JP2022523362A - 単一分子配列決定における使用のための拡張可能ポリマーの固体合成のための方法、組成物、およびデバイス - Google Patents
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Abstract
Description
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照により組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、870225_424WO_Sequence_Listing_ST25.txtである。テキストファイルは5KBで、2020年2月20日に作成され、EFS-Webを用いて電子的に提出されている。
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドとも呼ばれる「核酸」は、1つのヌクレオチドのペントースの3’位が、ホスホジエステル基によって次の5’位に連結されている、共有結合した一連のヌクレオチドである。核酸分子は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、または両方の組み合わせであり得る。DNA(デオキシリボ核酸)およびRNA(リボ核酸)は、ヌクレオチド残基が、ホスホジエステル結合によって特定の配列で連結された生物学的に存在するポリヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、または「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドの直鎖骨格を有する任意のポリマー化合物を包含する。オリゴマーとも呼ばれるオリゴヌクレオチドは、一般に、より短い鎖のポリヌクレオチドである。核酸は、配列決定を目的とする場合、一般に「標的核酸」、「標的配列」、「鋳型」または「ライブラリ断片」と呼ばれる。
固体合成によって増強できる例示的なプライマー伸長反応の1つは、Stratos Genomicsによって開発された「Sequencing by Expansion」(SBX)プロトコルの基礎を形成する「XNTP」として知られる非天然ヌクレオチド類似体の重合である(例えば、Kokoris et al.、米国特許第7,939,259号、「High Throughput Nucleic Acid Sequencing by Expansion」を参照のこと)。一般に、SBXは、この生化学的重合を使用して、DNA鋳型の配列を「Xpandomer」と呼ばれる測定可能なポリマー上に転写する。転写された配列は、約10nm離れた高シグナル対ノイズレポーターにおいてXpandomer骨格に沿ってコード化され、高シグナル対ノイズ、高分化応答のために設計される。これらの違いは、ネイティブDNAと比較して、Xpandomerの配列リード効率および精度の著しい性能向上を提供する。SBXプロセスの一般化された概要を図1A、図1B、図1C、および図1Dに示す。
本発明は、以下の例示的な実施形態に記載されるような特定の方法、装置、および組成物を使用することができる。
固体Xpandomer合成-マイクロ流体チップへのオリゴヌクレオチドの伸長直接コンジュゲーション
この実施例は、XNTPヌクレオチド類似体から構成される一本鎖ポリヌクレオチド鋳型の拡張可能なコピーであり、改善されたナノポア配列決定のための固有の特徴を有するXpandomerの固体合成を記載する。チップへの伸長オリゴヌクレオチド(「E-オリゴ」)の共有結合によって官能化されたマイクロ流体チップ基質上で、固体Xpandomer合成を行った。XNTPによる結合E-オリゴのポリメラーゼ媒介伸長は、チップに結合したままであり、効率的かつ制御された方法で洗浄、処理、および放出され得るXpandomer産物を生成する。
拡張による配列決定のための固体Xpandomer合成(SBX)
この実施例は、222mer鋳型のXpandomerコピーの固体合成およびプロセシング、続いてナノポアセンサーシステムを使用した産物の配列決定を記載する。配列決定前のワークフローの全ての工程を、Xpandomer中間体および基質に結合した最終産物を用いて行った。このプロトコルは、溶液ベースのワークフローを超える多くの利点、例えば、反応のそれぞれのための純粋な試薬を減少した体積で順次添加する能力を提供する。この実験では、E-オリゴの直接共有結合によってプライミングされたマイクロ流体チップ基質上でXpandomer伸長反応を行った。チップの機能化およびE-オリゴのクリック結合を実施例1に記載のように行った。
末端キャッピングによるXpandomer合成
この実施例は、合成中のXpandomer産物の末端キャッピングおよび異なる反応添加剤を用いたプロセスを最適化するための試みを記載する。以下の実験で使用した鋳型は、HIV2ゲノム由来の121mer配列であり、使用したE-オリゴ(「EO」)は、以下の特徴を有するE52 EOであった。リーダーポリマー、コンセントレータポリマー、および配列5’TCATAAGACGAACGGA 3’(配列番号4)を有するオリゴヌクレオチドプライマーによる5’SIMA(蛍光タグ)。末端キャップは、以下の配列、5’K[GCGTTAGGTCCCAGTGTTTAC(配列番号15)]X 3’を有する末端オリゴヌクレオチドを含み、式中、Kは、Gクランプを表し、Xは、PEG3部分を表す。末端オリゴヌクレオチドは、鋳型の5’末端と相補的であり、ハイブリダイズする。末端オリゴヌクレオチドの5’末端は、図7Aの特徴710Aに示されるリンカーを介してddCTPキャップに連結され、完全な末端キャップ構造を形成する。
末端キャッピングを用いた固体Xpandomer合成
この実施例は、全長産物の末端キャッピングと組み合わせた222merのXpandomerの固体合成を記載する。実施例1に記載されるように、基質への伸長オリゴヌクレオチド(「E-オリゴ」)の共有結合によって官能化されたマイクロ流体チップ基質上で固体合成を行った。鋳型の全長コピーが完了すると、DNAポリメラーゼは、鋳型の5’末端にハイブリダイズした末端キャップに遭遇し、末端キャップの5’末端をXpandomerの3’末端に結合する。末端キャップに結合した蛍光色素は、ゲル電気泳動による鋳型の全長コピーの可視化を可能にする。
鏡像化ライブラリ構築物-ライブラリインサートへのTridentアダプターの連結
この実施例は、本発明の鏡像化ライブラリ構築物を生成する際の最初の工程を記載し、ここで、三つ又アダプターは、二本鎖DNAのライブラリ断片に連結される。図24Aは、この実験で使用した構築物の基本的な構造的特徴を示す。ライブラリ断片は、HIV2ゲノムに由来する二本鎖60mer配列であり、「マイナス」鎖(図のトップ鎖に対応する)および「プラス」鎖(図のボトム鎖に対応する)は、3’一塩基オーバーハングを組み込む。ライブラリ鎖の極性は、図中に「5’」の番号で示されている。三つ又アダプターは、図24Aに示すように、3本のDNA鎖で構成されており、各鎖の極性は「3’」の番号で示されている。三つ又のトップ鎖およびボトム鎖は、同一の配列を有する24merのオリゴヌクレオチドであるが、中間鎖を含むオリゴヌクレオチドの配列は、トップ鎖配列およびボトム鎖配列の逆相補体である。トップ鎖およびボトム鎖はまた、ライブラリ断片への指向性連結を可能にする3’一塩基オーバーハングを有する。3本の鎖の5’末端は、化学分岐剤によって一緒に連結されて、三つ又アダプターを形成し、中間鎖およびボトム鎖は二本鎖ハイブリッドを形成し、一方、トップ鎖は一本鎖のままである。
鏡像化ライブラリ構築物-鏡像化ライブラリ構築物を生成するための三つ又アダプターおよびエキソヌクレアーゼ消化からの伸長
この実施例は、図25Aに簡略化された形で示されている、鏡像化ライブラリ構築物を生成する際の伸長および消化工程を説明する。伸長工程では、M1構築物の三つ又アダプターの一本鎖のトップ鎖をDNAポリメラーゼによる伸長プライマーとして使用し、ライブラリ断片を鋳型としてDNAの新しい鎖を合成する。M1構築物の伸長は、図中にM2構築物を生成する。次いで、消化工程のために、M2の元の鋳型鎖(5’表記で示す)をエキソヌクレアーゼ処理によって除去して、M3構築物を生成する。M3は、ライブラリ断片「プラス」鎖の2つの同一の一本鎖コピーを含み、「鏡像化ライブラリ構築物」と呼ばれる。
M1鏡像化ライブラリ構築物の固体合成
この実施例は、固体支持体上にM1構築物を構築するためのワークフローを記載する。ワークフローを簡略化して図26Aに示す。以下の実験では、Yアダプター(「YAD」)を、クリックケミストリーを用いて支持体に最初に共有結合させた。次いで、ライブラリ断片および三つ又アダプターを結合YADに連結して、支持体上にM1構築物を生成した。YADと支持体との間の感光性結合の切断によって、M1が最終的に支持体から放出された。
鏡像化ライブラリ構築物の拡張による配列決定
この実施例は、拡張による鏡像化ライブラリ配列決定(SBX)の概念実証を示す。この実験における出発材料は、実施例7に記載のHIV2 60merライブラリ断片の周りに構築されたM1産物であった。M2産物を生成するための伸長条件は以下の通りであった。Thermopol反応緩衝液中約7.5pmol M1産物、0.2mM dNTPおよび0.16U/μL Ventポリメラーゼ。反応物 37.3μLを95℃で2分間インキュベートし、次いで95℃で15秒間および72℃で6秒間の25サイクルに供した。M3産物を生成するためのM2消化条件は以下の通りであった。伸長反応物 36.68μLを、ラムダエキソ緩衝液中0.26U/μL ラムダエキソヌクレアーゼで処理した。反応を37℃で5分間行い、次いで、熱不活性化して、M3鏡像化ライブラリ構築物を生成した。
耐酸性磁気ビーズ上の末端キャッピングを用いた固体Xpandomer合成
この実施例は、ビーズ上のXpandomerの固体合成が、溶液中での合成と少なくとも同程度に効率的であることを実証する。4つの異なるXpandomer合成反応を行った。1)溶液中合成(伸長オリゴヌクレオチド上の蛍光SIMA色素);2)末端キャッピングなしのビーズ上合成(伸長オリゴヌクレオチド上の色素);3)末端キャッピングによるオンビーズ合成(末端キャップ末端オリゴヌクレオチド上の色素);4)末端キャップの代わりにブロッカーオリゴヌクレオチドを用いたオンビーズ合成。この実験で使用した伸長オリゴヌクレオチドは、以下の配列を有していた。5’[アジド]D10[PC-スペーサー]L25Z6[TCATAAGACGAACGGA(配列番号4)]3’、(式中、「PC」は、光切断性スペーサーを表す。;「D」は、PEG6スペーサーを表す。「L」は、C2スペーサーを表す。「Z」は、C12スペーサーを示す)。本明細書および図5を参照して考察するように、ビーズをアルキン基で官能化し、伸長オリゴヌクレオチドに共有結合させた。4pmolのオンビーズ伸長オリゴヌクレオチドを4pmolの100mer鋳型DNA+/-末端キャップオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。反応3に含まれる末端キャップは、以下の配列を有していた。3’ ddCTPRK[GCGTTAGGTCCCAGTTTTAC(配列番号17)]W 5’および反応4に含まれるブロッカーオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有していた。3’ RK[GCGTTAGGTCCCAGTGTTTTAC(配列番号18)]×5’、式中、「R」は、アミダイトを表し、「K」は、Gクランプを表し、「W」は、SIMA色素を表し、「X」は、PEG3を表す。鋳型DNAに対して2倍モル過剰のキャップまたはブロッカーオリゴを使用した。全ての伸長反応は、以下を含んでいた。50mM Tris-HCl、200mM NH4OAc、20% PEG、1M 尿素(反応4については0.25M)、5% NMS、10mM PEM、0.26μg/ul DPO4ポリメラーゼ変異体、1.6mM MnCl2、100μM dXTPおよび300μM ポリリン酸。反応3および4には0.02% Tweenも含まれ、反応4には0.5M ベタインも含まれていた。伸長反応を37℃で60分間行い、図30に示すように、伸長産物をゲル電気泳動によって分析した。図から分かるように、オンビーズ伸長(レーン2)は、溶液中伸長(レーン1)と同程度に効率的である。さらに、末端キャッピングオンビーズ(レーン3、末端キャップ上の色素)も非常に効率的である。
耐酸性磁気ビーズ上での固体Xpandomerの合成およびプロセシング
この実施例は、Xpandomerの効率的なオンビーズ合成およびプロセシングを実証する。プライマー伸長反応後、Xpandomer産物を酸処理によって処理してホスホルアミデート結合を切断し、拡張したポリマーを生成した。拡張産物を光切断によってビーズから放出し、ゲル電気泳動によって分析した。
Claims (35)
- 固体支持体上に核酸鋳型のコピーを合成する方法であって、
(a)リンカーを前記固体支持体上に固定化する工程であって、前記リンカーは、前記固体支持体に近位の第1の末端と、前記固体支持体に遠位の第2の末端とを含み、前記第1の末端はマレイミド部分に結合されており、前記第2の末端はアルキン部分に結合されており、前記マレイミド部分は前記固体支持体に架橋されている、固定化する工程と、
(b)前記リンカーにオリゴヌクレオチドプライマーを結合させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記核酸鋳型の3’末端の一部に相補的な核酸配列を含み、前記オリゴヌクレオチドプライマーの5’末端が、アジド部分にカップリングされ、前記アジド部分が、前記アルキン部分と反応してトリアゾール部分を形成する、結合させる工程と、
(c)前記核酸鋳型、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド基質、またはその類似体、適切な緩衝液、および任意に1つ以上の添加剤を含む反応混合物を提供する工程であって、前記核酸鋳型が、前記オリゴヌクレオチドプライマーに特異的にハイブリダイズする、提供する工程と、
(d)プライマー伸長反応を行って前記核酸鋳型の前記コピーを生成する工程と、を含む方法。 - 前記マレイミド部分が、光開始プロトン引き抜き反応によって前記固体基質に架橋される、請求項1に記載の方法。
- 前記固体基質が、ポリオレフィンから構成される、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリオレフィンが、環状オレフィンコポリマー(COC)またはポリプロピレンである、請求項3に記載の方法。
- 前記核酸鋳型が、DNA鋳型である、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA鋳型のコピーが、拡張可能ポリマーであり、前記拡張可能ポリマーが、非天然ヌクレオチド類似体の鎖を含み、非天然ヌクレオチド類似体のそれぞれが、ホスホルアミデートエステル結合によって隣接する非天然ヌクレオチド類似体に作動可能に連結されている、請求項5に記載の方法。
- 前記拡張可能ポリマーが、Xpandomerである、請求項6に記載の方法。
- 前記リンカーが、前記第1の末端と前記第2の末端との間に介在するスペーサーアームをさらに含み、前記スペーサーアームが、エチレングリコールの1つ以上のモノマーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記リンカーが、切断可能部分をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記固体支持体が、ビーズ、チューブ、キャピラリー、およびマイクロ流体チップからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 核酸標的配列のコピーの3’末端を選択的に改変する方法であって、
(a)前記核酸標的配列の第1の配列に相補的な配列を有する第1のオリゴヌクレオチドと、前記核酸標的配列の第2の配列に相補的な配列を有する第2のオリゴヌクレオチドとを提供する工程であって、前記核酸標的配列の前記第1の配列が、前記核酸標的配列の前記第2の配列に対して3’であり、前記第1のオリゴヌクレオチドが、核酸ポリメラーゼのための伸長プライマーを提供し、前記第2のオリゴヌクレオチドの5’末端が、ジデオキシヌクレオシド5’三リン酸に作動可能に連結され、前記ジデオキシヌクレオシド5’三リン酸が、前記核酸ポリメラーゼの基質を提供する、提供する工程と、
(b)前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチド、前記核酸標的配列、前記核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド基質、またはその類似体、適切な緩衝液、および任意に1つ以上の添加剤を含む反応混合物を提供する工程であって、前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記核酸標的配列に特異的にハイブリダイズする、提供する工程と、
(c)プライマー伸長反応を行って、前記標的配列の前記コピーを生成する工程であって、前記第2のオリゴヌクレオチドの5’末端が、前記核酸ポリメラーゼによって前記核酸標的配列の前記コピーの3’末端に作動可能に連結されている、生成する工程と、を含む方法。 - 前記ジデオキシヌクレオシド5’三リン酸が、可動性リンカーによって前記第2のオリゴヌクレオチドの5’末端に作動可能に連結されている、請求項11に記載の方法。
- 前記可動性リンカーが、1つ以上のヘキシル(C6)モノマーを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドが、1つ以上の2’メトキシリボ核酸類似体を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドの3’末端が、第1の固体支持体に固定化されている、請求項11に記載の方法。
- 前記第1の固体支持体を洗浄して、前記第2のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結された前記核酸標的の前記コピーを精製する工程をさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドが、第1の固体支持体に固定化されている、請求項11に記載の方法。
- 前記核酸標的配列の前記コピーを前記第1の固体支持体から放出させる工程、および前記核酸標的配列の前記コピーを第3のオリゴヌクレオチドと接触させる工程をさらに含み、前記第3のオリゴヌクレオチドが、前記第2のオリゴヌクレオチドの前記配列と相補的な配列を有し、前記第3のオリゴヌクレオチドが、前記第2のオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、前記第3のオリゴヌクレオチドの5’末端が、第2の固体支持体上に固定化される、請求項17に記載の方法。
- 前記第2の固体支持体を洗浄して、3’末端で前記第2のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結された前記核酸標的配列の前記コピーを精製する工程をさらに含む、請求項18に記載の方法。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記核酸標的配列に対する前記第2のオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させる1つ以上のヌクレオチド類似体を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記核酸標的配列の5’末端に作動可能に連結された異種核酸配列に相補的である、請求項11に記載の方法。
- 前記核酸標的配列が、一本鎖DNAであり、前記標的配列の前記コピーが、拡張可能ポリマーであり、前記拡張可能ポリマーが、非天然ヌクレオチド類似体の鎖を含み、前記非天然ヌクレオチド類似体のそれぞれが、ホスホルアミデートエステル結合によって隣接する非天然ヌクレオチド類似体に作動可能に連結されている、請求項11に記載の方法。
- 前記第1の固体支持体および前記第2の固体支持体が、ビーズ、チューブ、キャピラリー、およびマイクロ流体チップからなる群から選択される、請求項11または請求項18に記載の方法。
- 一本鎖DNA鋳型構築物のライブラリを生成する方法であって、前記鋳型構築物のそれぞれが、DNA標的配列の同じ鎖の2つのコピーを含み、前記方法が、
(a)DNA Yアダプターの集団を提供する工程であって、前記Yアダプターのそれぞれが、第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドを含み、前記第1のオリゴヌクレオチドの3’領域および前記第2のオリゴヌクレオチドの5’領域が、配列相補性によって二本鎖領域を形成し、前記第1のオリゴヌクレオチドの5’領域および前記第2のオリゴヌクレオチドの3’領域が、一本鎖であり、オリゴヌクレオチドプライマーの結合部位を含み、前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖領域の末端が、任意に固体基質上に固定化されている、提供する工程と、
(b)二本鎖DNA分子の集団を提供する工程であって、前記二本鎖DNA分子のそれぞれが、第1の鎖および第2の鎖を含み、前記二本鎖DNA分子のそれぞれの第1の末端が、前記Yアダプターの前記二本鎖末端と適合する、提供する工程と、
(c)キャッププライマーアダプターの集団を提供する工程であって、前記キャッププライマーアダプターのそれぞれが、第1のオリゴヌクレオチド、第2のオリゴヌクレオチド、および第3のオリゴヌクレオチドを含み、前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記第1のオリゴヌクレオチドと前記第3のオリゴヌクレオチドとの間に介在し、前記第1のオリゴヌクレオチド、第2のオリゴヌクレオチド、および第3のオリゴヌクレオチドが、化学分岐剤によって前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第3のオリゴヌクレオチドの5’末端および前記第2のオリゴヌクレオチドの3’末端に作動可能に連結され、前記第1のオリゴヌクレオチドの配列の一部が、前記第3のオリゴヌクレオチドの配列の一部と同一であり、前記第2のオリゴヌクレオチドの配列の一部が、前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第3のオリゴヌクレオチドの配列の一部の逆相補体であり、前記第2のオリゴヌクレオチドの5’末端および前記第3のオリゴヌクレオチドの3’末端が、前記二本鎖DNA分子のそれぞれの第2の末端と適合する二本鎖領域を形成する、提供する工程と、
(d)前記二本鎖DNA分子のそれぞれの前記第2の末端を、前記キャッププライマーアダプターのうちの1つの前記第2のオリゴヌクレオチドの5’末端および前記第3のオリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程と、
(e)前記二本鎖DNA分子のそれぞれの前記第1の末端を、前記DNA Yアダプターのうちの1つの前記二本鎖末端に連結する工程と、
(f)前記連結されたキャッププライマーアダプターのそれぞれの前記第1のオリゴヌクレオチドの3’末端からDNAポリメラーゼを用いて伸長する工程であって、前記連結された二本鎖DNA分子の前記第1の鎖が、前記DNAポリメラーゼの鋳型を提供し、前記DNAポリメラーゼが、前記二本鎖DNA分子の前記第1の鎖の配列と前記Yアダプターの前記第1のオリゴヌクレオチドの配列との逆相補体を含む第3の鎖を生成する、伸長する工程と、
(g)前記連結されたYアダプターの前記第1のオリゴヌクレオチドのそれぞれの5’末端からエキソヌクレアーゼで消化する工程であって、前記消化することが、前記第1のオリゴヌクレオチド、前記二本鎖DNA分子の前記第1の鎖、および前記キャッププライマーアダプターの前記第2のオリゴヌクレオチドを除去して、一本鎖鋳型構築物を生成し、前記一本鎖鋳型構築物のそれぞれが、前記二本鎖DNA分子の前記第2の鎖の配列をそれぞれが含む2つの鋳型分子を含み、前記2つの鋳型分子が、前記キャッププライマーアダプターの前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第3のオリゴヌクレオチドによって作動可能に連結されている、消化する工程と、を含む方法。 - 一本鎖DNA鋳型構築物のライブラリであって、前記鋳型構築物のそれぞれが、DNA標的配列の同じ鎖の第1のコピーおよび第2のコピーを含み、前記標的配列の前記第1のコピーおよび前記第2のコピーが作動可能に連結されており、前記一本鎖DNA鋳型構築物のライブラリが、請求項24に記載の方法によって生成される、一本鎖DNA鋳型構築物のライブラリ。
- 鏡像化されたXpandomer分子のライブラリを生成する方法であって、前記Xpandomer分子のそれぞれが、DNA標的配列の同じ鎖の2つのコピーを含み、前記方法が、
(a)請求項25に記載の一本鎖DNA鋳型構築物の前記ライブラリを提供する工程と、
(b)前記Yアダプターの前記第1の鎖の前記一本鎖部分に相補的な第1の伸長オリゴヌクレオチドの集団と、前記Yアダプターの前記第2の鎖の前記一本鎖部分に相補的な第2の伸長オリゴヌクレオチドの集団と、を提供する工程であって、前記第1の伸長オリゴヌクレオチドまたは前記第2の伸長オリゴヌクレオチドが、任意に固体基質上に固定化される、提供する工程と、
(c)一本鎖DNA鋳型構築物の前記ライブラリを前記第1の伸長オリゴヌクレオチドの前記集団および前記第2の伸長オリゴヌクレオチドの前記集団に特異的にハイブリダイズさせる工程と、
(d)キャップ分岐構築物の集団を提供する工程であって、前記キャップ分岐構築物が、第2のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結された第1のオリゴヌクレオチドを含み、前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記キャッププライマーアダプター構築物の前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第3のオリゴヌクレオチドの配列の一部に相補的な配列を含み、前記キャップ分岐構築物の前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドが、遊離5’ヌクレオシド三リン酸部分を提供する、提供する工程と、
(e)前記キャップ分岐構築物の集団を、前記一本鎖DNA鋳型構築物の集団に特異的にハイブリダイズさせる工程と、
(f)プライマー伸長反応を行って、前記DNA標的配列の前記第1のコピーおよび前記第2のコピーのXpandomerコピーを生成する工程であって、前記Xpandomerコピーが、前記キャップ分岐構築物によって作動可能に連結されている、生成する工程と、を含む方法。 - 固体支持体上にタグ付けされた二本鎖DNAアンプリコンのライブラリを生成する方法であって、
(a)二本鎖DNA分子の集団を提供する工程であって、前記二本鎖DNA分子のそれぞれが、第2の鎖に特異的にハイブリダイズした第1の鎖を含む、提供する工程と、
(b)順方向PCRプライマーおよび逆方向PCRプライマーを提供する工程であって、前記順方向PCRプライマーが、前記二本鎖DNA分子の前記第2の鎖(stand)の3’末端の一部に相補的な3’配列に作動可能に連結された第1の5’異種タグ配列を含み、前記逆方向PCRプライマーが、前記二本鎖DNA分子の前記第1の鎖の3’末端の一部に相補的な3’配列に作動可能に連結された第2の5’異種タグ配列を含む、提供する工程と、
(c)二本鎖DNA分子の前記集団が増幅されて第1のDNAアンプリコン産物の集団を生成し、前記第1のDNAアンプリコン産物が、第1の末端に前記第1の異種配列タグを含み、第2の末端に第2の異種配列タグを含む、第1のPCR反応を行う工程と、
(d)固体支持体上に固定化された捕捉オリゴヌクレオチド構造を提供する工程であって、前記捕捉オリゴヌクレオチド構造が、第1の末端および第2の末端を含み、前記第1の末端が前記固体支持体に共有結合しており、前記第2の末端が、前記第1のDNAアンプリコン産物の集団の前記第2の異種配列タグの一部に相補的な配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドを含み、前記捕捉オリゴヌクレオチド構造が、前記第1の末端と前記捕捉オリゴヌクレオチドとの間に介在した切断可能エレメントをさらに含む、提供する工程と、
(e)前記第1のDNAアンプリコン産物の集団と、前記第1の異種配列タグの一方の鎖の配列に相補的な配列を含む順方向プライマーと、前記第2の異種配列タグの一方の鎖に相補的な配列を含む逆方向プライマーと、を含む第2のPCR反応を行う工程であって、前記第1のDNAアンプリコン産物の集団の第1の鎖が、前記捕捉オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、前記第2のPCR反応が、固定化DNAアンプリコン産物の集団を生成し、前記固定化DNAアンプリコン産物の第2の鎖が、前記固体支持体に作動可能に連結されている、第2のPCR反応を行う工程と、を含む方法。 - 一本鎖DNA鋳型構築物のライブラリを生成する方法であって、前記鋳型構築物のそれぞれが、DNA標的配列の同じ鎖の2つのコピーを含み、前記方法が、
(a)請求項27に記載の固体支持体上に固定化されたDNAアンプリコン産物のライブラリを提供する工程と、
(b)キャッププライマーアダプターの集団を提供する工程であって、前記キャッププライマーアダプターのそれぞれが、第1のオリゴヌクレオチド、第2のオリゴヌクレオチド、および第3のオリゴヌクレオチドを含み、前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記第1のオリゴヌクレオチドと前記第3のオリゴヌクレオチドとの間に介在し、前記第1のオリゴヌクレオチド、前記第2のオリゴヌクレオチド、および前記第3のオリゴヌクレオチドが、化学分岐剤によって前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第3のオリゴヌクレオチドの5’末端および前記第2のオリゴヌクレオチドの3’末端に作動可能に連結され、前記第1のオリゴヌクレオチドの配列の一部が、前記第3のオリゴヌクレオチドの配列の一部と同一であり、前記第2のオリゴヌクレオチドの配列の一部が、前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第3のオリゴヌクレオチドの配列の一部の逆相補体であり、前記第2のオリゴヌクレオチドの5’末端および前記第3のオリゴヌクレオチドの3’末端が、前記タグ付けされた固定化DNAアンプリコン産物のそれぞれの遊離末端と適合する二本鎖領域を形成する、提供する工程と、
(c)前記固定化DNAアンプリコン産物のそれぞれの遊離末端を、前記キャッププライマーアダプターの前記第2のオリゴヌクレオチドの5’末端および前記第3のオリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程と、
(d)前記キャッププライマーアダプターの前記第1のオリゴヌクレオチドのそれぞれの3’末端からDNAポリメラーゼを用いて伸長する工程であって、前記固定化DNAアンプリコン産物の前記第2の鎖が、前記DNAポリメラーゼの鋳型を提供し、前記DNAポリメラーゼが第3の鎖を生成し、前記第3の鎖が前記第2の鎖のコピーである、伸長する工程と、
(e)前記捕捉オリゴヌクレオチド構造のそれぞれの前記切断可能エレメントを切断する工程であって、前記固体支持体から前記DNAアンプリコン産物を放出し、前記DNAアンプリコン産物のそれぞれの前記第2の鎖上に遊離5’末端を生成する、切断する工程と、
(f)前記DNAアンプリコン産物のそれぞれの切断された前記第2の鎖の前記遊離5’末端からエキソヌクレアーゼで消化する工程であって、前記DNAアンプリコン産物の前記第2の鎖および前記キャッププライマーアダプターの前記第2のオリゴヌクレオチドを除去して、一本鎖鋳型構築物のライブラリを生成し、前記一本鎖鋳型構築物のそれぞれが、前記キャッププライマーアダプターの前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第3のオリゴヌクレオチドによって作動可能に連結された前記DNAアンプリコン産物の前記第1の鎖の2つのコピーを含む、消化する工程と、を含む方法。 - 一本鎖DNA鋳型構築物のライブラリであって、前記鋳型構築物のそれぞれが、DNA標的配列の同じ鎖の第1のコピーおよび第2のコピーを含み、前記DNA標的配列の前記第1のコピーおよび前記第2のコピーが作動可能に連結されており、前記一本鎖DNA鋳型構築物のライブラリが、請求項28に記載の方法によって生成される、一本鎖DNA鋳型構築物のライブラリ。
- 鏡像化されたXpandomer分子のライブラリを生成する方法であって、前記Xpandomer分子のそれぞれが、DNA標的配列の同じ鎖の2つのコピーを含み、前記方法が、
(a)請求項29に記載の一本鎖DNA鋳型構築物のライブラリを提供する工程と、
(b)前記DNAアンプリコン産物の前記第2のタグに相補的な伸長オリゴヌクレオチドの集団を提供する工程であって、前記伸長オリゴヌクレオチドが、固体基質上に固定化されている、提供する工程と、
(c)前記一本鎖DNA鋳型構築物を前記伸長オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズさせる工程と、
(d)キャップ分岐構築物の集団を提供する工程であって、前記キャップ分岐構築物が、第2のオリゴヌクレオチドに作動可能に連結された第1のオリゴヌクレオチドを含み、前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記キャッププライマーアダプター構築物の前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第3のオリゴヌクレオチドの配列の一部に相補的な配列を含み、前記キャップ分岐構築物の前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドが、遊離5’ヌクレオシド三リン酸部分を提供する、提供する工程と、
(e)前記キャップ分岐構築物の集団を前記DNA鋳型構築物の集団と特異的にハイブリダイズさせる工程と、
(f)プライマー伸長反応を行って、前記DNA標的配列の第1のコピーおよび第2のコピーのXpandomerコピーを生成する工程であって、前記Xpandomerコピーが、前記キャップ分岐構築物に作動可能に連結されている、生成する工程と、を含む方法。 - 前記捕捉オリゴヌクレオチド構造および前記伸長オリゴヌクレオチドが、同じ固体支持体上に固定化され、前記伸長オリゴヌクレオチドが、切断可能なヘアピン構造を含み、前記切断可能なヘアピン構造が、前記切断する工程中に切断されて、前記DNAアンプリコン産物の結合部位を提供する、請求項30に記載の方法。
- 前記捕捉オリゴヌクレオチド構造が、マイクロ流体カードの第1のチャンバの第1の基質上に固定化され、前記伸長オリゴヌクレオチドが、前記マイクロ流体カードの第2のチャンバの第2の基質上に固定化され、前記第1のチャンバが、前記一本鎖DNA鋳型構築物の集団を生成するように構成され、前記第2のチャンバが、前記一本鎖DNA鋳型構築物のXpandomerコピーの集団を生成するように構成される、請求項30に記載の方法。
- 前記捕捉オリゴヌクレオチド構造が、ビーズ支持体上に固定化され、前記伸長オリゴヌクレオチドがCOCチップ支持体上に固定化され、前記ビーズ支持体が、一本鎖DNA鋳型構築物の集団を生成するように構成され、前記COCチップ支持体が、前記DNA鋳型構築物のXpandomerコピーの集団を生成するように構成される、請求項30に記載の方法。
- 前記捕捉オリゴヌクレオチド構造および前記伸長オリゴヌクレオチドが、ビーズ支持体上に固定化され、前記ビーズ支持体が、前記一本鎖DNA鋳型構築物の集団および前記DNA鋳型構築物のXpandomerコピーの集団を生成するように構成される、請求項30に記載の方法。
- 前記伸長オリゴヌクレオチドが、分岐オリゴヌクレオチド構造によって提供され、前記分岐オリゴヌクレオチド構造が、化学分岐剤によって第2の伸長オリゴヌクレオチドに作動可能に連結された第1の伸長オリゴヌクレオチドを含み、前記第1の伸長オリゴヌクレオチドが、リーダー配列と、コンセントレータ配列と、前記化学分岐剤と前記リーダー配列および前記コンセントレータ配列との間に介在する第1の切断可能部分と、を含み、前記第2の伸長オリゴヌクレオチドが、第2の切断可能部分を含む、請求項30に記載の方法。
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