽頭部癌、胃癌、頭頚部癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、リンパ腫、膵臓癌および肉腫からなる群から選択される固形腫瘍癌；ならびに炎症性サイトカイン類(例えば、IL1α、IL1β、IL33またはIL36)に関連する疾患(例えば、関節リウマチ、痛風、乾癬、化膿性汗腺炎、アレルギー性炎症、喘息、アトピー性皮膚炎が挙げられるが、これらに限定するものではない)を、上記した本発明の少なくとも1つのIL1RAP結合タンパク質を含む医薬組成物を用いて治療するための方法が提供される。
図1は、IL1RAPタンパク質に結合するmAb063マウスFabのX線図である。数字は、3.5オングストローム以内でmAb063に接近するIL1RAP上のアミノ酸残基を示している。 図2は、IL1タンパク質に結合するmAb067マウスFabのX線図である。数字は、3.5オングストローム以内でmAb067に接近するIL1RAP上のアミノ酸残基を示している。 図3は、IL1タンパク質に結合するmAb154F01-16FabのX線図である。数字は、3.5オングストローム以内でmAb067に接近するIL1RAP上のアミノ酸残基を示している。 図4は、ビニング試験の方法を示す図である。 図5は、表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイによる抗体の結合速度および親和性を決定するための形式である。 図6は、OCI-AML-1標的細胞を用いたPBMC ADCCアッセイにおけるGSK3903371Aの殺細胞活性(n=3、実験1の代表的なプロット)である。 図7は、初代AML標的細胞を用いた非フコシル化抗IL1RAP mAb GSK3903371AのADCC活性は、ヒト化mAb067-12よりもより強力であることを示す。 図8は、ヒト化mAb067-12およびGSK3903371AのCDC活性を示す。HEKK293/IL1RAP細胞を用いたCDCアッセイにおいて、ヒト化mAb067-12およびGSK3903371Aを評価した。抗RAC.huIgG1は、無関係抗原を認識するネガティブコントロールのIgG1 mAbである。 図9は、GSK3903371Aが、免疫不全NOGマウスにおけるヒトAML PDX株の増殖を阻害することを示す。
発明の詳細な説明
(定義)
本明細書において使用された通り、「IL1RAPタンパク質」または「IL1RAP」は、インターロイキン-1受容体アクセサリータンパク質を意味する。ヒトIL1RAPのアミノ酸配列は、配列番号59として示される。
本明細書で使用する場合、用語「結合に競合する」とは、本発明のIL1RAP結合タンパク質(抗体を含む)のいずれかと、IL1RAPへの結合に競合するあらゆるIL1RAP結合タンパク質(抗体を含む)を意味する。IL1RAPに対する2つの分子間の結合の競合は、フローサイトメトリー、メソスケールディスカバリーおよびELISAを含む当技術分野で既知の様々な方法によって試験することができる。結合は、直接測定することができる、つまり、2つ以上の結合タンパク質をIL1RAPと接触させて、1つまたは各々について、その結合を測定することができる。あるいは、目的分子の結合を、天然リガンドの結合に対して試験し、互いを定量的に比較することもできる。結合についての競合は、以下に記載されるようなビニング試験などの当技術分野で標準的な技術を使用して測定することができる。
本発明のIL1RAP結合タンパク質は、IL1RAPタンパク質に結合する。一実施形態では、用語「結合する」または「に結合する」とは、IL1RAP結合タンパク質の少なくとも1つ以上のアミノ酸残基が、X線結晶構造解析により測定される多くの場合に、IL1RAPタンパク質の少なくとも1つ以上のアミノ酸残基に対して＜5.0、＜4.5、＜4.0または＜3.5オングストローム以内で接近することを意味する。IL1RAP結合タンパク質が抗体である場合、抗体のCDRまたはフレームワーク領域内のアミノ酸残基のいくつかは、IL1RAPタンパク質の少なくとも1つまたはそれ以上のアミノ酸残基の＜5.0、＜4.5、＜4.0または＜3.5オングストローム以内で接近する。また、「結合する」または「に結合する」という用語は、IL1RAP結合タンパク質(抗IL1RAP抗体を含む)とIL1RAPリガンドとの相互作用が、1x10-8、1x10-9、さらに好ましくは1x10-10nM未満のKD(平衡解離定数)値を有することも意味し得る。
本明細書で使用する「IL1RAP結合タンパク質」という用語は、IL1RAPに結合することができる抗体、その断片およびドメインなどのその他のタンパク質構築体を指す。いくつかの実施形態において、IL1RAPは、ヒトIL1RAPである。用語「IL1RAP結合タンパク質」は、「IL1RAP抗原結合タンパク質」と互換的に使用することができる。したがって、当技術分野で理解されるように、抗IL1RAP抗体および／またはIL1RAP抗原結合タンパク質は、IL1RAP結合タンパク質と考えられるであろう。本明細書で使用される場合、「抗原結合タンパク質」とは、IL1RAPなどの抗原に結合するあらゆるタンパク質、例えば抗体、ドメインおよび本明細書に記載の他の構築体を含むが、これらに限定されないものである。本明細書で使用されるように、IL1RAP結合タンパク質の「抗原結合部分」は、IL1RAPに結合できるIL1RAP結合タンパク質の任意の部分、例えば、これに限定しないが抗原結合抗体断片を含む。
「抗体」という用語は、本明細書において、免疫グロブリン様ドメイン(例えば、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgE)を有する分子を指すために広義に用いられ、モノクローナル抗体、組換え抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体およびヘテロ共役抗体；単一の可変ドメイン(例えば、VH、VHH、VL、ドメイン抗体(dAbTM))、抗原結合抗体断片、Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、単鎖Fv、ジスルフィド結合scFv、ダイアボディ、TANDABS(登録商標)、および前記いずれかの改変体が挙げられる。
抗体の別の形式には、抗原結合タンパク質の1つ以上のCDRが、適切な非免疫グロブリンタンパク質のスキャッホルドまたは骨格上に、例えば、アフィボディ、SPAスキャッホルド、LDL受容体クラスAドメイン、アビマーまたはEGFドメイン上に配置され得る別のスキャッホルドが含まれる。
「ドメイン」という用語は、タンパク質の他の部分とは独立した3次構造を保持する折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般に、ドメインとは、タンパク質の個別の機能特性を担っており、多くの場合、タンパク質の残りの部分および/またはドメインの機能を損なわずに、その他のタンパク質に追加、削除または導入することが可能である。
「単一可変ドメイン」とは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインを指す。従って、それには、完全な抗体可変ドメイン(例えば、VH、VHHおよびVL)および改変された抗体可変ドメイン(例えば、1つまたは複数のループが、抗体可変ドメインの特徴を持たない配列により置換されている)、あるいはN-またはC末端の伸長部を切断されているか、または含んでいる抗体可変ドメイン、ならびに少なくとも全長ドメインの結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片が含まれる。単一可変ドメインは、異なる可変領域またはドメインとは独立して抗原またはエピトープを結合することが可能である。「ドメイン抗体」または「dAb(TM)」は、「単一可変ドメイン」と同一とみなし得る。単一可変ドメインは、ヒト単一可変ドメインであってもよいが、齧歯類ナースシャークおよびラクダ科VHH dAbsTMなどの別の種由来の単一可変ドメインもまた含まれる。ラクダ科のVHHは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコなどの種から得られる免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであって、軽鎖が自然に欠失した重鎖抗体を産生するものである。そのようなVHHドメインは、当技術分野で利用可能な標準技術に従ってヒト化することができ、そのようなドメインは、「単一可変ドメイン」であると考えられる。本明細書で使用されるVHには、ラクダ科VHHドメインが含まれる。
抗原結合フラグメントは、非抗体タンパク質スキャッホルド上の1つまたは複数のCDRを配置することにより提供されてもよい。本明細書で使用される「タンパク質スキャッホルド」は、免疫グロブリン(Ig)スキャッホルド(例えば、IgGスキャッホルド)を含んでおり、これは、4本鎖または2本鎖抗体であってもよいか、抗体のFc領域のみから構成されてもよいか、または抗体からの1または複数の定常領域から構成されてもよく、この定常領域はヒトまたは霊長類由来であってもよく、またはヒトおよび霊長類の定常領域の人工キメラであってもよいが、これらに限定されることはない。
タンパク質スキャッホルドは、Igスキャッホルド、例えば、IgGまたはIgAスキャッホルドであってもよい。IgGスキャッホルドは、抗体のドメイン(すなわち、CH1、CH2、CH3、VH、VL)の一部または全部を含んでいてもよい。抗原結合タンパク質は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはIgG4PEから選択されるIgGスキャッホルドを含んでいてもよい。例えば、スキャッホルドは、IgG1であってもよい。スキャッホルドは、抗体のFc領域からなるか、またはその一部であってもよい。
タンパク質スキャッホルドは、CTLA-4、リポカリン、プロテインA由来の分子(例えば、プロテインAのZドメイン(アフィボディ、SPA)、Aドメイン(アビマー／マキシボディ))、ヒートショックタンパク質(例えば、GroEl、GroESなど)、トランスフェリン(trans体)、アンキリンリピートタンパク(DARPin)、ペプチドアプタマー、C型レクチンドメイン(テトラネクチン)、ヒトγ-クリスタリンおよびヒトユビキチン(アフィリン)、PDZドメイン、ヒトプロテアーゼ阻害剤のサソリ毒素クニッツ型ドメインおよびフィブロネクチン／アドネクチンからなる群から選択されたスキャッホルド誘導体であってもよく、これらは天然リガンド以外の抗原(例えば、IL1RAPなど)に結合するためにタンパク質工学的に遺伝子操作が為されているスキャッホルド誘導体であってもよい。
抗原結合部位とは、抗原に特異的に結合できる抗原結合タンパク質上の部位を指し、これは単一可変ドメインである場合もあれば、または標準抗体に存在し得るような一対のVH/VLドメインの場合であってもよい。一本鎖Fv(ScFv)ドメインも、抗原結合部位を提供することができる。「エピトープ結合ドメイン」とは、エピトープとして知られる抗原の領域に、別のドメインとは独立して特異的に結合するドメインを指す。
多重特異的抗原結合タンパク質という用語は、少なくとも2つの異なる抗原結合部位を含んでいる抗原結合タンパク質を指す。これらの抗原結合部位の各々は、同一抗原または異なる抗原上に存在し得る異なるエピトープに結合することが可能である。多重特異的抗原結合タンパク質は、1つ以上の抗原、例えば2つの抗原、3つの抗原または4つの抗原に対して特異性を持つものである。
多重特異的抗原結合タンパク質の例としては、結合ドメインに直接または間接的に(例えば、リンカー配列を介して)両端を連結した抗体のFc領域またはその一部を含んでいるか、または本質的に含んでいるものが挙げられる。このような抗原結合タンパク質は、Fc領域またはその一部によって分離された2つの結合ドメインを含んでいてもよい。分離されたとは、結合ドメインが、互いに直接連結されていないことを意味し、Fc領域またはその他の任意のスキャッホルド領域の反対側の末端(CおよびN末端)に存在していてもよい。
抗原結合タンパク質は、例えば各スキャッホルド領域のN末端およびC末端で、直接またはリンカーを介して間接的に2つの結合ドメインに結合した2つのスキャッホルド領域の各々を含んでいてもよい。各結合ドメインは、異なる抗原に結合することができる。
本明細書で使用される場合、用語「mAbdAb」とは、別の結合ドメイン、特にドメイン抗体のような単一の可変ドメインに連結されたモノクローナル抗体を指す。mAbdAbは、少なくとも2つの抗原結合部位を有しており、その内の少なくとも1つが、ドメイン抗体に由来するものであり、少なくとも1つは、一対のVH/VLドメイン由来のものである。
「dAbTMコンジュゲート」とは、共有結合または非共有結合によって薬剤が化学的に結合されたdAbを含む組成物を指す。好ましくは、dAbと薬剤は、共有結合している。このような共有結合は、ペプチド結合またはその他の手段(例えば、改変された側鎖)により行われても良い。非共有結合は、直接的(例えば、静電相互作用、疎水性相互作用)であっても、または間接的(例えば、相補的結合パートナー(例えば、ビオチンおよびアビジン)の非共有結合を介して、一方のパートナーが薬剤と共有結合され、相補的結合パートナーがdAbTMに共有結合されてもよい)であってもよい。相補的結合パートナーを用いる場合、結合パートナーの1つは、薬剤に、直接的に共有結合されるか、または適切なリンカー部分を介して共有結合され得る。
本明細書で使用する場合、「dAbTM融合」とは、dAbTMおよびポリペプチド薬剤(これは、dAbTMまたはmAbであり得る)を含む融合タンパク質を意味する。dAbTMおよびポリペプチド薬剤は、一本の連続したポリペプチド鎖の別の部分(moieties)として存在する。
一実施形態では、本明細書の抗原結合タンパク質は、ヒトIL1RAPおよび別の種由来のIL1RAP(例えば、カニクイザルIL1RAP)との間の交差反応性を示し得る。一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ヒトおよびカニクイザルのIL1RAPを特異的に結合する。ヒトおよびサルの種と結合できる薬剤を提供することにより、これらの系において薬剤を試験し、同じ薬剤を使用したデータを一緒に比較することができる。イヌまたはサルなどの疾患モデルで使用される他の種間、特にサルとの交差反応性が予測される。
本明細書を通じて使用される「中和する」という用語は、IL1RAPおよびIL1RAPリガンド(例えば、IL-1α、IL-β、IL-33およびIL-36またはそれらの受容体)の相互作用が、IL1RAP結合タンパク質の非存在下におけるIL1RAPおよびIL1RAPリガンドの相互作用と比較して、in vitroまたはin vivoで本明細書に記載の抗原結合タンパク質の存在下において低下することを意味する。中和とは、IL1RAPのそのリガンドへの結合を阻止すること、IL1RAPがそのリガンドにより活性化されることを防止すること、IL1RAPまたはその受容体をダウンレギュレートすること、またはエフェクター機能に影響を与えることの内で1つ以上を理由とするものであり得る。
IL1RAPおよびIL1RAPリガンドとの間の相互作用に対するIL1RAP結合タンパク質の効果は、部分的または全体的であってもよい。中和性IL1RAP結合タンパク質は、IL1RAPとIL1RAP-L(IL1RAPリガンド)との相互作用を、IL1RAP結合タンパク質の非存在下におけるIL1RAP-IL1RAPリガンドの相互作用と比較して、少なくとも20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、82%84%、86%、88%、90%、92%、94%95%、96%、97%、98%、99%、100%まで遮断することができる。
中和とは、当業者には既知の1つ以上のアッセイを使用するか、または本明細書に記載されている通りに決定または測定され得る。
親和性とは、1つの分子、例えば、本発明の抗原結合タンパク質が、別の分子、例えばその標的抗原と、1つの結合部位にて結合する強さである。抗原結合タンパク質のその標的への結合親和性は、平衡方法(例えば、酵素結合免疫吸着法(ELISA)またはラジオイムノアッセイ(RIA))または反応速度(例えば、BIACORETM分析)により決定することができる。例えば、実施例5に記載したBiacoreTM法を結合親和性の測定に使用することができる。
結合力(avidity)とは、複数の部位で2つの分子が互いに結合する強さの総和であり、例えば、相互作用の結合価を説明するものである。
実施形態において、IL1RAP結合タンパク質-IL1RAP相互作用の平衡解離定数(KD)は、100nM以下、10nM以下、2nM以下または1nM以下である。あるいは、KDは、5～10nMまたは1～2nMであってもよい。KDは、1pMと500pMの間または500pMと1nMの間であってもよい。当業者であれば、KDの数値が小さいほど、結合が強いことを理解するであろう。KDの逆数(即ち、1/KD)は、単位M-1の平衡結合定数(KA)である。当業者は、KA数値が大きいほど、結合が強いことを理解するであろう。
結合速度定数(ka)または「オンレート」とは、IL1RAP結合タンパク質-IL1RAP複合体形成速度を説明するものである。実施形態において、結合速度定数(ka)は、約1.0×105M-1s-1である。
「単離される」とは、抗原結合タンパク質または核酸などの分子が、自然界に存在し得る環境から取り出されることを意図している。例えば、分子は、その分子が、自然界にて通常存在するであろう物質から分離して精製される場合である。例えば、試料中の分子の質量は、全質量の95％であってもよい。
本明細書で使用する「発現ベクター」という用語は、真核細胞または原核細胞などの細胞に、目的の核酸を導入するために用いることができる単離核酸または目的の核酸配列がタンパク質などのペプチド鎖として発現する無細胞発現系を意味する。このような発現ベクターとしては、例えば、コスミド、プラスミド、ウイルス配列、トランスポゾンおよび目的の核酸を含む線状核酸などを挙げることができる。発現ベクターが細胞または無細胞発現系(例えば、網状赤血球溶解液)に導入されると、目的の核酸によってコードされるタンパク質が、転写／翻訳機構によって産生される。本明細書の範囲内にある発現ベクターは、真核生物または原核生物の発現に必要なエレメントを備え、CMVプロモーター駆動ベクター、例えばpcDNA3.1、pCEP4およびそれらの誘導体のウイルスプロモーター駆動ベクター、バキュロウイルス発現ベクター、ショウジョウバエ発現ベクターおよびヒトIg遺伝子プロモーターなどの哺乳類遺伝子プロモーターによって駆動する発現ベクターが含まれる。その他の例としては、原核生物発現ベクター、例えばT7プロモーター駆動ベクター、例えばpET41、ラクトースプロモーター駆動ベクターおよびアラビノース遺伝子プロモーター駆動ベクターなどが挙げられる。当業者であれば、その他の多くの適切な発現ベクターおよび発現系を認識するであろう。
本明細書で使用する「組換え宿主細胞」という用語は、細胞への導入前に単離された目的の核酸配列を含む細胞を意味する。例えば、目的の核酸配列は、発現ベクター中に存在していてもよく、また一方で細胞は原核生物または真核生物であってもよい。真核細胞の例としては、哺乳類細胞、例えば、COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2、653、SP2／0、NS0、293、HeLa、ミエローマ、リンパ腫細胞またはそれらの任意の誘導体が挙げられるが、これらに限定するものではない。最も好ましくは、真核細胞は、HEK293細胞、NS0細胞、SP2/0細胞またはCHO細胞である。大腸菌は、原核細胞の例示である。本明細書による組換え細胞は、トランスフェクション、細胞融合、不死化または当該技術分野において周知の別の方法により生成されてもよい。細胞にトランスフェクトされた発現ベクターなどの目的の核酸配列は、細胞外染色体であっても、または細胞の染色体に安定に組み込まれたものであってもよい。
IL1Rap結合タンパク質、例えば本発明の抗体は、本発明の抗原結合タンパク質のコード配列を含む発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクションすることにより産生されることができる。発現ベクターまたは組換えプラスミドは、抗原結合タンパク質に対するこれらのコード配列を、宿主細胞における複製および発現ならびに／または宿主細胞からの分泌を制御することができる従来の制御配列と作動可能にて結合させることによって作成される。制御配列には、プロモーター配列(例えば、CMVプロモーター)およびその他の既知の抗体から得られるシグナル配列が含まれる。同様に、相補的な抗原結合タンパク質の軽鎖または重鎖をコードするDNA配列を有する第2の発現ベクターを作成することができる。特定の実施形態では、この第2の発現ベクターは、各ポリペプチド鎖が機能的に発現されることを可能な限り実現できるように、コード配列および選択可能マーカーに関する限りは第1の発現ベクターと同一である。あるいは、抗原結合タンパク質の重鎖および軽鎖のコード配列は、単一ベクター上に存在してもよい。
選択された宿主細胞を、第1および第2のベクターの両方を用いて従来技術により同時にトランスフェクト(または、単純に1つのベクターによるトランスフェクト)を行い、組換えまたは合成の軽鎖および重鎖の両方を含む本発明のトランスフェクトされた宿主細胞を作製する。次に、トランスフェクトされた細胞を、従来技術により培養して、本発明の遺伝子組換え抗原結合タンパク質を作成する。組換え重鎖および／または軽鎖両方の結合体を含む抗原結合タンパク質は、ELISAまたはRIAなどの適切なアッセイにより培養物からスクリーニングされる。別の抗原結合タンパク質を構築するために、同様の従来技術を用いることができる。
本発明の組成物の方法および構築に用いたクローニングおよびサブクローニング工程のために適切なベクターは、当業者により選択され得る。例えば、従来のpUCシリーズのクローニングベクターを使用してもよい。ベクターの1つであるpUC19は、Amersham(Buckinghamshire, イギリス)またはPharmacia(Uppsala, スウェーデン)などの販売元から購入できる。さらに、豊富なクローニングサイトと選択可能な遺伝子(例えば、抗生物質耐性)を有し、かつ操作が容易な任意のベクターをクローニングに使用して、容易に複製することができる。このように、本発明においては、クローニングベクターの選択について、制限する要因はない。
また発現ベクターは、異種DNA配列の発現を増幅するのに適した遺伝子、例えば、哺乳類のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(DHFR)により特徴付けられてもよい。その他のベクター配列としては、ポリAシグナル配列、例えばウシ成長ホルモン(BGH)およびβグロビンプロモーター配列(betaglopro)由来のものが挙げられる。本明細書で有用な発現ベクターは、当業者に既知の技術によって合成することができる。
このようなベクターの構成要素(例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列など)は、選択された宿主における組換えDNA産物の発現および／または分泌を制御する際に用いるために、販売会社または天然供給源から得てもよいし、既知の手順で合成してもよい。哺乳類、細菌、昆虫、酵母および真菌の発現のために多数の種類が当技術分野で知られているその他の適切な発現ベクターも、この目的のために選択され得る。
本発明は、本発明の抗原結合タンパク質のコード配列を含む組換えプラスミドでトランスフェクトされた細胞株も包含する。これらのクローニングベクターのクローニングおよび他の操作に有用な宿主細胞もまた、一般的に行われる。しかし、本発明の抗原結合タンパク質の構築におけるクローニングベクターの複製およびその他の工程に対して、大腸菌の様々な株からの細胞を使用することができる。
本発明の抗原結合タンパク質の発現に適した宿主細胞または細胞株としては、哺乳動物細胞(例えば、NS0、Sp2/0、CHO(例えば、DG44)、COS、HEK)、線維芽細胞(例えば、3T3)およびミエローマ細胞などがあり、例えば、CHOまたはミエローマ細胞で発現させてもよい。ヒト細胞を用いることにより、ヒトのグリコシル化パターンにて分子を修飾することが可能である。あるいは、その他の真核生物細胞株を用いてもよい。適切な哺乳類宿主細胞の選択ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物製造および精製のための方法は、当技術分野で既知である。例えば、上記にて引用したSambrookらを参照されたい。
細菌細胞は、組換えFabまたは本発明の別の実施形態の発現に適した宿主細胞として有用であることが実証され得る(例えば、Plueckthun, A., Immunol. Rev., 130：151-188 (1992)を参照されたい)。しかし、細菌細胞で発現されるタンパク質は、アンフォールド形態または不適切に折り畳まれた形態または非グリコシル化形態である傾向があるため、細菌細胞で生産された任意の組み換えFabは、抗原結合能力の保持についてスクリーニングすべきであろう。細菌細胞によって発現された分子が適切に折り畳まれた形態で産生された場合、その細菌細胞は望ましい宿主であろうし、別の実施形態では、分子は細菌宿主で発現し、その後再度折り畳まれる場合もある。例えば、発現に使用される大腸菌の様々な株は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞としてよく知られている。また、枯草菌(B. Subtilis)、ストレプトマイセス属およびその他の桿菌等の各種菌株も本方法に用いることができる。所望により、当業者に公知の酵母細胞の株も宿主細胞として利用可能であるか、または昆虫細胞、例えばDrosophilaおよびLepidopteraおよびウイルス発現系も利用できる。例えば、Miller et al., Genetic Engineering 8：277-298, Plenum Press(1986)および引用されている文献を参照されたい。
ベクターを構築し得る一般的な方法、本発明の宿主細胞を作成するために必要なトランスフェクション方法、およびかかる宿主細胞から本発明の抗原結合タンパク質を製造するために必要な培養方法は、いずれも従来技術のいずれかにより選択され得る。通常、本発明の培養方法は、無血清培養法であり、通常、細胞を、懸濁液中で無血清培養することにより行われる。同様に、一旦産生された本発明の抗原結合タンパク質は、アンモニウムエロキシジ沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当技術分野の標準的手順に従い、細胞培養内容物から精製することができる。このような技術は当業者の技術範囲内であり、本発明を制限するものではない。例えば、改変された抗体の調製は、WO 99/58679およびWO 96/16990に記載されている。
抗原結合タンパク質の発現のさらなる別の方法として、米国特許第4,873,316号に記載されているようなトランスジェニック動物での発現を利用することもできる。これは、動物のカゼインプロモーターを用いた発現系に関するもので、トランスジェニックに哺乳動物に組み込んだ場合、雌がその乳汁中に所望の組換えタンパク質を産生することを可能にするものである。
本発明のさらなる実施形態では、本発明の抗体を製造する方法が提供され、この方法は、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖をコードするベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を培養する工程と、それによって産生された抗体を回収する工程を含む。
本発明に従って、ヒトIL1 RAPに結合して、その活性を中和する本発明の抗IL1 RAP抗体の製造方法が提供され、この方法は、以下の工程：
抗体の重鎖をコードする第1のベクターを提供する工程；
抗体の軽鎖をコードする第2のベクターを提供する工程；
哺乳類宿主細胞(例えば、CHO)を、前記第1および第2のベクターで形質転換する工程；
前記宿主細胞から前記培養培地への抗体の分泌を促進する条件下で、前記工程(c)の宿主細胞を培養する工程；ならびに
工程(d)の分泌された抗体を回収する工程、
を含んでいる。
本発明の一実施形態では、少なくとも1つの発現カセットを含む、組換え形質転換された宿主細胞、トランスフェクトされた宿主細胞または形質導入された宿主細胞が提供され、例えば、発現カセットは、本明細書に記載の発明に関する抗原結合タンパク質の重鎖をコードするポリヌクレオチドおよび更に明細書に記載の発明に関する抗原結合タンパク質の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいるか、または2つの発現カセットが存在しており、第1のカセットは軽鎖をコードし、第2のカセットは重鎖をコードしている。例えば、一つの実施形態において、第1の発現カセットは、定常領域を含む抗原結合タンパク質または本明細書に記載した本発明の定常領域に結合されているその抗原結合断片を含む抗原結合タンパク質の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでおり、更に定常領域を含む抗原結合タンパク質または本明細書に記載の本発明の定常領域に結合されているその抗原結合断片を含む抗原結合タンパク質の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる第2のカセットを含んでいる、例えば、第1の発現カセットは、配列番号55の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでおり、また第2の発現カセットは、配列番号56の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる。
本発明の別の実施形態では、定常領域または本明細書に記載した発明の定常領域と連結されているその抗原結合断片を含む抗体の重鎖および/または軽鎖をコードしている1以上の発現カセットを含むベクターを含んでいる安定に形質転換された宿主細胞が提供される。例えば、そのような宿主細胞は、軽鎖をコードする第1のベクターおよび重鎖をコードする第2のベクターを含んでおり、例えば第1のベクターは、配列番号55の重鎖をコードしており、第2のベクターは、配列番号56の軽鎖をコードしている。
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の本発明の宿主細胞が提供されるが、ここで該細胞は真核生物であり、例えば、該細胞は哺乳類である。そのような細胞株の例には、CHOまたはNS0が挙げられる。
本発明の別の実施形態では、定常領域または本明細書に記載した発明の定常領域と連結されているその抗原結合断片を含む抗体を製造するための方法が提供され、この方法は、培養培地、例えば無血清培養培地中で宿主細胞を培養する工程を含んでいる。
本発明の別の実施形態では、前記抗体が、無血清培養培地を含む抗体に関して少なくとも95％以上(例えば、98％以上)にさらに精製される、本明細書に記載の発明に記載の方法が提供される。
さらに別の実施形態では、抗原結合タンパク質および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
本発明の別の実施形態では、使用説明書と共に記載された本明細書に記載の本発明による組成物を含むキットオブパーツが提供される。
本発明の治療剤の投与様式は、宿主に薬剤を送達するためのあらゆる適切な経路であってよい。本発明の抗原結合タンパク質および医薬組成物は、非経口投与、即ち、皮下(s.c.)、髄腔内、腹腔内、筋肉内(i.m.)または静脈内(i.v.)への投与に特に有用である。そのような一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、静脈内投与または皮下投与される。
本発明の治療剤は、有効量の本発明の抗原結合タンパク質を有効成分として、医薬的に許容される担体中に含む医薬組成物として調製することができる。一実施形態では、本発明の予防薬は、注射可能な形態で抗原結合タンパク質を含む水性懸濁液または溶液である。一実施形態では、懸濁液または溶液は、生理学的pHで緩衝されている。一実施形態では、非経口投与のための組成物は、医薬的に許容される担体に溶解した本発明の抗原結合タンパク質またはそのカクテル溶液を含むことになる。一実施形態では、担体は、水性担体である。様々な水性担体が用いられてもよく、例えば、0.9％生理食塩水、0.3％グリシンなどが挙げられる。これらの溶液は、無菌であり、一般に粒子状物質を含まないものであり得る。これらの溶液は、従来のよく知られた滅菌技術(例えば、濾過)により滅菌されてもよい。組成物は、pH調整剤および緩衝剤などの生理学的条件に近づけるために必要な医薬的に許容される補助物質を含んでもよい。このような医薬組成物中の本発明の抗原結合タンパク質の濃度は、広範囲に変更されてもよい、即ち約0.5％未満、通常または少なくとも約1％～約15または20重量％にもなり、主に、選択された特定の投与様式に従って、液体量、粘性などに基づいて選択されるであろう。
従って、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約250mlの滅菌リンゲル液と、リンゲル液1mlあたり約1～約30または5mg～約25mgの本発明の抗原結合タンパク質を含むように調製することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は周知であるか、または当業者には明らかであり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaにさらに詳細に記載されている。本発明の静脈内投与可能な抗原結合タンパク質製剤の調製については、Lasmar U and Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech.today, page 129-137, Vol.3 (3rd April 2000)； Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188； Stability of protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY： Plenum Press (1992)； Akers,M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J.Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300； Imamura, K et al "Effects of types of sugar on stabilization of protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274； Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-dry", J Pharm. J. (2003) 2283-2300； "Excipient-Drug interactions in protein formation," "J Pharm Sci 92 (2004) 2284"； "Excipient-drug interference interference", "J Pharm.J. (2004) 2284", "J Pharm.J. (2004) 2284", "J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039； Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein peroxidise g n", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922； および Ha,E Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002)が挙げられるが、これらの全ての内容を、出典明示により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、本発明の治療剤は、医薬組成物中に存在する場合、単位用量形態で存在する。適切な治療上有効な用量は、当業者により容易に決定されるであろう。適切な用量は、患者の体重に応じて計算されてもよく、例えば、適切な用量は、約0.1～約20mg/kg、例えば約1～約20mg/kg、例えば約10～約20mg/kgまたは例えば約1～約15mg/kg、例えば約10～約15mg/kgの範囲であってもよい。好ましくは、IL1 RAP mAbは、1mg／kgの静脈内注入用量として投与され得る。
「キメラ抗体」とは、ドナー抗体由来の天然に存在する可変領域(軽鎖および重鎖)を、アクセプター抗体由来の軽鎖および重鎖の定常領域と結合させて含む、遺伝子組換え抗体の一種である。
「ヒト化抗体」とは、ヒト以外のドナー免疫グロブリンから得られるCDRを有しており、その残りの分子の免疫グロブリン由来の部分が、1つ以上のヒト免疫グロブリンから得られる遺伝子組換え抗体のタイプを指す。さらに、フレームワークサポート残基は、結合親和性を維持するように変更されてもよい(例えば、Queen et. al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86：10029-10032 (1989), Hodgson, et al., Bio/Technology, 9：421(1991)を参照されたい)。適切なヒトアクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列との相同性によって、従来のデータベース、例えばKABAT(登録商標)データベース、Los AlamosデータベースおよびSwissタンパク質データベースから選択されるものであってよい。ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性(アミノ酸ベースで)に特徴が有るヒト抗体は、ドナーCDRを挿入するための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適している場合がある。軽鎖定常領域または可変フレームワーク領域を提供することができる適切なアクセプター抗体は、同様の方法で選択することができる。アクセプター抗体の重鎖および軽鎖は、同じアクセプター抗体から得る必要はないことに留意されたい。先行技術は、そのようなヒト化抗体を製造するいくつかの方法を記載している－例えば、EP-A-0239400およびEP-A-054951を参照されたい。
「完全ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から得られる可変領域および定常領域を有する抗体(存在する場合)を含む。本発明のヒト配列抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異導入によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異)を含んでいてもよい。完全ヒト抗体は、最終的に、ヒト由来のポリヌクレオチドによってのみコードされるアミノ酸配列、またはかかる配列と同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書において、トランスジェニックマウスにおいて産生されたマウスゲノムに挿入されたヒト免疫グロブリンコード化DNAによってコードされる抗体は、最終的にヒト由来のDNAによってコードされるので完全ヒト抗体となる。この場合、ヒト免疫グロブリンをコードするDNAが、マウス内で再配列されて(抗体をコードするように)、体細胞変異が起こる可能性もある。マウス内でこのような変化を受けた元々のヒトDNAにコードされた抗体は、本明細書における完全ヒト抗体である。このようなトランスジェニックマウスを使用することにより、ヒト抗原に対する完全ヒト抗体を選択することが可能となる。当技術分野で理解されているように、完全ヒト抗体は、ヒト生殖細胞DNA配列を含む抗体を生成するために、ヒトDNAライブラリーをファージに挿入するファージディスプレイ技術を使用して作製することができる。
「ドナー抗体」という用語は、その可変領域のアミノ酸配列、CDRまたは他の機能的断片もしくはその類似体を、第1の免疫グロブリンパートナーに提供する抗体を指す。したがって、ドナーは、ドナー抗体に特徴的な抗原特異性および中和活性を有する改変された免疫グロブリンコード領域、およびその結果として発現された改変抗体を提供する。
用語「アクセプター抗体」は、ドナー抗体に対して異種であり、その重鎖および／または軽鎖フレームワーク領域および／またはその重鎖および／または軽鎖定常領域をコードするアミノ酸配列の全て(または任意の部分)を、第1の免疫グロブリンパートナーに提供する抗体を意味する。ヒト抗体は、アクセプター抗体であってもよい。
用語「VH」および「VL」は、本明細書において、抗原結合タンパク質の重鎖可変領域および軽鎖可変領域各々を指すために使用される。
「CDR」は、抗原結合タンパク質の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。これらのCDRは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部には、3つの重鎖および3つの軽鎖のCDR(またはCDR領域)が存在する。したがって、本明細書で使用する「CDR」とは、3つ全ての重鎖CDR、3つ全ての軽鎖CDR、全ての重鎖および軽鎖CDRまたは少なくとも2つのCDRを指す。
本明細書全体を通して、可変ドメイン配列および全長抗体配列中のアミノ酸残基は、Kabat番号付けの規則に従って番号が付される。同様に、実施例で使用される用語「CDR」、「CDRL1」、「CDRL2」、「CDRL3」、「CDRH1」、「CDRH2」、「CDRH3」は、Kabat番号付け規則に従って番号が付されたものである。詳細については、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1991)を参照されたい。
可変ドメイン配列および全長抗体配列のアミノ酸残基について、別の番号付け規則があることは、当業者には明らかであろう。CDR配列についても別の番号付けの規則があり、例えばChothia et al.(1989) Nature 342： 877-883に記載されている。抗体の構造およびタンパク質の折り畳みは、別の残基がCDR配列の一部とみなされる場合があり、当業者に理解されるようなものを意味し得る。
当業者が利用できるCDR配列の他の番号付けの規則には、「AbM」法(University of Bath)および「contact」法(University College London)が含まれる。Kabat法、Chothia法、AbM法およびcontact法のうち少なくとも2つを用いて最小重複領域を決定することにより、「最小結合単位」を提供することができる。最小結合単位とは、CDRの一部分であってもよい。
以下の表1は、各CDRまたは結合単位について、各番号付けの規則を使用した1つの定義を示している。表1では、可変ドメインアミノ酸配列の番号付けにKabat番号付けスキームが使用されている。CDRの定義のいくつかは、使用する個々の出版物により異なる可能性があることに留意されたい。
Figure 2022539178000002
CDRまたは最小結合単位は、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失または付加によって改変されてもよく、ここで変異体抗原結合タンパク質は、改変されていないタンパク質の生物学的特性を実質的に保持する。
CDR H1、H2、H3、L1、L2、L3の各々は、単独で、または任意の別のCDRと組み合わせて改変され得ることが理解されるであろう。一実施形態では、CDRは、最大3個のアミノ酸、例えば、1または2個のアミノ酸、例えば1個のアミノ酸の置換、欠失または付加によって改変される、通常、改変とは、例えば以下の表2に示されるような、置換、特に保存的置換である。
Figure 2022539178000003
例えば、変異体CDRでは、最小結合単位のアミノ酸残基は、同一残基を維持していてもよいが、KabatまたはChothia定義の一部としてCDRを構成するフランキング残基を、保存アミノ酸残基で置換されていてもよい。
上記のように改変されたCDRまたは最小結合単位を含むそのような抗原結合タンパク質は、本明細書において「機能的CDR変異体」または「機能的結合単位変異体」と呼ばれる場合がある。好適には、一つの実施形態では、IL1RAP結合タンパク質は、配列番号33、34、35、38、39および／または40に記載のアミノ酸配列を有する1つまたは複数のCDRおよび／またはその機能CDR変異体を含んでいるものが提供される。
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗原結合タンパク質の特定の結合ドメインと接触する抗原の部分を指す。エピトープは、線形であってもよいし、立体構造／非連続的であってもよい。立体構造または不連続性のエピトープは、別の配列によって分離された、すなわち、抗原の一次配列において連続した配列中には存在しないアミノ酸残基を含んでいる。これらの残基は、ペプチド鎖の異なる領域に由来するものであっても、抗原の三次元構造では近接している。多量体抗原の場合、立体構造的エピトープまたは不連続性エピトープは、異なるペプチド鎖から得た残基を含む場合がある。エピトープ内に含まれる特定の残基は、コンピュータモデリングプログラムやX線結晶構造解析などの当技術分野における既知の手法によって得られた三次元構造によって決定することができる。
CDRのL1、L2、L3、H1およびH2は、構造的に有限数の主鎖立体構造のうちの1つを示す傾向がある。CDRの特定の標準的な構造分類は、CDRの長さと、CDRおよびフレームワーク領域両方において重要な位置に存在する残基(構造決定残基またはSDR)によって決定されるループパッキングとの両方により規定される。MartinおよびThornton (1996； J Mol Biol 263：800-815)は、「キー残基」の標準テンプレートを定義する自動化手法を開発した。クラスター分析を用いて、CDRのセットについて標準分類を規定し、埋没した疎水性基、水素結合残基、保存的グリシンおよびプロリンを分析することにより、標準テンプレートを同定した。抗体配列のCDRは、配列をキー残基テンプレートと比較し、同一性または類似性マトリクスを用いて各テンプレートをスコア化することにより、標準分類に割り当てることができる。
CDRあたり、対応するCDRあたり、結合単位あたり、重鎖または軽鎖可変領域あたり、重鎖または軽鎖あたり、および抗原結合タンパク質あたりに、複数の変異体CDR標準位置が存在する場合があり得るため、抗原結合タンパク質がIL1RAPと特異的に結合できるようにCDRの標準的な構造が維持されていれば、本発明の抗原結合タンパク質内において、任意の置換の組み合わせが存在していてもよい。
上述したように、CDRの特定の標準的な構造分類は、CDRの長さと、CDRおよびフレームワーク領域両方の重要な位置に存在する残基によって決定されるループパッキングとの両方により規定される。
クエリー核酸配列と対象者の核酸配列の「同一性パーセント」とは、ペアワイズBLASTNアライメントを行った後、対象の核酸配列がクエリー核酸配列と100％のクエリーカバレッジを有する場合に、BLASTNアルゴリズムによって算出されるパーセントで表される「同一性」の値である。このようなクエリー核酸配列と対象の核酸配列とのペアワイズBLASTNアラインメントは、National Center for Biotechnology Instituteのウェブサイトに掲載されているBLASTNアルゴリズムのデフォルト設定を用い、低複雑性領域のフィルタをオフにして行うことができる。重要なことは、クエリー核酸配列が、本明細書の1つ以上の請求項において同定される核酸配列によって記載され得ることである。
クエリーアミノ酸配列と対象のアミノ酸配列との間の「同一性パーセント」とは、ペアワイズBLASTPアライメントを行った後、対象のアミノ酸配列がクエリーアミノ酸配列と100％のクエリーカバレッジを有する場合に、BLASTPアルゴリズムによって算出される、パーセントで表される「同一性」の値である。このようなクエリーアミノ酸配列と対象のアミノ酸配列とのペアワイズBLASTPアラインメントは、National Center for Biotechnology Instituteのウェブサイトに掲載されているBLASTPアルゴリズムのデフォルト設定を用い、低複雑性領域のフィルタをオフにして行う。重要なことは、クエリーアミノ酸配列は、本明細書の1つ以上の請求項において同定されるアミノ酸配列によって記載され得ることである。
クエリー配列は、対象配列と100％同一であってもよく、または％同一性が100％未満となるように対象配列と比較して、一定数までのアミノ酸またはヌクレオチドの変更を含んでもよい。例えば、クエリー配列は、対象配列と少なくとも50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％同一である。このような改変は、少なくとも1つのアミノ酸欠失、置換(保存的置換および非保存的置換を含む)または挿入を含み、前記改変は、クエリー配列のアミノまたはカルボキシ末端位置またはそれらの末端位置間の任意の場所で生じていても、クエリー配列中のアミノ酸またはヌクレオチドの間で個別に、またはクエリー配列内の1つ以上の連続したグループに点在していてもよい。
％同一性は、CDRを含むクエリー配列の全長にわたって決定することができる。あるいは、CDR(複数可)はCDR(複数可)を除外してもよく、例えば、CDR(複数可)が対象配列と100％同一であって、同一性の変更はクエリー配列の残りの部分に存在し、そのためCDR配列は不変(fix)／インタクトである。
ある実施形態において：
(1)ポリヌクレオチドに対する同一性は、所定の配列中のヌクレオチドの総数に、100で割った％同一性を規定する数値を掛けて、その積を前記配列中のヌクレオチドの総数から差し引くことによって計算されるか、または
nn＜ xn-(xn・y)
(式中、nnは、ヌクレオチドの変更数であり、xnは、所定の配列中のヌクレオチドの総数であり、yは、95%の場合は0.95であり、97%の場合は0.97であり、100%の場合は1.00であり、・は乗算演算子の記号であり、xnとyの任意の非整数積は、xnから引く前に最も近い整数に四捨五入される)。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変更は、このコード配列にナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異を生じさせ、それによってこのような変更後のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを変えることができる。
(2) ポリペプチドに対する同一性は、アミノ酸の総数に、100で割った％同一性を規定する数値を掛けて、その積を前記アミノ酸の総数から差し引くことによって計算されるか、または
na＜xa-(xa・y)
(式中、naは、アミノ酸の変更数であり、xaは、配列中のアミノ酸の総数であり、yは95%の場合は0.95であり、97%の場合は0.97であり、100%の場合は1.00であり、・は乗算演算子の記号であり、xaとyの任意の非整数積は、xaから引く前に最も近い整数に四捨五入される。
変異体の配列は、配列番号51、52、55または56のような、非改変タンパク質の生物学的特性を実質的に保持する。
VHまたはVL配列は、最大15個のアミノ酸置換、付加または欠失を有する変異体配列であってよい。例えば、変異体配列は、最大15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1個のアミノ酸置換(複数可)、付加(複数可)または欠失(複数可)を有してもよい。
配列変化は、CDRを排除してもよく、例えば、CDRは、VHまたはVL配列と同一であって、その変化は、VHまたはVL配列の残りの部分に存在しており、そのためCDR配列は不変／インタクトである。
当業者は、抗体のような抗原結合タンパク質の産生に際して、特に、使用される細胞株および抗原結合タンパク質の特定アミノ酸配列に依って翻訳後の修飾が起こる可能性があることを理解するであろう。例えば、特定のリーダー配列の切断、様々なグリコシル化およびリン酸化パターンにおける様々な糖部分の付加、脱アミド化、酸化、ジスルフィド結合スクランブル、異性化、C末端リジンクリップおよびN末端グルタミン環化などが含まれ得る。本発明は、1つ以上の翻訳後修飾を受けたか、または受けている抗原結合タンパク質の使用を包含する。したがって、本発明の「抗原結合タンパク質」または「抗体」は、本明細書に記載されるような翻訳後修飾を受けた、各々前記に定義された通りの「抗原結合タンパク質」または「抗体」を含む。
脱アミド化は、主にアスパラギン(N)を、約3：1の割合でイソアスパラギン酸およびアスパラギン酸(D)に変換する酵素反応である。より少ない頻度で、脱アミド化は、グルタミン残基でも同様に起こり得る。CDRにおける脱アミドにより、分子電荷に変化が生じるが、一般的には抗原結合への変化は起こらず、PK/PDに影響を与えない。
酸化は、製造および保存中(すなわち、酸化的条件の存在下)に起こり、活性酸素種によって直接的に、または酸化ストレスの二次副生成物との反応によって間接的に誘導されるタンパク質の共有結合の改変がおこる。酸化は、主にメチオニン残基で起こるが、トリプトファン残基および遊離システイン残基でも起こる場合がある。
ジスルフィド結合スクランブルは、製造時および基本的な保存条件下で発生する可能性がある。特定の環境下において、ジスルフィド結合が、切断されるか、または誤って形成されることにより、対を形成しないシステイン残基(-SH)が生じる場合がある。これらの遊離(対を形成していない)スルフヒドリル(-SH)は、シャッフリングを促進する可能性がある。
異性化は、通常、製造、精製および貯蔵(酸性pHで)中に起こり、通常、アスパラギン酸が化学的プロセスによってイソアスパラギン酸に変換された場合に起こる。
重鎖および/または軽鎖のN末端グルタミンは、ピログルタミン酸(pGlu)を形成する傾向がある。pGlu形成は、殆どが、製造バイオリアクター内で起こるが、加工および保存条件のpHまたは温度に依り、非酵素的に形成することもある。pGlu形成は、組換えmAbの主要な分解経路の1つとして考えられている。
C末端リジンクリッピングは、カルボキシペプチダーゼによって触媒される酵素反応であり、組換えmAbにおいて一般的に観察される反応である。このプロセスのバリエーションには、片方または両方の重鎖からリジンを除去することが含まれる。リジンクリッピングは、生物活性に影響を与えず、mAbのエフェクター機能にも影響を与えないと考えられる。
ヒトには、タンパク質と結合することができる自然発生的な自己抗体が存在する。自己抗体は、内因性タンパク質(ナイーブ対象に存在する)にも、薬剤治療のために対象に投与されたタンパク質およびペプチドにも結合することが可能である。治療用タンパク質に結合する自己抗体と、薬剤治療に反応して新たに形成された抗体は、総称して抗薬剤抗体(ADA)と呼ばれる。対象に投与される治療用タンパク質およびペプチドなどの分子に対する既存の抗体は、それらの効力に影響を与えて、投与反応、過敏症、治療患者の臨床反応の変化、および該分子を維持、排除または中和することによるバイオアベイラビリティを変化させる可能性がある。ヒト免疫グロブリン(抗体)単一可変ドメインまたはdAbsTMを含んでおり、対象(特に、ヒト対象)に投与したときに免疫原性が低下する(すなわち、既存のADAに結合する能力が低下する)治療用分子を提供することは有利であろう。
したがって、本発明の1つの実施形態では、同等の非改変分子と比較して、既存の抗体(ADA)に結合する能力が低下している改変dAbTMが提供される。結合能力の低下とは、改変された分子が既存のADAに対して低い親和性または低いアビディティにて結合することを意味する。前記改変dAbTMは、(a)C末端の付加、伸長、欠失またはタグ化、および／または(b)1または複数のアミノ酸フレームワークの置換から選択される1または複数の改変を含んでいる。
本明細書のポリペプチドおよびdAbsTMならびにこれらを含むアゴニストは、例えば、PEG基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体または少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Fc領域または抗体ドメインとのコンジュゲーションによって、より大きな流体力学的サイズを有するように構成することが可能である。例えば、ポリペプチドdAbsTMおよびアゴニストは、より大きな抗体の抗原結合断片としてまたは抗体(例えば、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab)2、IgG、scFvとして構成され得る)として構成され得る。
本明細書で使用される場合、「流体力学的サイズ」とは、水溶液全体への分子拡散に基づいた、分子(例えば、抗原結合タンパク質)の見かけのサイズをいう。水溶液へのタンパク質の拡散または運動を、タンパク質の見かけのサイズを導き出すために処理することができ、サイズは、タンパク質粒子の「ストークス半径」または「流体力学的半径」によって示される。タンパク質の「流体力学的サイズ」は、質量および形状(立体構造)の両方により変化し、同じ分子量を持つ2つのタンパク質は、タンパク質全体の立体構造と電荷に依り流体力学的サイズが異なり得る。流体力学的サイズが大きくなると、腎クリアランスが低下し、半減期(t1/2)が長くなる。
本明細書の抗原結合タンパク質(例えば、ドメイン抗体単量体および多量体)の流体力学的サイズは、当技術分野において周知の方法を用いて決定することができる。例えば、抗原結合タンパク質の流体力学的サイズを決定するために、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用してもよい。抗原結合タンパク質の流体力学的サイズを決定するための適切なゲル濾過マトリックス、例えば、架橋アガロースマトリックスは、周知であり、容易に入手可能である。
抗原結合タンパク質形成のサイズ(例えば、ドメイン抗体単量体に結合したPEG部分のサイズ)は、所望の用途に応じて変更することができる。例えば、抗原結合タンパク質が、血液循環を離れて末梢組織に投与することを意図している場合、IL1RAP結合タンパク質の流体力学的サイズを低く保ち、血流からの血管外漏出を容易にすることが望ましい。あるいは、抗原結合タンパク質をより長い期間、全身循環系に留まらせたい場合には、抗原結合タンパク質のサイズを大きくすることができ、例えば、Ig様タンパク質として形成させることができる。
医薬組成物のさらなる説明
本明細書に記載のIL1RAP結合タンパク質(本明細書においては、抗原結合タンパク質を指す場合もある)は、本明細書に記載のヒト疾患の治療に使用するための医薬組成物に組み込むことができる。一実施形態では、医薬組成物は、任意に1つ以上の医薬的に許容される担体および／または賦形剤と組み合わせた抗原結合タンパク質を含んでいる。
かかる組成物は、許容可能な医薬業務により知られており、かつ求められている医薬的に許容される担体を含む。
医薬組成物は、注射または連続的な注入によって投与され得る(例としては、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与および門脈内投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない)。一実施形態では、組成物は、静脈内投与に適している。医薬組成物は、局所投与(これには、経皮投与、吸入投与、鼻腔内投与または経眼投与が含まれるが、これらに限定されない)または経腸投与(これには、経口または直腸投与が含まれるが、これらに限定されない)に好適であり得る。
医薬組成物は、0.5mg～10gのIL1RAP結合タンパク質、例えば5mg～1gの抗原結合タンパク質を含んでいてもよい。あるいは、前記該組成物は、5mg～500mg、例えば5mg～50mgで含んでいてもよい。
このような医薬組成物の製造方法は、当業者には周知である。その他の賦形剤を、投与様式および使用される特定タンパク質に適切となるように組成物に添加してもよい。様々な賦形剤およびそれらの用途の例が、Lowe et al.,(2011)に記載されている。
抗原結合タンパク質を投与するための有効量および治療レジメンは、患者の年齢、体重、健康状態および治療される疾患などの要因に依って変更され得る。かかる要因は、主治医の判断の範囲に含まれる。適切な用量を選択する際のガイダンスは、例えば、Bai et al.,(2012)に見出され得る。
医薬組成物は、別の医薬と一緒に抗原結合タンパク質をキットの一部分として、また適宜、使用説明書と共に含んでいてもよい。便宜上、キットは、使用説明書と共に所定量の試薬を含んでいてもよい。
用語「個体」、「対象」および「患者」は、本明細書において互換的に使用される。一実施形態では、対象は、霊長類、例えばマーモセットまたはサルなどの哺乳類である。別の実施形態では、対象は、ヒトである。
本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、治療方法においても使用され得る。治療とは、治療的、予防的または防止的であってもよい。治療は、疾患の少なくとも1つの態様または症状の緩和、軽減または予防を包含するもので、本明細書に記載される疾患の予防または治癒を包含する。
本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、治療的、予防的または防止的な治療のために有効量で使用される。本明細書に記載の抗原結合タンパク質の治療的有効量は、疾患の1つまたは複数の症状を改善または軽減するために、あるいは疾患を予防または治癒するために有効な量である。
従って、一実施形態において、本発明のIL1RAP結合タンパク質は、治療における使用のために提供される。一実施形態では、本発明のIL1RAP結合タンパク質は、癌または炎症性サイトカインに関連する疾患の治療における使用のために提供される。本発明は、癌または炎症性サイトカインに関連する疾患を治療するための医薬品製造における本発明のIL1RAP結合タンパク質の使用もまた含む。
製造方法に関する詳細な説明
抗原結合タンパク質は、多数の従来技術のいずれかにより製造することができる。例えば、抗原結合タンパク質は、それらを天然に発現する細胞から精製されてもよいし(例えば、抗体は、それを産生するハイブリドーマから精製することができる)、または組換え発現系で産生させてもよい。
本発明の抗原結合タンパク質を生成するために、様々な発現系および精製手法を用いることができる。一般に、宿主細胞は、所望の抗原結合タンパク質をコードする組換え発現ベクターで形質転換される。様々な宿主細胞を用いることができ、原核生物(グラム陰性またはグラム陽性細菌を含み、例えば大腸菌、バチルス属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属)、酵母(例えば、サッカロマイセス・セレビシエ、ピキア・パストリス)、真菌(例えば、アスペルギルス属)または高等真核生物(例えば、昆虫細胞およびCHO、Perc6、HEK293、HeLaなどの哺乳類由来の細胞株)を用いることができる。
宿主細胞は、単離された宿主細胞であってもよい。宿主細胞は、通常、多細胞生物(例えば、植物または動物)の一部ではない。宿主細胞は、非ヒト宿主細胞であってもよい。
細菌、真菌、酵母および哺乳類の細胞宿主と共に使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターならびにクローニング方法は、当技術分野において既知である。
細胞は、抗原結合タンパク質の発現を促進する条件下で培養することができ、ポリペプチドは、一般的なタンパク質精製方法によって回収することができる。本明細書で使用が意図される抗原結合タンパク質は、夾雑物質を実質的に含まない実質的に均質な抗原結合タンパク質を含んでいる。
当業者は、抗原結合タンパク質の産生に際して、特に使用される細胞株および抗原結合タンパク質の特定のアミノ酸配列に依って、翻訳後修飾が起こり得ることを理解するであろう。これには、特定のリーダー配列の切断、様々なグリコシル化パターンにおける様々な糖部分の付加、脱アミド化(例えば、アスパラギンまたはグルタミン残基において)、酸化(例えば、メチオニン、トリプトファンまたは遊離システイン残基)、ジスルフィド結合スクランブル、異性化(例えば、アスパラギン酸残基)、C末端リジンクリッピング(例えば、一方または両方の重鎖から)およびN末端グルタミン環化(例えば、重鎖および／または軽鎖において)などが含まれ得る。本発明は、1つ以上の翻訳後修飾が行われたか、または改変された抗体の使用を包含する。修飾は、CDR、可変フレームワーク領域または定常領域で起こり得る。修飾により、分子電荷が変化する場合がある。通常、修飾は、抗原結合、機能、生物活性における変化をもたらさず、IL1RAP結合タンパク質の薬物動態学的(PK)特性または薬力学的(PD)特性に影響を与えない。
本明細書で使用する「エフェクター機能」という用語は、抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)、補体依存性細胞傷害活性(CDC)媒介応答、Fc媒介性食作用または抗体依存性細胞食作用(ADCP)およびFcRn受容体を介した抗体リサイクルのうちの1以上を指すことを意味する。
抗原結合タンパク質の定常領域と各種Fc受容体(FcR)(例えば、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16))との相互作用は、抗原結合タンパク質のエフェクター機能を媒介すると考えられている。重要な生物学的効果は、エフェクター機能の結果である可能性がある。通常、エフェクター機能を媒介するためには、抗原結合タンパク質が抗原に結合することが必要であり、全ての抗原結合タンパク質が、全てのエフェクター機能を媒介するわけではない。
エフェクター機能は、多くの方法、例えば、ナチュラルキラー細胞上のFcγRIIIとの結合を介するか、または単球/マクロファージ上のFcγRIを介してADCC/ADCPエフェクター機能を測定する方法で測定することができる。例えば、本発明の抗原結合タンパク質は、ナチュラルキラー細胞アッセイにおいて、ADCCエフェクター機能を評価することができる。ADCCおよび／またはCDC機能を評価するための実用的なアプローチは、Kellner C et al., "Boosting ADCC and CDC activity by Fc engineering and evaluation of antibody effector functions", Methods, 1；65(1)：105-13 (2014)において見出すことができる。
ヒトの定常領域のアイソタイプ、特にIgG4およびIgG2のアイソタイプは、a) 古典的経路による補体の活性化；b) 抗体依存性の細胞傷害性に関する機能を低下させる。抗原結合タンパク質の重鎖定常領域には、目的とするエフェクター特性に応じて様々な改変が施されていてもよい。特定の変異を含むIgG1定常領域は、Fc受容体への結合を減少させて、それによりADCCおよびCDCを減少させることが別々に記載されている(Kellner C et al., "Boosting ADCC and CDC activity by Fc engineering and evaluation of antibody effector functions", Methods, 1；65(1)：105-13 (2014))。
本発明の一実施形態では、抗原結合タンパク質が、ADCCおよび／または補体の活性化またはエフェクター機能を低下させるような定常領域を含む抗原結合タンパク質が提供される。そのような実施形態では、重鎖定常領域は、IgG2もしくはIgG4アイソタイプの天然に無効化された定常領域または突然変異したIgG1定常領域を含んでいてもよい。一例として、235位および237位におけるアラニン残基の置換が挙げられる(EUインデックス番号付け)。
抗体のサブクラスにより、部分的に、補体活性化またはFc受容体(FcR)結合および抗体依存性細胞傷害(ADCC)などの二次的エフェクター機能が決まる(Huber, et al., Nature 229(5284)： 419-20 (1971)； Brunhouse，et al., Mol Immunol 16(11)： 907-17 (1979))。特定の用途にとって最適なタイプの抗体を特定する際に、抗体のエフェクター機能が考慮されてもよい。例えば、hIgG1抗体は、比較的長い半減期を持ち、補体の固定時に非常に有効であり、FcγRIおよびFcγRIIの両方に結合する。一方、ヒトIgG4抗体は、半減期が短く、補体を固定せず、FcRへの親和性も低い。IgG4のFc領域におけるセリン228をプロリン(S228P)に置換すると、hIgG4で観察される不均一性が減少し、血清半減期が長くなる(Kabat, et al., "Sequences of proteins of immunological interest" 5.sup.th Edition (1991)； Angal, et al., Mol Immunol 30(1)： 105-8 (1993))。ロイシン235をグルタミン酸に置き換える第2の変異(L235E)により、残存するFcR結合活性および補体結合活性が消失する(Alegre，et al，J Immunol 148(11)： 3461-8 (1992))。両方の変異を有する得られた抗体は、IgG4PEと呼ばれる。hIgG4アミノ酸の番号付けは、EU番号付けの文献から得られる：Edelman, G.M. et al., Proc. Natl.Acad. usa, 63, 78-85 (1969). PMID：5257969。本発明の1つの実施形態において、置換S228PおよびL235Eを有するIgG4 Fc領域を含むIL1RAP抗原結合タンパク質は、IgG4PEとして表記され得る。
ADCC/CDCの増強
当技術分野で理解されているように、抗体のADCCおよび/またはCDC活性を増加させる様々な技術が知られている。これらには、Fc領域における様々な変異、コンプリジェント(Complegent)およびポテリジェント(Potelligent)技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の1つの態様では、1つ以上のADCC／CDC増強技術が、本発明のIL1RAP結合タンパク質(特に、抗IL1RAP抗体)に適用され得る。
変異
残基Asn297に特異的変異またはグリコシル化の変更を含むヒトIgG1定常領域は、Fc受容体への結合を増強することも記載されている。いくつかの場合において、これらの変異により、ADCCおよびCDCが増強されることも判っている；例えば、Kellner(2013)を参照されたい。
本発明の一実施形態では、このような変異は、239、332および330(IgG1)、またはその他のIgGアイソタイプにおける同等位置から選択される1つ以上の位置に存在する。好適な変異の例は、S239DおよびI332EおよびA330Lである。一実施形態では、本明細書に記載の本発明の抗原結合タンパク質は、239および332位で変異しているか、例えばS239DおよびI332E、またはさらなる実施形態では、239および332および330位から選択される3つ以上の位置で変異している、例えばS239DおよびI332EおよびA330L(EUインデックス番号付け)。
コンプリジェント(登録商標)
本発明の一実施形態では、抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能を示すように、例えば増強されたADCCまたは増強されたCDC、または増強されたADCCおよびCDC機能を示すように、IgG3由来の少なくとも1つのCH2ドメインおよびキメラ重鎖定常領域を含む抗原結合タンパク質が提供される。1つのそのような実施形態において、抗原結合タンパク質は、IgG3由来の1つのCH2ドメインを含んでよく、または両方のCH2ドメインがIgG3由来のものであってもよい。
また本発明による抗原結合タンパク質を製造する方法も提供され、この方法は、以下の工程を含む：
a) 本明細書に記載の単離核酸を含む発現ベクターを含んでいる組換え宿主細胞を培養する工程、ここで該発現ベクターは、IgG1およびIgG3 Fcドメインアミノ酸残基の両方を有するFcドメインをコードする核酸配列を含んでいる；および
b) 抗原結合タンパク質を回収する工程。
このような抗原結合タンパク質の製造方法は、例えば、BioWa, Inc.(Princeton, NJ)および協和発酵工業(現協和発酵キリン)株式会社(以下、「協和発酵キリン」という)から入手可能なコンプリジェント(登録商標)技術システムを用いて実施することができ、この方法で発現ベクターを含む組換え宿主細胞は、IgG1およびIgG3 Fcドメインのアミノ酸残基両方を有するキメラFcドメインをコードする核酸配列を発現して、前記キメラFcドメインを含まないその他の同一抗原結合タンパク質と比較して、増強された補体依存性細胞傷害活性(CDC)を示す抗原結合タンパク質を産生する。コンプリジェント(登録商標)技術システムの態様は、WO2007011041およびUS20070148165に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、CDC活性は、IgG鎖のFc領域に配列特異的変異を導入することによって増強され得る。当業者であれば、別の適切なシステムも認識するであろう。
ポテリジェント(登録商標)
本発明は、抗原結合タンパク質を製造する方法も提供し、この方法は、以下の工程を含む：
a) 本明細書に記載の単離核酸を含む発現ベクターを含む組換え宿主細胞を培養する工程、ここでα-1,6-フコース転移酵素をコードするFUT8遺伝子は、組換え宿主細胞においては不活性化されている；および
b) 抗原結合タンパク質を回収する工程。
このような抗原結合タンパク質の製造方法は、例えば、BioWa, Inc.(Princeton, NJ)から入手可能なポテリジェント(POTELLIGENTTM)(登録商標)技術システムを用いて実施することができ、ここでFUT8遺伝子の機能的コピーを含まないCHOK1SV細胞は、機能的FUT8遺伝子を有する細胞で産生された同一のモノクローナル抗体と比較して、増強された抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性を示すモノクローナル抗体を産生する。ポテリジェント(POTELLIGENTTM)(登録商標)技術システムの態様は、US7214775、US6946292、WO0061739およびWO0231240に記載されており、これらは参照によりその全てが本明細書に組み込まれるものとする。当業者であれば、その他の適切なシステムも認識するであろう。
このような改変は、単独で使用されるだけでなく、エフェクター機能をさらに増強するために互いに組み合わせて使用され得ることは、当業者には明らかであろう。
本発明の1つのそのような実施形態では、変異したキメラ重鎖定常領域を含んでいる重鎖定常領域を含む抗原結合タンパク質が提供され、例えば、ここで抗原結合タンパク質はIgG3に由来する少なくとも1つのCH2ドメインおよびIgG1に由来する1つのCH2ドメインを含んでおり、該抗原結合タンパク質は、増強されたエフェクター機能、例えば、増強されたADCCまたは増強されたCDCのうちの1つ以上を示すように、該IgG1 CH2ドメインは、239位、332位および330位から選択される位置に1以上の変異を有しており(例えば、変異は、S239D、I332EおよびA330Lから選択され得る)。一実施形態では、IgG1 CH2ドメインは、変異S239DおよびI332Eを有する。
本発明の別の実施形態では、キメラ重鎖定常領域を含み、かつ変更されたグリコシル化プロファイルを有する抗原結合タンパク質が提供される。そのような1つの実施形態において、重鎖定常領域は、IgG3に由来する少なくとも1つのCH2ドメインおよびIgG1に由来する1つのCH2ドメインを含んでおり、フコース対マンノースの比が0.8：3以下であるように変更されたグリコシル化プロファイルを示すものであり、例えば、該抗原結合タンパク質が、変異および変更されたグリコシル化プロファイルを含まない免疫グロブリン重鎖定常領域を有する同じ抗原結合タンパク質と比較して、増強されたエフェクター機能を有するように、例えば、1以上の以下の機能：増強されたADCCまたは増強されたCDCを示すように脱フコシル化されている、例えば、該抗原結合タンパク質は、増強されたADCCおよび増強されたCDCを有する。
別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、少なくとも1つのIgG3 CH2ドメインおよびIgG1由来の少なくとも1つの重鎖定常ドメインを有しており、ここで両方のIgG CH2ドメインが、本明細書に記載された限定に従って変異されている。
本発明の一実施形態では、本明細書に記載の本願抗原結合タンパク質を製造する方法も提供され、この方法は、以下の工程を含む：
a) 本明細書に記載の単離核酸を含む発現ベクターを含む組換え宿主細胞を培養する工程であって、前記発現ベクターは、IgG1およびIgG3 Fcドメインアミノ酸残基の両方を有するキメラFcドメインをコードするFc核酸配列をさらに含んでおり、ここでα-1,6-フコース転移酵素をコードするFUT8遺伝子が、組換え宿主細胞においては不活性化されている；および
b) 抗原結合タンパク質を回収する工程。
このような抗原結合タンパク質の製造方法は、例えば、BioWa, Inc.(Princeton, NJ)から入手可能なアクリタマブ(ACCRETAMABTM)(登録商標)技術システムを用いて実施することができる。この技術システムは、ポテリジェント(POTELLIGENTTM)(登録商標)およびコンプリジェント(COMPLEGENTTM)(登録商標)技術システムを組み合わせて、キメラFcドメインを含まず、かつオリゴ糖上にフコースを有する別の同一モノクローナル抗体と比較して増加したADCCおよびCDC両方の増強活性を示す抗原結合タンパク質を生成する。
本発明のさらに別の実施形態では、変異したキメラ重鎖定常領域を含む抗原結合タンパク質が提供され、前記抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質が、増強されたエフェクター機能、例えば、増強されたADCCまたは増強されたCDCのうちの1以上の機能を示すように変更されたグリコシル化プロファイルを有する。一実施形態では、変異は、239位、332位および330位から選択され、例えば、変異は、S239D、I332EおよびA330Lから選択される。さらなる実施形態では、重鎖定常領域は、IgG3由来の少なくとも1つのCH2ドメインおよびIgG1由来の1つのCH2ドメインを含む。一実施形態では、重鎖定常領域は、フコースとマンノースの比が0.8：3以下であるように、例えば抗原結合タンパク質が脱フコシル化されている、変更されたグリコシル化プロファイルを有しており、前記抗原結合タンパク質は、同じ非キメラ抗原結合タンパク質または前記変異および変更されたグリコシル化プロファイルが存在しない免疫グロブリン重鎖定常領域と比較して、増強されたエフェクター機能を有している。
IgG抗体の長い半減期は、FcRnとの結合に依り変化することが報告されている。そのため、定常領域を遺伝子操作することにより、相互作用に関するpH依存性を維持しながら、pH6.0でのIgGのFcRnへの結合親和性を増強する置換が、Kuo and Aveson(2011)により広く研究されてきた。
本発明の抗原結合タンパク質を改変する別の手段は、免疫グロブリン定常ドメインまたはFcRn(胎児性Fc受容体)結合ドメインの改変により、前記タンパク質のインビボ半減期を増加させることである。
成体哺乳類では、新生児Fc受容体としても知られるFcRnは、IgGアイソタイプの抗体を結合して、分解から守る保護受容体として作用することにより、血清抗体レベルを維持する際に重要な役割を担っている。IgG分子は、内皮細胞のエンドサイトーシスにより、FcRnに結合すると循環系にリサイクルされて排出される。一方、FcRnに結合しないIgG分子は、細胞内に入り、リソソーム経路をターゲットとして、そこで分解される。
新生児FcRn受容体は、抗体のクリアランスと組織間のトランスサイトーシスの両方に関与していると考えられている：Kuo and Aveson, (2011)。ヒトFcRnと直接相互作用することが実証されたヒトIgG1残基には、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434およびHis435が挙げられる。このセクションに記載されたこれらのいずれかの位置におけるスイッチは、本発明の抗原結合タンパク質の血清半減期の増強および／またはエフェクター特性の変化を可能にし得る。
FcRnへの親和性を高めることにより半減期を増加させるための変異
本発明の抗原結合タンパク質は、FcRnに対する定常ドメインまたはその断片の親和性を高める1つまたは複数のアミノ酸改変を有していてもよい。これらの改変により、これらのタンパク質の半減期を増加させることができる：Kuo and Aveson (2011)。治療および診断用IgGおよび別の生物活性分子の半減期を増加させることにより、多くの利点、例えばこれら分子の投与量および／または頻度を低下させる利点を有する。従って、一つの実施形態では、本明細書において提供される本発明の抗原の結合を提供するか、またはこれらのアミノ酸改変の1つ以上を含むIgG定常ドメインの全部または一部(FcRn結合部分)と、そのような改変IgG定常ドメインに結合した非IgGタンパク質または非タンパク質分子とを含む融合タンパク質を提供するものであり、ここで該改変IgG定常ドメインの存在は、抗原結合タンパク質のin vivo半減期を増大させる。
半減期を増加させることが可能な多くの方法が知られており(Kuo and Aveson, (2011))、例えば、アミノ酸改変は、アラニンスキャニング変異誘発、ランダム変異誘発およびFcRnへの結合および／またはin vivo挙動を評価するためのスクリーニングを含む技術により行われる。また、変異させるアミノ酸変異の1つを選択するために、変異誘発後にコンピューターによる計算ストラテジーを使用してもよい。
従って、本発明は、FcRnへの結合が最適化された抗原結合タンパク質の変異体を提供する。好ましい実施形態において、抗原結合タンパク質の前記変異体は、抗原結合タンパク質のFc領域において少なくとも1つのアミノ酸改変を含んでおり、この改変は、その親のポリペプチドと比較したFc領域の226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401 403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446および447からなる群から選択され、該Fc領域のアミノ酸の番号は、KabatにおけるEUインデックスの番号付けによるものである。
本発明のさらなる態様において、改変はM252Y/S254T/T256Eである。
さらに、様々な出版物には、半減期が変更された生理学的に活性な分子を得るための方法が記載されており、例えば、Kontermann(2009)には、分子にFcRn結合ポリペプチドを導入するか、FcRn結合親和性は維持しているが別のFc受容体の親和性が大幅に低下した抗体と融合させるか、または抗体のFcRn結合ドメインと融合させることにより得られる方法が記載されている。
pHスイッチ技術による半減期の増強
定常領域の置換は、治療用IgG抗体の機能を大幅に向上させることができるが、厳密に保存された定常領域の置換はヒトにおいて免疫原性のリスクがあり、多様性の高い可変領域配列の置換は免疫原性が低くなる可能性がある。可変領域に関しては、抗原との結合親和性を向上させるためにCDR残基を遺伝子操作すること、安定性を向上させて免疫原性のリスクを低下させるためにCDR残基およびフレームワーク残基を遺伝子操作することなどの報告がある。周知のように、抗原に対する親和性の向上は、ランダム化ライブラリィのファージディスプレイまたはリボソームディスプレイを用いた親和性成熟により達成することができる。
安定性の向上は、配列および構造に基づく合理的な遺伝子操作から合理的に得ることができる。免疫原性リスクの低下(脱免疫化)は、様々なヒト化手法およびT細胞エピトープの除去によって達成することができ、これらはin silico技術を用いた予測またはin vitroアッセイによる決定が可能である。さらに、可変領域は、pIが低くなるようように遺伝子操作されている。これらの抗体では、FcRn結合が同程度であるにも拘らず、野生型抗体と比較して、より長い半減期が観察された。pH依存性の抗原結合を示す抗体を設計または選択することで、抗体および/または抗原の半減期を変更することができ、例えば、IgG2抗体の半減期は、抗原に結合した抗体が抗原媒介クリアランスメカニズムにより正常に分解されれば、半減期の短縮が可能である。同様に、抗原：抗体の複合体は、抗原の半減期に影響を与え、抗原を通常の分解プロセスから保護することで半減期を延ばすか、または抗体媒介性の分解により半減期を短縮させることができる。一実施形態は、pH5.5/pH7.4またはpH6.0/pH7.4におけるKD比が2以上となるような、エンドソームのpH(即ち、pH5.5～6.0)と比較して、pH7.4で抗原に対して高い親和力を有する抗体に関するものである。例えば、抗体の薬物動態(PK)特性および薬力学的(PD)特性を増強するために、CDR残基にヒスチジンを導入することによって、抗体へのpH感受性の結合を設計することが可能である。
さらに、生物学的半減期を低下させた抗原結合タンパク質を製造する方法も提供される。His435をアラニンに変異させた変異体IgGは、FcRn結合に関する選択的喪失および血清半減期の有意な低下をもたらす(例えば、US6,165,745は、抗原結合タンパク質をコードするDNAセグメントに変異を導入して生物学的半減期を減少させた抗原結合タンパク質を産生する方法を開示している)。この変異は、Fc-ヒンジドメインの253位、310位、311位、433位または434位におけるアミノ酸置換を含む。
リンカー
タンパク質スキャッホルドは、Ig配列のような天然に存在する配列と同じであってもよいし、天然に存在する配列の断片であってもよく、天然に存在し得る追加の配列、異なる種由来の配列または合成配列を含んでいてもよく、またこれらをスキャッホルドのN末端またはC末端に加えてもよい。そのような追加の配列は、本明細書で定義されるようなエピトープ結合ドメインとタンパク質スキャッホルドを連結する場合、リンカーであると考えてもよい。
別の態様では、抗原結合構築体は、エピトープ結合ドメインに直接または間接的に(例えば、リンカー配列を介して)各末端で連結され、抗体のFc領域またはその一部から本質的になるか、またはそれらを本質的に含んでいる。このような抗原結合構築体は、Fc領域またはその一部によって分離された2つのエピトープ結合ドメインを含んでいてもよい。分離されているとは、エピトープ結合ドメインが互いに直接連結されていないことを意味し、一態様では、Fc領域またはその他の任意のスキャッホルド領域の反対側の末端(CおよびN末端)に配置されている。
一態様では、抗原結合構築体は、2つのエピトープ結合ドメインに各々結合した2つのスキャッホルド領域を含んでおり、例えば、各スキャッホルド領域のNおよびC末端で、直接またはリンカーを介して間接的に結合される。
本発明のタンパク質スキャッホルドは、リンカーを使用してエピトープ結合ドメインに結合させることができる。好適なリンカーの例としては、長さが、1アミノ酸～150アミノ酸または1アミノ酸～140アミノ酸、例えば、1アミノ酸～130アミノ酸、1～120アミノ酸または1～80アミノ酸、1～50アミノ酸、1～20アミノ酸または1～10アミノ酸、または5～18アミノ酸であり得るアミノ酸配列を含む。このような配列は、固有の三次構造を有していてもよく、例えば、本発明のリンカーは、単一の可変ドメインを含んでもよい。一実施形態におけるリンカーの大きさは、単一の可変ドメインに相当する。好適なリンカーは、1～100オングストロームの長さであってもよく、例えば、20～80オングストロームの長さであってもよく、例えば、20～60オングストロームの長さであってもよく、例えば、40オングストローム未満、20オングストローム未満、または5オングストローム未満の長さのものであってもよい。
一実施形態では、IL1RAP結合タンパク質は、モノクローナル抗体(mAb)である。好適には、IL1RAP結合タンパク質は、ヒト化モノクローナル抗体である。一態様において、本発明のモノクローナル抗体は、完全なヒトであり得る。
別の態様では、IL1RAP結合タンパク質は、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、ミニボディ、単離VHまたは単離VLであるフラグメントである。一実施形態では、IL1RAP結合タンパク質は、その抗原結合部分である。
さらに、本発明は、本明細書に記載のIL1RAP結合タンパク質またはモノクローナル抗体を含む医薬組成物である。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、少なくとも1つの抗新生物剤をさらに含む。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、少なくとも1つの第2の免疫調節剤をさらに含む。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、少なくとも1つの免疫刺激アジュバントをさらに含む。
本発明のIL1結合タンパク質は、固形腫瘍を治療するために使用することができる。一態様において、腫瘍は、頭頸部癌、胃癌、メラノーマ、腎細胞癌(RCC)、食道癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頸癌、膀胱癌、乳癌、メラノーマ、腎細胞癌(RCC)、EC扁平上皮癌および中皮腫から選択される。別の態様では、ヒトは、多発性骨髄腫、慢性リンパ芽球性白血病(CLL)、濾胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群および慢性骨髄性白血病などの液性腫瘍を有している。
本明細書で使用される用語「治療する」およびその文法的変形によって、治療的療法が意味される。特定の条件に関して、治療するとは、以下を意味する：(1)症状の生物学的症候の1つ以上の症状を改善または予防すること；(2)(a)その症状に至るか、またはその原因となる生物学的カスケードの1つ以上の過程を阻止するか、または(b)その症状の生物学的症候の1つ以上を阻止すること、(3)症状またはその症状の治療に関連した兆候、効果または副作用の1つ以上を緩和すること、(4)症状または症状の1つ以上の生物学的症候の進行を遅らせること、および／または(5)寛解期間に追加の治療を行わずに、その症候の寛解状態であると考えられる期間中に、1つ以上の症状の生物学的症候を排除または検出不能なレベルにまで低下することにより前記症状または症状の1つ以上の生物学的症候を治癒させることである。当業者であれば、特定の疾患または症状について寛解とみなされる期間を理解するであろう。予防的治療もその期間により考えられる。当業者は、「予防」が、絶対的な用語でないことを理解するであろう。医学における「予防」とは、症状またはその生物学的症候の可能性または重症度を実質的に低下させるため、またはかかる症状またはその生物学的症候の発症を遅らせるための薬剤の予防的投与を指すと理解される。予防的治療は、対象が、癌を発症するリスクが高いと考えられる場合、例えば、対象が強い癌の家族歴を有する場合、または対象が発癌物質に曝露された場合などに適切である。
本明細書では、「癌」、「新生物」および「腫瘍」という用語は、互換的に用いられ、単数形または複数形のいずれにおいても、宿主生物にとって病気となる悪性転換を遂げた細胞を指すものとする。初代がん細胞は、十分に確立された技術、特に組織学的試験により、非がん細胞と容易に区別することができる。本明細書で使用する癌細胞の定義には、初代癌細胞だけでなく、癌細胞となる起源に由来するあらゆる細胞が含まれる。これには、転移したがん細胞、がん細胞から得られたインビトロ培養物および細胞株も含まれる。通常、固形腫瘍として現れる癌の種類を説明する場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍とは、腫瘍の質量に基づいて検出可能なもの；例えば、コンピューター断層撮影(CT)スキャン、磁気共鳴イメージング(MRI)、X線、超音波または身体検査の触診などの処置によって検出可能なもの、および／または患者から得られる試料中の1つまたは複数の癌特異抗原の発現により検出可能なものである。腫瘍とは、造血器系(または、血液学的または血液関連の)癌、例えば、血球または免疫細胞に由来する癌であってもよく、「液性腫瘍」と言われる場合もある。血液腫瘍に基づく臨床症状の具体例としては、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病等の白血病；多発性骨髄腫、MGUSおよびワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症等の形質細胞悪性腫瘍；非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫等のリンパ腫等がある。
本発明のIL1RAP結合タンパク質は、異常な数の芽球細胞または望ましくない細胞増殖が存在する可能性のある癌の治療あるいはリンパ系悪性腫瘍および骨髄系悪性腫瘍の両方を含む血液系癌と診断された癌の治療に使用することができる。骨髄系悪性腫瘍には、急性骨髄性(または、骨髄球性、骨髄原性または骨髄芽球性)白血病(未分化または分化)、急性前骨髄性(または、前骨髄球性、前骨髄原性または前骨髄芽球性)白血病、急性骨髄単球性(または、骨髄単芽球性)白血病、急性単球性(または、単芽球性)白血病、赤芽球性白血病および巨核球性(または、巨核球性)白血病などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの白血病は、まとめて急性骨髄性(または、骨髄球性または骨髄性)白血病(AML)と言われる場合もある。骨髄系悪性腫瘍には、骨髄増殖性障害(MPD)も含まれ、例えば、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、本態性血小板血症(または血小板症)および真性多血症(PCV)などが挙げられるが、これらに限定するものではない。骨髄系悪性腫瘍には、骨髄異形成症候群(または、骨髄異形成症候群またはMDS)(不応性貧血(RA)、芽球増加型不応性貧血(RAEB)、移行期の芽球増加型不応性貧血(RAEBT))、さらに骨髄線維症(MFS)(特発性骨髄化異形成を伴うか、または伴わない)も挙げられる。
本発明のIL1RAP結合タンパク質は、これらのタンパク質に対する免疫応答を増強するために(すなわち、ワクチン接種プロトコルにおいて)、その他の組換えタンパク質および／またはペプチド(腫瘍抗原または癌細胞など)と共に使用することができる。
例えば、そのIL1RAP結合タンパク質を使用して、少なくとも1つのIL1RAP結合タンパク質を目的抗原(例えば、ワクチン)と共投与することにより、抗原特異的免疫応答を刺激することができる。従って、別の態様では、本発明は、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法を提供するものであって、対象における抗原に対する免疫応答が増強されるように、(i)抗原；および(ii)本発明のIL1RAP結合タンパク質を、対象に投与することを特徴とする方法を提供する。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来の抗原であってもよい。そのような抗原の非限定的な例には、腫瘍抗原またはウイルス、細菌もしくはその他の病原体由来の抗原が挙げられる。
本明細書で使用される「腫瘍抗原」は、免疫応答、特にT細胞媒介性免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本明細書で使用される「腫瘍抗原」という用語は、腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原の両方を含む。腫瘍特異的抗原は、腫瘍細胞に特有のものであり、体内の別の細胞には存在しない。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞に特有ではなく、抗原に対する免疫寛容状態を誘導できない条件下においては正常細胞上にも発現している。腫瘍上の抗原の発現は、免疫系が抗原に反応できるような条件下で起こる場合もある。腫瘍関連抗原は、免疫系が未熟で応答できない胎児期成長時に正常細胞上に発現する抗原であるか、または通常、正常細胞上には極めて低いレベルで存在するが、腫瘍細胞上では非常に高レベルで発現する抗原であり得る。
腫瘍抗原の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2などの分化抗原；MAGEファミリー抗原(例えば、MAGE1、MAGE-2、MAGE3、MAGE10、MAGE11、MAGE12、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA8、MAGEA9、MAGEB18、MAGEB6、MABEC1、MAGED2、MAGEE1、MAGEH1、MAGEL2、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15MAGE-3などを含むが、これに限定するものではない)などの腫瘍特異的多分化抗原(tumor-specific multilineage antigens)；MEL4、メラノーマ関連抗原100+、メラノーマgp100、NRIP3、NYS48、OCIAD1、OFA-iLRP、OIP5、卵巣癌関連抗原(OV632)、PAGE4、PARP9、PATE、プラスチンL、PRAME、前立腺特異的抗原、プロテイナーゼ3、プロステイン(prostein)、Reg3a、RHAMM、ROPN1、SART2、SDCCAG8、SEL1L、SEPT1、SLC45A2、SPANX、SSX5、STXGALNAC1、STEAP4、サバイビン、TBC1D2、TEM1、TRP1、上皮由来の腫瘍抗原、XAGE1、XAGE2、WT-1；CEAなどの過剰発現した胚性抗原；過剰発現した癌遺伝子および変異した癌抑制遺伝子、例えばp53、Ras、HER-2/neu；染色体転座より生じた固有の腫瘍抗原、例えば、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；およびウイルス抗原、例えば、エプスタイン-バー(Epstein Barr)ウイルス抗原EBVAおよびヒト乳頭腫ウイルス(HPV)抗原E6およびE7。
その他の腫瘍抗原としては、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-fetoprotein、beta-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3＼CA27.29＼BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68＼P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733＼EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90＼Mac-2結合タンパク質＼シクロフィリンC-関連タンパク質、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、グリオーマ関連抗原、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸管カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスターゼ、前立腺特異抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、Her2/neu、サバイビン(survivin)およびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、ELF2M、好中球エラスターゼ、ephrinB2、CD19、CD20、CD22、ROR1、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、インシュリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体およびメソセリンが挙げられるが、これに限定するものではない。
通常、治療される高感受性腫瘍に対して活性を有するあらゆる抗新生物剤が、本発明における癌の治療において共投与され得る。そのような薬剤の例は、Cancer Principles and Practice of Oncology by V.T. Devita and S. Hellman (editors), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishersに見出すことができる。当業者であれば、関連する薬剤および癌に関する特定の特性に基づいて、どの薬剤の組み合わせが有用であるかを認識することができるであろう。本発明において有用な典型的な抗新生物剤には、これらに限定されないが、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイドなどの微小管阻害剤；白金配位錯体；ナイトロジェンマスタード、オキサザホスホリン、アルキルスルホネート、ニトロソウレアおよびトリアゼンなどのアルキル化剤；アントラサイクリン、アクチノマイシンおよびブレオマイシンなどの抗生物質；エピポドフィロトキシンなどのトポイソメラーゼII阻害剤；プリン類似体、ピリミジン類似体および抗葉酸化合物などの代謝拮抗剤；カンプトテシンなどのトポイソメラーゼI阻害剤；ホルモンおよびホルモン類似体；シグナル伝達経路阻害剤；非受容体チロシンキナーゼ血管形成阻害剤；免疫療法剤；アポトーシス促進剤および細胞周期シグナル伝達阻害剤が挙げられる。
本発明のIL1RAP結合タンパク質と併用投与または共投与して使用するための別の有効成分または成分群の例は、あらゆる化学療法剤、免疫調節剤または免疫調節剤および免疫刺激性アジュバントを含む抗新生物剤である。
微小管阻害剤または抗有糸***剤は、細胞周期のM期または有糸***期の期間に、腫瘍細胞の微小管に対して作用する細胞期に特異的な薬剤である。微小管阻害剤の例としては、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイドが挙げられるが、これらに限定されない。
天然物由来のジテルペノイドは、細胞周期のG2/M期に作用する細胞期に特異的な抗癌剤である。ジテルペノイドは、微小管のチューブリンサブユニットと結合することで、このタンパク質を安定化させると考えられている。タンパク質の分解が阻害され、有糸***が停止し、細胞死が起こると考えられている。ジテルペノイドの例としては、パクリタキセルおよびその類似体であるドセタキセルが挙げられるが、これらに限定されない。
パクリタキセルは、(2R,3S)-N-ベンゾイル-3-フェニルイソセリンを伴う5β,20-エポキシ-1,2α,4,7β,10β,13α-ヘキサ-ヒドロキシタックス-11-エン-9-オン 4,10-ジアセテート 2-ベンゾエート 13-エステルであり、太平洋イチイ(Taxus brevifolia)から単離された天然ジテルペン製品で、注射液TAXOL(登録商標)として市販されている。テルペンの一種であるタキサン系に属する。これは、1971年にWaniらによって初めて単離されたものであり(Wani et al. J. Am. Chem, Soc., 93：2325. 1971)、化学的およびX線結晶構造解析法によりその構造が特定された。その活性についての1つのメカニズムは、パクリタキセルが、チューブリンと結合する能力に関連しており、結合により癌細胞の成長を阻害するものである(Schiff et al., Proc. Natl, Acad, Sci. USA, 77：1561-1565 (1980)； Schiff et al., Nature, 277：665-667 (1979)； Kumar, J. Biol, Chem, 256： 10435-10441 (1981))。いくつかのパクリタキセル誘導体の合成および抗癌活性の総説として、以下を参照されたい：D. G. I. Kingston et al., Studies in Organic Chemistry vol. 26, entitled "New trends in Natural Products Chemistry 1986", Attaur-Rahman, P.W. Le Quesne, Eds.(Elsevier, Amsterdam, 1986) pp 219-235。
パクリタキセルは、米国において難治性卵巣癌(Markman et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 64：583, 1991； McGuire et al., Ann. lntem, Med., 111：273,1989)および乳癌の治療(Holmes et al., J.J. Nat. Cancer Inst., 83：1797,1991)の治療における臨床使用が承認されている。皮膚における新生物(Einzig et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 20：46)および頭頸部癌(Forastire et al., Sem. Oncol., 20：56, 1990)の治療に対する有力な候補であると考えられている。この化合物は、多嚢胞性腎臓病(Woo et al., Nature, 368：750. 1994)、肺癌およびマラリアの治療に関する可能性も示している。パクリタキセルによる患者の治療により、閾値濃度(50nM)以上の服用期間(Kearns, C.M. et. al., Seminars in Oncology, 3(6) p.16-23, 1995)に関連した骨髄抑制(複数の細胞系列、Ignoff, R.J. et. al, Cancer Chemotherapy Pocket Guide, 1998)がおこる。
ドセタキセル、即ち、(2R,3S)-N-カルボキシ-3-フェニルイソセリン, N-tert-ブチルエステル,5β-20-エポキシ-1,2α,4,7β,10β,13α-ヘキサヒドロキシタックス-11-エン-9-オン 4-アセテート 2-ベンゾエート・3水和物は、注射液のTAXOTERE(登録商標)として市販されている。ドセタキセルは乳癌の治療に適応がある。ドセタキセルは、パクリタキセルq.v.の半合成誘導体であり、西洋イチイの葉から抽出された天然の前駆体である10-脱アセチル-バッカチンIIIを使用して製造されたものである。ドセタキセルの用量規定毒性は、好中球減少である。
ビンカアルカロイドは、シソ科の植物から得られる細胞期に特異的な抗悪性腫瘍剤である。ビンカアルカロイドは、チューブリンに特異的に結合することにより、細胞周期のM期(有糸***)に作用する。その結果、結合したチューブリン分子は、微小管に重合することができなくなる。有糸***は、中期で停止し、その後細胞死が起こると考えられる。ビンカアルカロイドの例として、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ビンブラスチン、即ち、硫酸ビンカロイコブラスチンは、注射液のVELBAN(登録商標)として市販されている。様々な固体腫瘍の二次治療として適応症があり、主に、精巣癌および様々なリンパ腫(例えば、ホジキン病、リンパ球性リンパ腫および組織球性リンパ腫)の治療に適応がある。骨髄抑制は、ビンブラスチンの服用制限のある副作用である。
ビンクリスチン、即ち、ビンカロイコブラスチンである22-オキソ-硫酸塩は、注射用液のONCOVIN(登録商標)として市販されている。ビンクリスチンは、急性白血病の治療に適応があり、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の治療レジメンにも使用されている。最も一般的なビンクリスチンの副作用は、脱毛および神経症状であって、骨髄抑制および胃腸粘膜炎は、余り多くない。
ビノレルビン、即ち3',4'-ジデヒドロ-4’-デオキシ-C'-ノルビンカロイコブラスチン[R-(R*,R*)-2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(1：2)(塩)]、ビノレルビン酒石酸塩(NAVELBINE(登録商標))の注射用液として購入でき、半合成ビンカアルカロイドである。ビノレルビンは、様々な固形癌、特に非小細胞肺癌、進行乳癌およびホルモン抵抗性前立腺癌の治療において、単剤または別の化学療法剤(例えば、シスプラチン)との併用により適応を示す。骨髄抑制は、ビノレルビンの最も一般的な服用制限のある副作用である。
白金錯体は、DNAと相互作用する細胞期に非特異的な抗がん剤である。白金錯体は、腫瘍細胞に入り、水和し(aquation)、DNAと鎖内および鎖間架橋を形成し、腫瘍に生物学的な悪影響を及ぼす。白金錯体の例としては、シスプラチンおよびカルボプラチンが挙げられるが、これらに限定されない。
シスプラチン、即ち、cis-ジアンミン白金(II)ジクロリドは、注射用液のPLATINOL(登録商標)として市販されている。シスプラチンは、主に、転移性精巣癌、卵巣癌および進行性膀胱癌の治療に適応がある。シスプラチンの主な服用制限のある副作用は、腎毒性(水分補給および利尿によってコントロールされ得る)および聴神経障害である。
カルボプラチン、即ち、白金のジアミン(1,1-シクロブタンジカルボキシレート(2-)-O,O')は、注射液のPARAPLATIN(登録商標)として市販されている。カルボプラチンは、主に進行性卵巣癌の一次治療および二次治療に適応がある。骨髄抑制は、カルボプラチンの用量制限毒性である。
アルキル化剤は、細胞期に非特異的な抗癌剤であり、強力な求電子剤である。一般に、アルキル化剤は、DNA分子の求核性部位、例えば、リン酸、アミノ、スルフヒドリル、ヒドロキシル、カルボキシルおよびイミダゾール基などを介したアルキル化により、DNAと共有結合を形成する。このアルキル化により、核酸の機能が破壊され、細胞死へと至る。アルキル化剤の例としては、シクロホスファミド、メルファランおよびクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード；ブスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；カルムスチンなどのニトロソウレア；およびダカルバジンなどのトリアゼン系などが挙げられるが、これらに限定するものではない。
シクロホスファミド、即ち、2-［ビス(2-クロロエチル)アミノ]テトラヒドロ-2H-1,3,2-オキサザホスホリン 2-オキシド・一水和物は、CYTOXAN(登録商標)として注射用液または錠剤で市販されている。シクロホスファミドは、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫および白血病の治療において単剤または別の化学療法剤との併用にて使用される。脱毛症、嘔吐および白血球減少は、シクロホスファミドの最も一般的な服用制限のある副作用である。
メルファラン、即ち、4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]-L-フェニルアラニンは、ALKERAN(登録商標)として注射液または錠剤で市販されている。メルファランは、多発性骨髄腫および切除不能な卵巣の上皮癌の緩和治療に適応がある。骨髄抑制は、メルファランの最も一般的な服用制限のある副作用である。
クロラムブシル、即ち、4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]ベンゼンブタン酸は、ロイケラン錠(LEUKERAN(登録商標))として市販されている。クロラムブシルは、慢性リンパ性白血病および悪性リンパ腫、例えばリンパ肉腫、巨大濾胞性リンパ腫およびホジキン病の緩和治療に適応がある。骨髄抑制は、クロラムブシルの最も一般的な服用制限のある副作用である。
ブスルファン、即ち、1,4-ブタンジオールジメタンスルホン酸塩は、マイラン錠剤(MYLERAN(登録商標))として市販されている。ブスルファンは、慢性骨髄性白血病の緩和治療に適応がある。骨髄抑制は、ブスルファンの最も一般的な服用制限のある副作用である。
カルムスチン、即ち、1,3-［ビス(2-クロロエチル)-1-ニトロソウレアは、BiCNU(登録商標)として凍結乾燥物の単回バイアルとして市販されている。カルムスチンは、単剤または他剤との併用により、脳腫瘍、多発性骨髄腫、ホジキン病および非ホジキンリンパ腫のための緩和治療に適応がある。遅発性の骨髄抑制は、カルムスチンの最も一般的な服用制限のある副作用である。
ダカルバジン、即ち、5-(3,3-ジメチル-1-トリアゼノ)-イミダゾール-4-カルボキサミドは、DTIC-Dome(登録商標)として単回バイアルで市販されているものである。ダカルバジンは、転移性悪性黒色腫の治療に適応があり、またホジキン病の2次治療のための別の薬剤との併用においても適応がある。吐き気、嘔吐および食欲不振は、ダカルバジンの最も一般的な服用制限のある副作用である。
抗腫瘍抗生物質は、細胞期に非特異的な薬剤であって、この薬剤がDNAと結合するか、またはDNAに入り込む。通常、このような作用により、安定したDNA複合体または鎖の切断が起こり、核酸の通常の機能が阻害され、細胞死へと至る。抗腫瘍抗生物質の例としては、ダクチノマイシンなどのアクチノマイシン類、ダウノルビシンおよびドキソルビシンなどのアンスロサイクリン類；およびブレオマイシン類などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ダクチノマイシンは、アクチノマイシンDとしても知られており、COSMEGEN(登録商標)として注射剤の形態で市販されている。ダクチノマイシンは、ウィルム腫瘍および横紋筋肉腫の治療に適応がある。吐き気、嘔吐および食欲不振は、ダクチノマイシンの最も一般的な服用制限のある副作用である。
ダウノルビシン、即ち、(8S-cis-)-8-アセチル-10-[(3-アミノ-2,3,6-トリデオキシ-α-L-リキソ-ヘキソピラノシル)オキシ]-7,8,9,10-テトラヒドロ-6,8,11-トリヒドロキシ-1-メトキシ-5,12ナフタセンジオン塩酸塩は、DAUNOXOME(登録商標)としてポゾーム注射剤で、またはCERUBIDINE(登録商標)として注射剤として市販されている。ダウノルビシンは、急性非リンパ球性白血病および進行性のHIV関連カポジ肉腫の治療における寛解導入に適応がある。骨髄抑制は、ダウノルビシンの最も一般的な服用制限のある副作用である。
ドキソルビシン、即ち、(8S,10S)-10-[(3-アミノ-2,3,6-トリデオキシ-α-L-リキソ-ヘキソピラノシル)オキシ]-8-グリコロイル,7,8,9,10-テトラヒドロ-6,8,11-トリヒドロキシ-1-メトキシ-5,12ナフタセンジオン塩酸塩は、RUBEX(登録商標)またはADRIAMYCIN RDF(登録商標)として注射剤で市販されている。ドキソルビシンは、主に急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄芽球性白血病の治療に適応があるが、一部の固形癌およびリンパ腫の治療にも有用な成分である。骨髄抑制は、ドキソルビシンの最も一般的な服用制限のある副作用である。
ブレオマイシンは、Streptomyces verticillus株から単離された細胞毒性グリコペプチド系抗生物質の混合物であって、BLENOXANE(登録商標)として市販されている。ブレオマイシンは、扁平上皮癌、リンパ腫および精巣がんの単剤または他剤併用による緩和治療薬として適応がある。肺毒性および皮膚毒性は、ブレオマイシンの最も一般的な服用制限のある副作用である。
トポイソメラーゼII阻害剤には、エピポドフィロトキシン類が含まれるが、これらに限定されない。
エピポドフィロトキシンは、マンドレイク植物に由来する細胞期に特異的な抗新生物剤である。エピポドフィロトキシンは、通常、トポイソメラーゼIIおよびDNAと共に3成分複合体を形成して、DNA鎖を切断するこより、細胞周期のS期およびG2期の細胞に影響を及ぼす。鎖切断の蓄積により、細胞死に至る。エピポドフィロトキシンの例としては、エトポシドおよびテニポシドが挙げられるが、これらに限定されない。
エトポシド、即ち、4'-脱メチル-エピポドフィロトキシン9[4,6-0-(R)-テニリデン-β-D-グルコピラノシド]は、注射液またはカプセルでVePESID(登録商標)として市販されており、一般的にはVP-16として知られている。単剤または別の化学療法剤との併用にて精巣癌および非小細胞肺癌の治療に適応がある。骨髄抑制は、エトポシドの最も一般的な副作用である。白血球低下の事象は、血小板の低下よりも重篤になる傾向がある。
テニポシド、即ち、4'-脱メチル-エピポドフィロトキシン9[4,6-0-(R)-テニリデン-D-グルコピラノシド]は、注射用液でVUMON(登録商標)として市販されており、一般にはVM-26と言われている。テニポシドは、単剤または別の化学療法剤との併用にて小児の急性白血病の治療に適応がある。骨髄抑制は、テニポシドの最も一般的な服用制限のある副作用である。テニポシドは、白血球減少および血小板減少の両方を誘発する可能性がある。
抗腫瘍代謝拮抗剤は、DNA合成を阻害するか、またはプリンまたはピリミジン塩基の合成を阻害して、DNA合成を制限することにより、細胞周期のS期(DNA合成)に作用する細胞期に特異的な抗腫瘍剤である。その結果、S期が進行せずに、細胞死へと至る。抗腫瘍代謝拮抗剤の例としては、フルオロウラシル、メトトレキサート、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニンおよびゲムシタビンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
5-フルオロウラシル、5-フルオロ-2,4-(1H,3H)ピリミジンジオンは、フルオロウラシルとして市販されている。5-フルオロウラシルの投与により、チミジル酸合成が阻害され、またRNAおよびDNAの両方に取り込まれる。その結果、通常、細胞死が起こる。5-フルオロウラシルは、乳癌、結腸癌、直腸癌、胃癌および膵臓癌の治療において、単剤または別の化学療法剤と併用して使用される。骨髄抑制および粘膜炎は、5-フルオロウラシルの服用制限のある副作用である。別のフルオロピリミジン類似体には、5-フルオロデオキシウリジン(フロクスウリジン)および5-フルオロデオキシウリジン一リン酸塩が挙げられる。
シタラビン、即ち、4-アミノ-1-β-D-アラビノフラノシル-2(1H)-ピリミジノンは、CYTOSAR-U(登録商標)として市販されており、一般に、Ara-Cとして知られている。シタラビンは、合成中のDNA鎖にシタラビンの末端が組み込まれることにより、DNA鎖の伸長を阻害することにより、S期で細胞期特異性を示すと考えられている。シタラビンは、急性白血病の治療において、単剤または他の化学療法剤との併用にて適応がある。その他のシチジン類縁体には、5-アザシチジンおよび2',2'-ジフルオロデオキシシチジン(ゲムシタビン)が挙げられる。シタラビンは、白血球減少、血小板減少および粘膜炎を誘発する。
メルカプトプリン、即ち、1,7-ジヒドロ-6H-プリン-6-チオン・一水和物は、PURINETHOL(登録商標)として市販されている。メルカプトプリンは、まだ特定されていないメカニズムでDNA合成を阻害することにより、S期において細胞期特異性を示す。メルカプトプリンは、急性白血病の治療において、単剤または他の化学療法剤と併用して使用される。骨髄抑制および胃腸粘膜炎は、メルカプトプリンを高用量で投与する際に予想される副作用である。メルカプトプリンの類似薬としてアザチオプリンが有用である。
チオグアニン、即ち、2-アミノ-1,7-ジヒドロ-6H-プリン-6-チオンは、TABLOID(登録商標)として市販されている。チオグアニンは、まだ特定されていないメカニズムでDNA合成を阻害することにより、S期において細胞期特異性を示す。チオグアニンは、急性白血病の治療において、単剤または他の化学療法剤と併用して使用される。骨髄抑制(例えば、白血球減少、血小板減少および貧血)は、チオグアニン投与による最も一般的な服用制限のある副作用である。しかし、胃腸の副作用も起こり、投与量が制限される場合がある。その他のプリン体類似体には、ペントスタチン、エリスロヒドロキシノニルアデニン、リン酸フルダラビンおよびクラドリビンが含まれる。
ゲムシタビン、即ち、2'-デオキシ-2',2'-ジフルオロシチジンモノヒドロクロリド(β-アイソマー)は、GEMZAR(登録商標)として市販されている。ゲムシタビンは、S期およびG1/S境界を通過する細胞の成長を阻害することにより、細胞期特異性を示す。ゲムシタビンは、局所進行性の非小細胞肺癌の治療においてシスプラチンと併用するか、また局所進行性の膵臓癌の治療において単独で適応を示す。骨髄抑制(例えば、白血球減少、血小板減少および貧血)は、ゲムシタビン投与による最も一般的な服用制限のある副作用である。
メトトレキサート、即ち、N-[4[(2,4-ジアミノ-6-プテリジニル)メチル]メチルアミノ]ベンゾイル]-L-グルタミン酸は、メトトレキサートナトリウムとして市販されている。メトトレキサートは、プリンヌクレオチドおよびチミジレートの合成に必要なジヒドロ葉酸還元酵素の阻害を介してDNAの合成、修復および／または複製を阻害することにより、特にS期の細胞期へ影響を及ぼす。メトトレキサートは、絨毛癌、髄膜白血病、非ホジキンリンパ腫の治療、ならびに乳癌、頭頸部癌、卵巣癌および膀胱癌の治療において、単剤または他の化学療法剤との併用で適応が有る。骨髄抑制(例えば、白血球減少、血小板減少および貧血)および粘膜炎は、メトトレキサート投与により予想される副作用である。
カンプトテシンおよびカンプトテシン誘導体を含むカンプトテシン類は、トポイソメラーゼI阻害剤として入手可能であるか、または開発中である。カンプトテシンの細胞傷害活性は、そのトポイソメラーゼI阻害活性に関連していると考えられる。カンプトテシンの例としては、イリノテカン、トポテカンおよび以下に記載する7-(4-メチルピペラジノメチレン)-10,11-エチレンジオキシ-20-カンプトテシンの種々の光学異性体が挙げられるが、それらに限定されない。
イリノテカン塩酸塩、即ち、(4S)-4,11-ジエチル-4-ヒドロキシ-9-［(4-ピペリジノピペリジノ)カルボニルオキシ]-1H-ピラノ[3',4',6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-3,14(4H,12H)ジオン塩酸塩は、注射用液のCAMPTOSAR(登録商標)として市販されている。
イリノテカンは、カンプトテシンの誘導体で、活性代謝体であるSN-38とともにトポイソメラーゼI-DNA複合体と結合する。トポイソメラーゼＩ：DNA：イリノテカンまたはSN-38の三成分複合体と複製酵素との相互作用によって引き起こされる修復不可能な二本鎖切断の結果として、細胞毒性が生じると考えられている。イリノテカンは、結腸または直腸の転移性癌の治療に適応がある。イリノテカン塩酸塩の服用制限のある副作用は、骨髄抑制(好中球減少を含む)および消化器系作用(下痢を含む)である。
トポテカン塩酸塩、(S)-10-[(ジメチルアミノ)メチル]-4-エチル-4,9-ジヒドロキシ-1H-ピラノ[3',4',6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-3,14-(4H,12H)ジオン一塩酸塩は、注射用液のHYCAMTIN(登録商標)として市販されている。トポテカンは、カンプトテシン誘導体であって、トポイソメラーゼI-DNA複合体に結合し、DNA分子のねじれひずみに応答して、トポイソメラーゼIにより引き起こされる一本鎖切断体の再結合を阻害する。トポテカンは、転移性卵巣癌および小細胞肺癌の二次治療薬として適応を示す。トポテカンHClの服用制限のある副作用は、骨髄抑制(主に、好中球減少)である。
リツキシマブは、キメラ型モノクローナル抗体で、RITUXAN(登録商標)およびMABTHERA(登録商標)として販売されている。リツキシマブは、B細胞上のCD20に結合し、細胞のアポトーシスを引き起こす。リツキシマブは、静脈内投与され、関節リウマチおよびB細胞性非ホジキンリンパ腫の治療のために承認されている。
オファツムマブ(Ofatumumab)は、ARZERRA(登録商標)として販売されている完全ヒトモノクローナル抗体である。オファツムマブは、B細胞のCD20に結合し、フルダラビン(フルダラ：Fludara)およびアレムツズマブ(キャンパス：Campath)を用いた治療に抵抗性を示す成人の慢性リンパ性白血病(CLL；白血球の癌の一種)の治療に使用されている。
トラスツズマブ(HEREPTIN(登録商標))は、HER2受容体に結合するヒト化モノクローナル抗体である。元々の適応症は、HER2陽性の乳癌である。
セツキシマブ(ERBITUX(登録商標))は、上皮成長因子受容体(EGFR)を阻害するキメラマウスヒト抗体である。
mTOR阻害剤には、ラパマイシン(FK506)およびラパログ、RAD001またはエベロリムス(Afinitor)、CCI-779またはテムシロリムス、AP23573、AZD8055、WYE-354、WYE-600、WYE-687ならびにPp121などが挙げられるが、これらに限定するものではない。
ベキサロテン(Bexarotene)は、Targretin(登録商標)として販売されており、レチノイドX受容体(RXR)を選択的に活性化するレチノイドのメンバーである。これらのレチノイド受容体は、レチノイン酸受容体(RAR)とは異なる生物学的活性を有している。化合物名は、4-[1-(5,6,7,8-テトラヒドロ-3,5,8,8-ペンタメチル-2-ナフタレニル)エテニル]安息香酸であり、ベキサロテンは、少なくとも一つの別の薬剤による治療が成功しなかった人の皮膚T細胞リンパ腫CTCL(皮膚がんの一種)の治療に使用されている。
Nexavar(登録商標)として販売されているソラフェニブは、マルチキナーゼ阻害剤と呼ばれる薬剤の一種である。化合物名は、4-[4-[4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル]カルバモイルアミノ]フェノキシ]-N-メチル-ピリジン-2-カルボキサミドである。ソラフェニブは、進行した腎細胞癌(腎臓における癌の一種)の治療に使用される。また、ソラフェニブは、切除不能な肝細胞癌(手術で治療できないタイプの肝臓癌)の治療にも使用される。
erbB阻害剤の例としては、ラパチニブ、エルロチニブおよびゲフィチニブが挙げられる。ラパチニブ、即ち、N-(3-クロロ-4-{[(3-フルオロフェニル)メチル]オキシ}フェニル)-6-[5-({[2-(メチルスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-2-フラニル]-4-キナゾリンアミン(例示として、式IIで表される)は、強力な経口用の低分子のerbB-1およびerbB-2(EGFRおよびHER2)チロシンキナーゼ二重阻害剤であって、HER2陽性の転移性乳癌の治療のために、カペシタビンとの併用にて承認されている。
Figure 2022539178000004
式(II)の化合物の遊離塩基のHCl塩およびジトシル酸塩は、1999年7月15日に公開されたWO99/35146および2002年1月10日に公開されたWO02/02552に開示された方法に従って製造することができる。
エルロチニブ、即ち、N-(3-エチニルフェニル)-6,7-ビス{[2-(メチルオキシ)エチル］オキシ}-4-キナゾリンアミンは、商品名タルセバとして市販されており、下記に示した通り、式III：
Figure 2022539178000005
 により表わされる。
エルロチニブの遊離塩基およびHCl塩は、例えば、米国第5,747,498号の実施例20に従って製造することができる。
ゲフィチニブ、即ち、4-キナゾリンアミン、N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-7-メトキシ-6-[3-4-モルホリン)プロポキシ]は、下記に示した通り、式IV：
Figure 2022539178000006
 により表される。
IRESSA(登録商標)(Astra-Zenenca)の商品名で市販されているゲフィチニブは、erbB-1阻害剤であって、白金系化学療法およびドセタキセル系化学療法の両方に失敗した後の局所進行性または転移性非小細胞肺癌患者の治療に単独療法として適応がある。ゲフィチニブの遊離塩基のHCl塩およびジHCl二塩は、1996年4月23日に出願され、1996年10月31日にWO 96／33980として公開された国際特許出願番号PCT／GB96／00961の方法に従って製造することができる。
また、現在開発中の下記式A：
Figure 2022539178000007
 のカンプトテシン誘導体は、そのラセミ混合物(R,S)の形態ならびにRおよびSエナンチオマーを含め、興味深い化合物であり、化合物名「7-(4-メチルピペラジノメチレン)-10,11-エチレンジオキシ-20(R,S)-カンプトテシン(ラセミ混合物)」または「7-(4-メチルピペラジノメチレン)-10,11-エチレンジオキシ-20(R)-カンプトテシン(Rエナンチオマー)または「7-(4-メチルピペラジノメチレン)-10,11-エチレンジオキシ-20(S)-カンプトテシン(Sエナンチオマー)」により知られている。このような化合物および関連化合物が、米国特許第6,063,923号；第5,342,947号；第5,559,235号；第5,491,237号および1997年11月24日に出願した継続中の米国特許出願第08／977,217号における製造方法と共に記載されている。
ホルモンおよびホルモン類似体は、ホルモン(複数可)と、癌の成長および／または不成長との間に関係がある癌を治療するのに有用な化合物である。癌治療に有用なホルモンおよびホルモン類似体の例としては、小児の悪性リンパ腫および急性白血病の治療に有用な副腎皮質IL1RAPステロイド、例えば、プレドニゾンおよびプレドニゾロン；副腎皮質癌およびエストロゲン受容体を含むホルモン依存性乳癌の治療に有用なアミノグルテチミドおよびその他のアロマターゼ阻害剤(例えば、アナストロゾール、レトラゾール、ボラゾールおよびエキセメスタン)；プロゲストリン、例えば、ホルモン依存性乳癌および子宮内膜癌の治療に有用な酢酸メゲストロール；前立腺癌および前立腺肥大症の治療に有用なエストロゲン、アンドロゲンおよび抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロンおよび5-還元剤(例えば、フィナステリドおよびデュタステリド)；ホルモン依存性乳癌およびその他の感受性癌の治療に有用な抗エストロゲン(例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロキシフェン、ヨードキシフェン)および選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERMS)、例えば米国特許第5,681,835号および6,207,716号に記載の化合物；ならびに前立腺癌の治療のための、ロイチン化ホルモン(LH)および／または卵胞刺激ホルモン(FSH)の放出を刺激するゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)およびその類似体、例えば、酢酸ゴセレリンおよびルプロリドなどのLHRHアゴニストおよびアンタゴニストが挙げられるが、これらに限定するものではない。
シグナル伝達経路阻害剤とは、細胞内変化を引き起こす化学的プロセスを遮断または阻害する阻害剤である。本明細書で使用する場合、この変化とは、細胞増殖または分化である。本発明で有用なシグナル伝達阻害剤には、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、SH2／SH3ドメインブロッカー、セリン／スレオニンキナーゼ、ホスホチジルイノシトール-3キナーゼ、マイオイノシトールのシグナル伝達およびRas癌遺伝子の阻害剤を含む。
いくつかのタンパク質チロシンキナーゼは、細胞増殖の制御に関与する様々なタンパク質中の特定のチロシン残基のリン酸化を触媒している。このようなプロテインチロシンキナーゼは、受容体キナーゼと非受容体キナーゼに大別される。
受容体チロシンキナーゼは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびチロシンキナーゼドメインを持つ膜貫通タンパク質である。受容体チロシンキナーゼは、細胞増殖の制御に関与しており、一般に成長因子受容体と呼ばれている。これらのキナーゼの多くの不適切な活性化、例えば過剰発現または変異による不適切な活性化、即ち異常なキナーゼ成長因子受容体活性は、無制御の細胞増殖をもたらすことが判っている。従って、このようなキナーゼの異常活性は、悪性組織増殖に関連している。従って、かかるキナーゼの阻害剤は、癌の治療法を提供できる。成長因子受容体としては、例えば、上皮成長因子受容体(EGFr)、血小板由来成長因子受容体(PDGFr)、erbB2、erbB4、血管内皮成長因子受容体(VEGFr)、免疫グロブリン様ドメインおよび上皮成長因子ホモロジードメインを有するチロシンキナーゼ(TIE-2)、インスリン成長因子I(IGFI)受容体、マクロファージコロニー刺激因子Cfms)、BTK、ckit、cmet、線維芽細胞成長因子(FGF)受容体、Trk受容体(TrkA、TrkBおよびTrkC)、エフリン(eph)受容体およびRETプロトオンコジーンが挙げられるが、これに限定するものではない。いくつかの成長受容体阻害剤は開発中であり、リガンドアンタゴニスト、抗体、チロシンキナーゼ阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドなどがが挙げられる。成長因子受容体および成長因子受容体機能を阻害する薬剤は、例えば、Kath, John C., Exp. Opin. Ther．Patents (2000) 10(6)：803-818； Shawver et al, DDT Vol 2, No.2 February 1997；およびLofts, F. J. et al, "Growth factor receptors as targets", New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy, ed. (2000) 10(6)：803-818, Shawver, et al, DDT Vol 2, No.2 February 1997；および Lofts, F. J. et al, "Growth factor receptors as targets", Inc. Workman, Paul and Kerr, David, CRC press 1994, Londonに記述されている。
成長因子受容体キナーゼではないチロシンキナーゼは、非受容体チロシンキナーゼと呼ばれる。本発明において有用な、抗癌剤の標的であるか、または標的となり得る非受容体チロシンキナーゼとしては、cSrc、Lck、Fyn、Yes、Jak、cAbl、FAK(Focal adhesion kinase)、ブルトン型チロシンキナーゼ、Bcr-Ablなどが挙げられる。このような非受容体キナーゼおよび非受容体チロシンキナーゼ機能を阻害する薬剤は、Sinh, S. and Corey, S.J., (1999) Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research 8 (5)： 465-80； and Bolen, J.B., Brugge, J.S.,(1997) Annual review of Immunology. 15： 371-404に記載されている。
SH2/SH3ドメインブロッカーは、PI3-K p85サブユニット、Srcファミリーキナーゼ、アダプター分子(Shc、Crk、Nck、Grb2)およびRas-GAPなどの様々な酵素またはアダプタータンパク質におけるSH2またはSH3ドメイン結合を阻害する薬剤である。抗癌剤の標的としてのSH2/SH3ドメインは、Smithgall, T.E. (1995), Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 34(3) 125-32において議論されている。
セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤は、Rafキナーゼ(rafk)、マイトジェンまたは細胞外調節キナーゼ(MEKs)および細胞外調節キナーゼ(ERKs)の阻害剤を含むMAPキナーゼカスケードブロッカー；およびPKCs(α、β、γ、ε、μ、λ、ι、ζ)遮断剤を含むプロテインキナーゼCファミリーメンバー阻害剤などが挙げられる。IkBキナーゼファミリー(IKKa、IKKb)、PKBファミリーキナーゼ、AKTキナーゼファミリーメンバーおよびTGFβ受容体キナーゼが挙げられる。このようなセリン／スレオニンキナーゼおよびその阻害剤は、Yamamoto, T., Taya, S., Kaibuchi, K., (1999), Journal of Biochemistry. 126 (5) 799-803； Brodt, P, Samani, A., and Navab, R.(2000), Biochemical Pharmacology, 60. 1101-1107； Massague, J., Weis-Garcia, F.(1996) Cancer Surveys. 27：41-64； Philip, P.A., and Harris, A.L. (1995), Cancer Treatment and Research. 78： 3-27, Lackey, K. et al Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, (10), 2000, 223-226； U.S. Patent No. 6,268,391；および Martinez-Iacaci, L., et al, Int. J. Cancer (2000), 88(1), 44-52に記載されている。
PI3-キナーゼ、ATM、DNA-PKおよびKuの阻害剤を含むホスファチジルイノシトール-3 キナーゼファミリーの阻害剤も、本発明において有用である。そのようなキナーゼは、Abraham, R.T. (1996), Current Opinion in Immunology 8 (3) 412-8； Canman, C.E., Lim, D.S. (1998), Oncogene 17 (25) 3301-3308； Jackson, S.P. (1997), International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 9 (7)：935-8； およびZhong, H. et al, Cancer res, (2000) 60(6), 1541-1545において議論されている。
また本発明では、ミオイノシトールシグナル伝達阻害剤、例えば、ホスホリパーゼC阻害剤およびミオイノシトール類似体なども有用である。このようなシグナル伝達阻害剤は、Powis, G., and Kozikowski A., (1994 New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy ed., Paul Workman and David Kerr, CRC press 1994, London.に記載されている。
シグナル伝達経路の阻害剤の別のグループは、Ras癌遺伝子阻害剤である。このような阻害剤には、ファルネシルトランスフェラーゼ、ゲラニル-ゲラニルトランスフェラーゼおよびCAAXプロテアーゼの阻害剤、ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムおよび免疫療法剤が挙げられる。このような阻害剤は、野生型変異体rasを含む細胞のras活性化を阻害し、それによって抗増殖剤として作用することが示されている。Ras癌遺伝子阻害については、Scharovsky, O.G., Rozados, V.R., Gervasoni, S.I. Matar, P. (2000), Journal of Biomedical Science. 7(4 292-8)； Ashby, M.N. (1998), Current Opinion in Lipidology. 9 (2) 99-102； およびBennett, C.F. and Cowsert, L.M. BioChim. Biophys. Acta, (1999) 1489(1)：19-30に記載されている。
上記のように、受容体キナーゼリガンド結合に対する抗体アンタゴニストは、シグナル伝達阻害剤としても機能し得る。このシグナル伝達経路阻害剤のグループには、受容体チロシンキナーゼの細胞外リガンド結合ドメインに対するヒト化抗体の使用が含まれる。例えば、Imclone C225 EGFRの特異的抗体(Green, M.C. et al, Monoclonal Antibody Therapy for Solid Tumors, Cancer Treat. Rev., (2000), 26(4, 269-286を参照されたい)；Herceptin(登録商標) erbB2抗体(Tyrosine Kinase Signalling in Breast cancer：erbB Family Receptor Tyrosine Kniases, Breast cancer Res. 2000, 2(3), 176-183を参照されたい)；および2CB VEGFR2特異的抗体(Brekken, R.A. et al, Selective Inhibition of VEGFR2 Activity by a monoclonal Anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice, Cancer Res. (2000) 60, 5117-5124を参照されたい)である。
非受容体キナーゼの血管新生阻害剤もまた、本発明における用途を見出すことができる。血管新生に関連するVEGFRおよびTIE2の阻害剤は、シグナル伝達阻害剤(両受容体は受容体チロシンキナーゼである)に関して、上記で議論されている。erbB2およびEGFRの阻害剤は、血管新生、主にVEGFの発現を阻害することが示されているので、一般的に、血管新生はerbB2／EGFRシグナル伝達に関連がある。従って、EGFR/erbB2阻害剤と血管新生阻害剤との組み合わせは、理に叶っている。従って、非受容体チロシンキナーゼ阻害剤を、本発明のEGFR／erbB2阻害剤と組み合わせて使用してもよい。例えば、VEGFR(受容体チロシンキナーゼ)を認識しないが、リガンドに結合する抗VEGF抗体；血管新生を阻害するインテグリン(αv、β3)の低分子阻害剤；エンドスタチンおよびアンジオスタチン(非RTK)も、開示したerbファミリー阻害剤と組み合わせた有用性が証明され得る(Bruns CJ et al.(2000), Cancer Res., 60：2926-2935；Schreiber AB, Winkler MEおよびDerynck R. (1986), Science, 232： 1250-1253；Yen et al.(2000), Oncogene 19： 3460-3469を参照されたい)。
免疫療法レジメンで使用される薬剤も、式(I)の化合物と組み合わせて有用であり得る。erbB2またはEGFRに対する免疫応答を生じさせるための多くの免疫学的戦略が存在する。これらの戦略は、一般に、腫瘍ワクチン接種の領域である。免疫学的アプローチの有効性は、低分子阻害剤を用いたerbB2／EGFRシグナル伝達経路の複合的阻害によって大幅に増強される可能性がある。erbB2／EGFRに対する免疫学的／腫瘍ワクチンアプローチの議論は、Reilly RT et al.(2000), Cancer Res.60：3569-3576；およびChen Y, Hu D, Eling DJ, Robbins J, およびKipps TJ (1998), Cancer Res. 58： 1965-1971に見い出だされる。
プロアポトーシスレジメンに使用される薬剤(例えば、bcl-2アンチセンスオリゴヌクレオチド)もまた、本発明の組み合わせにおいて使用することができる。タンパク質のBcl-2ファミリーのメンバーは、アポトーシスを阻害する。従って、bcl-2のアップレギュレーションは、化学療法の抵抗性に関連している。研究により、上皮成長因子(EGF)が、bcl-2ファミリーの抗アポトーシスメンバー(即ち、mcl-1)を刺激することが実証された。そこで、腫瘍におけるbcl-2の発現をダウンレギュレートするように設計された戦略により、即ちGenta's G3139 bcl-2アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床効果が実証され、現在、フェーズII/IIIの治験中である。bcl-2に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド戦略を用いたこのようなアポトーシス促進戦略は、Water JS et al.(2000), J. Clin. Oncol. 18： 1812-1823；およびKitada S et al.(1994, Antisense Res. Dev. 4： 71-79)において議論されている。
トラスツズマブ(HEREPTIN(登録商標))は、HER2受容体に結合するヒト化モノクローナル抗体である。本来の適応症は、HER2陽性乳癌である。
トラスツズマブエムタンシン(商品名：Kadcyla, カドサイラ)は、モノクローナル抗体トラスツズマブ(ハーセプチン)と細胞障害性毒性薬剤のメルタンシン(DM1)を結合させた抗体薬物複合体である。トラスツズマブ単独では、HER2/neu受容体に結合してがん細胞の増殖を止めるが、メルタンシンは細胞に入り込んで、チューブリンに結合して破壊する。モノクローナル抗体はHER2を標的としており、HER2はがん細胞でのみ過剰発現しているため、コンジュゲートは、毒素を腫瘍細胞に特異的に送達する。このコンジュゲートは、T-DM1と略される。
セツキシマブ(ERBITUX(登録商標))は、上皮成長因子受容体(EGFR)を阻害するキメラ型マウスヒト抗体である。
ペルツズマブ(別名2C4、商品名：Omnitarg)は、モノクローナル抗体である。「HER二量体化阻害剤」と呼ばれる薬剤群の中で、この分類の最初の薬剤である。HER2に結合することにより、HER2と別のHER受容体の二量体化を阻害し、その結果、腫瘍の成長を遅らせると仮定されている。ペルツズマブについては、2001年1月4日公開のWO01/00245に記載されている。
リツキシマブは、RITUXAN(登録商標)およびMABTHERA(登録商標)として販売されているキメラ型モノクローナル抗体である。リツキシマブは、B細胞上のCD20に結合し、細胞のアポトーシスを引き起こす。リツキシマブは静脈内投与されるもので、関節リウマチおよびB細胞性非ホジキンリンパ腫の治療薬として承認されている。
オファツムマブは、ARZERRA(登録商標)として販売されている完全ヒトモノクローナル抗体である。オファツムマブは、B細胞上のCD20に結合し、フルダラビン(フルダラ)およびアレムツズマブ(キャンパス)による治療に抵抗性を示す成人の慢性リンパ性白血病(CLL：白血球のがんの一種)の治療に使用されている。
細胞周期シグナル伝達阻害剤は、細胞周期の制御に関与する分子を阻害する。サイクリン依存性キナーゼ(CDK)と呼ばれるタンパク質キナーゼファミリーと、サイクリンと呼ばれるタンパク質ファミリーとの相互作用により、真核生物の細胞周期の進展が制御される。細胞周期の正常な進展には、様々なサイクリン/CDK複合体の協調的な活性化および不活性化が必要である。細胞周期シグナル伝達の阻害剤は、現在開発中である。例えば、CDK2、CDK4およびCDK6を含むサイクリン依存性キナーゼの例示およびそれに対する阻害剤は、例えば、Rosania et al, Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(2)：215-230に記載されている。
本明細書で使用される「免疫調節剤」は、免疫系に作用するモノクローナル抗体を含む任意の物質を指す。本発明のIL1RAP結合タンパク質は、免疫調節物質とみなすことができる。免疫調節剤は、癌治療のための抗新生物剤として使用することができる。例えば、免疫調節剤には、イピリムマブ(YERVOY)などの抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体(オプジーボ：Opdivo／ニボルマブ：nivolumabおよびキイトルーダ：Keytruda／ペムブロリズマブ：pembrolizumab)などが挙げられるが、これらに限定するものではない。その他の免疫調節剤としては、OX-40抗体、PD-L1抗体、LAG3抗体、TIM-3抗体、41BB抗体およびGITR抗体などが挙げられるが、これらに限定するものではない。
ヤーボイ(イピリムマブ)は、ブリストル・マイヤーズ・スクイブ社により販売されている完全ヒトCTLA-4抗体である。イピリムマブのタンパク質構造および使用方法は、米国特許第6,984,720号および第7,605,238号に記載されている。
オプジーボ／ニボルマブは、ブリストル・マイヤーズ・スクイブ社により販売されている、免疫増強作用を有する負の免疫調節性ヒト細胞表面受容体PD-1(プログラム死-1：programmed death-1またはプログラム細胞死-1/PCD-1：programmed cell death-1／PCD-1)に対する完全ヒトモノクローナル抗体である。ニボルマブは、Igスーパーファミリー膜貫通タンパク質であるPD-1に結合し、そのリガンドであるPD-L1およびPD-L2による活性化を阻害することにより、T細胞の活性化および腫瘍細胞または病原体に対する細胞媒介性の免疫応答を提供する。活性化されたPD-1は、P13k/Akt経路の活性化を抑制することにより、T細胞の活性化およびエフェクター機能を負に制御する。ニボルマブに対する別の名称は、以下の通りである：BMS-936558、MDX-1106およびONO-4538。ニボルマブのアミノ酸配列、使用方法および製造方法は、米国特許第8,008,449号に開示されている。
キイトルーダ/ペムブロリズマブは、Merck社が肺癌の治療薬として販売している抗PD-1抗体である。ペムブロリズマブのアミノ酸配列および使用方法は、米国特許第8,168,757号明細書に開示されている。
CD134は、OX40としても知られ、TNFRスーパーファミリーの受容体メンバーであり、CD28とは異なり、休止期のナイーブT細胞に構成的に発現していない。OX40は、活性化後24～72時間後に発現する二次的な共刺激分子であり、そのリガンドであるOX40Lも、休止期の抗原提示細胞には発現しないが、活性化されると発現するようになる。OX40の発現は、T細胞の完全活性化に依存しており、CD28がない場合、OX40の発現は遅くなり、4倍低いレベルとなる。OX-40抗体、OX-40融合タンパク質およびそれらの使用方法は、米国特許番号：US 7,504,101； US 7,758,852； US 7,858,765； US 7,550,140； US 7,960,515； WO2012027328； WO2013028231に開示されている。
PD-L1(CD274またはB7-H1とも呼ばれる)に対する抗体および使用方法は、米国特許第7，943,743号；米国特許第8,383,796号；US20130034559、WO2014055897、米国特許第8,168，179号；および米国特許第7,595,048号に開示されている。PD-L1抗体は、癌の治療のための免疫調節剤として開発中である。
本明細書で使用される「免疫刺激剤」は、免疫系を刺激することができるあらゆる薬剤を示す。本明細書で使用される免疫刺激剤には、ワクチンアジュバントが含まれるが、これに限定されるものではない。
アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩(AGP)は、ワクチンアジュバントとして、ならびに免疫化した動物におけるサイトカイン産生を刺激するための免疫刺激剤として、マクロファージを活性化するための免疫刺激剤として、自然免疫反応を促進するための免疫刺激剤として、および抗体産生を増強するための免疫刺激剤として有用であることが知られている。アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩(AGPs)は、Toll様受容体4(TLR4)の合成リガンドである。AGPおよびTLR4を介したその免疫調節作用は、WO2006/016997、WO2001/090129および/または米国特許第6,113,918号などの特許公報に開示され、文献に報告されている。別のAGP誘導体は、米国特許第7,129,219号、米国特許第6,525,028号および米国特許第6,911,434号に開示されている。ある種のAGPは、TLR4のアゴニストとして作用し、その他のAGPはTLR4アンタゴニストとして認識される。
本発明で用いられるアミノアルキルグルコサミニドリン酸化合物は、以下の式1：
Figure 2022539178000008
 (式中、
mは、0～6であり；
nは、0～4であり；
Xは、OまたはS、好ましくはOであり；
Yは、OまたはNHであり；
Zは、OまたはHであり；
各R1、R2、R3は、C1-20アシルおよびC1-20アルキルからなる群から独立して選択され；
R4は、HまたはMeであり；
R5は、-H、-OH、-(Cl-C4)アルコキシ、-PO3R8R9、-OPO3R8R9、-SO3R8、-OSO3R8、-NR8R9、-SR8、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R8および-CONR8R9からなる群から独立して選択され、ここでR8およびR9は、Hおよび(Cl-C4)アルキルから各々独立して選択され；および
各R6およびR7は、独立して、HまたはPO3H2である)
で示される構造を有する。
式1aにおいて、通常の脂肪アシル残基(即ち、第二級アシルオキシまたはアルコキシ残基、例えば、R1O、R2OおよびR3O)が結合している3'立体中心の立体配置は、RまたはS、好ましくはRである(カーン・インゴルド・プレローグ優先規則により指定される)。R4およびR5が結合しているアグリコン立体中心の立体配置は、RまたはSであり得る。全ての立体異性体、エナンチオマーおよびジアステレオマーの両方、ならびにそれらの混合物は、本発明の範囲内であると考えられる。
ヘテロ原子Xからアグリコンの窒素原子の間の炭素原子の数は、変数「n」によって決定され、0～4の整数、好ましくは0～2の整数とすることができる。
正常な脂肪酸R1、R2およびR3の鎖長は、炭素数が約6～約16個、好ましくは炭素数が約9～約14個であり得る。鎖長は、同一であっても、異なっていてもよい。いくつかの好ましい実施形態は、R1、R2およびR3が、6、10、12または14個である鎖長を含む。
式1は、L／D-セリル、-スレオニル、-システイニルエーテルまたはエステル脂質AGP、アゴニストとアンタゴニストの両方およびその類似体(n=1～4)、ならびに様々なカルボン酸生物学的等価体(即ち、R5は、塩を形成することが可能な酸性基であり；リン酸は、グルコサミン単位の4-または6-位のいずれかであるが、好ましく4位である)等を包含する。
式1のAGP化合物を用いる本発明の好ましい実施形態において、nは0であり、R5はCO2Hであり、R6は、PO3H2であり、R7はHである。この好ましいAGP化合物は、以下の式1a：
Figure 2022539178000009
 (式中、Xは、OまたはSであり；Yは、OまたはNHであり；ZはOまたはHであり；各々R1、R2、R3は、C1-20アシルおよびC1-20アルキルからなる群より独立して選択され；R4は、Hまたはメチルである)
の構造として規定される。
式1aにおいて、通常の脂肪アシル残基(すなわち、第二級アシルオキシまたはアルコキシ残基、例えば、R1O、R2OおよびR3O)が結合している3'立体中心の立体配置は、RまたはS、好ましくはRである(カーン・インゴルド・プレローグ優先規則により指定される)。R4およびCO2Hが結合しているアグリコン立体中心の立体配置は、RまたはSであり得る。全ての立体異性体、エナンチオマーおよびジアステレオマーの両方、ならびにそれらの混合物は、本発明の範囲内であると考えられる。
式1aは、L／D-セリル、-スレオニル、-システイニルエーテルまたはエステル脂質AGP、アゴニストおよびアンタゴニストの両方を包含する。
式1および式1aの両方において、Zは、二重結合によって結合しているOであるか、または各々が単結合によって結合している2つの水素原子である。即ち、化合物は、Z=Y=Oである場合にエステル結合し；Z=OおよびY=NHである場合にアミド結合し；Z=H/HおよびY=Oである場合にエーテル結合している。
特に好ましい式1の化合物は、CRX-601およびCRX-527として示される。それらの構造は、以下の通りに示される：
Figure 2022539178000010
Figure 2022539178000011
 。
さらに、別の好ましい実施形態は、下記に示される構造：
Figure 2022539178000012
 を有するCRX-547が用られる。
さらなる別の形態には、AGP、例えばCRX 602またはCRX 526が挙げられ、これは、短い二級アシルまたはアルキル鎖を有するAGPに対する安定性の増強を提供する：
Figure 2022539178000013
 。
一実施形態では、治療を必要とする哺乳動物における癌を治療するための方法が提供され、この方法は、治療上有効量の、本発明のIL1RAP結合タンパク質、およびb)少なくとも1つの抗新生物剤を投与する工程を特徴とする。
一実施形態では、治療を必要とする哺乳動物における癌を治療するための方法が提供され、この方法は、治療上有効量の、本発明のIL1RAP結合タンパク質、およびb)少なくとも1つの第二の免疫調節剤を投与する工程を特徴とする。
一実施形態では、前記第二の免疫調節剤は、抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体、および抗41BB抗体、抗LAG3抗体および抗TIM3抗体の群から選択される。
一実施形態では、治療を必要とする哺乳動物における癌を治療するための方法が提供され、この方法は、前記哺乳動物に、治療上有効量の、本発明のIL1RAP結合タンパク質およびb)少なくとも1つの免疫刺激剤を投与する工程を特徴とする。
1．ビニング試験から得た競合データ(図4)
ビニングの結果：
精製した抗IL1RAP mAbsを、競合ELISA(「ビニング」)試験に供し、一対の抗体がヒトIL1RAPに同時に結合する能力を試験した。簡単に言うと、1つのmAb、その捕捉mAbを、ELISAプレート上にコートした後、第2の試験用mAbおよびビオチン化IL1RAPを加えた。インキュベーション後、捕捉mAbと結合したビオチン-IL1RAPのレベルを、ストレプトアビジン-HRPに基づく比色アッセイで定量し、450nmでの吸光度のレベルで測定した。試験用抗体が、IL1RAPの捕捉抗体への結合を阻害する場合、450nmの吸光度が低いレベルとなり、2つの抗体は同一または類似のエピトープに結合すると結論付けられ、それらは同一のエピトープ「ビン(bin)」内に存在すると言える。このアッセイに基づき、mAb001、mAb016、mAb048、mAb063、mAb067およびmAb117は、IL1RAPへの結合について互いに競合していたので、同一または類似のエピトープに結合すると考えられる。
ビニング法
精製した抗IL1RAP抗体を、384ウェルELISAプレート上にコートして、40μl/ウェルの希釈抗体(1μg/ml PBS)を4℃で一晩インキュベートした。その後、プレートをPBSTで洗い、40μlのブロッキング緩衝液(2％BSAを含むPBST)でブロッキングし、競合するIL1RAP抗体をELISAプレートに加えた。その後、ビオチン標識したヒトIL1RAP(ビオチン-hIL1RAP)の溶液を加えて、よく混合した。競合するIL1RAP抗体は、10または50μg/mlで使用し、ビオチン-HIL1RAPは、評価する特定のコーティングIL1RAP抗体のEC50またはEC80と同一またはそれに近い濃度で使用した。37℃で1時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、50μlのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ(洗浄緩衝液で1：5000)を、各ウェルに添加した。プレートを、室温で50分間インキュベートして、PBSTで洗浄した。50μlのTMB基質を、各ウェルに加え、室温で10分間インキュベートした。1N HCl(50μl)を加えて、反応を停止させた。450 nmの吸光度を、分光光度計マイクロプレートリーダーで測定した。試験抗体が捕捉抗体と競合してヒトIL1RAPに結合できる程度は、以下の式により算出された：
Figure 2022539178000014
 (式中、mIgGは、ヒトIL1RAPと結合しない陰性コントロールのマウスIgG分子である)。
Figure 2022539178000015
2．全てのbin 1のmAbs：mAb067、mAb001、mAb048、mAb117、mAb063のKD値(図5)
ヒトIL1RAPタンパク質に対するマウス抗ヒトIL1RAP mAbsの結合速度および親和性は、Biocore T200プラットフォームを用いた表面プラズモン共鳴技術によって決定された。Biacoreチップ表面に抗Fc IgG抗体を固定して、これを用いて、30μL/minの流速にて試験抗体を捕捉した。次いで、Hisタグ化したヒトIL-1RAP細胞外ドメインタンパク質の連続希釈物をチップ上に流して、3分間の結合フェーズ、その後に20～60分間の解離フェーズを行った。そのサイクルの間に、グリシンpH1.5を10μL/minの流速でチップ上に流して、Biacoreチップを120秒間で再生させた。結合定数(ka)、解離定数(kd)および結合親和性(KD)を、マルチプル・サイクル結合速度(Multiple cycle kinetics)アルゴリズムで決定した。
Figure 2022539178000016
3．ヒトIL1RAPに対するmAb067-12およびGSK3903371AのKD値
表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて、組換えヒトおよびカニクイザルIL1RAPとGSK3903371Aとの結合速度を確立させた。この標的は、インビボでは膜結合型(mIL1RAP)および選択的スプライシングによるmRNAの結果として形成される分泌型可溶性デコイ受容体(sIL1RAP)として観察される(Greenfeder 1995, Jensen 2000)。IL1RAPの排除型(shed form)は、LPS刺激マクロファージからも検出され得る(Eichelbaum 2014)。ヒトIL1RAPについては、組換え体の精製IL1RAPおよびIL1RAP細胞外ドメイン(ECD)について結合速度を得た。成熟細胞表面アイソフォーム(347個のアミノ酸)および可溶性IL1RAPアイソフォーム(336個のアミノ酸)の最初の330個のアミノ酸は同一である。カニクイザルIL1RAP(cyno IL1RAP)については、ECDについてしか結合速度が得られ無かった。
GSK3903371AのヒトおよびカニクイザルIL1RAPへの結合の代表的な速度を、以下の表 3.1に示す。37℃における、GSK3903371AのヒトIL1RAP ECDおよび可溶性ヒトIL1RAPに対する結合親和性(KD)は、各々2.54nMおよび3.58nMであった。カニクイザルIL1RAP ECDに対する親和性(幾何平均KD=3.47nM)は、事前に規定されたリード選択基準(ヒトIL1RAPのKDの10倍以内の適切な非ヒト霊長類オルソログのKD)を満たすものであった。
GSK3903371Aと、ヒトIL1RAP ECD、カニクイザルIL1RAP ECDおよびヒト可溶型IL1RAP(sIL1RAP)との結合速度
GSK3903371Aおよび関連の無い非フコシル化アイソタイプコントロール(EPO：fIX POTELLIGENT(登録商標))を、CM5センサーチップ上でプロテインAにより捕捉した。その後、ヒトおよびカニクイザルIL1RAP ECD、ヒト可溶型IL1RAPを、捕捉抗体上に流して、非avid標的化結合を繰り返した。データを、1：1のキネティックフィットモデルを用いて解析した。
Figure 2022539178000017
文献：
Greenfeder, S.A., et al., Molecular Cloning and Characterization of a Second Subunit of the Interleukin 1 Receptor Complex. Journal of Biological Chemistry, 1995. 270(23)： p. 13757-13765.
Jensen, L.E., et al., IL-1 signaling cascade in liver cells and the involvement of a soluble form of the IL-1 receptor accessory protein. J Immunol, 2000. 164(10)： p. 5277-86.
Eichelbaum, K. and J. Krijgsveld, Rapid Temporal Dynamics of Transcription, protein Synthesis, and Secretion during Macrophage Activation. Molecular & Cellular Proteomics, 2014. 13(3)： p. 792-810.
ヒトIL1RAPに対するmAb067-12(ヒト化)のKD
SPRによるヒト化抗体の結合親和性の決定(Biacore分析)
ヒト化mAb067-12のヒトIL1RAP細胞外ドメインタンパク質(GK002, HuIL1Racp-ECD-His6)およびカニクイザルIL1RAP(GK017, CynoIL1Racp-ECD-His6)への結合親和性を、以下の通りに測定した。Biacore T200(GE Healthcare)のフローセル内のセンサーチップCM5(GE Healthcare, BR-1005-30)と抗ヒトIgG Fcモノクローナル抗体を、Antibody Capture Kit(Genway, GWB-20A705)を用いて結合させた。抗ヒトFc mAbによる捕捉を容易にするためにmAb067-12を、フローセル上に流した。組換えヒトIL1RAP-ECD-His6タンパク質(GK002)またはカニクイザルIL1RAP-ECD-His6タンパク質(GK017)の連続希釈液を、捕捉ヒト化mAb上に流して、Biacore T200 evaluation software v1.0を用いてKD値を測定した。
Figure 2022539178000018
詳細な方法：
フローセルへの抗Fc抗体の固定化：
Series S CM5センサーチップのフローセルを、新たに調製した50 mmol/L NHSおよび200 mmol/L EDC緩衝液を用いて、10 μL/minの流速で活性化した。HBS-EP+(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% P20, pH 7.4)をランニングバッファーとして使用した。10 mM NaAc(pH4.5)で希釈した抗ヒトFc抗体を、10 μL/minで活性化したフローセルに注入した。残存する活性な結合部位を、1Mエタノールアミンを420秒間注入して、ブロッキングした。
ヒト化抗体のKD測定
フローセル1をリファレンスフローセルとして使用し、フローセル1には抗体を注入しなかった。試験抗体を、10μL/minの流速にてフローセル2、3および4のいずれか1つで捕捉した。その後、希釈したGK002またはGK017を、30μL/minの流速で180秒間、4つのフローセルに注入して、会合についてのデータを収集した。解離測定のために、緩衝液の流量を、30μL/minの流速で1200秒間維持した。解離測定の終了後、10μL/minの流速で60秒間10mM グリシン-HCl(pH1.5)を注入することにより、試験した抗体および抗原を表面から除去した。上記の工程を、連続希釈したHisタグ付きIL1RAP ECDタンパク質を各濃度について繰り返した。各抗体のKD値を、Biacore T200評価ソフトウェア1.0を用いて評価し、データを1：1結合モデルでフィットさせた。
4．mAb067-12を、ポテリジェント(Potelligent)の細胞株で発現させて、GSK3903371Aを産生させる
GSK3903371Aは、ヒトインターロイキン-1 受容体アクセサリータンパク質(IL1RAP)に対するヒト化モノクローナル抗体である。この機能分子としては、2本の軽鎖(κ)と2本の重鎖(IgG1)からなるジスルフィド結合したα2β2四量体である。この重鎖定常領域は、POTELLIGENT α-1,6-フコース転移酵素(FUT8)ノックアウトCHO細胞株(協和発酵キリングループのBioWa社)での発現によってフコシル化されていない。この事により、Fcを介したエフェクター機能の付随的増強に伴い、Fcγ受容体(FcγRs)を特異的に活性化するための分子親和性が増強される(Pereira 2018)。簡単に言うと、mAb067-12重鎖および軽鎖発現プラスミドを直線化し、CHO DG44 FUT8-/- POTELLIGENT(登録商標)宿主細胞をトランスフェクトするために使用した。トランスフェクトされた細胞の増殖を強化するために薬剤選択を適用して、単一細胞クローニングを行い、GSK3903371Aを発現するモノクローナル細胞株を単離した。
文献：
Pereira, N.A., et al., The "less-is-more" in therapeutic antibodies： Afucosylated anti-cancer antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. mAbs, 2018： p. 1-44.
5．GSK3903371Aに対するADCCデータ
実施例1：AML細胞株,OCI-AML-1
説明：
GSK3903371Aは、ADCCメカニズムによってIL1RAP発現細胞を強力に枯渇させるように設計された非フコシル化Fc強化抗IL1RAP抗体である。GSK3903371Aにより、3つの独立したADCCアッセイにおいて、64.1pM(58.5-70.1pM)の平均EC50(幾何平均/範囲)にてOCI-AML-1細胞の標的細胞死が誘導された。このEC50は、その他のバッチのGSK3903371Aを用いた同一アッセイで得られたEC50に同程度であった。
方法：
末梢血単核細胞(PBMC)を、ヘパリン処理したヒト全血からAccuspin Tube(Sigma)内のHistopaque上で遠心分離することにより単離した。その後、PBMCを洗い、計数して、標的細胞増殖培地で1x107細胞/mlに希釈した。ヒトAML細胞株OCI-AML-1を、ADCCアッセイ用の標的細胞として使用した。ユーロピウム標識した標的細胞を、標的細胞増殖培地で1x105細胞/mlの濃度に希釈した。6.7nMまでの濃度範囲のGSK3903371Aを、1x104標的細胞と、室温で30分間混合した後に、5x105PBMCエフェクター細胞を加えた。エフェクター細胞：ターゲット細胞(E：T)の最終的な割合は、50：1であった。このアッセイを、3時間インキュベートし、細胞から放出されたユーロピウム量を定量することによって、抗体依存性細胞毒性(ADCC)を測定した。
実験1および2において、データをエクセルで分析し、以下の式：
[実験的放出-自然発生的)／(最大放出-自然発生的)]×100
を用いて、コントロールウェル[エフェクター＋標的のみ](即ち、抗体なし)からの最大ユーロピウム放出値および最小(自然発生的)ユーロピウム放出値を用いて、％特異的分解値を得た。
実験3では、コントロール抗体と試験抗体による細胞分解の一般的なバックグラウンドが増加し、非常に高い細胞溶解率が得られた。この例では、EC50値は、実測した蛍光値を用いて計算された。細胞溶解データまたは実測した蛍光データを用いたEC50値は、同等であった。
EC50値は、Grafit(Erithacus Software)の4パラメータロジスティック非線形フィットモデルを用いて、以下の式を用いて算出した：
[Y = ボトム＋(トップ－ボトム)/(1+10^((LogIC50-X)*ヒルスロープ))]
(式中、Xは濃度であり、Yはその反応であり、トップ/ボトムとは、曲線のプラトーでの反応である)。
Figure 2022539178000019
実施例2：初代アムル細胞
非フコシル化抗IL1RAP mAb GSK3903371Aおよび対応するフコシル化mAb067-12を、初代AML細胞およびヒトNKエフェクター細胞に対するADCCアッセイで試験した。GSK3903371Aは、様々なドナーのNK細胞を用いた3回の独立した実験において、EC50値が、6.1 pM、8.8 pMおよび10.2 pM(幾何平均 8.18 pM)にて初代AML細胞に対して強力なADCC活性を示した(表1)。この活性は、抗体を添加したNKエフェクター細胞の非存在下にて試験した場合には観察されず(図示せず)、観察された活性は、NK媒介性による活性であり、GSK3903371AによるAML細胞の直接の分解によるものではないことが実証された。mAb067-12 Fc WTは、GSK3903371A(EC508.8 pM)と比較して、EC5092 pMという10倍低い活性を示した(図6)。mAb067-12 Fc WTは、コントロールにより規定された全細胞の50％しか分解せずに低い最大活性を示したが、GSK3903371Aの最大活性は、全細胞の90％の分解を示した。
これらのデータから、GSK3903371Aが、初代AML細胞に対して強力なADCC活性を有し、この活性はNK細胞を介したものであることが示された。また、GSK3903371Aは、フコシル化された分子のmAb067-12と比較して、優れたADCC活性を有していることが実証された。
方法
試験抗体の連続希釈液を、RPMI1640/10%FCS中の4×104 細胞/ウェルのAML患者のPBMC(標的細胞)に加えて、この混合物を室温で30分間インキュベートした。健康なドナーNKエフェクター細胞を、エフェクター：標的(E：T)比を5：1で標的細胞に加えて、37℃、5％CO2で18時間インキュベートした。その後、細胞を、500 gで5分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを、FACS緩衝液に再懸濁した。AML芽球集団を同定するために、細胞を以下のマーカーで染色した：CD45、CD16および/またはCD337および近赤外生存/死(登録商標)細胞染色。染色後、細胞を遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットをCellFixに再懸濁し、フローサイトメーター(CytoFlex, Beckman Coulter)上で分析した。前方散乱光と側方散乱光の標準的なフローサイトメトリー解析および生存/死(登録商標)細胞染色を使用して、生存細胞を同定した。側方散乱光(SSC-A)対CD45のドットプロットは、AML芽球集団の同定に使用した。NK細胞を除外するために、CD45が弱陽性(dim)である事象(疾病芽球細胞集団、即ち標的細胞集団と考えられる)をゲーティングし、さらにSSC-Aに対して抗CD16とCD337の併用、またはSSC-Aに対してCD16単独のドットプロットにてプロットした。CD45dim、CD16および/またはCD337陰性の事象をゲーティングし、標的細胞集団として指定した。各試験ウェル中の標的細胞集団として事象/μLの統計値を用いて、以下に詳述するように、溶出パーセント値を計算した。
各試験ウェルあたりの分解値％を、Excel(Microsoft)にて下記式：
1-(試験ウェル1μLあたりの事象数／抗体を含まないコントロールウェルの1μLあたりの事象の平均値)
により算出して、パーセント値で表示した。％分解値(3回反復した値の平均+/-SEM)を、GraphPad Prism software(ver 5.0.4)でプロットした。EC50値は、GraphPad Prismの「log(アゴニスト) vs. 応答－可変スロープ(4パラメーター)」式で算出した。
Figure 2022539178000020
6. GSK3903371A(およびmAb067-12)に対するCDCデータ
ヒト化抗IL1RAPクローンmAb067-12とその非フコシル化型GSK3903371Aを、IL1RAP過剰発現細胞株(HEK293/IL1RAP)を標的細胞として、補体依存性の細胞傷害(CDC)アッセイにより評価した。補体の供給源として子ウサギ血清を用いた。HumAb067-12およびGSK3903371Aは、共に強力なCDC活性を示し、EC50は1桁のnM、最大の細胞傷害性は約68～80%であった。
方法
細胞表面にヒトIL1RAPを安定に発現するHEK293細胞株(HEK293/IL1RAP)を、補体依存性細胞傷害活性(CDC)をアッセイするための標的細胞として用いた。HEK/IL1RAP細胞を、試験抗体と共に、37℃で30分間インキュベートした。その後、希釈したウサギ血清を、5% v/vの濃度になるように加えて、アッセイプレートを、37℃で12時間インキュベートした。CellTiter-Glo蛍光試薬を、各ウェルに添加し、2分間オービタルシェーカーで混合し、細胞分解を誘導した。プレートを、室温で10分間インキュベートした後、SpectraMax M5マイクロタイタープレートリーダーで発光を測定した。発光シグナルは、生存細胞から放出されるATP量に比例しており、これを用いて細胞毒性レベルを決定した。データを、非線形回帰曲線フィッティングを用いて分析して、以下の通りに、log(抗体濃度)対％細胞毒性を評価した：
細胞毒性％ ＝ 100×(E-S)/(M-S)
(式中、Eは、「実験ウェル」の発光値を表し、Sは、細胞、培地、ウサギ血清の発光値(即ち、抗体無し)を表し、Mは、培地およびウサギ血清の発光値(即ち、細胞および抗体無し)を表す。
曲線フィッティングモデルは、用量応答曲線が1.0のヒルスロープを持つと仮定し、以下の式に基づく：
Y＝ボトム＋(トップ－ボトム)/(1+10^((LogEC50-X)))
Y-maxとは、「最大％ＣＤＣ」と呼ばれ、試験抗体により誘導される最大分解度である。
Figure 2022539178000021
7. GSK3903371Aのインビボ試験
GSK3903371Aは、免疫不全のNOGマウスにおいて、ヒトAML PDX細胞株の増殖を阻害する能力を評価された。NOGマウスに、AML PDX細胞株であるLEXFAM2734をi.v.注射により移植した。3日後、マウスに10 mg/kgのGSK3903371AまたはアイソタイプコントロールをIP注射して処理した。mAbsを、週に3回、35日目の試験終了時まで投与した。GSK3903371Aは、14、21、28日後の末梢血中のヒトAML細胞の蓄積を有意に阻害した。移植後35日目には、GSK3903371A投与マウスにおいてAML細胞が減少する有意ではない傾向が見られた。さらに、GSK3903371Aは、試験終了時の骨髄におけるAML細胞の蓄積を阻害した。
8. X線結晶解析(図1参照)により、IL1RAPタンパク質の以下のアミノ酸残基が、mAb063C-S Fabと、5オングストローム以内の距離を有していることが判明した。
ILE 131
GLU 132
TYR 133
GLY 134
ILE 135
ARG 137
GLN 165
ASN 166
PHE 167
ASN 168
ASN 169
VAL 170
ILE 171
PRO 172
GLU 173
SER 178
PHE 179
LEU 180
ILE 181
LEU 183
9. X線結晶解析(図2参照)により、IL1RAPタンパク質の以下のアミノ酸残基が、mAb067 Fabと、5オングストローム以内の距離を有していることが判明した。
GLU 19
GLU 21
GLN 113
LYS 114
ASP 115
SER 116
CYS 117
PHE 118
LYS 152
PRO 153
THR 154
ILE 155
THR 156
TYR 158
CYS 161
TYR 162
LYS 163
GLN 165
ASN 166
VAL 193
THR 195
TYR 196
PRO 197
GLY 200
ARG 201
THR 202
HIS 204
THR 206
10. X線結晶解析(図3参照)により、IL1RAPタンパク質の以下のアミノ酸残基が、mAB154F01-16と、5オングストローム以内の距離を有していることが判明した。
ILE 131
GLU 132
TYR 133
GLY 134
ILE 135
MET 159
CYS 161
TYR 162
LYS 163
GLN 165
ASN 166
PHE 167
ASN 168
ASN 169
VAL 170
ILE 171
LEU 180
ILE 181
ALA 182
LEU 183
SER 185
ASN 186
配列表
mAb001 (マウス)
配列番号1：
マウスmAb001重鎖可変領域cDNA配列：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGGATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAATGGATTGGTAACATTTACCCTTCTGATAGTAAAACTCACTACAATCAAAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGATTACTACGGTAGCATAGGGATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

配列番号2
マウスmAb001重鎖可変領域タンパク質配列：
QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTSYWMDWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSKTHYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDYYGSIGMDYWGQGTSVTVSS

配列番号3
SYWMD

配列番号4
NIYPSDSKTHYNQKFKD

配列番号5
DYYGSIGMDY

配列番号6
マウスmAb001軽鎖可変領域cDNA配列：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCTTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGGCAAGTCAGGAAATTAGTGGTTACTTAAGCTGGCTTCAGCAGAAACCAGATGGAACTATTAAACGCCTGATCTACGCCGCATCCACTTTAGATTCTGGTGTCCCAAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATTAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGCAGACTATTACTGTCTACAATATGCTAGTTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA

配列番号7
マウスmAb001軽鎖可変領域タンパク質配列：
DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYASYPWTFGGGTKLEIK

配列番号8
RASQEISGYLS

配列番号9
AASTLDS

配列番号10
LQYASYPWT
マウスmAb016
配列番号11
マウスmAb016重鎖可変領域cDNA配列：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCTTCAGTGAAGCTG
TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGGATTGGGTGAAGCAGAGG
CCTGGACAAGGCCTTGAATGGATTGGTAACATTTACCCTTCTGATAGTGCAACTCACTAC
AATCAAAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTATAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC
ATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGATTAC
TACGGTAGCATAGGGATGGACTCTTGGGGTCAAGGAACCTCTGTCACCGTCTCCTCA

配列番号12
マウスmAb016重鎖可変領域タンパク質配列：
QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTSYWMDWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSATHY
NQKFKDKATLTIDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDYYGSIGMDSWGQGTSVTVSS

配列番号13
SYWMD

配列番号14
NIYPSDSATHYNQKFKD

配列番号15
DYYGSIGMDS

配列番号16
マウスmAb016軽鎖可変領域cDNA配列：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCTTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGT
CTCACTTGTCGGGCAAGTCAGGAAATTAGTGATTACTTAAGCTGGCTTCAGCAGAAACCA
GATGGAACTATTAAACGCCTGATCTACGCCGCATCCACTTTAGATTCTGGTGTCCCAAAA
AGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCT
GAAGATTTTGCAGACTATTACTGTCTACAATATGCTAGTTTTCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGCACCAAGCTGGAGATCAAA

配列番号17
マウスmAb016軽鎖可変領域タンパク質配列：
DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISDYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPK
RFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYASFPWTFGGGTKLEIK

配列番号18
RASQEISDYLS

配列番号19
AASTLDS

配列番号20
LQYASFPWT
マウスmAb048
配列番号21
マウスmAb048重鎖可変領域cDNA配列：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGACCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTG
TCCTGCAAGGCTTATGGCTACACTTTCTTTAGTTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGAGG
CCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAATGATTCATCCTAATAGTGGTACCACTAACAAC
AATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTTCAGTACAGCCTAC
ATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCGAGGGGTTAT
AGTAACTACGACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCATTCTCACAGTCTCCTCA

配列番号22
マウスmAb048重鎖可変領域タンパク質配列：
QVQLQQPGADLVKPGASVKLSCKAYGYTFFSYWMHWVRQRPGQGLEWIGMIHPNSGTTNN
NEKFKSKATLTVDKSFSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGYSNYDFDYWGQGTILTVSS

配列番号23
SYWMH

配列番号24
MIHPNSGTTNNNEKFKS

配列番号25
GYSNYDFDY

配列番号26
マウスmAb048軽鎖可変領域cDNA配列：
GACATCAAGATGACCCAGTTTCCATCTTCCATGTATGCTTCTCTAGGAGAGAGAGTCACT
ATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATACCTATTTAATCTGGATCCAGCAGAAACCA
GGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAAATAGATTGGCAGATGGGGTCCCATCA
AGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTCTTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGCAT
GAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAGTTTCCGTATACGTTCGGAGGG
GGGACCAAGCTGGAAATAAAA

配列番号27
マウスmAb048軽鎖可変領域タンパク質配列：
DIKMTQFPSSMYASLGERVTITCKASQDINTYLIWIQQKPGKSPKTLIYRANRLADGVPS
RFSGSGSGQDSSLTISSLEHEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK

配列番号28
KASQDINTYLI

配列番号29
RANRLAD

配列番号30
LQYDEFPYT
マウスmAb067
配列番号31
マウスmAb067重鎖可変領域cDNA配列：
CAGGTTAAACTTCACCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATG
TCCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTTAATAGCTACTGGATACACTGGGTAAAACAGAGG
CCTGGACAGGGTCTGGAATGGATCGGATACAATAATCCTACCTCTGGTTATAGTGAGTAC
AATCAGAAGTTCACGGACAAGGCCACATTGAGTGCAGACAAATCTTCCAGTACAGCCTAC
ATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGTAAGAGAGTAT
GGTGACTTATTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

配列番号32
マウスmAb067重鎖可変領域タンパク質配列：
QVKLHQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFNSYWIHWVKQRPGQGLEWIGYNNPTSGYSEY
NQKFTDKATLSADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCVREYGDLFAYWGQGTLVTVSA

配列番号33
SYWIH

配列番号34
YNNPTSGYSEYNQKFTD

配列番号35
EYGDLFAY

配列番号36
マウスmAb067軽鎖可変領域cDNA配列：
AACATTGTAATGACCCAATCTCCCAAATCCATGTCCATGTCAGTAGGAGAGAGGGTCACC
TTGAGCTGCAAGGCCAGTGAGAATGTGGGTTATTCTGTATCCTGGTTTCAGCAGAAACCA
GATCAGTCTCCAAAACTGCTGATATACGGGGCATCCAACCGGTACACTGGGGTCCCCGAT
CGCTTCACAGGCAGTGGATCTGCAACAGATTTCACTCTGACCATCAGCACTGTGCAGGCT
GAAGACCTTGCAGATTATCACTGTGGACAGATTTACATCTATCCGTACACGTTCGGAGGG
GGGACCAAGCTGGAAATAAAA

配列番号37
マウスmAb067軽鎖可変領域タンパク質配列：
NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGYSVSWFQQKPDQSPKLLIYGASNRYTGVPD
RFTGSGSATDFTLTISTVQAEDLADYHCGQIYIYPYTFGGGTKLEIK

配列番号38
KASENVGYSVS

配列番号39
GASNRYT

配列番号40
GQIYIYPYT
マウスmAb117
配列番号41
マウスmAb117重鎖可変領域cDNA配列：
CAGGCTTATCTACAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAGCAGTCACCTAGACAGGGCCTGGAATGGGTTGGAGTTTTTTATTTAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGTGGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGACCCGGGGGCTATGCCAACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

配列番号42
マウスmAb117重鎖可変領域タンパク質配列：
QAYLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQSPRQGLEWVGVFYLGNGDTSYNEKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARPGGYANWYFDVWGTGTTVTVSS

配列番号43
SYNMH

配列番号44
VFYLGNGDTSYNEKFKG

配列番号45
PGGYANWYFDV

配列番号46
マウスmAb117軽鎖可変領域cDNA配列：
GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACTGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTGAGGTATCCTGGTATCAACAGAAACCAGGCCAATCTCCTAATACACTGATCTACTCGGCATCCTATCGGCACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCACCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGACTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGACCTGAAA

配列番号47
マウスmAb117軽鎖可変領域タンパク質配列：
DIVMTQSQKFMSTSVGDWVSVTCKASQNVGTEVSWYQQKPGQSPNTLIYSASYRHSGVPDRFTGSGSGTEFTLTITNVQSEDLADYFCQQYNSFPLTFGAGTKLDLK

配列番号48
KASQNVGTEVS

配列番号49
SASYRHS

配列番号50
QQYNSFPLT

配列番号51
mAb067-12(ヒト化)に対する重鎖可変領域
Figure 2022539178000022

配列番号52
mAb067-12(ヒト化)に対する軽鎖可変領域
Figure 2022539178000023

配列番号53
mAb067-12(ヒト化)に対する重鎖可変領域のcDNA
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTCAGCTGCAAGGCCTCCGGGTACACCTTCAACAGCTACTGGATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTCGAGTGGATGGGCTACAACAACCCCACCAGCGGCTACAGCGAGTACAACCAGAAGTTCACCGACAGGGTGACCATCACAGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCAAGGGAGTACGGCGACCTGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCT

配列番号54
mAb067-12(ヒト化)に対する軽鎖可変領域のcDNA
GCCATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGAGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCGAGAACGTGGGCTACAGCGTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACGGCGCAAGCAACAGGTACACCGGCGTGCCCTCTAGGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGCCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACCACTGCGGCCAGATCTACATCTACCCCTACACTTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATTAAG
mAb067-12(ヒト化)に対する重鎖全長タンパク質
配列番号55

EvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgYtfNSYWIHwvrqapgqglewmgYNNPTSGYSEYNQKFTDrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarEYGDLFAYwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
mAb067-12(ヒト化)に対する軽鎖全長タンパク質
配列番号56
AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASENVGYSVSWFQQKPGKSPKLLIYGASNRYTGVPSRFSGSGSATDFTLTISSLQPEDFATYHCGQIYIYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
mAb067-12(ヒト化)に対する重鎖全長cDNA
配列番号57
GAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAAGTGAAGAAGCCCGGAAGCAGCGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCAACAGCTACTGGATCCATTGGGTGCGCCAGGCTCCAGGACAGGGACTCGAGTGGATGGGATACAACAACCCCACCAGCGGCTACAGCGAGTACAACCAGAAGTTCACCGACCGCGTGACCATCACAGCCGATAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGTCTAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCCGGGAGTACGGAGACCTGTTCGCTTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCCAGCGCTTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
mAb067-12(ヒト化)に対する軽鎖全長cDNA
配列番号58
GCCATCCAGATGACCCAGTCTCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGAGATAGAGTGACCATCACTTGCAAGGCCAGCGAGAACGTGGGCTACAGCGTGTCTTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGAGCCCTAAGCTGCTGATCTACGGCGCCTCTAACAGATACACCGGCGTGCCTAGCAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGCCACAGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCAGAAGACTTCGCCACCTACCATTGCGGCCAGATCTACATCTACCCCTACACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA

配列番号59
IL1RAPの完全アミノ酸配列

1 mtllwcvvsl yfygilqsda sercddwgld tmrqiqvfed eparikcplf ehflkfnyst
61 ahsagltliw ywtrqdrdle epinfrlpen riskekdvlw frptllndtg nytcmlrntt
121 ycskvafple vvqkdscfns pmklpvhkly ieygiqritc pnvdgyfpss vkptitwymg
181 cykiqnfnnv ipegmnlsfl ialisnngny tcvvtypeng rtfhltrtlt vkvvgspkna
241 vppvihspnd hvvyekepge ellipctvyf sflmdsrnev wwtidgkkpd ditidvtine
301 sishsrtede trtqilsikk vtsedlkrsy vcharsakge vakaakvkqk vpaprytvel
361 acgfgatvll vvilivvyhv ywlemvlfyr ahfgtdetil dgkeydiyvs yarnaeeeef
421 vlltlrgvle nefgyklcif drdslpggiv tdetlsfiqk srrllvvlsp nyvlqgtqal
481 lelkaglenm asrgninvil vqykavketk vkelkraktv ltvikwkgek skypqgrfwk
541 qlqvampvkk sprrsssdeq glsysslknv
mAB154F01-16重鎖可変領域(ヒト)
配列番号60
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGSGGISWVRQAPGQGLEWMGWISDYNGQTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARVGTDTWYAFDIWGQGTLVTVSS
mAB154F01-16軽鎖可変領域(ヒト)
配列番号61
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQPDNLRTFGGGTKVEIK
mAb063重鎖可変領域cDNA配列：
配列番号62
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATA
TCCTGTAAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAACAGAGC
CATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACATATTAATCCTAACAGCGGTAGTACTACCTAC
ACTGAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTAC
ATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGACGACTCTGCAGTCTATTACTGTGTCAGAAGGATT
GGGAAGAACTGGCATTGCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
mAb063重鎖可変領域タンパク質配列(実施例1のビニング試験に使用された)
配列番号63
Figure 2022539178000024


配列番号64
DYYMN

配列番号65
HINPNSGSTTYTEKFKD

配列番号66
RIGKNWHCDV

配列番号67
mAb063軽鎖可変領域cDNA配列
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACC
ATCTCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTCAACTTTCATGGTACTCATTTAATGCACTGGTAC
CAACAGAAACCAGGACAGGCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAACCTAGATTCT
GGAGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGAGACAGACTTCACCCTCAACATCCAT
CCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCGACCTATTTCTGTCAGCAAAGTATTGAGGATCCATTC
ACGTTCGGCTCGGGGACATACTTGGAAATAAAA

配列番号68
mAb063軽鎖可変領域タンパク質配列：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVNFHGTHLMHWYQQKPGQAPKLLIYAASNLDS
GVPARFSGSGSETDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSIEDPFTFGSGTYLEIK

配列番号69
RASESVNFHGTHLMH

配列番号70
AASNLDS

配列番号71
QQSIEDPFT

mAb 067-12に対する重鎖可変領域に対する別のcDNA
配列番号72
GAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAAGTGAAGAAGCCCGGAAGCAGCGTGAAGGTG
TCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCAACAGCTACTGGATCCATTGGGTGCGCCAGGCT
CCAGGACAGGGACTCGAGTGGATGGGATACAACAACCCCACCAGCGGCTACAGCGAGTAC
AACCAGAAGTTCACCGACCGCGTGACCATCACAGCCGATAAGAGCACCAGCACCGCCTAC
ATGGAGCTGTCTAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCCGGGAGTAC
GGAGACCTGTTCGCTTATTGGGGCCAGGGAACACTGGTGACAGTGTCCAGC

ヒトmAb154D01-5重鎖可変領域
配列番号73
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFNSRWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDVRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAVYYCARVGGGILYMDVWGKGTTVTVSS

ヒトmAb154D01-5軽鎖可変領域：
配列番号74
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQSYIWPPITFGGGTKVEIK

mAb063C-S重鎖可変領域タンパク質配列(実施例8のX線解析試験に使用された, 図1)
配列番号75

EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGHINPNSGSTTYTEKFKDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSDDSAVYYCVRRIGKNWHSDVWGTGTTVTVSS

Claims (19)

  1. 配列番号2および7；12および17；22および27;32および37；42および47；51および52;または63および68である各重鎖可変配列および軽鎖可変配列を含む、重鎖および軽鎖可変領域を有するIL1RAP抗体のいずれか1つと、IL1RAPタンパク質との結合に対して競合する、ILL1rap結合タンパク質。
  2. ADCCおよび／またはCDCにより、IL1RAP発現腫瘍細胞を直接殺傷する能力、癌細胞に対するIL-1の増殖促進効果を阻害する能力、および／またはIL-1のMDSC促進効果を阻害することにより腫瘍特異性免疫応答の増強を促進する能力をさらに有する、請求項1記載のIL1RAP結合タンパク質。
  3. X線結晶構造解析により決定された通りの配列番号59のヒトIL1RAPのGln165およびAsn166のアミノ酸の一方または両方で、ヒトIL1RAPに結合するIL1RAP結合タンパク質。
  4. 配列番号33に記載のCDRH1；配列番号34に記載のCDRH2；配列番号35に記載のCDRH3；配列番号38に記載のCDRL1；配列番号39に記載のCDRL2および/または配列番号40に記載のCDRL3、あるいは各CDRの直接同等物(ここで、該直接同等物は、該CDRにおいて2つ以下のアミノ酸置換を有する)のうちの1つ以上を含むことを特徴とする、IL1RAP結合タンパク質。
  5. ヒトIL1RAPタンパク質に結合するIL1RAP結合タンパク質であって、該IL1RAP結合タンパク質が、配列番号51に記載のアミノ酸配列と少なくとも85、90、95、98または99%同一のアミノ酸配列を含むVHドメイン、および／または配列番号52に記載のアミノ酸配列と少なくとも85、90、95、98または99%同一のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、IL1RAP結合タンパク質。
  6. 配列番号33；配列番号34および配列番号35に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDRならびに配列番号38；配列番号39；および配列番号40に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDRを含む、ヒト化モノクローナル抗体。
  7. 配列番号51に記載のアミノ酸配列を有するVHドメイン；および配列番号52に記載のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、ヒト化モノクローナル抗体。
  8. 配列番号55に記載のアミノ酸配列を含む全長重鎖；および配列番号56に記載のアミノ酸配列を含む全長軽鎖を含む、ヒト化モノクローナル抗体。
  9. POTELLIGENT(登録商標)α-1,6-フコシルトランスフェラーゼ(FUT8)ノックアウトCHO細胞株から発現される、請求項8または請求項7に記載の抗体。
  10. 請求項1～9のいずれか1項に記載のIL1RAP抗原結合タンパク質または抗体のいずれか1つを含む、医薬組成物。
  11. 急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)および骨髄異形成症候群(MDS)；ならびに前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、メラノーマ、膀胱癌、脳腫瘍、子宮頸癌、上咽頭癌、胃癌、頭/頸部癌、腎癌、肝癌、卵巣癌、リンパ腫、膵臓癌および肉腫からなる群より選択される固体腫瘍癌を、治療する方法。
  12. 配列番号33に記載のCDRH1；配列番号34に記載のCDRH2；配列番号35に記載のCDRH3；配列番号38に記載のCDRL1；配列番号39に記載のCDRL2および/または配列番号40に記載のCDRL3または各CDRの直接同等物(ここで、該直接同等物は、該CDRにおいて2つ以下のアミノ酸置換を有する)のうち1つ以上を有する、IL1RAP結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  13. ヒトIL1RAPタンパク質に特異的に結合するIL1RAP結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、該ILrap結合タンパク質が、配列番号51に記載のアミノ酸配列と少なくとも85、90、95、98または99％同一のアミノ酸配列を含むVHドメインおよび/または配列番号52に記載のアミノ酸配列と少なくとも85、90、95、98または99％同一のアミノ酸配列を含むVLドメインを含むことを特徴とする、ポリヌクレオチド。
  14. 配列番号33、配列番号34および配列番号35に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDRならびに配列番号38、配列番号39および配列番号40に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDRを含む、ヒト化モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド。
  15. 配列番号51に記載のアミノ酸配列を有するVHドメイン；ならびに配列番号52に記載のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、ヒト化モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド。
  16. 配列番号55に記載のアミノ酸配列を有する全長重鎖；および配列番号56に記載のアミノ酸配列を有する全長軽鎖を含む、ヒト化モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド。
  17. 配列番号53、54、57、58または72のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも85、90、95、98または99%の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
  18. 配列番号53、54、55、56または72のポリヌクレオチド配列を含む、請求項17に記載のポリヌクレオチド。
  19. 請求項17または18に記載したポリヌクレオチドのいずれかを含むベクターおよび宿主細胞。
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