JP2022534988A - ｔＲＮＡプールを調節するためのＴＲＥＭの使用 - Google Patents

ｔＲＮＡプールを調節するためのＴＲＥＭの使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、一般的には、ｔＲＮＡベースエフェクター分子（ＴＲＥＭ）の使用及びその作製方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／８５５，５６１号に対する優先権を主張するものであり、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的手段により提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年５月１９日に作成された前記ＡＳＣＩＩの複製は、Ｆ２０９９－７００１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは１０５，５２０バイトである。
ｔＲＮＡベースエフェクター分子（ＴＲＥＭ）は、タンパク質の開始及び伸長を含むいくつかの機能を有する複合体分子である。ＴＲＥＭを含む組成物は、疾患を治療又は予防するように前記機能を調節するために使用できる。
一態様では、本発明は、第１の配列を有するコドンを含む内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む細胞中のｔＲＮＡプールを調節する方法であって、
任意選択により、細胞中の（ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は両方の存在量についての知識を取得すること、例えば、細胞中の（ｉ）及び（ｉｉ）の相対量についての知識を取得することであって、（ｉ）は、第１の配列を有するＯＲＦのコドンと対形成するアンチコドンを有するｔＲＮＡ部分（第１のｔＲＮＡ部分）であり、及び（ｉｉ）は、第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分（第２のｔＲＮＡ部分）である、取得することと；
細胞中の第１のｔＲＮＡ部分及び第２のｔＲＮＡ部分の相対量を調節するのに十分な量及び時間で、細胞を、ＴＲＥＭを含む組成物と接触させることであって、ＴＲＥＭは、（ａ）第１の配列を有するコドン又は（ｂ）第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有する、接触させることと、
それにより細胞中のｔＲＮＡプールを調節することと
を含む方法を特徴とする。
ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物は、薬学的に許容される組成物である。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、終止コドンと対形成するアンチコドンを含まない。
ある実施形態では、本方法は、（ｉ）についての知識を取得することを含む。ある実施形態では、本方法は、（ｉｉ）についての知識を取得することを含む。ある実施形態では、本方法は、（ｉ）及び（ｉｉ）についての知識を取得することを含む。
一態様では、本発明は、第１の配列を有するコドンを含む内在性ＯＲＦを有する対象中のｔＲＮＡプールを調節する方法であって、
任意選択により、対象中の（ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は両方の存在量についての知識を取得すること、例えば、対象中の（ｉ）及び（ｉｉ）の相対量についての知識を取得することであって、（ｉ）は、第１の配列を有するＯＲＦのコドンと対形成するアンチコドンを有するｔＲＮＡ部分（第１のｔＲＮＡ部分）であり、及び（ｉｉ）は、第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分（第２のｔＲＮＡ部分）である、取得することと；
対象中の第１のｔＲＮＡ部分及び第２のｔＲＮＡ部分の相対量を調節するのに十分な量及び時間で、対象をＴＲＥＭを含む組成物と接触させることであって、ＴＲＥＭは、（ａ）第１の配列を有するコドン又は（ｂ）第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有する、接触させることと、
それにより対象中のｔＲＮＡプールを調節することと
を含む方法を特徴とする。
ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物は、薬学的に許容される組成物である。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、終止コドンと対形成するアンチコドンを含まない。
ある実施形態では、本方法は、（ｉ）についての知識を取得することを含む。ある実施形態では、本方法は、（ｉｉ）についての知識を取得することを含む。ある実施形態では、本方法は、（ｉ）及び（ｉｉ）についての知識を取得することを含む。
別の態様では、本開示は、内在性ＯＲＦ（このＯＲＦは、第１の配列を有するコドンを含む）を有する細胞中のｔＲＮＡプールを評価する方法であって、（ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は両方の存在量についての知識を、例えば、直接的又は間接的に、取得すること、例えば、細胞中の（ｉ）及び（ｉｉ）の相対量についての知識を取得することであって、（ｉ）は、第１の配列を有するＯＲＦのコドンと対形成するアンチコドンを有するｔＲＮＡ部分（第１のｔＲＮＡ部分）であり、及び（ｉｉ）は、細胞中の第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分（第２のｔＲＮＡ部分）である、取得することと、それにより細胞中のｔＲＮＡプールを評価することと、を含む方法を提供する。
ある実施形態では、本方法は、（ｉ）についての知識を取得することを含む。ある実施形態では、本方法は、（ｉｉ）についての知識を取得することを含む。ある実施形態では、本方法は、（ｉ）及び（ｉｉ）についての知識を取得することを含む。
ある実施形態では、（ｉ）についての知識を取得することは、（ｉ）の存在量、例えば、相対量に対する値を取得することを含む。
ある実施形態では、（ｉｉ）についての知識を取得することは、（ｉｉ）の存在量、例えば、相対量に対する値を取得することを含む。
ある実施形態では、前記値に応答して、本方法は、第１のｔＲＮＡ部分及び第２のｔＲＮＡ部分の相対量を調節するのに十分な量及び時間で、ＴＲＥＭを含む組成物を投与することであって、ＴＲＥＭは、（ａ）第１の配列を有するコドン又は（ｂ）第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有する、投与することを含む。
別の態様では、本開示は、第１の配列を有するコドンを含む内在性ＯＲＦを有する対象中のｔＲＮＡプールを評価する方法であって、（ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は両方の存在量についての知識を、例えば、直接的又は間接的に、取得すること、例えば、対象中の（ｉ）及び（ｉｉ）の相対量についての知識を取得することであって、（ｉ）は、第１の配列を有するＯＲＦのコドンと対形成するアンチコドンを有するｔＲＮＡ部分（第１のｔＲＮＡ部分）であり、及び（ｉｉ）は、細胞中の第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分（第２のｔＲＮＡ部分）である、取得することと、それにより対象中のｔＲＮＡプールを評価することと、を含む方法を提供する。
ある実施形態では、本方法は、（ｉ）についての知識を取得することを含む。ある実施形態では、本方法は、（ｉｉ）についての知識を取得することを含む。ある実施形態では、本方法は、（ｉ）及び（ｉｉ）についての知識を取得することを含む。
ある実施形態では、（ｉ）についての知識を取得することは、（ｉ）の存在量、例えば、相対量に対する値を取得することを含む。
ある実施形態では、（ｉｉ）についての知識を取得することは、（ｉｉ）の存在量、例えば、相対量に対する値を取得することを含む。
ある実施形態では、前記値に応答して、本方法は、第１のｔＲＮＡ部分及び第２のｔＲＮＡ部分の相対量を調節するのに十分な量及び時間で、ＴＲＥＭを含む組成物を投与することであって、ＴＲＥＭは、（ａ）第１の配列を有するコドン又は（ｂ）第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有する、投与することを含む。
別の態様では、本発明は、同義変異を含むコドン（同義変異コドン又はＳＭＣ）を含む内在性ＯＲＦを含む対象中又は細胞中のｔＲＮＡプールを調節する方法であって、
ＴＲＥＭを含む組成物を提供することであって、ＴＲＥＭは、ＳＭＣ（ＴＲＥＭ）と対形成するアンチコドン配列を含むイソアクセプターｔＲＮＡ部分を含む、提供することと；
対象中又は細胞中のｔＲＮＡプールを調節するのに十分な量及び時間で、対象をＴＲＥＭを含む組成物と接触させ又は細胞の場合には細胞をＴＲＥＭを含む組成物からのＴＲＥＭと接触させることと、
それにより対象中又は細胞中のｔＲＮＡプールを調節することと
を含む方法を特徴とする。
ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物と接触させる前、対象又は細胞は、ＳＭＣと対形成するアンチコドンを有する第１のｔＲＮＡ部分（第１のｔＲＮＡ部分）及びＳＭＣ以外のコドンと対形成するアンチコドンを有する第２のｔＲＮＡ部分（第２のｔＲＮＡ部分）を含む。
別の態様では、本発明は、第１の配列を有するコドンを含む内在性ＯＲＦを有する対象を治療する方法であって、
ＴＲＥＭを含む組成物を提供することであって、ＴＲＥＭは、（ａ）第１の配列を有するＯＲＦのコドンと対形成するアンチコドン又は（ｂ）第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分を含む、提供することと、
対象を治療するのに十分な量及び時間で、対象をＴＲＥＭを含む組成物と接触させることと、
それにより対象を治療することと
を含む方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、同義変異を含むコドン（同義変異コドン又はＳＭＣ）を含む内在性ＯＲＦを有する対象を治療する方法であって、
ＴＲＥＭを含む組成物を提供することであって、ＴＲＥＭは、ＳＭＣ（ＴＲＥＭ）と対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分を含む、提供することと；
対象を治療するのに十分な量及び時間で、対象をＴＲＥＭ含む組成物と接触させることと、
それにより対象を治療することと
を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、第１の配列を有するコドンを含む内在性ＯＲＦを有する対象を治療する方法であって、
（ｉ）対象中の第１の配列を有するコドンの状態に対する値を、例えば、直接的又は間接的に、取得することであって、前記値は、対象からのサンプル中の第１の配列を有するコドンの存在又は不在の尺度を含む、取得すること、及び第１の配列を有するコドンを有するとして対象を同定すること；並びに
（ｉｉ）前記値に応答して、ＴＲＥＭを含む組成物を対象に投与することであって、ＴＲＥＭは、第１の配列を有するコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分を含む、投与すること、
それにより対象を治療すること
を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、同義変異を含むコドン（同義変異コドン又はＳＭＣ）を含む内在性ＯＲＦを有する対象を治療する方法であって、
（ｉ）対象のＳＭＣ状態に対する値を、例えば、直接的又は間接的に、取得することであって、前記値は、対象からのサンプル中のＳＭＣの存在又は不在の尺度を含む、取得すること、及びＳＭＣを有するとして対象を同定すること；並びに
（ｉｉ）前記値に応答して、ＴＲＥＭを含む組成物を対象に投与することであって、ＴＲＥＭは、ＳＭＣと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分を含む、投与すること、
それにより対象を治療すること
を含む方法を特徴とする。
ある態様では、本発明は、第１の配列を有するコドンを含む内在性ＯＲＦを有する対象に対する療法を選択する方法であって、
対象中の第１の配列を有するコドンの状態に対する値を、例えば、直接的又は間接的に、取得することであって、前記値は、対象からのサンプル中の第１の配列を有するコドンの存在又は不在の尺度を含む、取得すること、及び
第１の配列を有するコドンの存在が、前記対象が療法に対する反応者である可能性が高いこと又は前記対象が療法に反応すること若しくは反応する可能性が高いことの指標となり、
それにより療法を選択すること
を含む方法を特徴とする。
ある態様では、本発明は、同義変異を含むコドン（同義変異コドン又はＳＭＣ）を含む内在性ＯＲＦを有する対象に対する療法を選択する方法であって、
対象のＳＭＣ状態に対する値を、例えば、直接的又は間接的に、取得することであって、前記値は、対象からのサンプル中のＳＭＣの存在又は不在の尺度を含む、取得すること、及び
ＳＭＣの存在が、前記対象が療法に対する反応者である可能性が高いこと又は前記対象が療法に反応すること若しくは反応する可能性が高いことの指標となり、
それにより療法を選択すること
を含む方法を特徴とする。
ある態様では、本発明は、第１の配列を有するコドンを含む内在性ＯＲＦを有する対象を評価する方法であって、
対象中の第１の配列を有するコドンの状態に対する値を、例えば、直接的又は間接的に、取得することであって、前記値は、対象からのサンプル中の第１の配列を有するコドンの存在又は不在の尺度を含む、取得すること；及び
第１の配列を有するコドンを有するとして対象を同定すること、
それにより対象を評価すること
を含む方法を提供する。
ある態様では、本発明は、同義変異を含むコドン（同義変異コドン又はＳＭＣ）を含む内在性ＯＲＦを有する対象を評価する方法であって、
対象のＳＭＣ状態に対する値を、例えば、直接的又は間接的に、取得することであって、前記値は、対象からのサンプル中のＳＭＣの存在又は不在の尺度を含む、取得することと、
ＳＭＣを有するとして対象を同定することと、
それにより対象を評価することと
を含む方法を特徴とする。
本明細書で開示されるように、ｔＲＮＡベースエフェクター分子（ＴＲＥＭ）は、様々な細胞プロセスを媒介できる複合体分子である。ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物は、対象中、組織内又は細胞中のｔＲＮＡプールを調節するために、例えば、インビトロ又はインビボで、細胞、組織又は対象に投与できる。また、本明細書で開示されるのは、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物を投与することによって、障害又は障害の症状を治療又は予防する方法である。本明細書にさらで開示されるのは、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物、調製物及びその作製方法である。
前述の組成物（例えば、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物）、前記組成物の使用方法及び／又はその作製方法のいずれかの追加の特徴は、以下に列挙される実施形態の１つ以上を含む。
当業者は、通例の実験だけを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を認識することになるか、又は確認することがきできるであろう。そのような均等物は、以下に列挙される実施形態によって包含されることが意図される。
列挙される実施形態
１．第１の配列を有するコドンを含む内在性ＯＲＦを有する細胞中のｔＲＮＡプールを評価する方法であって、（ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は両方の存在量についての知識を、例えば、直接的又は間接的に、取得すること、例えば、細胞中の（ｉ）及び（ｉｉ）の相対量についての知識を取得することであって、（ｉ）は、第１の配列を有するＯＲＦのコドンと対形成するアンチコドンを有するｔＲＮＡ部分（第１のｔＲＮＡ部分）であり、及び（ｉｉ）は、細胞中の第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分（第２のｔＲＮＡ部分）である、取得することと、それにより細胞中のｔＲＮＡプールを評価することと、を含む方法。
２．第１の配列を有するコドンを含む内在性ＯＲＦを有する対象中のｔＲＮＡプールを評価する方法であって、（ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は両方の存在量についての知識を、例えば、直接的又は間接的に、取得すること、例えば、対象中の（ｉ）及び（ｉｉ）の相対量についての知識を取得することであって、（ｉ）は、第１の配列を有するＯＲＦのコドンと対形成するアンチコドンを有するｔＲＮＡ部分（第１のｔＲＮＡ部分）であり、及び（ｉｉ）は、細胞中の第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分（第２のｔＲＮＡ部分）である、取得することと、それにより対象中のｔＲＮＡプールを評価することと、を含む方法。
３．（ｉ）についての知識を取得することを含む、実施形態１又は２の方法。
４．（ｉｉ）についての知識を取得することを含む、実施形態１又は２の方法。
５．（ｉ）及び（ｉｉ）についての知識を取得することを含む、実施形態１又は２の方法。
６．（ｉ）についての知識を取得することが、（ｉ）の存在量、例えば、相対量に対する値を取得することを含む、実施形態１～３又は５のいずれか１つの方法。
７．（ｉｉ）についての知識を取得することが、（ｉｉ）の存在量、例えば、相対量に対する値を取得することを含む、実施形態１～２又は４～５のいずれか１つの方法。
８．前記値に応答して、方法が、第１のｔＲＮＡ部分及び第２のｔＲＮＡ部分の相対量を調節するのに十分な量及び時間で、ＴＲＥＭを含む組成物を投与することであって、ＴＲＥＭは、（ａ）第１の配列を有するコドン又は（ｂ）第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有する、投与することを含む、実施形態６又は７の方法。
９．内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（このＯＲＦは、第１の配列を有するコドンを含む）を含む細胞中のｔＲＮＡプールを調節する方法であって、
任意選択により、細胞中の（ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は両方の存在量についての知識を取得すること、例えば、細胞中の（ｉ）及び（ｉｉ）の相対量についての知識を取得することであって、（ｉ）は、第１の配列を有するＯＲＦのコドンと対形成するアンチコドンを有するｔＲＮＡ部分（第１のｔＲＮＡ部分）であり、及び（ｉｉ）は、第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分（第２のｔＲＮＡ部分）である、取得すること；
細胞中の第１のｔＲＮＡ部分及び第２のｔＲＮＡ部分の相対量を調節するのに十分な量及び／又は時間で、細胞をＴＲＥＭを含む組成物と接触させることであって、ＴＲＥＭは、（ａ）第１の配列を有するコドン又は（ｂ）第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有する、接触させること、
それにより細胞中のｔＲＮＡプールを調節すること
を含む方法。
１０．ＴＲＥＭが、（ａ）と対形成するアンチコドンを含む、実施形態９の方法。
１１．ＴＲＥＭが、（ｂ）と対形成するアンチコドンを含む、実施形態９の方法。
１２．内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（このＯＲＦは、第１の配列を有するコドンを含む）を有する対象中のｔＲＮＡプールを調節する方法であって、
任意選択により、対象中の（ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は両方の存在量についての知識を取得すること、例えば、対象中の（ｉ）及び（ｉｉ）の相対量についての知識を取得することであって、（ｉ）は、第１の配列を有するＯＲＦのコドンと対形成するアンチコドンを有するｔＲＮＡ部分（第１のｔＲＮＡ部分）であり及び（ｉｉ）は、第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分（第２のｔＲＮＡ部分）である、取得すること；
対象中の第１のｔＲＮＡ部分及び第２のｔＲＮＡ部分の相対量を調節するのに十分な量及び／又は時間で、対象をＴＲＥＭを含む組成物と接触させることであって、ＴＲＥＭは、（ａ）第１の配列を有するコドン又は（ｂ）第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有する、接触させること、
それにより対象中のｔＲＮＡプールを調節すること
を含む方法。
１３．ＴＲＥＭが、（ａ）と対形成するアンチコドンを含む、実施形態１２の方法。
１４．ＴＲＥＭが、（ｂ）と対形成するアンチコドンを含む、実施形態１２の方法。
１５．（ｉ）についての知識を取得することを含む、実施形態９～１４のいずれか１つの方法。
１６．（ｉｉ）についての知識を取得することを含む、実施形態９～１４のいずれか１つの方法。
１７．（ｉ）及び（ｉｉ）についての知識を取得することを含む、実施形態９～１４のいずれか１つの方法。
１８．（ｉ）についての知識を取得することが、（ｉ）の存在量、例えば、相対量に対する値を取得することを含む、実施形態９～１４のいずれか１つの方法。
１９．（ｉｉ）についての知識を取得することが、（ｉｉ）の存在量、例えば、相対量に対する値を取得することを含む、実施形態９～１４のいずれか１つの方法。
２０．前記値に応答して、細胞又は対象が、（ａ）又は（ｂ）と対形成するアンチコドンを有するＴＲＥＭを含む組成物と接触される、実施形態１８又は１９の方法。
２１．同義変異を含むコドン（同義変異コドン又はＳＭＣ）を含む内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する対象中のｔＲＮＡプールを調節する方法であって、
ＴＲＥＭを含む組成物を提供することであって、ＴＲＥＭは、ＳＭＣ（ＴＲＥＭ）と対形成するアンチコドン配列を含むイソアクセプターｔＲＮＡ部分を含む、提供すること；
対象中のｔＲＮＡプールを調節するのに十分な量及び／又は時間で、対象をＴＲＥＭを含む組成物と接触させること、
それにより対象中のｔＲＮＡプールを調節すること
を含む方法。
２２．同義変異を含むコドン（同義変異コドン又はＳＭＣ）を含む内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む細胞中のｔＲＮＡプールを調節する方法であって、
ＴＲＥＭを含む組成物を提供することであって、ＴＲＥＭは、ＳＭＣ（ＴＲＥＭ）と対形成するアンチコドン配列を含むイソアクセプターｔＲＮＡ部分を含む、提供すること；
細胞中のｔＲＮＡプールを調節するのに十分な量及び／又は時間で、細胞をＴＲＥＭを含む組成物と接触させること、
それにより細胞中のｔＲＮＡプールを調節すること
を含む方法。
２３．対象中又は細胞中の（ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は両方の存在量についての知識を取得すること、例えば、（ｉ）及び（ｉｉ）の相対量についての知識を取得することを含み、（ｉ）は、ＳＭＣと対形成するアンチコドンを有するｔＲＮＡ部分（第１のｔＲＮＡ部分）であり、及び（ｉｉ）は、ＳＭＣ以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分（第２のｔＲＮＡ部分）である、実施形態２１又は２２の方法。
２４．（ｉ）についての知識を取得することを含む、実施形態２３の方法。
２５．（ｉｉ）についての知識を取得することを含む、実施形態２３の方法。
２６．（ｉ）及び（ｉｉ）についての知識を取得することを含む、実施形態２３の方法。
２７．（ｉ）についての知識を取得することが、（ｉ）の存在量、例えば、相対量に対する値を取得することを含む、実施形態２３の方法。
２８．（ｉｉ）についての知識を取得することが、（ｉｉ）の存在量、例えば、相対量に対する値を取得することを含む、実施形態２３の方法。
２９．前記値に応答して、細胞又は対象がＴＲＥＭと接触される、実施形態２７又は２８の方法。
３０．第１の配列を有するコドンを含む内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する対象を治療する方法であって、
ＴＲＥＭを含む組成物を提供することであって、ＴＲＥＭは、第１の配列を有するＯＲＦのコドンと対形成するアンチコドン又は第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分を含む、提供することと、
対象を治療するのに十分な量及び／又は時間で、対象をＴＲＥＭを含む組成物と接触させることと、
それにより対象を治療することと、
を含む方法。
３１．同義変異を含むコドン（同義変異コドン又はＳＭＣ）を含む内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する対象を治療する方法であって、
ＴＲＥＭを含む組成物を提供することであって、ＴＲＥＭは、ＳＭＣ（ＴＲＥＭ）と対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分を含む、提供すること；
対象を治療するのに十分な量及び／又は時間で、対象をＴＲＥＭを含む組成物と接触させること、
それにより対象を治療すること
を含む方法。
３２．（ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は両方の存在量についての知識を取得すること、例えば、
（ｉ）第１の配列を有するコドン又はＳＭＣと対形成するアンチコドンを有するｔＲＮＡ部分（第１のｔＲＮＡ部分）；及び／又は
（ｉｉ）第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成する又はＳＭＣ以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分（第２のｔＲＮＡ部分）、
の相対量についての知識を取得することを含む、実施形態３０又は３１の方法。
３３．（ｉ）についての知識を取得することを含む、実施形態３２の方法。
３４．（ｉｉ）についての知識を取得することを含む、実施形態３２の方法。
３５．（ｉ）及び（ｉｉ）についての知識を取得することを含む、実施形態３２の方法。
３６．（ｉ）についての知識を取得することが、（ｉ）の存在量、例えば、相対量に対する値を取得することを含む、実施形態３２の方法。
３７．（ｉｉ）についての知識を取得することが、（ｉｉ）の存在量、例えば、相対量に対する値を取得することを含む、実施形態３２の方法。
３８．前記値に応答して、対象がＴＲＥＭと接触される、実施形態２７又は２８の方法。
３９．第１の配列を有するコドンを含む内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する対象を治療する方法であって、
（ｉ）対象中の第１の配列を有するコドンの状態に対する値を、例えば、直接的又は間接的に、取得することであって、前記値は、対象からのサンプル中の第１の配列を有するコドンの存在又は不在の尺度を含む、取得すること、及び第１の配列を有するコドンを有するとして対象を同定すること；並びに
（ｉｉ）前記値に応答して、ＴＲＥＭを含む組成物を対象に投与することであって、ＴＲＥＭは、第１の配列を有するコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分を含む、投与すること、
それにより対象を治療すること
を含む方法。
４０．同義変異を含むコドン（同義変異コドン又はＳＭＣ）を含む内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する対象を治療する方法であって、
（ｉ）対象のＳＭＣ状態に対する値を、例えば、直接的又は間接的に、取得することであって、前記値は、対象からのサンプル中のＳＭＣの存在又は不在の尺度を含む、取得すること、及びＳＭＣを有するとして対象を同定すること；並びに
（ｉｉ）前記値に応答して、ＴＲＥＭを含む組成物を対象に投与することであって、ＴＲＥＭは、ＳＭＣと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分を含む、投与すること、
それにより対象を治療すること
を含む方法。
４１．第１の配列を有するコドンを含む内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する対象に対する療法を選択する方法であって、
対象中の第１の配列を有するコドンの状態に対する値を、例えば、直接的又は間接的に、取得することであって、前記値は、対象からのサンプル中の第１の配列を有するコドンの存在又は不在の尺度を含む、取得すること；及び
第１の配列を有するコドンの存在が、前記対象が療法に対する反応者である可能性が高いこと又は前記対象が療法に反応すること若しくは反応する可能性が高いことの指標となり、
それにより療法を選択すること
を含む方法。
４２．同義変異を含むコドン（同義変異コドン又はＳＭＣ）を含む内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する対象に対する療法を選択する方法であって、
対象のＳＭＣ状態に対する値を、例えば、直接的又は間接的に、取得することであって、前記値は、対象からのサンプル中のＳＭＣの存在又は不在の尺度を含む、取得すること、及び
ＳＭＣの存在が、前記対象が療法に対する反応者である可能性が高いこと又は前記対象が療法に反応すること若しくは反応する可能性が高いことの指標となり、
それにより療法を選択すること
を含む方法。
４３．第１の配列を有するコドンを含む内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する対象を評価する方法であって、
対象中の第１の配列を有するコドンの状態に対する値を、例えば、直接的又は間接的に、取得することであって、前記値は、対象からのサンプル中の第１の配列を有するコドンの存在又は不在の尺度を含む、取得すること；及び
第１の配列を有するコドンを有するとして対象を同定すること、
それにより対象を評価すること
を含む方法。
４４．同義変異を含むコドン（同義変異コドン又はＳＭＣ）を含む内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する対象を評価する方法であって、
対象のＳＭＣ状態に対する値を、例えば、直接的又は間接的に、取得することであって、前記値は、対象からのサンプル中のＳＭＣの存在又は不在の尺度を含む、取得すること；及び
ＳＭＣを有するとして対象を同定すること、
それにより対象を評価すること
を含む方法。
４５．ＴＲＥＭが、終止コドンと対形成するアンチコドンを含まない、実施形態８～４４のいずれか１つの方法。
４６．（ａ）第１の配列を有するＯＲＦコドン又は（ｂ）ＳＭＣが、終止コドン、例えば、ＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧ以外である、実施形態１～４５のいずれか１つの方法。
４７．ＴＲＥＭがカノニカルアンチコドン／負荷部位組合せを含む、実施形態８～４６のいずれか１つの方法。
４８．（ａ）第１の配列を有するＯＲＦコドン又は（ｂ）ＳＭＣが、前記コドンの第１の位置に変異、例えば、ＳＮＰを有する、実施形態１～４７のいずれか１つの方法。
４９．（ａ）第１の配列を有するＯＲＦコドン又は（ｂ）ＳＭＣが、前記コドンの第２の位置に変異、例えば、ＳＮＰを有する、実施形態１～４８のいずれか１つの方法。
５０．（ａ）第１の配列を有するＯＲＦコドン又は（ｂ）ＳＭＣが、前記コドンの第３の位置に変異、例えば、ＳＮＰを有する、実施形態１～４９のいずれか１つの方法。
５１．第１のｔＲＮＡ部分が内在性ｔＲＮＡを含み、及び第２のｔＲＮＡ部分が内在性ｔＲＮＡを含み、例えば、細胞又は対象が、ＴＲＥＭを含む組成物と接触されていない、実施形態１～２０、２３～２９、３２～３８又は４５～５０のいずれか１つの方法。
５２．第１のｔＲＮＡ部分及び第２のｔＲＮＡ部分の１つが、内在性ｔＲＮＡ及びＴＲＥＭを含む、実施形態１～２０、２３～２９、３２～３８又は４５～５１のいずれか１つの方法。
５３．（ａ）第１の配列を有するＯＲＦコドン又は（ｂ）ＳＭＣが、ＴＲＥＭを含む組成物との接触の不在下で、表現型、例えば、望ましくない表現型、例えば、障害又は症状、例えば、表１から選ばれる障害又は症状と関連する、実施形態１～５２のいずれか１つの方法。
５４．障害又は症状が、表１で提供される疾患群、例えば、心血管、皮膚科、内分泌、免疫学、神経学、腫瘍学、眼科又は呼吸系から選ばれる、実施形態５３の方法。
５５．障害が心肥大である、実施形態５３又は５４の方法。
５６．障害が冠動脈疾患である、実施形態５３又は５４の方法。
５７．障害が高血圧である、実施形態５３又は５４の方法。
５８．障害又は症状が肥満関連形質である、実施形態５３又は５４の方法。
５９．障害が１型糖尿病である、実施形態５３又は５４の方法。
６０．障害が２型糖尿病である、実施形態５３又は５４の方法。
６１．障害が乾癬である、実施形態５３又は５４の方法。
６２．障害が子宮内膜症である、実施形態５３又は５４の方法。
６３．障害が、慢性炎症性疾患、例えば、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性結腸炎又は多面発現である、実施形態５３又は５４の方法。
６４．障害がクローン病である、実施形態５３又は５４の方法。
６５．障害がグレーブス病である、実施形態５３又は５４の方法。
６６．障害が、アルツハイマー病、例えば、年齢発症アルツハイマー病又は家族性アルツハイマー病である、実施形態５３又は５４の方法。
６７．障害が大鬱病性障害である、実施形態５３又は５４の方法。
６８．障害が片頭痛である、実施形態５３又は５４の方法。
６９．障害がパーキンソン病である、実施形態５３又は５４の方法。
７０．障害が統合失調症である、実施形態５３又は５４の方法。
７１．障害又は症状が、化学療法に対する有害反応、例えば、好中球減少症又は白血球減少症である、実施形態５３又は５４の方法。
７２．障害が、乳癌、例えば、早期発症乳癌である、実施形態５３又は５４の方法。
７３．障害が卵巣癌である、実施形態５３又は５４の方法。
７４．障害が結腸直腸癌である、実施形態５３又は５４の方法。
７５．障害が、上皮性卵巣癌でのカルボプラチン廃棄である、実施形態５３又は５４の方法。
７６．障害が、多発性骨髄腫でのクロストリジウム・ディフィシレ（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染である、実施形態５３又は５４の方法。
７７．障害が、子宮内膜癌、例えば、類内膜組織診によるものである、実施形態５３又は５４の方法。
７８．障害が食道扁平上皮細胞癌である、実施形態５３又は５４の方法。
７９．障害が膠芽細胞腫である、実施形態５３又は５４の方法。
８０．障害が肺癌である、実施形態５３又は５４の方法。
８１．障害又は症状がマクロファージ遊走阻止因子レベルである、実施形態５３又は５４の方法。
８２．障害が口腔癌及び咽頭癌である、実施形態５３又は５４の方法。
８３．障害が膵癌である、実施形態５３又は５４の方法。
８４．障害が近視である、実施形態５３又は５４の方法。
８５．障害がＣＯＰＤである、実施形態５３又は５４の方法。
８６．障害が喘息である、実施形態５３又は５４の方法。
８７．第１の配列を有するＯＲＦコドン又はＳＭＣが、表１で提供される遺伝子、例えば、転写物に配置される、実施形態１～８６のいずれか１つの方法。
８８．第１の配列を有するＯＲＦコドン又はＳＭＣが、表１で提供されるコドン、例えば、表１の「前／後のコドン」の列に列挙されるコドン、例えば、表１の前記列に列挙される第２のコドンを含む、実施形態１～８７のいずれか１つの方法。
８９．ＴＲＥＭを含む組成物と接触させることが、第２の表現型、例えば、望ましくない表現型の寛解、例えば、障害又は症状の寛解、例えば、表１から選ばれる障害又は症状の寛解と関連する、実施形態１～８８のいずれか１つの方法。
９０．障害又は症状が、表１で提供される疾患群、例えば、心血管、皮膚科、内分泌、免疫学、神経学、腫瘍学、眼科又は呼吸系から選ばれる、実施形態８９の方法。
９１．対象が、表１から選ばれる障害若しくは症状を有するか又は対象からの細胞が、表１に列挙される障害若しくは症状、例えば、心血管、皮膚科、内分泌、免疫学、神経学、腫瘍学、眼科若しくは呼吸系の疾患から選ばれる疾患群と関連する、実施形態１～９０のいずれか１つの方法。
９２．障害が心肥大である、実施形態９１の方法。
９３．障害が冠動脈疾患である、実施形態９１の方法。
９４．障害が高血圧である、実施形態９１の方法。
９５．障害又は症状が肥満関連形質である、実施形態９１の方法。
９６．障害が１型糖尿病である、実施形態９１の方法。
９７．障害が２型糖尿病である、実施形態９１の方法。
９８．障害が乾癬である、実施形態９１の方法。
９９．障害が子宮内膜症である、実施形態９１の方法。
１００．障害が、慢性炎症性疾患、例えば、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性結腸炎又は多面発現である、実施形態９１の方法。
１０１．障害がクローン病である、実施形態９１の方法。
１０２．障害がグレーブス病である、実施形態９１の方法。
１０３．障害が、アルツハイマー病、例えば、年齢発症アルツハイマー病又は家族性アルツハイマー病である、実施形態９１の方法。
１０４．障害が大鬱病性障害である、実施形態９１の方法。
１０５．障害が片頭痛である、実施形態９１の方法。
１０６．障害がパーキンソン病である、実施形態９１載の方法。
１０７．障害が統合失調症である、実施形態９１の方法。
１０８．障害又は症状が、化学療法に対する有害反応、例えば、好中球減少症又は白血球減少症である、実施形態９１の方法。
１０９．障害が、乳癌、例えば、早期発症乳癌である、実施形態９１の方法。
１１０．障害が卵巣癌である、実施形態９１の方法。
１１１．障害が結腸直腸癌である、実施形態９１の方法。
１１２．障害が、上皮性卵巣癌でのカルボプラチン廃棄である、実施形態９１の方法。
１１３．障害が、多発性骨髄腫でのクロストリジウム・ディフィシレ（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染である、実施形態９１の方法。
１１４．障害が、子宮内膜癌、例えば、類内膜組織診によるものである、実施形態９１の方法。
１１５．障害が食道扁平上皮細胞癌である、実施形態９１の方法。
１１６．障害が膠芽細胞腫である、実施形態９１の方法。
１１７．障害が肺癌である、実施形態９１の方法。
１１８．障害又は症状が、マクロファージ遊走阻止因子レベルである、実施形態９１の方法。
１１９．障害が口腔癌及び咽頭癌である、実施形態９１の方法。
１２０．障害が膵癌である、実施形態９１の方法。
１２１．障害が近視である、実施形態９１の方法。
１２２．障害がＣＯＰＤである、実施形態９１の方法。
１２３．障害が喘息である、実施形態９１の方法。
１２４．知識を取得することが、第１のｔＲＮＡ部分及び第２のｔＲＮＡ部分の相対量に対する値を得ることを含む、実施形態１～１２３のいずれか１つの方法。
１２５．前記値に応答して、方法が、対象又は細胞をＴＲＥＭを含む組成物と接触させることを含む、実施形態１２４の方法。
１２６．第１のｔＲＮＡ部分が内在性ｔＲＮＡを含み、及び第２のｔＲＮＡ部分が内在性ｔＲＮＡを含み、例えば、細胞又は対象が、ＴＲＥＭを含む組成物と接触されていない、実施形態１～１２５のいずれか１つの方法。
１２７．第１のｔＲＮＡ部分及び第２のｔＲＮＡ部分の１つが、内在性ｔＲＮＡ及びＴＲＥＭを含む、実施形態１～１２６のいずれか１つの方法。
１２８．対象又は細胞との接触前、第１のｔＲＮＡ部分が第２のｔＲＮＡ部分よりも豊富である、実施形態８～１２７のいずれか１つの方法。
１２９．例えば、存在量が、実施例２９～３２のいずれかに記載されるアッセイによって決定される場合、第１のｔＲＮＡ部分が、第２のｔＲＮＡ部分よりも
少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％豊富であるか、又は
０．５～９９％、１～９９％、２～９９％、３～９９％、４～９９％、５～９９％、６～９９％、７～９９％、８～９９％、９～９９％、１０～９９％、１５～９９％、２０～９９％、２５～９９％、３０～９９％、４０～９９％、５０～９９％、６０～９９％、７０～９９％、８０～９９％、９５～９９％、０．５～９５％、０．５～９０％、０．５～８５％、０．５～８０％、０．５～７０％、０．５～６０％、０．５～５０％、０．５～４０％、０．５～３０％、０．５～２５％、０．５～２０％、０．５～１５％、０．５～１０％、０．５～９％、０．５～８％、０．５～７％、０．５～６％、０．５～５％、０．５～４％、０．５～３％、０．５～２％若しくは０．５～１％豊富である、実施形態１～１２８のいずれか１つの方法。
１３０．対象又は細胞との接触前、第２のｔＲＮＡ部分が第１のｔＲＮＡ部分よりも豊富である、実施形態８～１２９のいずれか１つの方法。
１３１．例えば、存在量が実施例２９～３２のいずれかに記載されるアッセイによって決定される場合、第２のｔＲＮＡ部分が、第１のｔＲＮＡ部分よりも
少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％豊富であるか、又は
０．５～９９％、１～９９％、２～９９％、３～９９％、４～９９％、５～９９％、６～９９％、７～９９％、８～９９％、９～９９％、１０～９９％、１５～９９％、２０～９９％、２５～９９％、３０～９９％、４０～９９％、５０～９９％、６０～９９％、７０～９９％、８０～９９％、９５～９９％、０．５～９５％、０．５～９０％、０．５～８５％、０．５～８０％、０．５～７０％、０．５～６０％、０．５～５０％、０．５～４０％、０．５～３０％、０．５～２５％、０．５～２０％、０．５～１５％、０．５～１０％、０．５～９％、０．５～８％、０．５～７％、０．５～６％、０．５～５％、０．５～４％、０．５～３％、０．５～２％又は０．５～１％豊富である、実施形態１～１３０のいずれか１つの方法。
１３２．ＴＲＥＭを含む組成物を細胞又は対象と接触させること又はそれで治療することが、細胞中又は対象中のｔＲＮＡプールを調節することを含む、実施形態８～１３１のいずれか１つの方法。
１３３．調節が、第２のｔＲＮＡ部分と比較して第１のｔＲＮＡ部分の量を増加させることを含む、実施形態９～２９又は４５～１３２のいずれか１つの方法。
１３４．増加が、対象中又は治療細胞中の第１のｔＲＮＡ部分の量、例えば、絶対量の増加である、実施形態１３３の方法。
１３５．増加が、参照、例えば、治療細胞の成分、例えば、第１のｔＲＮＡ部分又は第２のｔＲＮＡ部分のベースラインレベルを基準にする、実施形態１３３又は１３４の方法。
１３６．第１のｔＲＮＡ部分の量が、参照を基準にして少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０若しくは１００倍又は１～１００倍、１～５０倍、１～２５倍、１～２０倍、１～１５倍、１～１０倍、１～５倍、１～４倍、１～３倍、１～２倍、２～１００倍、３～１００倍、４～１００倍、５～１００倍、１０～１００倍、１５～１００倍、２０～１００倍、２５～１００倍若しくは５０～１００倍に増加される、実施形態１３３～１３５のいずれか１つの方法。
１３７．調節が、第１のｔＲＮＡ部分と比較して第２のｔＲＮＡ部分の相対量を増加させることを含む、実施形態９～２９又は４５～１３６のいずれか１つの方法。
１３８．増加が、対象中又は治療細胞中の第２のｔＲＮＡ部分の量、例えば、絶対量の増加である、実施形態１３７の方法。
１３９．増加が、参照、例えば、治療細胞の成分、例えば、第２のｔＲＮＡ部分又は第１のｔＲＮＡ部分のベースラインレベルを基準にする、実施形態１３７又は１３８の方法。
１４０．第１のｔＲＮＡ部分の量が、参照を基準にして少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０又は１００倍に増加される、実施形態１３７～１３９のいずれか１つの方法。
１４１．調節が、第１のｔＲＮＡ部分対第２のｔＲＮＡ部分の比を調節することを含む、実施形態９～２９又は４５～１４０のいずれか１つの方法。
１４２．第１のｔＲＮＡ部分対第２のｔＲＮＡ部分の比が、１：１０，０００、１：５０００、１：１０００、１：９００、１：８００、１：７００、１：６００、１：５００、１：４００、１：３００、１：２００、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１である、実施形態１４１の方法。
１４３．第２のｔＲＮＡ部分対第１のｔＲＮＡ部分の比が、１：１０，０００、１：５０００、１：１０００、１：９００、１：８００、１：７００、１：６００、１：５００、１：４００、１：３００、１：２００、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１である、実施形態１４１の方法。
１４４．第１のｔＲＮＡ部分対第２のｔＲＮＡ部分の比が増加される、実施形態１４１～１４３のいずれか１つの方法。
１４５．第１のｔＲＮＡ部分対第２のｔＲＮＡ部分の比が減少される、実施形態１４１～１４３のいずれか１つの方法。
１４６．第１のｔＲＮＡ部分対第２のｔＲＮＡ部分の比が、参照、例えば、ＴＲＥＭを含む組成物と接触されていないこと以外は同様の細胞での比と比較される、実施形態１４１～１４５のいずれか１つの方法。
１４７．細胞がヒト細胞であるか又は対象がヒトである、実施形態１～１４６のいずれか１つの方法。
１４８．ＯＲＦの変異体コピーが、細胞又は対象に導入されない、実施形態８～１４７のいずれか１つの方法。
１４９．ＴＲＥＭを含む組成物と接触させること又はそれで治療することが、例えば、実施例３３～３８のいずれか１つに記載のアッセイによって評価されるとおり、ＯＲＦの翻訳物の生成及び／又は機能を増加させる、実施形態８～１４７のいずれか１つの方法。
１５０．ＯＲＦ又はＳＭＣ含有ＯＲＦがポリペプチドをコードする、実施形態１～１４９のいずれか１つの方法。
１５１．ＯＲＦ又はＳＭＣ含有ＯＲＦが染色体ＯＲＦである、実施形態１～１５０のいずれか１つの方法。
１５２．ＯＲＦ又はＳＭＣ含有ＯＲＦがミトコンドリアＯＲＦである、実施形態１～１５０のいずれか１つの方法。
１５３．ＴＲＥＭを含む組成物と接触させることが、症状又は障害、例えば、第１の配列を有するコドン又はＳＭＣと関連する症状又は障害を寛解させる、実施形態８～１５２のいずれか１つの方法。
１５４．症状又は障害が表１から選ばれる、実施形態１５３の方法。
１５５．障害が心肥大である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１５６．障害が冠動脈疾患である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１５７．障害が高血圧である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１５８．障害又は症状が肥満関連形質である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１５９．障害が１型糖尿病である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１６０．障害が２型糖尿病である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１６１．障害が乾癬である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１６２．障害が子宮内膜症である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１６３．障害が、慢性炎症性疾患、例えば、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性結腸炎又は多面発現である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１６４．障害がクローン病である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１６５．障害がグレーブス病である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１６６．障害が、アルツハイマー病、例えば、年齢発症アルツハイマー病又は家族性アルツハイマー病である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１６７．障害が大鬱病性障害である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１６８．障害が片頭痛である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１６９．障害がパーキンソン病である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１７０．障害が統合失調症である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１７１．障害又は症状が、化学療法に対する有害反応、例えば、好中球減少症又は白血球減少症である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１７２．障害が、乳癌、例えば、早期発症乳癌である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１７３．障害が卵巣癌である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１７４．障害が結腸直腸癌である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１７５．障害が、上皮性卵巣癌でのカルボプラチン廃棄である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１７６．障害が、多発性骨髄腫でのクロストリジウム・ディフィシレ（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１７７．障害が、子宮内膜癌、例えば、類内膜組織診によるものである、実施形態１５３又は１５４の方法。
１７８．障害が食道扁平上皮細胞癌である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１７９．障害が膠芽細胞腫である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１８０．障害が肺癌である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１８１．障害又は症状がマクロファージ遊走阻止因子レベルである、実施形態１５３又は１５４の方法。
１８２．障害が口腔癌及び咽頭癌である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１８３．障害が膵癌である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１８４．障害が近視である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１８５．障害がＣＯＰＤである、実施形態１５３又は１５４の方法。
１８６．障害が喘息である、実施形態１５３又は１５４の方法。
１８７．第１の配列を有するＯＲＦコドン又はＳＭＣが、一方の対立遺伝子に存在する、例えば、対象又は細胞が、第１の配列を有するコドン又はＳＭＣに関してヘテロ接合である、実施形態１～１８６のいずれ１つの方法。
１８８．第１の配列を有するＯＲＦコドン又はＳＭＣが、両方の対立遺伝子に存在する、例えば、対象又は細胞が、第１の配列を有するコドン又はＳＭＣに関してホモ接合である、実施形態１～１８７のいずれ１つの方法。
１８９．対象中又は細胞中でのタンパク質生成を調節することを含む、実施形態８～１８８のいずれか１つの方法。
１９０．対象中又は細胞中での翻訳物プロファイル、例えば、アミノ酸取り込みの量、速度、生成速度、コンフォメーション、活性、細胞中位置、修飾率又はポリペプチドの結合パートナーとの共翻訳相互作用を調節することを含む、実施形態８～１８９のいずれか１つの方法。
１９１．第１の配列を有するＯＲＦコドン又はＳＭＣを含むｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドの開始又は伸長を調節することを含む、実施形態８～１９０のいずれか１つの方法。
１９２．ＴＲＥＭを含む組成物が、本明細書に記載される方法によって、例えば、合成法によって（例えば、固相合成若しくは液相合成を用いて合成される）、インビトロ転写（ＩＶＴ）を用いて又は細胞中でＴＲＥＭをコードするベクターを発現させることにより作製される、実施形態８～１９１のいずれか１つの方法。
方法が、
（ａ）ＴＲＥＭを発現するのに十分な条件下で、ＴＲＥＭをコードする外在性核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む宿主細胞を提供すること；及び
（ｂ）ＴＲＥＭを含む組成物を生成するために宿主細胞培養物から発現されたＴＲＥＭを精製し、
それによりＴＲＥＭを含む組成物を作製すること
を含む、実施形態１９２の方法。
１９４．ＴＲＥＭを含む組成物が、ＴＲＥＭを含む医薬組成物である、実施形態８～１９３の方法。
１９５．ＴＲＥＭを含む組成物が医薬賦形剤を含む、実施形態８～１９４のいずれかの方法。
１９６．外来ＤＮＡ又はＲＮＡを哺乳動物宿主細胞に導入することを含む、実施形態１９３～１９５のいずれかの方法。
１９７．核酸が、転写時にＴＲＥＭを発現するＤＮＡを含む、実施形態１９３～１９６のいずれかの方法。
１９８．核酸が、逆転写時に、ＴＲＥＭを提供するように転写され得るＤＮＡをもたらすＲＮＡを含む、実施形態１９３～１９７のいずれかの方法。
１９９．ＴＲＥＭを含む組成物が、ＴＲＥＭ断片、例えば、本明細書に記載のものを含む、実施形態８～１９８のいずれかの方法。
２００．宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態１９３～１９９のいずれかの方法。
２０１．宿主細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（例えば、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞）、ＨＴ－１０８０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨＫＢ－１１細胞、ＣＡＰ細胞、ＨｕＨ－７細胞、ＢＨＫ ２１細胞、ＭＲＣ－Ｓ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＷＩ－３８細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はＭＣＦ７細胞から選択される細胞を含む、実施形態１９３～２００のいずれかの方法。
２０２．宿主細胞が、非哺乳動物細胞、例えば、細菌細胞、酵母細胞又は昆虫細胞である、実施形態１９３～２０１のいずれかの方法。
２０３．ＴＲＥＭが、表２に列挙されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に対して少なくとも８０％同一なＲＮＡ配列又はその断片若しくは機能性断片を含む組換えＴＲＥＭを含むＧＭＰグレード組成物（例えば、ｃＧＭＰに準拠して及び／又は同様の要件に従って作製されたＴＲＥＭを含む組成物）である、実施形態８～２０２のいずれかの方法。
２０４．ＴＲＥＭが、表３に列挙される１つ以上の転写後修飾を含む、実施形態８～２０３のいずれかの方法。
２０５．組換えＴＲＥＭを含む組成物が、少なくとも０．５ｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ、１５ｇ、２０ｇ、３０ｇ、４０ｇ、５０ｇ、１００ｇ、２００ｇ、３００ｇ、４００ｇ又は５００ｇである、実施形態２０３又は２０４の方法。
２０６．組換えＴＲＥＭを含む組成物が、０．５ｇ～５００ｇ、０．５ｇ～４００ｇ、０．５ｇ～３００ｇ、０．５ｇ～２００ｇ、０．５ｇ～１００ｇ、０．５ｇ～５０ｇ、０．５ｇ～４０ｇ、０．５ｇ～３０ｇ、０．５ｇ～２０ｇ、０．５ｇ～１０ｇ、０．５ｇ～９ｇ、０．５ｇ～８ｇ、０．５ｇ～７ｇ、０．５ｇ～６ｇ、０．５ｇ～５ｇ、０．５ｇ～４ｇ、０．５ｇ～３ｇ、０．５ｇ～２ｇ、０．５ｇ～１ｇ、１ｇ～５００ｇ、２ｇ～５００ｇ、５ｇ～５００ｇ、１０ｇ～５００ｇ、２０ｇ～５００ｇ、３０ｇ～５００ｇ、４０ｇ～５００ｇ、５０ｇ～５００ｇ、１００ｇ～５００ｇ、２００ｇ～５００ｇ、３００ｇ～５００ｇ、又は４００ｇ～５００ｇである、実施形態２０３又は２０４の方法。
２０７．ＴＲＥＭを含む組成物が、１種以上、例えば、複数種のＴＲＥＭを含む、実施形態８～２０６のいずれか１つの方法。
２０８．ＴＲＥＭを含む組成物（又はＴＲＥＭを含む組成物の生成における中間体）が、以下の特徴：
（ｉ）少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度；
（ｉｉ）０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、又は１００ｎｇ／ｍｌ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入；
（ｉｉｉ）ＴＲＥＭを含む組成物の１ミリグラム（ｍｇ）当たり０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、又は１００ｎｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入；
（ｉｖ）１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、又は１００ｎｇ／ｍｌ未満のＤＮＡ、例えば、宿主細胞ＤＮＡ；
（ｖ）全長ＴＲＥＭと比較して０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％未満の断片；
（ｖｉ）例えば、リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）試験によって測定される、内毒素の低レベル又は欠如；
（ｖｉｉ）例えば、実施例１４に記載されるアッセイによって測定されるとおりのインビトロ翻訳活性；
（ｖｉｉｉ）少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、０．１ｕｇ／ｍＬ、０．５ｕｇ／ｍＬ，１ｕｇ／ｍＬ、２ｕｇ／ｍＬ、５ｕｇ／ｍＬ、１０ｕｇ／ｍＬ、２０ｕｇ／ｍＬ、３０ｕｇ／ｍＬ、４０ｕｇ／ｍＬ、５０ｕｇ／ｍＬ、６０ｕｇ／ｍＬ、７０ｕｇ／ｍＬ、８０ｕｇ／ｍＬ、１００ｕｇ／ｍＬ、２００ｕｇ／ｍＬ、３００ｕｇ／ｍＬ、５００ｕｇ／ｍＬ、１０００ｕｇ／ｍＬ、５０００ｕｇ／ｍＬ、１０，０００ｕｇ／ｍＬ、又は１００，０００ｕｇ／ｍＬのＴＲＥＭ濃度；
（ｉｘ）例えば、無菌製剤に関するｃＧＭＰガイドラインに従う無菌性であって、例えば、組成物又は調製物は、無菌的条件下で試験された場合に１００未満の生存可能な微生物の増殖を裏付け、組成物又は調製物は、ＵＳＰ＜７１＞の規格を満たし、及び／又は組成物又は調製物は、ＵＳＰ＜８５＞の規格を満たす、無菌性；又は
（ｘ）例えば、組成物又は調製物は、ウイルス混入の欠如、又は検出不可能なレベルのウイルス混入を有する、ウイルス混入
のうちの１つ以上を含む、実施形態８～２０７のいずれか１つの組成物。
２０９．接触させることがインビトロ法である、例えば、細胞又は組織が、ＴＲＥＭを含む組成物とインビトロで接触される、実施形態８～２０８のいずれかの方法。
２１０．接触させることがエクスビボ法であり、例えば、細胞又は組織が、エクスビボでＴＲＥＭを含む組成物と接触され、及び任意選択により、接触された細胞又は組織が、対象、例えば、細胞又は組織が由来する対象、又は異なる対象に導入される、例えば、投与される、実施形態８～２０９のいずれかの方法。
２１１．方法が、インビボ法であり、例えば、対象、又は対象の組織若しくは細胞が、インビボでＴＲＥＭを含む組成物と接触される、実施形態８～２０９のいずれかの方法。
２１２．ＴＲＥＭを含む組成物が、送達剤、例えば、リポソーム、ポリマー（例えば、ポリマーコンジュゲート）、粒子、マイクロスフェア、マイクロ粒子又はナノ粒子により投与される、実施形態８～２１１のいずれかの方法。
２１３．ＴＲＥＭを含む組成物が、担体なしで、例えば、ＴＲＥＭのネイキッド送達を介して投与される、実施形態８～２１１のいずれかの方法。
２１４．ＴＲＥＭが、
（ａ）生成物、例えば、タンパク質の安定性及び／又は
（ｂ）生成物のリボソーム占有
を高める、実施形態８～２１３のいずれかの方法。
２１５．ＴＲＥＭが、
リボソーム占有を調節するか；
タンパク質翻訳又は安定性を調節するか；
ｍＲＮＡ安定性を調節するか；
タンパク質フォールディング又は構造を調節するか；
タンパク質形質導入又は区画化を調節するか；
コドン使用を調節するか；
細胞運命を調節するか；又は
シグナル経路、例えば、細胞シグナル経路を調節する、
実施形態８～２１４のいずれかの方法。
２１６．ＴＲＥＭが表３からの転写後修飾を含む、実施形態８～２１５のいずれかの方法。
２１７．ＴＲＥＭが、コグネイトアダプター機能を含み、及びＴＲＥＭが、ペプチド鎖の開始又は伸長においてＴＲＥＭのアンチコドンと天然で関連付けられるアミノ酸の受け入れ及び取り込みを媒介する、実施形態８～２１６のいずれかの方法。
２１８．ＴＲＥＭが、天然に存在するｔＲＮＡのＲＮＡ配列に対して少なくとも８０％同一なＲＮＡ配列を含む、実施形態８～２１７のいずれかの方法。
２１９．ＴＲＥＭが、表２に列挙されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ又はその断片若しくは機能性断片に対して少なくとも８０％同一なＲＮＡ配列を含む、実施形態８～２１８のいずれかの方法。
２２０．ＴＲＥＭが、表２に列挙されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列又はその断片を含む、実施形態８～２１９のいずれかの方法。
２２１．ＴＲＥＭが、表２に列挙されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列、又はその断片に対して少なくともＸＸ％同一なＲＮＡ配列を含み、ＸＸが、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９から選択される、実施形態８～２２０のいずれかの方法。
２２２．ＸＸが、８０である、実施形態２２１の方法。
２２３．ＸＸが、８５である、実施形態２２１の方法。
２２４．ＸＸが、９０である、実施形態２２１の方法。
２２５．ＸＸが、９５である、実施形態２２１の方法。
２２６．ＸＸが、９７である、実施形態２２１の方法。
２２７．ＸＸが、９８である、実施形態２２１の方法。
２２８．ＸＸが、９９である、実施形態２２１の方法。
２２９．ＤＮＡ配列が、配列番号１若しくはその断片、又は配列番号２若しくはその断片、又は配列番号３若しくはその断片、又は配列番号４若しくはその断片、又は配列番号５若しくはその断片、又は配列番号６若しくはその断片、又は配列番号７若しくはその断片、又は配列番号８若しくはその断片、又は配列番号９若しくはその断片、又は配列番号１０若しくはその断片、又は配列番号１１若しくはその断片、又は配列番号１２若しくはその断片、又は配列番号１３若しくはその断片、又は配列番号１４若しくはその断片、又は配列番号１５若しくはその断片、又は配列番号１６若しくはその断片、又は配列番号１７若しくはその断片、又は配列番号１８若しくはその断片、又は配列番号１９若しくはその断片、又は配列番号２０若しくはその断片、又は配列番号２１若しくはその断片、又は配列番号２２若しくはその断片、又は配列番号２３若しくはその断片、又は配列番号２４若しくはその断片、又は配列番号２５若しくはその断片、又は配列番号２６若しくはその断片、又は配列番号２７若しくはその断片、又は配列番号２８若しくはその断片、又は配列番号２９若しくはその断片、又は配列番号３０若しくはその断片、又は配列番号３１若しくはその断片、又は配列番号３２若しくはその断片、又は配列番号３３若しくはその断片、又は配列番号３４若しくはその断片、又は配列番号３５若しくはその断片、又は配列番号３６若しくはその断片、又は配列番号３７若しくはその断片、又は配列番号３８若しくはその断片、又は配列番号３９若しくはその断片、又は配列番号４０若しくはその断片、又は配列番号４１若しくはその断片、又は配列番号４２若しくはその断片、又は配列番号４３若しくはその断片、又は配列番号４４若しくはその断片、又は配列番号４５若しくはその断片、又は配列番号４６若しくはその断片、又は配列番号４７若しくはその断片、又は配列番号４８若しくはその断片、又は配列番号４９若しくはその断片、又は配列番号５０若しくはその断片、又は配列番号５１若しくはその断片、又は配列番号５２若しくはその断片、又は配列番号５３若しくはその断片、又は配列番号５４若しくはその断片、又は配列番号５５若しくはその断片、又は配列番号５６若しくはその断片、又は配列番号５７若しくはその断片、又は配列番号５８若しくはその断片、又は配列番号５９若しくはその断片、又は配列番号６０若しくはその断片、又は配列番号６１若しくはその断片、又は配列番号６２若しくはその断片、又は配列番号６３若しくはその断片、又は配列番号６４若しくはその断片、又は配列番号６５若しくはその断片、又は配列番号６６若しくはその断片、又は配列番号６７若しくはその断片、又は配列番号６８若しくはその断片、又は配列番号６９若しくはその断片、又は配列番号７０若しくはその断片、又は配列番号７１若しくはその断片、又は配列番号７２若しくはその断片、又は配列番号７３若しくはその断片、又は配列番号７４若しくはその断片、又は配列番号７５若しくはその断片、又は配列番号７６若しくはその断片、又は配列番号７７若しくはその断片、又は配列番号７８若しくはその断片、又は配列番号７９若しくはその断片、又は配列番号８０若しくはその断片、又は配列番号８１若しくはその断片、又は配列番号８２若しくはその断片、又は配列番号８３若しくはその断片、又は配列番号８４若しくはその断片、又は配列番号８５若しくはその断片、又は配列番号８６若しくはその断片、又は配列番号８７若しくはその断片、又は配列番号８８若しくはその断片、又は配列番号８９若しくはその断片、又は配列番号９０若しくはその断片、又は配列番号９１若しくはその断片、又は配列番号９２若しくはその断片、又は配列番号９３若しくはその断片、又は配列番号９４若しくはその断片、又は配列番号９５若しくはその断片、又は配列番号９６若しくはその断片、又は配列番号９７若しくはその断片、又は配列番号９８若しくはその断片、又は配列番号９９若しくはその断片、又は配列番号１００若しくはその断片、又は配列番号１０１若しくはその断片、又は配列番号１０２若しくはその断片、又は配列番号１０３若しくはその断片、又は配列番号１０４若しくはその断片、又は配列番号１０５若しくはその断片、又は配列番号１０６若しくはその断片、又は配列番号１０７若しくはその断片、又は配列番号１０８若しくはその断片、又は配列番号１０９若しくはその断片、又は配列番号１１０若しくはその断片、又は配列番号１１１若しくはその断片、又は配列番号１１２若しくはその断片、又は配列番号１１３若しくはその断片、又は配列番号１１４若しくはその断片、又は配列番号１１５若しくはその断片、又は配列番号１１６若しくはその断片、又は配列番号１１７若しくはその断片、又は配列番号１１８若しくはその断片、又は配列番号１１９若しくはその断片、又は配列番号１２０若しくはその断片、又は配列番号１２１若しくはその断片、又は配列番号１２２若しくはその断片、又は配列番号１２３若しくはその断片、又は配列番号１２４若しくはその断片、又は配列番号１２５若しくはその断片、又は配列番号１２６若しくはその断片、又は配列番号１２７若しくはその断片、又は配列番号１２８若しくはその断片、又は配列番号１２９若しくはその断片、又は配列番号１３０若しくはその断片、又は配列番号１３１若しくはその断片、又は配列番号１３２若しくはその断片、又は配列番号１３３若しくはその断片、又は配列番号１３４若しくはその断片、又は配列番号１３５若しくはその断片、又は配列番号１３６若しくはその断片、又は配列番号１３７若しくはその断片、又は配列番号１３８若しくはその断片、又は配列番号１３９若しくはその断片、又は配列番号１４０若しくはその断片、又は配列番号１４１若しくはその断片、又は配列番号１４２若しくはその断片、又は配列番号１４３若しくはその断片、又は配列番号１４４若しくはその断片、又は配列番号１４５若しくはその断片、又は配列番号１４６若しくはその断片、又は配列番号１４７若しくはその断片、又は配列番号１４８若しくはその断片、又は配列番号１４９若しくはその断片、又は配列番号１５０若しくはその断片、又は配列番号１５１若しくはその断片、又は配列番号１５２若しくはその断片、又は配列番号１５３若しくはその断片、又は配列番号１５４若しくはその断片、又は配列番号１５５若しくはその断片、又は配列番号１５６若しくはその断片、又は配列番号１５７若しくはその断片、又は配列番号１５８若しくはその断片、又は配列番号１５９若しくはその断片、又は配列番号１６０若しくはその断片、又は配列番号１６１若しくはその断片、又は配列番号１６２若しくはその断片、又は配列番号１６３若しくはその断片、又は配列番号１６４若しくはその断片、又は配列番号１６５若しくはその断片、又は配列番号１６６若しくはその断片、又は配列番号１６７若しくはその断片、又は配列番号１６８若しくはその断片、又は配列番号１６９若しくはその断片、又は配列番号１７０若しくはその断片、又は配列番号１７１若しくはその断片、又は配列番号１７２若しくはその断片、又は配列番号１７３若しくはその断片、又は配列番号１７４若しくはその断片、又は配列番号１７５若しくはその断片、又は配列番号１７６若しくはその断片、又は配列番号１７７若しくはその断片、又は配列番号１７８若しくはその断片、又は配列番号１７９若しくはその断片、又は配列番号１８０若しくはその断片、又は配列番号１８１若しくはその断片、又は配列番号１８２若しくはその断片、又は配列番号１８３若しくはその断片、又は配列番号１８４若しくはその断片、又は配列番号１８５若しくはその断片、又は配列番号１８６若しくはその断片、又は配列番号１８７若しくはその断片、又は配列番号１８８若しくはその断片、又は配列番号１８９若しくはその断片、又は配列番号１９０若しくはその断片、又は配列番号１９１若しくはその断片、又は配列番号１９２若しくはその断片、又は配列番号１９３若しくはその断片、又は配列番号１９４若しくはその断片、又は配列番号１９５若しくはその断片、又は配列番号１９６若しくはその断片、又は配列番号１９７若しくはその断片、又は配列番号１９８若しくはその断片、又は配列番号１９９若しくはその断片、又は配列番号２００若しくはその断片、又は配列番号２０１若しくはその断片、又は配列番号２０２若しくはその断片、又は配列番号２０３若しくはその断片、又は配列番号２０４若しくはその断片、又は配列番号２０５若しくはその断片、又は配列番号２０６若しくはその断片、又は配列番号２０７若しくはその断片、又は配列番号２０８若しくはその断片、又は配列番号２０９若しくはその断片、又は配列番号２１０若しくはその断片、又は配列番号２１１若しくはその断片、又は配列番号２１２若しくはその断片、又は配列番号２１３若しくはその断片、又は配列番号２１４若しくはその断片、又は配列番号２１５若しくはその断片、又は配列番号２１６若しくはその断片、又は配列番号２１７若しくはその断片、又は配列番号２１８若しくはその断片、又は配列番号２１９若しくはその断片、又は配列番号２２０若しくはその断片、又は配列番号２２１若しくはその断片、又は配列番号２２２若しくはその断片、又は配列番号２２３若しくはその断片、又は配列番号２２４若しくはその断片、又は配列番号２２５若しくはその断片、又は配列番号２２６若しくはその断片、又は配列番号２２７若しくはその断片、又は配列番号２２８若しくはその断片、又は配列番号２２９若しくはその断片、又は配列番号２３０若しくはその断片、又は配列番号２３１若しくはその断片、又は配列番号２３２若しくはその断片、又は配列番号２３３若しくはその断片、又は配列番号２３４若しくはその断片、又は配列番号２３５若しくはその断片、又は配列番号２３６若しくはその断片、又は配列番号２３７若しくはその断片、又は配列番号２３８若しくはその断片、又は配列番号２３９若しくはその断片、又は配列番号２４０若しくはその断片、又は配列番号２４１若しくはその断片、又は配列番号２４２若しくはその断片、又は配列番号２４３若しくはその断片、又は配列番号２４４若しくはその断片、又は配列番号２４５若しくはその断片、又は配列番号２４６若しくはその断片、又は配列番号２４７若しくはその断片、又は配列番号２４８若しくはその断片、又は配列番号２４９若しくはその断片、又は配列番号２５０若しくはその断片、又は配列番号２５１若しくはその断片、又は配列番号２５２若しくはその断片、又は配列番号２５３若しくはその断片、又は配列番号２５４若しくはその断片、又は配列番号２５５若しくはその断片、又は配列番号２５６若しくはその断片、又は配列番号２５７若しくはその断片、又は配列番号２５８若しくはその断片、又は配列番号２５９若しくはその断片、又は配列番号２６０若しくはその断片、又は配列番号２６１若しくはその断片、又は配列番号２６２若しくはその断片、又は配列番号２６３若しくはその断片、又は配列番号２６４若しくはその断片、又は配列番号２６５若しくはその断片、又は配列番号２６６若しくはその断片、又は配列番号２６７若しくはその断片、又は配列番号２６８若しくはその断片、又は配列番号２６９若しくはその断片、又は配列番号２７０若しくはその断片、又は配列番号２７１若しくはその断片、又は配列番号２７２若しくはその断片、又は配列番号２７３若しくはその断片、又は配列番号２７４若しくはその断片、又は配列番号２７５若しくはその断片、又は配列番号２７６若しくはその断片、又は配列番号２７７若しくはその断片、又は配列番号２７８若しくはその断片、又は配列番号２７９若しくはその断片、又は配列番号２８０若しくはその断片、又は配列番号２８１若しくはその断片、又は配列番号２８２若しくはその断片、又は配列番号２８３若しくはその断片、又は配列番号２８４若しくはその断片、又は配列番号２８５若しくはその断片、又は配列番号２８６若しくはその断片、又は配列番号２８７若しくはその断片、又は配列番号２８８若しくはその断片、又は配列番号２８９若しくはその断片、又は配列番号２９０若しくはその断片

、又は配列番号２９１若しくはその断片、又は配列番号２９２若しくはその断片、又は配列番号２９３若しくはその断片、又は配列番号２９４若しくはその断片、又は配列番号２９５若しくはその断片、又は配列番号２９６若しくはその断片、又は配列番号２９７若しくはその断片、又は配列番号２９８若しくはその断片、又は配列番号２９９若しくはその断片、又は配列番号３００若しくはその断片、又は配列番号３０１若しくはその断片、又は配列番号３０２若しくはその断片、又は配列番号３０３若しくはその断片、又は配列番号３０４若しくはその断片、又は配列番号３０５若しくはその断片、又は配列番号３０６若しくはその断片、又は配列番号３０７若しくはその断片、又は配列番号３０８若しくはその断片、又は配列番号３０９若しくはその断片、又は配列番号３１０若しくはその断片、又は配列番号３１１若しくはその断片、又は配列番号３１２若しくはその断片、又は配列番号３１３若しくはその断片、又は配列番号３１４若しくはその断片、又は配列番号３１５若しくはその断片、又は配列番号３１６若しくはその断片、又は配列番号３１７若しくはその断片、又は配列番号３１８若しくはその断片、又は配列番号３１９若しくはその断片、又は配列番号３２０若しくはその断片、又は配列番号３２１若しくはその断片、又は配列番号３２２若しくはその断片、又は配列番号３２３若しくはその断片、又は配列番号３２４若しくはその断片、又は配列番号３２５若しくはその断片、又は配列番号３２６若しくはその断片、又は配列番号３２７若しくはその断片、又は配列番号３２８若しくはその断片、又は配列番号３２９若しくはその断片、又は配列番号３３０若しくはその断片、又は配列番号３３１若しくはその断片、又は配列番号３３２若しくはその断片、又は配列番号３３３若しくはその断片、又は配列番号３３４若しくはその断片、又は配列番号３３５若しくはその断片、又は配列番号３３６若しくはその断片、又は配列番号３３７若しくはその断片、又は配列番号３３８若しくはその断片、又は配列番号３３９若しくはその断片、又は配列番号３４０若しくはその断片、又は配列番号３４１若しくはその断片、又は配列番号３４２若しくはその断片、又は配列番号３４３若しくはその断片、又は配列番号３４４若しくはその断片、又は配列番号３４５若しくはその断片、又は配列番号３４６若しくはその断片、又は配列番号３４７若しくはその断片、又は配列番号３４８若しくはその断片、又は配列番号３４９若しくはその断片、又は配列番号３５０若しくはその断片、又は配列番号３５１若しくはその断片、又は配列番号３５２若しくはその断片、又は配列番号３５３若しくはその断片、又は配列番号３５４若しくはその断片、又は配列番号３５５若しくはその断片、又は配列番号３５６若しくはその断片、又は配列番号３５７若しくはその断片、又は配列番号３５８若しくはその断片、又は配列番号３５９若しくはその断片、又は配列番号３６０若しくはその断片、又は配列番号３６１若しくはその断片、又は配列番号３６２若しくはその断片、又は配列番号３６３若しくはその断片、又は配列番号３６４若しくはその断片、又は配列番号３６５若しくはその断片、又は配列番号３６６若しくはその断片、又は配列番号３６７若しくはその断片、又は配列番号３６８若しくはその断片、又は配列番号３６９若しくはその断片、又は配列番号３７０若しくはその断片、又は配列番号３７１若しくはその断片、又は配列番号３７２若しくはその断片、又は配列番号３７３若しくはその断片、又は配列番号３７４若しくはその断片、又は配列番号３７５若しくはその断片、又は配列番号３７６若しくはその断片、又は配列番号３７７若しくはその断片、又は配列番号３７８若しくはその断片、又は配列番号３７９若しくはその断片、又は配列番号３８０若しくはその断片、又は配列番号３８１若しくはその断片、又は配列番号３８２若しくはその断片、又は配列番号３８３若しくはその断片、又は配列番号３８４若しくはその断片、又は配列番号３８５若しくはその断片、又は配列番号３８６若しくはその断片、又は配列番号３８７若しくはその断片、又は配列番号３８８若しくはその断片、又は配列番号３８９若しくはその断片、又は配列番号３９０若しくはその断片、又は配列番号３９１若しくはその断片、又は配列番号３９２若しくはその断片、又は配列番号３９３若しくはその断片、又は配列番号３９４若しくはその断片、又は配列番号３９５若しくはその断片、又は配列番号３９６若しくはその断片、又は配列番号３９７若しくはその断片、又は配列番号３９８若しくはその断片、又は配列番号３９９若しくはその断片、又は配列番号４００若しくはその断片、又は配列番号４０１若しくはその断片、又は配列番号４０２若しくはその断片、又は配列番号４０３若しくはその断片、又は配列番号４０４若しくはその断片、又は配列番号４０５若しくはその断片、又は配列番号４０６若しくはその断片、又は配列番号４０７若しくはその断片、又は配列番号４０８若しくはその断片、又は配列番号４０９若しくはその断片、又は配列番号４１０若しくはその断片、又は配列番号４１１若しくはその断片、又は配列番号４１２若しくはその断片、又は配列番号４１３若しくはその断片、又は配列番号４１４若しくはその断片、又は配列番号４１５若しくはその断片、又は配列番号４１６若しくはその断片、又は配列番号４１７若しくはその断片、又は配列番号４１８若しくはその断片、又は配列番号４１９若しくはその断片、又は配列番号４２０若しくはその断片、又は配列番号４２１若しくはその断片、又は配列番号４２２若しくはその断片、又は配列番号４２３若しくはその断片、又は配列番号４２４若しくはその断片、又は配列番号４２５若しくはその断片、又は配列番号４２６若しくはその断片、又は配列番号４２７若しくはその断片、又は配列番号４２８若しくはその断片、又は配列番号４２９若しくはその断片、又は配列番号４３０若しくはその断片、又は配列番号４３１若しくはその断片、又は配列番号４３２若しくはその断片、又は配列番号４３３若しくはその断片、又は配列番号４３４若しくはその断片、又は配列番号４３５若しくはその断片、又は配列番号４３６若しくはその断片、又は配列番号４３７若しくはその断片、又は配列番号４３８若しくはその断片、又は配列番号４３９若しくはその断片、又は配列番号４４０若しくはその断片、又は配列番号４４１若しくはその断片、又は配列番号４４２若しくはその断片、又は配列番号４４３若しくはその断片、又は配列番号４４４若しくはその断片、又は配列番号４４５若しくはその断片、又は配列番号４４６若しくはその断片、又は配列番号４４７若しくはその断片、又は配列番号４４８若しくはその断片、又は配列番号４４９若しくはその断片、又は配列番号４５０若しくはその断片、又は配列番号４５１若しくはその断片である、実施形態２１９～２２８のいずれかの方法。
２３０．ｔＲＮＡエフェクター分子（ＴＲＥＭ）を作製する方法であって、合成方法（例えば、固相合成又は液相合成を用いて合成される）又はインビトロ転写（ＩＶＴ）を含む方法。
２３１．ｔＲＮＡエフェクター分子（ＴＲＥＭ）を作製する方法であって、
（ａ）ＴＲＥＭを発現するのに十分な条件下で、ＴＲＥＭをコードする外在性核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む宿主細胞を提供すること及び
（ｂ）ＴＲＥＭを含む組成物を生成するために宿主細胞培養物から発現されたＴＲＥＭを精製し、それによりＴＲＥＭを含む組成物を作製すること、
を含む方法。
２３２．ＴＲＥＭを含む組成物が、ＴＲＥＭ断片、例えば、本明細書に記載のものを含む、実施形態２３０又は２３１の方法。
２３３．ＴＲＥＭ断片が、宿主細胞中でインビボで生成される、実施形態２３２の方法。
２３４．ＴＲＥＭ断片が、発現されたＴＲＥＭを細胞によるＴＲＥＭの生成後に断片化することによって生成される、例えば、宿主細胞によって生成されたＴＲＥＭが、宿主細胞からの放出又は精製後に断片化される、例えば、ＴＲＥＭが、エクスビボで断片化される、実施形態２３２又は２３３の方法。
２３５．方法が、例えば、参照細胞、例えば、ＴＲＥＭを発現するように操作されていないか又は改変されていない同様の細胞と比較して、増加、例えば、宿主細胞中の全内在性ｔＲＮＡ及びＴＲＥＭの生成における少なくとも２．２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２０倍の増加（例えば、実施例１～３又は７～１１のいずれかに記載されるアッセイによって測定されるとおり）をもたらす、実施形態２３０～２３４のいずれかの方法。
２３６．方法が、ＴＲＥＭ生成及び／又はｔＲＮＡ生成の２．２～２０倍、２．２～１５倍、２．２～１０倍、２．２～９倍、２．２～８倍、２．２～７倍、２．２～６倍、２．２～５倍、２．２～４倍、２．２～３倍、２．２～２．５倍、２．５～２０倍、３～２０倍、４～２０倍、５～２０倍、６～２０倍、７～２０倍、８～２０倍、９～２０倍、１０～２０倍又は１５～２０倍の増加をもたらす、実施形態２３５の方法。
２３７ 方法が、例えば、実施例１～３又は７～１１のいずれかに記載されるアッセイによって測定されるとおり、宿主細胞中において検出可能なレベルのＴＲＥＭをもたらす、実施形態２３０～２３６のいずれかの方法。
２３８．宿主細胞が、ＴＲＥＭの転写後修飾の能力がある、実施形態２３０～２３７のいずれかの方法。
２３９．宿主細胞が、ＴＲＥＭの転写後修飾、例えば、表３から選択される転写後修飾の能力がある、実施形態２３０～２３８のいずれかの方法。
２４０．宿主細胞が、ＴＲＥＭの転写後修飾、例えば、表３から選択される転写後修飾を提供するその能力を調節する、例えば、増加させるように改変されている、例えば、宿主細胞が、遺伝子、例えば、表３からの酵素をコードする遺伝子又はヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性又はリボヌクレアーゼ活性）を有する酵素をコードする遺伝子、例えば又はダイサー、アンジオゲニン、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＰ、ＲＮａｓｅＺ、Ｒｎｙ１若しくはＰｒｒＣのうちの１つ以上の発現の増加又は減少を可能にするように改変されている、実施形態２３０～２３９のいずれかの方法。
２４１．宿主細胞が、ＴＲＥＭの転写後修飾、例えば、表３から選択される転写後修飾の能力がある哺乳動物細胞である、実施形態２３０～２４０のいずれか１つの方法。
２４２．宿主細胞が、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＴ－１０８０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＣＡＰ細胞又はＨｕＨ－７細胞を含む、実施形態２３０～２４１のいずれかの方法。
２４３．宿主細胞が、癌遺伝子、例えば、Ｒａｓ、ｃ－ｍｙｃ又はｃ－ｊｕｎの発現の増加を有する、実施形態２３０～２４２のいずれかの方法。
２４４．宿主細胞が、腫瘍抑制因子、例えば、ｐ５３又はＲｂの発現の減少を有する、実施形態２３０～２４３のいずれかの方法。
２４５．宿主細胞が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ）の発現の増加を有する、実施形態２３０～２４４のいずれかの方法。
２４６．宿主細胞が非哺乳動物宿主細胞である、実施形態２３０～２４５のいずれかの方法。
２４７．宿主細胞が、細菌細胞、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞又は酵母細胞である、実施形態２３０～２４６のいずれかの方法。
２４８．ＴＲＥＭを含む組成物（又はＴＲＥＭを含む組成物の生成における中間体）の以下の特徴：
（ｉ）少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の純度；
（ｉｉ）０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ又は１００ｎｇ／ｍｌ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入；
（ｉｉｉ）ＴＲＥＭを含む組成物の１ミリグラム（ｍｇ）当たり０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ又は１００ｎｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入；
（ｉｖ）１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ又は１００ｎｇ／ｍｌ未満のＤＮＡ、例えば、宿主細胞ＤＮＡ；
（ｖ）０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％ ９％又は１０％未満の断片；
（ｖｉ）例えば、リムルス・アメボサイト（Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ）ライセート（ＬＡＬ）試験によって測定されるとおりの内毒素の低レベル又は欠如；
（ｖｉｉ）例えば、実施例１４に記載されるアッセイによって測定されるとおりのインビトロ翻訳活性；
（ｖｉｉｉ）少なくとも０．１、ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、０．１ｕｇ／ｍＬ、０．５ｕｇ／ｍＬ、１ｕｇ／ｍＬ、２ｕｇ／ｍＬ、５ｕｇ／ｍＬ、１０ｕｇ／ｍＬ、２０ｕｇ／ｍＬ、３０ｕｇ／ｍＬ、４０ｕｇ／ｍＬ、５０ｕｇ／ｍＬ、６０ｕｇ／ｍＬ、７０ｕｇ／ｍＬ、８０ｕｇ／ｍＬ、１００ｕｇ／ｍＬ、２００ｕｇ／ｍＬ、３００ｕｇ／ｍＬ、５００ｕｇ／ｍＬ、１０００ｕｇ／ｍＬ、５０００ｕｇ／ｍＬ、１０，０００ｕｇ／ｍＬ又は１００，０００ｕｇ／ｍＬのＴＲＥＭ濃度；
（ｉｘ）例えば、無菌製剤に関するｃＧＭＰガイドラインに従う無菌性であって、例えば、組成物又は調製物は、無菌的条件下で試験された場合に１００未満の生存可能な微生物の増殖を裏付け、組成物又は調製物は、ＵＳＰ＜７１＞の規格を満たし及び／又は組成物又は調製物は、ＵＳＰ＜８５＞の規格を満たす、無菌性；又は
（ｘ）例えば、組成物又は調製物は、ウイルス混入の欠如又は検出不可能なレベルのウイルス混入を有する、ウイルス混入
のうちの１つ以上を測定することをさらに含む、実施形態２３０～２４７のいずれかの方法。
２４９．測定値を参照値又は規格と比較することをさらに含む、実施形態２４８の方法。
２５０．比較に応じて、ＴＲＥＭを含む組成物を調節して、
（ｉ）組成物の純度を増大させるか；
（ｉｉ）組成物中のＨＣＰの量を減少させるか；
（ｉｉｉ）組成物中のＤＮＡの量を減少させるか；
（ｉｖ）組成物中の断片の量を減少させるか；
（ｖ）組成物中の内毒素の量を減少させるか；
（ｖｉ）組成物のインビトロ翻訳活性を増大させるか；
（ｖｉｉ）組成物のＴＲＥＭ濃度を増大させるか；又は
（ｖｉｉｉ）組成物の無菌性を増大させること
をさらに含む、実施形態２４９の方法。
２５１．ＴＲＥＭが、バイオリアクター中で培養された宿主細胞から精製された、実施形態２３０～２５０のいずれかのＴＲＥＭ。
２５２．
（ｉ）少なくとも１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３又は１×１０１４個の宿主細胞を含むか；
（ｉｉ）１００ｍＬ～１００リットルの培養培地、例えば、少なくとも１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル又は１００リットルの培養培地を含むか；
（ｉｉｉ）バイオリアクターが、連続フローバイオリアクター、バッチプロセスバイオリアクター、灌流バイオリアクター及びフェドバッチバイオリアクターから選択されるか；又は
（ｉｖ）バイオリアクターが、ＴＲＥＭを発現するのに十分な条件下で保持される、
実施形態２５１のバイオリアクター。
２５３．ＴＲＥＭが、
（ｉ）制御領域配列；
（ｉｉ）修飾されたＴＲＥＭをコードする配列；
（ｉｉｉ）２種のＴＲＥＭをコードする配列；又は
（ｉｖ）ｔＲＮＡＭＥＴ配列以外の配列
を含む核酸配列によってコードされるか又はそれらから発現される、実施形態２３０～２５２のいずれかの方法。
２５４．核酸配列がプロモーター配列を含む、実施形態２５３の方法。
２５５．核酸配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）認識部位、例えば、Ｐｏｌ ＩＩＩ結合部位を含むプロモーター配列、例えば、Ｕ６プロモーター配列又はその断片を含む、実施形態２５３又は２５４の方法。
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、明細書及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
別途定義しない限り、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体として参照により組み込まれる。さらに、材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
［図１Ａ］パネルＡ：非ＳＮＰ対象のｍＲＮＡ及びタンパク質配列並びに内在性ｔＲＮＡプールを描く。第２のコドンの配列は、アミノ酸バリンをコードするＧＴＧ（白三角によって描かれる）である。２つのバリンイソアクセプターｔＲＮＡ種が示されている。２つのｔＲＮＡ種の各々は、異なるバリンコドンを認識する。２つの種は、異なる存在量を有する。野生型コドンＧＴＧを認識する種は、シェードされておらず、より高い存在量である。シェード種は、より低い存在量を有し、野生型コドンと対形成しない。そのため、使用コドン（ＧＴＧ）に対応するバリンイソアクセプターｔＲＮＡ種は豊富である。［図１Ｂ］パネルＢ：描かれたｍＲＮＡ配列中の第２のコドンの第３の位置（黒三角で示される）に単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を有する対象のｍＲＮＡ及びタンパク質配列並びに内在性ｔＲＮＡプールを描く。内在性ｔＲＮＡプールの組成は、図１パネルＡに対して記載されたものと同一である。しかしながら、第２のコドンのバリンの取り込みは、ここでは、それほど豊富でないｔＲＮＡ種（シェード種）の使用に依存する。結果として、図１パネルＢに示されるように、翻訳は損なわれる。また、それほど豊富でないｔＲＮＡ種を使用する他の結果は、例えば、ペプチド鎖の伸長の中断、より低いタンパク質生成、タンパク質ミスフォールディング、タンパク質誤局在化、改変タンパク質機能又は改変ｍＲＮＡ転写物安定性であり得る。［図１Ｃ］パネルＣ：第２のコドンの第３の位置にＳＮＰを含む図１パネルＢと同一なｍＲＮＡ配列を描く。プールの内在性ｔＲＮＡは、パネルＡ及びＢと同一であるが、プールは、ＳＮＰコドンと対形成する種の存在量を増加させる外在性ＴＲＥＭが補充されている。これによってｍＲＮＡの翻訳の改善をもたらすことができるようになる。 ［図２Ａ］パネルＡ：非ＳＮＰ対象のｍＲＮＡ及びタンパク質配列並びに内在性ｔＲＮＡプールを描く。第２のコドンの配列は、アミノ酸バリンをコードするＧＴＧ（白三角によって描かれる）である。２つのバリンイソアクセプターｔＲＮＡ種が示されている。２つのｔＲＮＡ種の各々は、異なるバリンコドンを認識する。２つの種は、異なる存在量を有する。野生型コドンＧＴＧを認識する種は、シェードされておらず、より高い存在量である。シェード種は、より低い存在量を有し、野生型コドンと対形成しない。そのため、使用コドン（ＧＴＧ）に対応するバリンイソアクセプターｔＲＮＡ種は豊富である。これによって、描かれるように対応するタンパク質へのｍＲＮＡ配列の翻訳がもたらされる。［図２Ｂ］パネルＢ：描かれたｍＲＮＡ配列中の第２のコドンの第３の位置（黒三角で示される）に単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を有する対象のｍＲＮＡ及びタンパク質配列並びに内在性ｔＲＮＡプールを描く。内在性ｔＲＮＡプールの組成は、図１パネルＡに対して記載されたものと同一である。しかしながら、第２のコドンのバリンの取り込みは、ここでは、それほど豊富でないｔＲＮＡ種（シェード種）の使用に依存する。結果として、図２パネルＢに示されるように、対応するタンパク質へのｍＲＮＡ配列の翻訳は損なわれる。［図２Ｃ］パネルＣ：第２のコドンの第３の位置（黒三角で示される）にＳＮＰを含む図２パネルＢと同一なｍＲＮＡ配列を描く。プールの内在性ｔＲＮＡは、パネルＡ及びＢと同一であるが、プールは、ＳＮＰコドンと対形成する種の存在量を増加させる外在性ＴＲＥＭが補充されている。結果として、対応するタンパク質へのｍＲＮＡ配列の翻訳は損なわれず、非ＳＮＰ対象のものに類似している。 上端行：非ＳＮＰ対象の内在性ｔＲＮＡプール並びに右に移動してｍＲＮＡ及びタンパク質配列を描く。第２のコドンの配列は、アミノ酸バリンをコードするＧＴＧ（白三角によって描かれる）である。２つのバリンイソアクセプターｔＲＮＡ種が示されている。２つのｔＲＮＡ種の各々は、異なるバリンコドンを認識する。２つの種は、異なる存在量を有する。野生型コドンＧＴＧを認識する種は、シェードされておらず、より高い存在量である。シェード種は、より低い存在量を有し、野生型コドンと対形成しない。そのため、使用コドン（ＧＴＧ）に対応するバリンイソアクセプターｔＲＮＡ種は豊富である。これによって、描かれるように対応するタンパク質へのｍＲＮＡ配列の翻訳がもたらされる。より豊富なｔＲＮＡ種を使用することはまた、転写物安定性、タンパク質発現、タンパク質機能、タンパク質フォールディング又はタンパク質局在化に影響を及ぼし得る。中間行：描かれたｍＲＮＡ配列中の第２のコドンの第３の位置（黒三角で示される）に単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を有する対象の内在性ｔＲＮＡプール並びにｍＲＮＡ及びタンパク質配列を描く。内在性ｔＲＮＡプールの組成は、図３上端行に対して記載されたものと同一である。しかしながら、第２のコドンのバリンの取り込みは、ここでは、それほど豊富でないｔＲＮＡ種（シェード種）の使用に依存する。結果として、図３中間行に示されるように、対応するタンパク質へのｍＲＮＡ配列の翻訳は損なわれる。それほど豊富でないｔＲＮＡ種を使用することまた、転写物安定性の低減、タンパク質発現の低減、タンパク質機能の変化、タンパク質フォールディングの変化又はタンパク質局在化の変化をもたらし得る。下端行：第２のコドンの第３の位置（黒三角で示される）にＳＮＰを含む図３中間行と同一なｍＲＮＡ配列を描く。プールの内在性ｔＲＮＡは、上端行及び中間行と同一であるが、プールは、ＳＮＰコドンと対形成するできる種の存在量を増加させる外在性ＴＲＥＭが補充されている。結果として、対応するタンパク質へのｍＲＮＡ配列の翻訳は損なわれない。 開始メチオニン（ｉＭｅｔ）に対応するＴＲＥＭによるトランスフェクション後の３つの細胞株における細胞増殖の増大を示すグラフである。図４Ａは、Ｃｙ３－標識ｉＭｅｔ－ＣＡＴ－ＴＲＥＭでトランスフェクトされたか又はＣｙ３－標識非タグ化対照でトランスフェクトされたＵ２０Ｓ細胞の％細胞培養密度（細胞増殖の尺度）の増大を示すグラフである。図４Ｂは、Ｃｙ３－標識ｉＭｅｔ－ＣＡＴ－ＴＲＥＭでトランスフェクトされたか又はＣｙ３－標識非タグ化対照でトランスフェクトされたＨ１２９９細胞の％細胞培養密度（細胞増殖の尺度）の増大を示すグラフである。図４Ｃは、Ｃｙ３－標識ｉＭｅｔ－ＣＡＴ－ＴＲＥＭでトランスフェクトされたか又はＣｙ３－標識非タグ化対照でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞の％細胞培養密度（細胞増殖の尺度）の増大を示すグラフである。 無細胞ライセートを伴う翻訳反応へのｉＭＥＴ－ＴＲＥＭの添加時のＮａｎｏＬｕｃレポーター発現の増加を示すグラフである。対照として、緩衝液を伴う翻訳反応が実施された。
本開示は、とくに、細胞中又は対象中のｔＲＮＡプールを調節するためのｔＲＮＡベースエフェクター分子（ＴＲＥＭ）の使用方法を特徴とする。また、本明細書で開示されるのは、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物を投与することによって、障害の治療又は障害の症状の寛解を行う方法である。本明細書で開示されるように、ｔＲＮＡベースエフェクター分子（ＴＲＥＭ）は、様々な細胞プロセスを媒介できる複合体分子である。ＴＲＥＭを含む医薬組成物は、こうした機能を調節するために、細胞、組織又は対象に投与することができる。
定義
「取得する」又は「取得すること」は、それらの用語が本明細書で使用される場合、物理的要素又は値を「直接取得すること」又は「間接取得すること」により、値、例えば、数値の所有を得ることを指す。「直接取得すること」は、値を得るためにプロセスを実施すること（例えば、分析方法を実施すること）を指す。「間接取得すること」は、別のパーティー又はソース（例えば、その値を直接取得したサードパーティー検査機関）から値を受け取ることを指す。
「同族アダプター機能ＴＲＥＭ」は、その用語が本明細書で使用される場合、ＴＲＥＭのアンチコドンと天然で結合されるＡＡ（同族ＡＡ）による開始又は伸長を媒介するＴＲＥＭを指す。
「発現の減少」は、その用語が本明細書で使用される場合、参照と比較した減少を指し、例えば、対照領域の改変、又は薬剤の添加が、対象産物の発現の減少をもたらす場合、それが改変又は添加を伴わない他の同様の細胞と比較して減少される。
「外来核酸」は、その用語が本明細書で使用される場合、参照細胞、例えば、外来核酸が導入される細胞における最も近い配列中に存在しないか、又はそれから少なくとも１つのヌクレオチドが異なる核酸配列を指す。ある実施形態では、外来核酸は、ＴＲＥＭをコードする核酸を含む。
「外来ＴＲＥＭ」は、その用語が本明細書で使用される場合、
（ａ）参照細胞、例えば、外来核酸が導入される細胞における最も近い配列のｔＲＮＡから少なくとも１つのヌクレオチド又は１つの転写後修飾が異なるか；
（ｂ）それが転写された細胞以外の細胞に導入されているか；
（ｃ）それが天然に存在するもの以外の細胞において存在するか；又は
（ｄ）野生型ではない発現プロファイル、例えば、レベル又は分布を有する（例えば、それが野生型より高いレベルで発現される）ＴＲＥＭを指す。ある実施形態では、発現プロファイルは、発現を調節する核酸に導入される変化又はＲＮＡ分子の発現を調節する薬剤の添加によって媒介され得る。ある実施形態では、外来ＴＲＥＭは、特性（ａ）～（ｄ）のうちの１、２、３又は４つを含む。
「ＧＭＰ－グレード組成物」は、その用語が本明細書で使用される場合、現行の優良医薬品製造基準（ｃＧＭＰ）ガイドライン、又は他の同様の要件に従う組成物を指す。ある実施形態では、ＧＭＰ－グレード組成物は、医薬品として使用され得る。
本明細書で使用する場合、用語「増加」及び「減少」は、それぞれ参照に対して機能、発現、又は活性の特定の指標の量の増加又は減少をもたらす調節を指す。例えば、本明細書に記載されるＴＲＥＭの細胞、組織又は対象への投与の後、本明細書に記載されるとおりの指標のマーカー（例えば、タンパク質翻訳、ｍＲＮＡ安定性、タンパク質フォールディング）の量は、投与の前のマーカーの量に対して又は陰性対照薬剤の影響に対して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％、２Ｘ、３Ｘ、５Ｘ、１０Ｘ以上増加され得るか又は減少され得る。指標は、投与の後に投与が列挙された影響を有した時点で、例えば、治療が開始されてから少なくとも１２時間後、２４時間後、１週間後、１ヶ月後、３ヶ月後、又は６ヶ月後に測定され得る。
「発現の増加」は、その用語が本明細書で使用される場合、参照と比較した増加を指し、例えば、対照領域の改変、又は薬剤の添加が、対象産物の発現の増加をもたらす場合、それが改変又は添加を伴わない他の同様の細胞と比較して増加される。
「イソアクセプター」は、その用語が本明細書で使用される場合、複数のｔＲＮＡ分子又はＴＲＥＭを指し、この場合、複数の各分子は、異なる天然に存在するアンチコドン配列を含み、複数の各分子は、同一なアミノ酸の取り込みを媒介し、及びそのアミノ酸は、天然で複数のアンチコドンに対応するアミノ酸である。
「非同族アダプター機能ＴＲＥＭ」は、その用語が本明細書で使用される場合、ＴＲＥＭのアンチコドンと天然で結合されるＡＡ以外のＡＡ（非同族ＡＡ）による開始又は伸長を媒介するＴＲＥＭを指す。ある実施形態では、非同族アダプター機能ＴＲＥＭはまた、誤負荷ＴＲＥＭ（ｍＴＲＥＭ）とも呼ばれる。
「癌遺伝子」は、その用語が本明細書で使用される場合、細胞運命の決定、細胞生存及びゲノム維持を含む１つ以上の細胞プロセスを調節する遺伝子を指す。ある実施形態では、癌遺伝子は、それが存在する細胞に選択的な増殖優位性、例えば、調節解除、例えば、遺伝的調節解除（例えば、変異又は増幅）又は後成的調節解除をもたらす。例示的な癌遺伝子としては、Ｍｙｃ（例えば、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ又はＬ－Ｍｙｃ）、ｃ－Ｊｕｎ、Ｗｎｔ、又はＲＡＳが挙げられる。
「医薬組成物」は、その用語が本明細書で使用される場合、医薬としての使用に好適な組成物を指す。通常、医薬組成物は、医薬賦形剤を含む。ある実施形態では、医薬組成物はＴＲＥＭを含み得る（ＴＲＥＭを含む医薬組成物）。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、ＴＲＥＭを含む医薬組成物における唯一の活性成分であろう。実施形態において、ＴＲＥＭを含む医薬組成物、例えば、医薬組成物は、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、例えば、宿主細胞ＤＮＡ、内毒素及び細菌を含まないか、実質的に含まないか又は薬学的に許容される量未満でそれらを有する。ある実施形態では、医薬組成物、例えば、ＴＲＥＭを含む医薬組成物は、現行の優良製造基準（ｃＧＭＰ）ガイドライン又は他の同様の要件に従うＧＭＰグレード組成物である。ある実施形態では、医薬組成物、例えば、ＴＲＥＭを含む医薬組成物は、無菌性であり、例えば、組成物又は調製物は、無菌的条件下で試験された場合に１００未満の生存可能な微生物の増殖を裏付け、組成物又は調製物は、ＵＳＰ＜７１＞の規格を満たし、及び／又は組成物又は調製物は、ＵＳＰ＜８５＞の規格を満たす。
「転写後プロセシング」は、対象分子、例えば、ＴＲＥＭ、ＲＮＡ又はｔＲＮＡに関してその用語が本明細書で使用される場合、対象分子の共有結合性の修飾を指す。ある実施形態では、共有結合性の修飾は、転写後に起こる。ある実施形態では、共有結合性の修飾は、転写と同時に起こる。ある実施形態では、修飾は、インビボで、例えば、ＴＲＥＭを生成するために使用される細胞中でなされる。ある実施形態では、修飾は、エクスビボでなされ、例えば、それは、ＴＲＥＭを生成した細胞から単離されたか又は得られたＴＲＥＭに対してなされる。ある実施形態では、転写後修飾は、表３に列挙される転写後修飾から選択される。
「組換えＴＲＥＭ」は、その用語が本明細書で使用される場合、ヒトの介入によって修飾された細胞であって、ＴＲＥＭの生成を媒介する修飾（例えば、細胞は、ＴＲＥＭをコードする外来配列を含む）、又は発現、例えば、ＴＲＥＭの転写発現又は転写後修飾を媒介する修飾を有する細胞中で発現されたＴＲＥＭを指す。組換えＴＲＥＭは、参照ｔＲＮＡ、例えば、天然ｔＲＮＡと同じ、又は異なる配列、転写後修飾のセット、若しくは三次構造を有し得る。
「合成ＴＲＥＭ」は、その用語が本明細書で使用される場合、ＴＲＥＭをコードする内在性核酸を有する細胞以外で、例えば、無細胞固相合成によって合成されたＴＲＥＭを指す。合成ＴＲＥＭは、天然ｔＲＮＡと同じ、又は異なる配列、転写後修飾のセット、若しくは三次構造を有し得る。
「異種細胞において発現されたＴＲＥＭ」は、その用語が本明細書で使用される場合、非天然条件下で作製されたＴＲＥＭを指す。例えば、ｉ）天然に存在する細胞から、例えば、遺伝的に、代謝的に異なる（例えば、異なるプロファイルの遺伝子発現を有するか又は異なるレベルの細胞成分、例えば、吸収される栄養分を有する）、又は後成的に異なる細胞において作製されるか；ｉｉ）天然の条件（天然の条件は、細胞が天然でｔＲＮＡを作製する条件である）と異なる条件、例えば、栄養、ｐＨ、温度、細胞密度、又はストレス条件下で培養される細胞において作製されるか；又はｉｉｉ）参照と異なるレベル、比率、若しくは濃度、又は区画若しくは位置に局在させられた、例えば、天然条件下で起こるものと異なるレベル、比率、若しくは濃度、又は区画若しくは位置に局在させられた細胞において作製されるＴＲＥＭ。異種細胞において発現されるＴＲＥＭは、天然ｔＲＮＡと同じ、又は異なる配列、転写後修飾のセット、若しくは三次構造を有し得る。
「ｔＲＮＡ」は、その用語が本明細書で使用される場合、その天然の状態において天然に存在する転移リボ核酸を指す。
「ｔＲＮＡ系エフェクター分子」又は「ＴＲＥＭ」は、その用語が本明細書で使用される場合、下の（ａ）～（ｖ）の構造又は特性を含むＲＮＡ分子を指し、これは、組換えＴＲＥＭ、合成ＴＲＥＭ、又は異種細胞から発現されるＴＲＥＭである。ＴＲＥＭは、（ａ）～（ｖ）のうちの複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９）の構造及び機能を有し得る。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、天然に存在するｔＲＮＡや本明細書に記載されるｔＲＮＡなどのように、アンチコドンを含み、及びアミノ酸を受け入れて、ポリペプチド鎖へのアミノ酸の取り込みを媒介することができる。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、構造又はそれが作製された方法によって評価されるとおり、非天然である。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、以下の構造又は特性のうちの１つ以上を含む：
（ａ）アミノ酸に結合するアミノ酸結合ドメイン、例えば、アクセプターステムドメイン（ＡＳｔＤ）（ＡＳｔＤは、例えば、他の野生型ｔＲＮＡ中に存在するとき、アミノ酸、例えば、その同族アミノ酸又は非同族アミノ酸の受け入れ及びポリペプチド鎖の開始又は伸長におけるアミノ酸（ＡＡ）の転移を媒介するのに十分なＲＮＡ配列を含む）。通常、ＡＳｔＤは、シンテターゼ認識の一部であるアクセプターステム負荷のための３’末端アデノシン（ＣＣＡ）を含む。ある実施形態では、ＡＳｔＤは、天然に存在するＡＳｔＤ、例えば、表２における核酸によってコードされるＡＳｔＤと少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、又は１００％の同一性を有する。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、ＡＳｔＤ、例えば、表２における核酸によってコードされるＡＳｔＤの断片又は類似体を含んでもよく、実施形態における断片はＡＳｔＤ活性を有し、他の実施形態においてはＡＳｔＤ活性を有しない。（当業者は、表２における核酸によってコードされる配列に由来する本明細書に記載されるドメイン、ステム、ループ、又は他の配列特徴のいずれかに関して適切に対応する配列を決定することができる。例えば、当業者は、表２における核酸によってコードされるｔＲＮＡ配列に由来するＡＳｔＤに対応する配列を決定することができる。）
（ｂ）ジヒドロウリジンヘアピンドメイン（ＤＨＤ）（ＤＨＤは、例えば、他の野生型ｔＲＮＡ中に存在するとき、アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼの認識を媒介する、例えば、ＴＲＥＭのアミノ酸負荷のためのアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼに関する認識部位として作用するのに十分なＲＮＡ配列を含む）。実施形態において、ＤＨＤは、ＴＲＥＭの三次構造の安定化を媒介する。ある実施形態では、ＤＨＤは、天然に存在するＤＨＤ、例えば、表２における核酸によってコードされるＤＨＤと少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、又は１００％の同一性を有する。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、ＤＨＤ、例えば、表２における核酸によってコードされるＤＨＤの断片又は類似体を含んでもよく、実施形態における断片はＤＨＤ活性を有し、他の実施形態においてはＤＨＤ活性を有しない。
（ｃ）ｍＲＮＡにおけるそれぞれのコドンに結合するアンチコドン、例えば、アンチコドンヘアピンドメイン（ＡＣＨＤ）（ＡＣＨＤは、例えば、他の野生型ｔＲＮＡ中に存在するとき、コドンとの対形成（ゆらぎを伴うか又は伴わない）を媒介するのに十分な配列、例えば、アンチコドントリプレットを含む；ある実施形態では、ＡＣＨＤは、天然に存在するＡＣＨＤ、例えば、表２における核酸によってコードされるＡＣＨＤと少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、又は１００％の同一性を有する）。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、ＡＣＨＤ、例えば、表２における核酸によってコードされるＡＣＨＤの断片又は類似体を含んでもよく、実施形態における断片はＡＣＨＤ活性を有し、他の実施形態においてはＡＣＨＤ活性を有しない。
（ｄ）可変ループドメイン（ＶＬＤ）（ＶＬＤは、例えば、他の野生型ｔＲＮＡ中に存在するとき、アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼの認識を媒介する、例えば、ＴＲＥＭのアミノ酸負荷のためのアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼに関する認識部位として作用するのに十分なＲＮＡ配列を含む）。実施形態において、ＶＬＤは、ＴＲＥＭの三次構造の安定化を媒介する。ある実施形態では、ＶＬＤは、例えば、その同族アミノ酸に関するＴＲＥＭの特異性を調節する、例えば、増大させる、例えば、ＶＬＤは、ＴＲＥＭの同族アダプター機能を調節する。ある実施形態では、ＶＬＤは、天然に存在するＶＬＤ、例えば、表２における核酸によってコードされるＶＬＤと少なくとも７５、８０、８５、８５、９０、９５、又は１００％の同一性を有する。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、ＶＬＤ、例えば、表２における核酸によってコードされるＶＬＤの断片又は類似体を含んでもよく、実施形態における断片はＶＬＤ活性を有し、他の実施形態においてはＶＬＤ活性を有しない。
（ｅ）チミンヘアピンドメイン（ＴＨＤ）（ＴＨＤは、例えば、他の野生型ｔＲＮＡ中に存在するとき、リボソームの認識を媒介する、例えば、翻訳中のＴＲＥＭ－リボソーム複合体を形成するためのリボソームに関する認識部位として作用するのに十分なＲＮＡ配列を含む）。ある実施形態では、ＴＨＤは、天然に存在するＴＨＤ、例えば、表２における核酸によってコードされるＴＨＤと少なくとも７５、８０、８５、８５、９０、９５、又は１００％の同一性を有する。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、ＴＨＤ、例えば、表２における核酸によってコードされるＴＨＤの断片又は類似体を含んでもよく、実施形態における断片はＴＨＤ活性を有し、他の実施形態においてはＴＨＤ活性を有しない。
（ｆ）生理的条件下で、それは、ステム構造及び１つ又は複数のループ構造、例えば、１、２、又は３つのループを含む。ループは、本明細書に記載されるドメイン、例えば、（ａ）～（ｅ）から選択されるドメインを含み得る。ループは、１つ又は複数のドメインを含み得る。ある実施形態では、ステム又はループ構造は、天然に存在するステム又はループ構造、例えば、表２における核酸によってコードされるステム又はループ構造と少なくとも７５、８０、８５、８５、９０、９５、又は１００％の同一性を有する。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、ステム又はループ構造、例えば、表２における核酸によってコードされるステム又はループ構造の断片又は類似体を含んでもよく、実施形態における断片は、ステム又はループ構造の活性を有し、他の実施形態においてはステム又はループ構造の活性を有しない；
（ｇ）三次構造、例えば、Ｌ型三次構造；
（ｈ）アダプター機能、すなわち、ＴＲＥＭは、アミノ酸、例えば、その同族アミノ酸の受け入れを媒介し、及びポリペプチド鎖の開始又は伸長におけるＡＡの転移を媒介する；
（ｉ）同族アダプター機能（ＴＲＥＭは、ポリペプチド鎖を開始するか又は伸長するＴＲＥＭのアンチコドンと天然で結合されるアミノ酸（例えば、同族アミノ酸）の受け入れ及び取り込みを媒介する）；
（ｊ）非同族アダプター機能（ＴＲＥＭは、ポリペプチド鎖の開始又は伸長においてＴＲＥＭのアンチコドンと天然で結合されるアミノ酸以外のアミノ酸（例えば、非同族アミノ酸）の受け入れ及び取り込みを媒介する）；
（ｋ）調節機能、例えば、後成的機能（例えば、遺伝子サイレンシング機能又はシグナル経路調節機能）、細胞運命調節機能、ｍＲＮＡ安定性調節機能、タンパク質安定性調節機能、タンパク質形質導入調節機能、又はタンパク質区画化機能；
（ｌ）リボソーム結合を可能にする構造；
（ｍ）転写後修飾（例えば、それは、表３の１つ以上の修飾、例えば、表３に列挙される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５種の修飾を含む）；
（ｎ）ｔＲＮＡの機能特性、例えば、ｔＲＮＡによって保有される特性（ｈ）～（ｋ）のいずれかを阻害する能力；
（ｏ）細胞運命を調節する能力；
（ｐ）リボソーム占有を調節する能力；
（ｑ）タンパク質翻訳を調節する能力；
（ｒ）ｍＲＮＡ安定性を調節する能力；
（ｓ）タンパク質フォールディング及び構造を調節する能力；
（ｔ）タンパク質形質導入又は区画化を調節する能力；
（ｕ）タンパク質安定性を調節する能力；
（ｖ）シグナル経路、例えば、細胞性シグナル経路を調節する能力。
（ｗ）アンチコドンは終止コドンと対形成しない、例えば、ＵＡＧ、ＵＡＡ又はＵＧＡ以外のものと対形成するアンチコドンである；又は
（ｘ）天然に存在するｔＲＮＡや本明細書に記載されるｔＲＮＡなどのように、アンチコドンを含み、及びアミノ酸を受け入れて、ポリペプチド鎖へのアミノ酸の取り込みを媒介することができる。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、全長ｔＲＮＡ分子又はその断片を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、次の特性：（ａ）～（ｅ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、次の特性：（ａ）及び（ｃ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、次の特性：（ａ）、（ｃ）及び（ｈ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、次の特性：（ａ）、（ｃ）、（ｈ）及び（ｂ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、次の特性：（ａ）、（ｃ）、（ｈ）及び（ｅ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、次の特性：（ａ）、（ｃ）、（ｈ）、（ｂ）及び（ｅ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、次の特性：（ａ）、（ｃ）、（ｈ）、（ｂ）、（ｅ）及び（ｇ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、次の特性：（ａ）、（ｃ）、（ｈ）及び（ｍ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、次の特性：（ａ）、（ｃ）、（ｈ）、（ｍ）及び（ｇ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、次の特性：（ａ）、（ｃ）、（ｈ）、（ｍ）及び（ｂ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、次の特性：（ａ）、（ｃ）、（ｈ）、（ｍ）及び（ｅ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、次の特性：（ａ）、（ｃ）、（ｈ）、（ｍ）、（ｇ）、（ｂ）及び（ｅ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、次の特性：（ａ）、（ｃ）、（ｈ）、（ｍ）、（ｇ）、（ｂ）、（ｅ）及び（ｑ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、
（ｉ）アミノ酸に結合するアミノ酸結合ドメイン（例えば、本明細書の（ａ）に記載されるとおりのＡＳｔＤ）；及び
（ｉｉ）ｍＲＮＡにおけるそれぞれのコドンに結合するアンチコドン（例えば、本明細書の（ｃ）に記載されるとおりのＡＣＨＤ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、（ｉ）～（ｉｉ）の共有結合を提供する可動性ＲＮＡリンカーを含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、タンパク質翻訳を媒介する。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、第１及び第２の構造又はドメインの間の共有結合を提供するリンカー、例えば、ＲＮＡリンカー、例えば、可動性ＲＮＡリンカーを含む。ある実施形態では、ＲＮＡリンカーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のリボヌクレオチドを含む。ＴＲＥＭは、１つ又は複数のリンカーを含んでもよく、例えば、実施形態において、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を含むＴＲＥＭは、第１及び第２のドメインの間の第１のリンカー、並びに第３のドメイン及び別のドメインの間の第２のリンカーを有してもよい。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、表２に列挙されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列、又はその断片若しくは機能性断片と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるか、又はそれから１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、又は３０個以下のリボヌクレオチドが異なるＲＮＡ配列を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、表２に列挙されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列、又はその断片若しくは機能性断片を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、表２に列挙されるＤＮＡ配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％同一なＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列、又はその断片若しくは機能性断片を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、表２に列挙されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡに対して少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％同一であるか又はそれから１、２、３、４、５、１０若しくは１５個以下のリボヌクレオチドが異なるＴＲＥＭドメイン、例えば、本明細書に記載されるドメイン又はそれらの断片若しくは機能性断片を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、表２に列挙されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列、又はその断片若しくは機能性断片を含むＴＲＥＭドメイン、例えば、本明細書に記載されるドメインを含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、表２に列挙されるＤＮＡ配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％同一なＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列、又はその断片若しくは機能性断片を含むＴＲＥＭドメイン、例えば、本明細書に記載されるドメインを含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、７６～９０ヌクレオチド長である。実施形態において、ＴＲＥＭ又はその断片若しくは機能性断片は、１０～９０ヌクレオチド、１０～８０ヌクレオチド、１０～７０ヌクレオチド、１０～６０ヌクレオチド、１０～５０ヌクレオチド、１０～４０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、２０～９０ヌクレオチド、２０～８０ヌクレオチド、２０～７０ヌクレオチド、２０～６０ヌクレオチド、２０～５０ヌクレオチド、２０～４０ヌクレオチド、３０～９０ヌクレオチド、３０～８０ヌクレオチド、３０～７０ヌクレオチド、３０～６０ヌクレオチド、又は３０～５０ヌクレオチドである。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、アミノアシル化され、例えば、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによってアミノ酸が負荷される。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、アミノ酸が負荷されず、例えば、未負荷ＴＲＥＭ（ｕＴＲＥＭ）である。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、全長より短いｔＲＮＡを含む。実施形態において、ＴＲＥＭは、ｔＲＮＡの天然に存在する断片、又は天然に存在しない断片に対応し得る。例示的な断片としては、ＴＲＥＭ半分（例えば、ＡＣＨＤ、例えば、アンチコドン配列における切断に由来する、例えば、５’半分又は３’半分）；５’断片（例えば、ＤＨＤ又はＡＣＨＤにおける切断に由来する、例えば、５’末端を含む断片）；３’断片（例えば、ＴＨＤにおける切断に由来する、例えば、３’末端を含む断片）；又は内部断片（例えば、ＡＣＨＤ、ＤＨＤ又はＴＨＤの１つ以上における切断に由来する）が挙げられる。
「ＴＲＥＭを含む組成物」は、その用語が本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるＴＲＥＭを含む組成物を指す。ＴＲＥＭを含む組成物は、１種以上のＴＲＥＭを含み得る。ある実施形態では、組成物は、単一種のＴＲＥＭのみを含む。ある実施形態では、組成物は、第１のＴＲＥＭ種及び第２のＴＲＥＭ種を含む。例として、ある実施形態では、第１の種及び第２の種は、イソアクセプターであるが、互いに異なる配列を有する。ある実施形態では、組成物は、第１のアミノ酸、例えば、アラニンの取り込みを媒介する第１の種及び第２のアミノ酸、例えば、リシンの取り込みを媒介する第２の種を含むことができる。ある実施形態では、組成物は、ＸのＴＲＥＭ種を含む（Ｘ＝２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、表２における核酸によってコードされる配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、若しくは９５、又は１００％の同一性を有する。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、細胞培養物から精製される。ある実施形態では、ＴＲＥＭが精製される細胞培養物は、少なくとも１×１０７個の宿主細胞、１×１０８個の宿主細胞、１×１０９個の宿主細胞、１×１０１０個の宿主細胞、１×１０１１個の宿主細胞、１×１０１２個の宿主細胞、１×１０１３個の宿主細胞、又は１×１０１４個の宿主細胞を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５又は９９％の乾燥重量ＴＲＥＭである（液体組成物に関して、乾燥重量は、実質的に全ての液体の除去後、例えば、凍結乾燥後の重量を指す）。ある実施形態では、組成物は、液体である。ある実施形態では、組成物は、乾性、例えば、凍結乾燥物質である。ある実施形態では、組成物は、凍結された組成物である。ある実施形態では、組成物は、無菌である。ある実施形態では、組成物は、無菌性であり、例えば、組成物は、無菌的条件下で試験された場合に１００未満の生存可能な微生物の増殖を裏付け、組成物又は調製物は、ＵＳＰ＜７１＞の規格を満たし、及び／又は組成物又は調製物は、ＵＳＰ＜８５＞の規格を満たす。ある実施形態では、組成物は、少なくとも０．５ｇ、１．０ｇ、５０ｇ、１０ｇ、１５ｇ、２５ｇ、５０ｇ、１００ｇ、２００ｇ、４００ｇ又は５００ｇ（例えば、乾燥重量により決定された場合）のＴＲＥＭを含む。
「ｔＲＮＡプール」は、その用語が本明細書で使用される場合、ｔＲＮＡとして機能できる全ての種、例えば、内在性ｔＲＮＡ及びＴＲＥＭＳのプールを指す。ＴＲＥＭが投与されていない細胞又は対象の内在性ｔＲＮＡプールは、内在性ｔＲＮＡのみを含む。ＴＲＥＭは、内在性ｔＲＮＡのみを含むｔＲＮＡプールを調節するために添加することができるが、以前に投与されたＴＲＥＭを含むｔＲＮＡプールを有する細胞又は対象にも投与することができる。ある実施形態では、細胞又は対象に投与されるＴＲＥＭは、特定アンチコドンに天然で結合するアミノ酸（同族アミノ酸）を取り込むことにより、開始又は伸長を媒介する。ある実施形態では、投与されるＴＲＥＭは、終止コドン以外のアンチコドンを有する。
「腫瘍抑制因子」は、その用語が本明細書で使用される場合、細胞運命の決定、細胞生存及びゲノム維持を含む１つ以上の細胞プロセスを調節する遺伝子を指す。ある実施形態では、腫瘍抑制因子は、それが調節解除される、例えば、遺伝的に調節解除されるか（例えば、変異されるか又は欠失される）又は後成的に調節解除される細胞に選択的な増殖優位性をもたらす。例示的な腫瘍抑制因子は、ｐ５３又はＲｂを含む。
「と対形成する」又は「対形成」は、それらの用語が本明細書で使用される場合、コドンとアンチコドンとの対応を指し、十分に相補的なコドン：アンチコドン対さらには第３の位置が相補的である必要がない「ゆらぎ」対形成を含む。十分に相補的な対形成は、ワトソン・クリック塩基対形成に従ってコドンの３つ全ての位置と対応するアンチコドンとの対形成を指す。ゆらぎ対形成は、ワトソン・クリック塩基対形成に従ってコドンの第１及び第２の位置と対応するアンチコドンとの相補的対形成及びコドンの第３の位置では対応するアンチコドンとのフレキシブル対形成を指す。
修飾、置き換え、由来という用語及び同様の用語は、生成物に関して使用又は適用される場合、最終生成物又は最終生成物の構造のみを指し、本開示で明示的に提供されない限り、生成物のいずれの作製方法にも製造方法にも制限されない。
見出し、標題、副題、番号付け又は他の英数字の階層は、単に読みやすいように添付されており、相反する明示的な表現の不在は、性能の順序、重要性、大きさ又は他の値の順序を指示するものではない。
同義ＳＮＰ及びｔＲＮＡプールの調節方法
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、ゲノム中に見いだされる変異である。ＳＮＰは、ゲノムのいずれかの位置にも、例えば、コード配列（例えば、エクソン）、調節領域（例えば、イントロン、プロモーターエレメント、エンハンサー）又は非コード配列に存在することができる。
コード配列、例えば、エクソンに存在するＳＮＰは、異なるアミノ酸、例えば、非変異コドンによって特定されるものと比較して異なるアミノ酸を特定するようにコドンを改変することによって、対応するポリペプチドに影響を及ぼすことができる。
コドンを改変するが前記変異コドンによって特定されるアミノ酸を変化させないコード配列中に存在するＳＮＰは、対応するポリペプチドにその位置で取り込まれるアミノ酸を変化させない。これは、遺伝子コドンの縮重（すなわち、１つのアミノ酸を特定する２種以上のコドン）に起因し得る。コドン縮重は、ｔＲＮＡアンチコドンの第１の塩基での「ゆらぎ」塩基対形成によって裏付けられる。例えば、アミノ酸ロイシンを特定する野生型ＣＴＴコドンが同一アミノ酸ロイシンを特定するＣＴＣコドンに変異された場合、その特定位置でのその組成に対する対応するタンパク質は変化しないと予想される。コドンＣＴＴ及びＣＴＣは両方とも、アミノ酸ロイシンを特定するｔＲＮＡによって認識される。これらの異なる種のｔＲＮＡは、イソアクセプターｔＲＮＡと呼ばれる。
コドンを変化させるが変異コドンによって特定される対応するアミノ酸を変化させない変異は、同義ＳＮＰと呼ばれる。同義ＳＮＰは、サイレントＳＮＰとしても知られる。
ヒト集団に見いだされる同義ＳＮＰは、ある特定の疾患に関連付けられる。同義ＳＮＰはポリペプチド鎖の組成を改変することが予想されないので、理論により拘束されることを望むものではないが、同義ＳＮＰの影響は、コドン使用のバイアスに関連付けられると考えられる。例えば、同義ＳＮＰは、タンパク質翻訳の低減、タンパク質フォールディングの改変、タンパク質局在化の改変又はタンパク質機能の改変をもたらし得る。コドン使用とｔＲＮＡ存在量との関係は、現在調べられている。
ある実施形態では、細胞中のｔＲＮＡの量は、コドン使用に相関付けられる。ある実施形態では、非常によく使用されるコドンと対形成するｔＲＮＡは、あまりよく使用されないコドンと対形成するｔＲＮＡよりもより豊富である。ある実施形態では、あまりよく使用されないコドンと対形成するｔＲＮＡは、非常によく使用されるコドンと対形成するｔＲＮＡほど豊富ではない。
本明細書で定義されるとおり、細胞中のｔＲＮＡプールは、ｔＲＮＡとして機能できる全ての種、例えば、内在性ｔＲＮＡ及びＴＲＥＭＳのｔＲＮＡプールである。ＴＲＥＭが投与されていない細胞又は対象の内在性ｔＲＮＡプールは、内在性ｔＲＮＡのみを含む。ＴＲＥＭが投与されている細胞又は対象のｔＲＮＡプールは、内在性ｔＲＮＡ及びＴＲＥＭを含む。
理論により拘束されることを望むものではないが、細胞中又は対象中のｔＲＮＡプールは、細胞又は対象にＴＲＥＭを含む組成物を投与することにより改変することができると考えられる。ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物が投与されている細胞中又は対象中のｔＲＮＡプールは、内在性ｔＲＮＡ及び投与されたＴＲＥＭを含む。
ある実施形態では、同義ＳＮＰを有する対象又は細胞は、ＳＮＰコドンと対形成するｔＲＮＡのより低い存在量を有するｔＲＮＡプールを有する。ある実施形態では、対象又は細胞へのＳＮＰコドンと対形成するＴＲＥＭの投与は、対象中又は細胞中のイソアクセプティングｔＲＮＡプールの量を増加させ、例えば、ＳＮＰコドンと対形成することができる分子を特定するアミノ酸の量を増加させる。
例示的な同義ＳＮＰは、表１で提供される。見出し「前／後のコドン」を有する列は、特定転写物の野生型コドン及び変異コドンを記載する。ある実施形態では、治療方法、ｔＲＮＡプールの調節方法又は本明細書で開示される評価方法に記載される細胞又は対象は、表１で提供されるＳＮＰを有する。ある実施形態では、治療方法、ｔＲＮＡプールの調節方法又は本明細書で開示される評価方法に記載される細胞又は対象は、表１に列挙される疾患を有する。ある実施形態では、治療方法、ｔＲＮＡプールの調節方法又は本明細書で開示される評価の方法に記載される細胞又は対象は、表１に列挙されるＳＮＰ及び対応する疾患を有する。
Figure 2022534988000001
Figure 2022534988000002
Figure 2022534988000003
Figure 2022534988000004
Figure 2022534988000005
Figure 2022534988000006
Figure 2022534988000007
Figure 2022534988000008
Figure 2022534988000009
宿主細胞
宿主細胞は、ＴＲＥＭの発現及び／又は精製のために使用され得る細胞（例えば、培養細胞）である。ある実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞又は非哺乳動物細胞を含む。ある実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞又はげっ歯類細胞を含む。ある実施形態では、宿主細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（例えば、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞）、ＨＴ－１０８０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨＫＢ－１１細胞、ＣＡＰ細胞、ＨｕＨ－７細胞、ＢＨＫ ２１細胞、ＭＲＣ－Ｓ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＷＩ－３８細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。ある実施形態では、宿主細胞は、癌細胞、例えば、固形腫瘍細胞（例えば、乳癌細胞（例えば、ＭＣＦ７細胞）、膵臓細胞株（例えば、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞）、肺癌細胞、又は前立腺癌細胞、又は血液癌細胞）を含む。ある実施形態では、宿主細胞は、初代細胞、例えば、不死化されていない細胞又は有限増殖能を有する細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、対象、例えば、患者に由来する細胞である。
ある実施形態では、宿主細胞は、非哺乳動物細胞、例えば、細菌細胞、酵母細胞又は昆虫細胞を含む。ある実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を含む。ある実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞を含む。ある実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９細胞又はＨｉ５細胞を含む。
ある実施形態では、宿主細胞は、１つ以上の組織特異的ｔＲＮＡを発現する細胞を含む。例えば、宿主細胞は、ｔＲＮＡ、例えば、組織特異的ｔＲＮＡの発現と関連する組織に由来する細胞を含み得る。ある実施形態では、組織特異的ｔＲＮＡを発現する宿主細胞は、ＴＲＥＭ、又はその断片を発現するように改変される。
ある実施形態では、宿主細胞は、ＴＲＥＭの発現を可能にする条件下で維持され得る細胞である。
ある実施形態では、宿主細胞は、ＴＲＥＭを転写後修飾することができ、例えば、表３から選択される転写後修飾を付加することができる。ある実施形態では、宿主細胞は、表３に列挙される酵素を（例えば、天然に又は異種性に）発現する。ある実施形態では、宿主細胞は、酵素、例えば、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性又はリボヌクレアーゼ活性）を有する酵素、例えば、又はダイサー、アンジオゲニン、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＰ、ＲＮａｓｅＺ、Ｒｎｙ１又はＰｒｒＣのうちの１つ以上を（例えば、天然に又は異種性に）発現する。
宿主細胞を培養する方法
宿主細胞は、増殖、例えば、宿主細胞の増殖又は過剰増殖を促進する培地中で培養され得る。宿主細胞は、好適な培地、例えば、以下の培地：ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＭＥＭアルファ、ＲＰＭＩ、Ｆ－１０培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地、ＩＭＤＭ、培地１９９、リーボビッツ Ｌ－１５、マッコイ ５Ａ、ＭＤＣＢ培地、又はＣＭＲＬ培地のいずれかにおいて培養され得る。ある実施形態では、培地は、グルタミンを補充される。ある実施形態では、培地は、グルタミンを補充されない。ある実施形態では、宿主細胞は、過剰な栄養分を有する、例えば、栄養分の制限がない培地において培養される。
宿主細胞は、増殖因子、サイトカイン又はホルモンの１つ又は組合せ、例えば、血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））、ＨＥＰＥＳ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦｂ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、又は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の１つ又は組合せを含むか又はそれが補充された培地中で培養され得る。
宿主細胞、例えば、非哺乳動物宿主細胞は、以下の培地：ルリアブロス、ＹＰＤ培地又はグレース培地で培養できる。
宿主細胞はまた、ストレス、例えば、細胞ストレス、浸透圧ストレス、翻訳ストレス、又は癌化ストレスを誘導する条件下で培養され得る。ある実施形態では、ストレス（例えば、本明細書に記載されるとおり）を誘導する条件下で培養されたＴＲＥＭを発現する宿主細胞は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＴＲＥＭの断片をもたらす。
宿主細胞は、栄養制限培地下で培養されてもよく、例えば、宿主細胞は、１つ以上の栄養分の量が制限された培地中で培養される。制限できる栄養分の例は、アミノ酸、脂質、炭水化物、ホルモン、増殖因子又はビタミンである。ある実施形態では、１つ以上の栄養分の量が制限された培地、例えば、栄養が欠乏している培地中で培養されたＴＲＥＭを発現する宿主細胞は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＴＲＥＭの断片をもたらす。ある実施形態では、１つ以上の栄養分の量が制限された培地、例えば、栄養が欠乏している培地中で培養されたＴＲＥＭを発現する宿主細胞は、未負荷であるＴＲＥＭ（例えば、ｕＴＲＥＭ）をもたらす。
宿主細胞は、不死化細胞、例えば、不死化に関与する１つ以上の酵素、例えば、ＴＥＲＴを発現する細胞を含み得る。ある実施形態では、宿主細胞は、無期限に増殖され得る。
宿主細胞は、懸濁液中で又は単層として培養され得る。宿主細胞培養は、細胞培養容器又はバイオリアクター中で実施され得る。細胞培養容器は、細胞培養ディッシュ、プレート又はフラスコを含む。例示的な細胞培養容器としては、３５ｍｍ、６０ｍｍ、１００ｍｍ、又は１５０ｍｍディッシュ、マルチウェルプレート（例えば、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル又は９６ウェルプレート）、又はＴ－２５、Ｔ－７５若しくはＴ－１６０フラスコが挙げられる。
ある実施形態では、宿主細胞は、バイオリアクター中で培養され得る。バイオリアクターは、例えば、連続フローバッチバイオリアクター、灌流バイオリアクター、バッチプロセスバイオリアクター又はフェドバッチバイオリアクターであり得る。バイオリアクターは、ＴＲＥＭを発現するのに十分な条件下で維持され得る。培養条件は、ＴＲＥＭの収量、純度又は構造を最適化するように調節され得る。ある実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、又は１×１０１４個の宿主細胞を含む。ある実施形態では、バイオリアクターは、１×１０７～１×１０１４個の宿主細胞；１×１０７～０．５×１０１４個の宿主細胞；１×１０７～１×１０１３個の宿主細胞；１×１０７～０．５×１０１３個の宿主細胞；１×１０７～１×１０１２個の宿主細胞；１×１０７～０．５×１０１２個の宿主細胞；１×１０７～１×１０１１個の宿主細胞；１×１０７～０．５×１０１１個の宿主細胞；１×１０７～１×１０１０個の宿主細胞；１×１０７～０．５×１０１０個の宿主細胞；１×１０７～１×１０９個の宿主細胞；１×１０７～０．５×１０９個の宿主細胞；１×１０７～１×１０８個の宿主細胞；１×１０７～０．５×１０８個の宿主細胞；０．５×１０８～１×１０１４個の宿主細胞；１×１０８～１×１０１４個の宿主細胞；０．５×１０９～１×１０１４個の宿主細胞；１×１０９～１×１０１４個の宿主細胞；０．５×１０１０～１×１０１４個の宿主細胞；１×１０１０～１×１０１４個の宿主細胞；０．５×１０１１～１×１０１４個の宿主細胞；１×１０１１～１×１０１４個の宿主細胞；０．５×１０１２～１×１０１４個の宿主細胞；１×１０１２～１×１０１４個の宿主細胞；０．５×１０１３～１×１０１４個の宿主細胞；１×１０１３～１×１０１４個の宿主細胞；又は０．５×１０１３～１×１０１４個の宿主細胞を含む。
ある実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも１×１０５宿主細胞／ｍＬ、２×１０５宿主細胞／ｍＬ、３×１０５宿主細胞／ｍＬ、４×１０５宿主細胞／ｍＬ、５×１０５宿主細胞／ｍＬ、６×１０５宿主細胞／ｍＬ、７×１０５宿主細胞／ｍＬ、８×１０５宿主細胞／ｍＬ、９×１０５宿主細胞／ｍＬ、１×１０６宿主細胞／ｍＬ、２×１０６宿主細胞／ｍＬ、３×１０６宿主細胞／ｍＬ、４×１０６宿主細胞／ｍＬ、５×１０６宿主細胞／ｍＬ、６×１０６宿主細胞／ｍＬ、７×１０６宿主細胞／ｍＬ、８×１０６宿主細胞／ｍＬ、９×１０６宿主細胞／ｍＬ、１×１０７宿主細胞／ｍＬ、２×１０７宿主細胞／ｍＬ、３×１０７宿主細胞／ｍＬ、４×１０７宿主細胞／ｍＬ、５×１０７宿主細胞／ｍＬ、６×１０７宿主細胞／ｍＬ、７×１０７宿主細胞／ｍＬ、８×１０７宿主細胞／ｍＬ、９×１０７宿主細胞／ｍＬ、１×１０８宿主細胞／ｍＬ、２×１０８宿主細胞／ｍＬ、３×１０８宿主細胞／ｍＬ、４×１０８宿主細胞／ｍＬ、５×１０８宿主細胞／ｍＬ、６×１０８宿主細胞／ｍＬ、７×１０８宿主細胞／ｍＬ、８×１０８宿主細胞／ｍＬ、９×１０８宿主細胞／ｍＬ、又は１×１０９宿主細胞／ｍＬを含む。ある実施形態では、バイオリアクターは、１×１０５宿主細胞／ｍＬ～１×１０９宿主細胞／ｍＬ、５×１０５宿主細胞／ｍＬ～１×１０９宿主細胞／ｍＬ、１×１０６宿主細胞／ｍＬ～１×１０９宿主細胞／ｍＬ；５×１０６宿主細胞／ｍＬ～１×１０９宿主細胞／ｍＬ、１×１０７宿主細胞／ｍＬ～１×１０９宿主細胞／ｍＬ、５×１０７宿主細胞／ｍＬ～１×１０９宿主細胞／ｍＬ、１×１０８宿主細胞／ｍＬ～１×１０９宿主細胞／ｍＬ、５×１０８宿主細胞／ｍＬ～１×１０９宿主細胞／ｍＬ、１×１０５宿主細胞／ｍＬ～５×１０８宿主細胞／ｍＬ、１×１０５宿主細胞／ｍＬ～１×１０８宿主細胞／ｍＬ、１×１０５宿主細胞／ｍＬ～５×１０７宿主細胞／ｍＬ、１×１０５宿主細胞／ｍＬ～１×１０７宿主細胞／ｍＬ、１×１０５宿主細胞／ｍＬ～５×１０６宿主細胞／ｍＬ、１×１０５宿主細胞／ｍＬ～１×１０６宿主細胞／ｍＬ、又は１×１０５宿主細胞／ｍＬ～５×１０５宿主細胞／ｍＬを含む。
ある実施形態では、バッチプロセスバイオリアクターは、１×１０６～１×１０７宿主細胞／ｍｌを含む。
ある実施形態では、１００ｍＬの体積を有するバッチプロセスバイオリアクターは、１×１０８～１×１０９個の宿主細胞を含む。
ある実施形態では、１００Ｌの体積を有するバッチプロセスバイオリアクターは、１×１０１１～１×１０１２個の宿主細胞を含む。
ある実施形態では、フェドバッチバイオリアクターは、１×１０７～３×１０７宿主細胞／ｍｌを含む。
ある実施形態では、１００ｍＬの体積を有するフェドバッチバイオリアクターは、１×１０９～３×１０９個の宿主細胞を含む。
ある実施形態では、１００Ｌの体積を有するフェドバッチバイオリアクターは、１×１０１２～３×１０１２個の宿主細胞を含む。
ある実施形態では、灌流バイオリアクターは、１×１０８宿主細胞／ｍｌを含む。
ある実施形態では、１００ｍＬの体積を有する灌流バイオリアクターは、１×１０１０個の宿主細胞を含む。
ある実施形態では、１００Ｌの体積を有する灌流バイオリアクターは、１×１０１３個の宿主細胞を含む。
ある実施形態では、バイオリアクターは、宿主細胞の増殖を促進する条件下、例えば、宿主細胞の増殖に許容的な温度（例えば、３７℃）及び気体濃度（例えば、５％、ＣＯ２）で維持される。
例えば、いくつかの態様では、バイオリアクターユニットは、以下のうちの１つ以上、又は全てを実施できる：栄養分及び／若しくは炭素源の給送、好適な気体（例えば、酸素）の注入、発酵若しくは細胞培養培地の流入及び流出、気相及び液相の分離、温度の維持、酸素及びＣＯ２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、かき混ぜ（例えば、撹拌）、並びに／又は浄化／滅菌。例示的なバイオリアクターユニットは、ユニット内に複数のリアクターを含有してもよく、例えば、ユニットは、各ユニット中に１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個、又はそれ以上のバイオリアクターを有することができ、及び／又は設備は、設備内に単一又は複数のリアクターを有する複数のユニットを含有してもよい。任意の好適なバイオリアクター直径が使用され得る。
ある実施形態では、バイオリアクターは、約１００ｍＬと約１００Ｌの間の体積を有し得る。非限定的な例としては、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットルの体積が挙げられる。さらに、好適なリアクターは、複数回使用、単回使用、使い捨て、又は使い捨てではない場合があり、ステンレス鋼（例えば、３１６Ｌ又は任意の他の好適なステンレス鋼）及びインコネルなどの金属合金、プラスチック、及び／又はガラスを含む任意の好適な材料で形成され得る。いくつかの実施形態では、好適なリアクターは、円形、例えば、円柱状であり得る。いくつかの実施形態では、好適なリアクターは、四角形、例えば、長方形であり得る。四角形のリアクターは、いくつかの場合において、使用の容易さ（例えば、当業者による負荷及び設置）、リアクター内容物のより良好な混合及び均一性、並びにより小さい床の底面積など、円形リアクターを超える利点を提供する。
宿主細胞を改変する方法
宿主細胞は、ＴＲＥＭの生成を最適化する、例えば、最適化されたＴＲＥＭ収量、純度、構造（例えば、フォールディング）、又は安定性を有するように改変され得る。ある実施形態では、宿主細胞は、所望の分子、例えば、ＴＲＥＭの生成を最適化する、例えば、ＴＲＥＭの収量、純度、構造又は安定性を最適化する遺伝子の発現を増加させるか又は減少させるように（例えば、本明細書に記載される方法を使用して）改変され得る。ある実施形態では、宿主細胞は、生成を最適化する所望の遺伝子の発現を増加させるか又は減少させるように、例えば、本明細書に記載される方法を使用して、後成的に改変され得る。
ある実施形態では、宿主細胞は、癌遺伝子（例えば、本明細書に記載されるとおり）、腫瘍抑制因子（例えば、本明細書に記載されるとおり）又はｔＲＮＡ若しくはＴＲＥＭ調節に関与する分子（例えば、ｔＲＮＡ又はＴＲＥＭ転写、プロセシング、調節、安定性又はフォールディングに関与する遺伝子）の発現を増加させるか又は減少させるように改変され得る。例示的な癌遺伝子としては、Ｍｙｃ（例えば、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ又はＬ－Ｍｙｃ）、ｃ－Ｊｕｎ、Ｗｎｔ、又はＲＡＳが挙げられる。例示的な腫瘍抑制因子は、ｐ５３又はＲｂを含む。ｔＲＮＡ又はＴＲＥＭ調節に関与する例示的な分子としては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）及びＰｏｌＩＩＩアクセサリー分子（例えば、ＴＦＩＩＩＢ）；Ｍａｆ１、Ｔｒｍ１、Ｍｃｋ１若しくはＫｎｓ１；ｔＲＮＡ又はＴＲＥＭ調節に関与する酵素、例えば、表３に列挙される遺伝子；又はヌクレアーゼ活性を有する分子、例えば、又はダイサー、アンジオゲニン、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＰ、ＲＮａｓｅＺ、Ｒｎｙ１又はＰｒｒＣのうちの１つ以上が挙げられる。
ある実施形態では、宿主細胞は、トランスフェクション（例えば、一過性トランスフェクション又は安定トランスフェクション）；形質導入（例えば、ウイルス形質導入、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス又はレトロウイルス形質導入）；エレクトロポレーション；薬剤の脂質系送達（例えば、リポソーム）、薬剤のナノ粒子系送達；又は当該技術分野で知られる他の方法によって改変され得る。
ある実施形態では、宿主細胞は、所望の分子、例えば、遺伝子（例えば、癌遺伝子、又はｔＲＮＡ若しくはＴＲＥＭ調節に関与する遺伝子（例えば、表３に列挙される酵素をコードする遺伝子、又はヌクレアーゼ活性（例えばエンドヌクレアーゼ活性又はリボヌクレアーゼ活性）を有する酵素をコードする遺伝子、例えば、又はダイサー、アンジオゲニン、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＰ、ＲＮａｓｅＺ、Ｒｎｙ１又はＰｒｒＣのうちの１つ以上の発現を増加させる、例えば、過剰発現するように改変され得る。遺伝子の発現を増加させる例示的な方法としては、（ａ）宿主細胞を、遺伝子をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）と接触させること；（ｂ）宿主細胞を、標的タンパク質を発現するペプチドと接触させること；（ｃ）宿主細胞を、標的遺伝子の発現を調節する、例えば、増加させる分子（例えば、小さいＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ、又は低分子干渉ＲＮＡ）又は低分子量化合物）と接触させること；又は（ｄ）宿主細胞を、標的遺伝子の負の調節因子の発現を阻害する（例えば、変異させるか又はノックアウトする）遺伝子編集部分（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又はＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ分子）と接触させることが挙げられる。ある実施形態では、遺伝子をコードする核酸、又は遺伝子をコードする核酸を含有するプラスミドは、トランスフェクション又はエレクトロポレーションによって宿主細胞に導入され得る。ある実施形態では、遺伝子をコードする核酸は、宿主細胞を、遺伝子を発現するウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス又はレトロウイルス）と接触させることによって宿主細胞に導入され得る。
ある実施形態では、宿主細胞は、所望の分子、例えば、遺伝子（例えば、腫瘍抑制因子、又はｔＲＮＡ若しくはＴＲＥＭ調節に関与する遺伝子）の発現を減少させる、例えば、その発現を最小化するように改変され得る。遺伝子の発現を減少させる例示的な方法としては、（ａ）宿主細胞を、遺伝子の阻害剤（例えば、優性阻害のバリアント又は遺伝子によってコードされる遺伝子若しくはタンパク質の負の調節因子）をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）と接触させること；（ｂ）宿主細胞を、標的タンパク質を阻害するペプチドと接触させること；（ｃ）宿主細胞を、標的遺伝子の発現を調節する、例えば、阻害する分子（例えば、小さいＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ、又は低分子干渉ＲＮＡ）又は低分子量化合物）と接触させること；又は（ｄ）宿主細胞を、標的遺伝子の発現を阻害する（例えば、変異させるか又はノックアウトする）遺伝子編集部分（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又はＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ分子）と接触させることが挙げられる。ある実施形態では、遺伝子の阻害剤をコードする核酸、又は遺伝子の阻害剤をコードする核酸を含有するプラスミドは、トランスフェクション又はエレクトロポレーションによって宿主細胞に導入され得る。ある実施形態では、遺伝子の阻害剤をコードする核酸は、宿主細胞を、遺伝子の阻害剤を発現するウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス又はレトロウイルス）と接触させることによって宿主細胞に導入され得る。
ある実施形態では、宿主細胞（例えば、本明細書に記載される宿主細胞）は、癌遺伝子、例えば、本明細書に記載される癌遺伝子、例えば、ｃ－Ｍｙｃを発現する、例えば、過剰発現するように（例えば、核酸によるトランスフェクションによって）改変される。
ある実施形態では、宿主細胞（例えば、本明細書に記載される宿主細胞）は、腫瘍抑制因子、例えば、本明細書に記載される腫瘍抑制因子、例えば、ｐ５３又はＲｂの発現を抑制する、例えば、下方制御するように（例えば、核酸によるトランスフェクションによって）改変される。
ある実施形態では、宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）は、ｔＲＮＡ又はＴＲＥＭ、例えば、Ｍａｆ１を調節する遺伝子の発現を阻害する、例えば、ノックアウトするように（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９分子を使用して）改変される。ある実施形態では、宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）は、ｔＲＮＡ又はＴＲＥＭ、例えば、Ｔｒｍ１を調節する遺伝子を過剰発現するように改変される。
ある実施形態では、宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）は、ｔＲＮＡ又はＴＲＥＭ、例えば、Ｔｒｍ１を調節する遺伝子を過剰発現し、及び癌遺伝子、例えば、本明細書に記載される癌遺伝子、例えば、ｃ－Ｍｙｃを過剰発現するように改変される。
ＴＲＥＭ
「ｔＲＮＡ系エフェクター分子」又は「ＴＲＥＭ」は、本明細書に記載される特性の１つ以上を含むＲＮＡ分子を指す。ＴＲＥＭは、アミノ酸、例えば、同族アミノ酸で負荷される場合があるか；非同族アミノ酸で負荷される場合があるか（例えば、誤負荷ＴＲＥＭ（ｍＴＲＥＭ））；又はアミノ酸で負荷されない場合がある（例えば、未負荷ＴＲＥＭ（ｕＴＲＥＭ））。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、表２で開示されるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列、例えば、表２で開示される配列番号１～４５１のいずれか１つによってコードされるリボ核酸（ＲＮＡ）配列を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、表２で提供されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示される配列番号１～４５１のいずれか１つによってコードされるＲＮＡ配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なＲＮＡ配列を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、表２で提供されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示される配列番号１～４５１のいずれか１つに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、表２で開示されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列の少なくとも３０個の連続したヌクレオチド、例えば、表２で開示される配列番号１～４５１のいずれか１つによってコードされるＲＮＡ配列の少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、表２で提供されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示される配列番号１～４５１のいずれか１つによってコードされるＲＮＡ配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なＲＮＡ配列の少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、表２で提供されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示される配列番号１～４５１のいずれか１つに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列の少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを含む。
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ある実施形態では、ＴＲＥＭ、例えば、外来ＴＲＥＭは、以下の特性の１、２、３、又は４つを含む：
（ａ）参照細胞、例えば、外来核酸が導入される細胞における最も近い配列のｔＲＮＡから少なくとも１つのヌクレオチド又は１つの転写後修飾が異なるか；
（ｂ）それが転写された細胞以外の細胞に導入されているか；
（ｃ）それが天然に存在するもの以外の細胞において存在するか；又は
（ｄ）野生型ではない発現プロファイル、例えば、レベル又は分布を有する（例えば、それが野生型より高いレベルで発現される）。
ある実施形態では、発現プロファイルは、発現を調節する核酸に導入される変化、又はＲＮＡ分子の発現を調節する薬剤の添加によって媒介され得る。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ、例えば、外来ＴＲＥＭは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ、例えば、外来ＴＲＥＭは、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ、例えば、外来ＴＲＥＭは、（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ、例えば、外来ＴＲＥＭは、（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ、例えば、外来ＴＲＥＭは、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ、例えば、外来ＴＲＥＭは、（ａ）及び（ｄ）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ、例えば、外来ＴＲＥＭは、（ｃ）及び（ｄ）を含む。
ＴＲＥＭ断片
ある実施形態では、ＴＲＥＭは、断片（ＴＲＥＭ断片と本明細書で呼ばれる場合がある）、例えば、表２で開示されるデオキシリボ核酸配列によってコードされるＲＮＡの断片を含む。例えば、ＴＲＥＭは、完全配列未満のｔＲＮＡ、例えば、同じアンチコドン、治療されている対象と同じ種に由来するアンチコドン、又はその両方を有する完全配列未満のｔＲＮＡを含む。ある実施形態では、例えば、全長ＴＲＥＭ又はより長い断片に由来するＴＲＥＭ断片の生成は、酵素、例えば、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性又はリボヌクレアーゼ活性）を有する酵素、例えば、ダイサー、アンジオゲニン、ＲＮａｓｅＰ、ＲＮａｓｅＺ、Ｒｎｙ１、又はＰｒｒＣによって触媒され得る。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、インビボ、エクスビボ又はインビトロで生成され得る。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、宿主細胞においてインビボで生成される。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、エクスビボで生成される。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、インビトロで、例えば、実施例１２に記載されるとおりに生成される。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、発現されるＴＲＥＭを細胞によるＴＲＥＭの生成後に断片化することによって生成される、例えば、宿主細胞により生成されるＴＲＥＭは、宿主細胞からの放出又は精製後に断片化される、例えば、ＴＲＥＭは、エクスビボ又はインビトロで断片化される。
例示的なＴＲＥＭ断片としては、ＴＲＥＭ半分（例えば、ＡＣＨＤにおける切断に由来する、例えば、５’ＴＲＥＭ半分又は３’ＴＲＥＭ半分）、５’断片（例えば、ＤＨＤ又はＡＣＨＤにおける切断に由来する、例えば、５’末端を含む断片）、３’断片（例えば、ＴＨＤにおける切断に由来する、例えば、ＴＲＥＭの３’末端を含む断片）、又は内部断片（例えば、ＡＣＨＤ、ＤＨＤ又はＴＨＤの１つ以上における切断に由来する）が挙げられる。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、表２で提供されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示される配列番号１～４５１のいずれか１つによってコードされるＲＮＡ配列の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、表２で提供されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示される配列番号１～４５１のいずれか１つによってコードされるＲＮＡ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一なＲＮＡ配列の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、表２で提供されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示される配列番号１～４５１のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、表２で開示されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示される配列番号１～４５１のいずれか１つによってコードされるＲＮＡ配列の少なくとも５リボヌクレオチド（ｎｔ）、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ又は６０ｎｔ（全長未満）を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、表２で提供されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示される配列番号１～４５１のいずれか１つによってコードされるＲＮＡ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なＲＮＡ配列の少なくとも５リボヌクレオチド（ｎｔ）、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ又は６０ｎｔ（全長未満）を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、表２で提供されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示される配列番号１～４５１のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列の少なくとも５リボヌクレオチド（ｎｔ）、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ又は６０ｎｔ（全長未満）を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、１０～９０リボヌクレオチド（ｒｎｔ）、１０～８０ｒｎｔ、１０～７０ｒｎｔ、１０～６０ｒｎｔ、１０～５０ｒｎｔ、１０～４０ｒｎｔ、１０～３０ｒｎｔ、１０～２０ｒｎｔ、２０～９０ｒｎｔ、２０～８０ｒｎｔ、２０～７０ｒｎｔ、２０～６０ｒｎｔ、２０～５０ｒｎｔ、２０～４０ｒｎｔ、３０～９０ｒｎｔ、３０～８０ｒｎｔ、３０～７０ｒｎｔ、３０～６０ｒｎｔ、又は３０～５０ｒｎｔの長さの配列を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、例えば、本明細書で上に記載されるとおりのＴＲＥＭ構造、ドメイン、又は活性を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、例えば、本明細書に記載されるとおりのアダプター機能を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、例えば、本明細書に記載されるとおりの同族アダプター機能を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、例えば、本明細書に記載されるとおりの非同族アダプター機能を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、例えば、本明細書に記載されるとおりの調節機能を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、翻訳阻害機能、例えば、開始因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇの転置を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、後成的機能、例えば、障害、例えば、代謝障害の後成的遺伝を含む。いくつかの実施形態では、後成的遺伝機能は、例えば、体細胞の後成的調節と比較して、世代の影響を有し得る。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、レトロウイルス調節機能、例えば、レトロウイルス逆転写の調節、例えば、ＨＥＲＶ調節を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、例えば、ＡＧＯ及び／又はＰＩＷＩに結合することによる遺伝子サイレンシング機能を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、例えば、細胞ストレス下で、例えば、運動ニューロン生存を促進する、例えば、ストレス顆粒における翻訳開始因子の隔離による神経保護機能を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、例えば、転移性転写安定化タンパク質の結合及び／又は隔離を介して癌の進行を防ぐことによる抗癌機能を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、細胞生存機能、例えば、チトクロムｃ及び／又はｃｙｔ ｃリボ核タンパク質複合体に結合することによる、例えば、細胞生存の増加を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、リボソーム新生機能を含み、例えば、ＴＲＥＭ断片は、例えば、リボソームタンパク質をコードするｍＲＮＡに対する結合、例えば、その調節によってリボソーム新生を調節することができる。
ＴＲＥＭ修飾
本明細書に記載されるＴＲＥＭは、多くの場合本明細書で修飾と呼ばれる部分、例えば、表３に記載される部分を含み得る。本明細書で使用されるとおりの修飾という用語は、一般に、任意の特定のプロセスの産物であると解釈されるべきではないが、実施形態において、修飾の形成は、表３における酵素によって媒介され得る。実施形態において、修飾は、転写後に形成される。実施形態において、修飾は、転写と同時に形成される。ある実施形態では、修飾は、インビボ、例えば、宿主細胞において生じる。
ある実施形態では、修飾は、表３の列１～６２のいずれかに列挙される修飾である。ある実施形態では、修飾は、表３の列１～６２のいずれかに列挙される修飾であり、及び修飾の形成は、表３における酵素によって媒介される。ある実施形態では、修飾は、表３の列から選択され、及び修飾の形成は、表３における同じ列からの酵素によって媒介される。
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Figure 2022534988000040
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ＴＲＥＭ融合
ある実施形態では、本明細書で開示されるＴＲＥＭは、追加の部分、例えば、融合部分を含む。ある実施形態では、融合部分を、精製のために使用して、ＴＲＥＭのフォールディングを改変してもよいし、標的化部分として使用してもよい。ある実施形態では、融合部分は、タグ、リンカーを含み得るか、切断可能であり得るか又は酵素のための結合部位を含み得る。ある実施形態では、融合部分は、ＴＲＥＭのＮ末端又はＴＲＥＭのＣ末端に配置され得る。ある実施形態では、融合部分は、ＴＲＥＭをコードする同じ又は異なる核酸分子によってコードされ得る。
ＴＲＥＭを作製する方法
ＴＲＥＭは、当技術分野で公知の方法のいずれかに従って作製することができる。例えば、ＴＲＥＭは、合成法を用いて作製することができ、例えば、固相合成又は液相合成を用いて合成することができる。別の例として、ＴＲＥＭは、インビトロの転写（ＩＶＴ）方法を用いて作製することができる。さらに別の例として、ＴＲＥＭは、細胞中でＴＲＥＭをコードするベクターを発現することによって作製することができる。
オリゴヌクレオチドを合成するためのインビトロ法は、当技術分野で公知であり、本明細書で開示されるＴＲＥＭを作製するために使用することができる。例えば、ＴＲＥＭを作製するための化学合成法は、実施例２７で開示されている。ＴＲＥＭを作製するためのインビトロの転写法の例は、実施例２８に開示されている。
５’－シリル－２’－オルトエステル（２’－ＡＣＥ）化学を介して合成オリゴヌクレオチドを作製する追加の方法は、Ｈａｒｔｓｅｌ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，０３３－０５０で開示されており、その内容は全て、本願をもって参照により組み込まれ、本明細書で開示されるＴＲＥＭを作製するために使用することができる。
発現ベクターを設計し、構築し、及び標的（例えば、本明細書で開示されるＴＲＥＭ又は酵素）の生成のための宿主細胞を改変するための方法は、当該技術分野で知られる技術を使用する。例えば、細胞は、適切なプロモーターの制御下にある培養哺乳動物細胞（例えば、培養ヒト細胞）、昆虫細胞、酵母、細菌、又は他の細胞を使用して外来ＴＲＥＭを発現するように遺伝子改変される。一般に、組換え法が使用され得る。一般に、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）；Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）を参照されたい。例えば、哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、好適なプロモーター及びエンハンサー、並びに他の５’又は３’隣接非転写配列などの非転写エレメントを含み得る。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０開始点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、及びポリアデニル化部位は、異種ＤＮＡ配列の発現に必要となる他の遺伝要素を提供するために使用され得る。
ある実施形態では、本明細書で開示されるＴＲＥＭ又はＴＲＥＭを含む組成物を作製する方法は、ＴＲＥＭを発現する宿主細胞、例えば、改変された宿主細胞の使用を含む。
改変された宿主細胞は、ＴＲＥＭの発現を可能にする条件下で培養される。ある実施形態では、培養条件は、ＴＲＥＭの発現を増加させるように調節され得る。ＴＲＥＭを作製する方法はさらに、ＴＲＥＭを含む組成物を生成するために宿主細胞培養物から発現されたＴＲＥＭを精製することを含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、ＴＲＥＭ断片、例えば、表２で開示されるデオキシリボ核酸配列によってコードされるｔＲＮＡの断片である。例えば、ＴＲＥＭは、完全配列未満のｔＲＮＡ、例えば、同じアンチコドン、治療されている対象と同じ種に由来するアンチコドン、又はその両方を有する完全配列未満のｔＲＮＡを含む。ある実施形態では、例えば、全長ＴＲＥＭ又はより長い断片に由来するＴＲＥＭ断片の生成は、酵素、例えば、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性又はリボヌクレアーゼ活性）を有する酵素、例えば、ＲＮａｓｅＡ、ダイサー、アンジオゲニン、ＲＮａｓｅＰ、ＲＮａｓｅＺ、Ｒｎｙ１又はＰｒｒＣによって触媒され得る。
ある実施形態では、本明細書に記載されるＴＲＥＭを作製する方法は、宿主細胞（例えば、本明細書に記載されるとおりの、例えば、改変された宿主細胞）を、ＴＲＥＭを発現するのに十分な条件下でＴＲＥＭをコードする本明細書に記載される外来核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡと接触させる（例えば、形質導入するか又はトランスフェクトする）ことを含む。ある実施形態では、外来核酸は、表２で開示されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡのリボ核酸（ＲＮＡ）配列を含むＲＮＡ（又はＲＮＡをコードするＤＮＡ）を含む。ある実施形態では、外来核酸は、表２で提供されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＲＮＡ配列（又はＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ）を含む。ある実施形態では、外来核酸は、表２で開示されるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列によってコードされるリボ核酸（ＲＮＡ）配列の少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを含むＲＮＡ配列（又はＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ）を含む。ある実施形態では、外来核酸は、表２で提供されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＲＮＡ配列の少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを含むＲＮＡ配列（又はＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ）を含む。
ある実施形態では、宿主細胞は、例えば、実施例８に記載されるとおりのＴＲＥＭを発現するウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス又はレトロウイルス）で形質導入される。
発現されたＴＲＥＭは、例えば、本明細書に記載されるとおりのＴＲＥＭを含む組成物を生成する宿主細胞又は宿主細胞培養物から精製され得る。ＴＲＥＭの精製は、例えば、特定のｔＲＮＡ分子プロトコルのＭＡＣＳ単離において記載されるとおりのアフィニティー精製、又は当該技術分野で知られる他の方法によって実施され得る。ある実施形態では、ＴＲＥＭは、実施例７に記載される方法によって精製される。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ、例えば、ＴＲＥＭを含む組成物を作製する方法は、ＴＲＥＭを、試薬、例えば、ＴＲＥＭと相補的な核酸配列を含む捕捉試薬と接触させることを含む。単一の捕捉試薬又は複数の捕捉試薬を使用して、ＴＲＥＭ、例えば、ＴＲＥＭを含む組成物を作製することができる。単一の捕捉試薬が使用されるとき、捕捉試薬は、ＴＲＥＭと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％相補的な配列を有し得る。複数の捕捉試薬が使用されるとき、複数の異なるＴＲＥＭを有するＴＲＥＭの組成物が作製され得る。ある実施形態では、捕捉試薬は、薬剤、例えば、ビオチンにコンジュゲートされ得る。
ある実施形態では、方法は、例えば、捕捉試薬とのハイブリダイゼーションの前にＴＲＥＭを変性させることを含む。ある実施形態では、方法は、ハイブリダイゼーション及び／又は捕捉試薬からの放出の後に、ＴＲＥＭを再生することを含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ、例えば、ＴＲＥＭを含む組成物を作製する方法は、ＴＲＥＭを、試薬、例えば、分離試薬、例えば、クロマトグラフィー試薬と接触させることを含む。ある実施形態では、クロマトグラフィー試薬としては、カラムクロマトグラフィー試薬、平面クロマトグラフィー試薬、置換クロマトグラフィー試薬、ガスクロマトグラフィー試薬、液体クロマトグラフィー試薬、アフィニティークロマトグラフィー試薬、イオン交換クロマトグラフィー試薬、又はサイズ排除クロマトグラフィー試薬が挙げられる。
ある実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかによって作製されるＴＲＥＭは、（ｉ）アミノ酸、例えば、同族アミノ酸で負荷される場合があるか；（ｉｉ）非同族アミノ酸で負荷される場合があるか（例えば、誤負荷ＴＲＥＭ（ｍＴＲＥＭ））；又は（ｉｉｉ）アミノ酸で負荷されない場合がある（例えば、未負荷ＴＲＥＭ（ｕＴＲＥＭ））。
ある実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかによって作製されるＴＲＥＭは、未負荷ＴＲＥＭ（ｕＴＲＥＭ）である。ある実施形態では、ｕＴＲＥＭを作製する方法は、制限された量の１種以上の栄養分を有する培地（例えば、培地は、栄養が欠乏している）中で宿主細胞を培養することを含む。
ある実施形態では、負荷ＴＲＥＭ、例えば、同族ＡＡ又は非同族ＡＡで負荷されたＴＲＥＭは、例えば、ＡＡを解離することによって、例えば、高温でＴＲＥＭをインキュベートすることによって、負荷がなくなり得る。
ＴＲＥＭ又はＴＲＥＭ断片をコードする外来核酸
ある実施形態では、ＴＲＥＭをコードする外来核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡは、表２で開示されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示されるとおりの配列番号１～４５１のいずれか１つによってコードされるＲＮＡ配列の１つ又は複数の核酸配列を含む核酸配列を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭをコードする外来核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡは、表２で開示されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示されるとおりの配列番号１～４５１のいずれか１つによってコードされるＲＮＡ配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な核酸配列を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭをコードする外来核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡは、表２で開示されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示されるとおりの配列番号１～４５１のいずれか１つによってコードされるＲＮＡ配列の核酸配列を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭをコードする外来核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡは、表２で開示されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示されるとおりの配列番号１～４５１のいずれか１つによってコードされる複数のＲＮＡ配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な核酸配列を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭをコードする外来核酸は、表２で開示されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示されるとおりの配列番号１～４５１のいずれか１つに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭをコードする外来核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡは、ＴＲＥＭ断片、例えば、本明細書に記載されるとおりの表２で開示されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示されるとおりの配列番号１～４５１のいずれか１つの断片によってコードされる、例えば、ＲＮＡの断片の１つ又は複数のＲＮＡ配列を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、表２で提供されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示されるとおりの配列番号１～４５１のいずれか１つによってコードされるＲＮＡの核酸配列の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、表２で提供されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な核酸配列の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、表２で提供されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示されるとおりの配列番号１～４５１のいずれか１つに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なＤＮＡ配列によってコードされる核酸配列の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、表２で開示されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示される配列番号１～４５１のいずれか１つによってコードされるＲＮＡ配列の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、表２で提供されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示される配列番号１～４５１のいずれか１つによってコードされるＲＮＡ配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一なＲＮＡ配列の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の連続したヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭ断片は、表２で提供されるＤＮＡ配列、例えば、表２で開示されるとおりの配列番号１～４５１のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の連続したヌクレオチドを含む。
ある実施形態では、外来核酸は、転写時にＴＲＥＭを発現するＤＮＡを含む。
ある実施形態では、外来核酸は、逆転写時に、ＴＲＥＭを提供するように転写され得るＤＮＡをもたらすＲＮＡを含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭをコードする外来核酸は、（ｉ）制御領域配列；（ｉｉ）修飾されたＴＲＥＭをコードする配列；（ｉｉｉ）２つ以上のＴＲＥＭをコードする配列；又は（ｉｖ）ｔＲＮＡＭｅｔ配列以外の配列を含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭをコードする外来核酸は、プロモーター配列を含む。ある実施形態では、外来核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）認識配列、例えば、Ｐｏｌ ＩＩＩ結合配列を含む。ある実施形態では、プロモーター配列は、Ｕ６プロモーター配列又はその断片を含む。ある実施形態では、核酸配列は、変異、例えば、プロモーター向上変異、例えば、転写開始を増加させる変異、例えば、ＴＦＩＩＩＢ結合を増加させる変異を含むプロモーター配列を含む。ある実施形態では、核酸配列は、Ｐｏｌ ＩＩＩ結合を増加させ、及びｔＲＮＡ生成、例えば、ＴＲＥＭ生成の増加をもたらすプロモーター配列を含む。
また、ＴＲＥＭをコードする外来核酸を含むプラスミドも本明細書で開示される。ある実施形態では、プラスミドは、例えば、本明細書に記載されるとおりのプロモーター配列を含む。
ＴＲＥＭを含む組成物
ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物、例えば、ＴＲＥＭを含む医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。例示的な賦形剤としては、ＦＤＡ不活性成分データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｃｄｅｒ／ｉｉｇ／ｉｎｄｅｘ．Ｃｆｍ）で提供されるものが挙げられる。
ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物、例えば、ＴＲＥＭを含む医薬組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又は１５０グラムのＴＲＥＭを含む。ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物、例えば、ＴＲＥＭを含む医薬組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０又は１００ミリグラムのＴＲＥＭを含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物、例えば、ＴＲＥＭを含む医薬組成物は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５又は９９乾燥重量％のＴＲＥＭである。
ある実施形態では、本明細書で開示される作製方法のいずれかによって生成されたＴＲＥＭを含む組成物は、実施例１２で開示されるように又は当技術分野で公知のように、インビトロ負荷反応を用いてアミノ酸を負荷することができる。
ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物は、少なくとも１×１０６個のＴＲＥＭ分子、少なくとも１×１０７個のＴＲＥＭ分子、少なくとも１×１０８個のＴＲＥＭ分子又は少なくとも１×１０９個のＴＲＥＭ分子を含む。
ＴＲＥＭ精製
ＴＲＥＭを含む組成物、例えば、ＴＲＥＭを含む医薬組成物は、ヌクレオチド精製技術によって宿主細胞から精製され得る。一実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物は、例えば、特定のｔＲＮＡ分子プロトコルのＭＡＣＳ単離において記載されるとおりのアフィニティー精製、又は実施例７に記載される方法によって精製される。一実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物は、液体クロマトグラフィー、例えば、逆相イオン対クロマトグラフィー（ＩＰ－ＲＰ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥ）、アフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、及びその組合せによって精製される。例えば、Ｂａｒｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１８）４１０：３２３９－３２５２を参照されたい。
ＴＲＥＭの品質管理及び生成評価
本明細書で開示される方法のいずれかによって生成されるＴＲＥＭ又はＴＲＥＭを含む組成物、例えば、医薬ＴＲＥＭを含む組成物は、純度、宿主細胞タンパク質若しくはＤＮＡ含量、内毒素レベル、無菌性、ＴＲＥＭ濃度、ＴＲＥＭ構造、又はＴＲＥＭの機能活性などのＴＲＥＭ又はＴＲＥＭ調製物に関連する特徴について評価され得る。上記の特徴のいずれかは、特徴についての値を提供することによって、例えば、ＴＲＥＭ、ＴＲＥＭを含む組成物、又はＴＲＥＭを含む組成物の生成における中間体を評価するか又は試験することによって評価され得る。値はまた、標準値又は参照値と比較され得る。評価に応じて、ＴＲＥＭを含む組成物は、例えば、発売の準備ができているか、ヒト治験のための生成基準を満たすか、ＩＳＯ標準に従うか、ｃＧＭＰ標準に従うか、又は他の医薬標準に従うかに分類され得る。評価に応じて、ＴＲＥＭを含む組成物は、さらなる処理にかけられてもよく、例えば、それは、一定分量に、例えば、単一又は複数投与量に分けられてもよいし、容器、例えば、最終的に使用するバイアル内に配置されてもよいし、包装されてもよいし、輸送されてもよいし、又は市販されてもよい。実施形態において、評価に応じて、特徴の１つ以上が、ＴＲＥＭを含む組成物を最適化するために調節されてもよいし、加工されてもよいし、再加工されてもよい。例えば、ＴＲＥＭを含む組成物は、（ｉ）ＴＲＥＭを含む組成物の純度を上げるか；（ｉｉ）組成物中のＨＣＰの量を減少させるか；（ｉｉｉ）組成物中のＤＮＡの量を減少させるか；（ｉｖ）組成物中の断片の量を減少させるか；（ｖ）組成物中の内毒素の量を減少させるか；（ｖｉ）組成物のインビトロ翻訳活性を増大させるか；（ｖｉｉ）組成物のＴＲＥＭ濃度を増大させるか；又は（ｖｉｉｉ）組成物中に存在する任意のウイルス混入物を不活性するか若しくは除去する（例えば、組成物のｐＨを下げるか又は濾過によって）ために調節されてもよいし、加工されてもよいし、再加工されてもよい。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ（例えば、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む組成物の生成における中間体）は、すなわち、質量によって、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度を有する。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ（例えば、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む組成物の生成における中間体）は、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、又は５００ｎｇ／ｍｌ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入を有する。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ（例えば、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む組成物の生成における中間体）は、ＴＲＥＭを含む組成物の１ミリグラム（ｍｇ）当たり０．１ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７０ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、又は５００ｎｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入を有する。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ（例えば、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む組成物の生成における中間体）は、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、又は５００ｎｇ／ｍｌ未満のＤＮＡ含量、例えば、宿主細胞ＤＮＡ含量を有する。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ（例えば、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む組成物の生成における中間体）は、全長ＴＲＥＭと比較して０．１％、０，５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％未満のＴＲＥＭ断片を有する。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ（例えば、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む組成物の生成における中間体）は、例えば、リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）試験によって測定される、内毒素の低レベル又は欠如を有する。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ（例えば、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む組成物の生成における中間体）は、例えば、実施例１５に記載されるアッセイによって測定されるとおりのインビトロ翻訳活性を有する。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ（例えば、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む組成物の生成における中間体）は、少なくとも０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、０．１ｕｇ／ｍＬ、０．５ｕｇ／ｍＬ，１ｕｇ／ｍＬ、２ｕｇ／ｍＬ、５ｕｇ／ｍＬ、１０ｕｇ／ｍＬ、２０ｕｇ／ｍＬ、３０ｕｇ／ｍＬ、４０ｕｇ／ｍＬ、５０ｕｇ／ｍＬ、６０ｕｇ／ｍＬ、７０ｕｇ／ｍＬ、８０ｕｇ／ｍＬ、１００ｕｇ／ｍＬ、２００ｕｇ／ｍＬ、３００ｕｇ／ｍＬ、５００ｕｇ／ｍＬ、１０００ｕｇ／ｍＬ、５０００ｕｇ／ｍＬ、１０，０００ｕｇ／ｍＬ、又は１００，０００ｕｇ／ｍＬのＴＲＥＭ濃度を有する。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ（例えば、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む組成物の生成における中間体）は、例えば、組成物又は調製物は、無菌的条件下で試験された場合に１００未満の生存可能な微生物の増殖を裏付け、組成物又は調製物は、ＵＳＰ＜７１＞の規格を満たし、及び／又は組成物又は調製物は、ＵＳＰ＜８５＞の規格を満たす、無菌性である。
ある実施形態では、ＴＲＥＭ（例えば、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む組成物の生成における中間体）は、ウイルス混入物の欠如又は検出不可能なレベルのウイルス混入物、例えば、ウイルス混入物がないことを有する。ある実施形態では、組成物中に存在するウイルス混入物、例えば、いずれの残留ウイルスも、不活性化されるか又は除去される。ある実施形態では、ウイルス混入物、例えば、いずれの残留ウイルスも、例えば、組成物のｐＨを下げることによって、不活性化される。ある実施形態では、ウイルス混入物、例えば、いずれの残留ウイルスも、例えば、濾過又は当該分野で知られる他の方法によって、除去される。
ＴＲＥＭ投与
本明細書に記載されるＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物は、例えば、インビトロ、エクスビボ又はインビボでの細胞、組織及び／又は器官への直接的な投与によって、細胞、組織又は対象に投与され得る。インビボ投与は、例えば、局所、全身及び／又は非経口経路による、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、髄腔内、筋肉内、眼球、経鼻、泌尿生殖器、皮内、経皮、経腸、硝子体内、脳内、髄腔内、又は硬膜外を介するものであり得る。
ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物又は本明細書で開示されるＴＲＥＭを含む医薬組成物は、本明細書で開示される症状又は障害を有する対象に投与される。ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物又は本明細書で開示されるＴＲＥＭを含む医薬組成物は、症状又は障害を予防又は治療するために投与される。ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物の投与は、症状又は障害の治療又は予防をもたらす。ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物の投与は、対象中のｔＲＮＡプールを調節し、例えば、症状又は障害の治療をもたらす。ある実施形態では、障害は、表１から選ばれる。
ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物又は本明細書で開示されるＴＲＥＭを含む医薬組成物は、本明細書で開示される症状又は障害を有する対象からの細胞に投与される。ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物の投与は、対象からの細胞中のｔＲＮＡプールを調節する。ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物は、インビボ、インビトロ又はエクスビボで細胞に投与することができる。ある実施形態では、対象は、表１から選ばれる障害を有する。
ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物又は本明細書で開示されるＴＲＥＭを含む医薬組成物は、本明細書で開示される症状又は障害を有する対象の組織に投与される。ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物は、対象の組織内のｔＲＮＡプールを調節するために投与される。ある実施形態では、対象は、表１から選ばれる障害を有する。
ベクター及び担体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＴＲＥＭ、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物は、ベクターを使用して、細胞、例えば、哺乳動物細胞又はヒト細胞に送達される。ベクターは、例えば、プラスミド又はウイルスであり得る。いくつかの実施形態では、送達は、インビボ、インビトロ、エクスビボ、又はインサイチュである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルスである。いくつかの実施形態では、系又は系の成分は、ウイルス様粒子又はビロソームで細胞に送達される。いくつかの実施形態では、送達は、２つ以上のウイルス、ウイルス様粒子又はビロソームを使用する。
担体
本明細書に記載されるＴＲＥＭ、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物は、担体を含み得るか、担体とともに製剤化され得るか、又は担体中において送達され得る。
ウイルスベクター
担体は、ウイルスベクター（例えば、ＴＲＥＭをコードする配列を含むウイルスベクター）であり得る。ウイルスベクターを、細胞又は対象（例えば、ヒト対象又は動物モデル）に投与して、ＴＲＥＭ、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物を送達してもよい。ウイルスベクターは、全身的に又は局所的に投与され（例えば、注射され）得る。
ウイルスゲノムは、外来遺伝子の哺乳動物細胞への効率的な送達のために使用され得るベクターの豊富な供給源を提供する。ウイルスゲノムは、そのようなゲノム内に含有されるポリヌクレオチドが通常、普遍形質導入又は特殊形質導入によって哺乳動物細胞の核ゲノムに組み込まれるため、送達に有用なベクターとして当該技術分野で知られる。これらのプロセスは、天然のウイルス複製サイクルの一部として起こり、遺伝子組込みを誘導するために追加のタンパク質又は試薬を必要としない。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス（例えば、レトロウイルス科ファミリーウイルスベクター）、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、及びＡｄ４８）、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）などのマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹及びセンダイ）、ピコルナウイルス及びアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、複製欠損ヘルペスウイルス）、及びポックスウイルス（例えば、ワクシニア、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、鶏痘及びカナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト泡沫状ウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、トリＣ型ウイルス、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、オンコレトロウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶ群、レンチウイルス、アルファレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、スプーマウイルス（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）が挙げられる。他の例としては、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス哺乳動物腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、マソン・ファイザー・サルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス及びレンチウイルスが挙げられる。ベクターの他の例は、例えば、教示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８０１，０３０号明細書において記載される。いくつかの実施形態では、系又は系の成分は、ウイルス様粒子又はビロソームで細胞に送達される。
細胞及び小胞系担体
本明細書に記載されるＴＲＥＭ、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物は、小胞又は他の膜系担体において細胞に投与され得る。
実施形態において、本明細書に記載されるＴＲＥＭ、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物は、細胞、小胞若しくは他の膜系担体において又はそれを介して投与される。一実施形態では、ＴＲＥＭ、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物は、リポソーム又は他の同様の小胞において製剤化され得る。リポソームは、内部水性区画の周囲にある単層又は多層状脂質二重層及び相対的に不透過性の外側の親油性リン脂質二重層で構成される球状小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であり得る。リポソームは、生体適合性、無毒性であり、親水性及び親油性薬物分子の両方を送達することができ、それらの積荷を血漿酵素によって分解から保護することができ、及び生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を通って積荷を輸送できる（例えば、概説についてはＳｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，記事ＩＤ ４６９６７９，１２ページ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。
小胞は、いくつかの異なる型の脂質から作られ得るが；リン脂質が、薬物担体としてのリポソームを生成するために最も一般的に使用される。多層状小胞脂質の調製のための方法は、当該技術分野で知られている（例えば、多層状小胞脂質の調製に関する教示が、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照されたい）。小胞形成は、脂質フィルムが水溶液と混合されるときに自然に起こり得るが、それはまた、ホモジナイザー、ソニケーター、又は 押し出し装置を使用することによる振盪の形態で力をかけることによって促進され得る（例えば、概説に関してはＳｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，記事ＩＤ ４６９６７９，１２ページ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。押し出された脂質は、押し出された脂質の調製に関する教示が、参照により本明細書に組み込まれるＴｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７において記載されるとおり、サイズを低減するフィルターに通して押し出すことによって調製され得る。
脂質ナノ粒子は、担体の別の例であり、本明細書に記載されるＴＲＥＭ、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物のための生体適合性及び生分解性の送達系を提供する。ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）は、ＳＬＮの特徴を保持し、薬物安定性及び負荷能を向上させ、及び薬物漏出を防ぐ修飾された固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。ポリマーナノ粒子（ＰＮＰ）は、薬物送達の重要な成分である。これらのナノ粒子は、特定の標的に対する薬物送達を効率的に方向づけすることができ、及び薬物安定性及び制御された薬物放出を向上させることができる。リポソームとポリマーを組み合わせる新規の種類の担体である脂質－ポリマーナノ粒子（ＰＬＮ）もまた、利用され得る。これらのナノ粒子は、ＰＮＰ及びリポソームの補完的な利点を有する。ＰＬＮは、コア－シェル構造で構成され；ポリマーコアは、安定した構造をもたらし、及びリン脂質シェルは、良好な生体適合性を提供する。そのため、２つの成分は、薬物のカプセル封入効率を増大させ、表面修飾を容易にし、及び水溶性薬物の漏出を防ぐ。概説に関して、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ７，１２２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｎａｎｏ７０６０１２２を参照されたい。
エキソソームはまた、本明細書に記載されるＴＲＥＭ又はＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物のための薬物送達媒体として使用され得る。概説に関して、Ｈａ ｅｔ ａｌ．Ｊｕｌｙ ２０１６．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ．６巻，４号，２８７－２９６ページ；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｐｓｂ．２０１６．０２．００１を参照されたい。
エクスビボで分化した赤血球が、本明細書に記載されるＴＲＥＭ、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物のための担体として使用され得る。例えば、国際公開第２０１５０７３５８７号パンフレット；国際公開第２０１７１２３６４６号パンフレット；国際公開第２０１７１２３６４４号パンフレット；国際公開第２０１８１０２７４０号パンフレット；国際公開第２０１６１８３４８２号パンフレット；国際公開第２０１５１５３１０２号パンフレット；国際公開第２０１８１５１８２９号パンフレット；国際公開第２０１８００９８３８号パンフレット；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ２０１４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（２８）：１０１３１－１０１３６；米国特許第９，６４４，１８０号明細書；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８：４２３；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（２８）：１０１３１－１０１３６を参照されたい。
例えば、国際公開第２０１８２０８７２８号パンフレットに記載されるとおりのフソソーム（Ｆｕｓｏｓｏｍｅ）組成物もまた、本明細書に記載されるＴＲＥＭ、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物を送達する担体として使用され得る。
ビロソーム及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、本明細書で記載されるＴＲＥＭ、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物を標的細胞に送達するために担体として使用することができる。
植物ナノベシクル、例えば、国際公開第２０１１０９７４８０Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１３０７０３２４Ａ１号パンフレット又は国際公開第２０１７００４５２６Ａ１号パンフレットで記載されるものもまた、本明細書で記載されるＴＲＥＭ、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物を送達する担体として使用することができる。
担体なしの送達
本明細書で記載されるＴＲＥＭ、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物は、担体なしで、例えば、ＴＲＥＭ、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物のネイキッド送達を介して、細胞に投与することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で用いられるネイキッド送達は、担体なしの送達を指す。いくつかの実施形態では、担体なしの送達、例えば、ネイキッド送達は、部分、例えば、標的化ペプチドによる送達を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で記載されるＴＲＥＭ、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む医薬組成物は、担体なしで、例えば、ネイキッド送達を介して細胞に送達される。いくつかの実施形態では、担体なしの送達、例えば、ネイキッド送達は、部分、例えば、標的化ペプチドによる送達を含む。
ＴＲＥＭの使用
ＴＲＥＭを含む組成物（例えば、本明細書で記載されるＴＲＥＭを含む医薬組成物）は、例えば、本明細書で記載されるように、細胞中又は対象中のｔＲＮＡプールを調節するために使用することができる。実施形態において、本明細書で記載されるＴＲＥＭを含む組成物（例えば、ＴＲＥＭを含む医薬組成物）は、ｔＲＮＡプールを調節（増加又は減少）するのに十分な量及び時間で、細胞若しくは組織と接触されるか又はそれを必要とする対象に投与される。実施形態において、ｔＲＮＡプールは、第１のｔＲＮＡ部分及び追加のｔＲＮＡ部分、例えば、第２のｔＲＮＡ部分を含む。ある実施形態では、ｔＲＮＡ部分は、内在性ｔＲＮＡ及び／又はＴＲＥＭを含む。
ある実施形態では、ＴＲＥＭを含む組成物（例えば、本明細書で記載されるＴＲＥＭを含む医薬組成物）は、同義変異を含むコドン（同義変異コドン又はＳＭＣ）を含む内在性ＯＲＦを有する対象を治療する使用することができる。ある実施形態では、対象は、表１で開示される障害を有する。
ＴＲＥＭを含む組成物（例えば、本明細書で記載されるＴＲＥＭを含む医薬組成物）はまた、細胞、組織又は対象において機能を調節するために使用することができる。実施形態において、本明細書で記載されるＴＲＥＭを含む組成物（例えば、ＴＲＥＭを含む医薬組成物）は、以下のパラメーターの１つ以上を調節（増加又は減少）するのに十分な量及び時間で、細胞又は組織と接触されるか又はそれを必要とする対象に投与される：アダプター機能（例えば、同族又は非同族アダプター機能）、例えば、ポリペプチド鎖の開始又は伸長の速度、効率、堅牢性及び／又は特異性、リボソーム結合及び／又は占有；調節機能（例えば、遺伝子サイレンシング又はシグナリング）；細胞運命；ｍＲＮＡ安定性；タンパク質局在化；タンパク質フォールディング；タンク質安定性；タンパク質形質導入；又はタンパク質区画化。
パラメーターは、参照組織、細胞又は対象（例えば、健常、野生型又は対照細胞、組織、又は対象）と比較して、例えば、少なくとも５％（例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％以上）調節され得る。
本明細書で引用される全ての参考文献及び刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をさらに説明するために提供されているが、本発明の範囲を限定することを意図したものではなく；当業者に知られる他の手順、方法論、又は技術が代替的に使用され得ることが、それらの例示的な性質によって理解されるであろう。
Figure 2022534988000043
Figure 2022534988000044
Figure 2022534988000045
実施例１：一過性トランスフェクションに由来する哺乳動物生成宿主細胞におけるＴＲＥＭの製造
この実施例は、ＴＲＥＭを一過的に発現する哺乳動物宿主細胞において生成されるＴＲＥＭの製造を記載する。
この実施例において、ＴＲＥＭをコードする配列を含むプラスミドを作製するため、ｉＭｅｔ－ＣＡＴ ＴＲＥＭ、配列
Figure 2022534988000046
 の１つのコピーを含有するＤＮＡ断片が合成され、製造業者の指示書及び標準的な分子クローニング技術に従って、Ｕ６プロモーターを有するｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏ－ｍＣｈｅｒｒｙ骨格プラスミドにクローン化された。
トランスフェクション
上記の３μｇのプラスミドを使用して、製造業者の指示書に従って、９ｕＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ試薬を使用して、８０％の培養密度で蒔かれたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＴ１７５フラスコをトランスフェクトした。細胞は、精製のためにトランスフェクションの４８時間後に収集された。
小さいＲＮＡ単離キットを使用する精製
ｉＭｅｔ－過剰発現細胞を溶解した。小さいＲＮＡ（ｓＲＮＡ）画分を作製するため、Ｑｉａｇｅｎ ｍｉＲＮｅａｓｙキットなどの小さいＲＮＡ単離キットを使用して、製造業者の指示書に従って、ライセート中の全ＲＮＡプールの残りから２００ヌクレオチドより小さいＲＮＡを分離した。より大きいＲＮＡをさらに排除するため、ＬｉＣｌ沈殿を実施して、ｓＲＮＡ画分中に残留している大きいＲＮＡを除去した。最終的に、ｓＲＮＡ画分から１０ヌクレオチドより小さいＲＮＡを除去し、及び緩衝液交換のために、ｓＲＮＡ画分をＧ５０カラムに加えた。
ｓＲＮＡ画分からＴＲＥＭを単離するため、プローブ結合法が使用された。この実施例において、精製されている標的ＴＲＥＭの固有の領域に相補的なＤＮＡプローブ又は２’－ＯＭｅ核酸に対応するビオチン化捕捉プローブである、配列ＴＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＴＣＣＡＴＣＡ（配列番号４５５）を有する５’末端でビオチンにコンジュゲートされたプローブが、ｉＭｅｔ－ＣＡＴ－ＴＲＥＭに結合し、及びそれを精製するために使用された。ｓＲＮＡ画分は、アニーリング緩衝液及びビオチン化捕捉プローブとともに９０℃で４～５分間インキュベートされ、０．１℃／ｓの速度で２５℃まで冷却された。
次に、混合物は、結合緩衝液及びストレプトアビジンでコンジュゲートされたＲＮａｓｅを含まない磁性ビーズとともに１５分間インキュベートされて、ＤＮＡ－ＴＲＥＭ複合体のビーズへの結合を可能にした。次に、混合物が、磁界分離器ラックに加えられ、洗浄緩衝液で２～３回洗浄された。ビーズ上で保持されたＴＲＥＭを、ＤＮＡ捕捉プローブの完全な除去を確実にするためにＤＮａｓｅ酵素を含むか又は含まない溶出緩衝液を加えることによって溶出し、続いて薬学的に許容される賦形剤と混合して、試験ＴＲＥＭ生成物を作製した。
実施例２：安定な細胞株に由来する哺乳動物生成宿主細胞におけるＴＲＥＭの製造
この実施例は、ＴＲＥＭを安定に発現する哺乳動物宿主細胞において生成されるＴＲＥＭの製造を記載する。
ＴＲＥＭ発現レンチウイルスの調製
１０ｍｍディッシュ中でＴＲＥＭ発現レンチウイルスを調製するため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３２１６（商標））などのパッケージング細胞が、製造業者の指示書に従って、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１トランスフェクション試薬を使用して、実施例１に記載されるとおりのＴＲＥＭをコードする配列を含む９μｇのプラスミド、及び９μｇのＶｉｒａＰｏｗｅｒレンチウイルスパッケージングミックスでフォワードトランスフェクションされた。
１８時間後、培地は、新鮮な抗生物質を含まない高－ＦＢＳ（３０％ ＦＢＳ）培地で置き換えられ、２４時間後、ウイルスを含有する培地が、収集され、４℃で保存された。さらに１５ｍＬの高－ＦＢＳ培地が、プレートに加えられ、２４時間後に収集された。両方のウイルス含有培地収集物がプールされ、０．４５ミクロンフィルターに通して濾過された。ウイルスのコピー数は、製造業者のプロトコルに従って、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ｑＲＴ－ＰＣＲタイトレーションキットを使用して評価された。
ＴＲＥＭ発現レンチウイルスによる宿主細胞の形質導入
ＴＲＥＭ発現レンチウイルスで細胞を形質導入するため、レンチウイルス含有培地は、１０μｇ／ｍＬ ポリブレンの存在下で１：４の比で完全細胞培地により希釈され、細胞に加えられた。この実施例において、２９３Ｔ細胞が使用された。プレートを、１０００ｘｇで２時間回転して、細胞をスピン感染させた。１８時間後、培地を置き換えて細胞の回復を可能にした。形質導入の４８時間後、ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）抗生物質選択が、形質導入されていない対照細胞の集団とともに５～７日間実施された。
ＴＲＥＭは、実施例１に記載されるとおりに単離され、精製され、及び製剤化されて、ＴＲＥＭ調製物を得た。
フェノールクロロホルム抽出を使用する精製
細胞由来の全ＲＮＡプールは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌ．２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ２に記載されるとおりにチオシアン酸グアニジウム－フェノール－クロロホルム抽出によって細胞から回収され、エタノール沈殿によって濃縮された。次に、沈殿物中の全ｔＲＮＡプールが、Ｃａｔｈａｌａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ，１９８３；２（４）：３２９－３５に記載されるとおりに高リチウム塩条件下で沈殿によってより大きい核酸（ｒＲＮＡ及びＤＮＡを含む）から分離された。ＴＲＥＭを含有する溶出画分はさらに、プローブ結合を介して精製された。
ＴＲＥＭ画分は、アニーリング緩衝液及び精製されている標的ＴＲＥＭの固有の領域に相補的なＤＮＡプローブ又は２’－ＯＭｅ核酸に対応するビオチン化捕捉プローブとともにインキュベートされた。この実施例において、配列ＴＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＴＣＣＡＴＣＡ（配列番号４５５）を有する５’末端でビオチンにコンジュゲートされたプローブを使用して、ｉＭｅｔ－ＣＡＴを含むＴＲＥＭを精製した。混合物は、９０℃で４～５分間インキュベートされ、０．１℃／ｓの速度で２５℃まで冷却された。
次に、混合物は、結合緩衝液及びストレプトアビジンでコンジュゲートされたＲＮａｓｅを含まない磁性ビーズとともに１５分間インキュベートされて、ＤＮＡ－ＴＲＥＭ複合体のビーズへの結合を可能にした。次に、混合物が、磁界分離器ラックに加えられ、２～３回洗浄された。ビーズ上で保持されたＴＲＥＭを、ＤＮＡ捕捉プローブの完全な除去を確実にするためにＤＮａｓｅ酵素を含むか又は含まない溶出緩衝液を加えることによって溶出し、続いて薬学的に許容される賦形剤と混合して、試験ＴＲＥＭ生成物を作製した。
実施例３：安定な細胞株に由来する哺乳動物生成宿主細胞におけるＴＲＥＭの製造－２
この実施例は、哺乳動物宿主細胞から生成された粗細胞ライセートからのＴＲＥＭの製造を記載する。
ＴＲＥＭを発現する安定な細胞の作製
この実施例において、ＴＲＥＭをコードする配列を含むプラスミドは、実施例１又は２に記載されるとおりに作製される。ＴＲＥＭ発現レンチウイルスの調製及びＴＲＥＭ発現レンチウイルスによる宿主細胞の形質導入は、実施例２に記載されるとおりに実施された。
粗細胞ライセートからの精製
この実施例において、ＴＲＥＭ過剰発現細胞、ｉＭｅｔ－ＣＡＴ－ＴＲＥＭ過剰発現細胞は溶解され、溶解された材料は、アニーリング緩衝液及び精製されている標的ＴＲＥＭの固有の領域に相補的なＤＮＡプローブ又は２’－ＯＭｅ核酸に対応するビオチン化捕捉プローブとともにインキュベートされた。この実施例において、配列ＴＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＴＣＣＡＴＣＡ（配列番号４５５）を有する５’末端でビオチンにコンジュゲートされたプローブを使用して、ｉＭｅｔ－ＣＡＴを含むＴＲＥＭを精製した。混合物は、９０℃で４～５分間インキュベートされ、０．１℃／ｓの速度で２５℃まで冷却された。
次に、混合物は、結合緩衝液及びストレプトアビジンでコンジュゲートされたＲＮａｓｅを含まない磁性ビーズとともに１５分間インキュベートされて、ＤＮＡ－ＴＲＥＭ複合体のビーズへの結合を可能にした。次に、混合物が、磁界分離器ラックに加えられ、２～３回洗浄された。ビーズ上で保持されたＴＲＥＭを、ＤＮＡ捕捉プローブの完全な除去を確実にするためにＤＮａｓｅ酵素を含むか又は含まない溶出緩衝液を加えることによって溶出し、続いて薬学的に許容される賦形剤と混合して、試験ＴＲＥＭ生成物を作製した。
実施例４：哺乳動物細胞へのＴＲＥＭの送達
この実施例は、哺乳動物細胞へのＴＲＥＭの送達を記載する。
適切なフォールディングを確実にするため、ＴＲＥＭを、８５℃で２分間加熱し、続いて４℃で５分間急速冷却した。ＴＲＥＭを哺乳動物細胞に送達するため、異なる位置でＣｙ３により標識された１００ｎＭの２種のＴＲＥＭ調製物（Ｃｙ３－ｉＭＥＴ－１及びＣｙ３－ｉＭＥＴ－２）は、製造業者の指示書に従って、ＲＮＡｉＭａｘ試薬を使用してＵ２ＯＳ（Ｕ－２ ＯＳ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－９６（商標）））、Ｈ１２９９（ＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－５８０３（商標）））、及びＨｅＬａ（ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２（商標）））細胞中でトランスフェクトされた。１８時間後、トランスフェクション培地は除去され、新鮮な完全培地（Ｕ２ＯＳ：マッコイ５Ａ、１０％ ＦＢＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ；Ｈ１２９９：ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＢＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ；ＨｅＬａ：ＥＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ）と置き換えられた。
細胞へのＴＲＥＭ送達を観察するため、細胞は、生細胞解析システムにおいてモニターされた。この実施例において、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ由来）を使用して、細胞をモニターした。細胞は、４日間（２０ｘ、赤色 ５５０ｍｓ）モニターされた。
Ｃｙ３蛍光シグナルは、Ｃｙ３標識ＴＲＥＭが送達された細胞から容易に検出された。Ｃｙ３蛍光シグナルは、ＴＲＥＭが送達された細胞から４８時間かけて観察された。細胞からのＣｙ－３蛍光の検出は、Ｃｙ３標識ＴＲＥＭの細胞への送達を確証した。
実施例５：ＴＲＥＭを有する哺乳動物細胞における細胞増殖の増大
この実施例は、ＴＲＥＭ送達時の哺乳動物細胞の細胞増殖の増大を記載する。
適切なフォールディングを確実にするため、ｉＭｅｔ ＴＲＥＭは、８５℃で２分間加熱され、続いて４℃で５分間急速冷却された。ｉＭｅｔ ＴＲＥＭを哺乳動物細胞に送達するため、１００ｎＭのＣｙ３標識ｉＭｅｔ ＴＲＥＭは、製造業者の指示書に従って、ＲＮＡｉＭａｘ試薬を使用してＵ２ＯＳ（Ｕ－２ ＯＳ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－９６（商標）））、Ｈ１２９９（ＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－５８０３（商標）））、及びＨｅＬａ（ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２（商標）））細胞中でトランスフェクトされた。対照として、Ｃｙ３標識された非標的化対照ｓｉＲＮＡが細胞に送達された。１８時間後、トランスフェクション培地は除去され、新鮮な完全培地（Ｕ２ＯＳ：マッコイ５Ａ、１０％ ＦＢＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ；Ｈ１２９９：ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＢＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ；ＨｅＬａ：ＥＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ）と置き換えられた。細胞増殖における変化を観察するため、細胞は、生細胞解析システム、この実施例においてはＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ由来）で４日間（２０ｘ、位相差）モニターされた。
ｉＭｅｔ ＴＲＥＭのＵ２ＯＳ細胞（図４Ａ）、Ｈ１２９９（図４Ｂ）又はＨｅｌａ細胞（図４Ｃ）への送達は、試験された細胞株の全てにおいて細胞増殖の実質的な増大をもたらした。細胞増殖における増大は、Ｃｙ３標識された非標的化対照（Ｃｙ３－ＮＴＣ）の送達により観察される細胞増殖と比較された。データは、ＴＲＥＭの細胞への送達が、増殖及び成長の増大をもたらすことを実証している。
実施例６：ヒト細胞抽出物無細胞タンパク質合成（ｈＣＦＰＳ）ライセートにおけるＴＲＥＭ翻訳活性アッセイ
この実施例は、無細胞ライセート系における翻訳活性のＴＲＥＭ媒介性の増大を記載する。
ヒト細胞抽出物の調製
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、４０×１５０ｍｍの培養ディッシュにおいて約８０％の培養密度まで増殖させられた。細胞は、収集され、ＰＢＳ中で洗浄され、氷冷低張性溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＫＡｃ、１．５ｍＭ ＭｇＡｃ、５ｍＭ ＤＴＴ及び５×完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル）中で１：１にて再懸濁され、氷上で３０分間インキュベートされた。細胞は、ダウンス型ホモジナイザーを使用して又は２７Ｇ針にライセートを通過させることによって、＞９５％の細胞が破壊されるまで溶解された。ライセートは、１４，０００ｇにて４℃で１０分間遠心分離され、上清が回収され、低張性溶解緩衝液で希釈されて、約１５ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を得た。
ｍＲＮＡの転写
ｍＲＮＡ転写の鋳型は、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター、ベータ－グロビン３’ＵＴＲ、ｎａｎｏＬｕｃ ＯＲＦ、及び短い人工３’ＵＴＲを有するように設計された。鋳型は、ＰＣＲで増幅され、製造業者の推奨プロトコルに従って、テーリングを伴うＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によりキャップ付加され、ポリアデニル化されたｍＲＮＡを転写するために使用された。
ｈＣＦＰＳライセートにおけるＴＲＥＭ翻訳活性の発揮
翻訳反応は、３５％ ＨＥＫ２９３Ｔライセート、０．０２μＭ キャップ付加され、ポリアデニル化されたｎａｎｏＬｕｃ ｍＲＮＡ及び２μＭ 細胞精製されたＴＲＥＭ（実施例２に従って精製される）とともに翻訳緩衝液（１６ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．６、２．２ｍＭ ＭｇＡｃ、６０ｍＭ ＫＣｌ、０．０２ｍＭ完全アミノ酸混合物、１ｍＭ ＡＴＰ、０．５ｍＭ ＧＴＰ、２０ｍＭ クレアチンリン酸、０．１μｇ／μＬ クレアチンキナーゼ、０．１ｍＭ スペルミジン、２Ｕ／μｌ ＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤）中で準備された。反応は、１０μｌの三つ組において３７℃で３０分間実施された。対照反応に関して、１つの対照反応が、反応へのＴＲＥＭの添加により実施され、１つの対照反応が、反応へのｍＲＮＡの添加を伴わずに実施された。次に、ＮａｎｏＬｕｃ活性は、各反応を４０μｌの室温のＮａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、プレートリーダー中で発光を読み取ることによって検出された。
図５に示されるとおり、ｉＭＥＴ ＴＲＥＭ反応は、対照反応（緩衝液）と比較して、ＮａｎｏＬｕｃ発現において約１．５倍の増加をもたらした。データは、ＴＲＥＭの送達が、発光の増加によって反映されるとおり、ｎａｎｏＬｕｃ ｍＲＮＡ翻訳における増加をもたらすことを示す。
実施例７：哺乳動物生成宿主細胞におけるＴＲＥＭの製造、及び細胞機能を調節するその使用
この実施例は、哺乳動物宿主細胞において製造されるＴＲＥＭの製造を記載する。
プラスミド作製
この実施例において、ｔＲＮＡ遺伝子をコードするＴＲＥＭを含むプラスミドを作製するため、ｔＲＮＡｉＭｅｔ、ゲノム位置６ｐ２２．２及び配列
Figure 2022534988000047
 を有するｔＲＮＡ遺伝子（ｃｈｒ６．ｔＲＮＡ－ｉＭｅｔ（ＣＡＴ）を含むＤＮＡ断片は、以下のプライマー対を使用して、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅される：５’－ＴＧＡＧＴＴＧＧＣＡＡＣＣＴＧＴＧＧＴＡ（配列番号４５２）及び５’－ＴＴＧＧＧＴＧＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＴＣＡ（配列番号４５３）。この断片は、製造業者の指示書に従って、Ｕ６プロモーター（又は任意の他のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ動員プロモーター）を有するｐＬＫＯ．１ｐｕｒｏ骨格プラスミドにクローン化される。
トランスフェクション
上記の１ｍｇのプラスミドを使用して、１×１０５細胞／ｍＬの１Ｌの培養物の懸濁液に適応させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞）をトランスフェクトする。細胞を、トランスフェクションの２４、４８、７２、又は９６時間後に収集して、ノーザンブロットによって、又は定量的ＰＣＲ（ｑ－ＰＣＲ）によって決定されるとおりのＴＲＥＭ発現のための最適化された時点を決定する。
精製
最適化された収集細胞密度の時点で、ＴＲＥＭは、以前にＣａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２８（１２），ｅ６４（２０００）に記載されるとおりに精製される。簡潔に述べると、短いＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ）は、フェノール抽出によって細胞から回収され、エタノール沈殿によって濃縮される。次に、沈殿物中の全ｔＲＮＡが、段階的なイソプロパノール沈殿による高塩条件下でより大きい核酸（ｒＲＮＡ及びＤＮＡを含む）から分離される。ＴＲＥＭを含有する溶出画分はさらに、プローブ結合を介して精製される。ＴＲＥＭ画分は、アニーリング緩衝液及び精製されている標的ＴＲＥＭの固有の領域に相補的なＤＮＡプローブ又は２’－ＯＭｅ核酸に対応するビオチン化捕捉プローブとともにインキュベートされ、この実施例において、配列ＵＡＧＣＡＧＡＧＧＡＵＧＧＵＵＵＣＧＡＵＣＣＡＵＣＡ（配列番号４５４）を有する３’末端でビオチンにコンジュゲートされたプローブが、ｔＲＮＡ－Ｌｙｓ－ＵＵＵを含むＴＲＥＭを精製するために使用される。混合物は、９０℃で２～３分間インキュベートされ、４５℃まで急速に冷却され、４５℃で一晩インキュベートされる。次に、混合物は、４５℃まで事前に加熱された結合緩衝液及びストレプトアビジンがコンジュゲートされたＲＮａｓｅ－フリー磁性ビーズとともに３時間インキュベートされて、ＤＮＡ－ｔＲＮＡ複合体のビーズへの結合が可能になる。次に、混合物を、磁界分離器ラック中の事前に平衡化されたカラムに加え、４回洗浄した。ビーズ上に保持されたＴＲＥＭを、８０℃まで事前に加熱された溶出緩衝液を加えることによって３回溶出し、続いて薬学的に許容される賦形剤と混合して、試験ＴＲＥＭ生成物を作製する。
使用
１マイクログラムの試験ＴＲＥＭ調製物及び対照薬剤を、ＨＥＰ－３Ｂ又はＨＥＫ２９３Ｔなどの培養細胞株、組織又は対象と、対照薬剤と比較してＴＲＥＭ調製物が細胞の翻訳レベル又は活性を調節するのに十分な時間トランスフェクション、エレクトロポレーション又はリポソーム送達によって接触させる。
実施例８：哺乳動物生成宿主細胞におけるＴＲＥＭの製造、及び細胞機能を調節するその使用
この実施例は、哺乳動物宿主細胞において製造されるＴＲＥＭの製造を記載する。
プラスミド作製
この実施例において、ｔＲＮＡ遺伝子を含むＴＲＥＭをコードする配列を含むプラスミドを作製するため、ｔＲＮＡ－ｉＭｅｔ－ＣＡＴ、配列
Figure 2022534988000048
 を有するｔＲＮＡの少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡ断片が合成され、製造業者の指示書及び標準的な分子クローニング技術に従って、Ｕ６プロモーター（又は任意の他のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ動員プロモーター）を有するｐＬＫＯ．１ ｐｕｒｏ骨格プラスミドにクローン化される。
トランスフェクション
上記の１ｍｇのプラスミドを使用して、１×１０５細胞／ｍＬの１Ｌの培養物の懸濁液に適応させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞）をトランスフェクトする。細胞を、トランスフェクションの２４、４８、７２、又は９６時間後に収集して、ノーザンブロットによって、又は定量的ＰＣＲ（ｑ－ＰＣＲ）若しくはナノポアシークエンシングによって決定されるとおりのＴＲＥＭ発現のための最適化された時点を決定する。
精製
最適化された収集時点で、細胞を溶解し、２００ヌクレオチドより小さいＲＮＡのライセートからの分離を、製造業者の指示書に従って小さいＲＮＡ単離キットを使用して実施して、小さいＲＮＡ（ｓＲＮＡ）画分を作製する。
アフィニティー精製試薬を調製するため、ストレプトアビジンがコンジュゲートされたＲＮａｓｅ－フリー磁性ビーズが、精製されている標的ＴＲＥＭの固有の領域に相補的なＤＮＡプローブ又は２’－ＯＭｅ核酸に対応する２００ｍＭのビオチン化オリゴヌクレオチドとともに室温で３０分間インキュベートされる。この実施例において、配列５’ビオチン－ＴＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＴＣＣＡＴＣＡ（配列番号４５５）を有するプローブを使用して、ｔＲＮＡ－ｉＭｅｔを含むＴＲＥＭ（ＣＡＴ）を精製する。ビーズを洗浄し、７５℃で１０分間加熱する。
ｓＲＮＡ画分を７５℃で１０分間加熱し、続いて上記のアフィニティー精製試薬と混合する。混合物を室温で３時間インキュベートして、配列特異的な様式におけるＴＲＥＭのビーズ結合ＤＮＡプローブへの結合を可能にする。次に、ビーズを、２６０ｎｍでの洗浄溶液の吸光度がゼロに近くなるまで洗浄する。或いは、ビーズを３回洗浄し、最終洗浄液は、最終洗浄液中に存在する核酸の量を測定するためにＵＶ分光法によって調べられる。ビーズ上に保持されたＴＲＥＭを、８０℃まで事前に加熱され得るＲＮａｓｅ－フリー水を使用して３回溶出し、続いて薬学的に許容される賦形剤と混合して、試験ＴＲＥＭ生成物を作製する。
使用
１マイクログラムの試験ＴＲＥＭ調製物及び対照薬剤を、ＨｅＬａ、ＨＥＰ－３Ｂ又はＨＥＫ２９３Ｔなどの培養細胞株、組織又は対象と、対照薬剤と比較してＴＲＥＭ調製物が細胞の翻訳レベル又は活性を調節するのに十分な時間、トランスフェクション、エレクトロポレーション又はリポソーム送達によって接触させる。
実施例９：癌遺伝子を発現する改変された哺乳動物生成宿主細胞におけるＴＲＥＭの製造
この実施例は、Ｍｙｃを過剰発現するように改変された哺乳動物宿主細胞におけるＴＲＥＭの製造を記載する。
プラスミド作製及び宿主細胞改変
この実施例のための生成宿主細胞を作製するため、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２（商標））又はＨＥＰ－３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－８０６４（商標））が、通例の分子生物学の技術を使用して、ｃ－ｍｙｃ癌遺伝子タンパク質をコードする遺伝子配列を含有するプラスミド（例えば、ｐｃＤＮＡ３－ｃｍｙｃ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１６０１１））でトランスフェクトされる。得られた細胞株は、本明細書でＨｅＬａｍｙｃ＋宿主細胞又はＨＥＰ－３Ｂｍｙｃ＋宿主細胞と呼ばれる。
ＴＲＥＭ発現レンチウイルスの調製
ＴＲＥＭ発現レンチウイルスを調製するため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、製造業者の指示書に従ってリポフェクタミン２０００を使用して、３μｇの各パッケージングベクター（ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ、ｐＣＭＶ－ＶＳＶＧ－Ｇ及びｐＣｇｐＶ）及び実施例７に記載されるとおりのＴＲＥＭを含む９μｇのプラスミドでコトランスフェクトされる。２４時間後、培地を、新鮮な抗生物質を含まない培地と置き換え、４８時間後、ウイルス含有上清を回収し、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、０．４５μｍフィルターに通して濾過する。
ＴＲＥＭ発現レンチウイルスによる宿主細胞の形質導入
上記のとおりに調製される２ｍＬのウイルスを使用して、８μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で１００，０００個のＨｅＬａｍｙｃ＋宿主細胞又はＨＥＰ－３Ｂｍｙｃ＋宿主細胞を形質導入する。形質導入の４８時間後、ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）抗生物質選択が、形質導入されていない対照細胞の集団とともに２～７日間実施される。
ＴＲＥＭは、実施例７又は８に記載されるとおりに単離され、精製され、及び製剤化されて、ＴＲＥＭを含む組成物又はＴＲＥＭを含む調製物を得る。
実施例１０：ｔＲＮＡ合成のリプレッサーを阻害するように改変されたＴＲＥＭ生成宿主細胞の調製
この実施例は、ＴＲＥＭの生成のためのＨｅｋ２９３Ｍａｆ－／ＴＲＭ１細胞の調製を記載する。
Ｍａｆ１は、ｔＲＮＡ合成のリプレッサーである。Ｍａｆ１ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、標準的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓノックアウト技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｍａｆ１の発現レベル及び／又は活性の低減を有するＨｅｋ２９３Ｍａｆ－細胞株を生成するために、Ｍａｆ１の発現を低減するか又はＭａｆ１発現をノックアウトするようにＭａｆ１のコーディングエクソンにおけるフレームシフト変異を導入するように設計され得る）を使用して作製される。次に、この細胞株は、ｐＣＭＶ６－ＸＬ４－Ｔｒｍ１などの酵素Ｔｒｍ１（ｔＲＮＡ（グアニン２６－Ｎ２）－ジメチルトランスフェラーゼ）を改変するための発現プラスミドでトランスフェクトされ、選択マーカー、例えば、ネオマイシンで選択されて、Ｔｒｍ１を過剰発現する安定な細胞株（Ｈｅｋ２９３Ｍａｆ－／ＴＲＭ１細胞）を生成する。
Ｈｅｋ２９３Ｍａｆ－／ＴＲＭ１細胞は、実施例７～９のいずれかに記載されるとおりのＴＲＥＭの調製のための生成宿主細胞として使用され得る。
実施例１１：癌遺伝子及びｔＲＮＡ修飾酵素を過剰発現する改変された哺乳動物生成宿主細胞におけるＴＲＥＭの製造
この実施例は、Ｍｙｃ及びＴｒｍ１を過剰発現するように改変された哺乳動物宿主細胞におけるＴＲＥＭの製造を記載する。
プラスミド作製
この実施例において、ＴＲＥＭを含むプラスミドは、実施例７又は８に記載されるとおりに作製される。
宿主細胞改変、形質導入及び精製
Ｍｙｃ癌遺伝子を安定に過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔなどのヒト細胞株は、ｐＢＡＢＥｐｕｒｏ－ｃ－ｍｙｃＴ５８ＡプラスミドからＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのｍｙｃ癌遺伝子を発現するレトロウイルスの形質導入によって作製される。ｍｙｃ発現レトロウイルスを作製するため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ヒトｃ－ｍｙｃレトロウイルスベクター、ｐＢＡＢＥｐｕｒｏ－ｃ－ｍｙｃＴ５８Ａ及びパッケージングベクター、Ψ２ベクターによりリン酸カルシウム法を使用してトランスフェクトされる。６時間後、トランスフェクション培地を除去し、新鮮な培地と置き換える。２４時間のインキュベーションの後、培地を回収し、０．４５ｕｍフィルターに通して濾過する。レトロウイルス感染のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、２５００ｒｐｍにて１８℃で１時間スピン感染を使用して、レトロウイルス及びポリブレン（８ｕｇ／ｍｌ）で感染される。２４時間後、細胞培養培地を、新鮮な培地と置き換え、２４時間後、細胞は、２μｇ／ｍＬピューロマイシンで選択される。癌遺伝子ｍｙｃを安定に過剰発現する細胞が確立されると、それらは、ｐＣＭＶ６－ＸＬ４－Ｔｒｍ１プラスミドなどのＴｒｍ１プラスミドでトランスフェクトされ、この場合ネオマイシンを用いて選択マーカーで選択され、Ｍｙｃに加えてＴｒｍ１を過剰発現する安定な細胞株を生成する。並行して、ＴＲＥＭを過剰発現するレトロウイルスが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＰＬＫＯ．１－ｔＲＮＡベクターにより実施例９に記載されるとおりに作製される。
Ｍｙｃ及びＴｒｍ１を過剰発現する１×１０５個の細胞が、８μｇ／ｍＬポリブレンの存在下でＴＲＥＭウイルスにより形質導入される。培地を２４時間後に置き換える。形質導入の４８時間後、抗生物質選択が、形質導入されていない対照細胞の集団とともに２μｇ／ｍＬのピューロマイシンにより２～７日間実施される。ＴＲＥＭは、実施例７又は８に記載されるとおりの方法を使用して単離され、精製され、及び製剤化されて、ＴＲＥＭ調製物を生成する。
実施例１２：誤負荷ＴＲＥＭの生成
この実施例は、その天然のアンチコドンに対応しないアミノ酸で負荷されたＴＲＥＭの生成を記載する。
ＴＲＥＭは、実施例７～１１のいずれかに記載されるとおりに生成される。ＴＲＥＭ生成物は、当該技術分野で知られるインビトロ負荷反応を使用して異種アミノ酸により負荷される（例えば、Ｗａｌｋｅｒ ＆ Ｆｒｅｄｒｉｃｋ（２００８）Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）４４（２）：８１－６を参照されたい）。簡潔に述べると、精製されたＴＲＥＭ、例えば、ｔＲＮＡ－Ｖａｌ（ＧＴＧ）を含むＴＲＥＭを、目的の異種アミノ酸（例えば、グルタミン酸）、及び対応するアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（例えば、ｔＲＮＡの誤負荷を高めるように変異されたバリル－ｔＲＮＡシンテターゼ）とともに緩衝液中に置いて、ＴＲＥＭ負荷を誘導する。アミノアシル－ＴＲＥＭを単離するため、インビトロ負荷反応をスピンカラムに通し、Ａ２６０吸光度に基づく濃度を、酸ゲル電気泳動を使用するアミノアシル化の程度と同様に決定する。アミノアシル化ＴＲＥＭはまた、Ｒｅｚｇｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＰＮＡＳ １１０：１２２８９－１２２９４に記載されるとおり、Ｈｉｓ６タグ付きＥＦ－Ｔｕ（配列番号４５６として開示されるＥＦ－Ｔｕ）への結合に続くＮｉ－ＮＴＡアガロース上でのアフィニティークロマトグラフィー、フェノール－クロロホルム抽出及びその後の核酸の沈殿によって単離され得る。
実施例１３：ＴＲＥＭ断片の生成（インビトロ）
この実施例は、哺乳動物宿主細胞において製造されたＴＲＥＭからのインビトロでのＴＲＥＭ断片の生成を記載する。
ＴＲＥＭは、上の実施例７～１３のいずれかに記載されるとおりに作製される。ＲＮａｓｅ Ａ又はアンジオゲニンなどのｔＲＮＡ断片を生成することが知られる酵素による酵素的切断アッセイを使用して、細胞、組織又は対象に対する投与のための断片を生成する。
簡潔に述べると、上記のとおりに製造されるＴＲＥＭは、１０ｎＭの最終濃度のＲＮａｓｅ Ａを含む０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ ７．４、３０℃で１０分間、又は有効量のアンジオゲニン、及びＢＳＡを含む０．１Ｍ ＭＥＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０、３７℃で６時間のうちの１つの中においてインキュベートされる。
酵素処理の後に標的ＴＲＥＭ断片を単離するため、配列親和性精製手順が、上記のとおりに実施される。
実施例１４：細胞発現系におけるＴＲＥＭ断片の生成
この実施例は、細胞発現系におけるＴＲＥＭ断片の生成を記載する。
ＴＲＥＭを安定に過剰発現する細胞株は、実施例７～９又は１１のいずれかに記載されるとおりに作製される。ＴＲＥＭを過剰発現するＨｅｋ２９３Ｔ細胞は、０．５μｇ／ｍｌの組換えアンジオゲニンで９０分間処理された後、全ＲＮＡがトリゾールで抽出される。２００ヌクレオチドより小さいＲＮＡのサイズ選択は、製造業者の指示書に従って小さいＲＮＡ単離キットを使用して実施される。ストレプトアビジンがコンジュゲートされたＲＮａｓｅ－フリー磁性ビーズが、精製されているｔＲＮＡハーフの固有の領域に相補的なプローブ又はＤＮＡプローブに対応する２００ｍＭのビオチン化オリゴヌクレオチドとともに室温で３０分間インキュベートされる。ビーズは、７５℃で１０分間洗浄され、加熱される。サイズで選択されたＲＮＡの溶出液はまた、７５℃で１０分間加熱され、続いてビーズと混合される。ＴＲＥＭ－ビーズ混合物を、室温で３時間インキュベートして、ＴＲＥＭのビーズ結合ＤＮＡプローブへの結合が可能になる。次に、ビーズを、２６０ｎｍでの洗浄溶液がゼロに近くなるまで洗浄する。或いは、ビーズを３回洗浄し、最終洗浄液は、最終洗浄液中に存在する核酸の量を測定するためにＵＶ分光法によって調べられる。ビーズ上に保持されたＴＲＥＭは、８０℃まで事前に加熱されたＲＮａｓｅ－フリー水又は８０℃まで事前に加熱された溶出緩衝液を使用して、３回溶出される。
実施例１５：ＴＲＥＭ翻訳活性アッセイ
この実施例は、新生のポリペプチド鎖に組み込まれることになるＴＲＥＭの能力を評価するためのアッセイを記載する。
ＦＬＡＧ－ＡＡ－Ｈｉｓペプチド配列の翻訳
試験ＴＲＥＭは、ペプチドＦＬＡＧ－ＸＸＸ－Ｈｉｓ６ｘ（配列番号４５６として開示される「Ｈｉｓ６ｘ」）（ＸＸＸは、試験ＴＲＥＭアンチコドンに対応する３つの連続したコドンである）をコードするｍＲＮＡとのインビトロ翻訳反応において評価される。
ｔＲＮＡが枯渇したウサギ網状赤血球ライセート（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００１．ＲＮＡ ７：７６５－７７３）は、ＦＬＡＧ及びＨｉｓタグ翻訳に必要となる１０～２５ｕｇ／ｍＬのｔＲＮＡに加えて１０～２５ｕｇ／ｍＬの試験ＴＲＥＭとともに３０℃で１時間インキュベートされる。この実施例において、使用されるＴＲＥＭは、ｔＲＮＡ－Ｉｌｅ－ＧＡＴであり、したがって、使用されるペプチドは、ＦＬＡＧ－ＬＬＬ－Ｈｉｓ６ｘ（配列番号４５６として開示される「Ｈｉｓ６ｘ」）であり、加えられるｔＲＮＡは、以下：ｔＲＮＡ－Ａｓｐ－ＧＡＣ、ｔＲＮＡ－Ｔｙｒ－ＴＡＣ、ｔＲＮＡ－Ｌｙｓ－ＡＡＡ、ｔＲＮＡ－Ｌｙｓ－ＡＡＡＧ、ｔＲＮＡ－Ａｓｐ－ＧＡＴ、ｔＲＮＡ－Ｈｉｓ－ＣＡＴに加えて、ペプチドＦＬＡＧ及びＨＩＳタグを翻訳するために加えられるｔＲＮＡ－Ｉｌｅ－ＧＡＴである。試験ＴＲＥＭが、新生のペプチドに機能的に組み込まれることが可能かどうかを判断するため、ＥＬＩＳＡ捕捉アッセイが実施される。簡潔に述べると、固定化された抗Ｈｉｓ６Ｘ抗体（配列番号４５６として開示される「Ｈｉｓ６ｘ」）を使用して、反応混合物からＦＬＡＧ－ＬＬＬ－Ｈｉｓ６ｘペプチド（配列番号４５６として開示される「Ｈｉｓ６ｘ」）を捕捉する。次に、反応混合物が洗い落とされ、ペプチドが、ＥＬＩＳＡ検出工程において基質に対して反応する酵素がコンジュゲートされた抗ＦＬＡＧ抗体により検出される。生成されるＴＲＥＭが機能的である場合、ＦＬＡＧ－ＬＬＬ－Ｈｉｓ６ペプチド（配列番号４５６として開示される「Ｈｉｓ６」）が生成され、検出はＥＬＩＳＡ捕捉アッセイによって生じる。この実施例で記載される方法は、ＴＲＥＭの機能性の評価に使用するために採用することができる。
翻訳抑制アッセイ
このアッセイは、抑制変異をレスキューし及び完全なタンパク質の翻訳を可能にすることによって、翻訳アダプター分子機能を有する試験ＴＲＥＭを説明する。この実施例において、試験ＴＲＥＭ、ｔＲＮＡ－Ｉｌｅ－ＧＡＴは、それが、ｔＲＮＡ－Ｉｌｅ－ＧＡＴ－ＴＲＥＭ本体の配列を含有するが、ＧＡＴの代わりにＣＵＡに対応するアンチコドンを有するように生成される。ＨｅＬａ細胞は、５０ｎｇのＴＲＥＭ及びＧｅｓｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３９６：８２１－８３１に記載されるとおりのＳ２９位でＵＡＧ終止コドンを含有する変異体ＧＦＰをコードする２００ｎｇのＤＮＡプラスミドでコトランスフェクトされる。ＧＦＰプラスミド単独でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞は、陰性対照として機能する。２４時間後、細胞は、回収され、フローサイトメトリーによって蛍光回復について分析される。蛍光は、５０９ｎｍでの発光ピーク（３９５ｎｍでの励起）により読み取られる。この実施例で記載される方法は、ＴＲＥＭの機能性又はＴＲＥＭがＧＦＰ分子の停止変異をレスキューすることができるかの評価に使用するために採用することができ、全長蛍光タンパク質を生成することができる。
インビトロ翻訳アッセイ
このアッセイは、インビトロ翻訳反応において新生のポリペプチド鎖に順調に組み込まれることによって、翻訳アダプター分子機能を有する試験ＴＲＥＭを説明する。第一に、（ｉ）アンチコドンと可変ループの間の配列を標的化するか；又は（ｉｉ）アンチコドンと可変ループの間の領域に結合するアンチセンス又は相補的オリゴヌクレオチドを使用して内在性ｔＲＮＡが枯渇したウサギ網状赤血球ライセートが作製される（例えば、Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４６（１２）：６３８７－６４００を参照されたい）。１０～２５ｕｇ／ｍＬの試験ＴＲＥＭが、２ｕｇ／ｕＬのＧＦＰをコードするｍＲＮＡに加えて、枯渇ライセートに加えられる。加えられる試験ＴＲＥＭを伴うか又は伴わない、ＧＦＰ ｍＲＮＡを有する非枯渇ライセートは、陽性対照として使用される。ＧＦＰ ｍＲＮＡを有するが加えられる試験ＴＲＥＭを伴わない枯渇ライセートは、陰性対照として使用される。ＧＦＰ ｍＲＮＡ翻訳の進行は、λｅｘ４８５／λｅｍ５２８を使用して３７℃で３～５時間マイクロプレートリーダー上での蛍光の増加によってモニターされる。この実施例で記載される方法は、試験ＴＲＥＭが枯渇ライセートを補完することができて機能性である可能性が高いかの評価に使用するために採用することができる。
実施例１６：細胞状態の調節のためのアッセイ
この実施例は、細胞状態、例えば、細胞死を調節する際のＴＲＥＭの活性を検出するためのアッセイを記載する。
ＴＲＥＭ断片は、実施例１３に記載されるとおりに生成される。１ｕＭのＴＲＥＭ断片が、リポフェクタミン ３０００とともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされ、１時間間隔で１～６時間インキュベートされた後に細胞溶解される。細胞ライセートは、ウェスタンブロッティングにより分析され、ブロットは、アポトーシスの読み出し情報として完全な並びに切断されたカスパーゼ３及び９に対して抗体で探索される。細胞生存率を測定するため、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドにより室温で１５分間固定する。次に、固定され、洗浄された細胞を、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００により室温で１０分間処理し、ＰＢＳで３回洗浄する。最後に、細胞をＴＵＮＥＬアッセイ反応混合物により暗所にて３７℃で１時間処理する。試料は、フローサイトメトリーによって分析される。
実施例１７：オートファジーを調節する未負荷ＴＲＥＭの活性のためのアッセイ
この実施例は、オートファジーを調節する、例えば、誘導する能力、例えば、ＧＣＮ２－依存性ストレス応答（飢餓）経路シグナル伝達を活性化するか、ｍＴＯＲを阻害するか又はオートファジーを活性化する能力について未負荷ＴＲＥＭを試験するアッセイを記載する。
試験未負荷ＴＲＥＭ（ｕＴＲＥＭ）調製物は、トランスフェクション又はリポソーム送達を介してＨＥＫ２９３Ｔ又はＨｅＬａ細胞に送達される。ｕＴＲＥＭが送達されると、３０分～６時間の範囲の時間経過が、１時間間隔の時点で実施される。次に、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、溶解する。同じ手順が、負荷対照ＴＲＥＭ及び対照としてのランダムなＲＮＡオリゴにより実行される。細胞ライセートは、ウェスタンブロッティングにより分析され、ブロットは、ホスホ－ｅｌＦ２ａ、ＡＴＦ４、ホスホ－ＵＬＫ１、ホスホ－４ＥＢＰ１、ホスホ－ｅｌＦ２ａ、ホスホ－Ａｋｔ及びホスホ－ｐ７０Ｓ６Ｋを含むがこれらに限定されないＧＣＮ２経路活性化、ｍＴＯＲ経路阻害又はオートファジー誘導の既知の読み出し情報に対する抗体で探索される。ＧＡＰＤＨ、アクチン又はチューブリンなどの全タンパク質負荷対照、並びに非修飾（すなわち、非リン酸化）シグナル伝達タンパク質（すなわち、ホスホ－ｅｌＦ２ａのための対照としてｅｌＦ２ａを使用する）が、負荷対照として探索される。本実施例に記載の方法は、ｕＴＲＥＭの送達に際して、ＧＣＮ２飢餓シグナル経路、オートファジー経路の活性化及び／又はｍＴＯＲ経路の阻害を評価するための使用に適用し得る。
実施例１８：誤負荷ＴＲＥＭ（ｍＴＲＥＭ）の活性のためのアッセイ
この実施例は、プラスミドトランスフェクションの後のインビトロ誤負荷を使用する細胞系において生成されるｍＴＲＥＭの機能性を試験するアッセイを記載する。
この実施例において、ｍＴＲＥＭは、変異したコドンを含有するｍＲＮＡにもかかわらず、タンパク質におけるＷＴアミノ酸の組込みによって、変異体ｍＲＮＡを野生型（ＷＴ）タンパク質に翻訳することができる。それぞれ４７０ｎｍ及び３９０ｎｍの波長でのＧＦＰ励起を妨げるＴ２０３Ｉ又はＥ２２２Ｇ変異のいずれかを有するＧＦＰ ｍＲＮＡ分子が、この実施例のために使用される。ＧＦＰ蛍光を妨げるＧＦＰ変異体はまた、このアッセイにおけるレポータータンパク質として使用され得る。簡潔に述べると、ＧＦＰ Ｅ２２２Ｇ変異ｍＲＮＡ（ＧＡＧ→ＧＧＧ変異）を含有するウサギ網状赤血球ライセート及び過剰なｍＴＲＥＭ、この場合、ｔＲＮＡ－Ｇｌｕ－ＣＣＣを使用するインビトロ翻訳アッセイが使用される。陰性対照として、誤負荷ＴＲＥＭは反応に加えられない。この実施例で記載される方法は、ｍＴＲＥＭの機能性の評価に使用するために採用することができる。
実施例１９：ＴＲＥＭ調節によって寛解する可能性がある疾患関連ＳＭＣの同定
この実施例は、ＴＲＥＭベース療法のためのＳＭＣ含有タンパク質標的の選択を記載する。ＳＭＣは、情報サイレントの変異として理解することができ、それは、コドン配列を同義コドン変化させるが、翻訳又は翻訳後の性質に影響を及ぼし得る。選択方法は、３つのプログレッシブ選択工程（１）ＳＭＣの同定、（２）ｔＲＮＡ頻度の検査及び（３）疾患関連性のアノテーションにセグメント化された。これらの工程は、以下でさらに詳細に記載される。
ＳＭＣの同定
ＳＭＣ選択の出発点として、全ての既知のＳＮＰの管理された包括的リストを利用した。この実施例では、同義ＳＮＰ（すなわち、アミノ酸の変化をもたらさないコード配列の単一ヌクレオチド変化）としても知られるＳＭＣに関して選択するために、ｄｂＳＮＰ ＮＣＢＩ変異データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／及びＦＴＰサイトｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐ／ｏｒｇａｎｉｓｍｓ／）をフィルターした。簡潔に述べると、変異配列をヒトゲノム（ここではＧＲＣｈ３８ｐ７）にアライメントし、ＳＮＰＳを変異体及び変異タイプ、例えば、非コード変異体又はコード変異体及び同義又は非同義変異に分類した。同義変異を有するコード変異体として分類されたものをＳＭＣとして指定し、その次の選択に移行した。
ｔＲＮＡ頻度の検査
各ＳＭＣに対して、各野生型コドン及び変異コドン（ＳＭＣ）に対応するｔＲＮＡを特定した。ｔＲＮＡシークエンシングデータから、野生型コドン及び変異コドン（ＳＭＣ）の各々に対するｔＲＮＡの存在量を決定した。この実施例では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から以前に決定されたｔＲＮＡ－ｓｅｑ（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２，８３５－８３７（２０１５））を利用した。ｔＲＮＡ存在量の差、例えば、＞１０倍変化などの大きな差を有するＳＮＰを、優先的にその次の選択に移す。
疾患関連性の決定
ＳＮＰ ＩＤを一群の既知の疾患関連ＳＮＰにマッピングし、どのＳＮＰが疾患相関を有するかを決定した。この実施例では、我々は、ＧＷＡＳ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｗｉｄｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｇｗａｓ／）又は同様の資源を利用し、どのＳＮＰが既知の疾患相関を有するかを決定した。治療に関連する疾患相関（例えば、腫瘍原性又は神経学的障害との関連性）を有するものを、この次の工程に移行した。
最終的な選択
ＳＭＣのフィルターされたリストは、コード領域に（１）アミノ酸のコード配列を改変しないＳＭＣ；（２）ｔＲＮＡ集団の差、例えば、大きな差を有するＳＭＣ；及び（３）疾患関連性があるＳＭＣを含有する。この実施例では、最終的な選択は、目的の疾患、例えば、膵癌に基づいて行われる。ＢＣＡＲ１遺伝子は、例えば、膵癌に関連することが知られており、コドンＣＵＣからＣＵＵへの変化を引き起こすＳＮＰ（ｒｓ７１９０４５８）を有する。このコード配列変化は、取り込まれるＴＲＥＭの対応する変化をもたらす。いくつかの実施形態では、取り込まれる変異ＴＲＥＭは、例えば、存在量の約１００倍減少を有し、疾患表現型のアップレギュレーション及び／又は寛解の潜在的標的となる。
実施例２０：ＰＮＰＬ３Ａ ＳＭＣ
ＰＮＰＬ３Ａ遺伝子中のＳＭＣを同定するために、実施例１９の方法を使用した。ＰＮＰＬ３Ａ遺伝子は、ヒトにおいて非アルコール性脂肪肝疾患、線維化及び血清中アラニントランスアミナーゼの上昇の素因として同定されたｒｓ７３８４０８多型を有する。ｒｓ７３８４０８多型は、ＯＲＦに位置し及びＣＣＣからＣＣＵにコドンを変化させるＳＭＣである。ＣＣＣ及びＣＣＵコドンは両方とも、プロリンアミノ酸をコードし、鎖のその位置に野生型ＰＮＰＬ３Ａ ＯＲＦと同一なポリペプチド配列をもたらす。このポリペプチド鎖は、アディポニュートリンタンパク質である。
実施例２１：ＴＥＲＴ ＳＭＣ
ＴＥＲＴ遺伝子中のＳＭＣを同定するために、実施例１９の方法を使用した。ＴＥＲＴ遺伝子は、ヒトにおいて膵癌及び非小細胞肺癌の感受性因子として同定されたｒｓ２７３６０９８多型を有する。ｒｓ２７３６０９８多型は、ＯＲＦに位置し及びＧＣＧからＧＣＡにコドンを変化させるＳＭＣである。ＧＣＧ及びＧＣＡコドンは両方とも、アラニンアミノ酸をコードし、鎖のその位置に野生型ＴＥＲＴ ＯＲＦと同一なポリペプチド配列をもたらす。このポリペプチド鎖は、テロメラーゼリバーストランスクリプターゼタンパク質である。
実施例２２：ＡＣＨＥ ＳＭＣ
ＡＣＨＥ遺伝子中のＳＭＣを同定するために、実施例１９の方法を使用した。ＡＣＨＥ遺伝子は、アジア人集団において２型糖尿病の感受性因子として同定されたｒｓ７６３６多型を有する。ｒｓ７６３６多型は、ＯＲＦに位置し及びＣＣＣからＣＣＴにコドンを変化させるＳＭＣである。ＣＣＣ及びＣＣＴコドンは両方とも、プロリンアミノ酸をコードし、鎖のその位置に野生型ＡＣＨＥ ＯＲＦと同一なポリペプチド配列をもたらす。このポリペプチド鎖は、コリン及びアセテートへのニューロトランスミッターアセチルコリン（ＡＣｈ）の加水分解代謝を担う主要酵素であるアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）タンパク質である。
実施例２３：ＣＦＴＲ ＳＭＣ
ＣＦＴＲ遺伝子中のＳＭＣを同定するために、実施例１９の方法を使用した。ＣＦＴＲ遺伝子は、ＣＦＴＲ関連障害を有する患者に存在するｒｓ１０４２０７７多型を有する。ｒｓ１０４２０７７多型は、ＯＲＦに位置し及びＡＣＴからＡＣＧにコドンを変化させるＳＭＣである。ＡＣＴ及びＡＣＧコドンは両方とも、トレオニンアミノ酸をコードし、鎖のその位置に野生型ＣＦＴＲ ＯＲＦと同一なポリペプチド配列をもたらす。このポリペプチド鎖は、線維性嚢胞症膜コンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）である。
実施例２４：ＭＡＰ３Ｋ１ ＳＭＣ
ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子中のＳＭＣを同定するために、実施例１９の方法を使用した。ＭＡＰ３Ｋ１遺伝子は、乳癌の早期発症の感受性因子として同定されたｒｓ２２２９８８２多型を有する。ｒｓ２２２９８８２多型は、ＯＲＦに位置し及びＡＣＣからＡＣＴにコドンを変化させるＳＭＣである。ＡＣＣ及びＡＣＴコドンは両方とも、トレオニンアミノ酸をコードし、鎖のその位置に野生型ＭＡＰ３Ｋ１ ＯＲＦと同一なポリペプチド配列をもたらす。このポリペプチド鎖は、ＥＲＫ及びＪＮＫ ＭＡＰＫ経路さらには転写因子ＮＦ－κＢ経路をレギュレートするセリン／トレオニンキナーゼであるマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ１（ＭＡＰ３Ｋ１）である。
実施例２５：哺乳動物細胞精製を介するＳＭＣに相補的な候補ＴＲＥＭの生成
この実施例は、哺乳動物宿主細胞におけるＴＲＥＭの生成を記載する。
プラスミド作製
ｔＲＮＡ遺伝子を含むＴＲＥＭ、この実施例ではｔＲＮＡ－Ｓｅｒ－ＡＧＡを含むプラスミドを作製するために、配列
Figure 2022534988000049
 を有するｔＲＮＡ遺伝子の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡ断片を合成し、製造業者の指示書及び標準的分子クローン化技術に従って、Ｕ６プロモーター（又は任意の他のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ動員プロモーター）を有するｐＬＫＯ．１ｐｕｒｏ骨格プラスミドにクローン化する。
トランスフェクション
上記の１ｍｇのプラスミドを使用して、１×１０５細胞／ｍＬの１Ｌの培養物の懸濁液に適応させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞）をトランスフェクトする。トランスフェクションの２４、４８、７２又は９６時間後に細胞を収集して、ノーザンブロット、定量的ＰＣＲ（ｑ－ＰＣＲ）、ナノポアシークエンシングなどの定量方法によって決定されるとおりのＴＲＥＭ発現の最適化された時間点を決定する。
精製
最適化された収集時間点で、細胞をライシスし、フェノールクロロホルムなどの方法を用いて全ＲＮＡを精製する。製造業者の指示書／小さいＲＮＡ単離キットを用いて、２００ヌクレオチド未満のＲＮＡをライセートから分離して、小さいＲＮＡ（ｓＲＮＡ）画分を作製する。
アニーリング緩衝液及び精製される標的ＴＲＥＭの固有の領域に相補的なＤＮＡプローブに対応するビオチン化キャプチャープローブ、この実施例では、配列３’ビオチン－ＣＣＡＡＴＧＧＡＴＴＴＣＴＡＴＣＣＡＴＣＧＣＣＴＴＡＡＣＣＡＣＴＣＧＧＣＣＡＣＧＡＣＴＡＣＡＡＡＡ（配列番号４５７）を有するプローブとともに、ｓＲＮＡ画分をインキュベートして、ｔＲＮＡ－Ｓｅｒ－ＡＧＡを含むＴＲＥＭを精製する。混合物を９０℃で２～３分間インキュベートし、４５℃に急冷し、４５℃で一晩インキュベートする。次に、事前に４５℃に加熱された結合緩衝液及びストレプトアビジンコンジュゲートＲＮアーゼフリー磁気ビーズとともに混合物を３時間インキュベートし、ＤＮＡ－ｔＲＮＡ複合体をビーズに結合可能させる。次に、磁界分離器ラック中のあらかじめ平衡化されたカラムに混合物を添加し、４回洗浄する。８０℃に予熱された溶出緩衝液を添加することによりビーズ上に保持されたＴＲＥＭを３回溶出し、次に薬学的に許容される賦形剤と混合し、試験ＴＲＥＭ生成物を作製する。
実施例２６：細菌細胞精製を介するＳＭＣに相補的な候補ＴＲＥＭの生成
この実施例は、細菌宿主細胞におけるＴＲＥＭの生成を記載する。
プラスミド作製
ＴＲＥＭ、この実施例ではｔＲＮＡ遺伝子を細菌において生成するプラスミドを作製するために、配列
Figure 2022534988000050
 を有するｔＲＮＡ－Ｌｙｓ－ＵＵＵ遺伝子の少なくとも１つのコピーを含有するＤＮＡ断片を合成し、Ｐｏｎｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ４，９４７－９５９（２００９）に以前に記載されたとおりの細菌性ｔＲＮＡ発現ベクターにクローン化する。
トランスフォーメーション
ＴＲＥＭ発現プラスミドでトランスフォームされたコンピテント細菌から増殖された１×１０９細菌を、様々な細胞密度点で、この実施例ではＯＤ（６００）＝０．５、ＯＤ（６００）＝０．７、ＯＤ（６００）＝０．９で収集し、ノーザンブロット、定量的ＰＣＲ（ｑ－ＰＣＲ）、ナノポアシークエンシングなどの定量方法によって決定されるとおりのＴＲＥＭ発現の最適点を決定する。
精製
最適化された収集細胞密度点で、Ｃａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２８（１２），ｅ６４（２０００）に以前に記載されたようにＴＲＥＭを精製する。簡潔に述べると、短いＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ）をフェノール抽出により細胞から回収し、エタノール沈殿によって濃縮する。次に、ステップワイズイソプロパノール沈殿によって高塩条件下で、沈殿物中の全ｔＲＮＡをより大きな核酸（ｒＲＮＡ及びＤＮＡを含む）から分離する。プローブ結合を介してＴＲＥＭを含有する溶出画分をさらに精製する。アニーリング緩衝液及び精製される標的ＴＲＥＭの固有の領域に相補的なＤＮＡプローブに対応するビオチン化キャプチャープローブ、この実施例では、配列ＣＡＧＡＵＵＡＡＡＡＧＵＣＵＧ（配列番号４５８）を有する３’末端でビオチンにコンジュゲートされたプローブとともに、ＴＲＥＭ画分をインキュベートして、ｔＲＮＡ－Ｌｙｓ－ＵＵＵを含むＴＲＥＭを精製する。混合物を９０℃で２～３分間インキュベートし、４５℃に急冷し、４５℃で一晩インキュベートする。次に、事前に４５℃に加熱された結合緩衝液及びストレプトアビジンコンジュゲートＲＮアーゼフリー磁気ビーズとともに混合物を３時間インキュベートし、ＤＮＡ－ｔＲＮＡ複合体をビーズに結合可能させる。次にで、磁界分離器ラック中のあらかじめ平衡化されたカラムに混合物を添加し、４回洗浄する。８０℃に予熱された溶出緩衝液を添加することによりビーズ上に保持されたＴＲＥＭを３回溶出し、次に薬学的に許容される賦形剤と混合し、試験ＴＲＥＭ生成物を作製する。
実施例２７：化学合成を介するＳＭＣに相補的な候補ＴＲＥＭの生成
この実施例は、化学合成を用いるＴＲＥＭの生成を記載する。
配列
Figure 2022534988000051
 を用いて、ＴＲＥＭ、この実施例ではｔＲＮＡ－Ｔｈｒ－ＣＧＴを化学合成する。このＴＲＥＭは、例えば、Ｚｌａｔｅｖ ｅｔ．ａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，５０（１），１．２８．１－１．２８．１６に以前に記載されたように、ホスホロアミダイト化学を用いて固相化学合成によって生成される。簡潔に述べると、固形担体（例えば、制御細孔ガラス）に固定された成長鎖に、所望の順で保護ＲＮＡホスホロアミダイトを逐次添加する。付加の各サイクルは、（ｉ）成長鎖の５’－ヒドロキシルを保護するＤＭＴ基をデブロックすること、（ｉｉ）進入するホスホルアミダイトビルディングブロックに成長鎖を結合すること、（ｉｉｉ）依然として５’－ヒドロキシルを特徴とする全ての鎖状分子、すなわち、所望の進入するビルディングブロックとの結合に失敗したものにキャップすること及び（ｉｖ）新たに形成された三配位ホスファイトトリエステル連結の酸化を含む複数の工程を有する。最終的なビルディングブロックを結合して酸化した後、鎖を固形担体から切断し、５’－ヒドロキシルを保護するＤＭＴ基以外の全ての保護基を除去する。次に、ＲＰ－ＨＰＬＣによって鎖を精製し（例えば、ＤＭＴオン精製）、鎖を含有する画分を酸性条件下でＤＭＴ基の脱保護に付して、最終的なＴＲＥＭを与える。ＴＲＥＭは、５’－リン酸と３’－ＯＨを特徴とするであろう。次に、ＴＲＥＭを薬学的に許容される賦形剤と混合して、試験ＴＲＥＭ生成物を作製する。
ＴＲＥＭが負荷される必要がある場合、化学合成反応によって生成されたＴＲＥＭは、Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２９：５３０－５４７（１９７４）に以前に記載されたように、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを用いてインビトロでアミノアシル化される。簡潔に述べると、ＴＲＥＭをそのシンテターゼ及びその同族アミノとともに、この実施例では、それぞれ、トレオニル－ｔＲＮＡシンテターゼ及びトレオニンとともに、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートし、次にフェノール抽出し、Ｎｕｃ－ｔｒａｐカラムを用いて濾過し、エタノール沈澱する。次に、ＴＲＥＭを薬学的に許容される賦形剤と混合して、試験ＴＲＥＭ生成物を作製する。
実施例２８：インビトロ転写を介するＳＭＣに相補的な候補ＴＲＥＭの生成
この実施例は、インビトロ転写（ＩＶＴ）を用いるＴＲＥＭの生成を記載する。
ＴＲＥＭ、この実施例ではｔＲＮＡ－Ｌｅｕ－ＣＡＡは、Ｐｅｓｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ７（１０）：１４９６－５０５（２００１）に以前に記載されたように、配列
Figure 2022534988000052
 によるインビトロ転写を用いて生成される。簡潔に述べると、バクテリオファージＴ７プロモーターに続いてｔＲＮＡ－Ｌｅｕ－ＣＡＡ遺伝子配列を含有するＤＮＡプラスミドを線状化し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにより３７℃で４５分間インビトロ転写し、次にフェノール抽出し、Ｎｕｃ－ｔｒａｐカラムを用いて濾過し、エタノール沈澱する。次に、ＴＲＥＭを薬学的に許容される賦形剤と混合して、試験ＴＲＥＭ生成物を作製する。
ＴＲＥＭが負荷される必要がある場合、ＩＶＴ反応によって生成されたＴＲＥＭは、Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２９：５３０－５４７（１９７４）に以前に記載されたように、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを用いてインビトロでアミノアシル化される。簡潔に述べると、ＴＲＥＭをそのシンテターゼ及びその同族アミノとともに、この実施例では、それぞれ、ロイシル－ｔＲＮＡシンテターゼ及びロイシンとともに、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートし、次にフェノール抽出し、Ｎｕｃ－ｔｒａｐカラムを用いて濾過し、エタノール沈澱する。次に、ＴＲＥＭを薬学的に許容される賦形剤と混合して、試験ＴＲＥＭ生成物を作製する。
実施例２９：細胞へのＴＲＥＭ投与を介するｔＲＮＡプールの調節
この実施例は、細胞中のｔＲＮＡプールを調節するための細胞へのＴＲＥＭの投与を記載する。
実施例２５～２８のように生成されたＴＲＥＭは、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３，６７－６８（２００６）に以前に記載されたように、エレクトロポレーションを介して細胞に送達される。簡潔に述べると、１０６～１０７細胞、この実施例ではヒト上皮ＭＣＦ１０Ａ細胞をエレクトロポレーションキュベット中に移し、１～３０μｇのＴＲＥＭ、この実施例では配列
Figure 2022534988000053
 を有するｔＲＮＡ－Ｔｈｒ－ＣＧＴの添加後、穏やかに混合する。
キュベットをエレクトロポレーターに移し、デバイスを放電する（２００～３５０Ｖの電圧が使用される）。キュベットを氷上に配置し、完全培地を備えた培養ディッシュにエレクトロポレート細胞を移し、インキュベーターに２４～４８時間移す。
送達後、ｔＲＮＡプールの変化は、ナノポアシークエンシング、ｔＲＮＡシークエンシング、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ－ＰＣＲなどの方法によって定量することができる。この実施例では、Ｓａｄａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１９）１０，７５４に以前に記載されたように、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ直接ＲＮＡシークエンシングを用いてｔＲＮＡプールの変化をモニターする。
簡潔に述べると、ＴＲＥＭトランスフェクト細胞をライシスし、フェノールクロロホルムなどの方法を用いて全ＲＮＡを精製する。製造業者の指示書／小さいＲＮＡ単離キットを用いて、２００ヌクレオチド未満のＲＮＡをライセートから分離して、小さいＲＮＡ（ｓＲＮＡ）画分を作製する。
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用いて、ｓＲＮＡ画分を３７℃で３０分間脱アシル化する。等体積の１００ｍＭ酢酸Ｎａ／酢酸（ｐＨ４．８）及び１００ｍＭ ＮａＣｌの添加、続いてエタノール沈殿によって、溶液を中和する。脱アシル化ｓＲＮＡを水に溶解させ、アガロースゲル電気泳動によってそのインテグリティーを検証する。次に、製造業者の指示書に従って酵母ポリ（Ａ）テーリングキットを用いて脱アシル化ｓＲＮＡをポリアデニル化し、ｓＲＮＡポリアデニル化プールを作製する。ポリアデニル化後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩリバーストランスクリプターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＲＮＡ構造及び修飾の影響を受けにくい熱安定性グループＩＩイントロンＲＴ（ＴＧＩＲＴ，ＩｎＧｅｘ ＬＬＣ）を用いて、逆転写反応を実施しｃＤＮＡを作製する。Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅの標準的プロトコルに従って、ＲＮＡアダプター、Ｔ４リガーゼ及びライゲーション緩衝液とともにｃＤＮＡ混合物をインキュベートすることにより、シークエンシングアダプターをｃＤＮＡ混合物にライゲートする。次に、ライブラリーでナノポアシークエンシングを実施し、ゲノミックデータベース、この実施例ではゲノミックｔＲＮＡデータベースのＧｔＲＮＡｄｂに配列をマッピングする。この実施例で記載される方法は、ＴＲＥＭが投与されないものをと比較して、ＴＲＥＭが投与された細胞においてｔＲＮＡプールの評価に使用するために採用することができる。
実施例３０：リポソームを用いた細胞へのＴＲＥＭ投与を介するｔＲＮＡプールの調節
この実施例は、細胞中のｔＲＮＡプールを調節するためのリポソームベシクルを用いる細胞へのＴＲＥＭの投与を記載する。
実施例２５～２８のように生成されたＴＲＥＭは、ベシクル又は他の脂質ベース担体、例えば、リポソーム又は脂質ナノ粒子で細胞に送達される。この実施例では、製造業者の指示書に従ってリポソームキット（Ｓｉｇｍａ又は他のベンダーからのもの）を用いて、ＴＲＥＭ、この実施例では配列
Figure 2022534988000054
 を有するｔＲＮＡＴｈｒ－ＣＧＴを含有するリポソームを調製する。この実施例では、ヒト細胞系ＨＥＫ２９３Ｔを使用する。トランスフェクション日に７０～８０％の集密度が得られるように、細胞を播種する。トランスフェクションの３０分前、培地を血清フリー培地と交換し、その後、リポソームを細胞培地に添加する。
送達後、ｔＲＮＡプールの変化は、ナノポアシークエンシング、ｔＲＮＡシークエンシング（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２，８３５－８３７（２０１５））、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ－ＰＣＲなどの方法によって定量することができる。この実施例では、ｔＲＮＡシークエンシングを用いて、ｔＲＮＡプールの変化をモニターする。簡潔に述べると、ＴＲＥＭトランスフェクト細胞を溶解し、フェノールクロロホルムなどの方法を用いて全ＲＮＡを精製する。製造業者の指示書／小さいＲＮＡ単離キットを用いて、２００ヌクレオチド未満のＲＮＡをライセートから分離して、小さいＲＮＡ（ｓＲＮＡ）画分を作製する。
ワトソン・クリック面に位置するｍ１Ａ、ｍ１Ｇ及びｍ３Ｃ修飾を除去するために、ｓＲＮＡ画分をデメチラーゼ混合物で処理する。ｔＲＮＡプールの脱メチル化に続いて、ｔＲＮＡ構造の影響を受けにくい熱安定性グループＩＩイントロンＲＴ（ＴＧＩＲＴ）を用いて、ｔＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。このリバーストランスクリプターゼは、ＲＮＡライゲーションを必要とすることなくテンプレートスイッチングによりｔＲＮＡにＲＮＡシークエンシングアダプターを付加する。次に、ｔＲＮＡから作製されたライブラリーでＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングを実施し、ゲノミックデータベース、この実施例ではゲノミックｔＲＮＡデータベースのＧｔＲＮＡｄｂに配列をマッピングする。この実施例で記載される方法は、ＴＲＥＭが投与されないものをと比較して、ＴＲＥＭが投与された細胞においてｔＲＮＡプールの評価に使用するために採用することができる。
実施例３１：細胞へのＴＲＥＭコードプラスミドの送達を介するｔＲＮＡプールの調節
この実施例は、細胞中のｔＲＮＡプールを調節するための細胞へのＴＲＥＭコードプラスミドの送達を記載する。
ＴＲＥＭは、ベシクルベース担体を用いてＴＲＥＭコードプラスミドの送達を介して細胞において発現される。ヒト細胞においてＴＲＥＭを発現するために、ｔＲＮＡ遺伝子、この実施例では配列
Figure 2022534988000055
 を有するｔＲＮＡ－Ｇｌｙ－ＧＣＣを含有するプラスミドを生成する。ＤＮＡ断片のシームレスアセンブリーを用いて、この実施例ではＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いてプラスミドを生成する。この場合、目的の線状化哺乳動物発現ベクター、この実施例ではＰｐｕＭＩ酵素制限によって線状化されたｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏ－ｔｕｒｂｏＧＦＰを、ｔＲＮＡ遺伝子を含有するＤＮＡ断片と融合させる。この実施例のＤＮＡ断片は、５’→３’の順に以下のエレメント：ベクター線状化部位の３’末端からの２５ヌクレオチド長配列、Ｕ６プロモーター、ｔＲＮＡ配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終止シグナル、ベクター線状化部位の５’末端からの２５ヌクレオチド長配列を含む。
プラスミドを作製した後、製造業者の指示書に従ってＬｉｐｏｆａｃｔａｍｉｎｅ ３０００を用いて、ヒト細胞系、この実施例ではＨＥＫ２９３ＴをＴＲＥＭコードプラスミドでトランスフェクトする。送達後、ｔＲＮＡプールの変化は、ナノポアシークエンシング、ｔＲＮＡシークエンシング（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２，８３５－８３７（２０１５））、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ－ＰＣＲなどの方法によって定量することができる。この実施例では、ｔＲＮＡシークエンシングを用いて、ｔＲＮＡプールの変化をモニターする。簡潔に述べると、ＴＲＥＭトランスフェクト細胞をライシスし、フェノールクロロホルムなどの方法を用いて全ＲＮＡを精製する。製造業者の指示書／小さいＲＮＡ単離キットを用いて、２００ヌクレオチド未満のＲＮＡをライセートから分離して、小さいＲＮＡ（ｓＲＮＡ）画分を作製する。
ワトソン・クリック面に位置するｍ１Ａ、ｍ１Ｇ及びｍ３Ｃ修飾を除去するために、ｓＲＮＡ画分をデメチラーゼ混合物で処理する。ｔＲＮＡプールの脱メチル化に続いて、ｔＲＮＡ構造の影響を受けにくい熱安定性グループＩＩイントロンＲＴ（ＴＧＩＲＴ）を用いて、ｔＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。このリバーストランスクリプターゼは、ＲＮＡライゲーションを必要とすることなくテンプレートスイッチングによりｔＲＮＡにＲＮＡシークエンシングアダプターを付加する。次に、ｔＲＮＡから作製されたライブラリーでＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングを実施し、ゲノミックデータベース、この実施例ではゲノミックｔＲＮＡデータベースのＧｔＲＮＡｄｂに配列をマッピングする。この実施例で記載される方法は、ＴＲＥＭが投与されないものをと比較して、ＴＲＥＭが投与された細胞においてｔＲＮＡプールの評価に使用するために採用することができる。
実施例３２：細胞へのＴＲＥＭコードウイルスベクターの送達を介するｔＲＮＡプールの調節
この実施例は、細胞中のｔＲＮＡプールを調節するための細胞へのＴＲＥＭコードウイルスベクターの送達を記載する。
ＴＲＥＭは、ＴＲＥＭコードウイルスベクターの送達を介して細胞において発現される。この実施例では、レンチウイルスパッケージング及びＴＲＥＭをコードする送達系が使用される。簡潔に述べると、ＴＲＥＭ、この実施例では配列
Figure 2022534988000056
 を有するｔＲＮＡ－Ｇｌｙ－ＧＣＣを含むプラスミドを最初に作製することによって、ＴＲＥＭコードウイルスベクターを構築する。プラスミドは、ＤＮＡ断片のシームレスアセンブリーを用いて生成される。この場合、ｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏ－ｔｕｒｂｏＧＦＰ線状化ベクターは、実施例３１に記載されるように、ｔＲＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片にライゲートされる。ＴＲＥＭ発現レンチウイルスを調製するために、製造業者の指示書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を用いて、３μｇの各パッケージングベクター（ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ、ｐＣＭＶ－ＶＳＶＧ－Ｇ及びｐＣｇｐＶ）並びにＴＲＥＭを含む９μｇのプラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共トランスフェクトする。２４時間後、培地をフレッシュ抗生物質フリー培地と交換し、４８時間後、ウイルス含有上清を回収し、２０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、その後、０．４５のμｍフィルターに通して濾過する。
次に、目的の細胞にウイルスを感染させる。この実施例では、８μｇ／ｍＬポリブレンの存在下で２ｍＬの調製されたウイルスを用いて、１００，０００ＨｅＬａ細胞を形質導入する。形質導入の４８時間後、非形質導入対照細胞の集団とともにピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）抗生物質選択を２～７日間実施し、発現のためにそれらのゲノム中にＴＲＥＭをインテグレートした細胞を選択する。
ｔＲＮＡプールの変化は、ナノポアシークエンシング、ｔＲＮＡシークエンシング（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２，８３５－８３７（２０１５））、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ－ＰＣＲなどの方法によって定量することができる。この実施例では、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（Ｋｏｒｎｉｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１９），ｇｋｚ２０２）を用いて、ｔＲＮＡプールの変化をモニターする。簡潔に述べると、ＴＲＥＭトランスフェクト細胞をライシスし、フェノールクロロホルムなどの方法を用いて全ＲＮＡを精製する。製造業者の指示書／小さいＲＮＡ単離キットを用いて、２００ヌクレオチド未満のＲＮＡをライセートから分離して、小さいＲＮＡ（ｓＲＮＡ）画分を作製する。
ワトソン・クリック面に位置するｍ１Ａ、ｍ１Ｇ及びｍ３Ｃ修飾を除去するために、ｓＲＮＡ画分をデメチラーゼ混合物で処理する。脱メチル化に続いて、目的のｔＲＮＡの３’末端に相補的なステム－ループアダプターを用いて、プールをｃＤＮＡに逆転写する。この工程では、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩファーストストランド合成システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて逆転写（ＲＴ）を実施する。次に、目的のｔＲＮＡによってコードされるｃＤＮＡの領域に相補的なフォワードプライマー及びＲＴ時に追加されるステム－ループアダプターに相補的なユニバーサルプライマーとともに、製造業者のプロトコルに従ってＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、定量的ＰＣＲを実施する。この実施例で記載される方法は、ＴＲＥＭが投与された細胞において、ＴＲＥＭが投与されないものをと比較して、ＣＧＴコドンと対形成することができるグリシン特定分子のレベルの評価に使用するために採用することができる。
実施例３３：ＳＭＣ含有ＯＲＦに対するＴＲＥＭ投与の影響を試験するための系
この実施例は、ＴＲＥＭ投与の影響を試験するためのＳＭＣ含有ＯＲＦを発現する系、この実施例では細胞系を記載する。
ＳＭＣ含有ＯＲＦ、この実施例ではＭＡＰ３Ｋ１遺伝子のｒｓ２２２９８８２多型に及ぼすＴＲＥＭ投与の影響を試験するために、樹立細胞系、この実施例ではヒト***上皮細胞、例えば、ＭＣＦ１０Ａ又は１８４Ａ１細胞をＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓによってゲノム編集し、目的の内在性遺伝子、この実施例ではＭＡＰ３Ｋ１遺伝子の発現をノックアウトする。ＭＡＰ３Ｋ１ノックアウト細胞は、以前に記載されたように（例えば、Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．，（９５），ｄｏｉ：１０．３７９１／５２１１８（２０１５））、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いて、ＭＡＰ３Ｋ１のコードエクソンに１ｂｐを挿入してフレームシフト変異を引き起こすように生成された。簡潔に述べると、ゲノム編集に使用するのに最も有効なガイドＲＮＡを予測するオンライン設計ツール、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／ａｎａｌｙｓｉｓ－ｔｏｏｌｓ／ｓｇｒｎａ－ｄｅｓｉｇｎを用いて、オフターゲット部位切断のリスクを低減するようにゲノムマッチを最小化する２０塩基対（ｂｐ）標的配列を含有する高スコアガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を選択する。この実施例では、標的化配列は、ＣＡＧＴＧＴＧＴＧＡＡＧＡＣＧＧＣＴＧＣ（配列番号４６１）である。標的化配列は、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）プラスミド（ｐＸ３３０）（ＡｄｄｇｅｎｅプラスミドＩＤ４２２３０）にクローン化される。ＭＡＰ３Ｋ１を標的化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物及びクローン選択用のピューロマイシン発現構築物でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過的にトランスフェクトする。翌日、ピューロマイシンを用いて細胞を２日間選択し、サブクローン化して単一コロニーを形成する。ＭＡＰ３Ｋ１ ＫＯクローンは、ＰＣＲスクリーンによって同定される。得られたクローンは、ＭＡＰ３Ｋ１に対する抗体を用いてｑＰＣＲ及びイムノブロットによって検証される。
生成後、この細胞系は、一過性プラスミドトランスフェクションを介して又は安定なレンチウイルス形質導入法を介して、ＷＴ又はＳＭＣ含有ｍＲＮＡを過剰な発現するために使用される。次に、目的のＴＲＥＭを各細胞系に投与し、実施例１９～２４に記載されるようなアッセイを用いて、ＷＴ ＯＲＦと比較してＳＭＣ含有ＯＲＦに及ぼすその影響は評価する。
実施例３４：ＴＲＥＭの投与がＳＭＣ含有ＯＲＦのタンパク質発現レベルに影響を及ぼすことの決定
この実施例は、ＳＭＣ含有ＯＲＦの発現レベルを改変するためのＴＲＥＭの投与を記載する。
ＳＭＣ含有タンパク質、この実施例ではアディポニュートリンをコードするＰＮＰＬ３Ａ遺伝子由来のもののタンパク質発現レベルに及ぼすＴＲＥＭ投与の影響を試験するための系を生成するために、ＰＮＰＬ３Ａ ｒｓ７３８４０８ ＯＲＦ配列を含有するプラスミドを正常ヒト肝細胞系ＴＨＬＥ－３にトランスフェクトし、フレームシフト変異をＰＮＰＬＡ３のコードエクソンに含有させて内在性ＰＮＰＬＡ３をノックアウトするようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓにより編集する（ＴＨＬＥ ３＿ＰＮＰＬＡ３ＫＯ細胞）。対照として、野生型ＰＮＰＬ３Ａ ＯＲＦ配列を含有するプラスミドでＴＨＬＥ－３＿ＰＮＰＬＡ３ＫＯ細胞のアリコートをトランスフェクトする。
ＴＲＥＭは、ｒｓ７３８４０８ ＯＲＦ配列を含有するＴＨＬＥ－３＿ＰＮＰＬＡ３ＫＯ細胞、さらには野生型ＰＮＰＬ３Ａ ＯＲＦ配列を含有するＴＨＬＥ－３＿ＰＮＰＬＡ３ＫＯ細胞に送達される。この実施例では、ＴＲＥＭは、ＣＣＴコドンと対をなす塩基のＡＧＧアンチコドンを含有するプロリンイソアクセプターを含有する。すなわち、配列
Figure 2022534988000057
 を有する。時間経過は、３０分間～６時間の範囲内で実施され、１時間に及ぶインターバル時間点を有する。各時間点で、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ライシスする。ウェスタンブロッティングによって細胞ライセートを分析し、アディポニュートリンタンパク質に対する抗体でブロットをプローブする。ＧＡＰＤＨ、アクチン、チューブリンなどの全タンパク質ローディングコントロールもまた、ローディングコントロールとしてプローブされる。
この実施例で記載される方法は、ｒｓ７３８４０８ ＯＲＦ含有細胞におけるアディポニュートリンタンパク質の発現レベルの評価に使用するために採用することができる。
実施例３５：ＳＭＣ含有ＯＲＦのタンパク質翻訳速度を変化させるＴＲＥＭ投与
この実施例は、ＳＭＣ含有ＯＲＦのタンパク質翻訳速度を改変するためのＴＲＥＭの投与を記載する。
翻訳伸長速度に及ぼすＴＲＥＭ添加の影響をモニターするために、インビトロ翻訳システム、この実施例ではＰｒｏｍｅｇａ製のＲＲＬシステムを使用する。この場合、レポーター遺伝子、この実施例ではＧＦＰの蛍光経時変化は、翻訳速度のサロゲートである。最初に、アンチコドンと可変ループとの間の配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて内在性ｔＲＮＡが枯渇されたウサギ網状赤血球ライセートを作製する（例えば、Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４６（１２）：６３８７－６４００を参照されたい）。この実施例では、ＧＣＡコドンと対をなす塩基のＵＧＣアンチコドンを含有するアラニンイソアクセプターを含む、すなわち、配列
Figure 2022534988000058
 を有する、ＴＲＥＭは、０．１～０．５μｇ／ｕＬの、リンカーによりＧＦＰ ＯＲＦに融合された野生型ＴＥＲＴ ＯＲＦをコードするｍＲＮＡ又はリンカーによりＧＦＰ ＯＲＦに融合されたｒｓ２７３６０９８ ＴＥＲＴ ＯＲＦをコードするｍＲＮＡに加えて、インビトロ翻訳アッセイライセートに添加される。ＧＦＰ ｍＲＮＡ翻訳の進行は、１時間にわたり３０秒ごとに収集されるデータ点のλｅｘ４８５／λｅｍ５２８を用いて、３７℃のマイクロプレートリーダー上で蛍光増加によりモニターされる。蛍光変化量は、ＴＲＥＭ添加あり及びなしでｒｓ２７３６０９８ ＯＲＦと比較して野生型ＯＲＦの翻訳伸長の速度を決定するために経時的にプロットされる。この実施例で記載される方法は、ＴＲＥＭの存在下又は不在下でｒｓ２７３６０９８ ＯＲＦ及び野生型ＯＲＦの翻訳速度の評価に使用するために採用することができる。
実施例３６：ＳＭＣに相補的なＴＲＥＭの調節がＳＭＣ含有ＯＲＦに由来するタンパク質の機能を変化させることの決定
この実施例は、ＳＭＣ含有ＯＲＦの機能を変化させるためのＴＲＥＭの投与を記載する。
インビトロ翻訳（ＩＶＴ）システム（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ製のＲＲＬシステム）を用いて、ＴＲＥＭの存在下及び不在下で野生型及びＳＭＣ含有ｍＲＮＡを翻訳する。この実施例では、ＳＭＣ含有遺伝子は、アセチルコリンエステラーゼタンパク質をコードするＡＣｈＥであり、及びＴＲＥＭは、ＣＣＵコドンと対をなす塩基のＡＧＧアンチコドンを含有するプロリンイソアクセプターを含有する。すなわち、配列
Figure 2022534988000059
 を有する。
ＴＲＥＭの添加がＳＭＣ含有タンパク質、この実施例ではアセチルコリンエステラーゼタンパク質の機能活性を変化させるかを決定するために、ＡＣｈＥによるアセチルチオコリンの加水分解から生成されるチオコリンを定量するＤＴＮＢを使用する機能アッセイを使用する。簡潔に述べると、キットのＡＣｈＥ反応混合物とともに翻訳反応を室温で１０～３０分間インキュベートし、その後、ＡＣｈＥ活性に比例するＯＤ４１０ｎｍのＤＴＮＢ付加物の吸収強度を用いて、形成されたチオコリンの量を測定する。この実施例で記載される方法は、ｒｓ７６３６ ＡＣｈＥ ｍＲＮＡ又は野生型ＡＣｈＥ ｍＲＮＡの翻訳から得られるタンパク質のＡＣｈＥ活性の評価に使用するために採用することができる。
実施例３７：ＳＭＣに相補的なＴＲＥＭの調節がＳＭＣ含有ＯＲＦに由来するタンパク質の局在化を変化させることの決定
この実施例は、ＳＭＣ含有ＯＲＦの局在化を改変するためのＴＲＥＭの投与を記載する。
ＳＭＣ含有ＯＲＦのタンパク質局在化に及ぼすＴＲＥＭ投与の影響を試験する系を生成するために、ＧＦＰやｍｙｃなどのレポーターでタグ付けされたＣＦＴＲ ｒｓ１０４２０７７ ＯＲＦ配列を含有するプラスミドをヒト肺上皮細胞系ＭＲＣ－５にトランスフェクトする。対照として、レポーターでタグ付けされた野生型ＣＦＴＲ ＯＲＦ配列を含有するプラスミドも、並行してＭＲＣ－５細胞にトランスフェクトする。
ＴＲＥＭ添加がＣＦＴＲの局在化を変化させるかを決定するために、細胞をカバースリップ上に播種し、２４時間後、ＣＦＴＲ ＳＭＣに相補的なＴＲＥＭ又は対照ＴＲＥＭでトランスフェクトする。この実施例では、ＣＦＴＲ ＳＭＣに相補的なＴＲＥＭは、ＡＣＧコドンと対をなす塩基のＣＧＵアンチコドンを含有するトレオニンイソアクセプターを含む。すなわち、配列
Figure 2022534988000060
 を有する。対照ＴＲＥＭは、スクランブル配列又は負荷を防止するようにＴＲＥＭの５’末端を変化させたトレオニン配列のいずれかからなる。２４時間後、細胞を固定し、ＣＦＴＲ及びそのレポーターに対して染色し、顕微鏡下で可視化する。この実施例で記載される方法は、野生型ＣＦＴＲ及びｒｓ１０４２０７７ ＣＦＴＲの局在化の評価に使用するために採用することができる。
実施例３８：ＳＭＣに相補的なＴＲＥＭの調節がＳＭＣ含有ＯＲＦから翻訳されるタンパク質のフォールディングを変化させることの決定
この実施例は、ＳＭＣ含有ＯＲＦのフォールディングを改変するためのＴＲＥＭの投与を記載する。
プラスミド作製及びトランスフェクション
タンパク質ミスフォールディングをもたらすＳＭＣを同定するために、ＳＭＣ－ＯＲＦ含有タンパク質、この実施例ではｒｓ７１９０４５８ ＢＣＡＲ１ ＯＲＦを合成し、製造業者の指示書及び標準的分子クローン化技術に従って、ＣＭＶプロモーター（又は任意の他の哺乳動物プロモーター）及び精製タグ、この実施例ではＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫエピトープ（配列番号４６６））を含有するプラスミドにクローン化する。ここでは、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ－１プラスミドを使用する。ヒトＨｅＬａ細胞株にプラスミドをトランスフェクトする。この実施例では、ＣＵＵコドンと対をなす塩基のＵＵＧアンチコドンを含有するロイシンイソアクセプターを含む、すなわち、配列
Figure 2022534988000061
 を有する、ＴＲＥＭもまた、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトする。対照として、ＳＭＣ ＢＣＡＲ１ ＯＲＦ含有プラスミド単独で及び個別に野生型ＢＣＡＲ１ ＯＲＦ配列を含有するプラスミドで、ＢＣＡＲ１ ＫＯ細胞をトランスフェクトする。
精製
最適化された収集時間点で、この実施例ではトランスフェクションの７２時間後、細胞をライシスし、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離する。プレパック及び平衡化された抗フラグパックＭ２アガロースカラム上に重力フロー下で上清をロードする。カラムを１０～２０カラム体積のＴＢＳ（ＴｒｉｓＨＣｌ、ＮａＣｌ）又は塩含有緩衝液で洗浄する。ＦＬＡＧタグ付きタンパク質をビーズから溶出させるために、ＦＬＡＧタグペプチドとともにビーズをインキュベートする。純度品質管理のために溶出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で泳動させる。この精製は、ＴＲＥＭの存在下及び不在下でＷＴ ＢＣＡＲ１ ＯＲＦ及びＳＭＣ ＢＣＡＲ１ ＯＲＦでトランスフェクトされた細胞で実施される。
タンパク質フォールディングの初期検査
タンパク質フォールディングの影響を調べるために、熱融解を用いてＷＴ及びＳＭＣ含有ＯＲＦに由来する精製タンパク質の安定性をモニターする。この実施例では、アンフォールディングタンパク質へのインターカレーター色素の結合の変化を測定する蛍光色素（Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ）による差次的スキャニング蛍光測定（ＤＳＦ）を使用する。タンパク質フォールディングの改変は、熱融解曲線の変動をもたらす。この方法を用いて、ＴＲＥＭ添加あり及びなしのＳＭＣ ＯＲＦ由来タンパク質を対照野生型ＢＣＡＲ１と比較する。この実施例で記載される方法は、ＳＭＣ含有ＯＲＦに由来するタンパク質の熱融解曲線の評価に使用するために採用することができる。
実施例３９：ＳＭＣに相補的なＴＲＥＭの調節がＳＭＣ含有ＯＲＦの翻訳から得られる細胞表現型を改変することの決定
この実施例は、ＳＭＣ含有ＯＲＦの細胞表現型を改変するためのＴＲＥＭの投与を記載する。
細胞プロセス、この実施例では細胞遊走に及ぼすＴＲＥＭ投与の影響を試験する系を生成するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを用いてＢＣＡＲ１がノックアウトされたヒト膵癌細胞系ＰＡＮＣ－１に、ＳＭＣ含有ＯＲＦ、この実施例ではｒｓ７１９０４５８ ＢＣＡＲ１ ＯＲＦ配列を含有するプラスミドをトランスフェクトする。対照として、ＷＴ ＢＣＡＲ１ ＯＲＦ配列を含有するプラスミドでＰＡＮＣ－１ ＢＣＡＲ１ ＫＯ細胞をトランスフェクトする。
この実施例では、ＣＵＵコドンと対をなす塩基のＵＵＧアンチコドンを含有するロイシンイソアクセプターを含む、すなわち、配列
Figure 2022534988000062
 を有する、ＴＲＥＭを、ＰＡＮＣ－１細胞に送達する。スクランブル配列又は負荷を防止するようにＴＲＥＭの５’末端を変化させたロイシン配列のいずれかを含有する対照ＴＲＥＭの送達を対照として使用する。単層で８０％集密度まで細胞を増殖させ、ウェルの中心を横切って新しい１ｍｌピペットチップでスクラッチする。浮遊細胞を除去するために細胞を２回濯ぎ、培地を補充する。４８時間後、細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色する。染色された単層を写真撮影し、ギャップ距離を定量する。この実施例で記載される方法は、ＴＲＥＭが投与された細胞の遊走表現型の評価に使用するために採用することができる。
実施例４０：ＳＭＣ含有ＯＲＦの翻訳から得られる疾患状態を寛解するためのＴＲＥＭの調節
この実施例は、ＳＭＣ含有ＯＲＦから得られる疾患状態を寛解するためのＴＲＥＭレベルの増加を記載する。
疾患状態、この実施例では乳癌発症に及ぼすＴＲＥＭ投与の影響を試験する系を生成するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを用いてＢＣＡＲ１がノックアウトされたヒト非トランスフォーム***細胞系ＭＣＦ１０Ａに、ＳＭＣ含有ＯＲＦ、この実施例ではｒｓ２２２９８８２ ＭＡＰ３Ｋ１ ＯＲＦ配列を含有するプラスミドをトランスフェクトする。対照として、野生型ＭＡＰ３Ｋ１ ＯＲＦ配列を含有するプラスミドでＭＣＦ１０Ａ ＭＡＰ３Ｋ１ ＫＯ細胞をトランスフェクトする。
この実施例では、ＡＣＵコドンと対をなす塩基のＡＧＵアンチコドンを含有するトレオニンイソアクセプターを含む、すなわち、配列
Figure 2022534988000063
 を有する、ＴＲＥＭを、ＭＣＦ１０Ａ細胞に送達する。スクランブル配列又は負荷を防止するようにＴＲＥＭの５’末端を変化させたトレオニン配列のいずれかを含有する対照ＴＲＥＭの送達を対照として使用する。ＥＲＫ及びＪＮＫキナーゼのリン酸化状態に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングにより、ＭＡＰＫシグナル伝達の増加に関して細胞をモニターする。全タンパク質ローディングコントロール、例えば、ＧＡＰＤＨ、アクチン又はチューブリン、さらには非修飾（すなわち、非リン酸化）シグナリングタンパク質（すなわち、ホスホ－ＥＲＫに対する対照としてＥＲＫを使用する）をローディングコントロールとしてプローブする。また、標準的増殖及びトランスウェル浸潤アッセイを用いて、細胞増殖及び浸潤に関して細胞をモニターする。乳癌進行をモニターするために、細胞を皮下注射するか又はＳＣＩＤマウスの***脂肪パッドに注入し、キャリパーを用いて腫瘍体積を１日１回モニターし、腫瘍の長さ、幅及び高さを測定する。この実施例で記載される方法は、腫瘍表現型の評価に使用するために採用することができる。

Claims (71)

  1. 第１の配列を有するコドンを含む内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む細胞中のｔＲＮＡプールを調節する方法であって、
    任意選択により、（ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は両方の存在量についての知識を取得すること、例えば、前記細胞中の（ｉ）及び（ｉｉ）の相対量についての知識を取得することであって、（ｉ）は、前記第１の配列を有する前記ＯＲＦのコドンと対形成するアンチコドンを有するｔＲＮＡ部分（第１のｔＲＮＡ部分）であり、及び（ｉｉ）は、前記第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分（第２のｔＲＮＡ部分）である、取得することと；
    前記細胞中の前記第１のｔＲＮＡ部分及び前記第２のｔＲＮＡ部分の相対量を調節するのに十分な量及び時間で、前記細胞を、ＴＲＥＭを含む組成物と接触させることであって、前記ＴＲＥＭは、（ａ）前記第１の配列を有するコドン又は（ｂ）前記第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有する、接触させることと、
    それにより前記細胞中のｔＲＮＡプールを調節することと
    を含む方法。
  2. 第１の配列を有するコドンを含む内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する対象中のｔＲＮＡプールを調節する方法であって、
    任意選択により、前記対象中の（ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は両方の存在量についての知識を取得すること、例えば、前記対象中の（ｉ）及び（ｉｉ）の相対量についての知識を取得することであって、（ｉ）は、前記第１の配列を有する前記ＯＲＦのコドンと対形成するアンチコドンを有するｔＲＮＡ部分（第１のｔＲＮＡ部分）であり、及び（ｉｉ）は、前記対象中の前記第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分（第２のｔＲＮＡ部分）である、取得することと；
    前記対象中の前記第１のｔＲＮＡ部分及び前記第２のｔＲＮＡ部分の相対量を調節するのに十分な量及び時間で、前記対象をＴＲＥＭを含む組成物と接触させることであって、前記ＴＲＥＭは、（ａ）前記第１の配列を有するコドン又は（ｂ）前記第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有する、接触させることと、
    それにより前記対象中のｔＲＮＡプールを調節することと
    を含む方法。
  3. 内在性ＯＲＦ（このＯＲＦは、第１の配列を有するコドンを含む）を有する細胞中のｔＲＮＡプールを評価する方法であって、（ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は両方の存在量についての知識を、例えば、直接的又は間接的に、取得すること、例えば、前記細胞中の（ｉ）及び（ｉｉ）の相対量についての知識を取得することであって、（ｉ）は、第１の配列を有する前記ＯＲＦのコドンと対形成するアンチコドンを有するｔＲＮＡ部分（第１のｔＲＮＡ部分）であり、及び（ｉｉ）は、前記細胞中の前記第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分（第２のｔＲＮＡ部分）である、取得することと、それにより前記細胞中のｔＲＮＡプールを評価することと、を含む方法。
  4. 第１の配列を有するコドンを含む内在性ＯＲＦを有する対象中のｔＲＮＡプールを評価する方法であって、（ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は両方の存在量についての知識を、例えば、直接的又は間接的に、取得すること、例えば、前記対象中の（ｉ）及び（ｉｉ）の相対量についての知識を取得することであって、（ｉ）は、第１の配列を有する前記ＯＲＦのコドンと対形成するアンチコドンを有するｔＲＮＡ部分（第１のｔＲＮＡ部分）であり、及び（ｉｉ）は、前記細胞中の前記第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分（第２のｔＲＮＡ部分）である、取得することと、それにより前記対象中のｔＲＮＡプールを評価することと、を含む方法。
  5. （ｉ）についての知識を取得することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. （ｉｉ）についての知識を取得することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  7. （ｉ）及び（ｉｉ）についての知識を取得することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  8. （ｉ）についての知識を取得することが、（ｉ）の存在量、例えば、相対量に対する値を取得することを含む、請求項１～５又は７のいずれか一項に記載の方法。
  9. （ｉｉ）についての知識を取得することが、（ｉｉ）の存在量、例えば、相対量に対する値を取得することを含む、請求項１～４又は６～７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記値に応答して、前記方法が、前記第１のｔＲＮＡ部分及び前記第２のｔＲＮＡ部分の相対量を調節するのに十分な量及び時間で、前記細胞又は対象をＴＲＥＭを含む組成物と接触させることを含み、前記ＴＲＥＭが、（ａ）前記第１の配列を有するコドン又は（ｂ）前記第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有する、請求項８又は９に記載の方法。
  11. ＴＲＥＭを含む前記組成物が、ＴＲＥＭを含む医薬組成物又はＴＲＥＭを含むＧＭＰグレード組成物である、請求項１～２又は５～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ＴＲＥＭが、終止コドンと対形成するアンチコドンを含まない、請求項１～２又は５～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 同義変異を含むコドン（同義変異コドン又はＳＭＣ）を含む内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む対象中又は細胞中のｔＲＮＡプールを調節する方法であって、
    ＴＲＥＭを含む組成物を提供することであって、前記ＴＲＥＭは、前記ＳＭＣ（前記ＴＲＥＭ）と対形成するアンチコドン配列を含むイソアクセプターｔＲＮＡ部分を含む、提供することと；
    前記対象中又は前記細胞中のｔＲＮＡプールを調節するのに十分な量及び／又は時間で、前記対象を前記ＴＲＥＭを含む組成物と接触させ又は細胞の場合には前記細胞を前記ＴＲＥＭを含む組成物からのＴＲＥＭと接触させることと、
    それにより前記対象中又は前記細胞中のｔＲＮＡプールを調節することと
    を含む方法。
  14. ＴＲＥＭを含む前記組成物と接触させる前、前記対象又は前記細胞が、前記ＳＭＣと対形成するアンチコドンを有する第１のｔＲＮＡ部分（前記第１のｔＲＮＡ部分）及び前記ＳＭＣ以外のコドンと対形成するアンチコドンを有する第２のｔＲＮＡ部分（前記第２のｔＲＮＡ部分）を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 第１の配列を有するコドンを含む内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する対象を治療する方法であって、
    ＴＲＥＭを含む組成物を提供することであって、前記ＴＲＥＭは、前記第１の配列を有するＯＲＦのコドンと対形成するアンチコドン又は前記第１の配列を有するコドン以外のコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分を含む、提供することと、
    前記対象を治療するのに十分な量及び／又は時間で、前記対象を前記ＴＲＥＭを含む組成物と接触させることと、
    それにより前記対象を治療することと
    を含む方法。
  16. 同義変異を含むコドン（同義変異コドン又はＳＭＣ）を含む内在性ＯＲＦを有する対象を治療する方法であって、
    ＴＲＥＭを含む組成物を提供することであって、前記ＴＲＥＭは、前記ＳＭＣ（前記ＴＲＥＭ）と対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分を含む、提供することと；
    前記対象を治療するのに十分な量及び時間で、前記対象をＴＲＥＭを含む前記組成物と接触させることと、
    それにより前記対象を治療することと
    を含む方法。
  17. 同義変異を含むコドン（同義変異コドン又はＳＭＣ）を含む内在性ＯＲＦを有する対象を治療する方法であって、
    （ｉ）前記対象のＳＭＣ状態に対する値を、例えば、直接的又は間接的に、取得することであって、前記値は、前記対象からのサンプル中のＳＭＣの存在又は不在の尺度を含む、取得すること、及びＳＭＣを有するとして前記対象を同定すること；並びに
    （ｉｉ）前記値に応答して、ＴＲＥＭを含む組成物を前記対象に投与することであって、前記ＴＲＥＭは、前記ＳＭＣと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分を含む、投与すること、
    それにより前記対象を治療すること
    を含む方法。
  18. 第１の配列を有するコドンを含む内在性ＯＲＦを有する対象を治療する方法であって、
    （ｉ）前記対象中の前記第１の配列を有するコドンの状態に対する値を、例えば、直接的又は間接的に、取得することであって、前記値は、前記対象からのサンプル中の前記第１の配列を有するコドンの存在又は不在の尺度を含む、取得すること、及び前記第１の配列を有するコドンを有するとして前記対象を同定すること；並びに
    （ｉｉ）前記値に応答して、ＴＲＥＭを含む組成物を前記対象に投与することであって、前記ＴＲＥＭは、前記第１の配列を有するコドンと対形成するアンチコドンを有するイソアクセプターｔＲＮＡ部分を含む、投与すること、
    それにより前記対象を治療すること
    を含む方法。
  19. 第１の配列を有するコドンを含む内在性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する対象を評価する方法であって、
    前記対象中の前記第１の配列を有するコドンの状態に対する値を、例えば、直接的又は間接的に、取得することであって、前記値は、前記対象からのサンプル中の前記第１の配列を有するコドンの存在又は不在の尺度を含む、取得すること；及び
    前記第１の配列を有するコドンを有するとして前記対象を同定すること、
    それにより前記対象を評価すること
    を含む方法。
  20. 同義変異を含むコドン（同義変異コドン又はＳＭＣ）を含む内在性ＯＲＦを有する対象を評価する方法であって、
    前記対象のＳＭＣ状態に対する値を、例えば、直接的又は間接的に、取得することであって、前記値は、前記対象からのサンプル中のＳＭＣの存在又は不在の尺度を含む、取得すること；及び
    ＳＭＣを有するとして前記対象を同定すること、
    それにより前記対象を評価すること
    を含む方法。
  21. 前記対象が、表１から選ばれる障害又は症状を有するか又は有するものとして同定される、請求項２～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記細胞が、表１から選ばれる障害又は症状と関連する、請求項１又は３～２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. （ａ）前記第１の配列を有するＯＲＦコドン又は（ｂ）前記ＳＭＣが、ＴＲＥＭを含む組成物との接触の不在下で、表現型、例えば、望ましくない表現型、例えば、障害又は症状、例えば、表１から選ばれる障害又は症状と関連する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記障害又は症状が、表１で提供される疾患群、例えば、心血管、皮膚科、内分泌、免疫学、神経学、腫瘍学、眼科又は呼吸系から選ばれる、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記障害が心肥大である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記障害が冠動脈疾患である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記障害が高血圧である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記障害又は症状が肥満関連形質である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記障害が１型糖尿病である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記障害が２型糖尿病である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記障害が乾癬である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記障害が子宮内膜症である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記障害が、慢性炎症性疾患、例えば、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性結腸炎又は多面発現である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記障害がクローン病である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記障害がグレーブス病である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記障害が、アルツハイマー病、例えば、年齢発症アルツハイマー病又は家族性アルツハイマー病である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記障害が大鬱病性障害である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記障害が片頭痛である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記障害がパーキンソン病である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記障害が統合失調症である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記障害又は症状が、化学療法に対する有害な反応、例えば、好中球減少症又は白血球減少症である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記障害が、乳癌、例えば、早期発症乳癌である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記障害が卵巣癌である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記障害が結腸直腸癌である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記障害が上皮性卵巣癌でのカルボプラチン廃棄である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記障害が、多発性骨髄腫でのクロストリジウム・ディフィシレ（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記障害が、子宮内膜癌、例えば、類内膜組織診によるものである、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記障害が食道扁平上皮細胞癌である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記障害が膠芽細胞腫である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記障害が肺癌である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記障害又は症状がマクロファージ遊走阻止因子レベルである、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記障害が口腔癌及び咽頭癌である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記障害が膵癌である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記障害が近視である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記障害がＣＯＰＤである、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記障害が喘息である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記第１の配列を有するＯＲＦコドン又は前記ＳＭＣが、表１で提供される転写物に位置する、請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記第１の配列を有するＯＲＦコドン又は前記ＳＭＣが、表１で提供されるコドン、例えば、表１の「前／後のコドン」の列に列挙されるコドン、例えば、表１の前記列に列挙される第２のコドンを含む、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記第１のｔＲＮＡ部分が内在性ｔＲＮＡ及びＴＲＥＭを含む、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記第２のｔＲＮＡ部分が内在性ｔＲＮＡ及びＴＲＥＭを含む、請求項１～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. ＴＲＥＭを含む前記組成物が、本明細書に記載される方法によって、例えば、合成法によって（例えば、固相合成若しくは液相合成を用いて合成される）、インビトロ転写（ＩＶＴ）を用いて又は細胞中でＴＲＥＭをコードするベクターを発現させることによって作製される、請求項１～２又は１０～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記ＯＲＦ又は前記ＳＭＣ含有ＯＲＦがポリペプチドをコードする、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記ＯＲＦ又は前記ＳＭＣ含有ＯＲＦが染色体ＯＲＦ又はミトコンドリアＯＲＦである、請求項１～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. ＴＲＥＭを含む前記組成物がＴＲＥＭを含む医薬組成物である、請求項１～２又は１０～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. ＴＲＥＭを含む前記組成物が医薬賦形剤を含む、請求項１～２又は１０～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. ＴＲＥＭを含む前記組成物が、送達剤、例えば、リポソーム、ポリマー（例えば、ポリマーコンジュゲート）、粒子、マイクロスフェア、マイクロ粒子又はナノ粒子により投与される、請求項１～２又は１０～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. ＴＲＥＭを含む前記組成物が、担体なしで、例えば、ＴＲＥＭのネイキッド送達を介して投与される、請求項１～２又は１０～６５のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記ＴＲＥＭが、同族アダプター機能を含み、及び任意選択により、前記ＴＲＥＭが、ペプチド鎖の開始又は伸長において前記ＴＲＥＭのアンチコドンと天然で関連付けられるアミノ酸の受け入れ及び取り込みを媒介する、請求項１～２又は１０～６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記ＴＲＥＭが、表２に列挙されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡに対して少なくとも８０％同一なＲＮＡ配列又はその断片若しくは機能性断片を含む、請求項１～２又は１０～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記ＴＲＥＭが、表２に列挙されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列又はその断片を含む、請求項１～２又は１０～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記ＴＲＥＭが、表２に列挙されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に対して少なくともＸＸ％同一なＲＮＡ配列又はその断片を含み、ＸＸが、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９から選択される、請求項１～２又は１０～７０のいずれか一項に記載の方法。
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