CN113308530A - 一种带状疱疹的血液tsRNA标志物、制备及应用 - Google Patents

一种带状疱疹的血液tsRNA标志物、制备及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113308530A
CN113308530A CN202110566764.7A CN202110566764A CN113308530A CN 113308530 A CN113308530 A CN 113308530A CN 202110566764 A CN202110566764 A CN 202110566764A CN 113308530 A CN113308530 A CN 113308530A
Authority
CN
China
Prior art keywords
herpes zoster
blood
rna
tsrna
marker
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110566764.7A
Other languages
English (en)
Inventor
姚明
朱建军
徐龙生
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Hospital of Jiaxing
Original Assignee
First Hospital of Jiaxing
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Hospital of Jiaxing filed Critical First Hospital of Jiaxing
Priority to CN202110566764.7A priority Critical patent/CN113308530A/zh
Publication of CN113308530A publication Critical patent/CN113308530A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

针对当前带状疱疹诊断方法存在成本昂贵、检测时间长等不足，本发明公开一种带状疱疹的血液tsRNA标志物tRF‑Pro‑AGG‑007，其序列如SEQ ID NO.1所示；SEQ ID NO.1：GGCTCGTTGGTCTAGGGGTATGATTCTCGGT。该血液tsRNA标志物与带状疱疹表现出显著的相关性，在带状疱疹患者体内的表达显著性的低于正常健康者，可用于检测带状疱疹，与当前带状疱疹诊断方法相比，可明显降低检测成本。

Description

一种带状疱疹的血液tsRNA标志物、制备及应用
技术领域
本发明涉及带状疱疹的生物诊断技术领域，具体涉及一种带状疱疹的血液tsRNA标志物、制备及应用。
背景技术
众所周知，水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster Virus,VZV)是引起带状疱疹(Herpes Zoster)的直接原因。在初次感染后，水痘-带状疱疹病毒就会寄宿在脊神经背根神经节或者脑神经。当人体免疫力下降时，它又会被再次激活，沿着神经不断迁移至周围神经纤维，最终在皮肤上表现出疱疹，并伴随着疼痛，更严重者则会发展为带状疱疹后遗神经痛，严重影响患者的生活质量，并增加医疗负担。早诊断早治疗是避免该病的严重危害性和并发症的有效措施，因此，在带状疱疹的早期阶段进行确诊并针对性干预治疗变得极为重要。
目前为止，VZV感染的诊断通常是通过皮疹来实现的，其他的诊断手段相对较少。有研究者通过对唾液和循环血液中VZV DNA的定量分析，探索了不同体液的病毒DNA含量对带状疱疹的诊断价值；也有学者研究分析了不同的疾病程度与循环血液中VZV DNA含量的相关性；还有从皮肤病损中可以培养VZV，但这些方法成本昂贵，检测时间长，不易获得，敏感性低。因此，当前对带状疱疹的明确诊断还存在困难。
发明内容
针对当前带状疱疹诊断方法存在成本昂贵、检测时间长等不足，本发明的目的在于提供一种带状疱疹的血液tsRNA标志物，与带状疱疹表现出显著的相关性，可用于检测带状疱疹，与当前带状疱疹诊断方法相比，可明显降低检测成本。
本发明提供如下的技术方案：
一种带状疱疹的血液tsRNA标志物，所述血液tsRNA标志物为tRF-Pro-AGG-007，其序列如SEQ ID NO.1所示；
SEQ ID NO.1：GGCTCGTTGGTCTAGGGGTATGATTCTCGGT。
本发明提供的血液tsRNA标志物在带状疱疹患者血浆中的表达显著性的低于健康者。
上述血液tsRNA标志物作为检测靶标在制备带状疱疹诊断试剂中的应用。
一种检测上述血液tsRNA标志物的检测试剂，所述检测试剂为检测如权利要求1所述的血液tsRNA标志物的特异性引物、探针或芯片。
作为本发明的优选，所述特异性引物的上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示：
SEQ ID NO.2：F：5’GATCGGCTCGTTGGTCTAGG 3’；
SEQ ID NO.3：R：5’GACGTGTGCTCTTCCGATCTAC 3’。
上述检测试剂在制备带状疱疹诊断试剂中的应用。
一种带状疱疹的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒含有上述检测试剂。
作为本发明的优选，所述诊断试剂盒用于检测血液tsRNA标志物的表达量。
本发明的有益效果如下：
本发明的血液tsRNA标志物tRF-Pro-AGG-007在带状疱疹患者血浆中的表达显著性的低于健康患者，与带状疱疹表现出显著的相关性，可作为诊断带状疱疹的标志物，将其应用于带状疱疹诊断试剂以及诊断试剂盒的制备，用于带状疱疹检测，与当前带状疱疹诊断方法存在成本昂贵、检测时间长等不足，可明显降低检测成本，提高检测效率。
附图说明
图1是tRF-Pro-AGG-007在N组、A组和B组中的差异性表达。
图2是tRF-Pro-AGG-007的标准曲线。
图3是tRF-Pro-AGG-007的扩增曲线。
图4是tRF-Pro-AGG-007的熔解曲线。
图5是管家基因U6的标准曲线。
图6是管家基因U6的扩增曲线。
图7是管家基因U6的熔解曲线。
图1中***p<0.001。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
本发明的带状疱疹的血液tsRNA标志物为tRF-Pro-AGG-007，其序列如下：
SEQ ID NO.1：GGCTCGTTGGTCTAGGGGTATGATTCTCGGT。
1.病例筛选
1.1带状疱疹患者定义为皮肤出现典型疱疹，沿神经分布，伴有烧灼感或神经痛。带状疱疹后遗神经痛(PHN)患者定义为发生带状疱疹且持续疼痛时间至少大于1个月的患者。正常健康受试者为门诊同期健康体检者。所有受试者均签署知情同意书。
1.2选择2018年12月至2019年12月在嘉兴市第一医院疼痛科就诊住院的带状疱疹患者共75例分为三组，分别是N组、A组和B组：
N组为正常健康者组，血浆25份；
A组为发生带状疱疹但后期未发展为带状疱疹后遗神经痛的患者，血浆25份；
B组为发生带状疱疹但后期发展为带状疱疹后遗神经痛的患者，血浆25份；
其中各组5份用于NGS分析，其余各组20份用于qRT-PCR分析验证。
1)带状疱疹患者纳入如下标准(需同时满足)：
(1)发疹前有轻度乏力、低热、食欲不振等全身症状，自觉灼热感或神经痛，触之有明显的痛觉敏感，也可无前驱症状即发疹；
(2)病变皮肤出现簇集成群水疱，沿一侧周围神经呈带状分布；
(3)可有明显的神经痛，可为钝痛、抽搐痛或跳痛，常伴有烧灼感，多为阵发性，也可为持续性伴局部***肿大；
(4)经带状疱疹相关针对性治疗有效；
(5)美国麻醉医师学会(ASA)分级Ⅰ、Ⅱ级；
(6)签署知情同意书者，并接受后续电话随访。
2)排除标准(符合任一条件即可)：
(1)发热等其他全身或局部感染者；
(2)交感***疾病者；
(3)经药物或其他物理治疗者；
(4)精神类疾病者；
(5)误诊者(如心绞痛、肋间神经痛、胆结石、胆囊炎、阑尾炎等)；
(6)其他疾病者(如接触性皮炎、丹毒、虫咬皮炎、脓疱疮、大疱性类天疱疮等)；
(7)经后续治疗排除带状疱疹诊断者。
2.RNA抽提及质量检测
2.1样品的RNA抽提
1)所用试剂如下：
TRIzol LS Reagent(Invitrogen life technologies)；
氯仿上海化学试剂有限公司；
异丙醇上海化学试剂有限公司；
100％乙醇(上海化学试剂有限公司)；
75％乙醇(以DEPC处理的水配置)；
冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司)；
无RNA酶的水；
无RNA酶的糖原(Invitrogen life technologies)。
2)匀浆
从-70℃冰箱中取出血浆样品，解冻后于4℃12,000×g离心10分钟，去除可能存在的杂质，取250ul血浆液体，转至1.5ml的离心管中，750μl的TRIzol LS Reagent试剂，手动剧烈振荡管体至混匀。
3)两相分离
匀浆后样品于15到30℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每750μl的TRIzol LS Reagent试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的TRIzol LS Reagent的60％。
4)RNA沉淀
将水相转移到新离心管中，并加入500μl异丙醇，混匀以沉淀其中的RNA。混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃12,000×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
5)RNA清洗
移去上清液，750μl的TRIzol LS Reagent试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃7,500×g离心5分钟。
6)重新溶解RNA沉淀
去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于-70℃。
2.2RNA质量检测
1)所用试剂如下
TE：10mM，Tris-HCl pH 8，1mM EDTA(Tris-HCl，EDTA华美生物工程公司)；
0.2M MOPS，pH 7.0(MOPS华美生物工程公司)；
0.02M乙酸钠(乙酸钠上海化学试剂有限公司)；
0.01M EDTA(EDTA华美生物工程公司)；
甲醛上海化学试剂有限公司；
甲醛上样染液(Ambion)；
Gold View染料上海赛百胜基因技术有限公司；
琼脂糖生工生物工程有限公司。
2)紫外吸收测定法
使用
Figure BDA0003081206240000052
ND-1000测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零，操作方法如下：
(1)滴加1ul DEPC水或者RNA样品至测量基座的表面；
(2)液滴会自动在上下基座之间形成液柱并自动完成测定，RNA浓度及质量的各种参数将在电脑中自动生成文件；
(3)一次测定完成后，用柔软的擦镜纸擦去上下基座表面上的样本液，便可进行下一个样品的测量；
(4)测定结果(电脑自动生成的EXCEL和JPEG文件附于实验报告文件夹中)：
I、浓度测定
260nm处读值为1表示40ng RNA/ul。样品RNA浓度计算公式为：A260 X 40ng/ul；
具体计算如下：
RNA溶于20μl DEPC水中，取1ul用于测定，测得A260＝65.003：
RNA浓度＝65.003X 40ng/ul＝2600.12ng/ul；
取1ul测量以后，剩余样品RNA为19μl，剩余RNA总量为：19μl X 2600.12ng/ul＝49.4μg；
II、纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围1.8到2.1。
即使比值超出这个范围，RNA样品也一样可以用于一些普通实验中如Northern杂交，RT-PCR和RNA酶保护实验。
3)变性琼脂糖凝胶电泳
(1)制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，加入10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37％甲醛溶液(12.3M)，10×MOPS电泳缓冲液如下表1所示：
表1.10×MOPS电泳缓冲液
Figure BDA0003081206240000051
Figure BDA0003081206240000061
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米；
(2)准备RNA样品
取1μg RNA，加1倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育5分钟使样品变性；
(3)电泳上样于胶孔中，5-6V/cm电压下电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm；
(4)紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带。RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。
3.RNA前处理与cDNA合成
3.1试剂
rtStarTMtRF&tiRNA Pretreatment Kit(Cat#AS-FS-005,Arraystar)；
rtStarTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(3’and 5’adaptor)(Cat#AS-FS-003,Arraystar)。
3.2 3’末端去乙酰化处理
a)按照下表2配置去乙酰化反应液：
表2.去乙酰化反应液
Input RNA ≤5μg
Deacylation Reaction缓冲液(5×) 3uL
RNase抑制剂 1μL
无核酸酶水 xμL
总体积/样本 15μL
b)涡旋混合，37℃孵育40分钟；
c)依次加入19μL Deacylation Stop Buffer，涡旋混合，室温孵育5分钟，终止去乙酰化反应。
3.3去除3’-cP与添加5’-P
d)将上一步骤的反应液置于冰上，依次加入下表3中的试剂：
表3.待加入试剂
Figure BDA0003081206240000062
Figure BDA0003081206240000071
e)涡旋混合，37℃孵育40分钟；
f)70℃孵育5分钟以终止反应；
g)重新抽提RNA。
3.4去甲基化处理
h)融解除Demethylase和Reverse Transcriptase外的所有试剂，涡旋混合，置于冰上。在使用前从冰箱将两种酶取出，简单离心，以待使用；
i)按照下表4配置去甲基化反应液：
表4.去甲基化反应液
无核酸酶水 xμL
Demethylation Reaction缓冲液(5×) 10μL
脱甲基酶 5μL
RNase抑制剂 1μL
Input RNA ≤5μg
总体积/样本 50μL
j)进行去甲基化反应：
在37℃水浴锅中孵育2小时，然后加入40μl Nuclease-free Water与10μlDemethylation Stop Buffer(5×)，终止去甲基化反应；
k)重新抽提RNA。
3.5连接3′接头
l)在200μL无RNA酶的PCR管中依次加入下列表5的试剂：
表5.待加入试剂
无核酸酶水 variable
样本RNA 0.5-3μL
3’Adaptor 0.5μL
RNA Spike-in 0.5μL
总体积 3.5μL
m)在热循环仪中70℃孵育2分钟，然后将PCR管移至冰上；
n)添加下列表6的反应试剂：
表6.待加入反应试剂
3’Ligation Reaction Buffer(2X) 5μL
3’Ligation Enzyme Mix 1.5μL
总体积 10μL
o)在热循环仪中25℃孵育1小时；
注意：延长孵育时间和降低孵育温度(18h；16℃)可以增大甲基化修饰RNA比如piRNA的连接效率，但同时也可能形成串联产物。
3.6反转录引物(Reverse Transcription Primer)杂交
此步反应对抑制接头二聚体的形成十分关键。反转录引物可与多余的3’接头杂交，从而将单链DNA接头转化为双链DNA分子。而双链DNA分子不是T4 RNA Ligase 1的底物，因此多余的3’接头不会与5’接头连接；
注意：如果总RNA起始量为100ng，将反转录引物用无酶水1:2稀释。
p)向步骤o的PCR管里加入下列表7的试剂：
表7.待加入的试剂
无核酸酶水 2.3μL
Reverse Transcription Primer 0.5μL
总体积 12.8μL
q)在热循环仪中依次75℃孵育5min，37℃孵育15min,25℃孵育15min。
3.7连接5′接头
r)在20μL无酶水中重悬5’接头；
注意：如果总RNA起始量为100ng，将5′接头用无酶水1:2稀释；
s)在单独的无核酸酶的200μL PCR管中加入0.6NμL的5’接头。(N为实验所处理的样本数目)在热循环仪中70℃孵育2分钟，然后立即在冰上冷却；
注意：将剩余的5’重悬接头储存在-80℃冰箱。为了避免RNA降解，请在接头变性后30分钟内使用接头；
t)向步骤q中的PCR管中依次加入下列表8中的反应物，充分混合：
表8.待加入的反应物
5′Adaptor(denatured) 0.5μL
5′Ligation Reaction Buffer 0.5μL
5′Ligation Enzyme Mix 1.2μL
总体积 μL
u)热循环仪25℃孵育1小时。
3.8反转录反应
v)在无核酸酶的200μL PCR管加入下列表9的反应物：
表9.待加入的反应物
Adaptor Ligated RNA 15μL
First-Strand Synthesis Reaction Buffer 4μL
RNase Inhibitor 0.5μL
Reverse Transcriptase 0.5μL
总体积 20μL
w)热循环仪50℃孵育1小时，然后立即在冰上冷却，反应产物可直接用于PCR扩增反应。
注意：如果未打算立即进行PCR扩增，热循环仪70℃孵育15分钟以终止RT反应。然后将样本置于-20℃冰箱保存。
4.NGS高通量测序和分析
4.1高通量测序
测序实验前，我们使用NanoDrop ND-1000提取并测定总RNA样品的纯度和浓度。总RNA样本经过预处理，去除一些干扰RNA-seq文库构建的RNA修饰。再将每个样本的总RNA依次连接到3'和5'小RNA适配器上。然后利用Illumina公司的RT引物和扩增引物合成并扩增cDNA。随后，从PAGE凝胶中提取并纯化～134-160bp PCR扩增片段。最后，用Agilent 2100生物分析仪对完成的文库进行定量。之后将文库变性、稀释至装载量1.3ml、装载浓度1.8pM。稀释后的文库载入试剂盒。根据制造商的说明，使用NextSeq 500/550V2 Kit在IlluminaNextSeq 500***上进行了50个周期的测序。
4.2生物学信息分析
首先对原始的Illumina读取进行处理，生成了三组各5个样本的cDNA文库。进行实验样本质控时，我们发现N组的其中一个样本在该组中存在的组内差异较大，考虑后决定将其剔除。之后，将测序读取段分别用cutadapt进行5’端和3’端的修整，并且丢弃非读取段(长度<14nt或长度>40nt)，并以FASTA格式进行记录。tRNA衍生片段的丰度是通过它们的测序计数来评估的，以每百万总比对读数(CPM)来标准化，并将CPM低于20的序列从分析中剔除。
4.3数据分析
我们以Fold change>1.5,P<0.05作为条件来进行筛选差异表达的tRNA衍生片段。同时，我们使用Off-Line base Caller软件v1.8进行图像分析和调用。主成分分析(PCA)、Venn图、层次聚类、散点图和火山图等分析图均在R语言中执行，用于对所表达的tRNA衍生片段进行统计分析和绘图。使用SPSS 25.0进行计算。数据分布的正态性采用KolmogorovSmirnov(KS)检验。正态分布的变量用单因素方差分析进行比较，数值用均数±标准差(SD)表示。对于分布异常的变量，采用Mann Whitney U检验进行比较，非正态分布的变量以中位数(四分位间距)表示。所有P值均为双侧且P<0.05为差异有统计学意义。
通过对深度测序的NGS的数据进行进一步分析发现，健康体检者组与带状疱疹患者组的受试者血浆中tRF-Pro-AGG-007片段表达存在差异，结果见表10所示。
表10.tRF-Pro-AGG-007的NGS数据分析结果(n＝5)
组别 tRF名称 类型 长度(nt) Fold Change log2FC P值 Up/Down
A vs N tRF-Pro-TGG-007 tRF-5c 31 0.034682352 -4.84965445 0.000357534 down
B vs N tRF-Pro-TGG-007 tRF-5c 31 0.057147678 -4.12916132 0.000621901 down
从上表中可以看出，带状疱疹但后期未发展为带状疱疹后遗神经痛的患者即A组，与正常健康者组即N组的P值为0.000357534，小于0.05，存在显著性差异。带状疱疹且后期发展为带状疱疹后遗神经痛的患者，即B组与正常健康者组即N组的P值为0.000621901，小于0.05，存在显著性差异。即带状疱疹患者和正常健康者血浆中tsRNA标志物tRF-Pro-AGG-007的表达存在显著性差异，带状疱疹患者明显低于正常健康者。
5.合成的cDNA用于实时定量PCR验证
采用qRT-PCR技术对更多的临床血浆样本进行tRF-Pro-AGG-007的定量分析，以对上述NGS的数据分析结果进行验证，共进行了60个临床样本(75例样本中NGS分析外的其余样本)的qRT-PCR验证，其中N组20例、A组20例、B组20例，结果如图1所示。
从图1中可以看出，相较于N组而言，tRF-Pro-AGG-007在A组和B组中均显著下调，***p<0.001。这一结果表明，tRF-Pro-AGG-007可作为带状疱疹疾病诊断的生物标志物。
具体的qRT-PCR过程如下。
5.1试剂：2X PCR master mix(Arraystar)；
仪器：洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；
引物设计软件：Primer 5.0；
QuantStudioTM5Real-time PCR System(Applied Biosystems)。
5.2设计引物
所用tRF-Pro-AGG-007的特异性引物的上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示：
SEQ ID NO.2：F：5’GATCGGCTCGTTGGTCTAGG 3’；
SEQ ID NO.3：R：5’GACGTGTGCTCTTCCGATCTAC 3’。
退火温度60℃，产物长度55bp。
所用内参基因U6的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物序列如SEQ IDNO.5所示：
SEQ ID NO.4：F:5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT 3’；
SEQ ID NO.5：R:5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT 3’。
退火温度60℃，产物长度89bp。
5.3制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板
实时定量PCR时各样品加样量均为2μl，然而由于受RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的2μl体积的cDNA其含量并不完全相同，为校正此差异，我们使用管家基因U6(不同样品间表达量基本恒定)作为内参。
1)针对每一需要测量的基因(即tRF-Pro-AGG-007)和管家基因(即内参基因U6)，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应，反应体系如表11所示；
表11.PCR反应体系
2×Master Mix 5μl
10uM的PCR特异引物F 0.5μl
10uM的PCR特异引物R 0.5μl
cDNA 2μl
加水至总体积为 10μl
轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心，设置PCR反应：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))；
2)PCR产物与100bp DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带；
3)将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为1，分别稀释为：
1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9，这几个梯度浓度的DNA。
5.4进行Realtime PCR反应
4)将所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系。体系配置如下表12所示：
表12.Realtime PCR反应体系
2×Master Mix 5μl
10uM的PCR特异引物F 0.5μl
10uM的PCR特异引物R 0.5μl
加水至总体积为 8μl
轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心；
5)加样
(1)将8ul混合液加到384-PCR板对应的每个孔中；
(2)再加入对应的2μl cDNA；
(3)小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合；
(4)在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上；
6)将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应：
(1)所有的指标均按以下程序进行：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))；
(2)为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/秒)进行。
5.5结果与计算
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量，其中，tRF-Pro-AGG-007的标准曲线、扩增曲线和溶解曲线分别见图2、3、4，管家基因U6的标准曲线、扩增曲线和溶解曲线分别见图5、6、7。
序列表
<110> 嘉兴市第一医院
<120> 一种带状疱疹的血液tsRNA标志物、制备及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> tRF-Pro-AGG-007的DNA序列(tsRNA的DNA序列)
<400> 1
ggctcgttgg tctaggggta tgattctcgg t 31
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> tRF-Pro-AGG-007的上游引物的DNA序列(引物)
<400> 2
gatcggctcg ttggtctagg 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> tRF-Pro-AGG-007的下游引物的DNA序列(引物)
<400> 3
gacgtgtgct cttccgatct ac 22
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> U6基因的上游引物的DNA序列(引物)
<400> 4
gcttcggcag cacatatact aaaat 25
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> U6基因的下游引物的DNA序列(引物)
<400> 5
cgcttcacga atttgcgtgt cat 23

Claims (7)

1.一种带状疱疹的血液tsRNA标志物，其特征在于，血液标志物tsRNA为tRF-Pro-AGG-007，其序列如SEQ ID NO.1所示；
SEQ ID NO.1：GGCTCGTTGGTCTAGGGGTATGATTCTCGGT。
2.如权利要求1所述的血液tsRNA标志物作为检测靶标在制备带状疱疹诊断试剂中的应用。
3.一种检测如权利要求1所述的血液tsRNA标志物的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂为检测如权利要求1所述的血液tsRNA标志物的特异性引物、探针或芯片。
4.根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述特异性引物的上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示：
SEQ ID NO.2：F：5’GATCGGCTCGTTGGTCTAGG 3’；
SEQ ID NO.3：R：5’GACGTGTGCTCTTCCGATCTAC 3’。
5.如权利要求3或4所述的检测试剂在制备带状疱疹诊断试剂中的应用。
6.一种带状疱疹的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒含有如权利要求3或4所述的检测试剂。
7.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒用于检测如权利要求1所述的血液tsRNA标志物的表达量。
CN202110566764.7A 2021-05-24 2021-05-24 一种带状疱疹的血液tsRNA标志物、制备及应用 Pending CN113308530A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110566764.7A CN113308530A (zh) 2021-05-24 2021-05-24 一种带状疱疹的血液tsRNA标志物、制备及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110566764.7A CN113308530A (zh) 2021-05-24 2021-05-24 一种带状疱疹的血液tsRNA标志物、制备及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113308530A true CN113308530A (zh) 2021-08-27

Family

ID=77374329

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110566764.7A Pending CN113308530A (zh) 2021-05-24 2021-05-24 一种带状疱疹的血液tsRNA标志物、制备及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113308530A (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130197067A1 (en) * 2010-07-08 2013-08-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Neuroprotective molecules and methods of treating neurological disorders and inducing stress granules
CN108165613A (zh) * 2017-12-26 2018-06-15 上海英拜生物科技有限公司 一种检测外泌体tRFRNA的方法
CN109999199A (zh) * 2019-03-21 2019-07-12 浙江大学 tiRNA作为药物靶点在结直肠癌转移治疗中的应用
CN111778335A (zh) * 2020-07-17 2020-10-16 王延博 用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织的tsRNA标志物、探针及其应用
EP3725897A1 (en) * 2017-12-13 2020-10-21 Hiroshima University Method for assisting detection of head and neck cancer
CN111826444A (zh) * 2020-07-17 2020-10-27 南京大学 一种与胰腺癌相关的血清/血浆tsRNA标志物、探针及其应用
WO2020243560A1 (en) * 2019-05-31 2020-12-03 Flagship Pioneering, Inc. Uses of trem compositions to modulate trna pools
CN112251508A (zh) * 2020-09-25 2021-01-22 徐州医科大学 一种与非梗阻性无***症诊断相关的***外泌体tsRNA标志物及其应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130197067A1 (en) * 2010-07-08 2013-08-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Neuroprotective molecules and methods of treating neurological disorders and inducing stress granules
EP3725897A1 (en) * 2017-12-13 2020-10-21 Hiroshima University Method for assisting detection of head and neck cancer
CN108165613A (zh) * 2017-12-26 2018-06-15 上海英拜生物科技有限公司 一种检测外泌体tRFRNA的方法
CN109999199A (zh) * 2019-03-21 2019-07-12 浙江大学 tiRNA作为药物靶点在结直肠癌转移治疗中的应用
WO2020243560A1 (en) * 2019-05-31 2020-12-03 Flagship Pioneering, Inc. Uses of trem compositions to modulate trna pools
CN111778335A (zh) * 2020-07-17 2020-10-16 王延博 用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织的tsRNA标志物、探针及其应用
CN111826444A (zh) * 2020-07-17 2020-10-27 南京大学 一种与胰腺癌相关的血清/血浆tsRNA标志物、探针及其应用
CN112251508A (zh) * 2020-09-25 2021-01-22 徐州医科大学 一种与非梗阻性无***症诊断相关的***外泌体tsRNA标志物及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11220713B2 (en) MicroRNAs as biomarkers for endometriosis
Martinez et al. Extracellular microRNAs profile in human follicular fluid and IVF outcomes
CN113604564A (zh) 一种检测外泌体相关microRNA分子的方法
US9951387B2 (en) Methods for detection of depressive disorders
US20120322680A1 (en) Use of mirnas as biomarkers in glioma diagnosis
JP2007509613A (ja) 遺伝子発現プロファイリングのためのｑＲＴ−ＰＣＲアッセイシステム
CN114085903B (zh) 检测线粒体3243a＞g突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法
Kupfer et al. Examining smoking-induced differential gene expression changes in buccal mucosa
EP2759602A1 (en) Non-invasive prenatal genetic diagnostic methods
Prieto-Fernández et al. A comprehensive study of vesicular and non-vesicular miRNAs from a volume of cerebrospinal fluid compatible with clinical practice
CN105441565B (zh) 作为骨肉瘤诊治靶标的miRNA
CN112824535A (zh) 基因突变多重检测用引物组合物及其试剂盒
CN108148908B (zh) 动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断分子标记物的应用
CN112322718B (zh) 一种早发冠心病基因检测试剂盒
Elkhodiry et al. miR-155 and functional proteins of CD8+ T cells as potential prognostic biomarkers for relapsing-remitting multiple sclerosis
CN113308530A (zh) 一种带状疱疹的血液tsRNA标志物、制备及应用
US20160208346A1 (en) Method and composition for detection of oncogenic hpv
CN113388698A (zh) 一种可诊断带状疱疹的血液tsRNA标志物、制备及应用
CN113308529A (zh) 一种可用于带状疱疹后遗神经痛诊断的血液tsRNA标志物、制备及应用
Kim et al. Highly sensitive and multiplexed one-step RT-qPCR for profiling genes involved in the circadian rhythm using microparticles
Li et al. A comprehensive evaluation of differentially expressed mRNAs and lncRNAs in cystitis glandularis with gene ontology, KEGG pathway, and ceRNA network analysis
CN105925686B (zh) 用于辅助检测非小细胞肺癌的标记物、引物以及检测方法
Carvalho-Silva et al. A major downregulation of circulating microRNAs in Zika acutely infected patients: potential implications in innate and adaptive immune response signaling pathways
CN111051531A (zh) 短核酸的多重检测
EP3190190B1 (en) Method for diagnosing fibromyalgia using micrornas

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination