WO2023068404A1 - Eml4-alk 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공 방법 및 alk 저해제 내성 비소세포폐암 치료용 조성물 - Google Patents

Eml4-alk 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공 방법 및 alk 저해제 내성 비소세포폐암 치료용 조성물 Download PDF

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cell lung
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김종환
김선영
김용성
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한국생명공학연구원
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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Definitions

  • the present invention relates to a method for providing information for selecting a treatment drug for a patient with EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer and a composition for treating ALK inhibitor-resistant non-small cell lung cancer, and more particularly, to a biological sample provided from a patient for the production of CDA (cytidine deaminase)
  • CDA cytidine deaminase
  • a method for providing information for selecting a drug for treatment of an EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patient including measuring the expression level and methylation level, and a deoxycytidine analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient It relates to a composition for treating non-small cell lung cancer that has acquired resistance to an ALK inhibitor.
  • ALK is a tyrosine kinase receptor, which includes the Ras/Raf/MEK/ERK1/2 pathway, JAK (Janus kinase)/STAT (signal transducers and activators of transcription) pathway, Pl3K (Phosphatidylinositol It plays an important role in cell proliferation, growth and survival through the 3-kinase)/Akt pathway.
  • overexpression of ALK results in abnormal proliferation and growth of cancer cells.
  • EML4 echinoderm microtubule-associated protein-like 4
  • ALK inhibitors such as crizotinib and ceritinib have been used as target therapeutics for ALK, but when continued use, they show resistance to therapeutic effects or show measurable responses. There is an invisible problem. In fact, only about 10% of non-small cell lung cancer patients respond to these drugs.
  • the inventors of the present invention conducted intensive research to develop a new therapeutic agent for the treatment of non-small cell lung cancer that has acquired resistance to ALK inhibitors in a patient group of EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer, and as a result, CDA (cytidine deaminase) was found to have decreased methylation and high expression levels, and deoxycytidine, an epigenetically oxidized form of deoxycytidine, was found in ALK inhibitor-resistant non-small cell lung cancer in which CDA was overexpressed. It was discovered that the analogue exhibited an excellent cancer cell growth inhibitory effect, and the present invention was completed.
  • CDA cytidine deaminase
  • an object of the present invention is a composition for providing information for selecting a treatment drug for EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patients, including an agent for measuring the expression level of CDA (cytidine deaminase) protein or gene, or the methylation level of CDA gene is to provide
  • an object of the present invention is to provide a composition for providing information for selecting a treatment drug for EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patients consisting of an agent for measuring the expression level of CDA (cytidine deaminase) protein or gene, or the methylation level of CDA gene is to provide
  • an object of the present invention is to provide information for selecting a treatment drug for EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patients consisting essentially of an agent for measuring the expression level of CDA (cytidine deaminase) protein or gene, or the methylation level of CDA gene to provide a composition.
  • CDA cytidine deaminase
  • Another object of the present invention is to provide information for drug selection for treatment of EML4-ALK-positive lung cancer patients, the expression level of CDA (cytidine deaminase) protein or gene, or CDA from biological samples provided from EML4-ALK-positive lung cancer patients. It is to provide an information providing method for selecting a drug for treatment of an EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patient, including the step of measuring the methylation level of a gene.
  • CDA cytidine deaminase
  • Another object of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer that has acquired resistance to ALK inhibitors, comprising a deoxycytidine analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. is to provide
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer that has acquired resistance to ALK inhibitors, consisting of a deoxycytidine analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof. is to do
  • Another object of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer that has acquired resistance to ALK inhibitors, essentially consisting of a deoxycytidine analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof. is to provide
  • Another object of the present invention is to provide a use of a deoxycytidine analogue or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the preparation of an agent for the treatment of EML4-ALK positive non-small cell lung cancer that has acquired resistance to an ALK inhibitor.
  • Another object of the present invention is to obtain resistance to ALK inhibitors, including administering an effective amount of a composition comprising a deoxycytidine analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof EML4- It is to provide a method for treating ALK-positive non-small cell lung cancer.
  • the present invention is a therapeutic drug for EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patients, including an agent for measuring the expression level of CDA (cytidine deaminase) protein or gene, or the methylation level of CDA gene
  • an agent for measuring the expression level of CDA (cytidine deaminase) protein or gene, or the methylation level of CDA gene A composition for providing information for selection is provided.
  • the present invention provides a composition for providing information for selecting a treatment drug for EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patients consisting of an agent for measuring the expression level of a cytidine deaminase (CDA) protein or gene, or the methylation level of a CDA gene.
  • CDA cytidine deaminase
  • the present invention provides a composition for providing information for selecting a treatment drug for EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patients consisting essentially of an agent for measuring the expression level of CDA (cytidine deaminase) protein or gene, or the methylation level of CDA gene to provide.
  • CDA cytidine deaminase
  • the present invention provides information for drug selection for treatment of EML4-ALK-positive lung cancer patients, CDA (cytidine deaminase) protein or Provided is an information providing method for selecting a drug for treatment of an EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patient, comprising measuring the expression level of a gene or the methylation level of a CDA gene.
  • CDA cytidine deaminase
  • the present invention provides EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer that has acquired resistance to an ALK inhibitor containing a deoxycytidine analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for prevention or treatment is provided.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer, which is resistant to ALK inhibitors, comprising a deoxycytidine analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer that has acquired resistance to ALK inhibitors, essentially consisting of a deoxycytidine analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof. .
  • the present invention is a deoxycytidine analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof for preparing a formulation for the treatment of EML4-ALK positive non-small cell lung cancer that has acquired resistance to ALK inhibitors. provide use.
  • the present invention is an ALK inhibitor comprising administering an effective amount of a composition comprising a deoxycytidine analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof.
  • the methylation level in the CDA (cytidine deaminase) gene is reduced compared to cell lines not showing resistance to ALK inhibitors, and as a result It was confirmed that the expression level of the CDA gene was significantly increased. Therefore, it is possible to determine whether or not resistance to an ALK inhibitor will be exhibited by detecting the expression level of the CDA gene or protein or the methylation level of the CDA gene in a biological sample provided from an EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patient.
  • the present invention provides a composition for providing information for selecting a treatment drug for EML4-ALK positive lung cancer patients, including an agent for measuring the expression level of a CDA protein or gene, or the methylation level of a CDA gene.
  • the CDA means an enzyme having an activity that converts cytidine (or deoxycytidine) into uridine (or deoxyuridine), CDA (cytidine deaminase; EC number 3.5.4.5; eg, CDD): GenBank Accession Nos. Sequences such as NP_001776.1 (Gene: NM_001785.2), CAA06460.1 (Gene: AJ005261.1), NP_416648.1 (Gene: NC_000913.3) can be referenced.
  • the CDA protein may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the CDA gene may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • plgicaerta iqkavsegyk dfraiaiasd mqddfispcg acrqvmrefg tnwpvymtkp
  • the "EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patient” refers to a non-small cell lung cancer patient with an ALK gene mutation. Mutation of the ALK gene may be formed from fusion of EML4 and ALK genes. The fused gene induces cancer by expressing EML4-ALK.
  • treatment After determining whether resistance to the ALK inhibitor has been obtained by measuring the expression level of the CDA protein or gene or the methylation level of the CDA gene in a biological sample provided from an EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patient through the composition of the present invention, treatment It can provide information for drug selection.
  • the expression level of the CDA protein or gene or the methylation level of the CDA gene in a biological sample provided from an EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patient through the composition of the present invention resistance to ALK inhibitors was not acquired. If the expression level of the CDA protein or gene is increased or the methylation level of the CDA gene is decreased compared to the untreated patient group, the patient can be judged as a patient who has acquired resistance to the ALK inhibitor. It can be excluded from selection as a treatment drug.
  • the patient group who did not acquire resistance to the ALK inhibitor If the expression level of the CDA protein or gene is reduced or unchanged, or the methylation level of the CDA gene is increased or unchanged, the patient can be judged as a patient who has not acquired resistance to ALK inhibitors. Therefore, ALK inhibitors can be selected as therapeutic drugs.
  • the expression level of CDA protein or gene in a biological sample provided from the EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patient through the composition of the present invention, or CDA By analyzing the methylation level of the gene, it is possible to make a decision on whether to continuously administer the ALK inhibitor.
  • the "ALK inhibitor” refers to a drug that exhibits a therapeutic effect on the EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patient and inhibits the kinase activity of EML4-ALK.
  • the acquisition of resistance to the ALK inhibitor is determined by comparing the initial drug response to the administration of the drug for a certain period of time when the ALK inhibitor is administered to a non-small cell lung cancer patient for a certain period of time for the treatment of non-small cell lung cancer. ALK inhibitor It can be said that non-dependent tolerance has been acquired for .
  • an increase in the expression level of the CDA gene or protein or a decrease in methylation of the CDA gene can be said to be an important factor in inducing resistance.
  • Progression of the non-small cell lung cancer can be confirmed by any means that can confirm the development of cancer by imaging, such as computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), ultrasound, X-ray imaging, mammography, PET scan, radiographic
  • CT computed tomography
  • MRI magnetic resonance imaging
  • ultrasound ultrasound
  • X-ray imaging X-ray imaging
  • mammography mammography
  • PET scan radiographic
  • the method is not particularly limited as long as it can be confirmed through an imaging technique such as a nuclide scan or a bone scan.
  • the ALK inhibitor may be selected from the group consisting of crizotinib, ceritinib, alectinib, brigatinib, and entrectinib. It is not limited.
  • the term 'expression' refers to the production of proteins or nucleic acids in cells.
  • 'protein' is used interchangeably with 'polypeptide' or 'peptide' and refers to a polymer of amino acid residues, eg as commonly found in proteins in their natural state.
  • 'polynucleotide' or 'nucleic acid' refers to deoxyribonucleotides (DNA) or ribonucleotides (RNA) in single- or double-stranded form. Unless otherwise limited, known analogs of natural nucleotides that hybridize to nucleic acids in a manner similar to naturally occurring nucleotides are also included.
  • 'mRNA' is RNA that transmits genetic information (gene-specific base sequence) to ribosomes that specify amino acid sequences from specific genes during protein synthesis.
  • the agent is an antibody or aptamer that specifically binds to the CDA protein; Alternatively, it may be a primer or probe that specifically binds to the CDA gene.
  • the term 'antibody' refers to an immunoglobulin that specifically binds to an antigenic site.
  • the CDA antibody in the present invention is an antibody that specifically binds only to the CDA protein without reacting to other proteins other than CDA.
  • an antibody that specifically binds to a CDA protein may be an antibody that specifically binds to a protein (CDA) comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, preferably.
  • CDA protein
  • the antibody can be prepared according to a conventional method in the art, such as cloning a CDA-encoding gene into an expression vector to obtain a protein encoded by the gene, and injecting the obtained protein into an animal to obtain an antibody produced.
  • the CDA antibody may be produced through the CDA full-length sequence protein, or may be produced using a polypeptide fragment containing the antigenic portion of the CDA protein.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and includes a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • a part of the entire antibody is also included in the antibody of the present invention, and all types of immunoglobulin antibodies that specifically bind to CDA are included.
  • the antibodies of the present invention include special antibodies and recombinant antibodies, such as humanized antibodies and chimeric antibodies, as long as they can specifically bind to the CDA protein.
  • the term 'aptamer' refers to a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA, or modified nucleic acid) having a stable tertiary structure as a substance capable of specifically binding to an analyte to be detected in a sample. , it is possible to specifically confirm the presence of the target protein in the sample.
  • the aptamer is synthesized by determining the sequence of an oligonucleotide that is selective for the target protein to be identified (CDA protein in the present invention) and has high binding ability according to the general aptamer preparation method, and then the 5' of the oligonucleotide is synthesized. It can be made by modifying the terminal or 3' terminal with -SH, -COOH, -OH or NH2 so that it can bind to the functional group of the aptamer chip, but is not limited thereto.
  • the meaning of measuring the expression level of the CDA gene includes measuring the expression level of transcripts derived from the CDA gene, and includes, for example, measuring the expression level of CDA mRNA.
  • the agent for measuring the expression level of the CDA gene is not limited thereto, but may preferably mean an agent for detecting mRNA expressed from the gene. Therefore, the type of agent for detecting the CDA gene is not particularly limited as long as it is a ligand that specifically attaches to or hybridizes to mRNA expressed from the gene, but may be, for example, a primer (pair) or a probe.
  • the 'primer' is a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxyl group, which can form base pairs with a complementary template and refers to a short nucleic acid sequence that serves as a starting point for template strand copying.
  • Primers can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates in an appropriate buffer and temperature. PCR conditions and lengths of sense and antisense primers can be appropriately selected according to techniques known in the art.
  • the sequence of the primer does not have to have a sequence completely complementary to a part of the base sequence of the template, and it is sufficient to have sufficient complementarity within a range capable of hybridizing with the template and performing the specific function of the primer. Therefore, the primers for measuring the expression level of CDA mRNA in the present invention do not have to have a sequence perfectly complementary to the CDA gene sequence, and the amount of CDA mRNA can be determined by amplifying a specific section of CDA mRNA or CDA cDNA through DNA synthesis. It is sufficient to have a length and complementarity suitable for the purpose to be measured.
  • the primers for the amplification reaction consist of a set (pair) that complementarily binds to the template (or sense) and the opposite side (antisense) of both ends of a specific section of the CDA mRNA to be amplified. Primers can be easily designed by those skilled in the art by referring to CDA mRNA or cDNA nucleotide sequences.
  • 'Probe' refers to a polynucleotide fragment such as RNA or DNA with a length of several to several hundred base pairs that can specifically bind to mRNA or cDNA (complementary DNA) of a specific gene. And since it is labeled, it is possible to check the presence or absence of the binding target mRNA or cDNA, and the expression level.
  • a probe complementary to CDA mRNA can be used for diagnosis of vascular dementia by performing a hybridization reaction with a sample of a subject to measure the expression level of CDA mRNA. Probe selection and hybridization conditions can be appropriately selected according to techniques known in the art.
  • primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support synthesis method or other well-known methods.
  • primers or probes may be variously modified according to methods known in the art to the extent that hybridization with CDA mRNA is not hindered. Examples of such modifications are methylation, capping, substitution of one or more natural nucleotides with homologs, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages such as methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, carbamates, etc. ) or charged linkages (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), and binding of fluorescent or enzymatic labeling materials.
  • an antibody, an aptamer, or a primer that recognizes CDA mRNA as a marker, selectively recognizing CDA protein as a marker, as well as one or more other types suitable for the analysis method may be included.
  • the 'methylation' refers to inactivation of a gene without a change in DNA sequence, and is classified as an epigenetic change by distinguishing it from genetic changes such as point mutations and gene deletions.
  • the change in the methylation level includes both hypermethylation and hypomethylation.
  • the methylation is the binding of a methyl group (-CH3) to the 5' carbon region of CpG by DNA methyl transferase (DNMT).
  • DNMT DNA methyl transferase
  • the level of methylation of the CDA gene may be the level of methylation at the promoter or enhancer region of the CDA gene.
  • the 'agent for measuring the methylation level' may include a primer specific for a methylated allele sequence of the CDA gene and a primer specific for an unmethylated allele sequence.
  • the preparation of the present invention may include a primer pair and an extension primer specific to the allelic sequence of the CDA gene.
  • the primers can be preferably designed according to the sequence of the CpG island to be analyzed for methylation, and a pair of primers that can specifically amplify cytosine that is methylated and not modified by bisulfite and that is not methylated It may be a primer pair capable of specifically amplifying cytosine modified by bisulfite. In addition, it may be a primer pair specific for the modified sequence and an extension primer.
  • the agent for measuring the methylation level of a gene in the present invention may include a compound that modifies an unmethylated cytosine base, a primer pair specific to the modified sequence of the gene, and an extension primer.
  • the compound that modifies the unmethylated cytosine base may be bisulfite, but is not limited thereto, and is preferably sodium bisulfite.
  • a method of detecting methylation of a promoter by modifying unmethylated cytosine residues using bisulfite is well known in the art (Herman JG et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 93: 9821 - 9826; WO01/26536; US2003/0148326A1).
  • the methylation-sensitive restriction enzyme is a restriction enzyme capable of specifically detecting methylation of a CpG island, and is preferably a restriction enzyme containing CG as a recognition site of the restriction enzyme. Examples include, but are not limited to, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, and NotI. Cleavage by the restriction enzyme depends on methylation or unmethylation at C of the restriction enzyme recognition site, and this can be detected through PCR or Southern blot analysis. Other methylation sensitive restriction enzymes other than the above restriction enzymes are well known in the art.
  • the composition may be provided in the form of a kit for providing information for selecting a treatment drug for EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patients.
  • the kit may further comprise one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.
  • the kit may be a kit characterized in that it includes essential elements necessary for carrying out the reverse transcription polymerase reaction.
  • the reverse transcription polymerase reaction kit includes each primer specific for a gene.
  • Other reverse transcription polymerase reaction kits include test tubes or other suitable container, reaction buffer (with varying pH and magnesium concentration), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNAse, RNAse inhibitor DEPC -Water (DEPC-water), sterilized water, etc. may be included.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which cDNA or an oligonucleotide corresponding to a gene or a fragment thereof is attached, and reagents, reagents, enzymes, and the like for producing a fluorescently labeled probe.
  • the substrate may include a cDNA or oligonucleotide corresponding to a control gene or a fragment thereof.
  • the present invention also provides information for drug selection for treatment of EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patients, CDA (cytidine deaminase) protein or expression level of genes from biological samples provided from EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patients, Alternatively, a method for providing information for selecting a drug for treatment of an EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patient, including measuring the methylation level of the CDA gene, is provided.
  • CDA cytidine deaminase
  • the term 'measurement' in the present invention may preferably mean 'analysis', and the analysis may be qualitative or quantitative analysis.
  • the qualitative analysis may mean measuring and confirming the presence or absence of a target substance
  • the quantitative analysis may mean measuring and confirming changes in the presence level (expression level) or amount of the target substance. there is.
  • analysis or measurement may be performed without limitation including both qualitative and quantitative methods, and preferably, quantitative measurement may be performed.
  • the sample can be used without limitation as long as it is obtained from an EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patient, and for example, cancer cells or tissues obtained by biopsy, blood, whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid, and various secretions. , urine, feces, etc.
  • a biological liquid sample body fluid sample
  • it may be to use a biological liquid sample (body fluid sample), for example, using blood, plasma, serum, saliva, nasal fluid, sputum, synovial fluid, amniotic fluid, ascites, cervical or vaginal secretions, urine and cerebrospinal fluid. it could be used.
  • the sample may be pretreated prior to use in analysis or measurement.
  • it may include homogenization, filtration, distillation, extraction, concentration, inactivation of interfering components, addition of reagents, and the like.
  • the measurement method of the CDA protein expression level is not particularly limited as long as it is by a protein expression measurement method known in the art. It may be performed by a method selected from the group consisting of immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, immunostaining method, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, and protein chip.
  • the measurement method of the gene expression level is not particularly limited as long as it is by a gene expression measurement method known in the art, but, for example, PCR, RNase protection assay, Northern blotting, Southern blotting ( southern blotting) and a method selected from the group consisting of DNA chips.
  • the measurement method of methylation level of the gene is not particularly limited as long as it is by a gene methylation measurement method known in the art, but for example, PCR, methylation specific PCR (methylation specific PCR), real-time methylation specific PCR (real time methylation specific PCR), PCR using methylated DNA specific binding protein, quantitative PCR, DNA chip, pyrosequencing, and bisulfite sequencing.
  • the expression level of the CDA protein or gene or the methylation level of the CDA gene is higher than that of the control group.
  • the methylation level of the CDA gene is lower than that of the control group, it can be determined that the response of the non-small cell lung cancer patient to the ALK inhibitor is low. That is, since the patient may be a non-small cell lung cancer patient who is resistant to an ALK inhibitor, it may be desirable to select a treatment strategy other than an ALK inhibitor to establish a treatment strategy.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer that has acquired resistance to ALK inhibitors, comprising a deoxycytidine analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. do.
  • the type of the deoxycytidine analog is not particularly limited, and for example, 5hmdC (5-hydroxymethyl-2'-deoxycitidine), 5fdC (5-formyl-2'-deoxycytidine), 5cadC (5- carboxyl-2'-deoxycitidine) and the like (Nature. 2015;524(7563):114-8).
  • the deoxycytidine analog in the present invention may be 5hmdC or 5fdC.
  • EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer that has acquired resistance to ALK inhibitors overexpresses CDA, and CDA converts 5hmdC and 5fdC into uridine variants.
  • the converted uridine variant is inserted into DNA, accumulates DNA damage, and eventually induces cell death.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be particularly effective in non-small cell lung cancer in which the expression of CDA protein or mRNA is increased or the methylation level of the CDA gene is decreased.
  • deoxycytidine analogs according to the present invention may be used as such or in the form of pharmaceutically acceptable salts.
  • 'pharmaceutically acceptable refers to a non-toxic composition that is physiologically acceptable and does not usually cause an allergic reaction or similar reaction when given to humans, and the salt is a pharmaceutically acceptable glass.
  • Acid addition salts formed by free acids are preferred.
  • organic acids and inorganic acids may be used.
  • the organic acid is not limited thereto, but citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, trifluoroacetic acid, benzoic acid, gluconic acid, metasulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4-toluenesulfonic acid, Includes glutamic acid and aspartic acid.
  • the inorganic acid includes, but is not limited to, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain a deoxycytidine analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof alone or may be formulated in a suitable form together with a pharmaceutically acceptable carrier, and further contain an excipient or diluent. can do.
  • a pharmaceutically acceptable carrier include all kinds of solvents, dispersion media, oil-in-water or water-in-oil emulsions, aqueous compositions, liposomes, microbeads and microsomes.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may further include, for example, a carrier for oral administration or a carrier for parenteral administration.
  • Carriers for oral administration may include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like.
  • various drug delivery materials used for oral administration may be included.
  • the carrier for parenteral administration may include water, suitable oil, saline, aqueous glucose and glycol, and the like, and may further include a stabilizer and a preservative.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium bisulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, and the like in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., a talc, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • composition of the present invention can be administered to mammals including humans by any method.
  • it can be administered orally or parenterally.
  • Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal administration can be used.
  • composition of the present invention may be formulated into a preparation for oral administration or parenteral administration according to the administration route as described above.
  • composition of the present invention may be formulated into powders, granules, tablets, pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions, etc. using a method known in the art.
  • preparations for oral use may be obtained by combining the active ingredient with a solid excipient, which is then milled and, after adding suitable auxiliaries, processed into a mixture of granules to obtain tablets or dragees.
  • excipients examples include sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol, starches including corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch, cellulose, Celluloses including methyl cellulose, sodium carboxymethylcellulose and hydroxypropylmethyl-cellulose, and the like, fillers such as gelatin, polyvinylpyrrolidone, and the like may be included. In addition, cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate may be added as a disintegrant, if desired. Furthermore, the pharmaceutical composition of the present invention may further include an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifier, and a preservative.
  • sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol,
  • preparations for parenteral administration they may be formulated in the form of injections, creams, lotions, external ointments, oils, moisturizers, gels, aerosols, and nasal inhalants by methods known in the art. These formulations are described in prescriptions generally known to all pharmaceutical chemists.
  • the total effective amount of the composition of the present invention can be administered to the patient in a single dose or by a fractionated treatment protocol in which multiple doses are administered over a long period of time.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient according to the severity of the disease.
  • the preferred total dose of the pharmaceutical composition of the present invention may be about 0.01 ⁇ g to 10,000 mg, most preferably 0.1 ⁇ g to 500 mg per kg of patient body weight per day.
  • the dose of the pharmaceutical composition is determined by considering various factors such as the formulation method, administration route, and number of treatments as well as the patient's age, weight, health condition, sex, severity of disease, diet, and excretion rate. Therefore, considering this point, those skilled in the art will be able to determine an appropriate effective dosage of the composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited in its formulation, administration route and administration method as long as it exhibits the effects of the present invention.
  • the composition may be administered in combination with an ALK inhibitor.
  • compositions When the composition of the present invention is administered in combination with an ALK inhibitor, the compositions may be administered individually in the form of a single composition or simultaneously administered in the form of a combination drug. That is, the composition and the ALK inhibitor may be administered simultaneously (simultaneously), separately (separately) or sequentially (sequentially), and there is no particular limitation on the order of administration when administered sequentially.
  • the present invention provides a use of a deoxycytidine analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof for preparing an agent for the treatment of EML4-ALK positive non-small cell lung cancer that has acquired resistance to an ALK inhibitor.
  • the present invention relates to EML4-ALK positive arsenic that has acquired resistance to ALK inhibitors, comprising administering an effective amount of a composition comprising a deoxycytidine analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof.
  • a method for treating cell lung cancer is provided.
  • the 'effective amount' of the present invention refers to an amount that exhibits an effect of improving, treating, preventing, detecting, diagnosing, or suppressing or reducing the disease of EML4-ALK positive non-small cell lung cancer that has acquired resistance to an ALK inhibitor when administered to a subject.
  • the 'individual' may be an animal, preferably a mammal, especially an animal including a human, and may also be a cell, tissue, organ, etc. derived from an animal.
  • the subject may be a patient in need of the effect.
  • the 'treatment' of the present invention comprehensively refers to improving EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer that has acquired resistance to ALK inhibitors or symptoms of the disease, which cures, substantially prevents, or conditions the disease It may include improving, including, but not limited to, alleviating, curing or preventing one or most of the symptoms resulting from the disease.
  • the term “comprising” is used in the same meaning as “including” or “characterized by”, and in the composition or method according to the present invention, specifically mentioned It does not exclude additional components or method steps not specified. Also, the term “consisting of” means excluding additional elements, steps or components not separately described. The term “essentially consisting of” means that in the scope of a composition or method, in addition to the described materials or steps, materials or steps that do not substantially affect the basic characteristics thereof may be included.
  • composition and method provided by the present invention it is possible to accurately distinguish EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patients who are resistant to ALK inhibitors, which will be very useful for selecting drugs for the treatment of EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patients.
  • composition of the present invention containing a deoxycytidine analogue can exhibit excellent anticancer effects in patients with EML4-ALK positive non-small cell lung cancer who are resistant to ALK inhibitors.
  • FIG. 1A Experimental workflow for characterizing cells acquired toleration. LR cells, which are ceritinib-resistant cells, were established by treatment with increasing concentrations of ceritinib.
  • FIG. 1b Heatmap representing differentially expressed genes (DEGs) compared to LR and H3122.
  • FIG. 1c Analysis of relative mRNA expression of DNA methyltransferase (DNMT) and Ten-eleven translocation (TET) families by qRT-PCR.
  • FIG. 1D Heatmap of differentially methylated loci between H3122 and LR cells at 41,223 CpG.
  • FIG. 1e Correlation of differences in DNA methylation and mRNA expression levels between H3122 and LR.
  • FIG. 1f Gene set analysis for differentially methylated genes in KEGG pathways and biological processes.
  • Figure 2 shows the results of confirming changes in DNA methylation and mRNA expression in naive and resistant cell lines.
  • DNA methylation levels of CDA were plotted as pie charts representing methylation ratios (black) in individual Infinium Human Methylation 450K BeadChip probes (red line).
  • cg04087271, cg20619374 and cg06984156 for CDA The graph shows the relative fold change of mRNA levels of CDA in H3122 and LR cell lines.
  • Figures 3a-3f show single cell RNA sequencing results from H3122 and LR cells.
  • Fig. 3b t-SNE visualizing 10 clusters (C0 to C9) from H3122 and LR cells.
  • Fig. 3c Proportion of H3122 and LR cells in clusters.
  • FIG. 3D Proportion of cell cycle status of H3122 and LR cells in 10 clusters.
  • Fig. 3e Trajectory analysis of H3122 and LR cells shown in two dimensions (top) and highlighted in 10 clusters.
  • FIG. 3F Heatmap of differentially expressed genes in whole cells between 3122 and LR.
  • Figures 4a to 4c are the results of single cell expression analysis of CDA in H3122 and LR cell populations
  • Fig. 4a Expression of CDA in t-SNE map.
  • Fig. 4b Violin plot showing the expression of CDA in each cluster. Each dot represents gene expression in each single cell.
  • FIG. 4C Expression heatmap showing the expression of CDA between naive and resistant states over time (cells sorted by time and colors indicate expression levels).
  • FIG. 5a to 5c and FIG. 6 are the results of evaluating the cytotoxicity of 5hmdC in CDA-overexpressing cells
  • FIG. 5a CDA mRNA expression levels (top) and protein expression levels (bottom) in H3122, LR, H1299 and H1703 cells.
  • FIG. 5B Colony formation of H3122, LR, H1299 and H1703 cells treated with 5hmdC for 10 days.
  • FIG. 5C Cell growth curves of H3122, LR, H1299 and H1703 cells treated with 5hmdC (0 ⁇ M, black; 1 ⁇ M, blue; 5 ⁇ M, magenta; 10 ⁇ M, red) for the indicated times.
  • FIG. 6 Immunofluorescence of ⁇ H2AX in H3122, LR, H1299 and H1703 cells (green). DMSO and 5hmdC (10 uM) were treated. Nuclear DNA was stained with DAPI (blue).
  • FIG. 7a to 7c are results confirming that CDA expression is associated with overall survival of lung adenocarcinoma (LUAD) patients based on the TCGA database.
  • FIG. 7b Results of overall survival of patients with low or high expression levels of CDA analyzed by the Kaplan-Meier method and log-rank test in LUAD.
  • FIG. 7C Model for targeting CDA with 5hmdC to overcome acquired resistance to ceritinib. During acquired resistance to ceritinib, CDA methylation is reduced and CDA expression is increased. Epigenetic nucleosides such as 5hmdC can induce DNA damage and apoptosis in CDA overexpression-resistant cells.
  • Lung cancer cell lines H3122, H1299 and H1703 were treated with 1% antibiotics (Gibco, Cat # 15240062 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) and 10% fetal bovine serum (HyClone, UT, USA). They were cultured in RPMI-1640 medium (WELGENE, Cat No. LM 011-01, Korea) supplemented with Ceritinib (LDK378). Resistant LR cells have been established in previous studies. In addition, it has been confirmed that H3122-LR cells also have resistance to crizotinib and lorlatinib (Yun MR et al., Enhancer Remodeling and MicroRNA Alterations Are Associated with Acquired Resistance to ALK Inhibitors See Cancer Res.
  • H3122 cells were cultured with increasing concentrations of ceritinib starting with an IC 30 , and resistant cells were induced after approximately 6 months of culture under continuous 1 ⁇ M ceritinib treatment conditions. All cells were maintained at 37° C. in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 .
  • RNA sequencing analysis (Bulk RNA-seq analysis)
  • RNA-Seq libraries were prepared using the TruSeq RNA sample preparation kit (Illumina, San Diego, CA, USA), and sequencing was performed using the Illumina HiSeq2000 platform to generate 100 bp paired-end reads. Sequenced reads were mapped to the human genome (hg19) using STAR (v.2.5.1), and gene expression levels were quantified with count modulo in STAR. The edgeR (v.3.12.1) package was used to select differentially expressed genes (DEGs) from RNA-seq count data. Meanwhile, TMM (the trimmed mean of M-values normalization) normalized the CPM (number per million) of each gene and log2-transformed for further analysis.
  • DNA methylation analysis of H3122 and LR cells was analyzed in duplicate using Illumina Infinium Methylation 450K Bead Chip Arrays (San Diego, CA, USA) according to the manufacturer's protocol. The resulting DNA methyl/non-methyl signal intensity data was imported into R (v.3.4.2) for analysis. Normalization was performed using the SWAN method with background correction using the minfi R package 3, v.1.30.0. Probes with detection p-values ⁇ 0.05 and DNA methylation values were summarized as normalized mean beta values. For the identification and extraction of differentially methylated regions (DMRs) between H3122 and LR, statistical analysis was performed using the DMRcate 4, v.1.20.0 R package. DMR was selected as a probe with a p-value ⁇ 0.05 and a mean difference greater than 15%.
  • DMRs differentially methylated regions
  • Samples were prepared as outlined in the Instructions for Use of the 10x Genomics Single Cell 3′ v2 Reagent Kit. Chromium Single Cell 3′ Library and Gel Bead Kit V2 (PN-120237), Chromium Single Cell 3′ Chip Kit V2 (PN-120236) and Chromium i7 Multiplex Kit (PN-120262) were used with 10x Genomics Chromium. Samples were sequenced on the HiSeq 2500 using the following run parameters. Read 1-26 cycles, read 2-98 cycles, index 1-8 cycles. A median sequencing depth of 60,000 reads/cell was targeted for each sample.
  • Pretreatment was followed by the pipeline provided by 10X Genome.
  • the conversion of raw sequencing data (bcl files) to fastq and fitting to the human reference genome hg19 was performed using Cell Ranger software.
  • a raw gene expression matrix was generated using the cell ranger count module.
  • Cell Ranger's 'aggr' module was used without the 'normalize' option.
  • the rest of the process was performed using the guided analysis pipeline in R (https://www.R-project.org/) and Seurat 5, v.2.4.
  • Cell and gene filtration processes only included genes expressed in 3 cells or more and cells expressed in 200 or more genes. Cells with a mitochondrial genome transcript ratio greater than 50% were considered lysed and excluded.
  • the global-scaling normalization method 'LogNormalize' was used with default parameters. The steps of variable gene selection, data scaling and linear dimension reduction were performed sequentially according to the Seurat directed analysis pipeline. To determine the 'dimension' of the data set, we checked the elbow plot and determined 10 PCs. Cells were clustered using Seurat's 'FindClusters' module and clusters were visualized using t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (tSNE) implemented in Seurat. We used the 'FindAllMarkers' module to find the DEGs in each cluster.
  • tSNE t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding
  • the membrane was incubated overnight at 4°C with the indicated primary antibodies. . After washing with TBS-T, the membrane was incubated for 30 minutes at room temperature for secondary antibody reaction (goat anti-mouse, Invitrogen, 31430; goat anti-rabbit, Invitrogen, 31460; 1:5000 ratio). After washing with TBS-T, blots were detected by ECL kit (Advansta, Cat. No. K-12045-D50) and visualized using Fujifilm LAS-4000.
  • Cells were plated in 8 wells (Lab-Tek II, Cat. No. 15446) and incubated at 37° C. in 5% CO2. Cells were washed twice with cold DPBS (WELGENE, Cat. No. LB001-02) and fixed with 4% paraformaldehyde (Biosesang, Cat. No. P2031) for 2 hours at room temperature. After washing three times in cold DPBS, cells were permeabilized in 0.25% Triton X-100 (Sigma Aldrich, Cat. No. T9284) for 10 min. After washing, cells were blocked overnight at 4°C in a humidified chamber. Cells were washed with cold DPBS and incubated with ⁇ H2A.X antibody (Cell Signaling, Cat. No.
  • RNA-seq and scRNA-seq of -resistant cell lines were performed (Fig. 1a).
  • LR -resistant cell lines
  • CYP4F11 Cytochrome P450 4F11
  • AXL receptor tyrosine kinase AXL
  • EDIL3 EGF like repeats and Discoidin Domains 3
  • GLB1L2 Galactosidase Beta 1 Like 2
  • DUSP6 Dual Specificity Phosphatase 6
  • the present inventors confirmed the mRNA expression levels of DNMT and TET using qRT-PCR, and confirmed that not only transcriptome changes but also DNA methylome changes can occur during the resistance formation process (Fig. 1c).
  • Hypermethylated and downregulated genes were related to apoptosis, cell proliferation and negative regulation of MAPK signaling (Fig. 1f), while hypomethylated and upregulated genes were related to cell adhesion, cell migration and Hippo signaling (Fig. 1f). These data suggest that transcriptional plasticity can induce stable epigenetic modifications, such as DNA methylation changes, during the course of ceritinib resistance acquisition.
  • the expression level of CDA was increased 5-fold in LR cell lines (FIG. 2c).
  • the promoter and putative enhancer regions of CDA showed reduced methylation in LR cell lines (Fig. 2c).
  • naive and resistant cells were divided into 7 groups and resistant cells had one main group and two outlier groups (Fig. 3a and b).
  • Clusters 0, 4 and 7 have mostly resistant cells (Fig. 3c). Interestingly, these clusters showed G2/M and S phases in cell cycle analysis (Fig. 3d), indicating that resistant cells are highly proliferative. Most of the cells in clusters 3 and 9 were naive, but also proliferated in G2/M or S phase. Trajectory analysis of all cells using monocle shows discrepancies between na ⁇ ve and resistant cells (FIG. 3e).
  • CDA-overexpressing cells were found among naive cells, suggesting that CDA-overexpressing cells may have an advantage in ceritinib treatment.
  • CDA overexpressing cells can be selected and propagated during the process of tolerance acquisition.
  • CDA is one of the highest confidence candidates showing a consistent expression pattern between naive and resistant cells.
  • compositions and method provided by the present invention it is possible to accurately distinguish EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patients who are resistant to ALK inhibitors, which will be very useful for selecting drugs for the treatment of EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patients.
  • the composition of the present invention containing a deoxycytidine analogue can exhibit excellent anticancer effects in EML4-ALK-positive non-small cell lung cancer patients who are resistant to ALK inhibitors, and thus have very high industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공 방법 및 ALK 저해제 내성 비소세포폐암 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 CDA(cytidine deaminase)의 발현 수준 및 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공 방법, 및 디옥시시티딘 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 ALK 저해제에 내성을 획득한 비소세포폐암 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공 방법 및 ALK 저해제 내성 비소세포폐암 치료용 조성물
본 발명은 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공 방법 및 ALK 저해제 내성 비소세포폐암 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 CDA(cytidine deaminase)의 발현 수준 및 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공 방법, 및 디옥시시티딘 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 ALK 저해제에 내성을 획득한 비소세포폐암 치료용 조성물에 관한 것이다.
ALK(Anaplastic Lymphoma kinase)는 티로신 키나아제 수용체(tyrosine kinase receptor)로서 Ras/Raf/MEK/ERK1/2 경로(pathway), JAK(Janus kinase)/STAT(signal transducers and activators of transcription) 경로, Pl3K(Phosphatidylinositol 3-kinase)/Akt 경로를 통해 세포의 증식, 생장 및 생존에 중요한 역할을 한다. 그러나 ALK의 과다 발현은 암세포의 비정상적인 증식과 생장을 초래한다.
한편, 비소세포폐암(Non-small cell lung cancer)에서 ALK의 EML4(echinoderm microtubule-associated protein-like 4)-ALK 돌연변이(mutation)는 암세포의 비정상적인 증식에 중요한 역할을 한다고 알려져 있어 ALK를 표적으로 하는 항암 치료에 대한 연구와 관심이 커지고 있다.
이러한 ALK의 표적 치료제로는 크리조티닙(crizotinib)과 세리티닙(ceritinib) 등의 ALK 저해제(inhibitor)가 사용되어 왔으나, 계속 사용시 치료효과들에 대하여 내성을 나타내거나, 측정가능한 정도의 반응을 보이지 않는 문제가 있다. 실제, 비소세포폐암 환자들의 약 10% 정도만이 이들 약물에 반응성을 보이고 있다.
따라서, EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 환자군에서 ALK 저해제를 사용할 것인지를 정확하게 판단하기 위한 효율적인 방법과 함께, ALK 저해제에 내성을 획득한 비소세포폐암을 치료하기 위한 새로운 치료제 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자는 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 환자군에서 ALK 저해제에 내성을 획득한 비소세포폐암을 치료하기 위한 새로운 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 내성이 생긴 세포에서 CDA(cytidine deaminase)의 메틸화가 감소하고, 발현 수준이 높음을 발견하였으며, CDA가 과발현된 ALK 저해제 내성 비소세포폐암에 디옥시시티딘(deoxycytidine)이 후성유전학적으로 산화된 형태의 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체가 우수한 암세포 성장 억제 효과를 나타낸다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 CDA(cytidine deaminase) 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 CDA(cytidine deaminase) 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제로 이루어진 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 CDA(cytidine deaminase) 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제로 필수적으로 이루어진 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 EML4-ALK 양성 폐암 환자의 치료용 약물 선택을 위한 정보를 제공하기 위하여, EML4-ALK 양성 폐암 환자로부터 제공된 생물학적 시료로부터 CDA(cytidine deaminase) 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료용 약물 선택을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 필수적으로 이루어진, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 치료용 제제를 제조하기 위한 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 치료 방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CDA(cytidine deaminase) 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CDA(cytidine deaminase) 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제로 이루어진 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CDA(cytidine deaminase) 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제로 필수적으로 이루어진 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 EML4-ALK 양성 폐암 환자의 치료용 약물 선택을 위한 정보를 제공하기 위하여, EML4-ALK 양성 폐암 환자로부터 제공된 생물학적 시료로부터 CDA(cytidine deaminase) 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료용 약물 선택을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 필수적으로 이루어진, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 치료용 제제를 제조하기 위한 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 치료 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, ALK 저해제에 내성을 나타내는 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 세포주에서는 ALK 저해제에 내성을 나타내지 않는 세포주와 비교해 CDA(cytidine deaminase) 유전자 내 메틸화 수준이 감소되어 있고, 결과적으로 CDA 유전자의 발현 수준이 현저히 증가되어 있는 것으로 확인이 되었다. 따라서, EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 CDA 유전자 또는 단백질의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 검출함으로써 ALK 저해제에 내성을 나타낼 것인지 여부를 판단할 수 있다.
이에, 본 발명은 CDA 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 EML4-ALK 양성 폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공용 조성물을 제공한다.
상기 CDA는 cytidine(혹은 deoxycytidine)을 uridine (혹은 deoxyuridine)으로 변환시키는 활성을 갖는 효소를 의미하는 것으로, CDA (cytidine deaminase; EC number 3.5.4.5; 예컨대, CDD): GenBank Accession Nos. NP_001776.1 (유전자: NM_001785.2), CAA06460.1 (유전자: AJ005261.1), NP_416648.1 (유전자: NC_000913.3) 등의 서열을 참고할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 상기 CDA 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 및 상기 CDA 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
[서열번호 1]
maqkrpactl kpecvqqllv csqeakksay cpyshfpvga alltqegrif kgcnienacy
plgicaerta iqkavsegyk dfraiaiasd mqddfispcg acrqvmrefg tnwpvymtkp
dgtyivmtvq ellpssfgpe dlqktq
[서열번호 2]
a tggcccagaa gcgtcctgcc tgcaccctga agcctgagtg tgtccagcag ctgctggttt
gctcccagga ggccaagaag tcagcctact gcccctacag tcactttcct gtgggggctg
ccctgctcac ccaggagggg agaatcttca aagggtgcaa catagaaaat gcctgctacc
cgctgggcat ctgtgctgaa cggaccgcta tccagaaggc cgtctcagaa gggtacaagg
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cctgcaggca agtcatgaga gagtttggca ccaactggcc cgtgtacatg accaagccgg
atggtacgta tattgtcatg acggtccagg agctgctgcc ctcctccttt gggcctgagg
acctgcagaa gacccagtga
본 발명에서 상기 "EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자"는 비소세포폐암 환자 중 ALK 유전자의 변이가 발생한 환자를 말한다. 상기 ALK 유전자의 변이는 EML4와 ALK 유전자가 융합되는 것으로부터 형성될 수 있다. 융합이 일어난 유전자는 EML4-ALK을 발현함으로써 암을 유발시킨다.
본 발명의 상기 조성물을 통해 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 CDA 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 측정함으로써 ALK 저해제에 내성을 획득했는지 여부를 판단한 후, 치료 약물 선택을 위한 정보를 제공할 수 있다.
구체적으로는, 본 발명의 상기 조성물을 통해 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 CDA 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 분석해 본 결과, ALK 저해제에 내성을 획득하지 않은 환자군과 비교해 CDA 단백질 또는 유전자의 발현 수준이 증가되어 있거나, 또는 CDA 유전자의 메틸화(methylation) 수준이 감소되어 있다면, 해당 환자는 ALK 저해제에 내성을 획득한 환자로 판단할 수 있기 때문에 ALK 저해제를 치료약물로 선정하는 것을 배제할 수 있다.
반대로, 본 발명의 상기 조성물을 통해 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 CDA 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 분석해 본 결과, ALK 저해제에 내성을 획득하지 않은 환자군과 비교해 CDA 단백질 또는 유전자의 발현 수준이 감소되어 있거나 변동이 없으며, 또는 CDA 유전자의 메틸화(methylation) 수준이 증가되어 있거나 변동이 없다면, 해당 환자는 ALK 저해제에 내성을 획득하지 않은 환자로 판단할 수 있기 때문에, ALK 저해제를 치료약물로 선정할 수 있다.
또는, EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자에 ALK 저해제를 일정 기간 투여한 후, 본 발명의 상기 조성물을 통해 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 CDA 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 분석함으로써 ALK 저해제를 지속적으로 투여할지 여부에 대한 판단을 내릴 수 있다.
본 발명에서, 상기 "ALK 저해제"는 상기 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자에 치료 효과를 나타내는 약물로, EML4-ALK의 카이네이즈 활성을 억제시키는 약물을 의미한다. 본 발명에 있어서, ALK 저해제에 대한 내성 획득 여부는 비소세포폐암 환자에게 비소세포폐암의 치료를 위해 ALK 저해제를 일정 기간 투여하였을 때, 약물이 투여된 초기의 약물 반응과 비교하여 일정 기간 약물을 투여한 후에 ALK 저해제에 대해 극히 낮은 감수성을 나타내어 암의 증세가 호전, 완화, 경감 또는 치료 증상을 나타내지 않거나, 2차적 ALK 돌연변이가 없고, 다른 ALK 저해제를 투여한 후에도 암이 진행성을 나타내었을 때 ALK 저해제에 대해 비의존적 내성을 획득했다고 말할 수 있다. 특히 상기와 같이 ALK 저해제에 내성을 획득한 경우, CDA 유전자 또는 단백질의 발현 수준 증가, 또는 CDA 유전자 메틸화의 감소는 내성 유발에 중요한 인자라 말할 수 있다. 상기 비소세포폐암의 진행은 암의 발생을 이미징하여 확인할 수 있는 모든 수단, 예를 들어 컴퓨터 단층촬영(CT), 자기공명영상(MRI), 초음파, X-선 영상, 유방조영술, PET 스캔, 방사성 핵종 스캔, 뼈 스캔 등의 영상화 기법을 통해 확인할 수 있는 것이라면 그 수단이 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 ALK 저해제는 크리조티닙(crizotinib), 세리티닙(ceritinib), 알렉티닙(alectinib), 브리가티닙(brigatinib) 및 엔트렉티닙(entrectinib)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 '발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 '단백질'은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 발명에서 용어 '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)' 또는 '핵산'은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 'mRNA'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자로부터 아미노산 서열을 특정하게 되는 리보솜으로 유전 정보(유전자 특이적 염기 서열)를 전달하는 RNA이다.
본 발명에서 상기 제제는 CDA 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머; 또는 상기 CDA 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
본 발명에서 용어 '항체(antibody)'는 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 면역글로불린(immunoglobulin)을 의미한다. 본 발명에서의 CDA 항체는 CDA 이외의 다른 단백질에는 반응하지 않고, CDA 단백질에만 특이적으로 결합하는 항체이다. 본 발명에서 CDA 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질(CDA)에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 상기 항체는 CDA 코딩 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 수득하고, 수득한 단백질을 동물에 주입하여 생성되는 항체를 수득하는 등의 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 상기 CDA 항체는 CDA 전장 서열 단백질을 통해 제작되는 것일 수도 있고, 또는 CDA 단백질의 항원성 부위를 포함하는 폴리펩타이드 단편을 이용하여 제조할 수도 있다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 다클론항체(polyclonal antibody) 또는 단일클론항체(monoclonal antibody)를 포함한다. 또한 항원-항체 결합성(반응)을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, CDA에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 CDA 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.
본 발명에서 용어 '앱타머'는 시료 내의 검출하고자 하는 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 특이적으로 시료 내의 표적 단백질의 존재를 확인할 수 있다. 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에따라, 확인하고자 하는 표적 단백질(본 발명에서는 CDA 단백질)에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 앱타머 칩의 관능기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 CDA 유전자의 발현 수준을 측정한다는 의미는 상기 CDA 유전자로부터 파생되는 전사물들의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 의미이고, 일례로 CDA mRNA 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다.
따라서 CDA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 상기 유전자로부터 발현된 mRNA를 검출하는 제제를 의미하는 것일 수 있다. 따라서 CDA 유전자를 검출하는 제제는, 상기 유전자로부터 발현된 mRNA에 특이적으로 부착 또는 혼성화(hybridization)하는 리간드라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 프라이머(쌍) 또는 프로브일 수 있다.
상기 '프라이머'는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서 CDA mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머는 CDA 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 CDA mRNA 또는 CDA cDNA의 특정 구간을 증폭하여 CDA mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 CDA mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 CDA mRNA 또는 cDNA 염기서열을 참조하여 용이하게 디자인할 수 있다.
'프로브(probe)'는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 CDA mRNA에 상보적인 프로브를 피검체의 시료와 혼성화 반응(hybridization)을 수행하여 CDA mRNA의 발현양을 측정함으로써 혈관성 치매의 진단에 이용할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 CDA mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
본 발명의 상기 조성물 CDA 단백질의 발현 수준을 측정하기 위하여 선택적으로 CDA 단백질을 마커로 인식하는 항체, 앱타머 또는 CDA mRNA를 마커로 인식하는 프라이머, 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 '메틸화(methylation)'는 DNA 서열의 변동 없이 유전자의 불활성화를 초래하는 것으로 점 돌연변이, 유전자 결손 등의 유전자적 변화와 구분하여 후성학적 변화로 분류된다. 본 발명에서 상기 메틸화 수준의 변화는 과메틸화(hypermethylation), 과소메틸화(hypomethylation)을 모두 포함하는 것이다.
상기 메틸화는 DNA methyl transferase(DNMT)에 의해 CpG의 5'탄소 부위에 메틸기(-CH3)가 결합된 것이다. CpG dinucleotides가 여러 개 모여있는 CpG islands는 주로 프로모터나 근처에 또는 exon의 시작 부위에 위치하는데 CpG islands에 메틸기(methyl)가 결합하면, mRNA 전사가 방해를 받아서 유전자 발현이 억제된다.
따라서, 본 발명에서 상기 CDA 유전자 메틸화 수준은 CDA 유전자의 프로모터 또는 인핸서 부위에서의 메틸화 수준일 수 있다.
본 발명에서 상기 '메틸화 수준을 측정하는 제제'는 CDA 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 제제는 CDA 유전자의 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 확장 프라이머를 포함할 수 있다.
상기 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 CpG 섬의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다. 또한, 변형된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 확장 프라이머일 수 있다.
또한, 본 발명에서 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물, 상기 유전자의 변형된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 확장 프라이머 (extension primer)를 포함할 수 있다.
상기 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트 (bisulfite)일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트이다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화된 사이토신 잔기를 변형시켜 프로모터의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(Herman JG et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9821 - 9826; WO01/26536; US2003/0148326A1).
또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 CpG 섬의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서, 바람직하게는 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소이다. 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 C에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고 이를 PCR 또는 서던블롯 (Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 조성물은 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공용 키트의 형태로 제공이 될 수도 있다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. 구체적인 일 양태로서, 상기 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머를 포함한다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로는, 바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료용 약물 선택을 위한 정보를 제공하기 위하여, EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자로부터 제공된 생물학적 시료로부터 CDA(cytidine deaminase) 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료용 약물 선택을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 본 발명에서 용어 '측정'은 바람직하게 '분석'을 의미하는 것일 수 있고, 상기 분석은 정성 또는 정량 분석일 수 있다. 상기 정성 분석은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있으며, 상기 정량분석은 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준) 또는 양의 변화를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명에서 분석 또는 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한없이 수행될 수 있으며, 바람직하게는 정량적인 측정이 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 시료는 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자로부터 수득한 것이라면 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 암 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료(체액 시료)를 사용하는 것일 수 있으며, 일례로 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질 분비물, 소변 및 뇌척수액을 사용하는 것일 수 있다.
상기 시료는 분석 또는 측정에 사용하기 전에 전처리될 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 CDA 단백질 발현 수준 측정은 당업계에 공지된 단백질 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트면역전기영동, 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질칩으로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 유전자 발현 수준 측정은 당업계에 공지된 유전자 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(southern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 유전자의 메틸화 수준 측정은 당업계에 공지된 유전자 메틸화 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 이루어진 군에서 선택된 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 방법에 따라 특정 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 상기 CDA 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 측정한 결과, CDA(cytidine deaminase) 단백질 또는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 높거나, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준이 대조군에 비하여 낮을 경우, ALK 저해제에 대한 상기 비소세포폐암 환자의 반응성이 낮을 것으로 판단할 수 있다. 즉, 상기 환자는 ALK 저해제에 내성을 나타내는 비소세포폐암 환자일 수 있기 때문에 ALK 저해제가 아닌 다른 치료제를 선택하여 치료전략을 세우는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, ALK 저해제에 내성을 나타내는 비소세포폐암 세포주에 디옥시시티딘 유사체를 처리한 결과 암 세포의 사멸이 유도되는 것으로 확인되었다.
본 발명에서 상기 디옥시시티딘 유사체는 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 5hmdC (5-hydroxymethyl-2'-deoxycitidine), 5fdC (5-formyl-2'-deoxycytidine), 5cadC (5-carboxyl-2'-deoxycitidine) 등을 들 수 있다(Nature. 2015;524(7563):114-8).
바람직하게는, 본 발명에서 상기 디옥시시티딘 유사체는 5hmdC 또는 5fdC일 수 있다.
본 발명에 일실시예에 따르면, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암은 CDA를 과발현하며, CDA는 5hmdC 및 5fdC를 유리딘 변이체로 전환시킨다. 이렇게 변환된 유리딘 변이체는 DNA로 삽입되어 DNA 데미지를 축적시키고, 결국 세포 사멸을 유도할 수 있다.
따라서, 본 발명에서 상기 약학적 조성물은 특히 CDA 단백질 또는 mRNA의 발현이 증가되어 있거나, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준이 감소되어 있는 비소세포폐암에서 그 효과가 매우 우수할 수 있다.
본 발명에 따른 디옥시시티딘 유사체는 그 자체 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 부여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말하여, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한, 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 디옥시시티딘 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 당업계에 공지되어 있는 것을 참고로 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 조성물은 ALK 저해제와 병용하여 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 상기 조성물이 ALK 저해제와 병용하여 투여될 때, 상기 조성물은 단일 조성물의 형태로 각각 투여되거나 또는 복합제의 형태로 동시에 투여될 수 있다. 즉, 상기 조성물은 ALK 저해제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있으며, 순차적으로 투여될 때 투여순서에 특별한 제한은 없다.
본 발명은 ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 치료용 제제를 제조하기 위한 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
본 발명은 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 '유효량'이란 개체에게 투여하였을 때, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암의 개선, 치료, 예방, 검출, 진단 또는 상기 질환의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체'란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 발명의 상기 '치료'는 ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 또는 상기 질환의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 상기 질환을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "을 포함하는(comprising)"이란 "함유하는(including)" 또는 "특징으로 하는(characterized by)"과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 "로 이루어지는(consisting of)"이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 "필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)"이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명이 제공하는 조성물 및 방법에 따르면 ALK 저해제에 내성을 나타내는 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자를 정확하게 구분할 수 있어, EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료를 위한 약물 선택에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 디옥시시티딘 유사체를 포함하는 본원발명의 조성물은 ALK 저해제에 내성을 나타내는 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자에 우수한 항암효과를 나타낼 수 있다.
도 1a 내지 도 1f는 H3122 및 LR 세포에서 DNA 메틸화 수준의 변화를 확인한 결과이다. (도 1a) 내성 획득 세포의 특성을 분석하기 위한 실험적인 작업 흐름. 세리티닙 저항성 세포인 LR 세포는 세리티닙의 농도를 증가시켜 처리함으로써 확립되었다. (도 1b) LR 및 H3122와 비교하여 DEG (differentially expressed genes)를 나타내는 히트맵. (도 1c) DNA 메틸트랜스퍼라제 (DNMT) 및 TET (Ten-eleven translocation) 패밀리의 상대 mRNA 발현을 qRT-PCR에 의해 분석한 결과. (도 1d) 41,223 CpG에서 H3122와 LR 세포 사이의 차별적으로 메틸화된 유전자좌의 히트맵. (도 1e) H3122와 LR 사이의 DNA 메틸화와 mRNA 발현 수준의 차이의 상관 관계. (도 1f) KEGG 경로 및 생물학적 과정에서 차별적으로 메틸화된 유전자에 대한 유전자 세트 분석.
도 2는 나이브(naive) 및 내성 세포주에서의 DNA 메틸화 및 mRNA 발현의 변화를 확인한 결과이다. CDA의 DNA 메틸화 수준을 개별 Infinium Human Methylation 450K BeadChip 프로브 (빨간색 선)에서 메틸화 비율 (검정)을 나타내는 원형 차트로 표시했다. CDA의 경우 cg04087271, cg20619374 및 cg06984156. 그래프는 H3122 및 LR 세포주에서 CDA의 mRNA 수준의 상대적인 배수 변화.
도 3a 내지 도 3f는 H3122 및 LR 세포로부터의 단일 세포 RNA 서열 분석 결과를 나타낸다. (도 3a) H3122 (청색, N = 4,977) 및 LR (적색, N = 2,250) 세포의 scRNA-seq 결과를 나타내는 t-SNE 플롯. (도 3b) H3122 및 LR 세포로부터 10 개의 클러스터 (C0 내지 C9)를 시각화하는 t-SNE. (도 3c) 클러스터에서 H3122 및 LR 세포의 비율. (도 3d) 10 클러스터에서 H3122 및 LR 세포의 세포 주기 상태의 비율. (도 3e) 2 차원 (위)으로 도시되고 10 개의 클러스터에서 강조된 H3122 및 LR 세포의 궤적 분석. (도 3f)3122와 LR 사이의 전체 세포에서 다르게 발현된 유전자의 히트맵.
도 4a 내지 도 4c는 H3122 및 LR 세포 집단에서 CDA의 단일 세포 발현 분석을 나타낸 결과이다 (도 4a) t-SNE 맵에서 CDA의 발현. (도 4b) 각 클러스터에서 CDA의 발현을 나타내는 바이올린 플롯. 각 점은 각 단일 세포에서 유전자 발현을 나타냄. (도 4c) 시간에 따라 나이브와 내성 상태 사이에서 CDA의 발현을 보여주는 발현 히트맵(세포는 시간으로 정렬되며 색상은 발현 수준을 나타냄).
도 5a 내지 도 5c 및 도 6은 CDA 과발현 세포에서 5hmdC의 세포 독성을 평가한 결과이다 (도 5a) H3122, LR, H1299 및 H1703 세포에서 CDA mRNA 발현 수준 (상단) 및 단백질 발현 수준 (하단). (도 5b) 10 일 동안 5hmdC로 처리된 H3122, LR, H1299 및 H1703 세포의 콜로니 형성. (도 5c) 지시된 시간 동안 5hmdC (0 μM, 검은 색; 1 μM, 파랑; 5 μM, 마젠타; 10 μM, 빨강)로 처리된 H3122, LR, H1299 및 H1703 세포의 세포 성장 곡선. (도 6) H3122, LR, H1299 및 H1703 세포에서 γH2AX의 면역 형광 (녹색). DMSO 및 5hmdC (10 uM)를 처리하였다. 핵 DNA를 DAPI (청색)로 염색하였다.
도 7a 내지 도 7c 은 CDA 발현은 TCGA 데이터베이스에 기초한 폐선암종 (LUAD) 환자의 전체 생존과 관련이 있음을 확인한 결과이다. (도 7a) LUAD 샘플 (n = 483) 및 정상 조직 샘플 (n = 347)에서 CDA의 발현 수준. (도 7b) CDA의 발현 수준이 낮거나 높은 환자의 전체 생존율을 Kaplan-Meier 방법 및 LUAD에서 로그 순위 테스트에 의해 분석한 결과. (도 7c) 세리티닙에 대한 획득 내성을 극복하기 위해 5hmdC로 CDA를 표적화 하기 위한 모델. 세리티닙에 대한 획득 내성 동안, CDA 메틸화가 감소되고 CDA 발현이 증가된다. 5hmdC와 같은 후성 유전적 뉴클레오사이드는 CDA 과발현 내성 세포에서 DNA 손상 및 세포 사멸을 유도할 수 있음.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실험방법
1. 세포주
폐암 세포주, H3122, H1299 및 H1703을 1% 항생제 (Gibco, Cat 번호 15240062 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 및 10% 태아 소 혈청 (HyClone, UT, USA). Ceritinib (LDK378)이 보충된 RPMI-1640 배지 (WELGENE, Cat 번호 LM 011-01, 한국)에서 배양했다. 내성 LR 세포는 이전 연구에서 확립되었다. 또한, H3122-LR 세포는 크리조티닙(crizotinib) 및 롤라티닙(lorlatinib)에 대한 내성 또한 가지고 있다는 것이 확인된 바 있다(Yun MR et al., Enhancer Remodeling and MicroRNA Alterations Are Associated with Acquired Resistance to ALK Inhibitors. Cancer Res. 2018 Jun 15;78(12):3350-3362 참조). 간략하게, H3122 세포에 세리티닙(ceritinib)을 IC30으로 시작하여 점차 농도를 증가시켜 배양하고, 연속적인 1μM 세리티닙 처리 조건에서 대략 6 개월의 배양 후 내성 세포를 유도하였다. 모든 세포를 5% CO2를 함유한 가습 대기에서 37℃로 유지시켰다.
2. RNA 시퀀싱 분석 (Bulk RNA-seq analysis)
RNA-Seq 라이브러리는 TruSeq RNA 샘플 준비 키트 (Illumina, San Diego, CA, USA)를 사용하여 준비했고, 시퀀싱은 Illumina HiSeq2000 플랫폼을 사용하여 100 bp 페어드 엔드 리드를 생성하였다. 서열화된 판독값은 STAR (v.2.5.1)를 사용하여 인간 게놈 (hg19)에 맵핑하였고, 유전자 발현 수준은 STAR에서 카운트 모듈로 정량화되었다. edgeR (v.3.12.1) 패키지는 RNA-seq 카운트 데이터에서 차등 발현 유전자 (DEG)를 선택하는데 사용되었다. 한편, TMM (the trimmed mean of M-values normalization)은 각 유전자의 CPM (백만 당 수)을 정규화하고, 추가 분석을 위해 log2-변형하였다.
3. 유전자 세트 및 경로 분석
DAVID (v.6.8)를 사용하여 DNA 메틸화 변화와 관련된 DEG에 대해 유전자 세트 및 경로 분석을 수행하였다. p-값 <0.05의 컷오프 임계 값을 사용하여 유의하게 풍부한 경로를 수득하였다. 추가 분석을 위해 적어도 3 개의 돌연변이 된 유전자가 풍부한 유전자 세트만 고려하였다.
4. qPCR 분석
제조사의 지시에 따라 RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen # 74136)를 사용하여 RNA를 분리하였다. iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Cat. No. 1708890)를 사용하여 1μg RNA로부터 cDNA를 합성하였다. PCR 반응은 200ng의 cDNA, 7.5μl의 SYBR GREEN, 0.3μl의 각 프라이머를 사용하여 각 샘플에 대해 3 번씩 수행되었다. 유전자의 발현값은 beta-액틴으로 정규화했다.
5. DNA 메틸화 분석
H3122 및 LR 세포의 DNA 메틸화 분석은 제조사의 프로토콜에 따라 Illumina Infinium 메틸화 450K 비드 칩 어레이 (San Diego, CA, USA)를 사용하여 이중으로 분석하였다. 생성된 DNA 메틸/비-메틸 신호 강도 데이터를 분석을 위해 R (v.3.4.2)로 가져왔다. minfi R 패키지 3, v.1.30.0을 사용하여 백그라운드 보정과 함께 SWAN 방법을 사용하여 정규화를 수행하였다. 검출 p-값 <0.05 및 DNA 메틸화 값을 갖는 프로브를 표준화된 평균 베타 값으로 요약하였다. H3122와 LR 사이의 차별적으로 메틸화된 영역 (DMR)의 확인 및 추출을 위해, DMRcate 4, v.1.20.0 R 패키지를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. DMR은 p 값 <0.05 및 평균 차이가 15%를 초과하는 프로브로 선택되었다.
6. 단일 세포 RNA-seq 라이브러리 제조 및 시퀀싱
10x Genomics 단일 세포 3 'v2 시약 키트 사용 설명서에 요약된대로 샘플을 준비했다. Chromium Single Cell 3 '라이브러리 및 Gel Bead Kit V2 (PN-120237), Chromium Single Cell 3'Chip Kit V2 (PN-120236) 및 Chromium i7 Multiplex Kit (PN-120262)를 10x Genomics Chromium과 함께 사용했다. 샘플은 다음 실행 매개 변수를 사용하여 HiSeq 2500에서 시퀀싱 되었다. Read 1-26 사이클, read 2-98 사이클, index 1-8 사이클. 60,000회 판독/셀의 중간 시퀀싱 깊이가 각 샘플에 대해 표적화되었다.
7. 단일 세포 RNA-seq 데이터 처리 및 분석
전처리 후 10X 게놈에 의해 제공되는 파이프 라인이 이어졌다. Raw 시퀀싱 데이터 (bcl 파일)를 fastq로 변환하고 인간 참조 게놈 hg19에 맞추는 과정은 Cell Ranger 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 세포 레인저 카운트 모듈을 사용하여 미가공 유전자 발현 매트릭스를 생성하였다. H3122 및 LR 데이터를 집계하기 위해 셀 레인저의 'aggr'모듈이 '정규화' 옵션없이 사용되었다. 나머지 프로세스는 R (https://www.R-project.org/) 및 Seurat 5, v.2.4의 안내 분석 파이프 라인을 사용하여 수행되었다.
세포 및 유전자 여과 공정은 3 개 이상의 세포에서 발현된 유전자 및 200 개 이상의 유전자에서 발현된 세포만을 포함하였다. 미토콘드리아 게놈 전사체 비율이 50%를 초과하는 세포는 용해된 것으로 간주하여 배제하였다. 데이터 정규화를 위해 글로벌-스케일링 정규화 방법인 'LogNormalize'가 기본 매개 변수와 함께 사용되었다. 가변 유전자의 선택, 데이터 스케일링 및 선형 치수 감소 단계를 Seurat 유도 분석 파이프 라인에 따라 순차적으로 수행하였다. 데이터 세트의 '차원'을 결정하기 위해 엘보 플롯(elbow plot)을 확인하고 10 PC를 결정했다. Seurat의 'FindClusters'모듈을 사용하여 셀을 클러스터링하고 Seurat에서 구현된 tSNE (t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding)를 사용하여 클러스터를 시각화했다. 각 클러스터에서 DEG를 찾기 위해 'FindAllMarkers'모듈을 사용했다.
8. 웨스턴 블롯
세포를 Laemmli Lysis-buffer (4 % (w/v) SDS, 20% 글리세롤, 120mM Tris-Cl (pH 6.8))에 용해시키고 프로테아제 억제제 (Roche, Cat. No. 5892791001)를 보충하였다. 단백질의 농도는 Bradford 단백질 분석 키트 (BioRad)를 사용하여 결정되었다. 단백질을 100℃에서 5 분 동안 비등시켰다. 단백질을 10-15 % SDS-PAGE 겔에 로딩하고 PVDF 막 (Roche, Cat. No. 3010040001)으로 옮겼다. TBS-T로 5% 탈지유 (BD, Cat. No. 232100) 또는 5% BSA (Sigma-Aldrich, Cat. No. A7906)로 차단한 후, 막을 지시된 1 차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. TBS-T로 세척한 후, 막을 2 차 항체 반응 (염소 항-마우스, Invitrogen, 31430; 염소 항-토끼, Invitrogen, 31460; 1 : 5000 비)을 위해 실온에서 30 분 동안 인큐베이션 하였다. TBS-T로 세척한 후, 블롯은 ECL 키트 (Advansta, Cat. No. K-12045-D50)에 의해 검출되었고 후지 필름 LAS-4000을 사용하여 시각화되었다.
9. 콜로니 형성 어세이
수확된 세포를 Countess 자동화 세포 계수기 (캘리포니아 주 칼스 배드 소재의 Invitrogen)에서 계수하고 6 웰 플레이트 (Corning, Cat. No. 3506)에 시딩 하였다. 플레이트를 5% CO2에서 37℃에서 배양하였다. 세포를 0.5% 크리스탈 바이올렛, 3.7% 포름알데히드 및 30% 에탄올로 고정 및 염색했다. 모든 분석은 3 회 수행했고, 2 회 이상의 독립적인 실험에서 반복했다.
10. 세포 분화 어세이
수확된 세포를 Countess 자동화 세포 계수기에서 계수하고 24 웰 플레이트 (Corning, Cat. No. 3524)에서 플레이팅 하였다. IncuCyte ZOOM 시스템 (Essen Biosciences)을 사용하여 2 시간마다 현미경 사진을 찍었고, 배양의 컨플루언스(confluence)는 160 시간에 걸쳐 Incucyte 소프트웨어 (Essen Biosciences)를 사용하여 측정되었습니다.
11. gammaH2A.X에 대한 면역형광염색
세포를 8 웰 (Lab-Tek II, Cat. No. 15446)에 플레이팅하고 37℃에서 5% CO2에서 배양 하였다. 세포를 차가운 DPBS (WELGENE, Cat. No. LB001-02)로 2회 세척하고 4% 파라포름 알데히드 (Biosesang, Cat. No. P2031)로 2 시간 동안 실온에서 고정시켰다. 차가운 DPBS에서 3 회 세척 한 후, 세포를 0.25% Triton X-100 (Sigma Aldrich, Cat. No. T9284)에서 10 분간 투과시켰다. 세척 후, 가습 챔버에서 4℃에서 밤새 세포를 차단하였다. 세포를 차가운 DPBS로 세척하고 가습 챔버에서 4℃에서 밤새 γH2A.X 항체 (Cell Signaling, Cat. No. 9718s, 1 : 500)와 함께 배양하였다. 세척 후, 세포를 Alexa 568 (1 : 400, Life Technologies) 및 DAPI (Sigma Aldrich)와 접합된 항-토끼 이차 항체와 배양하였다. 10x 렌즈를 사용하여 Nikon ECLIPSE Ti-S 및 Intensilight C-HGFI로 세포를 캡쳐했다.
실험결과
1. 세리티닙(ceritinib)에 대한 내성 획득 과정 동안 DNA 메틸화의 변화
NSCLC에서 ALK 억제제에 대한 저항성의 획득 과정 동안, DNA 메틸롬(methylome) 및 전사체(transcriptome) 변화를 탐색하기 위해, 본 발명자는 EML4-ALK 융합 양성 폐암 세포주, H3122 및 이전에 확립된 세리티닙-내성 세포주 (LR)의 450K BeadChip DNA 메틸화 분석, RNA-seq 및 scRNA-seq를 수행하였다(도 1a). RNA-seq에서 검출 가능한 유전자 (n = 10,519) 중, 13% 유전자 (n = 1,403)는 상향 조절되고 14 % 유전자 (n = 1,535)는 내성 세포에서 하향 조절되었다 (Fold Change> 2, FDR) <0.05) (도 1b). CYP4F11 (Cytochrome P450 4F11), AXL (AXL receptor tyrosine kinase), 및 EDIL3 (EGF like repeats and Discoidin Domains 3)이 가장 크게 상향 조정되었으며 GLB1L2 (Galactosidase Beta 1 Like 2) 및 DUSP6(Dual Specificity Phosphatase 6)이 가장 크게 하향 조정되었다. DNA 메틸트랜스퍼라제 (DNMT) 및 DNA 탈메틸라제 (TET)는 내성 세포에서 하향 조절되었다.
본 발명자는 qRT-PCR을 사용하여 DNMT 및 TET의 mRNA 발현 수준을 확인했는데, 전사체 변화뿐만 아니라 DNA 메틸롬 변화가 내성 형성 과정 동안 발생할 수 있음을 확인하였다(도 1c).
이러한 전사 변화가 DNA 메틸화 변화와 연관되어 있는지 여부를 조사하기 위해 본발명자는 인피니움 인간 메틸화 450K 배열을 사용하여 게놈 전체 메틸화 변화를 분석했다. LR세포에서 23,426 개의 CpG가 과메틸화 되었고 17,797 개의 CpG가 저메틸화되었다(도 1d). DNA 메틸화 및 유전자 발현의 통합 분석을 통해, 본 발명자는 XYLT1 (Xylosyltransferase 1) 및 DUSP6을 포함한 1,002 개의 유전자가 과메틸화되고 하향 조절되었으며, ANKRD2 (Ankyrin Repeat Domain 2) 및 CDA(Cytidine deaminase) 를 포함한 809 개의 유전자가 저메틸화되고 상향-조절 되었음을 확인하였다 (도 1e).
과메틸화 및 하향 조절된 유전자는 세포 자멸사, 세포 증식 및 MAPK 신호 전달의 음성 조절과 관련이 있었고(도 1f), 저메틸화 및 상향 조절된 유전자는 세포 부착, 세포 이동 및 히포 신호 전달과 관련이 있었다(도 1f). 이들 데이터는 전사 가소성이 세리티닙 내성 획득 과정 동안 DNA 메틸화 변화와 같은 안정한 후성 유전적 변형을 유도할 수 있음을 시사한다.
2. 세리티닙 내성 획득 과정 동안 CDA의 탈메틸화
CDA의 발현 수준은 LR 세포주에서 5배 증가하였다 (도 2c). CDA의 프로모터 및 추정적 인핸서 영역은 LR 세포주에서 메틸화가 감소된 것으로 나타났다 (도 2c). 이들 데이터는 전사 가소성이 내성 획득 과정 동안 프로모터 및 인핸서에서 DNA 메틸화 변화를 유도할 수 있음을 시사한다.
3. 나이브(naive) 및 내성 세포주의 이질성
나이브 및 내성 세포의 이질성을 탐색하기 위해, 본 발명자는 10X Genomics Single Cell 3 'Solution을 사용하여 scRNA-seq를 수행했다. 7,532 개의 세포에서 약 89,000 개의 평균 판독/세포 및 3,800 개의 중간 유전자/세포를 얻었다(결과 미도시). t-SNE 분석에 따르면, 나이브 세포는 7 개의 그룹으로 나눌수 있고 내성 세포는 하나의 주 그룹과 두 개의 특이치 그룹을 가지고 있었다 (도 3a 및 b).
클러스터 0, 4 및 7은 대부분 저항성 세포를 가지고 있다 (도 3c). 흥미롭게도, 이러한 클러스터는 세포주기 분석에서 G2/M 및 S 단계를 보여주었으며 (도 3d), 내성 세포가 고도로 증식한다는 것을 나타낸다. 클러스터 3 및 9의 대부분의 세포는 나이브 한 세포이지만 G2/M 또는 S 단계에서도 증식했다. 모노클(monocle)을 사용한 모든 세포의 궤적 분석은 나이브 및 내성 세포의 불일치를 보여준다 (도 3e).
본 발명자는 각각 1.5 배 이상의 증가 또는 감소된 발현을 나타내는 176 및 127 개의 유전자를 검출하였다 (FDR <0.001, 도 3f). FTL (Ferritin Light Chain), CLPTM1L (Cisplatin Resistance-Related Protein 9), 및 CDA는 내성 세포에서 가장 상향 조절된 유전자이었다.
4. 세리티닙 내성 형성 과정 동안 CDA의 발현 증가
다음으로 t-SNE 분석을 사용하여 CDA의 발현 수준의 세포간 차이를 확인했다. 예상한 바와 같이, CDA는 내성 세포주에서 높게 발현이 되었다 (도 4a). 흥미롭게도, 본 발명자들은 나이브 세포 중에서 CDA를 과발현 세포를 발견하였으며, 이는 CDA 과발현 세포가 세리티닙 치료에 이점을 가질 수 있음을 시사한다.
바이올린 플롯 결과에서도 또한 CDA 과발현 세포주는 주로 내성 세포 클러스터 0, 4 및 7에 분포가 되어 있는 것으로 확인되었지만, 드물게는 나이브 세포 클러스터에도 CDA 과발현 세포주가 존재하는 것으로 확인되었다 (도 4b).
Pseudotime으로 정렬된 발현 히트맵은 CDA가 세리티닙 내성 형성 과정 동안 지속적으로 증가함을 보여주었습니다 (도 4c).
이들 데이터는 나이브 세포 중에서 CDA 과발현 세포가 내성 획득 과정 동안 선택되고 전파될 수 있음을 시사한다.
5. 5hmdC와 5fdC는 선택적으로 CDA를 과발현하는 세포의 성장을 저해함
CDA는 나이브 세포와 내성 세포 사이에 일관된 발현 패턴을 나타내는 최고 신뢰도 후보 중 하나이다.
본 발명자는 5hmdC 혹은 5fdC의 처리가 LR 세포의 성장을 억제하는지 여부를 조사했다. 폐암 세포주 H1299 및 H1703을 CDA의 발현 수준이 낮은 대조군으로 사용하였다 (도 5a). 5hmdC 혹은 5fdC 처리는 LR 세포에서 용량 의존적으로 콜로니 형성을 감소시켰다 (도 5b).
고용량 (10 uM) 5hmdC 혹은 5fdC 처리는 또한 H3122에서는 콜로니 형성을 감소시켰지만 H1299 및 H1703에서는 그렇지 않았다. 이는 5hmdC 혹은 5fdC 가 CDA 과발현 세포의 세포 성장을 선택적으로 억제함을 시사한다.
세포 이미징 분석에서 유사한 용량 의존적 효과가 관찰되었다 (도 5c). 5fdC가 LR 세포에서 DNA 손상을 유발하는지 확인하기 위해, 본 발명자는 10 uM 5fdC로 처리된 세포에서 γ-H2AX에 대한 면역 형광 염색을 수행하였다. LR 세포는 증식 세포수의 3배 감소 및 DNA 손상으로 세포수의 2.5 배 증가를 나타냈다 (도 6). 이러한 결과는 CDA 과발현 내성 세포가 DNA 손상의 축적으로 인해 5fdC에 취약하다는 것을 입증한다.
6. CDA의 과발현은 항암제 내성 및 폐암 환자의 낮은 생존율과 관련이 있음
폐암에서 CDA의 임상적 관련성을 조사하기 위해 TCGA 및 GTEx 데이터 기반 도구 인 GEPIA를 사용하여 폐선암종 (LUAD)에서 CDA 발현 수준을 분석했다. CDA의 중간 발현 수준이 종양 (n = 483, TCGA로부터 수득) 및 정상 (n = 347, GTEx로부터 수득) 사이에서 유사하지만, 종양 샘플의 1/4은 정상 조직 샘플과 비교하여 CDA의 높은 발현 수준을 나타냈다 (도 7a). 또한, CDA 발현이 높은 LUAD 환자의 전체 생존 (OS)은 CDA 발현이 낮은 환자의 생존보다 현저히 낮았다 (도 7b).
본 발명이 제공하는 조성물 및 방법에 따르면 ALK 저해제에 내성을 나타내는 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자를 정확하게 구분할 수 있어, EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료를 위한 약물 선택에 매우 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 디옥시시티딘 유사체를 포함하는 본원발명의 조성물은 ALK 저해제에 내성을 나타내는 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자에 우수한 항암효과를 나타낼 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

Claims (18)

  1. CDA(cytidine deaminase) 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제제는 CDA 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머; 또는 상기 CDA 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 CDA 유전자의 메틸화 수준은 프로모터 또는 인핸서 부위에서의 메틸화 수준인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 CDA 유전자 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 효소, CDA 유전자의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료용 약물 선택을 위한 정보를 제공하기 위하여, EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자로부터 제공된 생물학적 시료로부터 CDA(cytidine deaminase) 단백질 또는 유전자의 발현 수준, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, EML4-ALK 양성 비소세포폐암 환자의 치료 약물 선택을 위한 정보 제공 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 폐 조직, 암 조직, 자궁경부 또는 질분비물, 소변 및 뇌척수액으로 이루어진 군에서 선택되는 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트면역전기영동, 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질칩으로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준 측정은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(southern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 메틸화 수준 측정은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 이루어진 군에서 선택된 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 CDA(cytidine deaminase) 단백질 또는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 높거나, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준이 대조군에 비하여 낮을 경우, ALK 저해제에 대한 상기 비소세포폐암 환자의 치료 반응성이 낮을 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 ALK 저해제는 크리조티닙(crizotinib), 세리티닙(ceritinib), 알렉티닙(alectinib), 브리가티닙(brigatinib) 및 엔트렉티닙(entrectinib)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 디옥시시티딘 유사체는 5hmdC (5-hydroxymethyl-2'-deoxycitidine) 또는 5fdC (5-formyl-2'-deoxycytidine)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 ALK 저해제와 병용 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 조성물과 ALK 저해제를 병용 투여 시 단일 약물로 순차적으로 또는 별도로 투여되거나, 또는 복합제의 형태로 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제12항에 있어서, 상기 ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암은 CDA 단백질 또는 mRNA의 발현이 증가되어 있거나, 또는 CDA 유전자의 메틸화 수준이 감소되어 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 치료용 제제를 제조하기 위한 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
  18. 디옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, ALK 저해제에 내성을 획득한 EML4-ALK 양성 비소세포폐암 치료 방법.
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