JP2022519116A - がん療法において使用するためのデオキシシチジン誘導体又はデオキシウリジン誘導体 - Google Patents
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Abstract
Description
1)アバスチン(Avastin)(登録商標)(ベバシズマブ)-複数の腫瘍学適応症を持つ血管新生阻害剤。アバスチン(Avastin)(登録商標)は、腫瘍内の新たな血管の発生を阻害し、腫瘍を効果的に飢えさせることにより、腫瘍成長を阻害すると考えられている。アバスチン(Avastin)(登録商標)は米国及び日本において承認されているが、アバスチン(Avastin)(登録商標)は欧州連合におけるGBM処置には承認されていない。実際に、第II相試験は、アバスチン(Avastin)(登録商標)が全生存利益をもたらさないことを指し示した(NCI 06-C-0064E)。アバスチン(Avastin)(登録商標)は一部の試験において無増悪生存期間をわずかに改善するが、患者の利益は多くの場合ごくわずかであり、再発性多形性膠芽腫患者においてアバスチン(Avastin)(登録商標)処置によって与えられる利益はない。
2)テモゾロミド(Temodal(登録商標)/Temodar(登録商標))(4-メチル-5-オキソ-2,3,4,6,8-ペンタアザビシクロ[4.3.0]ノナ-2,7,9-トリエン-9-カルボキサミド)-変異原性DNAアルキル化剤;ジェネリック製剤も利用可能である。テモゾロミドは、細胞死を誘発する腫瘍DNAを著しく突然変異させることにより、多形性膠芽腫成長を阻害すると考えられる。作用機序により、DNA修復タンパク質MGMTを発現する細胞は、テモゾロミド処置に対してほぼ例外なく抵抗性である。テモゾロミド処置は、全生存を2.5か月だけ改善する。同時に、テモゾロミド処置は、多くの場合、有意な副作用を引き起こす。テモゾロミドは、多形性膠芽腫のための一次処置である。
3)ギリアデル(gliadel)(登録商標)(カルムスチンウエハー)(1,3-ビス(2-クロロエチル)-1-ニトロソ尿素)-細胞毒性ナイトロジェンマスタード。これは、外科的切除後、脳に直接的に移植された生分解性ディスクとして送達される。無作為化試験は、ギリアデル(gliadel)(登録商標)が生存期間の中央値を2.1か月だけ改善することを実証した。ギリアデル(gliadel)(登録商標)で処置した患者は、テモゾロミド処置患者よりも少なく重症度の低い副作用を報告するが、テモゾロミドと比較して全生存が低減する。
Xは、アルデヒド、アルコール、保護されたアルコール、エーテル、エステル及びカルボン酸から選択される少なくとも1つの官能基を含有する、1から20個までの非水素原子を含有する基であり、但し、Xは、-COOHではなく、
W1及びW2は、それぞれ独立して、O、S又はNHであり、
Yは、H、又は1から15個までの非水素原子を含有する基であり、
Zは、-OPG、-ORz又は-N(RxRy)であり、ここで、Rx、Ry及びRzは、独立して、H、又は1から10個までの非水素原子を含有する基であり、
R1は、H、又は1から15個までの非水素原子を含有する基であり、
R2は、H、-OH、-OPG、-F、-Cl、-Br、-I又は-N3であり、
R3は、H、-F、-Cl、-Br、-I又は-N3であり、
ここで、PGは、アセチル(Ac)、ベンジル(Bn)又はベンゾイル(Bz)等のアルコール保護基である]
の化合物、又はその立体異性体、溶媒和物、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩
を提供する。
Xは、アルデヒド、アルコール、保護されたアルコール、エーテル、エステル及びカルボン酸から選択される少なくとも1つの官能基を含有する、1から20個までの非水素原子を含有する基であり、但し、Xは、-COOHではなく、
W1及びW2は、それぞれ独立して、O、S又はNHであり、
Yは、H、又は1から15個までの非水素原子を含有する基であり、
Zは、-OPG、-ORz又は-N(RxRy)であり、ここで、Rx、Ry及びRzは、独立して、H、又は1から10個までの非水素原子を含有する基であり、
R1は、H、又は1から15個までの非水素原子を含有する基であり、
R2は、H、-OH、-OPG、-F、-Cl、-Br、-I又は-N3であり、
R3は、H、-F、-Cl、-Br、-I又は-N3であり、
ここで、PGは、アセチル(Ac)、ベンジル(Bn)又はベンゾイル(Bz)等のアルコール保護基である]
の化合物、又はその立体異性体、溶媒和物、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩
を提供する。
Xは、アルデヒド、アルコール、保護されたアルコール、エーテル、エステル及びカルボン酸から選択される少なくとも1つの官能基を含有する、1から20個までの非水素原子を含有する基であり、但し、Xは、-COOHではない。
Lは、結合、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシであり、
X'は、-CHO、-OH、-OPG、-COOH、-OR、-OC(=O)R又は-C(=O)ORであり、ここで、PGは、アセチル(Ac)、ベンジル(Bn)又はベンゾイル(Bz)等のアルコール保護基であり、ここで、Rは、アルキル基、好ましくはメチルである。
W1及びW2は、それぞれ独立して、O、S又はNH、好ましくはO又はS、より好ましくはOである。
Yは、H、又は1から15個の非水素原子を含有する基である。好ましくは、Yは、H、又は1から10個の非水素原子を含有する基である。より好ましくは、Yは、H、又は1から5個の非水素原子を含有する基である。
Zは、-OPG、-ORz又は-N(RxRy)であり、ここで、Rx、Ry及びRzは、独立して、H、又は1から10個の非水素原子を含有する基であり、ここで、PGは、アセチル、ベンジル又はベンゾイル等のアルコール保護基である。
R1は、H、又は1から15個の非水素原子を含有する基、好ましくはH、又は1から13個の非水素原子を含有する基である。
R2は、H、-OH、-OPG、-F、-Cl、-Br、-I又は-N3であり、ここで、PGは、アセチル、ベンジル又はベンゾイル等のアルコール保護基である。
R3は、H、-F、-Cl、-Br、-I又は-N3、好ましくはHである。
の化合物、又はその立体異性体、溶媒和物、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩である。
の化合物又はその立体異性体、溶媒和物、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩である。
i)乳がんではなく、好ましくは膵臓がん、胃がん、精巣がん若しくは膣がんでもなく、より好ましくは腸のがんでもなく;及び/又は
ii)肝臓がん、乳がん、卵巣がん若しくは子宮頸がんでもない。
i)浸潤性乳管癌であり、且つ/又は
ii)野生型p53を発現し、且つ/又は
iii)トリプルネガティブではない、すなわち、エストロゲン受容体(ER+)、プロゲステロン受容体(PR+)及びHER2(HER2+)のうちの1つ又は複数を発現し、好ましくはER+及びPR+であり、且つ/又は
iv)p53に対してヘテロ接合性である。
i)腺癌であり、且つ/又は
ii)トリプルネガティブである、すなわち、エストロゲン受容体(ER-)、プロゲステロン受容体(PR-)又はHER2(HER2-)を発現せず、且つ/又は
iii)p53の突然変異バリアントを発現し、且つ/又は
iv)p53に対してホモ接合性である
乳がんのみである。
i)過剰発現されている、
ii)過剰発現されていない、
iii)過少発現されている、
iv)過少発現されていない、
v)過剰発現若しくは過少発現されている、又は
vi)過剰発現も過少発現もされていない
ものである。
1)目的のがん/腫瘍細胞からRNAを抽出するステップであって、前記抽出が、好ましくは、Norgen全RNA精製キット(Norgen Biotek社カタログ番号17200)を使用して実施されるステップ、
2)好ましくはMEGAピュアキットを製造業者の説明書(Ambion社)に従って使用して、抽出されたRNAからポリ(A)+RNAを調製するステップ、
3)逆転写酵素による処理によりポリ(A)+RNAから相補的DNA(cDNA)を調製するステップ、すなわち逆転写を実施するステップ、
4)TdT(末端デオキシヌクレオチド転移酵素)を使用してcDNAをフラグメント化するステップ、
5)GeneChipWT末端標識キット(Affymetrix社)を使用してcDNAフラグメントをビオチン化するステップ、
6)参照細胞株を用いてステップ1から5を繰り返すステップであって、前記参照細胞株がMDA-MB-231であるステップ、
7)ステップ5で取得された5.5μgのビオチン化cDNAフラグメントを、45℃で16時間にわたって第一のDNAマイクロアレイにハイブリダイズし、ステップ6で取得された5.5μgのビオチン化cDNAフラグメントを、45℃で16時間にわたってDNAマイクロアレイにハイブリダイズするステップであって、好ましくは、前記マイクロアレイがAffymetrix社GeneChipヒト遺伝子2.0STアレイ(Applied Biosystems社)であるステップ、
8)ハイブリダイズされたマイクロアレイを、好ましくはAffymetrix社GeneChipフルイディクスステーション450(Applied Biosystems社)中で洗浄及び染色するステップ、
9)前記染色されたマイクロアレイを、Affymetrix GeneChip Command Console(登録商標)ソフトウェアを利用するAffymetrix社GeneChipスキャナー3000 7Gを用いてスキャンして、生データシグナル値をCELファイルの形態で生成するステップ、
10)Affymetrix社ソフトウェアパッケージ(バージョン1.36.1)においてロバストマルチアレイアベレージ(RMA)の実装を使用して、好ましくはR. A. Irizarryら、Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics 4, 249~264(2003)において記述されている通りに、CELファイルを正規化して、遺伝子レベル発現値を生成するステップ、
11)affyPLMパッケージ(バージョン1.34.0)を使用して、相対対数発現(RLE)及び正規化非スケール化標準誤差(NUSE)を計算することにより、アレイの品質を評価するステップ。affyPLMパッケージからの出力は、RLE及びNUSE分布両方の箱ひげ図である。RLE箱ひげ図が0を中心として展開していないアレイ及びNUSE箱ひげ図が1を中心として展開していないアレイは、低品質としてフラグ付けされ、その後の分析から除外される。アレイが除外された場合、方法の前ステップが繰り返される。
12)ゼロの平均及び1の標準偏差まですべての試料にわたって正規化された発現値を持つPrcomp R関数を使用して主成分分析(PCA)を実施するステップ。PCAは、データにおける変動のほとんどを保持しながら遺伝子発現データセットの高次元性を削減するための次元削減法として使用される。故に、PCAの性能は、ダウンストリーム分析及び視覚化についてのデータのより低次元の表現を実現する。
13)limmaパッケージ(バージョン3.14.4、http://bioinf.wehi.edu.au/limma)で実装されるモデレート(経験的ベイズ法)t検定を使用して、目的のがん/腫瘍細胞における及び参照細胞株MDA-MB-231におけるCDAの差次的発現を評価するステップ、
ここで、マイクロアレイ分析ステップ10から13は、統計的計算のためのR環境(バージョン2.15.1)を使用して実施される。
1.目的のがん/腫瘍細胞から全RNAを抽出するステップ。これは、標準的なRNA抽出キット、好ましくはQIAGEN AllPrep DNA/RNA Miniキット(Hilden社、Germany)を製造業者の説明書に従って使用して実施されうる。
2.抽出されたRNAを、好ましくは自動電気泳動ツール、好ましくは2100バイオアナライザー(Agilent Technologies社)により、純度について場合により定量化及び評価するステップ。Agilent社バイオアナライザーは、RNA(及びDNA/タンパク質)の定寸、定量化及び品質管理に使用されるマイクロ流体プラットフォームであり、RNA試料のフラグメント化を定量化する「RNAインテグリティーナンバー」(RIN)を提供する。好ましくは、試料は、少なくとも7、好ましくは少なくとも8のRINを有する場合にのみ、プロセスにおいて更に使用される。
3.好ましくはIllumina TruSeq(商標)RNA試料調製キット(Illumina社、San Diego、CA、USA)及び関連プロトコールを使用して、RNAシーケンシングライブラリーを調製するステップ。このプロセスにおいて、好ましくは1試料あたり500~1000μgの全RNAを使用する。このキット及びプロトコールは、当技術分野において周知である。このステップは、下記のステップを含む。
3a.好ましくはRibo-Zero rRNA除去キット(Epicentre社、Madison、WI、USA)を、製造業者の説明書に準拠して使用して、抽出されたRNAを処理して、細菌及び真核生物リボソームRNAを枯渇させるステップ。
3b.残りのRNAを逆転写酵素及びランダムヘキサマーで処理して、長さ100~150塩基、又は好ましくは長さ200~300塩基の一本鎖cDNAフラグメントを作成するステップ。
3c.一本鎖cDNAフラグメントをDNAポリメラーゼI及びRNアーゼHで処理して、二本鎖相補的DNAフラグメント(cDNA)を生成するステップ、並びに
3d.RNA-seqアダプターをcDNAフラグメントの末端にライゲーションして、RNA-seqによって分析することができるアダプター-cDNA配列のライブラリーを生成するステップ。RNA-seqアダプターは、当技術分野において周知であり、任意の好適なアダプターが使用されうる。アダプターは、シーケンシングを可能にする機能エレメント、例えば、増幅エレメント及び一次シーケンシング部位を含有する。好ましくは、アダプターは、Illumina社インデックスアダプターである。アダプターを各cDNAフラグメントの一端にライゲーションして、シングルエンドライブラリーを生成することができ(これはシーケンシングすると1フラグメントあたり1つの「リード」をもたらすことになる)、この場合、ステップ3bにおけるcDNAフラグメント長さは、100~150塩基である。しかしながら、好ましくは、アダプターを各cDNAフラグメントの両端にライゲーションして、ペアエンドライブラリーを生成し(これはシーケンシングすると1フラグメントあたり2つの「リード」、いわゆる「メイトリード」又は「ペアリード」をもたらすことになる)、この場合、ステップ3bにおけるcDNAフラグメント長さは、200~300塩基である。
4.PCRによりアダプター-cDNA配列を場合により増幅するステップ。このステップは、DNAの量が配列分析ステップ5を実施するために不十分である場合に実施されうる。配列分析に必要とされるDNAの量は、当業者に周知である(好ましくは70~135μl、より好ましくは125μlのDNAの20pM溶液が、ステップ5においてシーケンサーのフローセルに充填される)。試料中のDNAの量を評価する方法は日常的であり、任意の好適な方法が使用されうる。好ましくは、使用される方法は、蛍光光度法であり、好ましくはQubit(登録商標)蛍光光度計が使用される。
5.好ましくはIllumina社フローセルシーケンサー、好ましくはIllumina社フローセルHiSeq 2500シーケンサー又はIllumina社フローセルNovaSeq 6000シーケンサーを使用し、好ましくはシングルエンドライブラリーがステップ3において生成される場合には100~150塩基対のシーケンシングサイクルを使用して、より好ましくはペアエンドライブラリーがステップ3において生成される場合には200~300塩基対のシーケンシングサイクルを使用して、アダプター-cDNA配列をシーケンシングするステップ。好ましくは70~135μl、より好ましくは125μlのDNAの20pM溶液が、フローセルに充填される。取得される生データセットは、分析された各フラグメントのユニーク配列識別子、その配列(いわゆる「リード」)、及びリード内の各塩基位置での配列のシーケンサーによる決定における信頼性の指示(いわゆるフレッド品質スコア)を提供するであろう。
6.決定された配列のデータセットから以下を除去することにより、リードの品質フィルタリングしたデータセットを調製するステップ:
i)10未満のフレッド品質スコアを有するリード内の塩基、
ii)10未満のフレッド品質スコアを有する同じリード内の塩基のダウンストリーム(すなわちシーケンシングの方向に続く)である、リード内の塩基、
iii)任意の未決定の(「未定の」)塩基(「N」)を含有するリード、
iv)汚染物質参照ゲノムにマッピングするリードであって、前記汚染物質参照ゲノムがエシェリキア・コリ(E. coli)ゲノムである、リード、及び
v)使用されるRNA-seqライブラリーがペアエンドライブラリーである場合、その「メイトリード」がステップ6(iii)から6(iv)の1つにおいて廃棄されるリード。
7.品質フィルタリングしたリードを、対象種のゲノム、すなわち好ましくはヒトゲノムに整列させるステップ。好ましくは、品質フィルタリングしたリードを、Ensemblデータベースバージョン98、好ましくはゲノムヒトGRCh38及びEnsembl遺伝子参照特色データベース(バージョンEnsemblゲノム45、GENCODE 32)由来のヒト参照ゲノムに整列させる。このステップに好適な整列ツールは、周知であり、広く入手可能であり、任意の好適な整列ツールが使用されうる。好ましくは、整列ツールは、TopHat2(バージョン2.1.1)[Trapnellら、(2010) Nature Biotechnology 28、511~515]である。
8.CDA遺伝子、及び場合により任意の他の目的の遺伝子についてのリードカウントの数を決定するステップ。このステップのためのバイオインフォマティクスツールは、周知であり、広く入手可能であり、任意の好適なツールが使用されうる。好ましくは、1遺伝子あたりのリードカウントは、HTSeqパッケージ(htseqカウント)を使用して決定される。それにより、このステップは、生リードカウントデータを提供する。
9.ステップ8で取得された生リードカウントデータを、100万あたりの転写産物(TPM)の単位に変換するステップ。これは、当技術分野において日常的に使用される、標準的な数学操作である。TPM値の決定は、i)遺伝子長及びii)シーケンシング深度についての生データを正規化することを伴うため、カウントデータをTPMの単位で提供することにより、遺伝子発現レベルの意味のある評価が可能になる。
i)生データにおける遺伝子長正規化に関して、単に遺伝子がより長く、そのためより多くのフラグメントが当該遺伝子と整列することから、より長い遺伝子ではより高いリードカウントが観察されうる。遺伝子長の正規化は、各遺伝子についてのリードカウントを遺伝子長(単位キロベース)で割ることを含む。
ii)シーケンシング深度は、異なる試料における同じ遺伝子間でのリードカウントの比較を改変する、試料間効果である。これを正規化するために、ステップ9i)で取得された1キロベースあたりのリードカウントを、「100万あたりのスケーリング係数」で割り、それ自体は、試料におけるリードの総数を100万で割ることによって取得されるものである。
i.試料におけるリードの総数を、1,000,000で割って、「100万あたりのスケーリング係数」を提供すること、
ii.1遺伝子あたりのリードカウントを、シーケンシング深度について正規化する「100万あたりの」スケーリング係数によって割り、それにより、100万あたりのリード(RPM)の単位を提供すること、及び
iii.RPM値を、遺伝子長について正規化するキロベースでの遺伝子の長さで割り、それにより、RPKMの単位を提供すること
によって計算される。
i.1遺伝子あたりのリードカウントを、遺伝子長について正規化するキロベースでの遺伝子の長さで割り、それにより、1キロベースあたりのリード(RPK)の単位を提供すること、
ii.試料における総RPK値を、1,000,000で割って、「100万あたりのスケーリング係数」を提供すること、及び
iii.ステップ(i)で取得されたRPK値を、ステップ(ii)で取得された、シーケンシング深度について正規化する「100万あたりの」スケーリング係数によって割り、それにより、TPMの単位を提供すること。
i)過剰発現されている、
ii)過剰発現されていない、
iii)過少発現されている、
iv)過少発現されていない、
v)過剰発現若しくは過少発現されている、又は
vi)過剰発現も過少発現もされていない
ものである。
i)過剰発現されている、
ii)過剰発現されていない、
iii)過少発現されている、
iv)過少発現されていない、
v)過剰発現若しくは過少発現されている、又は
vi)過剰発現も過少発現もされていない
ものである。
(a)任意の動物、例えば、慣例的に使用される動物、例えば、ヒツジ、ウサギ、ヤギ若しくはマウスのいずれか、又は卵黄に由来する、免疫グロブリンの種々のクラス又はサブクラス、例えば、IgG、IgA、IgM、IgD又はIgEのいずれか、
(b)モノクローナル又はポリクローナル抗体、
(c)インタクト抗体、又は、モノクローナル若しくはポリクローナルの抗体のフラグメント、該フラグメントは、抗体の結合領域、例えばFc部を欠いているフラグメント(例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、インタクト抗体において重鎖成分を接続するジスルフィド結合の還元的開裂によって取得されたいわゆる「半分子」フラグメントを含有するものである。Fvは、2本の鎖として発現される軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含有するフラグメントとして定義されうる、
(d)モノクローナル抗体、抗体のフラグメント、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は合成的に作製された若しくは改変された抗体様構造を含む、組換えDNA又は他の合成技術によって生成又は修飾された抗体。
動物
動物の収容、実験及び処分を含むこの作業のすべての態様は、Guide for the Care and Use of Laboratory Animals:第8版(National Academy Press, Washington, D. C.、2011)に概して従い、AAALAC認定実験動物施設内で実施した。動物のケア及び使用プロトコールは、Pharmacology Discovery Services Taiwan, Ltd社においてIACUCによって審査及び承認された。
原発性神経膠腫神経幹(GNS)細胞(G7、G14、G144、G166)を、神経幹細胞培地(50%DMEM-F12(Thermofisher社、カタログ番号21041025)、50%ニューロベーサル培地(Thermofisher社、カタログ番号10888-022)、N2(Life Technologies社、カタログ番号A-003-E)及びB27補給剤(Life Technologies社、カタログ番号12587010)、1mMのピルビン酸ナトリウム(Life Technologies社、カタログ番号11360-039)、2mMのグルタマックス(Life Technologies社、カタログ番号35050038)、1mMのHEPES(Fisher Scientific社、カタログ番号BP299-1)、0.1mMのβ-メルカプトエタノール(Life Technologies社、カタログ番号31350010)、1×非必須アミノ酸(Life Technologies社、カタログ番号11140-035)、0.006%ウシ血清アルブミン(Sigma社、カタログ番号A8577-10ML)、4μg/mlのヘパリン(Sigma社、カタログ番号H3149-25KU)、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、20ng/mlのhEGF(R&D Systems社、カタログ番号236-EG-200)、10ng/mlのbFGF(Peprotech社、カタログ番号100-18B))中、ポリ-D-リジン(Merck Millipore社、カタログ番号A-003-E)及びラミニン(R&D Systems社、カタログ番号3446-005-01)コーティングされたプレート上で培養した。
本発明の実施例で使用される化合物は、次の通りに取得した(CAT番号=カタログ番号)。
96ウェルプレート中、100μlの対応する培地中4000個の細胞を播種した。翌日、DMSO中で希釈した薬物を、8つの濃度で三連で添加した。薬物を、100μMから出発し、4倍希釈系列として添加した。細胞を薬物とともに72時間にわたってインキュベートした。細胞増殖を、MTTアッセイにより、製造業者のプロトコールに従って評価した(ATCC、カタログ番号30-1010K)。細胞生存を、DMSOのみにより処理された細胞の生存に対して正規化した。実験は3回実施したものであり、データは9つのウェルの平均±SEMを表す。
5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジン及び5-ホルミル-2'-デオキシシチジン(Berry and Associates社)を、ジメチルスルホキシド(DMSO)/Solutol(登録商標)R HS15/リン酸緩衝溶液(PBS)(5/5/90、v/v/v)中、30及び200及び400mg/mLの濃度で、5mL/kgの投薬体積での腹腔内投与用に製剤化した。10又は20mL/kgの投薬体積を適用した。
5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジン及び5-ホルミル-2'-デオキシシチジン(Berry and Associates社)を、ジメチルスルホキシド(DMSO)/Solutol(登録商標)R HS15/リン酸緩衝溶液(PBS)(5/5/90、v/v/v)中、15、50及び100mg/mLの濃度で、20mL/kgの投薬体積での腹腔内投与用に製剤化した。試験化合物を3日ごとに合計5回用量にわたって(q3d×5)投薬した。
最初に適切な体積のDMSOを予め秤量した化合物に添加し、次いで、適切な体積のSolutol(登録商標)及びPBS(5%DMSO/5%Solutol(登録商標)/90%PBS)を添加することによって、5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジン及び5-ホルミル-2'-デオキシシチジン(Berry and Associates社)投薬溶液を、各用量投与の前に新しく調製した。標準作用物質、テモゾロミドは、オスロ大学病院から粉末形態で提供を受け、最初に適切な体積のDMSOを予め秤量した化合物に添加し、次いで、適切な体積のSolutol(登録商標)及びPBS(5%DMSO/5%Solutol(登録商標)/90%PBS)を添加することによって、各用量の前に新しく製剤化した。5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジン及び5-ホルミル-2'-デオキシシチジンを、20mL/kgの用量体積で投与した。標準作用物質、テモゾロミドを、10mL/kgの用量体積で投与した。
%T/C=(Tn/Cn)×100%
Cn:対照群においてn日目に測定された腫瘍質量
Tn:処置群においてn日目に測定された腫瘍質量
%T/C値≦42%は、有意な抗腫瘍活性(#)とみなした。
%TGI=(1-(Tn/Cn))×100%
%TGI値≧58%は、有意な抗腫瘍活性(#)とみなした。
HPRT変異原性アッセイは、V79細胞中で実施した。50,000個のV79細胞を、6枚のウェルプレート中、3つの異なる濃度のd5hmC又はd5fCのいずれか(1、10、100μM)で24時間にわたって処理した。DMSOを陰性対照として使用した。処理後、細胞を必要に応じてT75フラスコ中で9日間にわたって二次培養して、HPRT突然変異体の発現を可能にした。10,000個の細胞を、選択培地(2.5μg/mlの6TG)を加えた10枚のレプリカペトリ皿(100×15mm)に再平板培養した。
100,000個の細胞を6ウェルプレート中に播種し、100μMのテモゾロミド、2'-デオキシ-5-ヒドロキシメチルシチジン、5-ホルミル-2'-デオキシシチジン又はDMSOとともに72時間にわたってインキュベートした。アポトーシス細胞の検出は、アネキシンV-7-アミノ-アクチノマイシンD(7-AAD)アポトーシス検出キット(Nordic Biosite AS社、カタログ番号640922)を製造業者のプロトコールに従って使用して評価した。
ウエスタンブロットを、先に記述した通りに(Towbinら、1979. Biotechnology、24、145~149)実施した。抗CDA抗血清(Abcam社、カタログ番号Ab82346)を製造業者の推奨濃度に従って使用した。二次抗体にコンジュゲートされたホースラディッシュペルオキシダーゼによるルミノールの酸化によって産生されたシグナルによって、タンパク質を定量化した。
腫瘍細胞に対する細胞毒性
上述した通りに(材料及び方法)成長させたHeLa細胞を、5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジン及び5-ホルミル-2'-デオキシシチジンで処理した。これらの化合物による3日間の処理後、細胞生存を上述した通りに(材料及び方法)評価した。5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジンによる処理後の生存はDMSO処理細胞と異なっていなかったが、驚くべきことに、5-ホルミル-2'-デオキシシチジンはHeLa細胞に対して細胞毒性であることが分かった。
正常細胞に対する細胞毒性
実施例1で実証される通り、5-ホルミル-2'-デオキシシチジン及び5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジンは、がん、特にグレードIV神経膠腫の処置のための有用な治療薬、特にテモゾロミド処置に対して抵抗性であるものである。
最大耐量
5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジン及び5-ホルミル-2'-デオキシシチジンは、正常細胞に対して限定された効果を有することから、本発明者らは、がん化学療法に通常は関連する副作用を引き起こすことなく、化合物を比較的高用量で与えることができると考えた。マウスにおけるこれらの化合物の最大耐量(MTD)は、上述した通りに(材料及び方法)決定した。MTDスキームを開発した(図1A)。研究のエンドポイントは72時間後の生存であったが、動物における急性毒性症状(死亡率、けいれん、振戦、筋弛緩、鎮静等)及び自律神経効果(下痢、唾液分泌、流涙、血管拡張、立毛等)の存在を、最初の30分間、並びに1、24、48及び72時間で再度、モニターした。体重を投薬前及び72時間で記録した。
インビボ細胞毒性
5-ホルミル-2'デオキシシチジン及び5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジンを、多形性膠芽腫マウス異種移植片モデルにおいて、上述した通りに(材料及び方法)評価した。U87-MG細胞を、ヌードマウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍を上述した通りに(材料及び方法)形成させた。腫瘍が129mm3から131mm3の間に到達した後、動物を4つの群-2つの処置群、陰性対照群及び陽性対照群に分けた。2つの処置群は、5-ホルミル-2'-デオキシシチジン及び5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジンであった。処置群のマウスに、1回2000mg/kg用量の5-ホルミル-2'-デオキシシチジン又は5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジンのいずれかを、3日ごとに合計5回用量にわたって受けさせた。陰性対照群は、IP注射がビヒクルを含有し化合物を含有しなかったことを除いて、処置群と同一に処置した。陽性対照群を、5回の日用量の40mg/kgのテモゾロミドで処置した。
細胞毒性対細胞静止作用
上記の細胞株アッセイは、代謝活性を測定するものであり、そのため、細胞***及び細胞死の阻害の間を区別しない。したがって、5-ホルミル-2'デオキシシチジン及び5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジンが、感受性細胞を死滅させているか又はそれらの細胞周期を遅延させているかを評価した。SF-188グレードIV神経膠腫細胞を、指示された濃度の、DMSO、テモゾロミド、5-ホルミル-2'-デオキシシチジン又は5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジンのいずれかで処理した。細胞を収穫し、アネキシンV(ホスファチジルセリンと結合するその能力によってアポトーシス細胞を検出する)及び7AAD(インタクトな細胞膜を容易に通過しないDNA染色;したがって、損なわれた膜を持つ細胞が選択的に染色されることになる)で染色し、フローサイトメトリー(cytometery)によって上述した通りに(材料及び方法)分析した。DMSO又はテモゾロミドで処理したSF-188細胞は、類似のサイトメトリープロファイルを産出し、テモゾロミド処理対照における死細胞の量がわずかに増大した。フローサイトメトリープロファイルによれば、5-ホルミル-2'-デオキシシチジン又は5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジンで処理したSF-188細胞の大部分が死滅した(図2A)。5-ホルミル-2'-デオキシシチジン又は5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジンに曝露したSF188細胞は死滅し、細胞周期チェックポイントで停止しないことが明確である。
2'-デオキシ糖誘導体の要件
広く使用されているがん化学療法薬である5-フルオロウラシルは、細胞毒性である複数のバリアントを有し、これらのバリアントは、ヌクレオシド(5-フルオロウリジン(flurouridine)及び5-フルオロ(fluro)-2'-デオキシウリジン)及び核酸塩基5-フルオロウラシルを含む。本発明者らは、5-ホルミル-2'-デオキシシチジン及び5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジンのリボヌクレオシド及び核酸塩基バリアントも細胞毒性であるか否かを評価した。
シチジンデアミナーゼの非効果
変異ヌクレオシド及びヌクレオチド類似体は、多くの場合、シチジンデアミナーゼ(CDA)によりヌクレオチドプールから取り出される。CDAは、ゲムシタビン及びシトシンアラビノシドという2つの一般的なヌクレオチド類似体抗がん剤を不活性化する。CDAによって不活性化されない抗がん剤が望ましいであろう。5-ホルミル-2'-デオキシシチジン及び5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジンはシチジン誘導体であるため、本発明者らは、CDAを発現している細胞が5-ホルミル-2'-デオキシシチジン及び5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジンによる処理に対して抵抗性であろうと仮定した。
変異原性作用欠如
多形性(Glibolastoma)膠芽腫のための現在の最前線の処置-テモゾロミドは、強力な突然変異原である。実際に、テモゾロミドは、突然変異している腫瘍細胞によりそのがん化学療法活性を非常に激しく発揮するため、腫瘍細胞は死滅する。テモゾロミドは、DNAをアルキル化(alkalyate)して突然変異を引き起こすことによって作用する。MGMT-アルキル化DNA損傷を除去することを司るタンパク質-の発現は、膠芽細胞腫細胞を、テモゾロミドの細胞毒性効果に対してほぼ完全に抵抗性にする。
他の化合物の細胞毒性対HeLa細胞
HeLa細胞を、5-ホルミル-2'-デオキシシチジン、5-ホルミルシチジン又は5-クロロ-2'-デオキシシチジンのいずれかで処理した。100、25、6.25、1.56、0.39、0.1、0.02又は0.006μMの濃度のこれらの化合物による3日間の処理後、細胞生存をMTTアッセイによって上述した通りに(材料及び方法)評価した。
他の化合物の細胞毒性対神経膠腫細胞
U87-MG細胞(神経膠腫、グレードIV)を、100、25、6.25、1.56、0.39、0.1、0.02又は0.006μMの濃度の、5-ホルミル-2'-デオキシシチジン、5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジン、5-カルボキシ-2'-デオキシシチジン、テモゾロミド、5-フルオロウラシル、5-ブロモ-2'-デオキシシチジン、5-ヨード-2'-デオキシシチジン又は5-クロロ-2'-デオキシシチジンのいずれかで処理した。これらの化合物による3日間の処理後、細胞生存をMTTアッセイによって上述した通りに(材料及び方法)評価した。
U87-MG細胞株を、10%ウシ胎児血清を補充したDMEM(Sigma社、カタログ番号D6429)中で成長させた。すべての細胞を、5%CO2の加湿ウォータージャケットインキュベーター内、37℃で維持した。細胞は、70から90%の間の集密で継代した。
96ウェルプレート中、100μlの対応する培地中4000個の細胞を播種した。翌日、DMSO中で希釈した薬物を、100、25、6.25、1.56、0.39、0.1、0.02又は0.006μMの濃度で三連で添加した。細胞を薬物とともに72時間にわたってインキュベートした。細胞増殖を、MTTアッセイにより、製造業者のプロトコールに従って評価した(ATCC、カタログ番号30-1010K)。細胞生存を、DMSOのみにより処理された細胞の生存に対して正規化した。実験は3回実施したものであり、データは9つのウェルの平均±SEMを表す。
チミジンシンターゼを介して媒介されない効果
細胞培養
U87-MG細胞株を、10%ウシ胎児血清を補充したDMEM(Sigma社、カタログ番号D6429)中で成長させた。すべての細胞を、5%CO2の加湿ウォータージャケットインキュベーター内、37℃で維持した。細胞は、70から90%の間の集密で継代した。
96ウェルプレート中、100μlの対応する培地中4000個の細胞を播種した。翌日、DMSO中で希釈した薬物を、8つの濃度で三連で添加した。薬物を、100μMから出発し、4倍希釈系列として添加した。細胞を薬物とともに72時間にわたってインキュベートした。細胞増殖を、MTTアッセイにより、製造業者のプロトコールに従って評価した(ATCC、カタログ番号30-1010K)。細胞生存を、DMSOのみにより処理された細胞の生存に対して正規化した。実験は3回実施したものであり、データは3つのウェルの平均±SDを表す
テモゾロミドとの組合せ療法
細胞培養
多形性膠芽腫細胞株(U87-MG)を、10%ウシ胎児血清を補充したDMEM(Sigma社、カタログ番号D6429)中で成長させた。すべての細胞を、5%CO2の加湿ウォータージャケットインキュベーター内、37℃で維持した。細胞は、70から90%の間の集密で継代した。
96ウェルプレート中、100μlの対応する培地中4000個の細胞を播種した。翌日、DMSO中で希釈した薬物を、8つの濃度で三連で添加した。薬物を、100μMから出発し、4倍希釈系列として添加した。細胞を薬物とともに72時間にわたってインキュベートした。細胞増殖を、MTTアッセイにより、製造業者のプロトコールに従って評価した(ATCC、カタログ番号30-1010K)。細胞生存を、DMSOのみにより処理された細胞の生存に対して正規化した。実験は3回実施したものであり、データはこれらの実験の平均を表す。
ウリジン類似体
5-メトキシメチル-2'-デオキシウリジン及び5-アセトキシメチル-2'-デオキシウリジンの細胞毒性効果を評価した。
U87-MG細胞株を、10%ウシ胎児血清を補充したDMEM(Sigma社、カタログ番号D6429)中で成長させた。すべての細胞を、5%CO2の加湿ウォータージャケットインキュベーター内、37℃で維持した。細胞は、70から90%の間の集密で継代した。
96ウェルプレート中、100μlの対応する培地中4000個の細胞を播種した。翌日、DMSO中で希釈した薬物を、8つの濃度で三連で添加した。薬物を、100μMから出発し、4倍希釈系列として添加した。細胞を薬物とともに72時間にわたってインキュベートした。細胞増殖を、MTTアッセイにより、製造業者のプロトコールに従って評価した(ATCC、カタログ番号30-1010K)。細胞生存を、DMSOのみにより処理された細胞の生存に対して正規化した。実験は3回実施したものであり、データは9つのウェルの平均±SEMを表す。
5-ホルミル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸の細胞毒性(HeLa)
細胞培養
HeLa細胞株を、10%ウシ胎児血清を補充したDMEM(Sigma社、カタログ番号D6429)中で成長させた。すべての細胞を、5%CO2の加湿ウォータージャケットインキュベーター内、37℃で維持した。細胞は、70から90%の間の集密で継代した。
96ウェルプレート中、100μlの対応する培地中4000個の細胞を播種した。翌日、DMSO中で希釈した薬物を、8つの濃度で三連で添加した。薬物を、100μMから出発し、4倍希釈系列として添加した。細胞を薬物とともに72時間にわたってインキュベートした。細胞増殖を、MTTアッセイにより、製造業者のプロトコールに従って評価した(ATCC、カタログ番号30-1010K)。細胞生存を、DMSOのみにより処理された細胞の生存に対して正規化した。実験は3回実施したものであり、データは9つのウェルの平均±SEMを表す。
5-ホルミル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸及び5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸の細胞毒性(神経膠腫)
U87-MG細胞(神経膠腫、グレードIV)を、100、25、6.25、1.56、0.39、0.1、0.02又は0.006μMの濃度の、5-ホルミル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸又は5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸のいずれかで処理した。これらの化合物による3日間の処理後、細胞生存をMTTアッセイによって上述した通りに(材料及び方法)評価した。
U87-MG細胞株を、10%ウシ胎児血清を補充したDMEM(Sigma社、カタログ番号D6429)中で成長させた。すべての細胞を、5%CO2の加湿ウォータージャケットインキュベーター内、37℃で維持した。細胞は、70から90%の間の集密で継代した。
96ウェルプレート中、100μlの対応する培地中4000個の細胞を播種した。翌日、DMSO中で希釈した薬物を、100、25、6.25、1.56、0.39、0.1、0.02又は0.006μMの濃度で三連で添加した。細胞を薬物とともに72時間にわたってインキュベートした。細胞増殖を、MTTアッセイにより、製造業者のプロトコールに従って評価した(ATCC、カタログ番号30-1010K)。細胞生存を、DMSOのみにより処理された細胞の生存に対して正規化した。実験は3回実施したものであり、データは少なくとも3つのウェルの平均±SDを表す。
CDA発現
種々の神経膠腫細胞株の線形及び対数基数2変換CDA発現レベルを決定した。指定された細胞株におけるCDA発現レベルを、GENEVESTIGATOR(登録商標)データベース(https://genevestigator.com/gv/)を使用し、CDA、生物:ホモ・サピエンス(Homo sapiens)、プラットフォーム:Affymetrix社Human Genome U133 2.0アレイを検索することによって同定した。結果を、図11から図13及びTable 6(表8)に示す。
血液脳関門透過性
血液脳関門透過性は、BioAssay systems社製の並行人工膜透過性アッセイキット(PAMPA)を使用して測定した。製造業者の説明書に準拠して、透過性を決定した。
Claims (26)
- 療法において使用するための、式(I):
Xは、アルデヒド、アルコール、保護されたアルコール、エーテル、エステル及びカルボン酸から選択される少なくとも1つの官能基を含有する、1から20個までの非水素原子を含有する基であり、但し、Xは、-COOHではなく、
W1及びW2は、それぞれ独立して、O、S又はNHであり、
Yは、H、又は1から15個までの非水素原子を含有する基であり、
Zは、-OPG、-ORz又は-N(RxRy)であり、ここで、Rx、Ry及びRzは、独立して、H、又は1から10個までの非水素原子を含有する基であり、
R1は、H、又は1から15個までの非水素原子を含有する基であり、
R2は、H、-OH、-OPG、-F、-Cl、-Br、-I又は-N3であり、
R3は、H、-F、-Cl、-Br、-I又は-N3であり、
ここで、PGは、アセチル(Ac)、ベンジル(Bn)又はベンゾイル(Bz)等のアルコール保護基である]
の化合物、又はその立体異性体、溶媒和物、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩。 - がんの処置又は予防において使用するための、式(I):
Xは、アルデヒド、アルコール、保護されたアルコール、エーテル、エステル及びカルボン酸から選択される少なくとも1つの官能基を含有する、1から20個までの非水素原子を含有する基であり、但し、Xは、-COOHではなく、
W1及びW2は、それぞれ独立して、O、S又はNHであり、
Yは、H、又は1から15個までの非水素原子を含有する基であり、
Zは、-OPG、-ORz又は-N(RxRy)であり、ここで、Rx、Ry及びRzは、独立して、H、又は1から10個までの非水素原子を含有する基であり、
R1は、H、又は1から15個までの非水素原子を含有する基であり、
R2は、H、-OH、-OPG、-F、-Cl、-Br、-I又は-N3であり、
R3は、H、-F、-Cl、-Br、-I又は-N3であり、
ここで、PGは、アセチル(Ac)、ベンジル(Bn)又はベンゾイル(Bz)等のアルコール保護基である]
の化合物、又はその立体異性体、溶媒和物、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩。 - Xが、-(CH2)n-X'であり、ここで、nは、0から6までであり、X'は、-CHO、-OH、-OR又は-OC(=O)Rであり、ここで、Rは、メチルである、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
- Xが、2から20個までの非水素原子を含有する基である、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
- Xが、-COOHでも-OHでもない、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
- Xが、
a)-CHO若しくは-CH2OH、又は
b)-CH2OCH3若しくは-CH2OC(=O)CH3
である、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用のための化合物。 - Xが、-CHO又は-CH2OHである、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
- Xが、CH2OHである、請求項1から9のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
- Zが、-NH2である、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
- 5-ホルミル-2'-デオキシシチジン、5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジン、5-メトキシメチル-2'-デオキシウリジン、5-アセトキシメチル-2'-デオキシウリジン、5-ホルミル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸若しくは5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸、又はその立体異性体、溶媒和物、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩である、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
- 5-ホルミル-2'-デオキシシチジン若しくは5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジン、又はその立体異性体、溶媒和物、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩である、請求項12に記載の使用のための化合物。
- 5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジン又はその立体異性体、溶媒和物、互変異性体若しくは薬学的に許容される塩である、請求項13に記載の使用のための化合物。
- がんが、外胚葉、沿軸中胚葉又は側板中胚葉に、好ましくは外胚葉に由来する組織のがんである、請求項2から14のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
- がんが、中枢神経系のがん、好ましくは脳がんである、請求項2から15のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
- がんが、神経膠腫、好ましくは膠芽細胞腫である、請求項2から16のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
- がんが、CDAが過剰発現されていないがんであり、好ましくは、前記がんが、100万あたりの転写産物(TPM)140以下のレベルでCDAを発現する、請求項2から17のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
- がんにおけるCDA発現レベルが、同じ条件下で同じ方法を使用して決定した際に、参照がん細胞株におけるCDA発現レベルの90%以下であり、ここで、前記参照がん細胞株は、MDA-MB-231である、請求項2から18のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
- がんが、ゲムシタビン、シタラビン、テモゾロミド又は5-フルオロウラシルによる処置に対して抵抗性である、請求項2から19のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
- 前記処置が、前記化合物を10mg/kgから405mg/kgの間の用量で投与することを含む、請求項2から20のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
- 前記処置が、更なる抗がん剤の投与を更に含む、請求項2から21のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
- がんの処置又は予防において使用するための、請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物と、更なる抗がん剤とを含む、キット。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物と、場合により更なる抗がん剤とを、1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤と一緒に含む、医薬組成物。
- 更なる抗がん剤が、ゲムシタビン、シタラビン、テモゾロミド、5-フルオロウラシル及びギリアデル(gliadel)(登録商標)からなる群から選択される、請求項22に記載の使用のための化合物、請求項23に記載のキット、又は請求項24に記載の医薬組成物。
- 対象においてがんを処置する又は予防する方法であって、請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物を、前記対象に投与する工程を含み、前記がんが、請求項2又は15から17のいずれか一項に規定の通りであり、前記処置が、請求項2、21、22又は25のいずれか一項に規定の通りである、方法。
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