JP2022527812A - Antibodies to liraglutide and their use - Google Patents
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Abstract
本発明は、リラグルチドフィブリルおよび／またはセマグルチドフィブリルの同定および／または定量化などのための、特定の抗体およびその使用に関する。The present invention relates to specific antibodies and their use, such as for the identification and / or quantification of liraglutide fibrils and / or semaglutide fibrils.
Description
本発明は、リラグルチドのフィブリルまたはセマグルチドのフィブリルに特異的な抗体、ならびにそのような抗体の使用に関する。 The present invention relates to antibodies specific for liraglutide fibrils or semaglutide fibrils, as well as the use of such antibodies.
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本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年３月３０日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、１９００４２ＷＯ０１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、サイズは１１１キロバイトである。
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ヒトＧＬＰ－１（７－３７）およびその類似体は、溶液中に様々なタイプの凝集体を形成する傾向があることが知られている。本明細書においてフィブリルと称されるそのような凝集体の特定のタイプは、不可逆的に形成され、液体形態での患者への投与のために、医薬品において最小限に保たれるべきであると考えられる。これまでのところ、そのようなフィブリルをアッセイ（すなわち、同定および／または定量化）するための好ましい方法は、フィブリルに結合すると発光スペクトルを変化させるフルオロフォアであるチオフラビンＴ（ＴｈＴ）に基づくものであり、例えば、本明細書のアッセイ（Ｖ）を参照されたい。ＴｈＴを介してペプチドフィブリルを検出するアッセイは、多くの場合、最初に試料にストレスを与えてフィブリルの量を増幅させ、検出を可能にすることを伴い、そのようなストレスの適用は望ましくないものであり、時間のかかるものである。ペプチドの可溶性形態を含む混合物においても、より高い感度でそのようなペプチドフィブリルを同定する手段が望まれる。 It is known that human GLP-1 (7-37) and its analogs tend to form various types of aggregates in solution. Certain types of such aggregates, referred to herein as fibrils, are irreversibly formed and should be kept to a minimum in pharmaceuticals for administration to patients in liquid form. Conceivable. So far, the preferred method for assaying (ie, identifying and / or quantifying) such fibrils has been based on thioflavin T (ThT), a fluorophore that changes the emission spectrum upon binding to fibrils. Yes, see, eg, Assay (V) herein. Assays for detecting peptide fibrils via ThT often involve first stressing the sample to amplify the amount of fibril, allowing detection, and the application of such stress is undesirable. It is time-consuming. Means for identifying such peptide fibrils with higher sensitivity are also desired in mixtures containing soluble forms of the peptide.
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って調製される。いくつかの実施形態では、本発明は、セマグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に従って調製される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体は、可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルを有し、当該結合レベルは、少なくとも２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度でのアッセイ（ＩＩＩ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体は、ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界は、少なくとも１μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体は、可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも５倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルを有し、当該抗体は、９５％超のモノマー純度を有し、当該結合レベルは、少なくとも３０μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体は、ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該抗体は、９５％超のモノマー純度を有し、当該検出限界は、少なくとも０．０２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って決定される。 In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to liraglutide fibrils, the fibrils being prepared according to assay (I) herein. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to semaglutide fibrils, the fibrils being prepared according to assay (II) herein. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to a rilaglutide fibril, the fibril is optionally prepared according to assay (I) herein, and the antibody is the level of binding of the antibody to soluble lylaglutide. It has a binding level to rilaglutide fibrils that is at least 10-fold higher than that, and the binding level is determined according to assay (III) at a concentration of at least 25 μM rilaglutide fibrils. In some embodiments, the present invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the fibril is optionally prepared according to assay (I) herein, and the antibody is from the detection limit of rilaglutide fibrils in the ThT assay. Also has a detection limit of rilaglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower, the detection limit being determined according to the assay (VI) herein at a concentration of at least 1 μM rilaglutide fibrils. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to a rilaglutide fibril, the fibril is optionally prepared according to assay (I) herein, and the antibody is the level of binding of the antibody to soluble lylaglutide. The antibody has a monomer purity of greater than 95% and the binding level is at least 30 μM in the assay (III) herein at a concentration of at least 30 μM. -B) is determined. In some embodiments, the present invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the fibrils are optionally prepared according to assay (I) herein and the antibody is from the detection limit of rilaglutide fibrils in the ThT assay. Also has a detection limit of rilaglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower, the antibody has a monomer purity of greater than 95%, and the detection limit is at least 0.025 μM as described herein. Determined according to assay (VI-B).
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列は、配列番号３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列は、配列番号１１５および１２１、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号３７、３８、および３９；配列番号４３、４４、および４５；配列番号４９、５０、および５１；配列番号５５、５６、および５７；配列番号６１、６２、および６３；配列番号６７、６８、および６９；配列番号７３、７４、および７５；配列番号７９、８０、および８１；配列番号８５、８６、および８７；配列番号９１、９２、および９３；配列番号９７、９８、および９９；配列番号１０３、１０４、および１０５；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列１１５、１１６、および１１７；配列番号１２１、１２２、１２３；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号４０、４１、および４２；配列番号４６、４７、および４８；配列番号５２、５３、および５４；配列番号５８、５９、および６０；配列番号６４、６５、および６６；配列番号７０、７１、および７２；配列番号７６、７７、および７８；配列番号８２、８３、および８４；配列番号８８、８９、および９０；配列番号９４、９５、および９６；配列番号１００、１０１、および１０２；配列番号１０６、１０７、および１０８；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列１１８、１１９、および１２０；配列番号１２４、１２５、および１２６；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。 In some embodiments, the present invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the heavy chain of the antibody comprises a CDR3 sequence, which is SEQ ID NO: 37, 43, 49, 55, 61. , 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, or selected from the group consisting of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. In some embodiments, the present invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, the variable region of the heavy chain of the antibody comprises a CDR3 sequence, the CDR3 sequence being SEQ ID NOs: 115 and 121, or one, two. It is selected from the group consisting of any of the sequences having one or three amino acid substitutions, deletions or insertions. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, the variable regions of the heavy chain of the antibody are SEQ ID NOs: 37, 38, and 39; SEQ ID NOs: 43, 44, and 45; SEQ ID NO: 49. , 50, 51; SEQ ID NOs: 55, 56, and 57; SEQ ID NOs: 61, 62, and 63; SEQ ID NOs: 67, 68, and 69; SEQ ID NOs: 73, 74, and 75; SEQ ID NOs: 79, 80, and 81. SEQ ID NOs: 85, 86, and 87; SEQ ID NOs: 91, 92, and 93; SEQ ID NOs: 97, 98, and 99; SEQ ID NOs: 103, 104, and 105; or one, two, or three amino acid substitutions, Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion or insertion. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils and the variable regions of the heavy chain of the antibody are SEQ ID NOs: 115, 116, and 117; SEQ ID NOs: 121, 122, 123; or one, two. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having one or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, the variable regions of the light chain of the antibody are SEQ ID NOs: 40, 41, and 42; SEQ ID NOs: 46, 47, and 48; SEQ ID NO: 52. , 53, and 54; SEQ ID NOs: 58, 59, and 60; SEQ ID NOs: 64, 65, and 66; SEQ ID NOs: 70, 71, and 72; SEQ ID NOs: 76, 77, and 78; SEQ ID NOs: 82, 83, and 84. SEQ ID NOs: 88, 89, and 90; SEQ ID NOs: 94, 95, and 96; SEQ ID NOs: 100, 101, and 102; SEQ ID NOs: 106, 107, and 108; or one, two, or three amino acid substitutions, Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion or insertion. In some embodiments, the present invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable regions of the light chain of the antibody are SEQ ID NOs: 118, 119, and 120; SEQ ID NOs: 124, 125, and 126; or one. Includes CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having two or three amino acid substitutions, deletions, or insertions.
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、先行する実施形態のいずれか１つに記載の重鎖の可変領域、および本明細書に定義される軽鎖の可変領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１０９および１１０、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１０９および１１０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する。 In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to liraglutide fibrils, wherein the antibody is a variable region of the heavy chain according to any one of the preceding embodiments, and light as defined herein. Contains variable regions of the chain. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the antibody is SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, and 12, Alternatively, it comprises a sequence selected from the group consisting of any of the sequences having up to 20 amino acid substitutions, deletions or insertions, such as up to 15 or up to 10. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the antibody is substituted, deleted, or deleted with up to 20 amino acids, such as SEQ ID NOs: 109 and 110, or up to 15 or up to 10. Includes sequences selected from the group consisting of any of the relevant sequences with insertions. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to liraglutide fibrils, wherein the antibody is from SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, and 12. It has at least 80% sequence identity, such as at least 90% or at least 95% of the sequence selected from the group. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to liraglutide fibrils, the antibody being at least 80%, such as at least 90% or at least 95% of the sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 109 and 110. Has% sequence identity.
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、１１１、および１１３、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、１１２、および１１４、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む。 In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the antibody is SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 111. , And a variable light chain (VL) sequence selected from the group consisting of any of the sequences having up to 20 amino acid substitutions, deletions, or insertions, such as 113, or up to 15 or up to 10. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the antibody is SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 112. , And a variable heavy chain (VH) sequence selected from the group consisting of any of the sequences having up to 20 amino acid substitutions, deletions, or insertions, such as 114, or up to 15 or up to 10.
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルの同定のための、本明細書に定義される抗体の使用に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを同定するための方法に関し、当該方法は、ａ）本明細書に定義される抗体をリラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを定量化するための方法に関し、当該方法は、ａ）本明細書に定義される抗体をリラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む。 In some embodiments, the invention relates to the use of antibodies as defined herein for the identification of liraglutide fibrils or semaglutide fibrils. In some embodiments, the invention relates to a method for identifying liraglutide fibrils or semaglutide fibrils, wherein the method a) binds an antibody as defined herein to liraglutide fibrils or semaglutide fibrils. Includes steps to do. In some embodiments, the invention relates to a method for quantifying liraglutide fibrils or semaglutide fibrils, wherein the method a) converts the antibodies defined herein into liraglutide fibrils or semaglutide fibrils. Includes steps to combine.
いくつかの実施形態では、本発明は、固体表面、例えば、アフィニティ表面を作るクロマトグラフ表面または膜表面に抗体を固定化し、リラグルチドまたはセマグルチドのフィブリルおよび可溶性形態の両方を含む混合物をその表面に曝露し、フィブリルまたはその一部の単離をもたらすことによる、リラグルチドまたはセマグルチドのフィブリルの除去または低減によるリラグルチドまたはセマグルチドの精製のための、本明細書に定義される抗体の使用に関する。 In some embodiments, the invention implants an antibody on a solid surface, eg, a chromatograph surface or membrane surface that creates an affinity surface, and exposes the surface to a mixture containing both fibril and soluble forms of liraglutide or semaglutide. And with respect to the use of the antibodies defined herein for purification of liraglutide or semaglutide by removal or reduction of liraglutide or semaglutide fibrils by resulting in isolation of fibrils or parts thereof.
本発明は、ＧＬＰ－１受容体アゴニストリラグルチドまたはセマグルチドのフィブリルに特異的に結合する抗体に関する。リラグルチドおよびセマグルチドは、ヒトＧＬＰ－１（７－３７）の類似体であり、溶液の形態で市販されている治療用ペプチドである。リラグルチドまたはセマグルチドのフィブリルは、医薬品において望ましくない。したがって、本発明の抗体は、リラグルチドまたはセマグルチドのフィブリルをそれらの可溶性形態と区別することを可能にする。本発明のそのような抗体は、任意にそれらの可溶性形態との混合物中のそのようなフィブリルの同定および／または定量化を可能にすること、ならびにリラグルチドまたはセマグルチドを含む医薬品の十分な品質を確保するための手段を提供することを含む、いくつかの技術的利点を有する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、可溶性リラグルチドの混合物からのリラグルチドフィブリルの単離または部分的単離を可能にする。そのような単離は、固体表面、例えば、クロマトグラフカラム、フィルター、または膜への固定化によって行われてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、任意に非常に過剰なペプチドの可溶性形態の存在下で、極めて低いレベルのペプチドフィブリルを検出するための高感度アッセイを可能にする。いくつかの実施形態では、特定のペプチドであるリラグルチドまたはセマグルチドに関しても、「フィブリル」、「ペプチドフィブリル」という用語は、リラグルチドについて本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って、またはセマグルチドについて本明細書のアッセイ（ＩＩ）に従って得られ得る凝集体のタイプを指し、そのようなフィブリルは、例えば、透過電子顕微鏡法を使用して、細い糸の形状のように見える。 The present invention relates to an antibody that specifically binds to the fibril of the GLP-1 receptor agonist liraglutide or semaglutide. Liraglutide and semaglutide are analogs of human GLP-1 (7-37) and are therapeutic peptides commercially available in the form of solutions. Liraglutide or semaglutide fibril is not desirable in medicine. Thus, the antibodies of the invention make it possible to distinguish liraglutide or semaglutide fibrils from their soluble forms. Such antibodies of the invention optionally allow identification and / or quantification of such fibrils in mixtures with their soluble forms, as well as ensuring sufficient quality of pharmaceuticals containing liraglutide or semaglutide. It has several technical advantages, including providing means for doing so. In some embodiments, the antibodies of the invention allow the isolation or partial isolation of liraglutide fibrils from a mixture of soluble liraglutide. Such isolation may be performed by immobilization on a solid surface, eg, a chromatograph column, filter, or membrane. In some embodiments, the antibodies of the invention allow sensitive assays to detect very low levels of peptide fibrils, optionally in the presence of very excess soluble forms of the peptide. In some embodiments, also with respect to the particular peptide liraglutide or semaglutide, the terms "fibril", "peptide fibril" are used according to assay (I) herein for liraglutide, or assay herein for semaglutide. Refers to the type of aggregate that can be obtained according to (II), such fibrils appearing in the form of fine threads, for example using transmission electron microscopy.
本発明者らは驚くべきことに、本発明の抗体が、振盪を伴わないＴｈＴアッセイなどのＴｈＴアッセイ、例えば、本明細書のアッセイ（Ｖ）と比較して、フィブリルを検出するための感度が少なくとも１００倍、およびおそらくさらには少なくとも１０００倍高いことを発見した。 We are surprisingly sensitive to the detection of fibrils by the antibodies of the invention compared to ThT assays such as the Shakeless ThT assay, eg, Assay (V) herein. We have found that it is at least 100 times higher, and perhaps at least 1000 times higher.
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って調製される。いくつかの実施形態では、本発明は、セマグルチドフィブリルに結合する抗体に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、セマグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に従って調製される。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍または少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界は、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って任意に決定される。いくつかの実施形態では、抗体は、可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも２０倍高いまたは少なくとも５０倍高いなど、少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴｈＴアッセイにおけるセマグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍または少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのセマグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界は、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って任意に決定される。いくつかの実施形態では、抗体は、可溶性セマグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも２０倍高いまたは少なくとも５０倍高いなど、少なくとも１０倍高いセマグルチドフィブリルへの結合レベルを有する。いくつかの実施形態では、結合レベルは、本明細書のアッセイ（ＩＶ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、結合レベルは、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、結合レベルは、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って決定される。 In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to liraglutide fibrils. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to liraglutide fibrils, the fibrils being prepared according to assay (I) herein. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to semaglutide fibrils. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to semaglutide fibrils, the fibrils being prepared according to assay (II) herein. In some embodiments, the antibody has a detection limit for liraglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower, such as at least 100-fold or at least 1000-fold below the detection limit for liraglutide fibrils in the ThT assay. It is optionally determined according to the assay (VI) herein. In some embodiments, the antibody has a level of binding to liraglutide fibrils that is at least 10-fold higher, such as at least 20-fold or at least 50-fold higher than the level of binding of the antibody to soluble liraglutide. In some embodiments, the antibody has a detection limit for semaglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower, such as at least 100-fold or at least 1000-fold below the detection limit for semaglutide fibrils in the ThT assay. The detection limit is arbitrarily determined according to the assay (VI) herein. In some embodiments, the antibody has a level of binding to semaglutide fibrils that is at least 10-fold higher, such as at least 20-fold or at least 50-fold higher than the level of binding of the antibody to soluble semaglutide. In some embodiments, the binding level is determined according to assay (IV) herein. In some embodiments, the binding level is determined according to assay (III) herein. In some embodiments, the binding level is determined according to the assay (III-B) herein.
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体は、可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルを有し、当該結合レベルは、少なくとも２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度でのアッセイ（ＩＩＩ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体は、ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界は、少なくとも１μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体は、可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも５倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルを有し、当該抗体は、９５％超のモノマー純度を有し、当該結合レベルは、少なくとも３０μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該フィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体は、ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該抗体は、９５％超のモノマー純度を有し、当該検出限界は、少なくとも０．０２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って決定される。 In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to a rilaglutide fibril, the fibril is optionally prepared according to assay (I) herein, and the antibody is the level of binding of the antibody to soluble lylaglutide. It has a binding level to rilaglutide fibrils that is at least 10-fold higher than that, and the binding level is determined according to assay (III) at a concentration of at least 25 μM rilaglutide fibrils. In some embodiments, the present invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the fibril is optionally prepared according to assay (I) herein, and the antibody is from the detection limit of rilaglutide fibrils in the ThT assay. Also has a detection limit of rilaglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower, the detection limit being determined according to the assay (VI) herein at a concentration of at least 1 μM rilaglutide fibrils. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to a rilaglutide fibril, the fibril is optionally prepared according to assay (I) herein, and the antibody is the level of binding of the antibody to soluble lylaglutide. The antibody has a monomer purity of greater than 95% and the binding level is at least 30 μM in the assay (III) herein at a concentration of at least 30 μM. -B) is determined. In some embodiments, the present invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the fibrils are optionally prepared according to assay (I) herein and the antibody is from the detection limit of rilaglutide fibrils in the ThT assay. Also has a detection limit of rilaglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower, the antibody has a monomer purity of greater than 95%, and the detection limit is at least 0.025 μM as described herein. Determined according to assay (VI-B).
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、１～１０ｐｐｍのフィブリル、あるいは１０～１００ｐｐｍのフィブリル、あるいは１００～１０００ｐｐｍのフィブリルなど、溶液中１～１０００ｐｐｍのフィブリルの濃度でリラグルチドフィブリルを検出することができる。 In some embodiments, the present invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the antibody is 1 to 1000 ppm in solution, such as 1 to 10 ppm fibril, or 10 to 100 ppm fibril, or 100 to 1000 ppm fibrils. Rilaglutide fibril can be detected by the concentration of fibril.
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列は、配列番号３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列は、配列番号１１５および１２１、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列は、配列番号３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号３７、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号４３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号４９、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号５５、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号６１、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号６７、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号７３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号７９、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号８５、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号９１、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号９７、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号１０３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号１１５、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号１２１、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかのＣＤＲ３配列を含む。 In some embodiments, the present invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the heavy chain of the antibody comprises a CDR3 sequence, which is SEQ ID NO: 37, 43, 49, 55, 61. , 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, or selected from the group consisting of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. In some embodiments, the present invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, the variable region of the heavy chain of the antibody comprises a CDR3 sequence, the CDR3 sequence being SEQ ID NOs: 115 and 121, or one, two. It is selected from the group consisting of any of the sequences having one or three amino acid substitutions, deletions or insertions. In some embodiments, the present invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the heavy chain of the antibody comprises a CDR3 sequence, which is SEQ ID NO: 37, 43, 49, 55, 61. , 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, or selected from the group consisting of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 37, or the CDR3 sequence of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. include. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 43, or the CDR3 sequence of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. include. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 49, or the CDR3 sequence of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. include. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 55, or the CDR3 sequence of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. include. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 61, or the CDR3 sequence of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. include. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 67, or the CDR3 sequence of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. include. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 73, or the CDR3 sequence of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. include. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 79, or the CDR3 sequence of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. include. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 85, or the CDR3 sequence of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. include. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 91, or the CDR3 sequence of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. include. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 97, or the CDR3 sequence of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. include. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 103, or the CDR3 sequence of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. include. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 115, or the CDR3 sequence of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. include. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 121, or the CDR3 sequence of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. include.
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号３７、３８、および３９；配列番号４３、４４、および４５；配列番号４９、５０、および５１；配列番号５５、５６、および５７；配列番号６１、６２、および６３；配列番号６７、６８、および６９；配列番号７３、７４、および７５；配列番号７９、８０、および８１；配列番号８５、８６、および８７；配列番号９１、９２、および９３；配列番号９７、９８、および９９；配列番号１０３、１０４、および１０５；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列１１５、１１６、および１１７；配列番号１２１、１２２、１２３；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号３７、３８、および３９；配列番号４３、４４、および４５；配列番号４９、５０、および５１；配列番号５５、５６、および５７；配列番号６１、６２、および６３；配列番号６７、６８、および６９；配列番号７３、７４、および７５；配列番号７９、８０、および８１；配列番号８５、８６、および８７；配列番号９１、９２、および９３；配列番号９７、９８、および９９；配列番号１０３、１０４、および１０５；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号 配列１１５、１１６、および１１７；配列番号１２１、１２２、１２３；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号３７、３８、および３９；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号４３、４４、および４５；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号４９、５０、および５１；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号５５、５６、および５７；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号６１、６２、および６３；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号６７、６８、および６９；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号７３、７４、および７５；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号７９、８０、および８１；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号８５、８６、および８７；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号９１、９２、および９３；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号９７、９８、および９９；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号１０３、１０４、および１０５；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号１１５、１１６、および１１７；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体の重鎖の可変領域は、配列番号１２１、１２２、および１２３；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。 In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, the variable regions of the heavy chain of the antibody are SEQ ID NOs: 37, 38, and 39; SEQ ID NOs: 43, 44, and 45; SEQ ID NO: 49. , 50, 51; SEQ ID NOs: 55, 56, and 57; SEQ ID NOs: 61, 62, and 63; SEQ ID NOs: 67, 68, and 69; SEQ ID NOs: 73, 74, and 75; SEQ ID NOs: 79, 80, and 81. SEQ ID NOs: 85, 86, and 87; SEQ ID NOs: 91, 92, and 93; SEQ ID NOs: 97, 98, and 99; SEQ ID NOs: 103, 104, and 105; or one, two, or three amino acid substitutions, Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion or insertion. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils and the variable regions of the heavy chain of the antibody are SEQ ID NOs: 115, 116, and 117; SEQ ID NOs: 121, 122, 123; or one, two. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having one or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, the variable regions of the heavy chain of the antibody are SEQ ID NOs: 37, 38, and 39; SEQ ID NOs: 43, 44, and 45; SEQ ID NO: 49. , 50, 51; SEQ ID NOs: 55, 56, and 57; SEQ ID NOs: 61, 62, and 63; SEQ ID NOs: 67, 68, and 69; SEQ ID NOs: 73, 74, and 75; SEQ ID NOs: 79, 80, and 81. SEQ ID NOs: 85, 86, and 87; SEQ ID NOs: 91, 92, and 93; SEQ ID NOs: 97, 98, and 99; SEQ ID NOs: 103, 104, and 105; or one, two, or three amino acid substitutions, Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion or insertion. In some embodiments, the present invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: SEQ ID NOs: 115, 116, and 117; SEQ ID NOs: 121, 122, 123; or one. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having two or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is either SEQ ID NO: 37, 38, and 39; or any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 43, 44, and 45; or any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is any of the sequences having SEQ ID NOs: 49, 50, and 51; or one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is either SEQ ID NO: 55, 56, and 57; or any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is either SEQ ID NO: 61, 62, and 63; or the sequence having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is either SEQ ID NO: 67, 68, and 69; or any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 73, 74, and 75; or any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 79, 80, and 81; or any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 85, 86, and 87; or any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 91, 92, and 93; or any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 97, 98, and 99; or any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 103, 104, and 105; or any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is any of the sequences having SEQ ID NOs: 115, 116, and 117; or one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of. In some embodiments, the variable region of the heavy chain of the antibody is SEQ ID NO: 121, 122, and 123; or any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of.
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号４０、４１、および４２；配列番号４６、４７、および４８；配列番号５２、５３、および５４；配列番号５８、５９、および６０；配列番号６４、６５、および６６；配列番号７０、７１、および７２；配列番号７６、７７、および７８；配列番号８２、８３、および８４；配列番号８８、８９、および９０；配列番号９４、９５、および９６；配列番号１００、１０１、および１０２；配列番号１０６、１０７、および１０８；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列１１８、１１９、および１２０；配列番号１２４、１２５、および１２６；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号４０、４１、および４２；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号４６、４７、および４８；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号５２、５３、および５４；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号５８、５９、および６０；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号６４、６５、および６６；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号７０、７１、および７２；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号７６、７７、および７８；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号８２、８３、および８４；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号８８、８９、および９０；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号９４、９５、および９６；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号１００、１０１、および１０２；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号１０６、１０７、および１０８；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号１１８、１１９、および１２０；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号１２４、１２５、および１２６；または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、本明細書に定義される重鎖の可変領域、および先行する実施形態のいずれか１つに記載の軽鎖の可変領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１０９および１１０、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１０９および１１０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義される配列に対して少なくとも７５％など、少なくとも７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義される配列に対して少なくとも８５％または少なくとも９０％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義される配列に対して少なくとも９２％または少なくとも９３％など、少なくとも９１％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義される配列に対して少なくとも９５％または少なくとも９６％など、少なくとも９４％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義される配列に対して少なくとも９８％または少なくとも９９％など、少なくとも９７％の配列同一性を有する。 In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, the variable regions of the light chain of the antibody are SEQ ID NOs: 40, 41, and 42; SEQ ID NOs: 46, 47, and 48; SEQ ID NO: 52. , 53, and 54; SEQ ID NOs: 58, 59, and 60; SEQ ID NOs: 64, 65, and 66; SEQ ID NOs: 70, 71, and 72; SEQ ID NOs: 76, 77, and 78; SEQ ID NOs: 82, 83, and 84. SEQ ID NOs: 88, 89, and 90; SEQ ID NOs: 94, 95, and 96; SEQ ID NOs: 100, 101, and 102; SEQ ID NOs: 106, 107, and 108; or one, two, or three amino acid substitutions, Contains CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion or insertion. In some embodiments, the present invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable regions of the light chain of the antibody are SEQ ID NOs: 118, 119, and 120; SEQ ID NOs: 124, 125, and 126; or one. Includes CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having two or three amino acid substitutions, deletions, or insertions. In some embodiments, the present invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is SEQ ID NO: 40, 41, and 42; or one, two, or three amino acid substitutions. , CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion, or an insertion. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is SEQ ID NO: 46, 47, and 48; or one, two, or three amino acid substitutions. , CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion, or an insertion. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is SEQ ID NO: 52, 53, and 54; or one, two, or three amino acid substitutions. , CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion, or an insertion. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is SEQ ID NO: 58, 59, and 60; or one, two, or three amino acid substitutions. , CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion, or an insertion. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is SEQ ID NO: 64, 65, and 66; or one, two, or three amino acid substitutions. , CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion, or an insertion. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is SEQ ID NO: 70, 71, and 72; or one, two, or three amino acid substitutions. , CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion, or an insertion. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is SEQ ID NO: 76, 77, and 78; or one, two, or three amino acid substitutions. , CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion, or an insertion. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is SEQ ID NO: 82, 83, and 84; or one, two, or three amino acid substitutions. , CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion, or an insertion. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is SEQ ID NO: 88, 89, and 90; or one, two, or three amino acid substitutions. , CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion, or an insertion. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is SEQ ID NO: 94, 95, and 96; or one, two, or three amino acid substitutions. , CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion, or an insertion. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is SEQ ID NO: 100, 101, and 102; or one, two, or three amino acid substitutions. , CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion, or an insertion. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is SEQ ID NO: 106, 107, and 108; or one, two, or three amino acid substitutions. , CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion, or an insertion. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is SEQ ID NO: 118, 119, and 120; or one, two, or three amino acid substitutions. , CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion, or an insertion. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is SEQ ID NO: 124, 125, and 126; or one, two, or three amino acid substitutions. , CDR2, and / or CDR3 sequences selected from the group consisting of any of the sequences having a deletion, or an insertion. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the antibody is a variable region of a heavy chain as defined herein, and a light chain described in any one of the preceding embodiments. Contains variable regions of the chain. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the antibody is SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, and 12, Alternatively, it comprises a sequence selected from the group consisting of any of the sequences having up to 20 amino acid substitutions, deletions or insertions, such as up to 15 or up to 10. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the antibody is substituted, deleted, or deleted with up to 20 amino acids, such as SEQ ID NOs: 109 and 110, or up to 15 or up to 10. Includes sequences selected from the group consisting of any of the relevant sequences with insertions. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to liraglutide fibrils, wherein the antibody is from SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, and 12. It has at least 80% sequence identity, such as at least 90% or at least 95% to the sequence selected from the group. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to liraglutide fibrils, the antibody being at least 80%, such as at least 90% or at least 95% of the sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 109 and 110. Has% sequence identity. In some embodiments, the antibody has at least 70% sequence identity, such as at least 75% with respect to the sequences defined herein. In some embodiments, the antibody has at least 80% sequence identity, such as at least 85% or at least 90% of the sequences defined herein. In some embodiments, the antibody has at least 91% sequence identity, such as at least 92% or at least 93% of the sequences defined herein. In some embodiments, the antibody has at least 94% sequence identity, such as at least 95% or at least 96% of the sequences defined herein. In some embodiments, the antibody has at least 97% sequence identity, such as at least 98% or at least 99% of the sequences defined herein.
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、１１１、および１１３、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルに結合する抗体に関し、当該抗体は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、１１２、および１１４、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む。 In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the antibody is SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 111. , And a variable light chain (VL) sequence selected from the group consisting of any of the sequences having up to 20 amino acid substitutions, deletions, or insertions, such as 113, or up to 15 or up to 10. In some embodiments, the invention relates to an antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the antibody is SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 112. , And a variable heavy chain (VH) sequence selected from the group consisting of any of the sequences having up to 20 amino acid substitutions, deletions, or insertions, such as 114, or up to 15 or up to 10.
いくつかの実施形態では、抗体は、単離抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、単鎖Ｆｖ断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆｃドメインをさらに含む単鎖Ｆｖ断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、当該リラグルチドフィブリルおよび／またはセマグルチドフィブリルに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、当該リラグルチドフィブリルに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、当該セマグルチドフィブリルに特異的に結合する。 In some embodiments, the antibody is an isolated antibody. In some embodiments, the antibody is a single chain Fv fragment. In some embodiments, the antibody comprises an Fc domain. In some embodiments, the antibody is a single chain Fv fragment further comprising an Fc domain. In some embodiments, the antibody specifically binds to the liraglutide fibril and / or semaglutide fibril. In some embodiments, the antibody specifically binds to the liraglutide fibril. In some embodiments, the antibody specifically binds to the semaglutide fibril.
いくつかの実施形態では、リラグルチドフィブリルに結合する抗体は、７０％超、あるいは７５％超、あるいは８０％超、あるいは８５％超、あるいは９０％超、あるいは９５％超のモノマー純度を有する。いくつかの実施形態では、リラグルチドフィブリルに結合する抗体は、７０％超のモノマー純度を有する。いくつかの実施形態では、リラグルチドフィブリルに結合する抗体は、７５％超のモノマー純度を有する。いくつかの実施形態では、リラグルチドフィブリルに結合する抗体は、８０％超のモノマー純度を有する。いくつかの実施形態では、リラグルチドフィブリルに結合する抗体は、８５％超のモノマー純度を有する。いくつかの実施形態では、リラグルチドフィブリルに結合する抗体は、９０％超のモノマー純度を有する。いくつかの実施形態では、リラグルチドフィブリルに結合する抗体は、９５％超のモノマー純度を有する。いくつかの実施形態では、リラグルチドフィブリルに結合する抗体の純度は、本明細書において「サイズ排除クロマトグラフィー」の中に記載される方法、続いて、すべてのピークのＡＵＣ２８０ｎｍの合計と関連するモノマー抗体のピークの２８０ｎｍでの吸光度に基づく曲線下面積（ＡＵＣ２８０ｎｍ）の決定に従って決定される。 In some embodiments, the antibody that binds to liraglutide fibrils has a monomer purity of greater than 70%, or greater than 75%, or greater than 80%, or greater than 85%, or greater than 90%, or greater than 95%. In some embodiments, the antibody that binds to liraglutide fibrils has a monomer purity of greater than 70%. In some embodiments, the antibody that binds to liraglutide fibrils has a monomer purity of greater than 75%. In some embodiments, the antibody that binds to liraglutide fibrils has a monomer purity of greater than 80%. In some embodiments, the antibody that binds to liraglutide fibrils has a monomer purity of greater than 85%. In some embodiments, the antibody that binds to liraglutide fibrils has a monomer purity of greater than 90%. In some embodiments, the antibody that binds to liraglutide fibrils has a monomer purity of greater than 95%. In some embodiments, the purity of the antibody that binds to rilaglutide fibrils is the method described herein in "Size Exclusion Chromatography", followed by the monomer associated with the sum of AUC 280 nm for all peaks. It is determined according to the determination of the area under the curve (AUC 280 nm ) based on the absorbance of the antibody peak at 280 nm.
リラグルチドおよびセマグルチド
リラグルチドおよびセマグルチドは、共有結合部分を含むヒトＧＬＰ－１（７－３７）の類似体である。本発明の抗体は、リラグルチドフィブリルおよび／またはセマグルチドフィブリルに結合する。「フィブリル」という用語は、リラグルチドに関して本明細書で使用される場合、リラグルチドフィブリルを指し、セマグルチドに関して本明細書で使用される場合、セマグルチドフィブリルを指す。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、リラグルチドフィブリルに結合する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、セマグルチドフィブリルに結合する。
Liraglutide and semaglutide Liraglutide and semaglutide are analogs of human GLP-1 (7-37) that contain covalent moieties. The antibodies of the invention bind to liraglutide fibrils and / or semaglutide fibrils. The term "fibril" as used herein refers to liraglutide fibrils and, as used herein with respect to semaglutide, refers to semaglutide fibrils. In some embodiments, the antibodies of the invention bind to liraglutide fibrils. In some embodiments, the antibodies of the invention bind to semaglutide fibrils.
リラグルチドは、Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ２６－（Ｎ－イプシロン－（ガンマ－Ｌ－グルタミル（Ｎ－アルファ－ヘキサデカノイル）））－ＧＬＰ－１（７－３７）であり、ＷＯ９８／０８８７１の実施例３７に従って調製され得る。ＷＯ９８／０８８７１の実施例３７は、参照により本明細書に組み込まれる。リラグルチドの構造はまた、ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．２，２００３でも公開されている。リラグルチドの構造はまた、ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１，２０１０でも公開されている。リラグルチドフィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に記載されるように調製され得る。可溶性リラグルチドの一例は、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋによって製造される市販の溶液、例えば、商標Ｖｉｃｔｏｚａ（登録商標）である。 Liraglutide is Arg34, Lys26- (N-epsilon- (gamma-L-glutamyl (N-alpha-hexadecanoyl)))-GLP-1 (7-37), prepared according to Example 37 of WO98 / 08871. Can be done. Example 37 of WO98 / 08871 is incorporated herein by reference. The structure of liraglutide is also described in WHO Drug Information Vol. 17, No. It is also open to the public in 2,2003. The structure of liraglutide is also described in WHO Drug Information Vol. 24, No. It is also open to the public in 1,2010. Liraglutide fibrils can be prepared as described in Assay (I) herein. An example of soluble liraglutide is Novo Nordisk A / S, a commercially available solution manufactured by Denmark, such as the trademark Victorosa®.
セマグルチドは、Ｎ－ε２６－［２－（２－［２－（２－［２－（２－［４－（１７－カルボキシヘプタデカノイルアミノ）－４（Ｓ）－カルボキシブチリルアミノ］エトキシ）エトキシ］アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ）アセチル］［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ－１－（７－３７）ペプチドであり、ＷＯ２００６／０９７５３７の実施例４に従って調製され得る。ＷＯ２００６／０９７５３７の実施例４は、参照により本明細書に組み込まれる。セマグルチドフィブリルは、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に記載されるように調製され得る。可溶性セマグルチドの例は、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋによって製造される市販の溶液、例えば、商標Ｏｚｅｍｐｉｃ（登録商標）である。 Semaglutide is N-ε26- [2- (2- [2- (2- [2- (2- [4- (17-carboxyheptadecanoylamino) -4 (S) -carboxybutyrylamino] ethoxy)). Ethoxy] acetylamino) ethoxy] ethoxy) acetyl] [Aib8, Arg34] GLP-1- (7-37) peptide, which can be prepared according to Example 4 of WO2006 / 097537. Example 4 of WO2006 / 097537 is incorporated herein by reference. Semaglutide fibrils can be prepared as described in Assay (II) herein. An example of soluble semaglutide is Novo Nordisk A / S, a commercially available solution manufactured by Denmark, such as the trademark Ozempic®.
抗体
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の機能性、ならびに／またはＣＤＲ、重鎖の可変領域、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、および／もしくはＦｃドメインの配列によって特徴付けられる一連の抗体のうちの１つ以上に関する。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔ抗体ナンバリングスキーム（Ｋａｂａｔ，Ｅｌｖｉｎ Ａ．（１９７６）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ：Ｈｏｌｔ，Ｒｉｎｅｈａｒｔ ＆ Ｗｉｎｓｔｏｎ）に従って決定される。いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の機能性および／またはＨ－ＣＤＲ３アミノ酸配列によって特徴付けられる一連の抗体のうちの１つ以上に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の機能性および／またはＣＤＲアミノ酸配列によって特徴付けられる一連の抗体のうちの１つ以上に関する（重鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、本明細書においてＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３と称され得る。同様に、軽鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、本明細書においてＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３と称され得る）。いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の機能性、ならびに／または重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列によって特徴付けられる一連の抗体のうちの１つ以上に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の機能性、ならびに／または重鎖の可変領域、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、および／もしくはＦｃドメインの配列によって特徴付けられる一連の抗体のうちの１つ以上に関する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｈ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、および／またはＨ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、および／またはＬ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、重鎖の可変領域および／または軽鎖の可変領域を含む。
Antibodies In some embodiments, the invention is characterized by the functionality of the antibody and / or the sequence of CDRs, variable regions of the heavy chain, the amino acid sequence of the variable region of the light chain, and / or the sequence of the Fc domain. With respect to one or more of the antibodies. In some embodiments, as used herein, the term "CDR" refers to the Kabat antibody numbering scheme (Kabat, Elvin A. (1976). Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry. New York. : Holt, Rinehard & Winston). In some embodiments, the invention relates to one or more of a series of antibodies characterized by antibody functionality and / or H-CDR3 amino acid sequence. In some embodiments, the present invention relates to one or more of a series of antibodies characterized by antibody functionality and / or the CDR amino acid sequence (CDR1, CDR2, and CDR3 of the variable region of the heavy chain. Also referred to herein as H-CDR1, H-CDR2, and H-CDR3. Similarly, CDR1, CDR2, and CDR3 of the variable regions of the light chain are referred to herein as L-CDR1, L-CDR2, And may be referred to as L-CDR3). In some embodiments, the invention relates to one or more of a series of antibodies characterized by the functionality of the antibody and / or the amino acid sequences of the variable region of the heavy chain and the variable region of the light chain. In some embodiments, the invention comprises a series of antibodies characterized by antibody functionality and / or the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain, the variable region of the light chain, and / or the sequence of the Fc domain. Regarding one or more of. In some embodiments, the antibody comprises H-CDR3. In some embodiments, the antibody comprises H-CDR1, H-CDR2, and / or H-CDR3. In some embodiments, the antibody comprises H-CDR1, H-CDR2, and H-CDR3. In some embodiments, the antibody comprises L-CDR1, L-CDR2, and / or L-CDR3. In some embodiments, the antibody comprises L-CDR1, L-CDR2, and L-CDR3. In some embodiments, the antibody comprises a variable region of the heavy chain and / or a variable region of the light chain.
本発明の抗体は、全抗体および抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）または単鎖抗体を含む、任意の形式であってもよい。 The antibodies of the invention may be in any form, including whole antibodies and antigen binding fragments (ie, "antigen binding moieties") or single chain antibodies.
いくつかの実施形態では、抗体は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆｃドメインに融合した単鎖可変断片（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）抗体である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体は、重鎖の可変領域（ＶＨ）および軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む１つのアミノ酸配列からなり、ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体は、Ｆｃドメインをさらに含む。 In some embodiments, the antibody is a single chain variable fragment (scFv) antibody. In some embodiments, the antibody is a single chain variable fragment (scFv-Fc) antibody fused to the Fc domain. In some embodiments, the scFv or scFv-Fc antibody consists of a single amino acid sequence comprising a heavy chain variable region ( VH ) and a light chain variable region ( VL ), and the scFv-Fc antibody is an Fc. Includes more domains.
いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、本明細書に記載されるような標準抗体ドメインおよび領域を含む完全長抗体である。完全長抗体（または全抗体）は、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重鎖（Ｈ）鎖および２つの軽鎖（Ｌ）鎖である、４つのポリペプチド鎖を含む。各重鎖は、重鎖の可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。各軽鎖は、軽鎖の可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。 In some embodiments, the antibody is, for example, a full-length antibody comprising standard antibody domains and regions as described herein. A full-length antibody (or whole antibody) comprises four polypeptide chains, which are two heavy chain (H) chains and two light chain (L) chains interconnected by disulfide bonds. Each heavy chain contains a heavy chain variable region ( VH ) and a heavy chain constant region ( CH ). Each light chain contains a variable region of the light chain ( VL ) and a constant region of the light chain ( CL ). The heavy chain constant region contains three domains, CH 1, CH 2, and CH 3. Each light chain includes a light chain variable region (abbreviated herein as VL ) and a light chain constant region. The light chain constant region contains one domain, CL .
重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域は各々、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保護された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに細分化され得る。各ＶＨおよびＶＬは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含んでもよい：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。 The variable region of the heavy chain and the variable region of the light chain each contain a binding domain that interacts with the antigen. The VH and VL regions can be further subdivided into hypervariable regions called complementarity determining regions (CDRs), interspersed with more protected regions called framework regions (FRs). Each V H and VL may contain 3 CDRs and 4 FRs arranged from the amino terminus to the carboxy terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The constant region of the antibody can mediate the binding of immunoglobulins to host tissues or factors, including various cells of the immune system (eg, effector cells) and the first component of the classical complement system (Clq).
いくつかの実施形態では、抗体は、抗体断片であり、そのような断片は、従来の組換え技術またはタンパク質工学技術を使用して得られ得る。本発明の抗体断片は、切頭によって、例えば、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の除去によって、作製され得る。また、断片は、１つ以上の内部欠失によって生成され得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に記載される抗体のいずれか１つの断片であるか、またはこれを含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に記載される抗体のうちの１つの抗原結合部分、またはそのバリアントであるか、またはこれを含む。例えば、本発明の抗体は、本明細書に記載される抗体のうちの１つのＦａｂ断片、もしくはそのバリアントであり得るか、または本発明の抗体は、本明細書に記載される抗体のうちの１つに由来する単鎖抗体、もしくはそのバリアントであり得る。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ（典型的には、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８；２４２：４２Ｓ－４２６、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １９８８；８５：５８７９－５８８３を参照されたい）、Ｆｄ（典型的には、ＶＨおよびＣＨ１）、およびｄＡｂ（典型的には、ＶＨ）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、およびＶ－ＮＡＲ；単一ＶＨおよび単一ＶＬ鎖を含む一価分子；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびカッパボディ（例えば、Ｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９７；１０：９４９－５７を参照されたい）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；ならびに１つ以上の単離されたＣＤＲまたは機能的パラトープが挙げられ、ここで、単離されたＣＤＲまたは抗原結合残基もしくはポリペプチドは、機能的抗体断片を形成するように一緒に会合または連結され得る。様々なタイプの抗体断片が、例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５；２Ｓ：１１２６－１１３６、ＷＯ２００５／０４０２１９、ならびに米国特許出願公開第２００５／０２３８６４６号および同第２００２／０１６１２０１号に記載または考察されている。 In some embodiments, the antibody is an antibody fragment, such fragment which can be obtained using conventional recombinant techniques or protein engineering techniques. The antibody fragments of the invention can be made by incision, eg, by removal of one or more amino acids from the N-terminus and / or C-terminus of the polypeptide. Fragments can also be produced by one or more internal deletions. In some embodiments, the antibody of the invention is, or comprises, a fragment of any one of the antibodies described herein. In some embodiments, the antibodies of the invention are, or include, an antigen binding moiety, or variant thereof, of one of the antibodies described herein. For example, the antibody of the invention can be a Fab fragment of one of the antibodies described herein, or a variant thereof, or the antibody of the invention is one of the antibodies described herein. It can be a single chain antibody derived from one or a variant thereof. Examples of antigen-binding fragments include Fab, Fab', F (ab) 2, F (ab') 2, Fv (typically single-arm VL and VH of antibodies), single-chain Fv ( scFv; see, eg, Bird et al., Science 1988; 242: 42S-426, and Huston et al. PNAS 1988; 85: 5879-5883), Fd (typically VH and CH 1). ), And dAb (typically VH ) fragments; VH , VL , VhH , and V-NAR; monovalent molecules containing single VE and single VL chains; minibody, diabody, Triabodies, tetrabodies, and kappabodies (see, eg, Ill et al., Protein Eng 1997; 10: 949-57); camel IgG; IgNAR; and one or more isolated CDRs or functional. Paratopes include, where the isolated CDRs or antigen-binding residues or polypeptides can be associated or linked together to form a functional antibody fragment. Various types of antibody fragments are described or discussed, for example, in Holliger and Hoodson, Nat Biotechnol 2005; 2S: 1126-1136, WO 2005/040219, and US Patent Application Publication Nos. 2005/02386646 and 2002/0161201. ing.
「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）または「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。ＣＤＲは概して、Ｋａｂａｔに従って定義される軽鎖の可変領域内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、および重鎖の可変領域内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに／または「超可変ループ」からの残基で構成される（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １９８７；１９６：９０１－９１７）。典型的には、この領域内のアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）に記載される方法によって実施される。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ公開番号９１－３２４２に記載される重鎖の可変領域および／軽鎖の可変領域のナンバリングシステムを指す。Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用すると、ペプチドの実際の線状アミノ酸配列は、可変領域のフレームワーク（ＦＲ）またはＣＤＲの短縮、またはそれらへの挿入に対応する、より少ないか、または追加のアミノ酸を含有し得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列と「標準」Ｋａｂａｔナンバリング配列との相同性領域でのアライメントにより、所与の抗体について決定され得る。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基という用語は、本明細書に定義されるように、ＣＤＲ内ではないこれらのＶＨまたはＶＬアミノ酸残基を指す。抗体の断片結晶化可能領域（Ｆｃドメイン）は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体、ならびに補体系の一部のタンパク質と相互作用することができる抗体の領域である。 The terms "complementarity determining regions"("CDRs") or "hypervariable regions" as used herein refer to amino acid residues of an antibody involved in antigen binding. CDRs are generally residues from CDR1, CDR2, and CDR3 in the variable region of the light chain defined according to Kabat, and CDR1, CDR2, and CDR3 in the variable region of the heavy chain, and / or "super-variable loops". It is composed of (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196: 901-917). Typically, the numbering of amino acid residues in this region is described by Kabat et al. It is carried out by the method described in (see above). As used herein, the term "Kabat" is used, for example, in Kabat et al. (1991) Sequences of Protections of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.A. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 refers to a heavy chain variable region and / light chain variable region numbering system. Using the Kabat numbering system, the actual linear amino acid sequence of the peptide contains less or additional amino acids that correspond to the shortening of the variable region framework (FR) or CDR, or insertion into them. obtain. Kabat numbering of residues can be determined for a given antibody by alignment in the region of homology between the antibody sequence and the "standard" Kabat numbering sequence. The term "framework region" or "FR" residue refers to these VE or VL amino acid residues that are not within the CDRs, as defined herein. An antibody fragment crystallizable region (Fc domain) is a region of an antibody that can interact with cell surface receptors called Fc receptors, as well as proteins that are part of the complement system.
「抗体誘導体」という用語は、抗体と別の薬剤または抗体とのコンジュゲートなど、抗体の任意の修飾形態を指す。 The term "antibody derivative" refers to any modified form of an antibody, such as a conjugate of an antibody with another agent or antibody.
「抗原」という用語は、抗体を生成するために使用される分子実体を指し得る。しかしながら、本明細書において、「抗原」という用語は、抗体に結合する、または特異的に結合する標的分子を広く指し、したがって、抗体を生成するために使用される分子実体の断片または模倣体を含む。抗体は、動物またはディスプレイスクリーニング、例えば、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイなどの免疫化によるものを含む任意の方法で生成され得る。 The term "antigen" can refer to a molecular entity used to produce an antibody. However, as used herein, the term "antigen" broadly refers to a target molecule that binds or specifically binds to an antibody, and thus refers to a fragment or mimic of a molecular entity used to produce an antibody. include. Antibodies can be produced by any method, including by animal or display screening, eg, by immunization such as phage display or yeast display.
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体またはその断片などの「抗原結合ポリペプチド」とその対応する抗原との間の分子相互作用の文脈において定義される。一般に、「エピトープ」は、抗体が結合する、または特異的に結合する抗原上の区域または領域、すなわち、抗体と物理的に接触している区域または領域を指す。エピトープは、抗体（エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる）への結合に直接関与する抗原中のアミノ酸残基、および抗体によって効果的に遮断される抗原のアミノ酸残基などの、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基（言い換えると、このアミノ酸残基は、抗体の「溶媒排除表面」および／または「フットプリント」内にある）を含み得る。所与の抗原は、多数の異なるエピトープを含んでもよく、それらのエピトープとしては、直鎖ペプチド抗原決定基、天然（成熟）立体配座において互いに近接して位置する１つ以上の非連続アミノ酸からなる立体配座抗原決定基、および炭水化物基などの抗原に共有結合した分子構造の全部または一部のいずれかからなる翻訳後抗原決定基が挙げられ得るが、これらに限定されない。 As used herein, the term "epitope" is defined in the context of molecular interactions between an "antigen-binding polypeptide" such as an antibody or fragment thereof and its corresponding antigen. In general, an "epitope" refers to a region or region on an antigen to which an antibody binds or specifically binds, i.e., a region or region in physical contact with the antibody. Epitopes are other amino acid residues in the antigen that are directly involved in binding to the antibody (also called the immunodominant component of the epitope) and amino acid residues in the antigen that are effectively blocked by the antibody. Amino acid residues (in other words, these amino acid residues are within the "solvent exclusion surface" and / or "footprint" of the antibody). A given antigen may contain a number of different epitopes, from linear peptide antigenic determinants, one or more discontinuous amino acids located in close proximity to each other in the natural (mature) configuration. Post-translational antigenic determinants consisting of all or part of a molecular structure covalently attached to an antigen, such as, but not limited to, a tritope antigenic determinant and a carbohydrate group.
抗体の「結合」、「特異的結合」、および「特異性」という用語は、抗体またはその抗原結合断片の選択性を説明するために本明細書で使用される。本発明による抗体は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに特異的に結合し得、抗体が他の抗原に対して有意により低い結合レベルを有することを示す。いくつかの実施形態では、有意により低いとは、少なくとも１５倍低い、または少なくとも２０倍低いなど、少なくとも１０倍低い結合レベルである。結合レベルは、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ）に従って、または本明細書のアッセイ（ＩＶ）に従って決定され得る。結合レベルは、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って決定され得る。 The terms "binding," "specific binding," and "specificity" of an antibody are used herein to describe the selectivity of an antibody or antigen-binding fragment thereof. Antibodies according to the invention can specifically bind to liraglutide fibrils or semaglutide fibrils, indicating that the antibodies have significantly lower binding levels to other antigens. In some embodiments, significantly lower is a binding level that is at least 10-fold lower, such as at least 15-fold lower, or at least 20-fold lower. The binding level can be determined according to assay (III) herein or according to assay (IV) herein. The binding level can be determined according to the assay (III-B) herein.
本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、２つ以上のアミノ酸残基の鎖間の一致数によって決定されるポリペプチド配列間の関連性の程度を指し、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって処理されたギャップアライメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のうちのより小さい配列間の完全一致率として決定され得る。ポリペプチドの配列同一性は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、およびＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３ （１９８８）に記載されるものなどが挙げられるがこれらに限定されない、当該技術分野において既知の方法によって容易に計算され得る。配列同一性を決定するための好ましい方法は、試験された配列間で最大の一致が得られるように設計されている。配列同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムに記載されており、２つの配列間の配列同一性を決定するためのそのような好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０（１９９０））を含む、ＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、上記参照）から公開されている。周知のスミス・ウォーターマン・アルゴリズムも、配列同一性を決定するために使用され得る。例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を使用して、配列同一性パーセントが決定される２つのポリペプチドは、それぞれのアミノ酸の最適な一致のためにアライメントされる（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）。ギャップ開始ペナルティ（平均対角の３倍として計算され、「平均対角」は、使用される比較マトリクスの対角の平均であり、「対角」は、特定の比較マトリクスによって各完全アミノ酸一致に割り当てられたスコアまたは数値である）、およびギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップ開始ペナルティの｛分数（１／１０）｝倍である）、ならびにＰＡＭ ２５０またはＢＬＯＳＵＭ ６２などの比較マトリクスが、アルゴリズムと併せて使用される。標準比較マトリクス（ＰＡＭ ２５０比較マトリクスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐ．３（１９７８）、ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリクスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９，１０９１５－１０９１９（１９９２）を参照されたい）も、アルゴリズムによって使用される。いくつかの実施形態では、配列同一性は、次のパラメータを使用して、例えば、アルゴリズムＧＡＰ：Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３－４５３（１９７０）、比較マトリクス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９，１０９１５－１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＵＭ ６２、ならびにギャップペナルティ：１２、ギャップ長ペナルティ：４、類似性の閾値：０、およびエンドギャップに対するペナルティなし。 As used herein, the term "sequence identity" refers to the degree of association between polypeptide sequences as determined by the number of matches between chains of two or more amino acid residues, a particular mathematics. It can be determined as the perfect match rate between smaller sequences of two or more sequences with gap alignments (if any) processed by a model or computer program (ie, an "algorithm"). The sequence identity of the polypeptide is described in Computational Molecular Biology, Lesk, A. et al. M. , Ed. , Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.M. W. , Ed. , Academic Press, New York, 1993, Computer Analysis of Section Data, Part 1, Griffin, A. et al. M. , And Griffin, H. et al. G. , Eds. , Humana Press, New Jersey, 1994, Sequencing Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. et al. , Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. et al. and Deverex, J. et al. , Eds. , M. Stockton Press, New York, 1991, and Carillo et al. , SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988), such as, but not limited to, can be readily calculated by methods known in the art. The preferred method for determining sequence identity is designed to provide maximum matching between the tested sequences. Methods for determining sequence identity are described in published computer programs, and such preferred computer programming methods for determining sequence identity between two sequences include GAP (Deverex et al.). , Program. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, Universality of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul et al. Examples include GCG program packages, including 410 (1990)). The BLASTX program is published from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and other sources (BLAST Manual, Altschul et al. NCB / NLM / NIH Bethesda, Md. 20894; Altschu et. The well-known Smith Waterman algorithm can also be used to determine sequence identity. For example, using the computer algorithm GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), Two polypeptides whose sequence identity percent are determined are aligned for optimal matching of their respective amino acids. (The "match span" determined by the algorithm). Gap start penalty (calculated as 3 times the average diagonal, "mean diagonal" is the diagonal average of the comparison matrix used, and "diagonal" is for each perfect amino acid match by a particular comparison matrix. An assigned score or number), and a gap extension penalty (usually {fraction (1/10)} times the gap start penalty), and a comparison matrix such as PAM 250 or BLOSUM 62, along with the algorithm. used. Standard comparison matrix (Dayoff et al. For PAM 250 comparison matrix, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978), BLOSUM 62 comparison matrix, Henikoff et al., Proc. See also Acad. Sci USA 89,10915-10919 (1992)), which is also used by the algorithm. In some embodiments, sequence identity can be determined using, for example, the algorithm GAP: Algorithm: Needleman et al. , J. Mol. Biol. 48,443-453 (1970), Comparative Matrix: Henikoff et al. , BLOSUM 62 from PNAS USA 89,10915-10919 (1992), and gap penalty: 12, gap length penalty: 4, similarity threshold: 0, and no penalty for end gaps.
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、１つ以上のアミノ酸置換または挿入を含む。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換の形態であってもよい。「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたは全く影響がないように、１つのアミノ酸残基を別の残基で置換することを伴い得る。保存的アミノ酸置換は、次のアミノ酸の群内で行われ得る：親水性：Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｉｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；脂肪族：Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；芳香族：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ；さらに、典型的には、任意の残基がアラニンで置換されてもよい。 In some embodiments, the antibodies of the invention comprise one or more amino acid substitutions or insertions. Amino acid substitutions may be in the form of conservative amino acid substitutions. "Conservative amino acid substitution" can involve substituting one amino acid residue with another so that it has little or no effect on the polarity or charge of the amino acid residue at that position. Conservative amino acid substitutions can be made within the following group of amino acids: hydrophilic: Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gin, Asn, Ser, Thr; aliphatic: Val, Ile, Leu, Met; bases. Sex: Lys, Arg, His; Fragrance: Phe, Tyr, Trp; Further, typically any residue may be substituted with alanine.
いくつかの実施形態では、１つ以上の非天然アミノ酸が、本発明の抗体への置換または挿入によって導入される。そのような非天然アミノ酸としては、共通アミノ酸のＤ－異性体、２，４－ジアミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、２－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトラリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β－アラニン、フルオロ－アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えば、Ｃα－メチルアミノ酸、およびＮα－メチルアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。 In some embodiments, one or more unnatural amino acids are introduced by substitution or insertion into the antibody of the invention. Such unnatural amino acids include D-isomers of common amino acids, 2,4-diaminobutyric acid, α-aminoisobutyric acid, 4-aminobutyric acid, 2-aminobutyric acid, 6-aminohexanoic acid, 2-aminoisobutyric acid, etc. 3-Aminopropionic Acid, Ornitine, Norleucine, Nolvalin, Hydroxyproline, Sarcosin, Citraline, Homocitrulin, Cyctic Acid, t-butylglycine, t-butylalanine, Phenylglycin, Cyclohexylalanine, β-alanine, Fluoro-amino Acids, Designer Amino acids such as, but are not limited to, Cα-methyl amino acids and Nα-methyl amino acids.
本発明の抗体のアミノ酸配列バリアントは、本発明の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、または所望のポリペプチドのインビトロ合成によって調製され得る。そのようなバリアントとしては、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、または置換が挙げられる。欠失、挿入、および置換の組み合わせは、最終構築物に到達するように作製され得るが、ただし、最終ポリペプチド産物が所望の特徴を有することを条件とする。バリアント（改変）ポリペプチドは、当該技術分野において既知の任意の技術を使用して調製され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、インビトロ変異誘発に供され得る。そのようなインビトロ変異誘発技術としては、ポリヌクレオチドを好適なベクターにサブクローニングすること、ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ－Ｉ ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの「ミューテーター」株に形質転換すること、および形質転換された細菌を好適な数の世代に増殖させることが挙げられる。変異／改変ＤＮＡに由来する産物は、本明細書に記載される技術を使用して容易にスクリーニングされて、それらが受容体結合および／または阻害活性を有するかを決定することができる。アミノ酸配列バリアントの設計において、変異部位の位置および変異の性質は、修飾される特徴に依存する。変異部位は、例えば、（１）最初に保存的アミノ酸選択で置換し、次いで達成された結果に応じてより多くのラジカル選択で置換すること、（２）標的残基を欠失させること、または（３）配置された部位に隣接して他の残基を挿入することによって、個々にまたは順次に修飾され得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列欠失は、約１～１５個の残基、より好ましくは約１～１０個の残基、および典型的には約１～５個の連続残基に及ぶ。 Amino acid sequence variants of the antibodies of the invention can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the nucleic acids of the invention or by in vitro synthesis of the desired polypeptide. Such variants include, for example, deletion, insertion, or substitution of residues in the amino acid sequence. Combinations of deletions, insertions, and substitutions can be made to reach the final construct, provided that the final polypeptide product has the desired characteristics. Variant polypeptides can be prepared using any technique known in the art. For example, the polynucleotides of the invention can be used for in vitro mutagenesis. Such in vitro mutagenesis techniques include subcloning the polynucleotide into a suitable vector, the vector being E. coli. Transforming into a "mutator" strain such as E. coli XL-I red (Stratagene) and growing the transformed bacterium into a suitable number of generations. Products derived from mutant / modified DNA can be readily screened using the techniques described herein to determine if they have receptor binding and / or inhibitory activity. In the design of amino acid sequence variants, the location of the site of mutation and the nature of the mutation depend on the characteristics being modified. Mutant sites are, for example, (1) first replaced with conservative amino acid selection and then with more radical selection depending on the results achieved, (2) deletion of target residues, or (3) It can be modified individually or sequentially by inserting other residues adjacent to the site where it was placed. In some embodiments, the amino acid sequence deletion spans about 1-15 residues, more preferably about 1-10 residues, and typically about 1-5 contiguous residues. ..
いくつかの実施形態では、分子は、定義された配列から本質的になる。いくつかの実施形態では、分子は、定義された配列からなる。いくつかの実施形態では、抗体は、単離抗体である。「単離抗体」という用語は、その自然環境中の別の／他の成分から分離および／もしくは回収されている抗体、ならびに／またはその自然環境中の成分の混合物から精製されている抗体を指す。本発明の抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、または非ヒト霊長類などの哺乳類種を含む、異なる種由来であってもよい。抗体は、齧歯類抗体、より具体的にはマウス抗体であってもよい。あるいは、抗体は、ニワトリなどの非哺乳類種由来であってもよい。抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。 In some embodiments, the molecule consists essentially of a defined sequence. In some embodiments, the molecule consists of a defined sequence. In some embodiments, the antibody is an isolated antibody. The term "isolated antibody" refers to an antibody that has been isolated and / or recovered from another / other component in its natural environment, and / or an antibody that has been purified from a mixture of components in its natural environment. .. The antibodies of the invention may be from different species, including mammalian species such as mice, rats, rabbits, pigs, or non-human primates. The antibody may be a rodent antibody, more specifically a mouse antibody. Alternatively, the antibody may be of non-mammalian species such as chicken. The antibody may further be a humanized antibody or a human antibody.
本発明の抗体は、組換えタンパク質、細胞培養、および免疫学的技術などの当該技術分野において既知の方法に従って調製され得る。そのような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編者），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編者），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５および１９９６）、ならびにＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編者），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのすべての改訂を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、ならびにＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（編者）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（現在までのすべての改訂を含む）などのソースの文献全体にわたって記載および説明されている。
Antibodies of the invention can be prepared according to methods known in the art such as recombinant proteins, cell culture, and immunological techniques. Such techniques are described in J. Mol. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Mol. Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.W. A. Brown (Editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach,
ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体を含む単鎖抗体は、そのアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列を宿主細胞中のプラスミドに挿入し、続いて、組換え技術、例えば、細菌細胞培養によって、この宿主細胞を使用して抗体を発現することによって調製され得、そのような方法は、当該技術分野において周知である。 Single-chain antibodies, including scFv or scFv-Fc antibodies, insert the DNA sequence corresponding to their amino acid sequence into a plasmid in the host cell, followed by use of this host cell by recombinant techniques, eg, bacterial cell culture. And can be prepared by expressing the antibody, such methods are well known in the art.
モノクローナル抗体は、典型的には、骨髄腫細胞を、所望の抗原で免疫化されたマウスからの脾臓細胞と融合することによって作製される。ヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体をコードするトランスジェニック動物（例えば、マウスまたは他の好適な種）から得られ得る。あるいは、組換えモノクローナル抗体は、レパートリークローニングまたはファージディスプレイ／酵母ディスプレイと称される技術を伴って作製され得る。組換え抗体工学は、マウスではなくウイルスまたは酵母を使用して抗体を作製することを伴う。 Monoclonal antibodies are typically made by fusing myeloma cells with spleen cells from mice immunized with the desired antigen. Human monoclonal antibodies can be obtained from transgenic animals encoding human antibodies (eg, mice or other suitable species). Alternatively, recombinant monoclonal antibodies can be made with a technique referred to as repertoire cloning or phage display / yeast display. Recombinant antibody engineering involves making antibodies using viruses or yeast rather than mice.
抗体の方法および使用
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを同定および／または定量化するための、本明細書に定義される抗体の使用に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、可溶性リラグルチドまたは可溶性セマグルチドを含む溶液からリラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを部分的に単離することを含む、単離するための、本明細書に定義される抗体の使用に関する。そのような同定および／または定量化は、抗体をフィブリルに結合し、続いて、結合した抗体を検出することによって、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を介して行われ得る。ＥＬＩＳＡは、当該技術分野において既知のように行われ得る。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡ用の容器（マイクロタイタープレートなど）は、最初に飽和している。飽和は、リゾチームまたはアルブミン、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはオボアルブミンなどのタンパク質を伴い得る。いくつかの実施形態では、フィブリルに結合した本発明の抗体は、二次抗体に結合される。本発明の抗体がＦｃドメインを含む場合、二次抗体は、このＦｃドメインに結合し得る。二次抗体上にマーカーが存在する場合、二次抗体の検出および／または定量化が可能であり得、そのようなマーカーは、分光法を介して同定され得るフルオロフォアであり得る。定量化は、本発明の抗体に結合したフィブリルの標準を使用して行われ得る。
Methods and Uses of Antibodies In some embodiments, the present invention relates to the use of antibodies as defined herein for identifying and / or quantifying liraglutide fibrils or semaglutide fibrils. In some embodiments, the invention is defined herein for isolation, comprising partially isolating liraglutide fibrils or semaglutide fibrils from a solution containing soluble liraglutide or soluble semaglutide. Regarding the use of antibodies. Such identification and / or quantification can be performed, for example, via an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) by binding the antibody to fibril and subsequently detecting the bound antibody. ELISA can be performed as known in the art. In some embodiments, the vessel for ELISA (such as a microtiter plate) is initially saturated. Saturation can be associated with proteins such as lysozyme or albumin, such as bovine serum albumin (BSA) or ovalbumin. In some embodiments, the antibody of the invention bound to fibril is bound to a secondary antibody. If the antibody of the invention comprises an Fc domain, the secondary antibody may bind to this Fc domain. If a marker is present on the secondary antibody, it may be possible to detect and / or quantify the secondary antibody, and such marker may be a fluorophore that can be identified via spectroscopy. Quantification can be performed using the standard of fibril bound to the antibody of the invention.
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される場合、「検出限界」という用語は、検出の最低限界を指し、これは、ある物質の、この物質が存在しない場合と区別され得る最低濃度である。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される場合、「検出限界」という用語は、本明細書のアッセイ（ＩＶ）に従って決定される３の混合物／可溶性特異性比を指す。抗体およびＴｈＴアッセイを使用した検出限界の比較は、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って行われ得る。抗体およびＴｈＴアッセイを使用した検出限界の比較は、本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って行われ得る。いくつかの実施形態では、抗体に関して本明細書で使用される場合、「検出限界」という用語は、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ）またはアッセイ（ＩＶ）などの、ＥＬＩＳＡにおいて当該抗体を使用するアッセイの検出限界を指す。いくつかの実施形態では、抗体に関して本明細書で使用される場合、「検出限界」という用語は、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）などの、ＥＬＩＳＡにおいて当該抗体を使用するアッセイの検出限界を指す。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される場合、「検出限界」という用語は、２つ組で試験された対照試料の標準偏差の３倍であり、標準偏差は、スチューデントのｔ検定によって決定され得る。 In some embodiments, as used herein, the term "detection limit" refers to the lowest detection limit, which is the lowest concentration of a substance that can be distinguished from the absence of this substance. Is. In some embodiments, as used herein, the term "detection limit" refers to a mixture / soluble specificity ratio of 3 determined according to assay (IV) herein. Comparison of detection limits using antibodies and ThT assays can be performed according to the assay (VI) herein. Comparison of detection limits using antibodies and ThT assays can be performed according to the assay (VI-B) herein. In some embodiments, as used herein with respect to an antibody, the term "detection limit" refers to an assay that uses the antibody in an ELISA, such as assay (III) or assay (IV) herein. Refers to the detection limit of. In some embodiments, as used herein with respect to an antibody, the term "detection limit" refers to the detection limit of an assay that uses the antibody in an ELISA, such as the assay (III-B) herein. Point to. In some embodiments, as used herein, the term "detection limit" is three times the standard deviation of the control sample tested in pairs, where the standard deviation is Student's t-test. Can be determined by.
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルの同定のための、本明細書に定義される抗体の使用に関する。 In some embodiments, the invention relates to the use of antibodies as defined herein for the identification of liraglutide fibrils or semaglutide fibrils.
いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）リラグルチドフィブリルおよび可溶性リラグルチド、または（ｉｉ）セマグルチドフィブリルおよび可溶性セマグルチドを含む混合物から、フィブリルを除去するためのアフィニティリガンドとしての、本明細書に定義される抗体の使用に関する。 In some embodiments, the invention is described herein as an affinity ligand for removing fibril from a mixture comprising (i) liraglutide fibrils and soluble liraglutide, or (ii) semaglutide fibrils and soluble semaglutide. With respect to the use of antibodies as defined in.
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを同定するための方法に関し、当該方法は、ａ）本明細書に定義される抗体をリラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む。 In some embodiments, the invention relates to a method for identifying liraglutide fibrils or semaglutide fibrils, wherein the method a) binds an antibody as defined herein to liraglutide fibrils or semaglutide fibrils. Includes steps to do.
いくつかの実施形態では、本発明は、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを定量化するための方法に関し、当該方法は、ａ）本明細書に定義される抗体をリラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む。ｂ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を検出するステップをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。いくつかの実施形態では、方法は、ｃ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を、任意に当該フィブリルの標準の使用によって定量化するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、フィブリルは、溶液中にある。いくつかの実施形態では、フィブリルは、可溶性リラグルチドをさらに含む溶液中にある。いくつかの実施形態では、フィブリルは、リラグルチドフィブリルおよび任意に可溶性リラグルチド以外の他のペプチドまたはタンパク質をさらに含まない溶液中にある。 In some embodiments, the invention relates to a method for quantifying liraglutide fibrils or semaglutide fibrils, wherein the method a) converts the antibodies defined herein into liraglutide fibrils or semaglutide fibrils. Includes steps to combine. b) The method according to any one of the preceding embodiments, further comprising the step of detecting an antibody bound to liraglutide fibrils or semaglutide fibrils. In some embodiments, the method further comprises c) quantifying the antibody bound to liraglutide fibrils or semaglutide fibrils, optionally by using the standard of the fibrils. In some embodiments, the fibril is in solution. In some embodiments, fibril is in solution further containing soluble liraglutide. In some embodiments, the fibril is in a solution that is further free of liraglutide fibrils and optionally other peptides or proteins other than soluble liraglutide.
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）試料中の１つ以上のフィブリルが固体支持体上に固定化される条件下で、固体支持体を試料と接触させることと、（ｂ）抗体が１つ以上の固定化フィブリルに結合して、抗体－フィブリル複合体を形成する条件下で、固体支持体を、本明細書に記載される抗体のいずれか１つまたはその抗原結合断片と接触させることと、（ｃ）抗体－フィブリル複合体を、検出可能な標識を含む第２の抗体と接触させることとを含み、ここで、（ｉ）第２の抗体は、抗体－フィブリル複合体に特異的に結合し、（ｉｉ）検出可能な標識からのシグナルの検出は、試料中の１つ以上のフィブリルの存在を示す。 In some embodiments, the method is (a) contacting the solid support with the sample under conditions where one or more fibrils in the sample are immobilized on the solid support, and (b) an antibody. The solid support is contacted with any one of the antibodies described herein or an antigen-binding fragment thereof, provided that the solid support binds to one or more immobilized fibrils to form an antibody-fibril complex. And (c) contacting the antibody-fibril complex with a second antibody containing a detectable label, wherein (i) the second antibody is directed to the antibody-fibril complex. Detection of a signal from a specifically bound (ii) detectable label indicates the presence of one or more fibrils in the sample.
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）試料中に存在する場合、フィブリルが抗体に結合し、表面に固定化されて複合体を形成するように、フィブリル特異的抗体を含む固体支持体を試料と接触させることと、（ｂ）複合体を検出することとを含む。 In some embodiments, the method is: (a) a solid support comprising a fibril-specific antibody such that when present in a sample, the fibril binds to the antibody and is immobilized on the surface to form a complex. Includes contacting the sample and (b) detecting the complex.
平面基板またはビーズの形態のポリマー材料から作製された固体支持体などが挙げられるがこれらに限定されない、当該技術分野において既知の任意の固体支持体が、本明細書に記載される方法で使用され得る。例えば、固体支持体は、スライド、マルチウェルプレート、（例えば、９６ウェルプレート）、またはビーズ、例えば、ラテックス、アガロース、セファロース、ストレプトアビジン、トシル活性化、エポキシ、ポリスチレン、アミノビーズ、アミンビーズ、カルボキシルビーズなどであってもよい。ある特定の実施形態では、ビーズは、粒子、例えば、微粒子であってもよい。「ビーズ」および「粒子」という用語は、本明細書において同じ意味で使用され、実質的に球状の固体支持体を指す。「微粒子」および「マイクロビーズ」という用語は、本明細書において同じ意味で使用され、例えば、検出モジュール内のウェルのアレイなど、ウェルのアレイを占有するか、またはそこに定着することが許容されるマイクロビーズまたは微粒子を指す。タンパク質またはペプチドをプレートまたは微粒子などの固体支持体に付着させるために、当該技術分野において既知の様々な技術が使用され得る。例えば、米国特許第５，６２０，８５０号に記載される方法など、反応部分をタンパク質に付加するための幅広い技術が知られている。タンパク質の表面への付着のための方法は、例えば、Ｈｅｌｌｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２３：１２８（１９９０）にも記載されている。 Any solid support known in the art, such as, but not limited to, solid supports made from polymer materials in the form of flat substrates or beads, is used in the methods described herein. obtain. For example, the solid support can be a slide, multi-well plate, (eg, 96-well plate), or beads, such as latex, agarose, sepharose, streptavidin, tosyl activation, epoxy, polystyrene, amino beads, amine beads, carboxyl. It may be beads or the like. In certain embodiments, the beads may be particles, eg, fine particles. The terms "beads" and "particles" are used interchangeably herein to refer to a substantially spherical solid support. The terms "fine particles" and "microbeads" are used interchangeably herein, and it is permissible to occupy or colonize an array of wells, for example, an array of wells within a detection module. Refers to microbeads or fine particles. Various techniques known in the art can be used to attach a protein or peptide to a solid support such as a plate or microparticle. A wide range of techniques for adding reaction moieties to proteins are known, for example, the methods described in US Pat. No. 5,620,850. Methods for attaching proteins to the surface are described, for example, in Heller, Ac. Chem. Res. , 23: 128 (1990).
固体支持体は、当該技術分野において既知の任意の好適な方法を使用して、大量の試料と接触させられ得る。本明細書で使用される場合、「接触」という用語は、試料中に１つ以上のフィブリルが存在する場合に結合相互作用が起こるように、固体支持体を試料中の１つ以上のフィブリルと十分に接近させる任意のタイプの混合作用を指す。接触は、試料をマルチウェルプレートまたは微粒子と混合することを含む、様々な異なる方法で達成され得る。接触は、必要な回数だけ繰り返され得る。インキュベーションは、例えば、アルブミン（例えば、ＢＳＡ）、非イオン性洗剤（Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、および／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＰＭＳＦ）などの、特異的結合相互作用を促進する結合緩衝液中にあってもよい。例えば、温度および塩濃度などの結合相互作用のための他の条件もまた、経験的に決定されてもよく、または製造業者の指示に基づいてもよい。例えば、接触は、室温（２１℃～２８℃、例えば、２３℃～２５℃）、３７℃、または４℃で行わ得る。本明細書において使用される場合、「検出可能な標識」および「標識」という用語は、視覚または機器による手段によって検出可能であるシグナルを発生させることができる部分を指す。検出可能な標識は、例えば、色素原、蛍光化合物、酵素、化学発光化合物、放射性化合物などのシグナル発生物質であってもよい。一実施形態では、検出可能な標識は、フルオロフォアなどの蛍光化合物であってもよい。試料中のフィブリルの存在または量は、当該技術分野において既知の任意の好適な方法を使用して決定（例えば、定量化）され得る。そのような方法としては、免疫測定法、例えば、ＥＬＩＳＡが挙げられるが、これに限定されない。 The solid support can be contacted with a large amount of sample using any suitable method known in the art. As used herein, the term "contact" refers to a solid support with one or more fibrils in a sample so that binding interactions occur in the presence of one or more fibrils in the sample. Refers to any type of mixing action that is sufficiently close. Contact can be achieved in a variety of different ways, including mixing the sample with a multi-well plate or microparticles. The contact can be repeated as many times as necessary. Incubation promotes specific binding interactions such as albumin (eg, BSA), nonionic detergents (Tween-20, Triton X-100), and / or protease inhibitors (eg, PMSF). It may be in buffer. Other conditions for binding interactions, such as temperature and salt concentration, may also be determined empirically or based on the manufacturer's instructions. For example, the contact can be at room temperature (21 ° C. to 28 ° C., eg, 23 ° C. to 25 ° C.), 37 ° C., or 4 ° C. As used herein, the terms "detectable marker" and "label" refer to a portion capable of generating a signal that is detectable by visual or instrumental means. The detectable label may be, for example, a signal generator such as a dye source, a fluorescent compound, an enzyme, a chemiluminescent compound, a radioactive compound or the like. In one embodiment, the detectable label may be a fluorescent compound such as fluorophore. The presence or amount of fibril in the sample can be determined (eg, quantified) using any suitable method known in the art. Such methods include, but are not limited to, immunoassays such as ELISA.
いくつかの実施形態では、本発明は、可溶性リラグルチドおよび／またはモノマーリラグルチドを上回ってリラグルチドフィブリルを検出するためのアッセイに関し、本発明による抗体を含み、当該抗体は、１～１０ｐｐｍのフィブリル、あるいは１０～１００ｐｐｍのフィブリル、あるいは１００～１０００ｐｐｍのフィブリルなど、溶液中１～１０００ｐｐｍのフィブリル濃度でリラグルチドフィブリルを検出することができる。 In some embodiments, the invention comprises an antibody according to the invention with respect to an assay for detecting rilaglutide fibrils above soluble lylaglutide and / or monomeric lylaglutide, wherein the antibody is 1-10 ppm fibrils, or 10%. Rilaglutide fibrils can be detected at a fibril concentration of 1 to 1000 ppm in a solution, such as up to 100 ppm fibril or 100 to 1000 ppm fibrils.
いくつかの実施形態では、「１つ（ａ）」は、「１つ以上」を意味する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、参照される値のマイナス１０％からプラス１０％の範囲を意味する。本明細書に別段示されない限り、単数形で提示される用語は、複数の状況も含む。 In some embodiments, "one (a)" means "one or more." As used herein, the term "about" means the range of minus 10% to plus 10% of the referenced value. Unless otherwise indicated herein, the terms presented in the singular form also include multiple situations.
発明を実施するための形態
本発明の非限定的な実施形態は、以下を含む。
１．リラグルチドフィブリルに結合する抗体。
２．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該フィブリルが、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って調製される、抗体。
３．セマグルチドフィブリルに結合する抗体。
４．セマグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該フィブリルが、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に従って調製される、抗体。
５．当該抗体が、ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍または少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って任意に決定される、実施形態１または２に記載の抗体。
６．当該抗体が、可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも２０倍高いまたは少なくとも５０倍高いなど、少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルを有する、実施形態１または２に記載の抗体。
７．当該抗体が、ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍または少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って任意に決定される、実施形態１または２に記載の抗体。
８．当該抗体が、可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも１０倍など、少なくとも５倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルを有し、当該結合レベルが、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って任意に決定される、実施形態１または２に記載の抗体。
９．当該抗体が、ＴｈＴアッセイにおけるセマグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍または少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのセマグルチドフィブリルの検出限界を有し、当該検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って任意に決定される、実施形態３または４に記載の抗体。
１０．当該抗体が、可溶性セマグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも２０倍高いまたは少なくとも５０倍高いなど、少なくとも１０倍高いセマグルチドフィブリルへの結合レベルを有する、実施形態３または４に記載の抗体。
１１．当該結合レベルが、本明細書のアッセイ（ＩＶ）に従って決定される、実施形態６または１０に記載の抗体。
１２．当該結合レベルが、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ）に従って決定される、実施形態６または１０に記載の抗体。
１３．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列が、配列番号３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される、抗体。
１４．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、
ａ．配列番号３７、３８、および３９、
ｂ．配列番号４３、４４、および４５、
ｃ．配列番号４９、５０、および５１、
ｄ．配列番号５５、５６、および５７、
ｅ．配列番号６１、６２、および６３、
ｆ．配列番号６７、６８、および６９、
ｇ．配列番号７３、７４、および７５、
ｈ．配列番号７９、８０、および８１、
ｉ．配列番号８５、８６、および８７、
ｊ．配列番号９１、９２、および９３、
ｋ．配列番号９７、９８、および９９、
ｌ．配列番号１０３、１０４、および１０５、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
１５．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の軽鎖の可変領域が、
ａ．配列番号４０、４１、および４２、
ｂ．配列番号４６、４７、および４８、
ｃ．配列番号５２、５３、および５４、
ｄ．配列番号５８、５９、および６０、
ｅ．配列番号６４、６５、および６６、
ｆ．配列番号７０、７１、および７２、
ｇ．配列番号７６、７７、および７８、
ｈ．配列番号８２、８３、および８４、
ｉ．配列番号８８、８９、および９０、
ｊ．配列番号９４、９５、および９６、
ｋ．配列番号１００、１０１、および１０２、
ｌ．配列番号１０６、１０７、および１０８、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
１６．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、先行する実施形態のいずれか１つに記載の重鎖の可変領域、および先行する実施形態のいずれか１つに記載の軽鎖の可変領域を含む、抗体。
１７．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む、抗体。
１８．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する、抗体。
１９．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、１１１、および１１３、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、抗体。
２０．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、１１２、および１１４、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む、抗体。
２１．当該抗体が、単離抗体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２２．当該抗体が、単離抗体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２３．当該抗体が、Ｆｃドメインを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２４．当該抗体が、Ｆｃドメインをさらに含む単鎖Ｆｖ断片である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２５．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルおよび／またはセマグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２６．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２７．当該抗体が、当該セマグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２８．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルの同定のための、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体の使用。
２９．（ｉ）リラグルチドフィブリルおよび可溶性リラグルチド、または（ｉｉ）セマグルチドフィブリルおよび可溶性セマグルチドを含む混合物から、フィブリルを除去するためのアフィニティリガンドとしての、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体の使用。
３０．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを同定するための方法であって、ａ）先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
３１．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを定量化するための方法であって、ａ）先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
３２．ｂ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を検出するステップをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３３．ｃ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を、任意に当該フィブリルの標準の使用によって定量化するステップをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３４．当該フィブリルが、溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３５．当該フィブリルが、可溶性リラグルチドをさらに含む溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３６．当該フィブリルが、リラグルチドフィブリルおよび任意に可溶性リラグルチド以外の他のペプチドまたはタンパク質をさらに含まない溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３７．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該フィブリルが、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体が、
ａ．可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも２０倍高いもしくは少なくとも５０倍高いなど、少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベル、および／または
ｂ．ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍もしくは少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界であって、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って任意に決定される当該検出限界、を有する、抗体。
３８．セマグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該フィブリルが、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に従って任意に調製され、当該抗体が、
ｃ．可溶性セマグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも２０倍高いもしくは少なくとも５０倍高いなど、少なくとも１０倍高いセマグルチドフィブリルへの結合レベル、および／または
ｄ．ＴｈＴアッセイにおけるセマグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１００倍もしくは少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍低い濃度でのセマグルチドフィブリルの検出限界、を有し、当該検出限界が、アッセイ（ＶＩ）に従って任意に決定される、抗体。
３９．当該結合レベルが、本明細書のアッセイ（ＩＶ）に従って決定される、実施形態３７または３８に記載の抗体。
４０．当該結合レベルが、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ）に従って決定される、実施形態３７または３８に記載の抗体。
４１．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列が、配列番号３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、１１５、および１２１、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される、抗体。
４２．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、ＣＤＲ３配列を含み、当該ＣＤＲ３配列が、配列番号３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される、抗体。
４３．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、
ａ．配列番号３７、３８、および３９、
ｂ．配列番号４３、４４、および４５、
ｃ．配列番号４９、５０、および５１、
ｄ．配列番号５５、５６、および５７、
ｅ．配列番号６１、６２、および６３、
ｆ．配列番号６７、６８、および６９、
ｇ．配列番号７３、７４、および７５、
ｈ．配列番号７９、８０、および８１、
ｉ．配列番号８５、８６、および８７、
ｊ．配列番号９１、９２、および９３、
ｋ．配列番号９７、９８、および９９、
ｌ．配列番号１０３、１０４、および１０５、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
４４．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の軽鎖の可変領域が、
ａ．配列番号４０、４１、および４２、
ｂ．配列番号４６、４７、および４８、
ｃ．配列番号５２、５３、および５４、
ｄ．配列番号５８、５９、および６０、
ｅ．配列番号６４、６５、および６６、
ｆ．配列番号７０、７１、および７２、
ｇ．配列番号７６、７７、および７８、
ｈ．配列番号８２、８３、および８４、
ｉ．配列番号８８、８９、および９０、
ｊ．配列番号９４、９５、および９６、
ｋ．配列番号１００、１０１、および１０２、
ｌ．配列番号１０６、１０７、および１０８、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
４５．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、先行する実施形態のいずれか１つに記載の重鎖の可変領域、および先行する実施形態のいずれか１つに記載の軽鎖の可変領域を含む、抗体。
４６．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む、抗体。
４７．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する、抗体。
４８．当該抗体が、単離抗体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
４９．当該抗体が、単鎖Ｆｖ断片である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５０．当該抗体が、Ｆｃドメインを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５１．当該抗体が、Ｆｃドメインをさらに含む単鎖Ｆｖ断片である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５２．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルおよび／またはセマグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５３．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５４．当該抗体が、当該セマグルチドフィブリルに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５５．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルの同定のための、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体の使用。
５６．（ｉ）リラグルチドフィブリルおよび可溶性リラグルチド、または（ｉｉ）セマグルチドフィブリルおよび可溶性セマグルチドを含む混合物から、フィブリルを除去するためのアフィニティリガンドとしての、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体の使用。
５７．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを同定するための方法であって、ａ）先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
５８．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを定量化するための方法であって、ａ）先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
５９．ｂ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を検出するステップをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６０．ｃ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を、任意に当該フィブリルの標準の使用によって定量化するステップをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６１．当該フィブリルが、溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６２．当該フィブリルが、可溶性リラグルチドをさらに含む溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６３．当該フィブリルが、リラグルチドフィブリルおよび任意に可溶性リラグルチド以外の他のペプチドまたはタンパク質をさらに含まない溶液中にある、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６４．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の重鎖の可変領域が、
ｍ．配列番号１１５、１１６、および１１７、
ｎ．配列番号 １２１、１２２、１２３、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
６５．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、当該抗体の軽鎖の可変領域が、
ａａ．配列番号１１８、１１９、および１２０、
ｂｂ．配列番号１２４、１２５、および１２６、
または１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、抗体。
６６．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、先行する実施形態のいずれか１つに記載の重鎖の可変領域、および先行する実施形態のいずれか１つに記載の軽鎖の可変領域を含む、抗体。
６７．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１０９および１１０、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む、抗体。
６８．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１０９および１１０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％など、少なくとも８０％の配列同一性を有する、抗体。
６９．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、１１１、および１１３、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、実施形態３７～６８のいずれか１つに記載の抗体。
７０．リラグルチドフィブリルに結合する抗体であって、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、１１２、および１１４、または最大１５個もしくは最大１０個など、最大２０個のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する当該配列のいずれかからなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む、実施形態３７～６９のいずれか１つに記載の抗体。
７１．当該抗体が、単離抗体である、実施形態３７～７０のいずれか１つに記載の抗体。
７２．当該抗体が、単鎖Ｆｖ断片である、実施形態３７～７１のいずれか１つに記載の抗体。
７３．当該抗体が、Ｆｃドメインを含む、実施形態３７～７２のいずれか１つに記載の抗体。
７４．当該抗体が、Ｆｃドメインをさらに含む単鎖Ｆｖ断片である、実施形態３７～７３のいずれか１つに記載の抗体。
７５．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルおよび／またはセマグルチドフィブリルに特異的に結合する、実施形態３７～７４のいずれか１つに記載の抗体。
７６．当該抗体が、当該リラグルチドフィブリルに特異的に結合する、実施形態３７～７５のいずれか１つに記載の抗体。
７７．当該抗体が、当該セマグルチドフィブリルに特異的に結合する、実施形態３７～７６のいずれか１つに記載の抗体。
７８．当該フィブリルが、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って任意に調製され、当該抗体が、
ａ．可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルであって、少なくとも２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度でのアッセイ（ＩＩＩ）に従って決定される、結合レベル、および／または
ｂ．ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界であって、少なくとも１μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って決定される、検出限界、および／または
ｃ．可溶性リラグルチドへの当該抗体の結合レベルよりも少なくとも５倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルであって、当該抗体が、９５％超のモノマー純度を有し、当該結合レベルが、少なくとも３０μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って決定される、結合レベル、および／または
ｄ．ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界であって、当該抗体が、９５％超のモノマー純度を有し、当該検出限界が、少なくとも０．０２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度での本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って決定される、検出限界、を有する、実施形態３７～７７のいずれか１つに記載の抗体。
７９．当該抗体が、１～１０ｐｐｍのフィブリル、あるいは１０～１００ｐｐｍのフィブリル、あるいは１００～１０００ｐｐｍのフィブリルなど、溶液中１～１０００ｐｐｍのフィブリル濃度でリラグルチドフィブリルを検出することができる、実施形態３７～７８のいずれか１つに記載の抗体。
８０．当該抗体が、７０％超、あるいは７５％超、あるいは８０％超、あるいは８５％超、あるいは９０％超、あるいは９５％超のモノマー純度を有する、実施形態３７～７９のいずれか１つに記載の抗体。
８１．当該抗体が、９５％超のモノマー純度を有する、実施形態３７～８０のいずれか１つに記載の抗体。
８２．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルの同定のための、実施形態３７～８１のいずれか１つに記載の抗体の使用。
８３．（ｉ）リラグルチドフィブリルおよび可溶性リラグルチド、または（ｉｉ）セマグルチドフィブリルおよび可溶性セマグルチドを含む混合物から、フィブリルを除去するためのアフィニティリガンドとしての、実施形態３７～８１のいずれか１つに記載の抗体の使用。００
８４．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを同定するための方法であって、ａ）実施形態３７～８１のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
８５．リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルを定量化するための方法であって、ａ）実施形態３７～８１のいずれか１つに記載の抗体を、リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合するステップを含む、方法。
８６．ｂ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を検出するステップをさらに含む、実施形態８４または８５に記載の方法。
８７．ｃ）リラグルチドフィブリルまたはセマグルチドフィブリルに結合した抗体を、任意に当該フィブリルの標準の使用によって定量化するステップをさらに含む、実施形態８４～８６のいずれか１つに記載の方法。
８８．当該フィブリルが、溶液中にある、実施形態８４～８７のいずれか１つに記載の方法。
８９．当該フィブリルが、可溶性リラグルチドをさらに含む溶液中にある、実施形態８４～８８のいずれか１つに記載の方法。
９０．当該フィブリルが、リラグルチドフィブリルおよび任意に可溶性リラグルチド以外の他のペプチドまたはタンパク質をさらに含まない溶液中にある、実施形態８４～８９のいずれか１つに記載の方法。
９１．可溶性リラグルチドおよび／またはモノマーリラグルチドよりもリラグルチドフィブリルを選択的に検出するためのアッセイであって、実施形態３７～８１のいずれか１つに記載の抗体を含み、当該抗体が、１～１０ｐｐｍのフィブリル、あるいは１０～１００ｐｐｍのフィブリル、あるいは１００～１０００ｐｐｍのフィブリルなど、溶液中１～１０００ｐｐｍのフィブリル濃度でリラグルチドフィブリルを検出することができる、アッセイ。
Embodiments of the Invention Non-limiting embodiments of the present invention include:
1. 1. An antibody that binds to liraglutide fibrils.
2. 2. An antibody that binds to liraglutide fibrils, wherein the fibrils are prepared according to assay (I) herein.
3. 3. An antibody that binds to semaglutide fibrils.
4. An antibody that binds to semaglutide fibrils, wherein the fibrils are prepared according to assay (II) herein.
5. The antibody has a detection limit for rilaglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower, such as at least 100-fold or at least 1000-fold below the detection limit for rilaglutide fibrils in the ThT assay, which is the detection limit herein ( The antibody according to
6. The antibody according to
7. The antibody has a detection limit for rilaglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower, such as at least 100-fold or at least 1000-fold below the detection limit for rilaglutide fibrils in the ThT assay, which is the detection limit herein ( The antibody according to
8. The antibody has a binding level to liraglutide fibrils that is at least 5-fold higher, such as 10-fold higher than the binding level of the antibody to soluble liraglutide, and the binding level is optional according to the assay (III-B) herein. The antibody according to
9. The antibody has a detection limit for semaglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower, such as at least 100-fold or at least 1000-fold below the detection limit for semaglutide fibrils in the ThT assay. The antibody according to
10. The antibody according to
11. The antibody according to
12. The antibody according to
13. An antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the heavy chain of the antibody comprises the CDR3 sequence, and the CDR3 sequence is SEQ ID NO: 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, An antibody selected from the group consisting of 91, 97, 103, or any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions.
14. An antibody that binds to liraglutide fibrils, wherein the variable region of the heavy chain of the antibody is
a. SEQ ID NOs: 37, 38, and 39,
b. SEQ ID NOs: 43, 44, and 45,
c. SEQ ID NOs: 49, 50, and 51,
d. SEQ ID NOs: 55, 56, and 57,
e. SEQ ID NOs: 61, 62, and 63,
f. SEQ ID NOs: 67, 68, and 69,
g. SEQ ID NOs: 73, 74, and 75,
h. SEQ ID NOs: 79, 80, and 81,
i. SEQ ID NOs: 85, 86, and 87,
j. SEQ ID NOs: 91, 92, and 93,
k. SEQ ID NOs: 97, 98, and 99,
l. SEQ ID NOs: 103, 104, and 105,
Or an antibody comprising a CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequence selected from the group consisting of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions.
15. An antibody that binds to liraglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is
a. SEQ ID NOs: 40, 41, and 42,
b. SEQ ID NOs: 46, 47, and 48,
c. SEQ ID NOs: 52, 53, and 54,
d. SEQ ID NOs: 58, 59, and 60,
e. SEQ ID NOs: 64, 65, and 66,
f. SEQ ID NOs: 70, 71, and 72,
g. SEQ ID NOs: 76, 77, and 78,
h. SEQ ID NOs: 82, 83, and 84,
i. SEQ ID NOs: 88, 89, and 90,
j. SEQ ID NOs: 94, 95, and 96,
k. SEQ ID NOs: 100, 101, and 102,
l. SEQ ID NOs: 106, 107, and 108,
Or an antibody comprising a CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequence selected from the group consisting of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions.
16. An antibody that binds to liraglutide fibrils and comprises a variable region of a heavy chain according to any one of the preceding embodiments and a variable region of a light chain according to any one of the preceding embodiments. ..
17. Antibodies that bind to rilaglutide fibrils, up to 20 such as SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, and 12, or up to 15 or up to 10. An antibody comprising a sequence selected from the group consisting of any of the sequences having an amino acid substitution, deletion, or insertion of.
18. Antibodies that bind to liraglutide fibrils and at least 90% of the sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 and 12. An antibody having at least 80% sequence identity, such as at least 95%.
19. Antibodies that bind to rilaglutide fibrils, such as SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 111, and 113, or up to 15 or up to 10. , An antibody comprising a variable light chain (VL) sequence selected from the group consisting of any of the sequences having up to 20 amino acid substitutions, deletions, or insertions.
20. Antibodies that bind to rilaglutide fibrils, such as SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 112, and 114, or up to 15 or up to 10. , An antibody comprising a variable heavy chain (VH) sequence selected from the group consisting of any of the sequences having up to 20 amino acid substitutions, deletions, or insertions.
21. The antibody according to any one of the preceding embodiments, wherein the antibody is an isolated antibody.
22. The antibody according to any one of the preceding embodiments, wherein the antibody is an isolated antibody.
23. The antibody according to any one of the preceding embodiments, wherein the antibody comprises an Fc domain.
24. The antibody according to any one of the preceding embodiments, wherein the antibody is a single chain Fv fragment further comprising an Fc domain.
25. The antibody according to any one of the preceding embodiments, wherein the antibody specifically binds to the liraglutide fibril and / or semaglutide fibril.
26. The antibody according to any one of the preceding embodiments, wherein the antibody specifically binds to the liraglutide fibril.
27. The antibody according to any one of the preceding embodiments, wherein the antibody specifically binds to the semaglutide fibril.
28. Use of the antibody according to any one of the preceding embodiments for the identification of liraglutide fibrils or semaglutide fibrils.
29. The antibody according to any one of the preceding embodiments as an affinity ligand for removing fibril from (i) liraglutide fibrils and soluble liraglutide, or (ii) semaglutide fibrils and mixtures containing soluble semaglutide. use.
30. A method for identifying liraglutide fibrils or semaglutide fibrils, comprising the step of a) binding the antibody according to any one of the preceding embodiments to liraglutide fibrils or semaglutide fibrils.
31. A method for quantifying liraglutide fibrils or semaglutide fibrils, comprising the step of a) binding the antibody according to any one of the preceding embodiments to liraglutide fibrils or semaglutide fibrils. ..
32. b) The method according to any one of the preceding embodiments, further comprising the step of detecting an antibody bound to liraglutide fibrils or semaglutide fibrils.
33. c) The method according to any one of the preceding embodiments, further comprising the step of quantifying an antibody bound to liraglutide fibril or semaglutide fibril, optionally by use of the standard of the fibril.
34. The method according to any one of the preceding embodiments, wherein the fibril is in solution.
35. The method according to any one of the preceding embodiments, wherein the fibril is in a solution further comprising soluble liraglutide.
36. The method according to any one of the preceding embodiments, wherein the fibril is in a solution further free of liraglutide fibrils and optionally other peptides or proteins other than soluble liraglutide.
37. An antibody that binds to liraglutide fibrils, wherein the fibril is optionally prepared according to assay (I) herein, and the antibody is:
a. At least 10-fold higher levels of binding to liraglutide fibrils, such as at least 20-fold or at least 50-fold higher than the level of binding of the antibody to soluble liraglutide, and / or b. The detection limit for liraglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower, such as at least 100-fold or at least 1000-fold below the detection limit for liraglutide fibrils in the ThT assay, as determined arbitrarily according to the assay (VI) herein. An antibody having a detection limit.
38. An antibody that binds to semaglutide fibril, wherein the fibril is optionally prepared according to assay (II) herein and the antibody is:
c. At least 10-fold higher levels of binding to semaglutide fibrils, such as at least 20-fold or at least 50-fold higher than the level of binding of the antibody to soluble semaglutide, and / or d. It has a detection limit for semaglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower, such as at least 100-fold or at least 1000-fold below the detection limit for semaglutide fibrils in the ThT assay, the detection limit according to the assay (VI). An arbitrarily determined antibody.
39. The antibody according to embodiment 37 or 38, wherein the binding level is determined according to assay (IV) herein.
40. The antibody according to embodiment 37 or 38, wherein the binding level is determined according to assay (III) herein.
41. An antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the heavy chain of the antibody comprises the CDR3 sequence, and the CDR3 sequence is SEQ ID NO: 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, An antibody selected from the group consisting of 91, 97, 103, 115, and 121, or any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions.
42. An antibody that binds to rilaglutide fibrils, wherein the variable region of the heavy chain of the antibody comprises the CDR3 sequence, and the CDR3 sequence is SEQ ID NO: 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, An antibody selected from the group consisting of 91, 97, 103, or any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions.
43. An antibody that binds to liraglutide fibrils, wherein the variable region of the heavy chain of the antibody is
a. SEQ ID NOs: 37, 38, and 39,
b. SEQ ID NOs: 43, 44, and 45,
c. SEQ ID NOs: 49, 50, and 51,
d. SEQ ID NOs: 55, 56, and 57,
e. SEQ ID NOs: 61, 62, and 63,
f. SEQ ID NOs: 67, 68, and 69,
g. SEQ ID NOs: 73, 74, and 75,
h. SEQ ID NOs: 79, 80, and 81,
i. SEQ ID NOs: 85, 86, and 87,
j. SEQ ID NOs: 91, 92, and 93,
k. SEQ ID NOs: 97, 98, and 99,
l. SEQ ID NOs: 103, 104, and 105,
Or an antibody comprising a CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequence selected from the group consisting of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions.
44. An antibody that binds to liraglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is
a. SEQ ID NOs: 40, 41, and 42,
b. SEQ ID NOs: 46, 47, and 48,
c. SEQ ID NOs: 52, 53, and 54,
d. SEQ ID NOs: 58, 59, and 60,
e. SEQ ID NOs: 64, 65, and 66,
f. SEQ ID NOs: 70, 71, and 72,
g. SEQ ID NOs: 76, 77, and 78,
h. SEQ ID NOs: 82, 83, and 84,
i. SEQ ID NOs: 88, 89, and 90,
j. SEQ ID NOs: 94, 95, and 96,
k. SEQ ID NOs: 100, 101, and 102,
l. SEQ ID NOs: 106, 107, and 108,
Or an antibody comprising a CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequence selected from the group consisting of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions.
45. An antibody that binds to liraglutide fibrils and comprises a variable region of a heavy chain according to any one of the preceding embodiments and a variable region of a light chain according to any one of the preceding embodiments. ..
46. Antibodies that bind to rilaglutide fibrils, up to 20 such as SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, and 12, or up to 15 or up to 10. An antibody comprising a sequence selected from the group consisting of any of the sequences having an amino acid substitution, deletion, or insertion of.
47. Antibodies that bind to liraglutide fibrils and at least 90% of the sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 and 12. An antibody having at least 80% sequence identity, such as at least 95%.
48. The antibody according to any one of the preceding embodiments, wherein the antibody is an isolated antibody.
49. The antibody according to any one of the preceding embodiments, wherein the antibody is a single chain Fv fragment.
50. The antibody according to any one of the preceding embodiments, wherein the antibody comprises an Fc domain.
51. The antibody according to any one of the preceding embodiments, wherein the antibody is a single chain Fv fragment further comprising an Fc domain.
52. The antibody according to any one of the preceding embodiments, wherein the antibody specifically binds to the liraglutide fibril and / or semaglutide fibril.
53. The antibody according to any one of the preceding embodiments, wherein the antibody specifically binds to the liraglutide fibril.
54. The antibody according to any one of the preceding embodiments, wherein the antibody specifically binds to the semaglutide fibril.
55. Use of the antibody according to any one of the preceding embodiments for the identification of liraglutide fibrils or semaglutide fibrils.
56. The antibody according to any one of the preceding embodiments as an affinity ligand for removing fibril from (i) liraglutide fibrils and soluble liraglutide, or (ii) semaglutide fibrils and mixtures containing soluble semaglutide. use.
57. A method for identifying liraglutide fibrils or semaglutide fibrils, comprising the step of a) binding the antibody according to any one of the preceding embodiments to liraglutide fibrils or semaglutide fibrils.
58. A method for quantifying liraglutide fibrils or semaglutide fibrils, comprising the step of a) binding the antibody according to any one of the preceding embodiments to liraglutide fibrils or semaglutide fibrils. ..
59. b) The method according to any one of the preceding embodiments, further comprising the step of detecting an antibody bound to liraglutide fibrils or semaglutide fibrils.
60. c) The method according to any one of the preceding embodiments, further comprising the step of quantifying an antibody bound to liraglutide fibril or semaglutide fibril, optionally by use of the standard of the fibril.
61. The method according to any one of the preceding embodiments, wherein the fibril is in solution.
62. The method according to any one of the preceding embodiments, wherein the fibril is in a solution further comprising soluble liraglutide.
63. The method according to any one of the preceding embodiments, wherein the fibril is in a solution further free of liraglutide fibrils and optionally other peptides or proteins other than soluble liraglutide.
64. An antibody that binds to liraglutide fibrils, wherein the variable region of the heavy chain of the antibody is
m. SEQ ID NOs: 115, 116, and 117,
n. SEQ ID NOs: 121, 122, 123,
Or an antibody comprising a CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequence selected from the group consisting of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions.
65. An antibody that binds to liraglutide fibrils, wherein the variable region of the light chain of the antibody is
aa. SEQ ID NOs: 118, 119, and 120,
bb. SEQ ID NOs: 124, 125, and 126,
Or an antibody comprising a CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequence selected from the group consisting of any of the sequences having one, two, or three amino acid substitutions, deletions, or insertions.
66. An antibody that binds to liraglutide fibrils and comprises a variable region of a heavy chain according to any one of the preceding embodiments and a variable region of a light chain according to any one of the preceding embodiments. ..
67. Antibodies that bind to rilaglutide fibrils and selected from the group consisting of any of the sequences having up to 20 amino acid substitutions, deletions, or insertions, such as SEQ ID NOs: 109 and 110, or up to 15 or up to 10. An antibody, including the sequence to be.
68. An antibody that binds to liraglutide fibrils and has at least 80% sequence identity, such as at least 90% or at least 95%, to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 109 and 110.
69. Antibodies that bind to rilaglutide fibrils, such as SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 111, and 113, or up to 15 or up to 10. 37 to 68, comprising a variable light chain (VL) sequence selected from the group consisting of any of the sequences having up to 20 amino acid substitutions, deletions, or insertions. antibody.
70. Antibodies that bind to rilaglutide fibrils, such as SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 112, and 114, or up to 15 or up to 10. 37 to any one of embodiments 37-69, comprising a variable heavy chain (VH) sequence selected from the group consisting of any of the sequences having up to 20 amino acid substitutions, deletions, or insertions. antibody.
71. The antibody according to any one of embodiments 37 to 70, wherein the antibody is an isolated antibody.
72. The antibody according to any one of embodiments 37 to 71, wherein the antibody is a single chain Fv fragment.
73. The antibody according to any one of embodiments 37 to 72, wherein the antibody comprises an Fc domain.
74. The antibody according to any one of embodiments 37 to 73, wherein the antibody is a single chain Fv fragment further comprising an Fc domain.
75. The antibody according to any one of embodiments 37 to 74, wherein the antibody specifically binds to the liraglutide fibril and / or semaglutide fibril.
76. The antibody according to any one of embodiments 37 to 75, wherein the antibody specifically binds to the liraglutide fibril.
77. The antibody according to any one of embodiments 37 to 76, wherein the antibody specifically binds to the semaglutide fibril.
78. The fibril is optionally prepared according to assay (I) herein and the antibody is:
a. The binding level to liraglutide fibrils that is at least 10-fold higher than the binding level of the antibody to soluble liraglutide and is determined by assay (III) at a concentration of at least 25 μM liraglutide fibrils, and / or b. The detection limit of rilaglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower than the detection limit of rilaglutide fibrils in the ThT assay, which is determined according to the assay (VI) herein at a concentration of at least 1 μM rilaglutide fibrils. And / or c. The level of binding to liraglutide fibrils is at least 5-fold higher than the level of binding of the antibody to soluble liraglutide, the antibody has a monomer purity greater than 95%, and the binding level is at least 30 μM in concentration of liraglutide fibrils. Binding levels and / or d. The detection limit for rilaglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower than the detection limit for rilaglutide fibrils in the ThT assay, where the antibody has a monomer purity greater than 95% and the detection limit is at least 0.025 μM. The antibody according to any one of embodiments 37-77, which has a detection limit, determined according to the assay (VI-B) herein at a concentration of rilaglutide fibrils.
79. Any of embodiments 37-78, wherein the antibody can detect liraglutide fibrils at a fibril concentration of 1-1000 ppm in solution, such as 1-10 ppm fibrils, 10-100 ppm fibrils, or 100-1000 ppm fibrils. The antibody described in one.
80. 13. Antibodies.
81. The antibody according to any one of embodiments 37 to 80, wherein the antibody has a monomer purity of more than 95%.
82. Use of the antibody according to any one of embodiments 37-81 for the identification of liraglutide fibrils or semaglutide fibrils.
83. The antibody according to any one of embodiments 37-81 as an affinity ligand for removing fibril from (i) liraglutide fibrils and soluble liraglutide, or (ii) semaglutide fibrils and mixtures containing soluble semaglutide. Use of. 00
84. A method for identifying liraglutide fibrils or semaglutide fibrils, comprising the step of a) binding the antibody according to any one of embodiments 37-81 to liraglutide fibrils or semaglutide fibrils. ..
85. A method for quantifying liraglutide fibrils or semaglutide fibrils, comprising the step of a) binding the antibody according to any one of embodiments 37-81 to liraglutide fibrils or semaglutide fibrils. Method.
86. b) The method of embodiment 84 or 85, further comprising the step of detecting an antibody bound to liraglutide fibrils or semaglutide fibrils.
87. c) The method of any one of embodiments 84-86, further comprising the step of quantifying an antibody bound to liraglutide fibrils or semaglutide fibrils optionally by use of the standard of the fibrils.
88. The method according to any one of embodiments 84-87, wherein the fibril is in solution.
89. The method according to any one of embodiments 84-88, wherein the fibril is in a solution further comprising soluble liraglutide.
90. The method according to any one of embodiments 84-89, wherein the fibril is in a solution further free of liraglutide fibrils and optionally other peptides or proteins other than soluble liraglutide.
91. An assay for selectively detecting rilaglutide fibrils over soluble lylaglutide and / or monomeric lylaglutide, comprising the antibody according to any one of embodiments 37-81, wherein the antibody is 1-10 ppm fibrils. , Or an assay capable of detecting rilaglutide fibrils at a fibril concentration of 1 to 1000 ppm in a solution, such as 10 to 100 ppm fibril, or 100 to 1000 ppm fibrils.
略語リスト
・ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４を調整した、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４の水溶液）
・ＰＥＳ：ポリエーテルスルホン
・ｓｃＦｖ－Ｆｃ：Ｆｃドメインに連結した単鎖可変断片
・ＴｈＴ：チオフラビンＴ
Abbreviation list-PBS: Phosphate buffered saline (Aqueous solution of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 , 1.8 mM KH 2 PO 4 adjusted for pH 7.4)
-PES: Polyether sulfone-scFv-Fc: Single chain variable fragment linked to the Fc domain-ThT: Thioflavin T
材料および方法
選択された抗体バリアントの抗体ライブラリ調製、選別、およびクローニング
抗体を、ライブラリ選別の２つの段階を通して単離した。選別の第１の段階において、４Ｄ５ ｓｃＦｖの重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）の多様性によって、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）酵母表面ディスプレイライブラリを生成したｓｃＦｖを、可動性リンカーを介して酵母Ａｇａ２タンパク質のＣ末端に遺伝的に融合し、細胞表面上の抗体ディスプレイを可能にした。酵母ディスプレイ抗体ライブラリを、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ，１４２０３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に固定化されたリラグルチドフィブリル（および対照としての可溶性リラグルチド）への結合によって選別した。ビーズを調製するために、８×１０７個のビーズを最初に１ｍＬの滅菌ＰＢＳで洗浄（２×）した。可溶性リラグルチド（１００μｇ、薬物組成物緩衝液中６ｍｇ／ｍＬのストックから）を、磁気ビーズを含有するＰＢＳ中に希釈し（最終体積８００μＬ）、一晩ビーズに結合した（撹拌することなく４℃）。フィブリル状リラグルチドでコーティングされたビーズについては、１００μｇのリラグルチドフィブリルを、回転混合しながら室温で一晩、８００μＬのＰＢＳ中のビーズに結合した。翌日、１０ｍＭのグリシンを補充した１ｍＬのＰＢＳでビーズを洗浄（２×）して、ビーズ上の未反応のトルエンスルホニル基をクエンチし、次いで、１ｇ／ＬのＢＳＡ（ＰＢＳ－Ｂ）を補充した１ｍＬのＰＢＳを使用して洗浄（２×）した後、酵母とインキュベーションした。１％のミルクを補充したＰＢＳ－Ｂ中のリラグルチドフィブリルでコーティングしたビーズに対して、８回の正の選択を実施した。リラグルチドフィブリルに対する立体配座特異的抗体を有する酵母を単離するために、最後の３回の選別は、リラグルチドフィブリルに対する正の選択の前にＰＢＳ－Ｂ中の可溶性リラグルチドでコーティングされたビーズに対して実施した負の選択を組み込んだ。
Materials and Methods Antibody libraries for selected antibody variants Preparation, sorting, and cloning Antibodies were isolated through two steps of library sorting. In the first step of sorting, the diversity of the heavy chain CDR3 (HCDR3) of 4D5 scFv produced a single chain variable fragment (scFv) yeast surface display library of scFv via a mobile linker to C for the yeast Aga2 protein. It was genetically fused to the terminus, enabling antibody display on the cell surface. Yeast display antibody libraries were sorted by binding to liraglutide fibrils (and soluble liraglutide as a control) immobilized on magnetic beads (Dynabeads M-280 Tosyactiveated, 14203, Invitrogen). To prepare the beads, 8 × 10 7 beads were first washed (2 ×) with 1 mL of sterile PBS. Soluble liraglutide (100 μg, from 6 mg / mL stock in drug composition buffer) was diluted in PBS containing magnetic beads (final volume 800 μL) and bound to the beads overnight (4 ° C. without agitation). .. For beads coated with fibril-like liraglutide, 100 μg of liraglutide fibrils were attached to the beads in 800 μL PBS overnight at room temperature with rotational mixing. The next day, the beads were washed (2x) with 1 mL PBS supplemented with 10 mM glycine to quench the unreacted toluenesulfonyl groups on the beads and then supplemented with 1 g / L BSA (PBS-B). After washing (2x) with 1 mL of PBS, it was incubated with yeast. Eight positive selections were performed on the liraglutide fibril-coated beads in PBS-B supplemented with 1% milk. To isolate yeasts with conformation-specific antibodies to liraglutide fibrils, the final three selections were against soluble liraglutide-coated beads in PBS-B prior to positive selection for liraglutide fibrils. Incorporated the negative choices made in.
ライブラリ選別の第２の段階（親和性成熟）において、選別の第１の段階からの最良のクローンのうちの１つのために、サブライブラリを設計した。第二世代ライブラリは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ３、およびＨＣＤＲ２における部位を多様化した。このライブラリを、リラグルチドフィブリルに対して４回の選択に供した。最初の２回の選別は、固定化されたリラグルチドフィブリルに対する正の選択の前に、可溶性リラグルチド（磁気ビーズ上に固定化された）に対する２つの連続的な負の選択を組み込んだ。負の選択をＰＢＳ－Ｂ中で実施した一方で、正の選択を、１％のミルクを補充したＰＢＳ－Ｂ中で行った。また、グルカゴンフィブリルでコーティングされたビーズに対して、３回目および４回目で３連続の負の選択を実施した。グルカゴンフィブリルでコーティングされたビーズを、すでに記載されているように調製した（Ｓｔｉｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。 In the second stage of library selection (affinity maturation), a sublibrary was designed for one of the best clones from the first stage of selection. Second generation libraries have diversified sites in LCDR1, LCDR3, and HCDR2. This library was subjected to four selections for liraglutide fibrils. The first two rounds incorporated two consecutive negative selections for soluble liraglutide (immobilized on magnetic beads) prior to the positive selection for immobilized liraglutide fibrils. Negative selections were made in PBS-B, while positive selections were made in PBS-B supplemented with 1% milk. Also, 3 consecutive negative selections were performed on the beads coated with glucagon fibril at the 3rd and 4th times. Beads coated with glucagon fibril were prepared as previously described (Simple et al., 2019).
選択された抗体を、すでに記載されているように、哺乳類発現ベクター抗Ｎｏｔｃｈ１＿Ｅ６－ｐＢＩＯＣＡＭ５にクローニングした（Ｓｔｉｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。簡潔に述べると、挿入物および骨格プラスミドをＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、精製およびライゲーションした。サンガー配列決定によってｓｃＦｖコード断片の挿入を確認した。これらのプラスミドは、抗体のＣ末端上に６ｘＨｉｓタグおよび３ｘＦＬＡＧタグを有する二価ｓｃＦｖ－ヒトＦｃ融合タンパク質を発現する。 The selected antibody was cloned into the mammalian expression vector anti-Notch1_E6-pBIOCAM5 as previously described (Simple et al., 2019). Briefly, inserts and skeletal plasmids were digested with NcoI and NotI, purified and ligated. Insertion of the scFv code fragment was confirmed by Sanger sequencing. These plasmids express a divalent scFv-human Fc fusion protein with a 6xHis tag and a 3xFLAG tag on the C-terminus of the antibody.
抗体発現および精製
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現系（カタログ番号Ａ１４６３５）でタンパク質を発現した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、細胞が１ｍＬ当たり約３～５百万個の生細胞密度に達するまで継代培養および増殖した。プラスミド（３０μｇ）を２５ｍＬのＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクションした。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３およびプラスミドＤＮＡの複合体を、製造業者のガイダンスに記載されるように調製した。簡潔に述べると、プラスミドＤＮＡおよびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ試薬をＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地で希釈し、穏やかなピペット操作を介して混合した。５分間のインキュベーション後、希釈されたトランスフェクション試薬を希釈されたＤＮＡと混合した。トランスフェクション試薬およびＤＮＡの複合体を、室温で２０分間インキュベーションし、Ｅｘｐｉ２９３細胞に添加した。細胞を、振盪しながら３７℃および５％ ＣＯ２でインキュベーションした。製造業者の指示に従って、エンハンサー１および２溶液を（トランスフェクション後）２０時間後に細胞に添加した。３日後、分泌抗体を含有する培地を採取し、３４００×ｇで４５分間遠心分離して、細胞および関連残屑を除去した。
Antibody expression and purification The protein was expressed in the Expi293F expression system (Cat. No. A14635). Expi293F cells were subcultured and proliferated until the cells reached a density of approximately 3-5 million live cells per mL. The plasmid (30 μg) was transfected into 25 mL of Expi293 cells. Complexes of ExpiFectamine 293 and plasmid DNA were prepared as described in the manufacturer's guidance. Briefly, plasmid DNA and ExpiFectamine reagent were diluted with Opti-MEM medium and mixed via gentle pipette operation. After 5 minutes of incubation, the diluted transfection reagent was mixed with the diluted DNA. The transfection reagent and DNA complex was incubated at room temperature for 20 minutes and added to Expi293 cells. The cells were incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 with shaking. According to the manufacturer's instructions,
プロテインＡクロマトグラフィーを使用して抗体を精製した。プロテインＡビーズ（２０３３４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳで洗浄し、グリシン緩衝液（ｐＨ２．５）と２０分間インキュベーションした。次に、ビーズをＰＢＳで洗浄し、次いで０．５ｍＬのビーズを３０ｍＬの浄化培地に添加し、４℃で一晩インキュベーションした。翌日、プロテインＡビーズを有する培地を１０ｍＬの精製カラム（８９８９８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加した。真空濾過を介してビーズを収集し、ＰＢＳ（１００ｍＬ）で十分に洗浄した。次いで、タンパク質Ａビーズを、２ｍＬの０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）で１５分間インキュベーションし、緩衝液（溶出タンパク質を含む）を遠心分離によって収集した。次いで、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ（８９８９１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、溶出抗体をＰＢＳに緩衝液交換した。２８０ｎｍでの吸光度測定を介してタンパク質濃度をアッセイした（１６８，４６０～２０５，３６０Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数）。 Antibodies were purified using protein A chromatography. Protein A beads (20334, Thermo Fisher Scientific) were washed with PBS and incubated with glycine buffer (pH 2.5) for 20 minutes. The beads were then washed with PBS, then 0.5 mL of beads were added to 30 mL of purified medium and incubated overnight at 4 ° C. The next day, medium with protein A beads was added to a 10 mL purified column (89898, Thermo Fisher Scientific). Beads were collected via vacuum filtration and washed thoroughly with PBS (100 mL). Protein A beads were then incubated with 2 mL of 0.1 M glycine buffer (pH 3.0) for 15 minutes and the buffer (including eluent protein) was collected by centrifugation. The eluted antibody was then buffer exchanged with PBS using Zeba Spin Desalting Colors (89891, Thermo Fisher Scientific). Protein concentrations were assayed via absorbance measurements at 280 nm (extinction coefficient of 168,460-205,360M -1 cm -1 ).
サイズ排除クロマトグラフィー
分析および分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）実験を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用して実施した。泳動緩衝液は、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭのカリウムナトリウム、１０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム、１．８ｍＭのリン酸二水素カリウム、および２００ｍＭのアルギニンであった。カラム流速は、０．７５ｍＬ／分であった。抗体試料（０．１ｍｇ／ｍＬ）を、カラム（ＧＥ ２８９９０９４４、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム、内径１０ｍｍ、長さ３００ｍｍ）に注入（１００μＬ）し、２２０および２８０ｎｍで吸光度シグナルをモニタリングした。分取ＳＥＣについては、ＦＲＣ－１０Ａ画分収集器を使用してモノマー画分を単離した。
Size Exclusion Chromatography Analysis and Preparative Size Exclusion Chromatography (SEC) experiments were performed using the Shimadzu Prominence HPLC System. The migration buffer was 137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium sodium, 10 mM disodium hydrogen phosphate, 1.8 mM potassium dihydrogen phosphate, and 200 mM arginine. The column flow rate was 0.75 mL / min. Antibody samples (0.1 mg / mL) were injected (100 μL) into a column (GE 28990944, Superdex 200
アッセイ（Ｉ）：リラグルチドフィブリルの調製
６ｍｇ／ｍＬのリラグルチドの試験溶液を、薬物組成物緩衝液（１４．０ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸水素二ナトリウム二水和物）中で調製し、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用して最終ｐＨを８．１５に調整し、続いて、シリンジ濾過（０．２２μｍのＰＥＳフィルター）した。１ｍＬのリラグルチド溶液のアリコートを、マイクロ遠心管に分配し、単一の３ｍｍガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｚ２６５９２６）を各管に添加し、管を１５～２０日間３００ｒｐｍで軌道振盪しながら、３７℃のサーモミキサー内でインキュベーションした。
Assay (I): Preparation of Rilaglutide fibrils 6 mg / mL test solution of Rilaglutide, drug composition buffer (14.0 mg / mL propylene glycol, 5.5 mg / mL phenol, 1.42 mg / mL phosphate) Prepared in disodium hydrogen dihydrate) and adjusted to a final pH of 8.15 using NaOH and / or HCl as needed, followed by syringe filtration (0.22 μm PES filter). .. An aliquot of 1 mL of liraglutide solution was dispensed into a microcentrifuge tube, a single 3 mm glass bead (Sigma Z265926) was added to each tube, and the tube was orbitally shaken at 300 rpm for 15-20 days at a 37 ° C. thermomixer. Incubated in.
陽性のＴｈＴシグナルを使用して、管からの試験溶液の少量の試料（約７５μＬ）を除去することによって、フィブリル形成をモニタリングし、これを本明細書に記載されるアッセイ（Ｖ）（ＴｈＴアッセイ）に従って分析した。試料が、本明細書のアッセイ（Ｖ）（ＴｈＴアッセイ）において新たに調製された試験溶液よりも少なくとも５倍高い蛍光を示した場合、フィブリルを２２１，０００×ｇ（１時間、４℃）で沈殿させた。フィブリル、例えば、ゲル状フィブリルが、管の底部で観察された。上清を管から除去した（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）による分析のために上清を保持）。ペレットを、ｐＨ８．１５の薬物組成物緩衝液で１回穏やかに洗浄し（ペレットを乱すことなく）、次いで、元の体積のｐＨ８．１５の薬物組成物緩衝液中に再懸濁し（ＴｈＴ分析のために除去されたいかなる体積も考慮に入れて）、４℃で保存した。フィブリルの濃度を、本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）に従って決定した。この計算が正確であるためには、遠心分離後にフィブリルペレットを全く同じ総体積で再懸濁することが重要である。 Fibril formation is monitored by removing a small sample (about 75 μL) of test solution from the tube using a positive ThT signal, which is described herein as an assay (V) (ThT assay). ) Was analyzed. If the sample exhibits at least 5-fold higher fluorescence than the newly prepared test solution in the assay (V) (ThT assay) herein, the fibril is at 221,000 xg (1 hour, 4 ° C.). Precipitated. Fibrils, such as gelled fibrils, were observed at the bottom of the tube. The supernatant was removed from the tube (retaining the supernatant for analysis by the assay (VII) (BCA assay) herein). The pellet was gently washed once with pH 8.15 drug composition buffer (without disturbing the pellet) and then resuspended in the original volume of pH 8.15 drug composition buffer (ThT analysis). Stored at 4 ° C. (taking into account any volume removed for). Fibril concentrations were determined according to the assay (VII) herein. For this calculation to be accurate, it is important to resuspend the fibril pellets in exactly the same total volume after centrifugation.
アッセイ（ＩＩ）：セマグルチドフィブリルの調製
ｐＨ６．９に調整された（必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用して）、任意に５０ｍＭのＮａＣｌを含む６ｍｇ／ｍＬのセマグルチド、および薬物組成物緩衝液（１４．０ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸水素二ナトリウム二水和物）の試験溶液を、マイクロ遠心管に１ｍＬのアリコートで入れ、単一の３ｍｍのガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｚ２６５９２６）を各管に添加し、管を１５～２０日間３００ｒｐｍで軌道振盪しながら、３７℃のサーモミキサー内でインキュベーションした。
Assay (II): Preparation of semaglutide fibrils 6 mg / mL semaglutide adjusted to pH 6.9 (using NaOH and / or HCl as needed), optionally with 50 mM NaCl, and drug composition. A test solution of a substance buffer (14.0 mg / mL propylene glycol, 5.5 mg / mL phenol, 1.42 mg / mL disodium hydrogen phosphate dihydrate) was placed in a microcentrifuge tube with 1 mL aliquot. A single 3 mm glass bead (Sigma Z265926) was added to each tube and the tube was incubated in a thermomixer at 37 ° C. for 15-20 days with orbital shaking at 300 rpm.
陽性のＴｈＴシグナルを使用して、管からの試験溶液の少量の試料（約７５μＬ）を除去することによって、フィブリル形成をモニタリングし、これを本明細書に記載されるアッセイ（Ｖ）（ＴｈＴアッセイ）に従って分析した。試料が、アッセイ（Ｖ）（ＴｈＴアッセイ）において、ｐＨ６．９の薬物組成物緩衝液中の新たに調製されたセマグルチドよりも少なくとも５倍高い蛍光を示した場合、フィブリルを２２１，０００×ｇ（１時間、４℃）で沈殿させた。フィブリル、例えば、ゲル状フィブリルが、管の底部で観察された。上清を管から除去した（アッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）による分析のために上清を保持）。ペレットを、ｐＨ６．９の薬物組成物緩衝液で１回穏やかに洗浄し（ペレットを乱すことなく）、次いで、元の体積のｐＨ６．９の薬物組成物緩衝液中に再懸濁し（ＴｈＴ分析のために除去されたいかなる体積も考慮に入れて）、４℃で保存した。フィブリルの濃度を、本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）に従って決定した。この計算が正確であるためには、遠心分離後にフィブリルペレットを全く同じ総体積で再懸濁することが重要である。 Fibril formation is monitored by removing a small sample (about 75 μL) of test solution from the tube using a positive ThT signal, which is described herein as an assay (V) (ThT assay). ) Was analyzed. If the sample fluoresces at least 5-fold higher than the freshly prepared semaglutide in the pH 6.9 drug composition buffer in the assay (V) (ThT assay), the fibril is 221,000 xg (th). It was precipitated at 4 ° C. for 1 hour). Fibrils, such as gelled fibrils, were observed at the bottom of the tube. The supernatant was removed from the tube (retaining the supernatant for analysis by Assay (VII) (BCA Assay)). The pellet was gently washed once with pH 6.9 drug composition buffer (without disturbing the pellet) and then resuspended in the original volume of pH 6.9 drug composition buffer (ThT analysis). Stored at 4 ° C. (taking into account any volume removed for). Fibril concentrations were determined according to the assay (VII) herein. For this calculation to be accurate, it is important to resuspend the fibril pellets in exactly the same total volume after centrifugation.
アッセイ（ＩＩＩ）：抗体特異性比（方法１）
抗体特異性比を以下のように決定した：
１．ＥＬＩＳＡプレート調製（３プレート）：
ａ．フィブリルコーティングされたＥＬＩＳＡプレートの場合：本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って調製されたリラグルチドフィブリルを、薬物組成物緩衝液中に再懸濁し（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）によって決定されるフィブリル濃度を有する）、約３００μＬの試料をマイクロ遠心管中、氷上で超音波処理した（１００％振幅で１０秒オン／３０秒オフの３サイクル、ＦＢ－１２０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を得た。溶液を、ＰＢＳ中で２５μＭのリラグルチドフィブリルに希釈し、９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（製品番号：４３９４５４）の各ウェルに１００μＬの試料を分配した。
ｂ．可溶性リラグルチドコーティングプレートの場合：６ｍｇ／ｍＬのリラグルチドを、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用してｐＨを８．１５に調整した、薬物組成物緩衝液（１４ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物）中で可溶化し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して溶液を濾過した。溶液を、ＰＢＳ中で２５μＭのリラグルチドに希釈し、９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（製品番号：４３９４５４）の各ウェルに１００μＬの試料を分配した。
ｉ．「バックグラウンド」プレートの場合：９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（製品番号：４３９４５４）の各ウェルに１００μＬのＰＢＳを分配した。
２．プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、４℃で一晩インキュベーションした。
３．翌日、各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
４．各ウェルに０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１０ｇ／ＬのＢＳＡを補充した３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートをブロッキングした。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で３時間インキュベーションした。
５．プレートがブロッキングされている間、抗体試料を、遠心分離機において２１，０００×ｇで５分間スピンさせ、２８０ｎｍでの吸光度によって上清の濃度を測定した。各抗体を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１ｇ／ＬのＢＳＡを補充したＰＢＳ中で５ｎＭに段階希釈した。
６．各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した
７．１００μＬの抗体溶液を各ウェルに分配した。各抗体を、２つ組（すなわち、１プレート当たり各抗体に対して２ウェル）で試験した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。
８．二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ ＨＲＰコンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１８８１７、ストック濃度：５０％グリセロール中０．５ｍｇ／ｍＬ）１：１０００を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１０ｇ／ＬのＢＳＡを補充したＰＢＳ中に希釈することによって、二次抗体溶液を調製した。
９．各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
１０．１００μＬの二次抗体溶液を各ウェルに分配した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。二次抗体インキュベーション中、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ－ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４２０８）を冷蔵庫から取り出して、溶液を室温に平衡化し、２Ｍ（４Ｎ）Ｈ２ＳＯ４を調製した。
１１．各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
１２．１００μＬのＵｌｔｒａ－ＴＭＢを各ウェルに添加し、黄色生成物が形成されるまでインキュベーションした（５～１０分）。
１３．１００μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって、反応をクエンチした。
１４．各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ）において４５０ｎｍで読み取った。
計算：ＥＬＩＳＡシグナル（４５０ｎｍでの吸光度）の比を、フィブリルコーティングプレートに対する各抗体と、可溶性リラグルチドコーティングプレートおよびバックグラウンドプレートに対するそのシグナルについて計算した。これらの比は、本明細書に報告されるフィブリル／可溶性比およびフィブリル／バックグラウンド比である。例えば、抗体が、リラグルチドフィブリルについて１．５、可溶性リラグルチドについて０．０５、およびバックグラウンドプレートについて０．１のシグナルをもたらした場合、フィブリル／可溶性比は、１．５／０．０５＝３０であり、フィブリル／バックグラウンド比は、１．５／０．１＝１５である。
Assay (III): Antibody specificity ratio (Method 1)
The antibody specificity ratio was determined as follows:
1. 1. ELISA plate preparation (3 plates):
a. For fibril-coated ELISA plates: Rilaglutide fibrils prepared according to assay (I) herein are resuspended in a drug composition buffer (determined by assay (VII) (BCA assay) herein). Approximately 300 μL of sample (with fibril concentration) was ultrasonically treated on ice in a microcentrifuge tube (3 cycles of 10 seconds on / 30 seconds off at 100% amplitude, FB-120 Sonic Dismembrator, Thermo Assay). Got The solution was diluted to 25 μM liraglutide fibrils in PBS and 100 μL of sample was dispensed to each well of a 96-well Nunc MaxiSorp ELISA plate (Product No .: 349454).
b. For soluble lylaglutide coated plates: 6 mg / mL lylaglutide, pH adjusted to 8.15 with NaOH and / or HCl as needed, drug composition buffer (14 mg / mL propylene glycol, 5). Solubilized in .5 mg / mL phenol, 1.42 mg / mL disodium phosphate dihydrate) and filtered through a 0.22 μm PES filter. The solution was diluted to 25 μM liraglutide in PBS and 100 μL of sample was dispensed to each well of a 96-well Nunc MaxiSorp ELISA plate (Product No .: 349454).
i. For "background" plates: 100 μL PBS was dispensed into each well of a 96-well Nunc MaxiSorp ELISA plate (Product No .: 349454).
2. 2. The plates were covered with adhesive film, wrapped in aluminum foil and incubated overnight at 4 ° C.
3. 3. The next day, the plates were washed 3 times by adding 300 μL PBS to each well.
4. Plates were blocked by adding 300 μL PBS supplemented with 0.1
5. While the plate was blocked, the antibody sample was spun in a centrifuge at 21,000 xg for 5 minutes and the concentration of the supernatant was measured by absorbance at 280 nm. Each antibody was serially diluted to 5 nM in PBS supplemented with 0.1
6. By adding 300 μL PBS to each well, 7.100 μL antibody solution was dispensed from each well with the plates washed 3 times. Each antibody was tested in pairs (ie, 2 wells for each antibody per plate). The plate was then covered with an adhesive film, wrapped in aluminum foil and incubated at room temperature for 1 hour.
8. PBS supplemented with secondary antibody (goat anti-human IgG-Fc HRP conjugate, Invitrogen A18817, stock concentration: 0.5 mg / mL in 50% glycerol) 1: 1000, 0.1
9. Plates were washed 3 times by adding 300 μL PBS to each well.
10. 100 μL of secondary antibody solution was dispensed into each well. The plate was then covered with an adhesive film, wrapped in aluminum foil and incubated at room temperature for 1 hour. During the secondary antibody incubation, the 1-Step Ultra-TMB ELISA substrate (Thermo Fisher Scientific, 34208) was removed from the refrigerator and the solution was equilibrated to room temperature to prepare 2M (4N) H2SO4.
11. Plates were washed 3 times by adding 300 μL PBS to each well.
12. 100 μL of Ultra-TMB was added to each well and incubated until a yellow product was formed (5-10 minutes).
The reaction was quenched by the addition of 13.100 μL of 2MH 2 SO 4 .
14. The absorbance of each well was read at 450 nm on a microplate reader (BioTek Synergy Neo).
Calculation: The ratio of the ELISA signal (absorbance at 450 nm) was calculated for each antibody to the fibril coated plate and its signal to the soluble liraglutide coated plate and background plate. These ratios are the fibril / soluble ratio and the fibril / background ratio reported herein. For example, if the antibody yields a signal of 1.5 for liraglutide fibrils, 0.05 for soluble liraglutide, and 0.1 for background plates, the fibril / solubility ratio is 1.5 / 0.05 = 30. Yes, the fibril / background ratio is 1.5 / 0.1 = 15.
アッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）：抗体特異性比（方法１Ｂ）
１．アッセイの前夜：ＢＳＡをＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬで可溶化し、次いで、３０ｃｃのルアーロックシリンジを用いて０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して滅菌し、１５０μＬの溶液をＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（製品番号：４３９４５４）９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに分配した。プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、４℃で一晩インキュベーションした。
２．ＥＬＩＳＡプレート（ＢＳＡでコーティング）を冷蔵庫から除去し、ウェルを３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。
ａ．フィブリルコーティングされたＥＬＩＳＡプレートの場合：本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って調製されたリラグルチドフィブリルを、薬物組成物緩衝液中に再懸濁し（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）によって決定されるフィブリル濃度を有する）、約３００μＬの試料をマイクロ遠心管中、氷上で超音波処理した（１００％振幅で１０秒オン／３０秒オフの３サイクル、ＦＢ－１２０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を得た。溶液を、ＰＢＳ中で１０μＭのリラグルチドフィブリルに希釈し、各ウェルに１００μＬの試料を分配した。
ｂ．可溶性リラグルチドコーティングプレートの場合：６ｍｇ／ｍＬのリラグルチドを、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用してｐＨを８．１５に調整した、薬物組成物緩衝液（１４ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物）中で可溶化し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して溶液を濾過した。溶液を、ＰＢＳ中で１０μＭのリラグルチドに希釈し、各ウェルに１００μＬの試料を分配した
ｉ．「バックグラウンド」プレートの場合：９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（製品番号：４３９４５４）の各ウェルに１００μＬのＰＢＳを分配した。
３．プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で３時間、撹拌することなくインキュベーションした。
４．この３時間の間、抗体試料を、遠心分離機において２１，０００×ｇで５分間スピンさせ、２８０ｎｍでの吸光度によって上清の濃度を測定した。各抗体を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１ｇ／ＬのＢＳＡを補充したＰＢＳ中で５ｎＭに段階希釈した（濃度の別段の定めがない限り）。
５．各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
６．１００μＬの抗体溶液を各ウェルに分配した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。
７．二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ ＨＲＰコンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１８８１７、ストック濃度：５０％グリセロール中０．５ｍｇ／ｍＬ）１：１０００を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１０ｇ／ＬのＢＳＡを補充したＰＢＳ中に希釈することによって、二次抗体溶液を調製した。
８．各ウェルに３００μＬのＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ）を添加することによって、プレートを３回洗浄した。
９．１００μＬの二次抗体溶液を各ウェルに分配した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。二次抗体インキュベーション中、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ－ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４２０８）を冷蔵庫から取り出して、溶液を室温に平衡化し、２Ｍ（４Ｎ）Ｈ２ＳＯ４を調製した。
１０．各ウェルに３００μＬのＰＢＳＴを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
１１．１００μＬのＵｌｔｒａ－ＴＭＢを各ウェルに添加し、黄色生成物が形成されるまでインキュベーションした（５～１０分）。
１２．１００μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって、反応をクエンチした。
１３．各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ）において４５０ｎｍで読み取った。
計算：ＥＬＩＳＡシグナル（４５０ｎｍでの吸光度）の比を、フィブリルコーティングプレートに対する各抗体と、可溶性リラグルチドコーティングプレートおよびバックグラウンドプレートに対するそのシグナルについて計算した。これらの比は、本明細書に報告されるフィブリル／可溶性比およびフィブリル／バックグラウンド比である。例えば、抗体が、リラグルチドフィブリルについて１．５、可溶性リラグルチドについて０．０５、およびバックグラウンドプレートについて０．１のシグナルをもたらした場合、フィブリル／可溶性比は、１．５／０．０５＝３０であり、フィブリル／バックグラウンド比は、１．５／０．１＝１５である。
Assay (III-B): Antibody specificity ratio (Method 1B)
1. 1. Eve of assay: BSA is solubilized in PBS at 1 mg / mL, then sterilized using a 30 cc luer lock syringe through a 0.22 μm PES filter and 150 μL of solution in 96 wells of Nunc MaxiSorp (Product No .: 439454). Distributed to each well of the ELISA plate. The plates were covered with adhesive film, wrapped in aluminum foil and incubated overnight at 4 ° C.
2. 2. The ELISA plate (coated with BSA) was removed from the refrigerator and the wells were washed 3 times with 300 μL PBS.
a. For fibril-coated ELISA plates: Rilaglutide fibrils prepared according to assay (I) herein are resuspended in a drug composition buffer (determined by assay (VII) (BCA assay) herein). Approximately 300 μL of sample (with fibril concentration) was ultrasonically treated on ice in a microcentrifuge tube (3 cycles of 10 seconds on / 30 seconds off at 100% amplitude, FB-120 Sonic Dismembrator, Thermo Assay). Got The solution was diluted in 10 μM liraglutide fibrils in PBS and 100 μL of sample was dispensed into each well.
b. For soluble lylaglutide coated plates: 6 mg / mL lylaglutide, pH adjusted to 8.15 with NaOH and / or HCl as needed, drug composition buffer (14 mg / mL propylene glycol, 5). Solubilized in .5 mg / mL phenol, 1.42 mg / mL disodium phosphate dihydrate) and filtered through a 0.22 μm PES filter. The solution was diluted to 10 μM liraglutide in PBS and 100 μL of sample was dispensed into each well i. For "background" plates: 100 μL PBS was dispensed into each well of a 96-well Nunc MaxiSorp ELISA plate (Product No .: 349454).
3. 3. The plates were covered with adhesive film, wrapped in aluminum foil and incubated at room temperature for 3 hours without stirring.
4. For these 3 hours, the antibody sample was spun in a centrifuge at 21,000 xg for 5 minutes and the concentration of the supernatant was measured by absorbance at 280 nm. Each antibody was serially diluted to 5 nM in PBS supplemented with 0.1
5. Plates were washed 3 times by adding 300 μL PBS to each well.
6. 100 μL of antibody solution was dispensed into each well. The plate was then covered with an adhesive film, wrapped in aluminum foil and incubated at room temperature for 1 hour.
7. PBS supplemented with secondary antibody (goat anti-human IgG-Fc HRP conjugate, Invitrogen A18817, stock concentration: 0.5 mg / mL in 50% glycerol) 1: 1000, 0.1
8. Plates were washed 3 times by adding 300 μL PBST (PBS supplemented with 0.1% Tween 20) to each well.
9. 100 μL of secondary antibody solution was dispensed into each well. The plate was then covered with an adhesive film, wrapped in aluminum foil and incubated at room temperature for 1 hour. During the secondary antibody incubation, the 1-Step Ultra-TMB ELISA substrate (Thermo Fisher Scientific, 34208) was removed from the refrigerator and the solution was equilibrated to room temperature to prepare 2M (4N) H 2 SO 4 .
10. Plates were washed 3 times by adding 300 μL PBST to each well.
11. 100 μL Ultra-TMB was added to each well and incubated until a yellow product was formed (5-10 minutes).
The reaction was quenched by the addition of 12.100 μL of 2MH 2 SO 4 .
13. The absorbance of each well was read at 450 nm on a microplate reader (BioTek Synergy Neo).
Calculation: The ratio of the ELISA signal (absorbance at 450 nm) was calculated for each antibody to the fibril coated plate and its signal to the soluble liraglutide coated plate and background plate. These ratios are the fibril / soluble ratio and the fibril / background ratio reported herein. For example, if the antibody yields a signal of 1.5 for liraglutide fibrils, 0.05 for soluble liraglutide, and 0.1 for background plates, the fibril / solubility ratio is 1.5 / 0.05 = 30. Yes, the fibril / background ratio is 1.5 / 0.1 = 15.
アッセイ（ＩＶ）：抗体特異性比（方法２）
抗体特異性比を以下のように決定した：
アッセイの前夜：ＢＳＡをＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬで可溶化し、次いで、３０ｃｃのルアーロックシリンジを用いて０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して滅菌し、１５０μＬの溶液をＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（製品番号：４３９４５４）９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに分配した。プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、４℃で一晩インキュベーションした。
Assay (IV): Antibody specificity ratio (Method 2)
The antibody specificity ratio was determined as follows:
Eve of assay: BSA is solubilized in PBS at 1 mg / mL, then sterilized using a 30 cc luer lock syringe through a 0.22 μm PES filter and 150 μL of solution in 96 wells of Nunc MaxiSorp (Product No .: 439454). Distributed to each well of the ELISA plate. The plates were covered with adhesive film, wrapped in aluminum foil and incubated overnight at 4 ° C.
アッセイの日：
１．リラグルチドを、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用してｐＨを８．１５に調整した、薬物組成物緩衝液（１４ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物）中、６０ｍｇ／ｍＬで可溶化し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過した。溶液をＰＢＳ中、６ｍｇ／ｍＬ（１６００μＭ）のリラグルチドに希釈した。この溶液を、「可溶性リラグルチド溶液」と称する。
２．本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って得て、約３００μＬの試料中でｐＨ８．１５の薬物組成物緩衝液中に再懸濁した（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）によって決定されるフィブリル濃度を有する）リラグルチドフィブリル（以下、フィブリル）を、マイクロ遠心管中、氷上で超音波処理した（１００％振幅で１０秒オン／３０秒オフの３サイクル、ＦＢ－１２０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を得た。この溶液を、「フィブリル溶液」と称する。
３．フィブリルの最終濃度が１００μＭになるように、超音波処理されたフィブリル溶液を可溶性リラグルチド溶液中に希釈した。次いで、溶液を、０．１μＭのフィブリルの結果として生じる試料まで、可溶性リラグルチド溶液中にさらに段階希釈した。２つの対照：ｉ）ＰＢＳ（ペプチドなし）、およびｉｉ）フィブリルなし（可溶性リラグルチド溶液のみ）を使用した。
４．ＥＬＩＳＡプレート（ＢＳＡでコーティング）を冷蔵庫から除去し、ウェルを３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。
５．上記の（３）からの１００μＬの各試料または対照を、新たに洗浄されたプレートのウェルに分配し、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で３時間撹拌することなくインキュベーションした。
６．上記の３時間のインキュベーション中、試験される約７５μＬの抗体（例えば、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質）を２１，０００×ｇで５分間スピンさせて、いかなる粒子状物質も沈殿させた。上清を除去し、この上清のＡ２８０ｎｍを決定して抗体の濃度を計算した。抗体を、ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０＋１ｇ／ＬのＢＳＡ中、５ｎＭに段階希釈し、使用するまで氷上で保持した。
７．３時間のインキュベーションの終了時に、プレートのウェルを３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。
８．１００μＬの５ｎＭ抗体を各ウェルに添加した。プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。
９．上記の１時間のインキュベーション中、二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ ＨＲＰコンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１８８１７、ストック濃度：５０％グリセロール中０．５ｍｇ／ｍＬ）を、ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０＋１０ｇ／ＬのＢＳＡ中１：１０００に希釈した。
１０．１時間のインキュベーションの終了時に、ウェルを３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。
１１．１００μＬの二次抗体溶液を各ウェルに添加した。プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。
１２．二次抗体インキュベーション中、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ－ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４２０８）を冷蔵庫から取り出して、溶液を室温に平衡化した。２Ｍ（４Ｎ）Ｈ２ＳＯ４を調製した。
１３．１時間のインキュベーションの終了時に、ウェルを３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。
１４．１００μＬのＵｌｔｒａ－ＴＭＢを各ウェルに添加し、１０分間インキュベーションした。
１５．１００μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって、反応をクエンチした。
１６．４５０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ）において読み取った。
計算：フィブリルを含むウェル内の各抗体についてのＥＬＩＳＡシグナルを、可溶性リラグルチドを有し、かつフィブリルがない対照ウェル中の同じ抗体についてのＥＬＩＳＡシグナルで割った。この比は、混合物／可溶性特異性比である。例えば、所与の抗体が、可溶性リラグルチドとの混合物中０．１μＭのリラグルチドフィブリルについて１．５のシグナル、および可溶性リラグルチド（フィブリルを欠く）について０．０５のシグナルをもたらした場合、混合物／可溶性特異性比は、１．５／０．０５＝３０である。
Assay day:
1. 1. Rilaglutide, pH adjusted to 8.15 using NaOH and / or HCl as needed, drug composition buffer (14 mg / mL propylene glycol, 5.5 mg / mL phenol, 1.42 mg /). It was solubilized at 60 mg / mL in mL disodium phosphate dihydrate) and filtered through a 0.22 μm PES filter. The solution was diluted to 6 mg / mL (1600 μM) liraglutide in PBS. This solution is referred to as a "soluble liraglutide solution".
2. 2. Obtained according to assay (I) herein and resuspended in approximately 300 μL of sample in pH 8.15 drug composition buffer (determined by assay (VII) (BCA assay) herein). Rilaglutide fibrils (hereinafter referred to as fibrils) having a fibril concentration were ultrasonically treated on ice in a microcentrifuge tube (3 cycles of 10 seconds on / 30 seconds off at 100% amplitude, FB-120 Sonic Dismembrator, Thermo Sample Assay). ) Was obtained. This solution is referred to as a "fibril solution".
3. 3. The sonicated fibril solution was diluted in a soluble liraglutide solution so that the final concentration of fibril was 100 μM. The solution was then further serially diluted in soluble liraglutide solution to the resulting sample of 0.1 μM fibril. Two controls: i) PBS (without peptide) and ii) without fibril (soluble liraglutide solution only) were used.
4. The ELISA plate (coated with BSA) was removed from the refrigerator and the wells were washed 3 times with 300 μL PBS.
5. Each 100 μL sample or control from (3) above was dispensed into the wells of a freshly washed plate, the plate covered with adhesive film, wrapped in aluminum foil and incubated at room temperature for 3 hours without stirring.
6. During the above 3 hour incubation, about 75 μL of the antibody being tested (eg, scFv-Fc fusion protein) was spun at 21,000 × g for 5 minutes to precipitate any particulate matter. The supernatant was removed, the A280 nm of the supernatant was determined and the antibody concentration was calculated. Antibodies were serially diluted to 5 nM in PBS + 0.1
At the end of the 7.3 hour incubation, the wells of the plates were washed 3 times with 300 μL PBS.
8. 100 μL of 5 nM antibody was added to each well. The plates were covered with adhesive film, wrapped in aluminum foil and incubated at room temperature for 1 hour.
9. During the above 1 hour incubation, secondary antibody (goat anti-human IgG-Fc HRP conjugate, Invitrogen A18817, stock concentration: 0.5 mg / mL in 50% glycerol) was added to PBS + 0.1
At the end of the 10.1 hour incubation, the wells were washed 3 times with 300 μL PBS.
11. 100 μL of secondary antibody solution was added to each well. The plates were covered with adhesive film, wrapped in aluminum foil and incubated at room temperature for 1 hour.
12. During the secondary antibody incubation, the 1-Step Ultra-TMB ELISA substrate (Thermo Fisher Scientific, 34208) was removed from the refrigerator and the solution was equilibrated to room temperature. 2M (4N) H 2 SO 4 was prepared.
At the end of the 13.1 hour incubation, the wells were washed 3 times with 300 μL PBS.
14. 100 μL Ultra-TMB was added to each well and incubated for 10 minutes.
The reaction was quenched by the addition of 15.100 μL of 2MH 2 SO 4 .
Absorbance at 16.450 nm was read on a microplate reader (BioTek Synergy Neo).
Calculation: The ELISA signal for each antibody in a well containing fibril was divided by the ELISA signal for the same antibody in a control well with soluble liraglutide and no fibril. This ratio is a mixture / soluble specificity ratio. For example, if a given antibody yields a signal of 1.5 for 0.1 μM liraglutide fibrils and a signal of 0.05 for soluble liraglutide (lacking fibrils) in a mixture with soluble liraglutide, the mixture / soluble specificity. The sex ratio is 1.5 / 0.05 = 30.
アッセイ（Ｖ）：ＴｈＴアッセイ
ペプチドの試験溶液を、フィブリル形成直後のフィブリルの存在について分析した。フィブリル形成前のペプチド濃度は、６ｍｇ／ｍＬであった。ペプチドは、リラグルチドまたはセマグルチドであってもよい。リラグルチドフィブリルは、本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って調製され得る。セマグルチドフィブリルは、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に従って調製され得る。試験溶液の７５μＬの試料を、１．３６μＬのＴｈＴ原液（ストック濃度：２２００μＭのＴｈＴ）と混合して、ペプチド／ＴｈＴ混合物中４０μＭの最終ＴｈＴ濃度に到達した。リラグルチドの場合、この混合物中の最終濃度は、１５７１μＭのリラグルチドであった（フィブリル化前に計算）。ペプチド／ＴｈＴ混合物の５０μＬの試料を、黒色３８４ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ ３８４ Ｗｅｌｌ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｐｌａｔｅｓ、１２５６６６２４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに添加し、５～１０分後、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏマイクロプレートリーダーを使用して、ＴｈＴ蛍光（λｅｘ＝４４４ｎｍ、λｅｍ＝４８２ｎｍ）値を測定した。
Assay (V): The test solution of the ThT assay peptide was analyzed for the presence of fibril immediately after fibril formation. The peptide concentration before fibril formation was 6 mg / mL. The peptide may be liraglutide or semaglutide. Liraglutide fibrils can be prepared according to assay (I) herein. Semaglutide fibrils can be prepared according to assay (II) herein. A 75 μL sample of the test solution was mixed with 1.36 μL ThT stock solution (stock concentration: 2200 μM ThT) to reach a final ThT concentration of 40 μM in the peptide / ThT mixture. In the case of liraglutide, the final concentration in this mixture was 1571 μM liraglutide (calculated prior to fibrillation). A 50 μL sample of the peptide / ThT mixture was added to the wells of a black 384-well plate (Fisherbrand 384 Well Polystyrene Plates, 12566624, Thermo Fisher Scientific), and after 5-10 minutes, the Biotech Synergy was used in a Biotek Synegy plate. ThT fluorescence (λex = 444 nm, λem = 482 nm) values were measured.
アッセイ（ＶＩ）：抗体アッセイと比較したＴｈＴアッセイ
可溶性リラグルチドとの混合物中のリラグルチドフィブリルの検出を、抗体アッセイと比較したＴｈＴ検出法を用いて決定した。
１．リラグルチドを、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用してｐＨを８．１５に調整した、薬物組成物緩衝液（１４ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物）中、６０ｍｇ／ｍＬで可溶化し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過した。溶液をＰＢＳ中、６ｍｇ／ｍＬ（１６００μＭ）のリラグルチドに希釈した。この溶液を、「可溶性リラグルチド溶液」と称する。
２．本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って得て、約３００μＬの試料中でｐＨ８．１５の薬物組成物緩衝液中に再懸濁した（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）によって決定されるフィブリル濃度を有する）リラグルチドフィブリル（以下、フィブリル）を、マイクロ遠心管中、氷上で超音波処理した（１００％振幅で１０秒オン／３０秒オフの３サイクル、ＦＢ－１２０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を得た。この溶液を、「フィブリル溶液」と称する。
３．フィブリルの最終濃度が１００μＭになるように、超音波処理されたフィブリル溶液を可溶性リラグルチド溶液中に希釈した。次いで、溶液を、０．００１、０．００２５、０．０１、０．０２５、０．１、０．２５、１、２．５、１０、および２５μＭのフィブリルの結果として生じる試料まで、可溶性リラグルチド溶液中にさらに段階希釈した。２つの対照：ｉ）ＰＢＳ（ペプチドなし）、およびｉｉ）フィブリルなし（可溶性リラグルチド溶液のみ）を使用した
ａ．この時点で、可溶性リラグルチド溶液中にフィブリル溶液を希釈することによって得られた溶液（ステップ３からの）を、オボアルブミンコーティングＥＬＩＳＡプレートのウェルに（１００μＬ）添加し、本発明の抗体を用いたＥＬＩＳＡ検出前に室温で２時間インキュベーションした。残りのＥＬＩＳＡプロトコルを、アッセイ（ＩＶ）（ステップ７以降）に記載されるように実施した。
４．残留試料（フィブリルおよび可溶性リラグルチドの混合物、ならびにステップ３からのＰＢＳ対照および可溶性リラグルチド対照）を、室温において２．５時間、マイクロ遠心管中でインキュベーションした。
５．チオフラビンＴ（ＴｈＴ）原液を、２２００μＭの濃度で調製した。ＴｈＴを、試料（最初に１６００μＭの総ペプチド濃度）に、４０μＭの最終濃度になるまで添加し、ペプチド／ＴｈＴ混合物の５０μＬの試料を、黒色３８４ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ ３８４ Ｗｅｌｌ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｐｌａｔｅｓ、１２５６６６２４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに添加した。Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏマイクロプレートリーダーを使用して、各試料について、ＴｈＴ蛍光（λｅｘ＝４４４ｎｍ、λｅｍ＝４８２ｎｍ）値を測定した。ペプチド／ＴｈＴ混合物中の最終（総）ペプチド濃度は、１５７１μＭであった（フィブリル化前に計算）。
６．フィブリルを含む溶液の蛍光測定値を、可溶性リラグルチド溶液（フィブリルなしの対照）の蛍光測定値で割り、比率を混合物／可溶性比として報告した。
Assay (VI): ThT Assay Compared to Antibody Assay The detection of liraglutide fibrils in a mixture with soluble liraglutide was determined using the ThT detection method compared to the antibody assay.
1. 1. Rilaglutide, pH adjusted to 8.15 using NaOH and / or HCl as needed, drug composition buffer (14 mg / mL propylene glycol, 5.5 mg / mL phenol, 1.42 mg /). It was solubilized at 60 mg / mL in mL of disodium phosphate dihydrate) and filtered through a 0.22 μm PES filter. The solution was diluted to 6 mg / mL (1600 μM) liraglutide in PBS. This solution is referred to as a "soluble liraglutide solution".
2. 2. Obtained according to assay (I) herein and resuspended in approximately 300 μL of sample in pH 8.15 drug composition buffer (determined by assay (VII) (BCA assay) herein). Rilaglutide fibrils (hereinafter referred to as fibrils) having a fibril concentration were ultrasonically treated on ice in a microcentrifuge tube (3 cycles of 10 seconds on / 30 seconds off at 100% amplitude, FB-120 Sonic Dismembrator, Thermo Sample Assay). ) Was obtained. This solution is referred to as a "fibril solution".
3. 3. The sonicated fibril solution was diluted in a soluble liraglutide solution so that the final concentration of fibril was 100 μM. Soluble rilaglutide is then added to the solution to the sample resulting from 0.001, 0.0025, 0.01, 0.025, 0.1, 0.25, 1, 2.5, 10, and 25 μM fibrils. Further serially diluted in solution. Two controls: i) PBS (without peptide) and ii) without fibril (soluble liraglutide solution only) a. At this point, the solution (from step 3) obtained by diluting the fibril solution into a soluble lylaglutide solution was added (100 μL) to the wells of an ovalbumin-coated ELISA plate and ELISA using the antibody of the invention. Incubate for 2 hours at room temperature prior to detection. The remaining ELISA protocol was performed as described in Assay (IV) (step 7 and beyond).
4. Residual samples (a mixture of fibril and soluble liraglutide, and PBS and soluble liraglutide controls from step 3) were incubated in a microcentrifuge tube for 2.5 hours at room temperature.
5. Thioflavin T (ThT) stock solution was prepared at a concentration of 2200 μM. ThT was added to the sample (initially a total peptide concentration of 1600 μM) to a final concentration of 40 μM, and a 50 μL sample of the peptide / ThT mixture was added to a black 384-well plate (Fisherbrand 384 Well Polystyrene Plates, 12566624, Thermo Fisher). It was added to the wells of Scientific). ThT fluorescence (λex = 444 nm, λem = 482 nm) values were measured for each sample using a Biotek Synergy Neo microplate reader. The final (total) peptide concentration in the peptide / ThT mixture was 1571 μM (calculated prior to fibrillation).
6. The fluorescence measurements of the solution containing fibril were divided by the fluorescence measurements of the soluble relaglutide solution (control without fibril) and the ratio was reported as a mixture / solubility ratio.
アッセイ（ＶＩ－Ｂ）：抗体アッセイと比較したＴｈＴアッセイ
可溶性リラグルチドとの混合物中のリラグルチドフィブリルの検出を、抗体アッセイと比較したＴｈＴ検出法を用いて決定した。
１．アッセイの前夜：ＢＳＡをＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬで可溶化し、次いで、３０ｃｃのルアーロックシリンジを用いて０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して滅菌し、１５０μＬの溶液をＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（製品番号：４３９４５４）９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに分配した。プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、４℃で一晩インキュベーションした。
２．アッセイの日、リラグルチド混合物をＢＳＡコーティングプレートに固定化した。
ａ．リラグルチドを、必要に応じてＮａＯＨおよび／またはＨＣｌを使用してｐＨを８．１５に調整した、薬物組成物緩衝液（１４ｍｇ／ｍＬのプロピレングリコール、５．５ｍｇ／ｍＬのフェノール、１．４２ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物）中、６０ｍｇ／ｍＬで可溶化し、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過した。溶液をＰＢＳ中、６ｍｇ／ｍＬ（１６００μＭ）のリラグルチドに希釈した。この溶液を、「可溶性リラグルチド溶液」と称する。
ｂ．本明細書のアッセイ（Ｉ）に従って得て、約３００μＬの試料中でｐＨ８．１５の薬物組成物緩衝液中に再懸濁した（本明細書のアッセイ（ＶＩＩ）（ＢＣＡアッセイ）によって決定されるフィブリル濃度を有する）リラグルチドフィブリル（以下、フィブリル）を、マイクロ遠心管中、氷上で超音波処理した（１００％振幅で１０秒オン／３０秒オフの３サイクル、ＦＢ－１２０ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を得た。この溶液を、「フィブリル溶液」と称する。
ｃ．フィブリルの最終濃度が１００μＭになるように、超音波処理されたフィブリル溶液を可溶性リラグルチド溶液中に希釈した。次いで、溶液を、０．００１、０．００２５、０．０１、０．０２５、０．１、０．２５、１、２．５、１０、および２５μＭのフィブリルの結果として生じる試料まで、可溶性リラグルチド溶液中にさらに段階希釈した。２つの対照：ｉ）ＰＢＳ（ペプチドなし）、およびｉｉ）フィブリルなし（可溶性リラグルチド溶液のみ）を使用した
ｄ．可溶性リラグルチド溶液中にフィブリル溶液を希釈することによって得られた溶液を、ＢＳＡコーティングＥＬＩＳＡプレートのウェルに（１００μＬ）添加し、室温で３時間インキュベーションした。
３．残りのＥＬＩＳＡプロトコルを、アッセイ（ＶＩ）について記載されるように、いくつかの修正を加えて実施した。
ａ．この３時間の間、抗体試料を、遠心分離機において２１，０００×ｇで５分間スピンさせ、２８０ｎｍでの吸光度によって上清の濃度を測定した。各抗体を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を補充したＰＢＳ中で５０ｎＭに段階希釈した。
ｂ．各ウェルに３００μＬのＰＢＳを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
ｃ．１００μＬの抗体溶液を各ウェルに分配した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。
ｄ．二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ ＨＲＰコンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１８８１７、ストック濃度：５０％グリセロール中０．５ｍｇ／ｍＬ）１：１０００を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および１０ｇ／ＬのＢＳＡを補充したＰＢＳ中に希釈することによって、二次抗体溶液を調製した。
ｅ．各ウェルに３００μＬのＰＢＳＴを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
ｆ．１００μＬの二次抗体溶液を各ウェルに分配した。次いで、プレートを接着フィルムで覆い、アルミニウムホイルで包み、室温で１時間インキュベーションした。二次抗体インキュベーション中、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ－ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４２０８）を冷蔵庫から取り出して、溶液を室温に平衡化し、２Ｍ（４Ｎ）Ｈ２ＳＯ４を調製した。
ｇ．各ウェルに３００μＬのＰＢＳＴを添加することによって、プレートを３回洗浄した。
ｈ．１００μＬのＵｌｔｒａ－ＴＭＢを各ウェルに添加し、黄色生成物が形成されるまでインキュベーションした（５～１０分）。
ｉ．１００μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって、反応をクエンチした。
ｊ．各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ）において４５０ｎｍで読み取った。
４．残留試料（フィブリルおよび可溶性リラグルチドの混合物、ならびにステップ３からのＰＢＳ対照および可溶性リラグルチド対照）を、室温において２．５時間、マイクロ遠心管中でインキュベーションした。
５．チオフラビンＴ（ＴｈＴ）原液を、２２００μＭの濃度で調製した。ＴｈＴを、試料（最初に１６００μＭの総ペプチド濃度）に、０．４μＭの最終濃度になるまで添加し、ペプチド／ＴｈＴ混合物の５０μＬの試料を、黒色３８４ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ ３８４ Ｗｅｌｌ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｐｌａｔｅｓ、１２５６６６２４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに添加した。Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏマイクロプレートリーダーを使用して、各試料について、ＴｈＴ蛍光（λｅｘ＝４４４ｎｍ、λｅｍ＝４８２ｎｍ）値を測定した。ペプチド／ＴｈＴ混合物中の最終（総）ペプチド濃度は、１５７１μＭであった（フィブリル化前に計算）。
６．フィブリルを含む溶液の蛍光測定値を、可溶性リラグルチド溶液（フィブリルなしの対照）の蛍光測定値で割り、比率を混合物／可溶性比として報告した。
Assay (VI-B): ThT Assay Compared to Antibody Assay The detection of liraglutide fibrils in a mixture with soluble liraglutide was determined using the ThT detection method compared to the antibody assay.
1. 1. Eve of assay: BSA is solubilized in PBS at 1 mg / mL, then sterilized using a 30 cc luer lock syringe through a 0.22 μm PES filter and 150 μL of solution in 96 wells of Nunc MaxiSorp (Product No .: 439454). Distributed to each well of the ELISA plate. The plates were covered with adhesive film, wrapped in aluminum foil and incubated overnight at 4 ° C.
2. 2. On the day of the assay, the liraglutide mixture was immobilized on a BSA coated plate.
a. Rilaglutide, pH adjusted to 8.15 using NaOH and / or HCl as needed, drug composition buffer (14 mg / mL propylene glycol, 5.5 mg / mL phenol, 1.42 mg /). It was solubilized at 60 mg / mL in mL disodium phosphate dihydrate) and filtered through a 0.22 μm PES filter. The solution was diluted to 6 mg / mL (1600 μM) liraglutide in PBS. This solution is referred to as a "soluble liraglutide solution".
b. Obtained according to assay (I) herein and resuspended in approximately 300 μL of sample in pH 8.15 drug composition buffer (determined by assay (VII) (BCA assay) herein). Rilaglutide fibrils (hereinafter referred to as fibrils) having a fibril concentration were ultrasonically treated on ice in a microcentrifuge tube (3 cycles of 10 seconds on / 30 seconds off at 100% amplitude, FB-120 Sonic Dismembrator, Thermo Sample Assay). ) Was obtained. This solution is referred to as a "fibril solution".
c. The sonicated fibril solution was diluted in a soluble liraglutide solution so that the final concentration of fibril was 100 μM. Soluble rilaglutide is then added to the solution to the sample resulting from 0.001, 0.0025, 0.01, 0.025, 0.1, 0.25, 1, 2.5, 10, and 25 μM fibrils. Further serially diluted in solution. Two controls: i) PBS (without peptide) and ii) without fibril (soluble liraglutide solution only) d. The solution obtained by diluting the fibril solution in the soluble liraglutide solution was added (100 μL) to the wells of a BSA-coated ELISA plate and incubated at room temperature for 3 hours.
3. 3. The remaining ELISA protocol was performed with some modifications as described for the assay (VI).
a. For these 3 hours, the antibody sample was spun in a centrifuge at 21,000 xg for 5 minutes and the concentration of the supernatant was measured by absorbance at 280 nm. Each antibody was serially diluted to 50 nM in PBS supplemented with 0.1% Tween 20 (PBST).
b. Plates were washed 3 times by adding 300 μL PBS to each well.
c. A 100 μL antibody solution was dispensed into each well. The plate was then covered with an adhesive film, wrapped in aluminum foil and incubated at room temperature for 1 hour.
d. PBS supplemented with secondary antibody (goat anti-human IgG-Fc HRP conjugate, Invitrogen A18817, stock concentration: 0.5 mg / mL in 50% glycerol) 1: 1000, 0.1
e. Plates were washed 3 times by adding 300 μL PBST to each well.
f. A 100 μL secondary antibody solution was dispensed into each well. The plate was then covered with an adhesive film, wrapped in aluminum foil and incubated at room temperature for 1 hour. During the secondary antibody incubation, the 1-Step Ultra-TMB ELISA substrate (Thermo Fisher Scientific, 34208) was removed from the refrigerator and the solution was equilibrated to room temperature to prepare 2M (4N) H2SO4.
g. Plates were washed 3 times by adding 300 μL PBST to each well.
h. 100 μL of Ultra-TMB was added to each well and incubated until a yellow product was formed (5-10 minutes).
i. The reaction was quenched by the addition of 100 μL of 2MH2SO4.
j. The absorbance of each well was read at 450 nm on a microplate reader (BioTek Synergy Neo).
4. Residual samples (a mixture of fibril and soluble liraglutide, and PBS and soluble liraglutide controls from step 3) were incubated in a microcentrifuge tube for 2.5 hours at room temperature.
5. Thioflavin T (ThT) stock solution was prepared at a concentration of 2200 μM. ThT was added to the sample (initially a total peptide concentration of 1600 μM) to a final concentration of 0.4 μM, and a 50 μL sample of the peptide / ThT mixture was added to a black 384-well plate (Fisherbrand 384 Well Polystyrene Plates, 12566624,). It was added to the wells of Thermo Fisher Scientific). ThT fluorescence (λex = 444 nm, λem = 482 nm) values were measured for each sample using a Biotek Synergy Neo microplate reader. The final (total) peptide concentration in the peptide / ThT mixture was 1571 μM (calculated prior to fibrillation).
6. The fluorescence measurements of the solution containing fibril were divided by the fluorescence measurements of the soluble relaglutide solution (control without fibril) and the ratio was reported as a mixture / solubility ratio.
アッセイ（ＶＩＩ）：ＢＣＡアッセイ
リラグルチドをリラグルチドフィブリルの標準として、およびセマグルチドをセマグルチドフィブリルの標準として用いて（ＢＳＡではない）、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２２５）を使用して、フィブリル（例えば、リラグルチドフィブリル）の濃度を決定した。薬物組成物緩衝液からのフェノールが、試料希釈に応じて様々な程度までＢＣＡ試薬と反応するため、定量化のために対照を実験してフェノールから生じるバックグラウンドシグナルを説明した。フィブリル集合中の初期濃度（６ｍｇ／ｍＬ）から上清中のペプチド濃度（超遠心分離後）を引くことによって、本明細書のアッセイ（Ｉ）またはアッセイ（ＩＩ）からの再懸濁されたフィブリル溶液中のフィブリルの濃度を決定した。リラグルチドフィブリルの分析を、以下に記載されるように行った：
１．リラグルチドを、６ｍｇ／ｍＬ（６０００μｇ／ｍＬ）の薬物組成物緩衝液、ｐＨ８．１５で溶解した。これを、「可溶性リラグルチド溶液」と称する。
２．標準については、可溶性リラグルチド溶液を（１）からＰＢＳ中に、２０００、１５００、１０００、７５０、５００、２５０、１２５、２５、および０μｇ／ｍＬの濃度で希釈し、ＰＢＳ中に希釈された同量の薬物組成物緩衝液、ｐＨ８．１５を含有する（がペプチドを欠く）「ブランク」を調製した。例えば、２０００μｇ／ｍＬの標準を６００μｇ／Ｌ作製するためには、（１）からの２００μＬの溶液および４００μＬのＰＢＳを必要とする。ブランクを作製するために、２００μＬの薬物組成物緩衝液（ペプチドなし）および４００μＬのＰＢＳを混合した。
３．本明細書のアッセイ（Ｉ）から得られた超遠心分離されたフィブリル（薬物組成物緩衝液、ｐＨ８．１５中）からの上清を、以下の希釈でＰＢＳ中に希釈した：１：２、１；４、１：８、１：１６、１：３２。同じ希釈でＰＢＳ中に希釈された薬物組成物緩衝液、ｐＨ８．１５を含有するこれらの試料について、「ブランク」も調製した。
４．透明（結合なしまたは低結合）の平底９６ウェルプレートの各ウェルに、１０μＬの標準（および対応するブランクを有する別個のウェル）、および１０μＬの希釈された試料（および対応するブランクを有する別個のウェル）を添加した。
５．ＢＣＡ Ｗｏｒｋｉｎｇ試薬を作り、２２５μＬを各ウェルに添加し、プレートを接着フィルムで覆った。
６．プレートを、紫色の形成が十分になるまで３７℃でインキュベーションした（これは概して、比較的迅速に起こり、ある程度の色は多くの場合、ほぼすぐに一部の試料で目に見える）。
７．５６２ｎｍのプレートリーダーで吸光度を読み取った。
８．標準についての「ブランク」吸光度値を、標準についての値から引いた。ペプチド濃度対吸光度をプロットし、二次多項式をフィッティングすることによって、標準曲線を、得られる（バックグラウンド減算された）吸光度にフィッティングした。
９．上清についての「ブランク」吸光度値を上清希釈についての値から引いた。（８）からの標準曲線を使用して、上清試料のペプチド濃度を決定し、それらの希釈倍率を掛けて、未希釈上清中のリラグルチド濃度を計算した。約２５０～１０００μｇ／ｍＬの範囲の計算濃度を有する試料が好ましい（これは、ＢＣＡアッセイの正確な範囲の中間である）。
１０．フィブリルが６ｍｇ／ｍＬ（６０００μｇ／ｍＬ）の濃度で集合したため、上清のペプチド濃度をこれから引いて、再懸濁された試料中のフィブリルの濃度を得た。この計算が正確であるためには、遠心分離後にアッセイ（Ｉ）のフィブリルペレットを全く同じ総体積で再懸濁することが重要である。
Assay (VII): BCA Assay Using liraglutide as a standard for liraglutide fibrils and semaglutide as a standard for semaglutide fibrils (not BSA), using Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, 23225). The concentration of fibril (eg, liraglutide fibril) was determined. Since phenol from the drug composition buffer reacts with the BCA reagent to varying degrees depending on the sample dilution, controls were experimented with for quantification to explain the background signal resulting from the phenol. Resuspended fibrils from assay (I) or assay (II) herein by subtracting the peptide concentration in the supernatant (after ultracentrifugation) from the initial concentration in the fibril assembly (6 mg / mL). The concentration of fibril in the solution was determined. An analysis of liraglutide fibrils was performed as described below:
1. 1. Liraglutide was dissolved in 6 mg / mL (6000 μg / mL) drug composition buffer, pH 8.15. This is referred to as a "soluble liraglutide solution".
2. 2. For standards, soluble liraglutide solution was diluted from (1) into PBS at concentrations of 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250, 125, 25, and 0 μg / mL, and the same amount diluted in PBS. A "blank" containing (but lacking the peptide) pH 8.15 of the drug composition buffer was prepared. For example, to make a standard of 2000 μg / mL 600 μg / L requires 200 μL solution from (1) and 400 μL PBS. To make a blank, 200 μL of drug composition buffer (without peptide) and 400 μL of PBS were mixed.
3. 3. The supernatant from the ultracentrifugated fibril (drug composition buffer, in pH 8.15) obtained from assay (I) herein was diluted in PBS with the following dilutions: 1: 2, 1; 4, 1: 8, 1:16, 1:32. A "blank" was also prepared for these samples containing the drug composition buffer, pH 8.15, diluted in PBS with the same dilution.
4. In each well of a clear (no binding or low binding) flat bottom 96-well plate, a 10 μL standard (and a separate well with a corresponding blank), and a 10 μL diluted sample (and a separate well with a corresponding blank). ) Was added.
5. A BCA Working reagent was made, 225 μL was added to each well, and the plate was covered with an adhesive film.
6. The plates were incubated at 37 ° C. until the formation of purple was sufficient (this generally happens relatively quickly and some color is often visible almost immediately in some samples).
The absorbance was read with a 7.562 nm plate reader.
8. The "blank" absorbance value for the standard was subtracted from the value for the standard. The standard curve was fitted to the resulting (background subtracted) absorbance by plotting the peptide concentration vs. absorbance and fitting a quadratic polynomial.
9. The "blank" absorbance value for the supernatant was subtracted from the value for the supernatant dilution. Using the standard curve from (8), the peptide concentration of the supernatant sample was determined and multiplied by their dilution factor to calculate the liraglutide concentration in the undiluted supernatant. Samples with calculated concentrations in the range of about 250-1000 μg / mL are preferred (this is in the middle of the exact range of the BCA assay).
10. Since the fibrils aggregated at a concentration of 6 mg / mL (6000 μg / mL), the peptide concentration in the supernatant was subtracted from this to give the concentration of fibrils in the resuspended sample. For this calculation to be accurate, it is important to resuspend the fibril pellets of Assay (I) in exactly the same total volume after centrifugation.
本明細書のアッセイ（Ｉ）への参照が、本明細書のアッセイ（ＩＩ）に置き換えられるべきであることを除いて、同様の手順がセマグルチドフィブリルに使用されてもよい。 Similar procedures may be used for semaglutide fibrils, except that references to assay (I) herein should be replaced with assay (II) herein.
結果
［実施例１］［抗体］
表１に列挙されるアミノ酸配列を有する抗体（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）を、組換え発現によって調製し、精製した。
Results [Example 1] [Antibody]
Antibodies (scFv-Fc) having the amino acid sequences listed in Table 1 were prepared and purified by recombinant expression.
表１は、各抗体の完全配列を列挙し、太字のテキストは、ＣＤＲの位置（Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の順で示される）を示し、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔ抗体ナンバリングスキームに従って定義した。表２は、表１の抗体の軽鎖の可変領域（ＶＬ配列）、重鎖の可変領域（ＶＨ配列）のアミノ酸配列を列挙する。表３は、表１の抗体のＣＤＲを列挙する。
［実施例２］［抗体のリラグルチドフィブリル特異性］
実施例１の抗体を、バックグラウンドおよび／または可溶性リラグルチドと比較して、リラグルチドフィブリルに結合するそれらの能力について個々に試験した。本明細書に定義されるアッセイ（ＩＩＩ）またはアッセイ（ＩＶ）に従って、試験を行った。結果を表４および５に示す。
The antibodies of Example 1 were individually tested for their ability to bind liraglutide fibrils compared to background and / or soluble liraglutide. Testing was performed according to Assay (III) or Assay (IV) as defined herein. The results are shown in Tables 4 and 5.
表４および５の結果は、試験された抗体が可溶性リラグルチドよりも有意に多くリラグルチドフィブリルに結合することを示す。表４の結果はまた、試験された抗体が、バックグラウンドよりも有意に多くリラグルチドフィブリルに結合することを示す。表５の結果は、試験された抗体が、高濃度の可溶性リラグルチドの混合物中で試験された場合、有意に多くリラグルチドフィブリルに結合することもできることを示す。 The results in Tables 4 and 5 show that the antibody tested binds significantly more liraglutide fibrils than soluble liraglutide. The results in Table 4 also show that the antibodies tested bind to liraglutide fibrils significantly more than in the background. The results in Table 5 show that the antibodies tested can also bind significantly more liraglutide fibrils when tested in a high concentration of soluble liraglutide mixture.
［実施例３］［ＴｈＴアッセイと比較したリラグルチドフィブリル－抗体の検出感度］
ＴｈＴアッセイを、過剰な可溶性リラグルチドとの混合物中のリラグルチドフィブリルに結合するその能力について試験して、本発明の抗体との感度の比較を可能にした。本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って実験を行った。結果を表６に示す。
The ThT assay was tested for its ability to bind liraglutide fibrils in a mixture with excess soluble liraglutide, allowing comparison of sensitivity with the antibodies of the invention. Experiments were performed according to the assay (VI) herein. The results are shown in Table 6.
［実施例４］［リラグルチド抗体の濃度依存性結合分析］
「抗体発現および精製」のセクションに記載されるように、抗体を調製した。抗体Ｅ、Ｍ、およびＮを、２０ｍｇ／Ｌ超の収率で二段階精製した。精製された抗体は、分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって実証されるように、主にモノマーであった（Ｅ、Ｍ、およびＮについては９５％超のモノマー、図１）。二段階精製された抗体（９５％超のモノマー）を使用したアッセイの感度はまた、一次抗体インキュベーション中のＢＳＡの除去によって増強された。これらの変化は、アッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）の改善をもたらした。
[Example 4] [Concentration-dependent binding analysis of liraglutide antibody]
Antibodies were prepared as described in the "Antibody Expression and Purification" section. Antibodies E, M, and N were purified in two steps with yields above 20 mg / L. Purified antibodies were predominantly monomers, as demonstrated by analytical size exclusion chromatography (more than 95% monomers for E, M, and N, FIG. 1). The sensitivity of the assay using a two-step purified antibody (> 95% monomer) was also enhanced by removal of BSA during the primary antibody incubation. These changes resulted in an improvement in the assay (III-B).
実施例１の抗体Ｅ、Ｍ、およびＮを、二段階精製し（９５％超のモノマー）、バックグラウンドおよび／または可溶性リラグルチドと比較して、リラグルチドフィブリルにそれらの結合する能力について個々に試験した。本明細書のアッセイ（（ＩＩＩ－Ｂ）に従って、試験を行った。結果を表７（凝集性リラグルチドおよび可溶性リラグルチドについての未加工の（バックグラウンド減算されていない）抗体結合シグナル）、ならびに表８（抗体のリラグルチドフィブリル特異性（リラグルチドフィブリル／モノマーリラグルチド））に示す。３つの独立した実験を実施し、報告された値は、平均である。
表７および８の結果は、試験された抗体が可溶性リラグルチドよりも有意に多くリラグルチドフィブリルに結合することを示す。 The results in Tables 7 and 8 show that the antibody tested binds significantly more liraglutide fibrils than soluble liraglutide.
二段階精製された抗体（９５％超のモノマー）の異なるバッチにおける抗体凝集体の量を制御することがより容易であるため、アッセイにおいて高度に精製された抗体（９５％超のモノマー）を使用することが、一段階精製された抗体（５％超の抗体凝集体）を使用した以前のアッセイ（ＩＩＩ）よりもアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）をより再現性のあるものにするという利点を有することも観察された。抗体凝集体がリラグルチドフィブリルへの結合に寄与したため、サイズ排除クロマトグラフィーを使用した抗体凝集体の除去により、低抗体濃度での抗体感度が低下した。しかしながら、抗体純度の上昇は、より低いバックグラウンドシグナルのため、より高い抗体濃度の使用を可能にし、これは、アッセイ感度の改善を可能にした。 Highly purified antibody (> 95% monomer) is used in the assay because it is easier to control the amount of antibody aggregates in different batches of two-step purified antibody (> 95% monomer). Having the advantage of making the assay (III-B) more reproducible than the previous assay (III) using one-step purified antibodies (> 5% antibody aggregates). Was also observed. Because antibody aggregates contributed to binding to liraglutide fibrils, removal of antibody aggregates using size exclusion chromatography reduced antibody sensitivity at low antibody concentrations. However, the increased antibody purity allowed the use of higher antibody concentrations due to the lower background signal, which allowed improved assay sensitivity.
［実施例５］［ＴｈＴアッセイと比較したリラグルチドフィブリル－抗体の検出感度］
「抗体発現および精製」のセクションに記載されるように、抗体を調製した。抗体Ｅ、Ｍ、およびＮを、２０ｍｇ／Ｌ超の収率で二段階精製した。精製された抗体は、分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって実証されるように、主にモノマーであった（Ｅ、Ｍ、およびＮについては９５％超のモノマー、図１）。二段階精製された抗体（９５％超のモノマー）を使用したアッセイの感度はまた、一次抗体インキュベーション中のＢＳＡの除去、および抗体濃度の増加（５から５０ｎＭ）によって増強され、アッセイ（ＶＩ－Ｂ）の改善をもたらした。
[Example 5] [sensitivity of detection of liraglutide fibril-antibody compared with ThT assay]
Antibodies were prepared as described in the "Antibody Expression and Purification" section. Antibodies E, M, and N were purified in two steps with yields above 20 mg / L. Purified antibodies were predominantly monomers, as demonstrated by analytical size exclusion chromatography (more than 95% monomers for E, M, and N, FIG. 1). The sensitivity of the assay using a two-step purified antibody (> 95% monomer) was also enhanced by removal of BSA during the primary antibody incubation and increased antibody concentration (5 to 50 nM), and the assay (VI-B). ) Brought about improvement.
ＴｈＴアッセイを、過剰な可溶性リラグルチドとの混合物中のリラグルチドフィブリルに結合するその能力について試験して、本発明の抗体Ｍとの感度の比較を可能にした。本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って実験を行った。結果を表９に示す。
表９の結果は、リラグルチドフィブリルを検出するための本発明の抗体の感度が、ＴｈＴアッセイよりも桁違いに高いことを示す。さらに、本発明の抗体が、シグナルがＴｈＴアッセイで記録されなかったフィブリルの濃度で、リラグルチドフィブリルを検出したこともわかった。 The results in Table 9 show that the sensitivity of the antibodies of the invention for detecting liraglutide fibrils is orders of magnitude higher than in the ThT assay. It was also found that the antibodies of the invention detected liraglutide fibrils at concentrations of fibril for which no signal was recorded in the ThT assay.
二段階精製された抗体（９５％超のモノマー）の異なるバッチにおける抗体凝集体の量を制御することがより容易であるため、アッセイにおいて高度に精製された抗体（９５％超のモノマー）を使用することが、一段階精製された抗体（５％超の抗体凝集体）を使用した以前のアッセイ（ＶＩ）よりもアッセイ（ＶＩ－Ｂ）をより再現性のあるものにするという利点を有することも観察された。抗体凝集体がリラグルチドフィブリルへの結合に寄与したため、サイズ排除クロマトグラフィーを使用した抗体凝集体の除去により、低抗体濃度（例えば、５ｎＭ）での抗体感度が低下した。しかしながら、抗体純度の上昇は、より低いバックグラウンドシグナルのため、より高い抗体濃度（５ｎＭの代わりに５０ｎＭ）の使用を可能にし、これは、アッセイ感度の改善を可能にした。 Highly purified antibody (> 95% monomer) is used in the assay because it is easier to control the amount of antibody aggregates in different batches of two-step purified antibody (> 95% monomer). Having the advantage of making the assay (VI-B) more reproducible than the previous assay (VI) using one-step purified antibodies (> 5% antibody aggregates). Was also observed. Because antibody aggregates contributed to binding to liraglutide fibrils, removal of antibody aggregates using size exclusion chromatography reduced antibody sensitivity at low antibody concentrations (eg, 5 nM). However, the increased antibody purity allowed the use of higher antibody concentrations (50 nM instead of 5 nM) due to the lower background signal, which allowed improved assay sensitivity.
［実施例６］［９５％超のモノマー純度を有する抗体の再現性］
実施例１の抗体Ｍを二段階精製し（９５％超のモノマー）、可溶性リラグルチドと比較した、過剰な可溶性リラグルチドの存在下でリラグルチドフィブリルに結合するその能力について試験した。本明細書のアッセイ（（ＶＩ－Ｂ）に従って、試験を行った。抗体の２つの異なるバッチを試験し、合計４つの独立した実験を実施した。結果を表１０に示す。
The antibody M of Example 1 was two-step purified (more than 95% monomer) and tested for its ability to bind liraglutide fibrils in the presence of excess soluble liraglutide compared to soluble liraglutide. The tests were performed according to the assay herein ((VI-B). Two different batches of antibody were tested and a total of four independent experiments were performed. Results are shown in Table 10.
表１０の結果は、アッセイにおいて高度に精製された抗体（９５％超のモノマー）を使用することが、非常に再現性のある結果をもたらすことを示す。 The results in Table 10 show that the use of highly purified antibodies (> 95% monomer) in the assay yields highly reproducible results.
本発明のある特定の特徴が本明細書に例示および記載されているが、ここで、多くの修正、置換、変更、および同等物が当業者に想到されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるこうしたすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。 Although certain features of the invention are exemplified and described herein, many modifications, substitutions, modifications, and equivalents will be conceived by those of skill in the art. Therefore, it should be understood that the appended claims are intended to cover all such modifications and modifications within the true spirit of the invention.
Claims (15)
ａ．可溶性リラグルチドに対する前記抗体の結合レベルよりも少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルであって、前記結合レベルが、アッセイ（ＩＩＩ）に従って少なくとも２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度で決定される、結合レベル、および／または
ｂ．ＴｈＴアッセイのリラグルチドフィブリルに対する検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルに対する検出限界であって、前記検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って少なくとも１μＭのリラグルチドフィブリル濃度で決定される、検出限界、および／または
ｃ．可溶性リラグルチドに対する前記抗体の結合のレベルよりも少なくとも５倍高いリラグルチドフィブリルへの結合のレベルであって、前記抗体が９５％を超える単体量の純度を有し、前記結合のレベルが、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って、少なくとも３０μＭのリラグルチドフィブリル濃度での決定される、結合レベル、および／または
ｄ．ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界であって、前記抗体が９５％を超える単体量の純度を有し、前記検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って少なくとも０．０２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度で決定される、検出限界
を有する、抗体。 An antibody that binds to liraglutide fibrils, wherein the fibril is optionally prepared according to assay (I) herein and the antibody is:
a. The binding level, and / Or b. The detection limit for rilaglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower than the detection limit for rilaglutide fibrils in the ThT assay, said detection limit is determined at a concentration of at least 1 μM rilaglutide fibrils according to the assay (VI) herein. , Detection limit, and / or c. The level of binding to liraglutide fibrils, which is at least 5-fold higher than the level of binding of the antibody to soluble liraglutide, wherein the antibody has a single amount of purity greater than 95% and the level of binding is described herein. The binding level, and / or d. The detection limit for rilaglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower than the detection limit for rilaglutide fibrils in the ThT assay, wherein the antibody has a single amount purity greater than 95% and the detection limit is herein. An antibody with a detection limit, determined by assay (VI-B) at a concentration of rilaglutide fibrils of at least 0.025 μM.
ａ．可溶性リラグルチドに対する前記抗体の結合レベルよりも少なくとも１０倍高いリラグルチドフィブリルへの結合レベルであって、前記結合のレベルが、アッセイ（ＩＩＩ）に従って少なくとも２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度で決定される、結合レベル、および／または
ｂ．ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界であって、前記検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ）に従って少なくとも１μＭのリラグルチドフィブリル濃度で決定される、検出限界を有する、請求項１に記載の抗体。 The fibril is optionally prepared according to assay (I) herein and the antibody is:
a. The binding level to liraglutide fibrils, which is at least 10-fold higher than the binding level of the antibody to soluble liraglutide, and the binding level is determined by assay (III) at a concentration of at least 25 μM liraglutide fibrils, and binding levels, and / Or b. The detection limit for rilaglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower than the detection limit for rilaglutide fibrils in the ThT assay, said detection limit is determined at a concentration of at least 1 μM rilaglutide fibrils according to the assay (VI) herein. The antibody according to claim 1, which has a detection limit.
ｃ．可溶性リラグルチドに対する前記抗体の結合のレベルよりも少なくとも５倍高いリラグルチドフィブリルへの結合のレベルであって、前記抗体が９５％を超える単体量の純度を有し、前記結合のレベルが、本明細書のアッセイ（ＩＩＩ－Ｂ）に従って少なくとも３０μＭのリラグルチドフィブリル濃度で決定される、結合レベル、および／または
ｄ．ＴｈＴアッセイにおけるリラグルチドフィブリルの検出限界よりも少なくとも１０倍低い濃度でのリラグルチドフィブリルの検出限界であって、前記抗体が９５％を超える単体量の純度を有し、前記検出限界が、本明細書のアッセイ（ＶＩ－Ｂ）に従って少なくとも０．０２５μＭのリラグルチドフィブリル濃度で決定される、検出限界を有する、請求項１または２に記載の抗体。 The fibril is optionally prepared according to assay (I) herein and the antibody is:
c. The level of binding to liraglutide fibrils, which is at least 5-fold higher than the level of binding of the antibody to soluble liraglutide, wherein the antibody has a single amount of purity greater than 95% and the level of binding is described herein. Binding levels and / or d. The detection limit for rilaglutide fibrils at a concentration at least 10-fold lower than the detection limit for rilaglutide fibrils in the ThT assay, wherein the antibody has a single amount purity greater than 95% and the detection limit is herein. The antibody according to claim 1 or 2, which has a detection limit, as determined by assay (VI-B) at a concentration of at least 0.025 μM rilaglutide fibrils.
ａ．配列番号３７、３８、および３９、
ｂ．配列番号４３、４４、および４５、
ｃ．配列番号４９、５０、および５１、
ｄ．配列番号５５、５６、および５７、
ｅ．配列番号６１、６２、および６３、
ｆ．配列番号６７、６８、および６９、
ｇ．配列番号７３、７４、および７５、
ｈ．配列番号７９、８０、および８１、
ｉ．配列番号８５、８６、および８７、
ｊ．配列番号９１、９２、および９３、
ｋ．配列番号９７、９８、および９９、
ｌ．配列番号１０３、１０４、および１０５、
ｍ．配列番号１１５、１１６、および１１７、
ｎ．配列番号 １２１、１２２、１２３、
または１、２、３個のアミノ酸置換、欠失、または挿入を有する前記配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。 The variable region of the heavy chain of the antibody
a. SEQ ID NOs: 37, 38, and 39,
b. SEQ ID NOs: 43, 44, and 45,
c. SEQ ID NOs: 49, 50, and 51,
d. SEQ ID NOs: 55, 56, and 57,
e. SEQ ID NOs: 61, 62, and 63,
f. SEQ ID NOs: 67, 68, and 69,
g. SEQ ID NOs: 73, 74, and 75,
h. SEQ ID NOs: 79, 80, and 81,
i. SEQ ID NOs: 85, 86, and 87,
j. SEQ ID NOs: 91, 92, and 93,
k. SEQ ID NOs: 97, 98, and 99,
l. SEQ ID NOs: 103, 104, and 105,
m. SEQ ID NOs: 115, 116, and 117,
n. SEQ ID NOs: 121, 122, 123,
Or any of claims 1-6 comprising a CDR1, CDR2, and / or CDR3 sequence selected from the group consisting of any of the above sequences having 1, 2, 3 amino acid substitutions, deletions, or insertions. The antibody according to one item.
ｏ．配列番号４０、４１、および４２、
ｐ．配列番号４６、４７、および４８、
ｑ．配列番号５２、５３、および５４、
ｒ．配列番号５８、５９、および６０、
ｓ．配列番号６４、６５、および６６、
ｔ．配列番号７０、７１、および７２、
ｕ．配列番号７６、７７、および７８、
ｖ．配列番号８２、８３、および８４、
ｗ．配列番号８８、８９、および９０、
ｘ．配列番号９４、９５、および９６、
ｙ．配列番号１００、１０１、および１０２、
ｚ．配列番号１０６、１０７、および１０８、
ａａ．配列番号１１８、１１９、および１２０、
ｂｂ．配列番号１２４、１２５、および１２６、
または１、２、３個のアミノ酸置換、欠失、または挿入を有する前記配列のいずれかからなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。 The variable region of the light chain of the antibody
o. SEQ ID NOs: 40, 41, and 42,
p. SEQ ID NOs: 46, 47, and 48,
q. SEQ ID NOs: 52, 53, and 54,
r. SEQ ID NOs: 58, 59, and 60,
s. SEQ ID NOs: 64, 65, and 66,
t. SEQ ID NOs: 70, 71, and 72,
u. SEQ ID NOs: 76, 77, and 78,
v. SEQ ID NOs: 82, 83, and 84,
w. SEQ ID NOs: 88, 89, and 90,
x. SEQ ID NOs: 94, 95, and 96,
y. SEQ ID NOs: 100, 101, and 102,
z. SEQ ID NOs: 106, 107, and 108,
aa. SEQ ID NOs: 118, 119, and 120,
bb. SEQ ID NOs: 124, 125, and 126,
Or any of claims 1-7, comprising a CDR1, CDR2, and / or a CDR3 sequence selected from the group consisting of any of the above sequences having 1, 2, 3 amino acid substitutions, deletions, or insertions. The antibody according to one item.
ａ）請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体をリラグルチドに結合する工程と、
ｂ）任意選択で、リラグルチドフィブリルに結合した抗体を検出する工程と、
ｃ）任意選択で、リラグルチドフィブリルに結合した抗体を、任意選択で、前記フィブリルの標準の使用によって、定量化する工程と、を含む、方法。 A method for identifying and / or quantifying liraglutide fibrils, wherein the method is:
a) The step of binding the antibody according to any one of claims 1 to 12 to liraglutide, and
b) Optional steps to detect antibodies bound to liraglutide fibrils, and
c) A method comprising optionally quantifying an antibody bound to liraglutide fibrils, optionally by use of said fibril standard.
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