JP2022518187A - 抗体 - Google Patents

Abstract

一態様では、本発明は、対象のがんの治療における第１の表現型から抗腫瘍表現型へのマクロファージの再極性化における使用のための免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）であって、第１の表現型が、静止状態（Ｍ０）マクロファージ表現型又は抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージ表現型を含み、抗腫瘍表現型が、以下のサイトカイン及びケモカイン：腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）；インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）；インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）；インターロイキン６（ＩＬ－６）；ＲＡＮＴＥＳ又はＣＣＬ５（活性化時調節、正常Ｔ細胞発現及び分泌）；並びに／又はインターロイキン１０（ＩＬ－１０）の発現により特徴づけられる新たに極性化したマクロファージ表現型を含む、前記ＩｇＥに関する。

Description

本発明は、がん治療の分野に関し、特に、対象のがんの治療における使用のための抗体に関する。より詳細には、本発明は、マクロファージの抗腫瘍表現型への再極性化による、がんの治療における使用のための抗体及び方法に関する。

治療抗体は、現在、多数の悪性疾患のための従来の治療を補完するが、現在、開発されている殆ど全ての物質は、５つの主要なヒト抗体クラスのうちの１つのみ、すなわち、血中に最も豊富な抗体クラスであるＩｇＧに依存している（Weiner LM et al (2010) Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol 10: 317-327）。ヒト免疫系は、種々の解剖学的コンパートメントにおいて免疫監視を行い、病原体の破壊を媒介する、９つの抗体クラス及びサブクラス（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１～４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２及びＩｇＥ）を天然に備えている。しかし、ＩｇＧのみ（殆どの場合ＩｇＧ１）が、がんの免疫療法に適用されている。

１つの理由は、ＩｇＧ抗体（特にＩｇＧ１）が、ヒト血中を循環する抗体の最も大きな割合を占めることであり得る。また、抗体クラスの選択は、それぞれＦｃ領域が９つの抗体クラス及びサブクラスのうちの１つに属する同一特異性のキメラ抗体の一団を比較する１９８０年代後期の先駆的研究に基づいている（Bruggemann M et al (1987) Comparison of the effector functions of human immunoglobulins using a matched set of chimeric antibodies. J Exp Med 166: 1351-1361）。抗体は、補体存在下での抗原発現標的細胞の補体に結合する能力並びに溶血及び細胞傷害を媒介する能力について評価された。ＩｇＧ１は、インビトロでの補体依存性細胞殺傷において最も有効なＩｇＧサブクラスであるが、ＩｇＡ及びＩｇＥ抗体は、完全に不活性であった。

Ｂ細胞マーカーＣＤ２０を認識する抗体による後続の臨床試験は、ＩｇＧ１が、Ｂ細胞悪性腫瘍、例えば、非ホジキンリンパ腫を有する患者の免疫療法に最も適するサブクラスであるという推論を支持した（Alduaij W, Illidge TM (2011) The future of anti-CD20 monoclonal antibodies: are we making progress? Blood 117: 2993-3001）。この研究以来、種々の抗体クラスによる抗腫瘍作用の比較は、リンパ性悪性腫瘍を有するマウスモデル及び患者の両方においてＩｇＧ及びＩｇＭに限局されてきたが、ＩｇＡは、リンパ腫のマウスモデルにおいてインビトロ及びインビボでＡＤＣＣを媒介することが示された（Dechant M, Valerius T (2001) IgA antibodies for cancer therapy. Crit Rev Oncol Hematol 39: 69-77）。

補体媒介腫瘍細胞死は、現在、抗体が腫瘍増殖の制限を媒介し得る複数の機構のうちの１つに過ぎないことがわかっている（Weiner GJ (2007) Monoclonal antibody mechanisms of action in cancer. Immunol Res 39: 271-278）。公知の機構は、Ｆｃ領域により免疫エフェクター分子を関与させて、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び食作用（ＡＤＣＰ）によって免疫細胞により媒介される標的細胞の破壊を誘導することを含む。また、抗体は、腫瘍細胞に直接作用して、増殖シグナル伝達経路を阻害するか、アポトーシスを誘導するか、腫瘍細胞の増殖及び細胞分化を制限するか、又は腫瘍細胞の接着及び遊走を遮断し得る。一部の抗体は、腫瘍が、血液供給により送達される必要不可欠な栄養素を得られないようにするために、腫瘍関連血管系と関連する標的を認識し、一方、他の抗体は、免疫制御標的（例えば、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１）を攻撃して、Ｔ細胞活性化を増強し、腫瘍微小環境の免疫抑制エレメントを克服するように開発されている（Ascierto PA et al (2010) Clinical experiences with anti-CD137 and anti-PD1 therapeutic antibodies. Semin Oncol 37: 508-516、Cai J, Han S, Qing R, Liao D, Law B, Boulton ME (2011) In pursuit of new anti-angiogenic therapies for cancer treatment. Front Biosci 16: 803-814）。また、細胞毒、薬物活性酵素、サイトカイン又は放射性核種の形態の毒性ペイロードを腫瘍に送達する抗体コンジュゲートのデザインに焦点を絞って広範な取り組みがなされた（Govindan SV, Goldenberg DM (2010) New antibody conjugates in cancer therapy. Scientific World Journal 10: 2070-2089）。また、ＩｇＧ抗体の抗原特異性／親和性及びエフェクター機能を最適化する主な目的により、確証された治療薬、例えば、トラスツズマブを向上させる多重抗体改変方法が考案されている（Kubota T et al (2009) Engineered therapeutic antibodies with improved effector functions. Cancer Sci 100: 1566-1572）。

ＩｇＥクラスの抗体は、アレルギー反応及び抗寄生虫活性における中心的役割を果たし、がん治療に有利であり得る多くの特性を有する。ＩｇＥに基づく能動及び受動免疫療法的方法は、インビトロ及びインビボの両がんモデルにおいて有効であることが示されており、このような方法のヒトにおける潜在的使用を示唆する（Leoh et al (2015) Curr Top Microbiol Immunol.; 388: 109-149）。したがって、ＩｇＥ治療抗体は、がん細胞に対する免疫監視の増強及び優れたエフェクター細胞能をもたらし得る。

完全ヒト抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＥは、一本鎖ＦｖＣ６ＭＨ３－Ｂ１の可変領域を使用して開発されている（Daniels TR et al (2012) Targeting HER2/neu with a fully human IgE to harness the allergic reaction against cancer cells. Cancer Immunol Immunother. 61: 991-1003.）。Ｃ６ＭＨ３－Ｂ１は、ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するマウス乳がん細胞（Ｄ２Ｆ２／Ｅ２）の存在下でヒトＦｃεＲＩを発現するＲＢＬ ＳＸ－３８細胞の脱顆粒をインビトロで誘導したが、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現を欠くか、又はＨＥＲ２／ｎｅｕの細胞外ドメインが脱落した（可溶性の）親Ｄ２Ｆ２細胞（ＥＣＤ^ＨＥＲ２）の存在下では誘導しなかった。このような結果は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原ががん細胞表面上に高いレベルで高発現している腫瘍微小環境内で急性炎症応答（Ｉ型過敏症）が生じ、ＦｃεＲＩ架橋結合が促進されエフェクター細胞の脱顆粒が誘発されると予想されることを示唆する（Pegram M, Ngo D. (2006) Application and potential limitations of animal models utilized in the development of trastuzumab (Herceptin): a case study. Adv Drug Deliv Rev. 58: 723-734.）。

ヒトＭＵＣ１抗原に特異的なマウス／ヒトキメラＩｇＥが開発されている（Teo PZ et al (2102) Using the allergic immune system to target cancer: activity of IgE antibodies specific for human CD20 and MUC1. Cancer Immunol Immunother. 61: 2295-2309.）。この抗体は、膜貫通型のヒトＭＵＣ１を発現するマウス乳がん細胞株（４Ｔ１．ｈＭＵＣ１）において腫瘍サイズを低下させることが示されている。しかし、おそらくは、４Ｔ１腫瘍が高度に無血管性であり、大量に密集して増殖するため応答は弱く、これにより薬物送達又はエフェクター細胞の動員が妨害され得る。

また、ＰＳＡ由来のＡＲ４７．４７の可変領域からなる新規のマウス／ヒトキメラ抗ＰＳＡ ＩｇＥが調査されている（Daniels-Wells TR et al (2013) A novel IgE antibody targeting the prostate-specific antigen as a potential prostate cancer therapy. BMC Cancer. 13: 195-207.）。ヒト樹状細胞をＰＳＡ及び抗ＰＳＡ ＩｇＥの複合体で刺激すると、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の活性化がインビトロで生じた。これは、抗ＰＳＡ ＩｇＥがＰＳＡと患者の血中で複合して、細胞傷害性Ｔリンパ球の活性に関与する第２の免疫応答の誘導が生じる可能性を示唆する。

ＩｇＥの受動的投与の代替戦略は、内因性ＩｇＥ応答を誘導することである。活性ワクチン接種プロトコールを確立する新規の方法は、腫瘍抗原特異的ＩｇＥを経口経路により誘導することである（Riemer AB et al (2007) Active induction of tumor-specific IgE antibodies by oral mimotope vaccination. Cancer Res. 67: 3406-3411）。合成的に製造したエピトープ模倣物（ミモトープ）が、トラスツズマブにより認識されるヒトＨＥＲ２／ｎｅｕのエピトープについて生成された。ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原を標的とする高力価血清ＩｇＥの誘導が観察され、内因性抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ ＩｇＥがＨＥＲ２／ｎｅｕ発現ヒト乳がん細胞（ＳＫ－ＢＲ－３）を認識して、げっ歯類ＦｃεＲＩを発現するラット好塩基性細胞（ＲＢＬ－２Ｈ３）の脱顆粒及び細胞傷害の両方が生じた。

がん関連抗原葉酸受容体αに特異的なマウス／ヒトキメラＩｇＥ抗体（ＭＯｖ１８ＩｇＥ）は、同系免疫適格動物において、その他の点では同一のＩｇＧと比較して、ＩｇＥに対する優れた抗腫瘍活性を有することが実証されている（Karagiannis et al., Cancer Res. 2017 Jun 1;77(11):2779-2783）。ＴＮＦα／ＭＣＰ－１シグナル伝達が、単球及びマクロファージの活性及び腫瘍への動員のＩｇＥ媒介機構として同定された。

しかし、ＩｇＥに基づく抗がん治療に応答する対象は、現在わかっていない。その上、ＩｇＥ抗体の抗がん作用を最も有効に促進させる方法も、わかっていない。

Weiner LM et al (2010) Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol 10: 317-327 Bruggemann M et al (1987) Comparison of the effector functions of human immunoglobulins using a matched set of chimeric antibodies. J Exp Med 166: 1351-1361 Alduaij W, Illidge TM (2011) The future of anti-CD20 monoclonal antibodies: are we making progress? Blood 117: 2993-3001 Dechant M, Valerius T (2001) IgA antibodies for cancer therapy. Crit Rev Oncol Hematol 39: 69-77 Weiner GJ (2007) Monoclonal antibody mechanisms of action in cancer. Immunol Res 39: 271-278 Ascierto PA et al (2010) Clinical experiences with anti-CD137 and anti-PD1 therapeutic antibodies. Semin Oncol 37: 508-516 Cai J, Han S, Qing R, Liao D, Law B, Boulton ME (2011) In pursuit of new anti-angiogenic therapies for cancer treatment. Front Biosci 16: 803-814 Govindan SV, Goldenberg DM (2010) New antibody conjugates in cancer therapy. Scientific World Journal 10: 2070-2089 Kubota T et al (2009) Engineered therapeutic antibodies with improved effector functions. Cancer Sci 100: 1566-1572 Leoh et al (2015) Curr Top Microbiol Immunol.; 388: 109-149 Daniels TR et al (2012) Targeting HER2/neu with a fully human IgE to harness the allergic reaction against cancer cells. Cancer Immunol Immunother. 61: 991-1003. Pegram M, Ngo D. (2006) Application and potential limitations of animal models utilized in the development of trastuzumab (Herceptin): a case study. Adv Drug Deliv Rev. 58: 723-734. Teo PZ et al (2102) Using the allergic immune system to target cancer: activity of IgE antibodies specific for human CD20 and MUC1. Cancer Immunol Immunother. 61: 2295-2309. Daniels-Wells TR et al (2013) A novel IgE antibody targeting the prostate-specific antigen as a potential prostate cancer therapy. BMC Cancer. 13: 195-207. Riemer AB et al (2007) Active induction of tumor-specific IgE antibodies by oral mimotope vaccination. Cancer Res. 67: 3406-3411 Karagiannis et al., Cancer Res. 2017 Jun 1;77(11):2779-2783

したがって、一態様では、対象における腫瘍と関連するマクロファージの再極性化における使用のための免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）であって、再極性化により、腫瘍微小環境におけるサイトカイン発現の調節及び抗腫瘍活性の増強が生じる、前記ＩｇＥを本発明において提供する。

別の態様では、対象のがんの治療における第１の表現型から抗腫瘍表現型へのマクロファージの再極性化における使用のための免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体であって、第１の表現型が、静止状態（Ｍ０）マクロファージ表現型又は抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージ表現型を含み、抗腫瘍表現型が、以下のサイトカイン及びケモカイン：腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）；インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）；インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）；インターロイキン６（ＩＬ－６）；ＲＡＮＴＥＳ又はＣＣＬ５（活性化時調節、正常Ｔ細胞発現及び分泌）；並びに／又はインターロイキン１０（ＩＬ－１０）の発現により特徴づけられる新たに極性化したマクロファージ表現型を含む、前記ＩｇＥ抗体を本発明において提供する。

別の態様では、対象のがんの治療における使用のための免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体であって、対象における腫瘍と関連するマクロファージが、静止状態（Ｍ０）マクロファージ表現型又は抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージ表現型を有し、前記ＩｇＥの治療（IgE treatment）が、腫瘍と関連するマクロファージの、以下のサイトカイン：腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）；インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）；インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）；インターロイキン６（ＩＬ－６）；ＲＡＮＴＥＳ又はＣＣＬ５（活性化時調節、正常Ｔ細胞発現及び分泌）；並びに／又はインターロイキン１０（ＩＬ－１０）の発現により特徴づけられる新たに極性化したマクロファージ表現型への再極性化を促進する、前記ＩｇＥ抗体を本発明において提供する。

一実施形態では、新たに極性化したマクロファージは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）を発現する。別の実施形態では、新たに極性化したマクロファージは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を発現する。別の実施形態では、新たに極性化したマクロファージは、インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）を発現する。別の実施形態では、新たに極性化したマクロファージは、インターロイキン６（ＩＬ－６）を発現する。別の実施形態では、新たに極性化したマクロファージは、ＲＡＮＴＥＳ又はＣＣＬ５（活性化時調節、正常Ｔ細胞発現及び分泌）を発現する。別の実施形態では、新たに極性化したマクロファージは、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）を発現する。一般には、新たに極性化したマクロファージ表現型は、このようなサイトカインの２又は３以上の任意の組合せにより特徴づけられ得る。好ましくは、新たに極性化したマクロファージ表現型は、以下のサイトカイン及びケモカイン：腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、ＲＡＮＴＥＳ又はＣＣＬ５（活性化時調節、正常Ｔ細胞発現及び分泌）並びにインターロイキン１０（ＩＬ－１０）のうちのいずれか３、４、５又は６つ全ての発現により特徴づけられる。

一実施形態では、新たに極性化したマクロファージ表現型は、抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージ表現型と比較した単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）の発現の増加により、さらに特徴づけられる。

別の実施形態では、新たに極性化したマクロファージ表現型は、抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージ表現型と比較したインターロイキン４（ＩＬ－４）の発現の増加により、さらに特徴づけられる。

別の実施形態では、新たに極性化したマクロファージ表現型は、静止状態（Ｍ０）マクロファージ表現型又は抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージ表現型と比較したインターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１３（ＩＬ－１３）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）及び／又はケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＸＣＬ１１）の発現の増加により、さらに特徴づけられる。

別の実施形態では、ＩｇＥの治療（IgE treatment）が、対象における腫瘍と関連する炎症促進（Ｍ１）マクロファージによるＩＦＮγ及び／又はＩＬ－１２の発現の増加をさらに促進する。

別の実施形態では、静止状態（Ｍ０）マクロファージ表現型又は抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージ表現型は、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＭＣＰ－１、ＣＸＣＬ９及び／又はＣＸＣＬ１１の発現により特徴づけられる。

別の実施形態では、対象における腫瘍と関連するマクロファージは、前記腫瘍の周辺を囲むように分布している。

別の実施形態では、新たに極性化したマクロファージ表現型が、さらなる単球及び／又はマクロファージの対象における腫瘍への動員を促進する。

別の実施形態では、がんは、皮膚がん、乳がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺がん、卵巣がん、結腸がん、神経膠腫、胃がん又は膵臓がんを含む。

別の実施形態では、ＩｇＥは、抗葉酸受容体α（ＦＲα）抗体、抗高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）抗体、抗ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）抗体又は抗ＳＦ－２５抗体を含む。

さらなる態様では、それを必要とする対象においてがんを治療するための、治療有効量の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）を対象に投与するステップを含む、方法であって、対象における腫瘍と関連するマクロファージが、静止状態（Ｍ０）マクロファージ表現型又は抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージ表現型を有し、前記ＩｇＥの治療（IgE treatment）が、腫瘍と関連するマクロファージの、以下のサイトカイン：腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）；インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）；インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）；インターロイキン６（ＩＬ－６）；ＲＡＮＴＥＳ又はＣＣＬ５（活性化時調節、正常Ｔ細胞発現及び分泌）；並びにインターロイキン１０（ＩＬ－１０）の発現により特徴づけられる新たに極性化したマクロファージ表現型への再極性化を促進し、前記新たに極性化したマクロファージ表現型が、静止状態（Ｍ０）マクロファージ表現型又は抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージ表現型と比較して抗腫瘍活性の増強を有し、これにより対象においてがんを治療する、前記方法を本発明において提供する。

一実施形態では、方法は、対象から得られた腫瘍試料中に存在するマクロファージの１又は２以上の表現型を検出するステップと、静止状態（Ｍ０）及び／又は抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージが試料中に所定のレベルを超えて存在する場合、ＩｇＥを対象に投与するステップとを含む。

別の実施形態では、方法は、以下のサイトカイン：ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ－１０、ＭＣＰ－１、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＭＣＰ－１、ＣＸＣＬ９、ＩＬ－１２及び／又はＣＸＣＬ１１の１又は２以上の、試料中に存在するマクロファージによる発現を検出するステップを含む。

ＩｇＥ架橋結合時のＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＩＬ－１２サイトカインプロファイルのマクロファージ上清の多重解析を示すグラフである。サイトカイン放出に対するＩｇＥ架橋結合の作用を調査し、細胞をＳＦ－２５ＩｇＥ又はＮＩＰ ＩｇＥ単独、ＳＦ－２５又はＮＩＰ ＩｇＥ＋抗ＩｇＥ、抗ＩｇＥ単独で処理した。値は、３つの独立的実験に基づいて、上清ｐｇ／ｍｌ±ＳＥＭとして表す。ＮＩＰは、４－ヒドロキシ－３－ヨード－５－ニトロフェニル酢酸である。 ＩｇＥ架橋結合時のＩＬ－４、ＩＬ－１０及びＩＬ－１３サイトカインプロファイルのマクロファージ上清の多重解析を示すグラフである。サイトカイン放出に対するＩｇＥ架橋結合の作用を調査し、細胞をＳＦ－２５ＩｇＥ又はＮＩＰ ＩｇＥ単独、ＳＦ－２５又はＮＩＰ ＩｇＥ＋抗ＩｇＥ、抗ＩｇＥ単独で処理した。値は、３つの独立的実験に基づいて、上清ｐｇ／ｍｌ±ＳＥＭとして表す。 ＩｇＥ架橋結合時のＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１及びＲＡＮＴＥＳサイトカインプロファイルのマクロファージ上清の多重解析を示すグラフである。サイトカイン放出に対するＩｇＥ架橋結合の作用を調査し、細胞をＳＦ－２５ＩｇＥ又はＮＩＰ ＩｇＥ単独、ＳＦ－２５又はＮＩＰ ＩｇＥ＋抗ＩｇＥ、抗ＩｇＥ単独で処理した。値は、３つの独立的実験に基づいて、上清ｐｇ／ｍｌ±ＳＥＭとして表す。 ＩｇＥ架橋結合時のＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）及びＩ－ＴＡＣ（ＣＸＣＬ１１）サイトカインプロファイルのマクロファージ上清の多重解析を示すグラフである。サイトカイン放出に対するＩｇＥ架橋結合の作用を調査し、細胞をＳＦ－２５ＩｇＥ又はＮＩＰ ＩｇＥ単独、ＳＦ－２５又はＮＩＰ ＩｇＥ＋抗ＩｇＥ、抗ＩｇＥ単独で処理した。値は、３つの独立的実験に基づいて、上清ｐｇ／ｍｌ±ＳＥＭとして表す。

ＩｇＥ治療により、マクロファージの種々の表現型によるサイトカイン及びケモカインの発現の独特なプロファイルがもたらされることが、驚くべきことに見出された。特に、静止状態（Ｍ０）及び抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージ表現型は、ＩｇＥ治療により、抗腫瘍活性が増強された新規のマクロファージ表現型へ再極性化可能であることが見出された。この新規のマクロファージ表現型は本明細書において、新たに極性化したマクロファージ表現型と呼ぶ。新たに極性化したマクロファージ表現型は、古典的な炎症促進（Ｍ１）及び抗炎症（Ｍ２ａ）の両マクロファージとは異なる、サイトカイン及びケモカイン発現の特異的プロファイルにより特徴づけられる。

したがって、新たに極性化したマクロファージ表現型は、ＩｇＥ抗体を使用する抗がん治療を増強するために利用することができる。例えば、対象における腫瘍と関連するマクロファージ表現型に基づいて、ＩｇＥ抗体治療のために対象を選択することができる。特に、腫瘍における静止状態（Ｍ０）及び抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージの検出、例えば、所定のレベル又は総マクロファージに占める所定の割合を超える検出は、マクロファージを抗腫瘍表現型へ再極性化させるためにＩｇＥ療法を使用する指標として使用し得る。

その上、本発明は、免疫療法的方法でがんを治療すること、すなわち、マクロファージの抗腫瘍表現型への再極性化を促進し（例えば、この表現型に特徴的なサイトカイン／ケモカインの発現を増強するために）、その結果、ＡＤＣＣのような機構による免疫細胞を介したがん細胞の殺傷を増強することが望ましい臨床状況において使用することができる。また、本発明は、例えば、腫瘍細胞自体に加えて、新たに極性化したマクロファージ表現型によりＭＣＰ－１のようなケモカインの発現が増加することにより、さらなる単球及び／又はマクロファージの腫瘍組織への動員を促進するために使用することができる。これは、例えば、抗腫瘍マクロファージが腫瘍に存在しないか、又は腫瘍組織周辺部のみに存在する場合、特に望ましいことがある。したがって、本発明は、マクロファージの抗腫瘍表現型への再極性化を必要とする新たな患者のサブグループ及び新たな臨床状況の治療を伴う、がん治療におけるＩｇＥ療法の使用の新たな臨床パラダイムを表す。

抗体
抗体は、抗原のエピトープ又はこの断片を特異的に認識して特異的に結合する、少なくとも１つの軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域を含む、ポリペプチドリガンドである。抗体は、重及び軽鎖から典型的になり、このそれぞれは、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域と呼ぶ可変領域を有する。まとめると、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、抗体により認識される抗原に結合する要因となる。

抗体は、インタクトな免疫グロブリン及び、当技術分野において周知の、抗体のバリアント並びに部分を含むが、ただし、このような断片は、ＩｇＥの少なくとも１つの機能を保持し、例えば、Ｆｃε受容体に結合可能である。また、抗体は、遺伝的に改変した形態、例えば、キメラ、ヒト化（例えば、可変領域にマウス配列を含むヒト化抗体）又はヒト抗体、二重特異性抗体、例えば、Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997に記載されている抗体を含む。

典型的には、天然に存在する免疫グロブリンは、重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖がジスルフィド結合により相互接続する。２つの型の軽鎖、ラムダ（λ）及びカッパ（ｋ）が存在する。抗体分子の機能活性を決定する９つの主なアイソタイプ又はクラス：ＩｇＡ１～２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１～４及びＩｇＭが存在し、重鎖型α、δ、ε、γ及びμに対応する。したがって、存在する重鎖の型により、抗体のクラスが定義される。特有の重鎖は、サイズ及び組成が異なり、α及びγは、約４５０アミノ酸を含み、一方、μ及びεは、約５５０アミノ酸を有する。各重鎖型の定常領域における差により、これらが特定の受容体型（例えば、Ｆｃ受容体）へ選択的に結合することから、各抗体アイソタイプの種々のエフェクター機能が判別できる。したがって、本発明の実施形態では、抗体は、好ましくは、イプシロン（ε）重鎖を含み、すなわち、抗体は、Ｆｃε受容体に結合するＩｇＥアイソタイプである。

各重鎖及び軽鎖は、定常領域及び可変領域を含む（領域は、「ドメイン」としても知られる）。ともに重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原に特異的に結合する。軽鎖及び重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とも呼ぶ３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含む。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、定義されている（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照）。Kabatのデータベースは、現在、オンラインで維持されている。種々の軽又は重鎖のフレームワーク領域の配列は、種、例えば、ヒトにおいて比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成する軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域の組合せであり、ＣＤＲを三次元空間に配置してアラインメントするように作用する。

ＣＤＲは主に、抗原のエピトープに結合する役割を担っている。各鎖のＣＤＲは、Ｎ末端から連番を付したＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と典型的に呼ばれ、また、特定のＣＤＲが位置する鎖により識別されるのが一般的である。したがって、ＶＨ ＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、ＶＬ ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインのＣＤＲ１である。

抗体は、特異的ＶＨ領域及びＶＬ領域配列を有し、このため特異的ＣＤＲ配列を有し得る。種々の特異性（すなわち、種々の抗原の種々の結合部位）を有する抗体は、種々のＣＤＲを有する。ＣＤＲは抗体に応じて異なるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置のみが、抗原結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこのような位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ぶ。「ＶＨ」とは、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」とは、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。

「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンにより、又は単一抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子をトランスフェクトした細胞により産生される抗体である。モノクローナル抗体は、例えば、骨髄腫細胞の免疫脾臓細胞との融合によるハイブリッド抗体形成細胞を生成するなど、当業者に公知の方法により作製される。モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体を含む。

「キメラ抗体」は、２つの異なる抗体に由来する配列を含み、これらは典型的には異なる種に由来する。例えば、キメラ抗体は、ヒト及びマウスの抗体ドメイン、例えば、ヒト定常領域及びマウス可変領域（例えば、標的抗原に特異的に結合するマウス抗体からのもの）を含み得る。

キメラ抗体は、典型的には、異なる種に属する軽鎖及び重鎖の免疫グロブリン遺伝子の可変及び定常領域を、例えば、遺伝子工学によって融合させることによって構築される。例えば、マウスモノクローナル抗体の遺伝子の可変セグメントは、ヒト定常セグメント、例えば、カッパ及びイプシロンに連結させることができる。したがって一例では、治療的キメラ抗体は、マウス抗体の可変ドメイン若しくは抗原結合ドメイン、及びヒト抗体の定常ドメイン若しくはエフェクタードメイン、例えば、ヒトＩｇＥ抗体のＦｃ（エフェクター）ドメインからなるハイブリッドタンパク質であるが、他の哺乳動物種も使用可能であり、又は可変領域は、分子技術により生成することもできる。キメラ抗体を生成する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、米国特許第５，８０７，７１５号を参照されたい。

「ヒト化」抗体は、ヒトフレームワーク領域及び非ヒト（例えば、マウス、ラット又は合成）抗体の１又は２以上のＣＤＲを含む抗体である。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼び、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ぶ。一実施形態では、全てのＣＤＲは、ヒト化免疫グロブリンのドナー免疫グロブリン由来である。定常領域は、典型的には、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５～９０％、例えば、約９５％以上同一である。したがって、ＣＤＲを除いて、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。

ヒト化抗体は、ヒト化免疫グロブリン軽鎖及びヒト化免疫グロブリン重鎖を典型的に含む。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同一の抗原に典型的に結合する。ヒト化免疫グロブリン又は抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから得られたアミノ酸による限られた数の置換を有し得る。ヒト化又は他のモノクローナル抗体は、抗原結合又は他の免疫グロブリン機能に対して実質的に影響しない、さらなるアミノ酸の保存的置換を有し得る。

ヒト化免疫グロブリンは、遺伝子工学的手段により構築することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照）。典型的には、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重及び軽可変鎖のドナー抗体相補性決定領域をヒト可変ドメインに移行させ、次いで、ドナー対応物のフレームワーク領域にヒト残基を置換することにより生成する。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体コンポーネントの使用は、ドナー抗体の定常領域の免疫原性と関連する潜在的問題を取り除く。ヒト化モノクローナル抗体を生成するための技術は、例えば、Jones et al., Nature 321:522, 1986、Riechmann et al., Nature 332:323, 1988、Verhoeyen et al., Science 239:1534, 1988、Carter et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 89:4285, 1992、Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992及びSinger et al., J. Immunol. 150:2844, 1993により記載されている。

「ヒト」抗体（「完全ヒト」抗体とも呼ばれる）は、ヒトフレームワーク領域及びヒト免疫グロブリン由来のＣＤＲの全てを含む抗体である。一例では、フレームワーク及びＣＤＲは、同一起源のヒト重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列由来である。しかし、あるヒト抗体のフレームワークは、異なるヒト抗体由来のＣＤＲを含むように改変することができる。

本発明の実施形態では、抗体は、キメラ、ヒト化又は完全ヒト抗体を含む、モノクローナル又はポリクローナル抗体であってもよい。

一実施形態では、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワークの配列は、ドナー免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワークの配列と少なくとも約６５％同一であり得る。したがって、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワークの配列は、ドナー免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワークの配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９９％又は少なくとも約９５％同一であり得る。ヒトフレームワーク領域、及びヒト化抗体フレームワーク領域において生じさせ得る変異は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照）。

また、特定の抗原に対するさらなる抗体を十分に確立された方法により生成してもよく、このような抗体由来の少なくとも可変領域又はＣＤＲを本発明の抗体において使用してもよい（例えば、生成した抗体を使用してＣＤＲ又は可変領域配列をＩｇＥアクセプター配列に供与し得る）。ポリペプチドの合成及び宿主動物の免疫のための方法は、当技術分野において周知である。典型的には、宿主動物（例えば、マウス）は、一定量の免疫原、並びに（モノクローナル抗体を生成する場合）Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 25 6:495-497の一般的体細胞ハイブリダイゼーション技術を使用して、そのリンパ球及び不死化骨髄腫細胞から調製したハイブリドーマを、腹腔内に接種する。

適する抗体を産生させるハイブリドーマは、インビトロ又はインビボで公知の手順を使用して増殖させ得る。モノクローナル抗体は、必要に応じて、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー及び限外濾過により培養培地又は体液から単離し得る。望ましくない活性が存在する場合、例えば、固相に結合する免疫原で生成した吸着剤上で調製を行い、所望の抗体を免疫原から溶出又は放出することにより除去することができる。必要に応じて、目的の抗体（モノクローナル又はポリクローナル）をシーケンシングしてもよく、次いで、ポリヌクレオチド配列をベクターにクローニングして発現又は増殖させてもよい。抗体をコードする配列を宿主細胞においてベクター内に維持してもよく、次いで、宿主細胞を増殖及び凍結させて将来的に使用することができる。

ファージディスプレイ技術、例えば、米国特許第５，５６５，３３２号及び他の公表文献に記載のものを使用して、ヒト抗体及び抗体断片をインビトロで非免疫ドナー由来の（例えば、関連する障害に罹患している患者を含むヒト対象由来の）免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパトワから選択及び生成し得る。例えば、既存の抗体ファージディスプレイライブラリーは、合成ポリペプチドの膨大なコレクションに対して並行してパニングし得る。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージのメジャー又はマイナーコートタンパク質遺伝子、例えば、Ｍ１３又はｆｄのいずれかにインフレームでクローニングし、機能性抗体断片としてファージ粒子の表面上に提示する。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むため、抗体の機能特性に基づく選択により、このような特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がまた生じる。したがって、ヒトライブラリーによるファージディスプレイを使用して選択される抗体配列は、特異的抗原への特異的結合を付与するヒトＣＤＲ又は可変領域配列を含む可能性があり、これを使用して本発明における使用のための完全ヒト抗体を用意してもよい。

ヒトＢ細胞及び形質細胞クローン由来の重及び軽鎖配列を得るための方法も当技術分野において周知であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して典型的に実施し、この方法の例は、Kuppers R, Methods Mol Biol. 2004;271:225-38、Yoshioka M et al., BMC Biotechnol. 2011 Jul 21;11:75、Scheeren FA et al., PLoS ONE 2011, 6(4): e17189. doi:10.1371/journal.pone.0017189、Wrammert J et al., Nature 2008 453, 667-671、Kurosawa N et al., BMC Biotechnol. 2011 Apr 13;11:39、Tiller et al., J Immunol Methods. 2008 January 1; 329(1-2): 112-124に記載されている。したがって、Ｂ細胞クローンを使用して選択された抗体配列は、標的抗原への特異的結合を付与するヒトＣＤＲ又は可変領域配列を含んでもよく、これを使用して、本発明における使用のための完全ヒト抗体を提供してもよい。

ＩｇＥ抗体
対象に投与する抗体は、ＩｇＥ抗体、すなわち、ＩｇＥアイソタイプの抗体である。ＩｇＥ及びＩｇＧの間にいくらかの根本的な構造的差異が存在し、これらは、機能的作用を有する。ＩｇＥは、他のクラスの抗体と同一の基本的分子構造を共有するが、ＩｇＥの重鎖は、ＩｇＧの重鎖よりも１つ多いドメインを含む。ＩｇＥのＣε３及びＣε4ドメインは、ＩｇＧのＣγ２及びＣγ３ドメインと配列が相同であり、構造が類似し、このためＣε２ドメインは、ＩｇＥの最も明白で際立った特徴である。Ｃε２ドメインは、重鎖ＩｇＥに対して折り畳まれており、Ｃε３ドメインと緊密に接触することが見出されている。ＩｇＥ重鎖のこの屈曲構造により、開又は閉構造をとることが可能となる。非結合ＩｇＥ二量体は、開構造において１つの鎖を、閉構造において１つの鎖を有する。ＦｃεＲＩのＩｇＥへの結合は、二相性であり、開Ｃε鎖への最初の結合の後、大規模な構造的再配列に関与して、閉Ｃε鎖への結合が可能となると考えられる。ＩｇＥ二量体及びＦｃεＲＩの間の結合は、２つの同一のＣε鎖の存在にもかかわらず１：１の化学量論で生じる。この再配列により、ＩｇＥ及びＦｃεＲＩの間の非常に密接な相互作用、並びにＩｇＧ及びＦｃγＲに見出されるよりもはるかに高いＦｃ受容体に対するＩｇＥの親和性が生じる（McDonnell, J. M., R. Calvert, et al. (2001) Nat Struct Biol 8(5): 437-441）。

本発明において使用する抗体は、Ｆｃε受容体に、例えば、ＦｃεＲＩ及び／又はＦｃεＲII受容体に結合することが典型的に可能である。好ましくは、抗体は、ＦｃεＲＩ（すなわち、高親和性Ｆｃε受容体）に結合することが少なくとも可能であるか、又はＦｃεＲII（ＣＤ２３、低親和性Ｆｃε受容体）に結合することが少なくとも可能である。典型的には、抗体はまた、Ｆｃε受容体を活性化することが可能であり、例えば、免疫系の細胞上で発現して、ＩｇＥにより媒介されるエフェクター機能を開始する。

イプシロン（ε）重鎖は、ＩｇＥ抗体に固有であり、Ｎ末端可変ドメインＶＨ及び４つの定常ドメインＣε１～Ｃε４を含む。他の抗体アイソタイプと同様に、可変ドメインは、抗原特異性を付与し、定常ドメインは、アイソタイプ特異的エフェクター機能を動員する。

ＩｇＥは、補体を固定することが不可能であり、単核細胞、ＮＫ細胞及び好中球の表面上に発現するＦｃ受容体ＦｃγＲＩ、ＲII及びＲIIIに結合しない点で、より豊富なＩｇＧアイソタイプとは異なる。しかし、ＩｇＥは、多様な免疫細胞、例えば、マスト細胞、好塩基球、単球／マクロファージ、好酸球上の「高親和性」ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ、Ｋａ．１０^１１Ｍ^－１）並びに炎症細胞及び抗原提示細胞（例えば、単球／マクロファージ、血小板、樹状細胞、Ｔ及びＢリンパ球）上に発現する「低親和性」受容体、ＣＤ２３としても知られるＦｃεＲII（Ｋａ．１０^７Ｍ^－１）との非常に特異的な相互作用が可能である。

このような受容体相互作用の要因となるＩｇＥ上の部位は、Ｃε鎖上のペプチド配列に位置しており、特有である。ＦｃεＲＩ部位は、Ｇｌｎ３０１及びＡｒｇ３７６の間に残基により作られた間隙に位置し、Ｃε２及びＣε３ドメインの間の接合部を含む（Helm, B. et al. (1988) Nature 331, 180183）。ＦｃεＲII結合部位は、Ｃε３内の残基Ｖａｌ３７０の周囲に位置する（Vercelli, D. et al. (1989) Nature 338, 649-651）。２つの受容体を識別する主な差は、ＦｃεＲＩは単量体Ｃεに結合するが、ＦｃεＲIIは二量体化Ｃεにのみ結合すること、すなわち、２つのＣε鎖は、結合していなければならないことである。ＩｇＥは、インビボでグリコシル化されるが、これはＦｃεＲＩ及びＦｃεＲIIへの結合に必要ではない。

したがって、Ｆｃε受容体への結合及び関連するエフェクター機能は、抗体の重鎖定常ドメインにより、特に、抗体のＦｃ領域をともに形成するドメインにより、典型的に媒介される。本明細書に記載する抗体は、ＩｇＥ抗体の少なくとも一部分、例えば、ＩｇＥ、好ましくは、ヒトＩｇＥに由来する１又は２以上の定常ドメインを典型的に含む。特定の実施形態では、抗体は、Ｃε１、Ｃε２、Ｃε３及びＣε４から選択される１又は２以上のドメイン（ＩｇＥに由来）を含む。一実施形態では、抗体は、少なくともＣε２及びＣε３、より好ましくは、少なくともＣε２、Ｃε３及びＣε４を含み、好ましくは、この場合、ドメインはヒトＩｇＥに由来する。一実施形態では、抗体は、イプシロン（ε）重鎖、好ましくは、ヒトε重鎖を含む。

ヒトＩｇＥに由来する定常ドメイン、特に、Ｃε１、Ｃε２、Ｃε３及びＣε４ドメインをコードするヌクレオチド配列は、例えば、国際公開第２０１３／０５０７２５号に開示されている。ヒトＣε１、Ｃε２、Ｃε３及びＣε４ドメイン並びにヒトε重鎖配列を含む、他のヒト及び哺乳動物のＩｇＥ及びこれらのドメインのアミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、公的に利用可能なデータベースから入手可能である。例えば、ヒト免疫グロブリン配列のデータベースは、国際免疫遺伝学情報システム（International ImMunoGeneTics Information System、ＩＭＧＴ（登録商標））のウェブサイトhttp://www.imgt.org.から利用可能である。一例としては、種々のヒトＩｇＥ重（ε）鎖アレル及びこれらの個々の定常ドメイン（Ｃε１～４）の配列が、http://www.imgt.org/IMGT_GENE-DB/GENElect?query=2+IGHE&species=Homo+sapiens.において利用可能である。

好ましい抗体
本発明において使用するＩｇＥ抗体は、任意の標的抗原に結合し得る。このような標的抗原の一部の非限定的な例としては、例えば、葉酸受容体α（ＦＲα）抗体、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４又はＣＳＰＧ４としても知られる）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｅｒｂＢ２としても知られる）、ＣＤ２０、ムチン１（ＭＵＣ１）及び前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が挙げられる。すなわち、本発明は、上記の標的のいずれか又は他の任意の抗原に特異的に結合する抗体を包含する。適するＩｇＥ抗体の例は、例えば、国際公開第２０１３／０５０７２５号、Karagiannis et al., J Immunol 2007; 179:2832-2843、Daniels et al (2012), Cancer Immunol Immunother. 61: 991-1003、Daniels-Wells et al (2013), BMC Cancer. 13: 195-207、Teo et al (2012), Cancer Immunol Immunother. 61: 2295-2309、Karagiannis et al., Cancer Immunol Immunother. 2009 Jun;58(6):915-30及びKaragiannis et al., Cancer Res; 77(11), 2017に記載されている。

一般には、本明細書に記載する抗体の機能性断片を本発明において使用し得る。機能性断片は、抗体に存在するときに必要とされる活性（例えば、抗原及びＦｃε受容体への特異的結合）を保持することを条件として、上記に特定する任意の長さ（例えば、少なくとも５０、１００、３００若しくは５００ヌクレオチド、又は少なくとも５０、１００、２００若しくは３００アミノ酸）であってもよい。

また、上記のアミノ酸及びヌクレオチド配列のバリアントも、得られる抗体がＦｃε受容体に結合することを条件に、本発明において使用し得る。典型的には、このようなバリアントは、上に特定する配列のうちの１つとの高度な配列同一性を有する。

アミノ酸又はヌクレオチド配列間の類似性は、配列間の類似性を単位として表し、別の言い方をすれば配列同一性と呼ばれる。配列同一性は、パーセント同一性（又は類似性若しくは相同性）を単位として頻繁に測定され、パーセントが高いほど２つの配列はより類似する。アミノ酸又はヌクレオチド配列の相同体又はバリアントは、標準的方法を使用してアラインメントした場合、比較的高度の配列同一性を有する。

比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知である。種々のプログラム及びアラインメントアルゴリズムは、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988、Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988、Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989、Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988及びPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988に記載されている。Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994では、配列アラインメント方法及び相同性算出の詳細な考察を示す。

NCBI Basic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990）は、米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information、ＮＣＢＩ、Bethesda, Md）及びインターネット上を含む、複数のソースから入手可能であり、配列解析プログラムblastp, blastn, blastx, tblastn及びtblastxと関連する使用を目的とする。このプログラムを使用した配列同一性を判定する方法の説明は、インターネットのＮＣＢＩウェブサイト上で利用可能である。

典型的には、バリアントは、本来のアミノ酸又はヌクレオチド配列と比較して１又は２以上のアミノ酸の保存的置換を含む。保存的置換は、抗体の標的抗原及び／又はＦｃε受容体に対する親和性に実質的には影響又はこれを低下させない置換である。例えば、標的抗原に特異的に結合するヒト抗体は、本来の配列（例えば、上に定義する配列）と比較して最大１、最大２、最大５、最大１０又は最大１５の保存的置換を含み、標的ポリペプチドへの特異的結合を保持し得る。また、保存的変異の用語は、抗体が標的抗原に特異的に結合することを条件に、非置換親アミノ酸の位置における置換アミノ酸の使用を含む。非保存的置換は、活性又は標的抗原及び／若しくはＦｃε受容体への結合を低下させる置換である。

保存的置換により交換し得る、機能的に類似するアミノ酸は、当業者に周知である。以下の６つのグループは、相互に保存的置換であると考えられるアミノ酸の例である：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

サイトカイン
本発明の実施形態では、ＩｇＥ治療を使用して、サイトカイン発現の特異的プロファイルにより特徴づけられる新規の抗腫瘍マクロファージ表現型への再極性化を促進し得る。一般には、「サイトカイン」の用語は、本明細書において使用する場合、ケモカインを含み、これは典型的に、単球、リンパ球及び他の免疫系細胞のような細胞の走化性の促進に関与する小型のサイトカインである。

インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）は、生物学的活性が、細胞媒介適応免疫応答の間に細胞増殖抑制性／細胞傷害性及び抗腫瘍機構と通常関連付けられるサイトカインである。腫瘍免疫監視におけるＩＦＮ－γの役割を関係づける十分な証拠があるにもかかわらず、このＩＦＮ－γが、特定の状況下で腫瘍形成促進作用も有し得ることを示唆する報告が絶え間なくなされている。ＩＦＮ－γの最もよく特徴づけられた機能は、主要組織適合（ＭＨＣ）クラスＩ分子を上方制御して、プロフェッショナル抗原提示細胞における抗原の刺激及び提示に役立つことである（Seliger B et al (2008) IFN inducibility of major histocompatibility antigens in tumors. Adv Cancer Res. 101: 249-76）。ＩＦＮ－γは、多くの免疫細胞型の分化及び機能を制御して、Ｔ細胞の分化、活性化及び恒常性の制御によりＴｈ１媒介免疫応答のあらゆる状況に本質的に関与し、これは、Ｔｈ２細胞の発生を阻害するが、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の発生を促進する（Agnello D et al (2003) Cytokines and transcription factors that regulate T helper cell differentiation: new players and new insights. J Clin Immunol. 23(3): 147-61）。これはまた、マクロファージを活性化し、ケモカインの生成を誘導する。したがって、ＩＦＮ－γは、腫瘍拒絶の誘導に重要であり得る。

炎症促進サイトカイン、例えば、インターロイキン１α（ＩＬ－１α）、ＩＬ－１β、ＩＬ－６及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）が、がんを促進又は抑制することがわかっている。しかし、このような相反する結果の根底にある細胞及び分子的基盤は、謎のままである。インターロイキン１（ＩＬ－１）は、多くの腫瘍型において上方制御されることが知られ、転移性及び血管形成性の遺伝子及び増殖因子の発現による腫瘍の進行における因子として関係づけられており、がん細胞は、ＩＬ－１を直接的に生成するか、腫瘍微小環境において細胞にＩＬ－１を生成するよう誘導し得る（Portier M et al (1993) Cytokine gene expression in human multiple myeloma. Br J Haematol. 85: 514-520）。しかし、Haabehtら（Oncoimmunology (2016) 5(1): e1039763）は、ＩＬ－１（ＩＬ－１α及びＩＬ－１β）がＩＦＮ－γと協同して、腫瘍浸潤マクロファージにおいて殺腫瘍活性を誘導することを示した。ＩＬ－１及びＩＦＮ－γの間のこの相乗作用により、炎症が、腫瘍特異的Ｔｈ１細胞により駆動される場合、がんを促進するのではなく抑制するしくみが説明され得る。まとめると、これらのデータは、炎症の、より詳細には、がんに対してＴｈ１により媒介される免疫の増強において基準となる炎症促進サイトカインＩＬ－１の、中心的役割を示唆する。

炎症及びがんの間の強力な関連性は、腫瘍形成を促進する腫瘍微小環境におけるＩＬ－６レベルが高レベルであることからうかがえる。ＩＬ－６は、炎症の状況下においてＴＮＦα及びＩＬ－１βの機能に匹敵する機能を有する炎症促進サイトカインとみなされることが多い。

最近まで、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）は、抗腫瘍免疫を妨げる免疫抑制サイトカインであるとみなされていた。ＩＬ－１０が、Ｔヘルパー１細胞機能及び抗腫瘍細胞溶解活性に必須であることが明らかとなっている。ＩＬ－１０の強力な抗炎症機能は、主に間接的かつ細胞を介したものであり、その免疫刺激機能と協同して腫瘍特異的免疫監視を向上させる（Dennis et al (2013) Curr Opin Oncol. 25(6): 637-645）。

インターロイキン（ＩＬ）４及び１３は、構造的に及び機能的に関連している。これらは、正常な生理的条件下だけでなく、がんにおいても免疫応答及び免疫微小環境を制御する。両方のサイトカインは、シグナル伝達を開始し、生物学的作用、例えば、腫瘍増殖、細胞生存、細胞接着及び転移を媒介する。特定のがんでは、このようなサイトカイン受容体の存在は、がんの悪性度のバイオマーカーとして作用し得る。加えて、このような両サイトカイン及びこれらの受容体は、腫瘍増殖のための免疫系の調節において重要な役割を果たすことがわかっている。ＩＬ－４は、Ｂリンパ球の増加及び抗体の産生を生じ、Ｔリンパ球の産生をも増加させる。ＩＬ－１３は、Ｔ細胞に直接的には作用できないため、ＩＬ－４ほど免疫偏位に重大ではないと考えられている。しかし、ＩＬ－１３の最近の研究では、このサイトカインが、免疫制御の多くの状況において重大な役割を果たすことが明らかとなっている。Terabeらによる研究（Cancer Immunol Immunother. (2004) 53(2): 79-85）等では、ＩＬ－１３が、ＮＫＴ細胞により腫瘍免疫監視が抑制される新規の免疫制御経路の中心であることを示している。

インターロイキン１２（ＩＬ－１２）は、自然（ＮＫ細胞）及び適応（細胞傷害性Ｔリンパ球）免疫の両方を活性化する能力のため、腫瘍免疫療法の理想的候補となると思われていた。ＩＬ－１２は多様な免疫細胞に作用するが、ＩＬ－１２の生理学的な全体的役割によって、特定の病原体に対するＴｈ１型免疫応答が組織化されていると思われる。ＩＬ－１２の強力な抗腫瘍作用は十分に確立されているが、このサイトカインは、例外はあり得るとしても、がん増殖を直接阻害することは不可能であると考えられる（Ferretti E et al (2010) Direct inhibition of human acute myeloid leukemia cell growth by IL-12. Immunol Lett. 133: 99-105）。むしろ、ＩＬ－１２は、がんに対するＴｈ１型免疫応答の主要な編成因子として作用する。別の重要な概念は、ＩＬ－１２が、全身的に存在するのではなく、腫瘍部位に直接存在している場合、より強力な抗腫瘍応答を誘発すると思われることである。

ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）としても知られる、ＲＡＮＴＥＳ（活性化時調節、正常Ｔ細胞発現及び分泌）は、ケモカインのベータファミリーのメンバーであり、リンパ球及び単球の炎症部位への強力な化学遊走因子である。また、Ｔ細胞により放出される特定のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ）の助けにより、ＲＡＮＴＥＳは、特定のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖及び活性化を誘導してＣＨＡＫ（ＣＣケモカイン活性化キラー）細胞を形成する。

ケモカインＣＸＣＬ９は、免疫細胞の走化性において重要な役割を果たし、蓄積された証拠により、ＣＸＣＬ９を含む腫瘍微小環境の操作によって腫瘍特異的Ｔ細胞による戦略の治療有効性が増強され得ることが示されている（Ding et al (2016) Cancer Med. 5(11): 3246-3259）。ＣＸＣＬ９によって、腫瘍細胞の遊走及び浸潤の増強によりがん転移（Ding Q et al (2016) An alternatively spliced variant of CXCR3 mediates the metastasis of CD133+ liver cancer cells induced by CXCL9. Oncotarget. 7: 14405-14414）並びに内皮細胞単層の破壊（Amatschek S et al (2011) CXCL9 induces chemotaxis, chemorepulsion and endothelial barrier disruption through CXCR3-mediated activation of melanoma cells. Br. J. Cancer. 104: 469-479）が促進され得る。しかし、腫瘍抑制因子として、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を動員し（Clancy-Thompson E et al (2015) Melanoma induces, and adenosine suppresses, CXCR3-Cognate chemokine production and T-cell infiltration of lungs bearing metastatic-like disease. Cancer Immunol. Res. 3: 956-967）、腫瘍血管形成を阻害する（Addison C. L et al (2000) The CXC chemokine, monokine induced by interferon-gamma, inhibits non-small cell lung carcinoma tumor growth and metastasis. Hum. Gene Ther. 11: 247-261）ことが主に示されている。

インターフェロン誘導性Ｔ細胞化学遊走因子（Ｉ－ＴＡＣ／ＣＸＣＬ１１）は、ＩＦＮ誘導性ケモカインであり、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び単球／マクロファージの動員を感染部位において媒介する。

Nakamuraらは（記事において）、「古典的」Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９及びＴｈ１７応答の免疫メディエーターの高い腫瘍内発現が、臨床結果と任意の関連性を有し得るかどうかを評価した。個々のメディエーターの検査では、２２のうち９のメディエーター：ＣＸＣＬ－９、ＣＸＣＬ－１０、ＣＸＣＬ－１１、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－４、ＭＣＰ－１、ＩＬ－２３、ＣＸＣＬ－１３が、ゲノム発現が低い患者と比較して、患者の生存率向上と有意に関連することが示された。生存率向上との最も顕著な関連性を有するサイトカインは、ＣＸＣＬ－１０及びＩＦＮγであり、２２％低い死亡リスクを伴った（ＣＸＣＬ－１０：ＨＲ＝０．７８、Ｐ＝０．００３７；ＩＦＮγ：ＨＲ＝０．７８、Ｐ＝０．００３６）。その上、Ｔｈ２サイトカイン、ＩＬ－４及びＭＣＰ－１の腫瘍内発現が高い対象は、優れた生存率を示し、死亡リスクがそれぞれ１９％及び１７％低下した（ＩＬ－４：ＨＲ＝０．７８、Ｐ＝０．０１２；ＭＣＰ－１：ＨＲ＝０．８３、Ｐ＝０．０２９）。Ｍ２ａマクロファージのＩｇＥ架橋から生じる新たに極性化したマクロファージ表現型が、ＩＬ－４及びＭＣＰ－１の両方の発現の増加を示すことがわかっている。

また、Nakamuraらは、一定の割合のＴｈ１サイトカインの高発現（ＩＦＮγ（ＨＲ＝０．７８、Ｐ＝０．００３６）、ＣＸＣＬ－９（ＨＲ＝０．８１、Ｐ＝０．０１２）、ＣＸＣＬ－１０（ＨＲ＝０．７８、Ｐ＝０．００３７）及びＣＸＣＬ－１１（ＨＲ＝０．８、Ｐ＝０．００７８））で、生存率向上との最大の関連性を観察し、また、このようなメディエーターを組み合わせた場合、２つのメディエーターの組合せであるＣＸＣＬ－９及びＣＸＣＬ－１０は、０．７４のＨＲを伴い（Ｐ＝０．０００６）、ＣＸＣＬ－９、ＣＸＣＬ－１０及びＣＸＣＬ－１１の組合せは、０．７３のＨＲを伴い（Ｐ＝０．０００２８）、患者生存率における最も高い向上は、４つ全てのメディエーター（ＩＦＮγ、ＣＸＣＬ－９、ＣＸＣＬ－１０及びＣＸＣＬ－１１）の高発現（ＨＲ＝０．７２、Ｐ＝０．０００２１）により測定された。これらは、生存利益を付与し得るこのようなメディエーターの相乗機能を示し得る。やはり、Ｍ２ａマクロファージに由来する新たに極性化したマクロファージ表現型が、ＩＦＮγの出現並びにＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１１の分泌の増加を伴う類似のプロファイルを示すことがわかっている。

Nakamuraらは、まとめると、このような知見は、細菌及びウイルスに対する免疫をある程度保護する「古典的」（Ｔｈ１、Ｔｈ２及びＴｈ１７）応答の免疫セクレトームメディエーター（immune secretome mediator）を同定し、さらに、アレルギー及び自己免疫のような病態に関与するメディエーターは、卵巣がん生存におけるポジティブな予後の文脈において、より良い予後と関連したと結論づける。詳細には、ＴＮＦα／ＭＣＰ－１の特性は、抗がん免疫における役割を有し得る。通常、感染クリアランスにおいて展開される、このような及び他の免疫特性は、特異的な免疫療法的方法、例えば、抗腫瘍特異的ＩｇＥにより、又は弱毒寄生体ワクチンにより増強されて（Baird, J.R. et al (2013) Avirulent Toxoplasma gondii generates therapeutic antitumor immunity by reversing immunosuppression in the ovarian cancer microenvironment. Cancer Res. 73(13): 3842-51、Fox, B.A. et al (2017) Cancer therapy in a microbial bottle: Uncorking the novel biology of the protozoan Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 13(9): e1006523）、免疫抑制を回復させ、卵巣及び他のがんにおける治療的利益を付与し得る。

本明細書に記載するサイトカイン及びケモカイン並びにこれらのアミノ酸配列（及びアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）は、当業者に周知であり、これらの配列は、公的に利用可能なデータベースから入手可能である。マクロファージ集団によるサイトカイン及びケモカインの発現は、適する任意の方法により（例えば、ポリペプチド又はＲＮＡのレベルで）、例えば、それらに対する抗体（標識していてもよい）を使用して検出し得る。このような抗体は、公知であり、市販されている。例えば、サイトカイン及びケモカインは、例えば、ＥＬＩＳＡ、磁気ビーズ及び／又は蛍光標識を含む、標準的方法により検出し得る。特に、蛍光標識（すなわち、フルオロフォア）は、抗サイトカイン抗体に（又は、例えば、抗サイトカイン抗体を同様に結合させる磁気微小粒子に）結合させ得る。一実施形態では、サイトカインは、実施例に記載するように磁気Luminex（登録商標）アッセイを使用して検出し得る。しかし、任意の他の適するものを代わりに使用してもよく、サイトカインをコードする転写物の発現を検出するために、例えば、ＲＴ－ＰＣＲを含む。

組成物及び治療方法
担体及び１若しくは２以上の治療ＩｇＥ抗体又はこの機能性断片を含む組成物を本明細書において提供する。組成物は、対象への投与のための単位剤形で調製することができる。投与の量及びタイミングは、所望の目的を達成するために、治療する医師の判断に委ねられる。抗体は、全身又は局所（例えば、腫瘍内）投与のために製剤化することができる。一例では、治療ＩｇＥ抗体は、非経口投与、例えば、静脈内投与のために製剤化する。

投与のための組成物は、薬学的に許容される担体、例えば、水性担体中に溶解した抗体（又はこの機能性断片）の溶液を含み得る。多様な水性担体、例えば、緩衝食塩水等を使用することができる。このような溶液は、無菌であり、望ましくない物質は一般に含まない。このような組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌し得る。組成物は、生理学的条件に近づけるのに必要とされる場合、薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整及び緩衝剤、毒性調整剤等、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含み得る。このような製剤における抗体の濃度は、広範に変化してもよく、選択される特定の投与方法及び対象のニーズに従って、主に液量、粘度、体重等に基づいて選択される。

静脈内投与用の医薬組成物の典型的な用量は、１日に対象の体重１ｋｇあたり抗体約１μｇ～１ｇ、より好ましくは１０μｇ～１００ｍｇ、最も好ましくは０．１～１５ｍｇを含む。特に、循環又はリンパ系ではなく隔離された部位、例えば、体腔又は器官の内腔に薬剤を投与する場合、１日に１ｋｇあたり０．１～最大約１００ｍｇの用量を使用し得る。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知であるか又は明らかであり、Remington’s Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995)のような公表文献により詳細に記載されている。

抗体は、凍結乾燥形態で提供し、投与前に滅菌水で再水和し得るが、これらはまた、既知濃度の滅菌溶液により提供する。次いで、抗体溶液は、０．９％の塩化ナトリウム、ＵＳＰを含む輸液バッグに加え、０．５～１５ｍｇ／体重ｋｇの用量で典型的に投与する。抗体医薬の投与における当技術分野の経験による豊富な技術が利用可能であり、これは、１９９７年のRITUXAN（登録商標）の認可以来、米国において市販されている。抗体は、静注又は急速静注ではなく緩徐な注入により投与することができる。一例では、高負荷用量を投与した後、低レベルの維持用量を投与する。例えば、４ｍｇ／ｋｇの初回負荷用量を約９０分の期間にわたって注入した後、先の用量が十分に許容される場合、３０分の期間にわたって注入される２ｍｇ／ｋｇの、４～８週の間の毎週の維持用量が投与される。

抗体（又はこの機能性断片）は、がん細胞などの細胞の増殖を遅延又は阻害するために投与することができる。このような適用では、治療有効量の抗体を、がん細胞の増殖、複製若しくは転移の阻害、又はがんの徴候若しくは症候の阻害に十分な量で対象に投与する。一部の実施形態では、抗体は、転移の進行を阻害若しくは予防するため、又は、局所リンパ節への微小転移などの微小転移などの転移のサイズ若しくは数を減少させるために対象に投与する（Goto et al., Clin. Cancer Res. 14(11):3401-3407, 2008）。

適する対象は、それらに限定されないが、メラノーマ、前立腺がん、扁平上皮がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、乳がん（基底乳がん、腺管がん及び小葉乳がんを含むが、これらに限定されない）、肺がん（例えば、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん及び中皮腫を含む、小細胞肺がん又は非小細胞肺がん）、白血病（例えば、急性骨髄性白血病及び１１ｇ２３陽性急性白血病）、リンパ腫（例えば、皮膚リンパ腫）、神経堤腫瘍（例えば、星状細胞腫、神経膠腫又は神経芽細胞種）、卵巣がん、結腸がん、胃がん、膵臓がん、骨がん（例えば、脊索腫）、神経膠腫、又は肉腫（例えば、軟骨肉腫）のようながんを有すると診断された対象を含み得る。好ましくは、抗体は、固形腫瘍を治療するために投与する。別の実施形態では、抗体は、血液腫瘍（例えば、白血病又はリンパ腫）を治療するために投与する。

抗体の治療有効量は、疾患の重症度及び患者の健康の一般的状態に依存する。抗体の治療有効量は、症候（複数可）の主観的な緩和、又は臨床医若しくは他の有資格観察者により認められた場合の客観的に同定可能な改善のいずれかをもたらす量である。このような組成物は、別の化学療法剤と組み合わせて、同時に又は順次投与することができる。

本発明の実施形態では、治療用ＩｇＥ抗体は、がんなどの疾患に罹患している患者、例えば、マクロファージの抗腫瘍表現型への再極性化から利益を得うる対象のサブグループを治療するために使用し得る。したがって、治療する患者のサブグループは、例えば、静止状態（Ｍ０）マクロファージ又は抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージが腫瘍内に存在する患者であり得る。このようなＭ０又はＭ２ａマクロファージの腫瘍内における存在は、公知の技術を使用して、例えば、サイトカイン及び／若しくはケモカイン並びに／又は細胞表面マーカーの特徴的プロファイルの発現の検出により判定し得る。

ここで、本発明は、例示のみのために、以下の非限定的実施形態を参照して、さらに記載する。
［実施例］

マクロファージ活性化及び極性化におけるＩｇＥ抗体の役割を調査した。ＩｇＥのマクロファージとの相互作用の下流作用のうちの１つは、ＦｃεＲＩ架橋結合時の細胞による可溶性メディエーターの放出であり得る（Josephs et al (2017) Anti-Folate Receptor-α IgE but not IgG Recruits 330 Macrophages to Attack Tumors via TNFα/MCP-1 Signaling. Cancer Research 77(5): 1127-1141）。

この理由から、Ｍ０、Ｍ１及びＭ２ａマクロファージの細胞培養物は、ＳＦ－２５又はＮＩＰ ＩｇＥで処理し、次いで、抗ヒトＩｇＥとともにインキュベートして、ＦｃεＲＩ結合抗体の架橋結合を誘発した。この試験のコントロールは、ＳＦ－２５又はＮＩＰ ＩｇＥ抗体処理単独、抗ＩｇＥ単独及び無処理細胞からなる。上清は、サイトカイン産生及び放出を可能とするために、処理後４時間に採取した。

ＩｇＥのマクロファージとの相互作用により、炎症促進性及び抗炎症性メディエーターの明瞭な産生が生じるかどうかの理解を目的として、サイトカイン及びケモカインの広範な集団を解析した。磁気ビーズを用いた多重アッセイの実施により、Ｍ０、Ｍ１及びＭ２ａマクロファージのサイトカインプロファイルを得ることが可能であった。これにより、多くの異なる可溶性メディエーターの同一試料における同時検出が可能となる。

方法及び材料
一次細胞の単離及び培養
Ｋ２ＥＤＴＡスプレーコーティング採取チューブを使用して、末梢静脈血（５０ｍｌ）を健常ドナーから採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、等量の血液及び２％のＦＣＳ／２ｍＭのＥＤＴＡを最終容量３０ｍｌまで穏やかに混合し、５０ｍｌのコニカルチューブに入れたFicoll-Paque（商標）PLUS１５ｍｌの密度勾配上にピペットで穏やかに滴下した。次いで、チューブを１２００×ｇで緩加速して制動せずに室温（ＲＴ）で２０分間遠心分離した。プラスチックのパスツールピペットを使用して血漿界面を回収し、新たなバイアルに移して、ＰＢＳを用いて６００×ｇで最大加速して減速することにより４℃で１０分間洗浄した。試料中に存在する赤血球は、細胞をＲＢＣ溶解緩衝液５ｍｌにより５分間ＲＴでインキュベートした後、ＰＢＳ＋２％のＦＣＳ／２ｍＭのＥＤＴＡで洗浄することにより溶解した。

単球をヒト血液から間接磁気標識システムPan Monocyte Isolation Kit（Miltenyi Biotec社）を使用して単離して、自然のままの単球をヒトＰＢＭＣから単離した。この技術を利用して、古典的（ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋＋）、非古典的（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋＋）及び中間的（ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋）単球集団の同時濃縮を実施した。高純度の単球集団を、標識され磁気的に結合させた細胞を除去することにより得る。ＰＢＭＣを単離した後、細胞を４０μｍの細胞濾過器に通して、いかなる凝集塊をも除去し、試料中の細胞数を、血球計算器を使用して定量した。次いで、ＰＢＭＣ１×１０^８を新たなバイアルに移し、ＰＢＳを用いて６００×ｇで５分間、最大加速して減速することにより洗浄した。上清の廃棄後、細胞をＭＡＣＳ緩衝液（０．５％のウシ胎仔血清及び２ｍＭのＥＤＴＡを添加したＰＢＳ）４００μｌ中に再懸濁した。

ヒト単球をネガティブセレクションにより単離するために、Pan Monocyte Isolation Kit（Miltenyi Biotec社）プロトコールに従った。簡潔には、抗体のヒトＦｃ受容体への不要な結合をブロッキングするために、ＦｃＲブロッキング試薬１００μｌを試料に加え、ピペットで上下に混合した後、ビオチン抗体カクテル１００μｌを加え、抗体の単球への結合を促進するために、試料を４℃で５分間インキュベートした。この後、ＭＡＣＳ緩衝液３００μｌ及び抗ビオチンマイクロビーズ２００μｌを十分に混合することによりバイアルに加えた。次いで、細胞を４℃で１０分間、再度インキュベートした。インキュベーション後、ＬＳカラムをMultiStand（Miltenyi Biotec社）上に乗せたMidiMACS（商標）分離器に挿入することにより、試料を磁気細胞分離に供した。カラムは、ＭＡＣＳ緩衝液３ｍｌで最初にすすぎ、容器が空になったところで、細胞懸濁液をカラムに投入した。濃縮単球画分であるフロースルーを採取した。ＭＡＣＳ緩衝液３ｍｌを添加することによりカラムを３回洗浄し、非標識細胞を採取して、前のステップで採取した流出液と混合した。主にリンパ球である標識細胞を採取するために、カラムを分離器から取り外して、適する採取チューブ上に静置した。ＭＡＣＳ緩衝液５ｍｌをカラム上に添加し、プランジャーを使用して磁気標識した非単球を流し出した。

単球集団の純度のレベルを確認するために、フローサイトメトリー（King’s College LondonのBiomedical Research Centre Flow Cytometry CoreにおけるBD FACSCanto（商標）IIを使用して実施）用の試料を次のように調製した。ＣＤ１４を認識するＢＶ７８６コンジュゲートｍＡｂ（１×１０^５細胞あたり１μｌ）及びＣＤ１６に対するＢＶ７１１コンジュゲートｍＡｂにより４℃で３０分間、細胞を染色した。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２％のウシ胎仔血清（Gibco社）を添加したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Gibco社））で１回洗浄し、フローサイトメーターにおけるデータ取得の準備ができるまで新鮮なＦＡＣＳ緩衝液で維持した。各フルオロフォアについて、単一の陽性コントロール及びＦＭＯコントロールを使用して、ゲートを設定した。

単球を上記の磁気分離により単離し、これらをＲＰＭＩ１６４０培地GlutaMAX（Gibco社）、２％のＦＢＳに再懸濁して接着を促進して、細胞を１～１．５×１０^６細胞／ｍｌの密度で６ウェルのプレートに播種し、各ウェルに細胞懸濁液２ｍｌを添加して、プレートを組織培養インキュベーター内に静置した。２時間のインキュベーション後、単球の接着を顕微鏡下で確認し、プレートを傾けてピペットで取り除くことにより培地を注意深く除去した。完全には接着しなかった細胞を除去するために、各ウェルを滅菌ＰＢＳ１ｍｌにより洗浄し、１０％のＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０並びに２０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦ（単球コロニー刺激因子、Peprotech社）を加えたペニシリン／ストレプトマイシン（ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）（Life Technologies社））を２ｍｌ補充して、単球をエクスビボで増殖させた。その後３日毎に、各新鮮ウェルの半量を４０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦを含む培地と交換した。７日後に、分化したマクロファージを観察した。

この時点から、所望の細胞表現型：Ｍ１又はＭ２のマクロファージに基づいて、種々のサイトカインを細胞培養物に加えた。マクロファージをＭ１表現型に極性化するために、２０ｎｇ／ｍｌのインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ、Life Technologies社）及び１００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ、Sigma社）を細胞に加え７２時間おいた。一方、マクロファージをＭ２表現型に極性化するために、２０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン４（ＩＬ－４、Peprotech社）を加え７２時間おいた。

ＳＦ－２５ＩｇＥ及びＩｇＧ１抗体の生成
スピナーボトルによるＳＦ－２５ＩｇＥの生成
ＳＦ－２５ＩｇＥ抗体を発現するＳｐ２／０細胞を、ＩＭＤＭ培地を総初期容量１８０ｍｌで有する１Ｌのスピナーボトルに、細胞密度５×１０５細胞／ｍｌで播種した。次いで、懸濁液に新鮮培地を５００ｍｌまでつぎ足し、３７℃及び５％ＣＯ２、定速７．５ｒｐｍの加湿インキュベーター内のスピナープレートに静置した。３日後、新鮮培地を最終容量１Ｌまで細胞懸濁液に加え、新鮮培地はそれ以上加えずに３週間、細胞を増殖させた。３日毎に、試料１ｍｌを各細胞懸濁液から採取して、抗体産生を経時的に観察した。試料を１．５ｍｌのチューブに採取し、１２５００×ｇで５分間遠心分離し、０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌して－２０℃で保存した。

振盪フラスコによるＳＦ－２５ＩｇＥの生成
ＳＦ－２５ＩｇＥ抗体を発現するＳｐ２／０細胞を、ＩＭＤＭ完全培地を初期容量６０ｍｌで有する１Ｌのエルレンマイヤーフラスコに、細胞密度５×１０５細胞／ｍｌで播種した。次いで、懸濁液に新鮮完全培地を１５０ｍｌまでつぎ足し、定速５５ｒｐｍの振盪プラットフォーム上の３７℃及び５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに静置した。３日毎に、試料１ｍｌを細胞懸濁液から採取して、抗体産生を経時的に観察した。試料を１．５ｍｌのチューブに採取し、１２５００×ｇで５分間遠心分離し、０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌して－２０℃で保存した。

ローラーボトルにおけるＳＦ－２５ＩｇＥの生成
ＳＦ－２５ＩｇＥ抗体を発現するＳｐ２／０細胞を、ＩＭＤＭ完全培地を総量２５０ｍｌで有する２Ｌのローラーボトルに、細胞密度５×１０５細胞／ｍｌで播種した。次いで、１０ｍｌの滅菌ピペットを細胞懸濁液に挿入することにより、細胞にＣＯ２注入を行い、次いで、ピペットをＣＯ２タンクに接続して、ガスを細胞培養物内に最大圧力１．５ｍＢａｒで２分間流動させた。ピペットを除去すると、ボトルの蓋を堅く閉じ、ボトルを回転シリンダー上に３７℃で静置した。３日毎に、細胞密度を監視し、最大可動容量１２００ｍｌに達するまで細胞培養物を新鮮培地で１：２に希釈した。これまでに記載のように３日毎、又は２週間の培養の終わりに細胞にＣＯ２を与え、この時点で細胞上清を回収した。

ＳＦ－２５ＩｇＥ抗体の精製
Ｓｐ２／０細胞上清における抗体の生成後、ＳＦ－２５ＩｇＥ抗体を精製するために、細胞上清を４００×ｇで３０分間遠心分離して、細胞をペレット状にした。遠心分離後、上清を採取し、Stericup（登録商標）０．４５μｍフィルターユニットを使用して濾過した。上清に０．０１％のアジ化ナトリウムを加えた後、アフィニティークロマトグラフィーに適用した。ヒトキメラＳＦ－２５ＩｇＥの精製は、HiTrap KappaSelectカラム（GE Healthcare Life Sciences社）を使用して実施した。

ＳＦ－２５ＩｇＥの全てのアフィニティークロマトグラフィー精製は、蠕動ポンプ（AKTA Prime社）を取り付けた自動装置を使用し、液体を１ｍｌ／分でカラムに通過させて実施した。最初のステップでは、カラムをＰＢＳで洗浄し、次いで、分泌された抗体を含む細胞培養物上清をカラムに通過させてアガロースビーズに結合させた。次いで、補足された抗体を溶出緩衝液（０．２Ｍのグリシン、ｐＨ２．３）で溶出した。溶出液を中和緩衝液（１Ｍのトリス、ｐＨ８．２）で直ちに中和した。次いで、ＰＢＳ溶液の循環によりカラムを再平衡化した。任意の凝集及び／又は分解した抗体産物を除外するために、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。全プロセスは、４℃で実行した。

ＩｇＥ抗体によるマクロファージの活性化
単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）に対するＩｇＥの架橋結合
マクロファージの極性化及び活性化においてＩｇＥ抗体が果たし得る役割を理解するために、単球由来マクロファージ表面に対するＩｇＥの関与及び架橋結合実験を、例えば、欧州特許第０３９７７００号明細書及びGould, H. J et al., Eur. J. Immunol. 1999. 29: 3527-3537に記載のようにＳＦ－２５及びＮＩＰ ＩｇＥ抗体を使用して行った。ＮＩＰ ＩｇＥは、ハプテンのニトロヒドロキシヨード酢酸（４－ヒドロキシ－３－ヨード－５－ニトロフェニル酢酸）に対して産生される非特異的ＩｇＥである。

Ｍ０、Ｍ１及びＭ２ａ（ＭＤＭ）マクロファージは、５μｇ／ｍｌのＩｇＥ抗体（Dako社）とともに１時間３７℃で、抗体溶液を細胞培養プレート上に直接加えることによりインキュベートした。１時間後、滅菌ピペットで上清を完全に除去し、滅菌ＰＢＳ１ｍｌを各ウェルに加え、次いで、いかなる非結合抗体をも洗浄除去した。次いで、適用可能であれば、細胞を１μｇ／ｍｌのポリクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体で処理して、細胞表面に既に結合しているＩｇＥ抗体に架橋結合させた。細胞は、さらに１時間、３７℃でインキュベートした。

刺激後４時間に細胞を回収して、ＭＤＭ細胞表面マーカー発現を調べ、刺激後２４時間に上清を採取してサイトカイン放出を調査した。

マクロファージ上清のサイトカイン検出のための磁気Luminexアッセイ
マクロファージ上清を刺激後４時間に採取して、種々の刺激条件下で細胞にサイトカインを産生及び分泌させた。上清は、接着細胞を妨害することなく、培養プレートを穏やかに傾けてピペットで取り除くことにより回収した。次いで、試料を６００×ｇで遠心分離して、浮遊する細胞及びデブリを除去し、次いで、新しいチューブに移して使用まで－２０℃で保存した。

アッセイの日には、試料を室温で解凍し、滅菌ＰＢＳで１：１に希釈して、アッセイプレート上に添加する準備ができるまで氷上に維持した。

多重アッセイを磁気Luminexキットにより、プロトコールの指示に従って実施した。簡潔には、微小粒子カクテル５０μｌをプレートの各ウェルに加えた直後、試料５０μｌを加えた。プレートを密封し、室温で２時間、軌道振盪機上でインキュベートした。洗浄緩衝液１００μｌを各ウェルへ追加及び除去することにより洗浄を実施した。洗浄手順を３回繰り返した。最終洗浄の液体を除去すると、各ウェルに希釈したビオチン抗体カクテル５０μｌを添加し、プレートを密封して、室温で１時間、軌道振盪機上でインキュベートした。洗浄ステップは、上記のように繰り返し、ストレプトアビジンＰＥを５０μｌウェルに加えた。プレートを再度密封し、上記のように３０分間インキュベートした。さらなる洗浄ステップを実施した後、洗浄緩衝液１００μｌを各ウェルに加えることにより微小粒子を再懸濁し、プレートを密封して、Luminex（商標）解析器上で解析する準備ができるまで最大９０分、振盪機上に放置した。

結果
Ｔｈ１応答に関与するサイトカインＩＬ－１２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα
ＩｇＥの架橋結合により、Ｍ０及びＭ２ａの両マクロファージにおいてＴＮＦα分泌の劇的な増加（１００～約２，０００ｐｇ／ｍｌ）が生じ、一方、Ｍ１細胞においては、試験した全ての実験条件下で、そのメディエーターの産生が非常に低度か又は全く検出されなかった（図１）。

程度は低いが、ＩｇＥの架橋結合によって、Ｍ０及びＭ２ａの両サブセットでＩＦＮγの産生が増強された。Ｍ１マクロファージは、他のサブセットと比較して４倍高いＩＦＮγのベースラインレベルを示したが、ＩＦＮαの濃度は、ＩｇＥによる活性化時にも安定したままであった。

ＩＬ－１２濃度を測定すると、同一の型及び規模の調節が観察され、ＳＦ－２５及びＮＩＰ ＩｇＥの両抗体で架橋結合された場合、Ｍ０及びＭ２ａマクロファージでは、ＩＬ－１２産生が１００から約１５００～２０００ｐｇ／ｍｌまで増加した。Ｍ１細胞では、ＩＬ－１２の高いベースラインレベル（約１，５００ｐｇ／ｍｌ）が特徴的であり、これは、ＩｇＥ処理でも影響されないままであった。

抗炎症サイトカインＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３
ＩｇＥ架橋結合時に、Ｍ０及びＭ２ａの両サブセットでは、ＩＬ－４産生は、わずかに増加したが、Ｍ１細胞では、影響されないままであった。

ＩＬ－１０に関しては、ベースラインレベルは、Ｍ０及びＭ１のマクロファージ間で非常に類似し（２０及び２５ｐｇ／ｍｌ）、Ｍ２ａでは、はるかに低かった（約７ｐｇ／ｍｌ）。しかし、ＩｇＥ架橋結合により、Ｍ０及びＭ２ａサブセットでは、ＩＬ－１０の放出が効果的に上方制御され、一方、Ｍ１マクロファージでは、レベルは変化しないままであった。

ＩＬ－１３のバックグラウンド濃度は、３つ全てのマクロファージ集団にわたって同一であった。しかし、細胞表面上でのＳＦ－２５及びＮＩＰ ＩｇＥの架橋結合後、Ｍ１マクロファージではなくＭ０及びＭ２ａ細胞では、ＩｇＥの架橋結合によりＩＬ－１３分泌が増加した（図２）。

炎症応答に関与するサイトカインＩＬ－１γ及びＩＬ－６
ＩＬ－１β及びＩＬ－６の両分泌を解析した場合、ＩｇＥ活性化に対する応答は、Ｍ０及びＭ２ａの表現型間で再び類似した。両サイトカインのベースライン濃度は、３つの細胞サブセットにわたって非常に低くなり、Ｍ１マクロファージでは、全ての処理にわたって安定したままであった。しかし、Ｍ０及びＭ２ａマクロファージでは、細胞結合ＩｇＥの架橋結合により、ＩＬ－１β及びＩＬ－６の分泌におけるネットの増加（net increase）が生じた（図３）。

マクロファージ化学遊走ケモカインＭＣＰ－１（ＣＣＬ２）及びＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）
ＭＣＰ－１により、単球、マクロファージ及び樹状細胞が炎症部位に動員されることがわかっている。また、炎症部位へのこの作用は、走化性及び食作用のような多くの重要なマクロファージ機能の調節物質であるＲＡＮＴＥＳにより促進される。したがって、任意の分泌調節により、この抗体クラスのマクロファージとの相互作用のさらなる解析が助けられるため、ＩｇＥ活性化時のＭＣＰ－１及びＲＡＮＴＥＳの濃度をここで試験した。

Ｍ０又はＭ１マクロファージのいずれにおいても、細胞結合ＩｇＥの架橋結合により、ＭＣＰ－１上清濃度の調節は生じなかった。一方、Ｍ２ａサブセットは、試験した全ての条件下でＭＣＰ－１の放出を増強することによりＩｇＥ活性化に応答した。

ＩｇＥ処理時のＲＡＮＴＥＳ分泌の調節により、Ｍ０及びＭ２ａの両マクロファージにおいて同一のパターンが示され、ここで発明者らは、細胞結合ＩｇＥが架橋結合された場合、この産生の劇的な増加を検出した。興味深いことには、Ｍ０及びＭ２ａマクロファージにおいてＲＡＮＴＥＳレベルが増加した場合、ピーク濃度がＭ１細胞におけるベースライン濃度にほぼ一致し、このＭ１細胞では、代わりにＲＡＮＴＥＳ分泌の調節は、試験した全ての条件にわたって検出されなかった（図３）。

インターフェロンガンマ誘導ケモカインＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）及びＩ－ＴＡＣ（ＣＸＣＬ１１）
Ｍ１マクロファージにおけるＭＩＧ濃度は、試験した種々の条件間で変化しないままであり、このマクロファージサブセットにおいて、ＩｇＥ活性化が、この産生には影響しないことを示した。類似の作用は、代わりにＭ０及びＭ２ａマクロファージ間で観察され、この場合、ＩｇＥの架橋結合により、ＭＩＧ分泌のわずかな増加が生じた。

Ｉ－ＴＡＣ濃度の解析により、このケモカインのバックグラウンドレベルが、Ｍ１マクロファージにおいて、他の２つのサブセットと比較してはるかに高かったことが明らかとなり、Ｍ１では、約４００ｐｇ／ｍｌのベースライン濃度が特徴的であって、Ｍ０及びＭ２ａ細胞において検出されたベースライン濃度の約４倍の高さであった。それにもかかわらず、Ｍ０及びＭ２ａ培養物のＩｇＥ架橋結合による処理によって、上清中に放出されたＩ－ＴＡＣの量が劇的に増加して、この濃度がＭ０細胞では約８０から約１６０ｐｇ／ｍｌに、Ｍ２ａマクロファージでは５０から約２００ｐｇ／ｍｌに上昇した（図４）。

まとめると、ＭＣＰ－１由来を除く試験した全ての可溶性メディエーターでは、細胞結合ＩｇＥの架橋結合により、Ｍ０及びＭ２ａマクロファージに対して同一の作用が誘発されたことが観察された。Ｍ０又はＭ１サブセットではなくＭ２ａマクロファージにおけるＩｇＥ架橋結合により、ＭＣＰ－１分泌の増強が誘発された。一方、Ｍ１マクロファージは、ＩｇＥ活性化に対してほぼ無応答となったが、２つの注目すべき例外を有し、ＩｇＥ架橋結合により炎症促進メディエーターＩＦＮγ及びＩＬ－１２の上方制御が誘発された（表３）。

表３では、ＩｇＥ架橋結合前後のマクロファージにおけるサイトカイン及びケモカイン放出の変化を↑増加の検出、↓減少の検出と設定し、可溶性メディエーターが見出し列「生理学的状態」から「ＩｇＥ架橋結合」と名付けられた列へと繰り返されない場合は、この産生は、２つの条件間で不変のままであった。Ｍ０及びＭ２ａマクロファージに対する細胞結合ＩｇＥの架橋結合により、試験した全ての可溶性メディエーターの産生が維持又は増加した。興味深いことには、ＭＣＰ－１は、Ｍ２ａ細胞の架橋結合時のみ上方制御され、Ｍ２ａマクロファージによるＭＣＰ－１産生及び分泌の誘導における抗腫瘍ＩｇＥ抗体の潜在的役割を示唆した。Ｍ１マクロファージの極性化状態は、ＩｇＥによる細胞の刺激時に保持され、ＩｇＥ抗体が、ＴＭＥにおいて炎症促進プロファイルを維持することを示唆した。対照的に、Ｍ０及びＭ２ａマクロファージに対する細胞結合ＩｇＥの架橋結合により、炎症促進性及び抗炎症性の両メディエーターを分泌する新たに極性化したマクロファージ表現型が生じ、これにより、静止状態（Ｍ０）又は腫瘍促進（Ｍ２ａ）表現型の、新たな炎症促進活性を特徴とする新たな表現型への偏向におけるＩｇＥ抗体の注目すべき作用が説明される。

マクロファージは、循環する末梢血単核球から分化する組織常在性食細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。これらは、自然並びに適応免疫において重要な活性及び制御機能を果たす（Murray PJ, Wynn TA (2011). Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol, 11(11): 723-37）。種々の表現型の活性化マクロファージは、Ｍ１マクロファージ（ＣＡＭ）及びＭ２マクロファージ（ＡＡＭ）に通常分類される。古典的活性化Ｍ１マクロファージは、急性炎症性表現型を有する免疫エフェクター細胞を含む。これらは、細菌に対して高度に攻撃的であり、大量のリンフォカインを産生する（Murray PJ, Wynn TA (2011). Obstacles and opportunities for understanding macrophage polarization. J Leukoc Biol, 89(4):557-63）。選択的活性化抗炎症Ｍ２マクロファージ（alternatively activated, anti-inflammatory M2-macrophages）は、少なくとも３つのサブグループに分けることができる。このようなサブタイプは、免疫の制御、寛容性の維持、及び組織修復／創傷治癒を含む様々な機能を有する。実際、単球／マクロファージ系列の細胞は、内因的並びに外因的刺激に対する応答において異常な柔軟性を示し、これにより最初のＭ１／Ｍ２極性化プロセスの無効化が可能となり、例えば、Ｍ２極性化マクロファージを特定の条件下でＭ１活性化状態に転換させることができる。

ヒトの初代マクロファージは、組織から十分な量で単離することが困難であり、培養において増殖しない。加えて、得られた細胞が、著しい表現型的不均一性を示すことが多いことが一般に認められている。ヒト血中単球が、容易に多数入手可能であり、インビトロでマクロファージに分化させることができるため、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）は、優れた代替物となる。

マクロファージの特性決定についての殆どの研究は、ヒト由来マクロファージとプロファイルがかなり異なるマウス細胞に対して行われてきた。例えば、ＣＤ２０６は、マウスにおいて良好なＭ２マーカーであるが、ＣＤ２００Ｒは、ヒト細胞において、より良好に作用すると思われる。加えて、Ｍ１及びＭ２マーカー間の差は、定量的な傾向を有する。例えば、Ｍ１及びＭ２の両方は、ＭＨＣIIを発現するが、Ｍ１は、はるかに高い強度でこれを発現する。Ｍ１／Ｍ２の分化に使用される表面マーカーの全てではないが殆どにも同じことが当てはまるため、「陽性コントロール」があることが非常に望ましい。しかし、Ｍ１マクロファージの一般に認められているマーカープロファイルは、ＣＤ６８＋／ＣＤ８０＋／ＣＤ１６３－又はＣＤ１６３ｌｏｗであるが、Ｍ２マクロファージは、ＣＤ６８＋／ＣＤ８０－／ＣＤ１６３＋と特徴づけられる。しかし、ＣＤ１６３の上方制御は、マクロファージの極性化方法（ＩＬ－４／ＩＬ－１０、ＲＰＭＩ培地又はエクスビボ）に依存する。理想的には、形態学（Ｍ１：卵形又は円形、Ｍ２：目玉焼き形又は樹状突起を有する）、遺伝子発現（例えば、ｉＮＯＳ／Ａｒｇ１比、サイトカインＩＬ－１ベータ、ケモカインＣＣＬ２及びＰｔｇｓ２）及びフローサイトメトリー解析を含む、複数の方法を特性決定に使用する。

考察
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、多数の機構により抗腫瘍作用を発揮することができる。しかし、Ｆｃ媒介機構により作用するｍＡｂが、免疫系の関与及び腫瘍微小環境の免疫プロファイルの調節においてどのように鍵となる役割を果たすかが最近わかってきた（Bakema et al (2014) Fc Receptor-Dependent Mechanisms of Monoclonal Antibody Therapy of Cancer. In Current topics in microbiology and immunology, 382: 373-392、Moore et al (2010) Engineered Fc variant antibodies with enhanced ability to recruit complement and mediate effector functions. mAbs 2(2): 181-189）。現在、使用されるいくつかのｍＡｂ、例えば、トラスツズマブ及びイピリムマブは、Ｆｃ媒介機構が、このようなクラスの抗がん剤の臨床的有効性に付与し得る実質的寄与の証拠をもたらした（Peggs et al, J Exp Med 2009 Aug 3;206(8):1717-1725; Simpson et al. J Exp Med 2013 Aug 26;210(9):1695-1710; Romano et al. Proc Natl Acad Sci USA 2015 May 12;112(19):6140-6145; Arce Vargas et al (2018) Fc Effector Function Contributes to the Activity of Human Anti-CTLA-4 Antibodies. Cancer Cell. 33(4): 649-663.e4; Shi et al (2014) Engagement of immune effector cells by trastuzumab induces HER2/ERBB2 downregulation in cancer cells through STAT1 activation. Breast Cancer Research. 16(2): R33）。したがって、ｍＡｂの細胞傷害機能を調節するだけでなく、固形悪性腫瘍の大多数における免疫抑制微小環境をも克服するＦｃ改変が、特別、注目されている（Bakema et al （上記参照）、Dahan et al (2015) FcγRs Modulate the Anti-tumor Activity of Antibodies Targeting the PD-1/PD-L1 Axis. Cancer Cell. 28(3): 285-295、Moore et al （上記参照））。臨床的有効性を向上させるようにＦｃドメインを改変するために探求された戦略の中でも、グリコシル化プロファイルの修飾及び種々のアイソタイプサブクラスの選択は、最も調査された戦略である（Ferrara et al (2006) Modulation of therapeutic antibody effector functions by glycosylation engineering: Influence of Golgi enzyme localization domain and co-expression of heterologous β1, 4-N-acetylglucosaminyltransferase III and Golgi α-mannosidase II. Biotechnology and Bioengineering. 93(5): 851-861、Kellner et al (2017) Modulating Cytotoxic Effector Functions by Fc Engineering to Improve Cancer Therapy. Transfusion Medicine and Hemotherapy: Offizielles Organ Der Deutschen Gesellschaft Fur Transfusionsmedizin Und Immunhamatologie. 44(5): 327-336、Schlothauer et al (2016) Novel human IgG1 and IgG4 Fc-engineered antibodies with completely abolished immune effector functions. Protein Engineering Design and Selection. 29(10): 457-466）。

対照的に、調査が不十分なままである戦略のうちの１つは、一般に使用されるＩｇＧとは異なるクラスのＦｃ領域を有する抗体の使用である。ＩｇＥクラスの抗体の改変は、このような戦略の１つである。実際、種々のＦｃ受容体が特有な免疫細胞サブセットにより発現するため、ＩｇＥのような新たな抗体アイソタイプの使用は、免疫エフェクター細胞の多様な集団の関与への橋渡しとなり、最終的には、臨床結果の潜在的な向上への橋渡しとなる。

固形悪性腫瘍の治療におけるＩｇＥ抗体の潜在的利点は、免疫グロブリンクラスの独特な生物学的特性とともに、多くのカギとなるＩｇＥ受容体発現免疫エフェクター細胞の腫瘍微小環境における実証された浸潤に依存する。このような知見に基づいて、腫瘍抗原を標的とする組換えＩｇＥ抗体を含む、いくつかのＩｇＥに基づく免疫治療的方法が、腫瘍細胞に対するＩｇＥ媒介免疫応答の誘発を目的として開発された（Daniels et al (2012) Targeting HER2/neu with a fully human IgE to harness the allergic reaction against cancer cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61(7): 991-1003、Josephs et al (2017) Anti-Folate Receptor-α IgE but not IgG Recruits 330 Macrophages to Attack Tumors via TNFα/MCP-1 Signaling. Cancer Research. 77(5): 1127-1141、Josephs et al (2018) An immunologically relevant rodent model demonstrates safety of therapy using a tumour-specific IgE. Allergy. 2018 Dec;73(12):2328-2341、Karagiannis et al (2012) Recombinant IgE antibodies for passive immunotherapy of solid tumours: from concept towards clinical application. Cancer Immunology, Immunotherapy: CII, 61(9), 1547-1564、Kershaw et al (1998) Tumor-specific IgE-mediated inhibition of human colorectal carcinoma xenograft growth. Oncology Research. 10(3): 133-142）。

ＩｇＥで刺激したマクロファージ細胞培養物から採取した上清について実施した、サイトカイン及びケモカインの解析により、ＩｇＥとの関与又はＩｇＥ架橋結合時の可溶性メディエーターの同定が可能となった。

Ｍ１マクロファージでは、ＩｇＥ架橋結合で、ＩＦＮγ及びＩＬ－１２のような炎症促進サイトカインの産生が保持された。Josephsらは、ＩＬ－１２を含む炎症促進免疫関連経路の上方制御及びＮＫ細胞免疫活性化特性を、ＭＯｖ１８ＩｇＥで処置した腫瘍を有するラットの肺において最近、実証した（Josephs et al., 2018上記参照）。このような知見を考慮すると、そのサブセットの公知の炎症促進及び抗原提示機能と一致して、ＩｇＥの関与及び架橋結合により、少なくともＭ１マクロファージが保持され得る可能性がある。

１つを除く試験した全てのメディエーター（ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＧ及びＩ－ＴＡＣ）の分泌は、非活性化Ｍ０及びＭ２ａマクロファージに対する細胞結合ＩｇＥの架橋結合により同一の方法で調節された。これは、２つのサブセットが、ＦｃεＲＩ経路の活性化を制御する能力において類似の分子機構を特徴とし得ることを示唆する。より詳細には、試験した全ての可溶性メディエーターの産生は、同一レベルで保持されたか、又はＩｇＥ架橋結合とともに増加した。ＳＦ－２５ＩｇＥとの架橋結合後にＭ０及びＭ２ａにより分泌されたサイトカインの集団は、定義のマクロファージサブタイプと一致しなかった。しかし、ＩｇＥ刺激細胞により提示されるメディエーター特性に基づけば、これは、炎症促進性及び抗炎症性の両メディエーター、並びに化学遊走因子を分泌する、新たに極性化したマクロファージサブセットに対応する。誘発されたＭ０及びＭ２ａの両マクロファージに対するＩｇＥ架橋結合により、炎症促進Ｍ１サイトカインＴＮＦαのレベルが増強された。一方、ＩｇＥ架橋結合は、Ｍ０及びＭ２マクロファージにおいて、マクロファージ化学遊走物質ＭＣＰ－１の産生に関して異なる作用を示した。Ｍ２ａマクロファージでは、ＩｇＥで処理すると、ＭＣＰ－１の産生及び放出が増強された。

単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）のようなケモカインは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質と共役する特異的細胞表面膜貫通受容体に結合し、このヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化により、ケモカインソースへの遊走を促す細胞内シグナル伝達カスケードの活性化が生じる。ＣＣＬ２とも呼ばれるＭＣＰ－１により、単球、メモリーＴリンパ球、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の遊走及び浸潤が制御される。単球は、灌流領域間の大きな圧力差から生じる剪断応力の増加により活性化された内皮に、接着及び侵入するため、腫瘍動脈形成の開始に重要である（Scholz et al (2001) Arteriogenesis, a new concept of vascular adaptation in occlusive disease. Angiogenesis. 4: 247-257）。ＭＣＰ－１は、単球を誘引するだけでなく、活性化された内皮において発現する細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ－１）の受容体であるＭＡＣ－１を上方制御するように誘導することによって接着を促進するため、このプロセスに関係づけられる。また、ＭＣＰ－１は、組織培養におけるマクロファージへの追加時に腫瘍細胞に対する細胞増殖抑制活性を増大させ（Zachariae et al (1990) Properties of monocyte chemotactic and activating factor (MCAF) purified from a human fibrosarcoma cell line. J Exp Med. 171: 2177-2182）、これにより細胞のアポトーシスを駆動することが示されている。

増え続ける疫学的及び臨床的データにより、慢性炎症によって腫瘍の増殖及び進行が促進されるという概念が支持されている。主要な炎症促進サイトカインとして、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）は、炎症及び発癌の仲立ちをする内因性腫瘍促進因子として作用することが可能であり、ＴＮＦαにより、ＴＮＦ誘導細胞傷害に対して抵抗性の殆どのがん細胞において増殖、生存、遊走、及び血管形成が刺激されて、腫瘍促進が生じることがわかっている。しかし、ＴＮＦαは、腫瘍細胞の増殖を抑制して腫瘍の退縮を誘導する能力をも有する。したがって、ＴＮＦαは、両刃の剣であり、腫瘍形成促進性又は抗腫瘍形成性のいずれかとなり得る（Wang and Lin (2008) Tumor necrosis factor and cancer, buddies or foes? Acta Pharmacol Sin. 29(11): 1275-1288）。天然に存在する化合物及び合成化合物を含む多数の薬剤は、ＮＦ－κＢ活性化を阻害することによりＴＮＦα誘導細胞死に対して腫瘍細胞を感作することが示されている。このような化合物をＴＮＦαと組み合わせると、腫瘍細胞において相乗的細胞傷害が生じた（Wang X et al (2006) 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin synergistically potentiates tumor necrosis factor-induced lung cancer cell death by blocking the nuclear factor-kappaB pathway. Cancer Res. 66(2): 1089-95、Zhang S et al (2004) Suppressed NF-kappaB and sustained JNK activation contribute to the sensitization effect of parthenolide to TNF-alpha-induced apoptosis in human cancer cells. Carcinogenesis. 25(11): 2191-9、Fas SC et al (2006) Wogonin sensitizes resistant malignant cells to TNFalpha- and TRAIL-induced apoptosis. Blood. 108(12): 3700-6、Ju W et al (2007) A critical role of luteolin-induced reactive oxygen species in blockage of tumor necrosis factor-activated nuclear factor-kappaB pathway and sensitization of apoptosis in lung cancer cells. Mol Pharmacol. 71(5): 1381-8、Rae C et al (2007) Elevated NF-kappaB responses and FLIP levels in leukemic but not normal lymphocytes: reduction by salicylate allows TNF-induced apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104(31): 12790-5、Shukla S, Gupta S (2004) Suppression of constitutive and tumor necrosis factor alpha-induced nuclear factor (NF)-kappaB activation and induction of apoptosis by apigenin in human prostate carcinoma PC-3 cells: correlation with down-regulation of NF-kappaB-responsive genes. Clin Cancer Res. 10(9): 3169-78、Shishodia S et al (2006) A synthetic triterpenoid, CDDO-Me, inhibits IkappaBalpha kinase and enhances apoptosis induced by TNF and chemotherapeutic agents through down-regulation of expression of nuclear factor kappaB-regulated gene products in human leukemic cells. Clin Cancer Res. 12(6): 1828-38）。加えて、ＴＮＦαは、アジュバント試薬として使用して、ドキソルビシンのような化学療法剤の抗がん作用を促進するか（Cao W et al (2005) TNF-alpha promotes Doxorubicin-induced cell apoptosis and anti-cancer effect through downregulation of p21 in p53-deficient tumor cells. Biochem Biophys Res Commun. 330(4): 1034-40）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）低発現がん腫を抗ＥＧＦＲ療法に対して感作するか（Hambek M et al (2001) Tumor necrosis factor alpha sensitizes low epidermal growth factor receptor (EGFR)-expressing carcinomas for anti-EGFR therapy. Cancer Res. 61(3): 1045-9）、又は非小細胞肺がん細胞においてＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害物質に対する獲得耐性を克服することができる（Ando K et al (2005) Enhancement of sensitivity to tumor necrosis factor alpha in non-small cell lung cancer cells with acquired resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 11(24 Pt 1): 8872-9）。ＴＮＦα及び化学療法剤の組合せは、治療に対する腫瘍感受性を増加させることにより、多くの腫瘍に有効な治療戦略となることが示されている。また、ＴＮＦαによって、Ｔ細胞及び樹状細胞を活性化して宿主の抗腫瘍適応免疫応答を増強させることが可能である。

本明細書において提示する知見は、Ｍ０及びＭ２ａマクロファージを刺激してＴＮＦαを分泌させることが可能であり、選択的活性化Ｍ２ａマクロファージが、ＩｇＥによる架橋結合時にＭＣＰ－１を上方制御する唯一の細胞型であることを示す。したがって、ＩｇＥは、この通常は抗炎症性選択的活性化マクロファージサブセットを、古典的活性化Ｍ１マクロファージと通常、関連する一部の特性を有する、より成熟し、より活性化した表現型に対して特異的に刺激する能力を有する。このような知見は、マクロファージの標的化によるがん治療における、ＩｇＥにより媒介される選択的活性化マクロファージの極性化の役割、例えば、マクロファージを活性表現型に、腫瘍において直接再教育するための、マクロファージを中心とする免疫療法の使用を示唆する。

上記明細書において言及する全ての公表文献は、参照により本明細書において組み込む。本発明の記載する方法及び系の種々の変更形態及び変形形態は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、主張する本発明が、このような特定の実施形態に不当に制限されるべきではないことが理解されるべきである。実際、当業者に明白な、本発明を実行するための記載の方法の種々の変更形態は、以下の特許請求の範囲内であることを意図する。

Claims (21)

1. 対象のがんの治療における第１の表現型から抗腫瘍表現型へのマクロファージの再極性化における使用のための免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）であって、前記第１の表現型が、静止状態（Ｍ０）マクロファージ表現型又は抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージ表現型を含み、前記抗腫瘍表現型が、以下のサイトカイン及びケモカイン：腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）；インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）；インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）；インターロイキン６（ＩＬ－６）；ＲＡＮＴＥＳ又はＣＣＬ５（活性化時調節、正常Ｔ細胞発現及び分泌）；並びにインターロイキン１０（ＩＬ－１０）の発現により特徴づけられる新たに極性化したマクロファージ表現型を含む、前記ＩｇＥ。
2. 対象のがんの治療における使用のための免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）であって、前記対象における腫瘍と関連するマクロファージが、静止状態（Ｍ０）マクロファージ表現型又は抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージ表現型を有し、前記ＩｇＥの治療が、前記腫瘍と関連する前記マクロファージの、以下のサイトカイン：腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）；インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）；インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）；インターロイキン６（ＩＬ－６）；ＲＡＮＴＥＳ又はＣＣＬ５（活性化時調節、正常Ｔ細胞発現及び分泌）；並びにインターロイキン１０（ＩＬ－１０）の発現により特徴づけられる新たに極性化したマクロファージ表現型への再極性化を促進する、前記ＩｇＥ。
3. 新たに極性化したマクロファージ表現型が、抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージ表現型と比較した単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）の発現の増加により、さらに特徴づけられる、請求項１又は２に記載の使用のためのＩｇＥ。
4. 新たに極性化したマクロファージ表現型が、静止状態（Ｍ０）マクロファージ表現型又は抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージ表現型と比較したインターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１３（ＩＬ－１３）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）及び／又はケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＸＣＬ１１）の発現の増加により、さらに特徴づけられる、請求項１～３のいずれかに記載の使用のためのＩｇＥ。
5. ＩｇＥの治療が、対象における腫瘍と関連する炎症促進（Ｍ１）マクロファージによるＩＦＮγ及び／又はＩＬ－１２の発現の増加をさらに促進する、請求項１～４のいずれかに記載の使用のためのＩｇＥ。
6. 対象における腫瘍と関連するマクロファージが、前記腫瘍の周辺を囲むように分布している、請求項１～５のいずれかに記載の使用のためのＩｇＥ。
7. 新たに極性化したマクロファージ表現型が、さらなる単球及び／又はマクロファージの対象における腫瘍への動員を促進する、請求項１～６のいずれかに記載の使用のためのＩｇＥ。
8. がんが、皮膚がん、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、前立腺がん、卵巣がん、結腸がん、神経膠腫、胃がん、肺がん又は膵臓がんを含む、請求項１～７のいずれかに記載の使用のためのＩｇＥ。
9. ＩｇＥが、抗葉酸受容体α（ＦＲα）抗体、抗高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）抗体、抗ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）抗体又は抗ＳＦ－２５抗体を含む、請求項１～８のいずれかに記載の使用のためのＩｇＥ。
10. それを必要とする対象においてがんを治療するための、治療有効量の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）を前記対象に投与するステップを含む、方法であって、前記対象における腫瘍と関連するマクロファージが、静止状態（Ｍ０）マクロファージ表現型又は抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージ表現型を有し、前記ＩｇＥの治療が、前記腫瘍と関連する前記マクロファージの、以下のサイトカイン：腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）；インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）；インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）；インターロイキン６（ＩＬ－６）；ＲＡＮＴＥＳ又はＣＣＬ５（活性化時調節、正常Ｔ細胞発現及び分泌）；並びにインターロイキン１０（ＩＬ－１０）の発現により特徴づけられる新たに極性化したマクロファージ表現型への再極性化を促進し、前記新たに極性化した前記マクロファージ表現型が、前記静止状態（Ｍ０）マクロファージ表現型又は前記抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージ表現型と比較して抗腫瘍活性の増強を有し、これにより前記対象においてがんを治療する、前記方法。
11. 対象から得られた腫瘍試料中に存在するマクロファージの１又は２以上の表現型を検出するステップと、静止状態（Ｍ０）及び／又は抗炎症（Ｍ２ａ）マクロファージが前記試料中に所定のレベルを超えて存在する場合、ＩｇＥを前記対象に投与するステップとを含む、請求項１０に記載の方法。
12. 以下のサイトカイン：ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ－１０、ＭＣＰ－１、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＭＣＰ－１、ＣＸＣＬ９、ＩＬ－１２及び／又はＣＸＣＬ１１の１又は２以上の、試料中に存在するマクロファージによる発現を検出するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
13. 対象における腫瘍と関連するマクロファージの再極性化における使用のための免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）であって、前記再極性化により、腫瘍微小環境におけるサイトカイン発現の調節及び抗腫瘍活性の増強が生じる、前記ＩｇＥ。
14. 再極性化したマクロファージが、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）を発現する、請求項１３に記載の使用のためのＩｇＥ。
15. 再極性化したマクロファージが、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を発現する、請求項１３又は１４に記載の使用のためのＩｇＥ。
16. 再極性化したマクロファージが、インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）を発現する、請求項１３～１５のいずれかに記載の使用のためのＩｇＥ。
17. 再極性化したマクロファージが、インターロイキン６（ＩＬ－６）を発現する、請求項１３～１６のいずれかに記載の使用のためのＩｇＥ。
18. 再極性化したマクロファージが、ＲＡＮＴＥＳ又はＣＣＬ５（活性化時調節、正常Ｔ細胞発現及び分泌）を発現する、請求項１３～１７のいずれかに記載の使用のためのＩｇＥ。
19. 再極性化したマクロファージが、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）を発現する、請求項１３～１８のいずれかに記載の使用のためのＩｇＥ。
20. 再極性化したマクロファージが、以下のサイトカイン及びケモカイン：腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）；インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）；インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）；インターロイキン６（ＩＬ－６）；ＲＡＮＴＥＳ又はＣＣＬ５（活性化時調節、正常Ｔ細胞発現及び分泌）；並びにインターロイキン１０（ＩＬ－１０）の発現により特徴づけられる新たに極性化したマクロファージ表現型を含む、請求項１３～１９のいずれかに記載の使用のためのＩｇＥ。
21. 再極性化したマクロファージが、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）を発現する、請求項１３～２０のいずれかに記載の使用のためのＩｇＥ。

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