JP2022518162A - 誘導放出抑制顕微鏡法用パルス整形 - Google Patents

Abstract

本明細書で開示されるのは、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡法のためのパルス整形方法である。この方法は、抑制波長λｄを有する光励起／抑制パルスを生成することと、励起／抑制パルスを励起部分と抑制部分へ時間的に分割することであって、励起部分および抑制部分が光軸に沿って伝搬し、遅延時間Δｔだけ離れるように時間的に分割することと、励起部分と抑制部分の間の有効位相差Δφを作り出すことと、励起／抑制パルスの励起部分および抑制部分を焦点へ集光することと、を含み、遅延時間Δｔおよび有効位相差Δφは、励起／抑制パルスの強度分布が第１時刻に焦点で極大値を持ち、第２時刻に焦点で極小値を持つように選択される。

Description

本発明は物理学および生物学の分野に属する。特に、本発明は誘導放出抑制顕微鏡法のための光パルスを整形する方法および装置に関する。

超解像顕微鏡法により、回折限界を下回る空間分解能でサンプルを光学的に画像化することが可能となり、超解像顕微鏡法は特に生体サンプル、例えば細胞の画像化に大いに関係する。その顕著な例は、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡法である。回折限界を下回る分解能を実現するために、ＳＴＥＤは、誘導放出を用いて励起状態を急速に減少させることで画像マーカーの自発的な蛍光を抑制することを頼りにしている。

従来の共焦点蛍光顕微鏡では、励起レーザー光がサンプル上で集光され、焦点にある画像マーカーを電子励起状態へ励起させることができる。励起された画像マーカーは、自発的に電子基底状態へと減衰して蛍光光子を放出し、蛍光光子が検出されて画像マーカーを撮像することができる。撮像の分解能は励起光の焦点サイズにより決定され、したがって回折限界により制限されることがある。

ＳＴＥＤ顕微鏡では励起レーザー光に抑制光が重ね合わせられ、この抑制光によって画像マーカーを誘導放出で電子励起状態から基底状態へ移動させることができる。焦点において、抑制光は、自然放出が起こる前に中心領域の外側の励起された画像マーカーを基底状態へ移動させることができるように、例えば中心で顕著な最小値を有するドーナツ状の強度分布を示しうる。その結果、中心領域の外側の画像マーカーを、中心領域内の画像マーカーだけが信号に寄与するように、効果的に消すことができる。中心領域の大きさは抑制光の出力に依存し、画像マーカーが励起された状態に留まる確率は抑制光の強度と共に非線形的に上がるため、中心領域の大きさを回折限界より小さくすることができる。これには高出力の抑制光が必要になることがあり、サンプルに損傷を与えかねない。サンプルに対する影響を低減するため、パルス状の励起および抑制が使用されうる。撮像の信号対雑音比は、第１抑制パルスの後に中心領域の画像マーカーを抑制するためにガウス分布の強度プロファイルを有する第２抑制パルスを併用し、時間分解検出を用いたバックグラウンド抑制により改善することができる（”P.Gao et al., Nature Photonics 11,163(2017)”を参照）。

抑制光による再励起を防ぐため、励起光と抑制光により画像マーカーのエネルギースペクトル内の異なる振動状態に対処することができる。したがって、これらの光の波長は概して異なり、その結果、２つのレーザー光源が必要になりうる。画像マーカーの励起に対して２光子過程を用いることで、励起光および抑制光に同じ波長を使うことが可能となる（”P.Bianchini et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109,6390(2012)”を参照）。しかし、この手法は充分に大きなストークスシフトを示す画像マーカーに限定される。さらに、分解能を改善するには励起光と抑制光を正確に重ね合わせることが必要となり、これは調整を退屈なものとしうる。調整を簡略化するため、両方の光を同じ光ファイバへ連結することができる。しかし、この場合は励起光および抑制光に対して所望の強度プロファイルを同時に生成するために特殊なビーム整形素子が必要となりうる（”D.Wildanger et al.,Journal of Microscopy, 236,35(2009)”および”M.Reuss et al., Optics Express 18,1049(2010)”を参照）。これは強度プロファイルの品質に対して有害な影響を与えることがあり、それゆえ分解能に影響を与えることがある（例えば”F.Goerlitz et al., Progress In Electromagnetics Research 147,57(2014)”を参照）。

したがって、本発明の目的は、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡の調整を簡略化し、必要となるレーザー出力を低減しながら分解能を向上させる方法および装置を提供することである。

この目的は、請求項１に係る方法および請求項１３に係る装置により達成される。本発明の実施形態は、従属請求項で詳述される。

誘導放出抑制顕微鏡法のためのパルス整形方法は、以下のステップ、すなわち、（１）抑制波長（depletion wavelength）λ_ｄを有する光励起／抑制パルスを生成することと、（２）励起／抑制パルスを励起部分と抑制部分へ時間的に分割することであって、励起部分および抑制部分が光軸に沿って伝搬し、遅延時間Δｔだけ離れるように時間的に分割することと、（３）励起部分と抑制部分の間の有効位相差Δφを作り出すことと、（４）励起／抑制パルスの励起部分および抑制部分を焦点へ集光することと、を含む。遅延時間Δｔおよび有効位相差Δφは、励起／抑制パルスの強度分布が第１時刻に焦点で極大値を持ち、第２時刻に焦点で極小値を持つように選択される。上記のステップの番号付けは明確化のために過ぎず、特定の実行順序を示すものではない。技術的に可能である限り、ステップの順番を変えることができて、方法およびその任意の実施形態は任意の順序でこれらのステップを行うことができる。特に、複数のステップを少なくとも部分的に同時に行ってもよい。

まず、抑制波長λ_ｄを有する光励起／抑制パルスが生成される。好ましくは、励起／抑制パルスはコヒーレントな光パルス、例えばレーザーパルスである。励起／抑制パルスは、例えばピコ秒レーザー光源やフェムト秒レーザー光源などのパルスレーザーから生成することができる。レーザー光源は、例えばモード同期レーザー光源、Ｑ－スイッチレーザー光源、または利得スイッチ駆動レーザー光源とすることができる。あるいは、励起／抑制パルスは、例えば連続波レーザー光源の出力を音響光学変調器、電気光学変調器、機械式シャッター、またはこれらの組み合わせを用いて変調することで連続波レーザー光源から生成することができる。励起／抑制パルスのパルス幅は、例えば１００ｆｓ～１０ｎｓの範囲とすることができて、好ましくは１ｐｓ～１ｎｓの範囲とすることができる。抑制波長は真空中での励起／抑制パルスの中心波長であり、例えば４００ｎｍ～２２００ｎｍとすることができる。励起／抑制パルスは、例えば伝搬方向と垂直な平面内でガウス分布の、またはフラットトップの（均一な）空間強度プロファイルを有することができる。

そして励起／抑制パルスは励起部分と抑制部分へ時間的に分割される。時間的な分割とは、励起部分と抑制部分は遅延時間Δｔだけ離れているが同じ光軸に沿って伝搬する、つまり励起部分と抑制部分はその伝搬方向を変えることでは空間的に分離されないように分割する、ということを指す。遅延時間Δｔは、抑制部分および励起部分が光軸に沿った所与の点、例えば焦点へ到達する時間の差分である。励起／抑制パルスは、例えば以下で詳述するように、励起部分の光路長と抑制部分の光路長を異なるものとすることで分割することができる。励起部分と抑制部分は、光軸と垂直な異なる強度分布を持ちうる。励起部分と抑制部分は同じパルス幅、例えば励起／抑制パルスのパルス幅に等しいパルス幅を持つことができる、または異なるパルス幅を持つことができる。

さらに、有効位相差Δφが励起部分と抑制部分の間に作り出される。有効位相差Δφは励起部分の電界と抑制部分の電界の間の位相差であり、有効位相差は０～２πである。つまり、有効位相差Δφは実際の位相差剰余２πとみなしうる。それに応じて、有効位相差Δφは、励起部分と抑制部分がどのように干渉して励起／抑制パルスの強度分布を生成するかを決定することができる。有効位相差Δφは、例えば以下で詳述するように、励起部分の光路長と抑制部分の光路長を異なるものとすることで作り出すことができる。

励起部分および抑制部分は、例えば励起／抑制パルスが分割後に通過する対物レンズにより焦点へ集光される。好ましくは、励起部分および抑制部分は、焦点における励起／抑制パルスの強度分布のウエストが第１時刻および／または第２時刻における抑制波長λ_ｄより小さくなるように、強く集光される。ウエストは、励起／抑制パルスの強度が励起／抑制パルスの強度分布の最大値の１／ｅ^２となる最大半径方向距離と定義され、半径方向は励起／抑制パルスの伝搬方向と垂直である。

励起／抑制パルスの分割の結果、焦点付近の励起／抑制パルスの強度分布は時間の関数として変動する。遅延時間Δｔおよび有効位相差Δφは、強度分布が第１時刻において焦点で極大値、好ましくは最大値を示すように選択され、強度分布は第２時刻において焦点で極小値を持つ。遅延時間Δｔは、例えば励起部分のみが第１時刻に焦点に到達したように選択することができる。それに応じて、第１時刻における励起／抑制パルスの強度分布は励起部分の強度分布により決定されうる。対物レンズの前の励起部分の位相パターンおよび／または強度分布は、励起部分の強度分布が焦点で極大値を持つようにすることができる。一例では、遅延時間Δｔはさらに、抑制部分が第２時刻に焦点に到達し、励起部分はまだまったく焦点を通過していないように選択することができる。したがって、第２時刻における励起／抑制パルスの強度分布は抑制部分と励起部分の間の干渉により決定されうる。有効位相差Δφは、例えば抑制部分と励起部分が焦点で相殺的干渉をするようにすることができる。別の例では、遅延時間Δｔは、励起部分が第２時刻に焦点をすでに通過しているように選択することができる。それに応じて、第２時刻における励起／抑制パルスの強度分布は抑制パルスの強度分布により決定されうる。対物レンズの前の抑制部分の位相パターンおよび／または強度分布は、抑制部分の強度分布が焦点で極小値を持つようにすることができる。

単一パルスからそのような強度分布を生成することで、方法は、ＳＴＥＤ顕微鏡の調整を容易にすることができる。第１時刻において、励起／抑制パルスはサンプル内の画像マーカーを例えば２光子励起により励起された状態へ励起するのに使用されることがある。場合によっては、励起／抑制パルスは、以下で詳述するように補助励起パルスを併用して、２光子励起、特に２色の２光子励起により、画像マーカーを励起することがある。励起／抑制パルスの強度分布は第１時刻に焦点で極大値を持つので、画像マーカーの励起確率も焦点で極大値を示すことがある。好ましくは、焦点の周りの小さな励起領域内の画像マーカーだけが励起される。第２時刻において、励起／抑制パルスは画像マーカーの励起状態を誘導放出により抑制するのに使用されることがある。第２時刻における励起／抑制パルスの強度分布の極小値は第１時刻における、つまり焦点における極大値と揃えられているので、抑制確率は励起確率が最大値を示す場所で最小値を示すことがある。それに応じて、画像マーカーが誘導放出により効果的に消されることがない中心領域は、励起領域と揃えられていることがある。これによりＳＴＥＤ顕微鏡の分解能を向上させることができて、励起および／または抑制で必要となる強度を低減することができる。

好ましい実施形態では、第２時刻における焦点での励起／抑制パルスの強度は、第２時刻における励起／抑制パルスの強度分布の最大値の１％未満であり、好ましくは０．１％未満である。これにより、焦点における抑制確率を低減しながら中心領域の外にある励起されたマーカーを効果的に抑制して、例えば中心領域からの信号を増大させることができる。第２時刻における励起／抑制パルスの強度は焦点から離れる場合は大きく増えてもよく、例えばあらゆる半径方向、好ましくはあらゆる方向において５０倍より大きく、好ましくは５００倍より大きく増えてもよい。強度が第２時刻における励起／抑制パルスの強度分布の最大値の１％未満である、焦点の周りの領域の大きさは、少なくとも一方向で、好ましくはあらゆる半径方向において、抑制波長の２０％未満とすることができる。

励起／抑制パルスは、例えば励起／抑制パルスが通過する透過型の位相マスクや励起／抑制パルスが反射される反射型の位相マスクなどの、空間的に変動する光路長を持つ位相マスクを使って分割することができる。光路長は抑制波長での光路長であり、位相マスクを横切る場合または位相マスクで反射される場合に、抑制波長の光が得る位相シフトを決定する。所与の位置において、透過型位相マスクの光路長は、励起／抑制パルスの伝搬方向に沿った、その位置での位相マスクの厚さとその位置での位相マスクの平均屈折率の積に等しい。位相マスクは、例えば第１厚さおよび／または第１屈折率を有する第１光路長の第１領域と、例えば第２厚さおよび／または第２屈折率を有する第２光路長の第２領域とを含みうる。励起部分は第１領域を通過する励起／抑制パルスの一部であってもよく、抑制部分は第２領域を通過する励起／抑制パルスの一部であってもよい。そして光路長間の差分により遅延時間Δｔが決定されうる。また、位相マスクは有効位相差Δφを作り出すのにも使用されることがあり、光路長間の差分により遅延時間Δｔおよび有効位相差Δφが決定されうる。あるいは、第１位相マスクは励起／抑制パルスを遅延時間Δｔで分割するのに使用されることがあり、第２位相マスクは有効位相差Δφを作り出すのに使用されることがある。光路長は一領域内で一定でありうる、または、例えば以下で詳述されるように励起／抑制パルスの各部分に位相パターンを刷り込む（imprint）ために、空間的に変動することがある。位相マスクは、例えば励起部分および／または抑制部分を圧縮する、または伸長するために、分散状態、つまり波長依存の光路長を示すことがある。一例では、第１領域は負分散を有し、第２領域は正分散を有し、正（負）分散は波長と共に増加する（減少する）光路長に対応する。

別の例では、反射面が光軸に沿った異なる位置に置かれる、空間的に変動する厚さを有するミラーにより励起／抑制パルスを逆反射することで、励起／抑制パルスを分割することができる。ミラーは例えば２つの平面領域を含むことがあり、一方は光軸に沿った第１位置に置かれて励起部分を反射し、他方は光軸に沿った第２位置に置かれて抑制部分を反射する。さらに、ミラーは有効位相差Δφを作り出すのに使用されることがある。あるいは、位相マスクが有効位相差Δφを作り出すのに使用されることがある。さらに別の例では、電気光学変調器、例えば空間的に変動する電界を用いる電気光学変調器、および／または、異なる電気光学特性を有する２つの領域を備える活性媒体を励起／抑制パルスを分割する、および／または、有効位相差Δφを作り出すのに使用することができる。

集光される前に、励起部分は例えば円形または楕円形の強度分布を持つことがあり、抑制部分は環状の強度分布を持つことがある。円形強度分布は、光が光軸の周りの半径Ｒの円の中に閉じ込められる強度分布であると理解され、楕円形強度分布は光が光軸の周りの楕円の中に閉じ込められる強度分布である。円形強度分布は光軸に対して対称であってもよい。一例では、円または楕円の中の強度は一様であってもよく、または２５％未満は変動してもよく、好ましくは１０％未満だけ変動してもよい。環状強度分布は、光が光軸の周りの内側の円または楕円と外側の円または楕円の間の環帯に閉じ込められる強度分布であると理解される。内側の円は第１半径Ｒ_１を有することができて、外側の円は第２半径Ｒ_２を有することができる。第１半径Ｒ_１は、例えば半径Ｒに等しくてもよい。環状強度分布は光軸に対して対称であってもよい。一例では、環帯の中の強度は一様であってもよく、または２５％未満は変動してもよく、好ましくは１０％未満だけ変動してもよい。円形強度分布を有する励起部分と環状強度分布を有する抑制部分を作り出すため、例えば円形または楕円形内側領域および内側領域を囲む環状外側領域を有する位相マスクを使用することができる。

励起部分と抑制部分の間の有効位相差Δφは、例えば０．９π～１．１πとすることができて、好ましくは０．９９π～１．０１πとすることができる。これにより、例えば第２時刻において励起／抑制パルスの強度分布の極小値を作り出すために、励起部分と抑制部分は焦点において相殺的干渉をすることがある。

遅延時間は、例えば抑制波長に対応する期間の５倍よりも大きくすることができる。好ましい実施形態では、遅延時間は抑制波長に対応する期間の５０倍より大きく、好ましくは抑制波長に対応する期間の２００倍より大きい。抑制波長に対応する期間は、抑制波長に対応する光周波数ν_ｄの逆数である。一例では、遅延時間は１００ｆｓ～１０００ｆｓとすることができる。大きな遅延時間は、例えば第１時刻における励起／抑制パルスの強度分布を長期間、例えば遅延時間にわたって維持するのを可能としうる。これは、例えば焦点においてある励起確率を実現するために、例えば励起部分を使って画像マーカーを励起する場合に有利となりうる。

励起／抑制パルスを分割することはさらに、例えば波長依存の光路長を有する分散相マスクを使って、励起部分および／または抑制部分を時間的に圧縮および／または伸長することを含みうる。一例では、励起部分は励起部分のパルス幅が励起／抑制パルスのパルス幅より短くなるように圧縮される、および／または、抑制部分は抑制部分のパルス幅が励起／抑制パルスのパルス幅より長くなるように伸長される、あるいはチャープされる。

励起部分と抑制部分の間の有効位相差Δφを作り出すことはさらに、位相パターンを励起部分および／または抑制部分へ刷り込むことを含みうる。位相パターンを刷り込むことはそれぞれの部分の電界の位相を位相シフトφ（ｘ，ｙ）により局所的に変更することを指し、それぞれの部分の伝搬方向と垂直な、所与の位置（ｘ、ｙ）における位相シフトφは位相パターンにより決定される。位相パターンは、例えば空間的に変動する光路長を有する位相マスクを使って刷り込むことができる。

好ましくは、抑制波長は、誘導放出を用いて励起／抑制パルスにより誘導されうる画像マーカーの２つの状態の間の遷移である、画像マーカーの抑制遷移と共鳴するように選択される。抑制遷移は、画像マーカーの２つの電子状態、例えば電子励起状態と電子基底状態の間の遷移でありうる。好ましくは、抑制遷移は準安定状態と短い存続期間の状態の間の遷移であり、例えば０．１ｎｓより大きな存続期間を有する準安定状態と１００ｆｓより短い存続期間を有する状態との間の遷移である。抑制遷移は、例えば励起／抑制パルスによる画像マーカーの励起を避けるための、例えば電子励起状態の振動基底状態と電子基底状態の振動励起状態の間の遷移でありうる。画像マーカーは、例えば蛍光タンパク質や窒素－空孔中心のようなフルオロフォア（蛍光色素分子）とすることができて、撮像されるサンプルの構成要素をラベル付けするのに使用することができる。

好ましい実施形態では、方法は、励起波長λ_ｅｘｃを有する光補助励起パルスを生成することも含む。補助励起パルスは、例えばピコ秒レーザー光源やフェムト秒レーザー光源などのパルスレーザー光源から生成することができる。レーザー光源は、例えばモード同期レーザー光源、Ｑ－スイッチレーザー光源、または利得スイッチ駆動レーザー光源とすることができる。あるいは、補助励起パルスは、例えば連続波レーザー光源の出力を音響光学変調器、電気光学変調器、機械式シャッター、またはこれらの組み合わせを用いて変調することで連続波レーザー光源から生成することができる。補助励起パルスのパルス幅は、例えば５０ｆｓ～１０ｐｓの範囲とすることができて、好ましくは１００ｆｓ～１ｐｓの範囲とすることができる。励起波長は真空中での補助励起パルスの中心波長であり、例えば４００ｎｍ～２２００ｍとすることができる。補助励起パルスは、例えば伝搬方向と垂直な平面内でガウス分布の、またはフラットトップの空間強度プロファイルを有することができる。

さらに、方法は、光補助励起パルスを励起／抑制パルスの励起部分に時間的および空間的に重ね合わせることを含みうる。補助励起パルスと励起／抑制パルスは、補助励起パルスおよび励起／抑制パルスが同じ光軸に沿って伝搬するように、例えばダイクロイックミラーまたはビームスプリッタ、特に偏光ビームスプリッタを用いて空間的に重ね合わせることができる。他の例では、補助励起パルスと励起部分は異なる光軸に沿って伝搬することがあり、焦点においてのみ重ね合わせることができる。好ましくは、補助励起パルスと励起／抑制パルスは、補助励起パルスの強度分布が焦点において極大値を持つように重ね合わせられる。補助励起パルスと励起／抑制パルス、特に励起部分は、例えば直交する直線偏光や反対方向の円偏光である、異なる偏光を持つことがある。補助励起パルスを励起／抑制パルスの励起部分に時間的に重ね合わせるため、補助励起パルスおよび／または励起／抑制パルスの放射時間は調整されることがある。さらに、またはあるいは、補助励起パルスおよび／または励起／抑制パルスの光路長は調整されることがある。補助励起パルスと励起部分は、補助励起パルスと励起部分の間の遅延時間が補助励起パルスのパルス幅より小さい場合に時間的に重ね合わせられる。一例では、補助励起パルスと励起部分の間の遅延時間は、補助励起パルスのパルス幅の２５％より小さくすることができて、好ましくは１０％より小さくすることができる。

好ましくは、励起波長および抑制波長は、励起波長を有する光子および抑制波長を有する光子を伴う２光子励起が画像マーカーの励起遷移の２光子励起と共鳴するように選択される。励起遷移は、１つまたは複数の光子を吸収することで誘導されうる画像マーカーの２つの状態の間の遷移である。励起遷移は、画像マーカーの２つの電子状態、例えば電子基底状態と電子励起状態の間の遷移でありうる。好ましくは、励起遷移は短い存続期間を有する状態、例えば１００ｆｓより短い存続期間を有する状態への遷移である。励起遷移は、例えば電子基底状態の振動基底状態と電子励起状態の振動励起状態の間の遷移でありうる。

好ましい実施形態では、励起波長は抑制波長とは異なる。これにより、励起／抑制パルス自体による２光子励起を防ぎつつ、補助励起パルスからの一つの光子と励起／抑制パルスからの一つの光子を吸収することによる２光子遷移によって画像マーカーを励起することができる。単色の２光子励起と比べて、２色の２光子励起は使用可能な画像マーカーに関してより大きな柔軟性を提供する。特に、励起波長および／または抑制波長は画像マーカーのエネルギースペクトルへ適合させることができて、したがって大きなストークスシフトを有する画像マーカーを必要としないことがある。励起確率は励起／抑制パルスと補助励起パルスの両方の強度分布に依存するため、２光子励起は画像マーカーが励起される励起領域の大きさを縮小するのに有利となりうる。さらに、励起／抑制パルスからの光子が励起に必要となるので、励起確率は、励起／抑制パルスの強度分布が第１時刻において極大値を有する焦点で最も大きくなりうる。そのため、励起範囲は第２時刻における励起／抑制パルスの強度分布の極小値と自動的に揃えることができる。一例では、補助励起パルスと励起部分は、例えば単一パルスからの光子による単色の２光子励起を抑制するために、反対方向の円偏光を持つ。

遅延時間Δｔは、例えば補助励起パルスのパルス幅の７５％～１２５％とすることができて、好ましくは９０％～１１０％とすることができる。これにより、補助励起パルスと励起部分の大部分を時間的に重ね合わせることが可能となり、同時に、補助励起パルスと抑制部分の時間的な重なりを少なくすることができる。一例では、補助励起パルスおよび励起部分は同時に焦点に到達してもよく、遅延時間Δｔは、補助励起パルスが焦点をちょうど通過したときに抑制部分が焦点に到達するように、補助励起パルスのパルス幅と等しくすることができる。

また、本発明は誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡法のためのパルス整形装置も提供する。装置は、抑制波長λ_ｄを有する光励起／抑制パルスを励起部分と抑制部分へ分割するように構成されているパルス整形器を含む。パルス整形器は、励起部分と抑制部分が光軸に沿って伝搬し、遅延時間Δｔだけ離れるように、励起／抑制パルスを時間的に分割するよう構成される。パルス整形器はさらに、励起部分と抑制部分の間の有効位相差Δφを作り出すよう構成される。遅延時間Δｔおよび有効位相差Δφは、励起／抑制パルスが焦点へ集光される場合に第１時刻に焦点で極大値を有する強度分布と第２時刻に焦点で極小値を有する強度分布を持つようになっている。パルス整形器は、入射する励起／抑制パルスの特定の位相パターンおよび／または強度分布、例えば一定の位相を有するガウス分布の、またはフラットトップのプロファイルへ適合させることができる、あるいは焦点において所望の強度分布を実現するために様々な位相パターンおよび／または強度分布へ適合させることができる。

パルス整形器は、例えば励起／抑制パルスを逆反射するように構成されているミラーを含みうる。ミラーは、例えば異なる厚さを有する２つの領域を含むことがあり、例えばこの２つの領域で反射される励起／抑制パルスの複数の部分の間の遅延時間Δｔおよび／または有効位相差Δφを作り出すために、２つの領域の反射面が光軸に沿って異なる位置に置かれる。あるいは、またはさらに、パルス整形器は電気光学変調器、例えば空間的に変動する電界を用いる電気光学変調器、および／または、異なる電気光学特性を有する２つの領域を備える活性媒体を含みうる。

好ましい実施形態では、パルス整形器は、例えば励起／抑制パルスを分割するため、および／または、有効位相差Δφを作り出すために、抑制波長で空間的に変動する光路長を持つ位相マスクを含む。位相マスクは、例えば透過型または反射型の位相マスクとすることができる。位相マスクは、例えば第１厚さおよび／または第１屈折率を有する第１光路長の第１領域と、例えば第２厚さおよび／または第２屈折率を有する第２光路長の第２領域とを含みうる。光路長間の差分は、２つの領域を通過するレーザーパルスの複数の部分が遅延時間Δｔおよび／または有効位相差Δφを有するようにすることができる。光路長間の差分は、ｍが整数で０≦δｍ＜１として、Δｌ＝（ｍ＋δｍ）λ_ｄと表すことができる。そして遅延時間ΔｔはΔｔ＝（ｍ＋δｍ）／ν_ｄで与えられ、有効位相差ΔφはΔφ＝２πδｍで与えられ、ν_ｄは抑制波長に対応する光周波数である。光路長は一領域内で一定でありうる、または、例えば励起／抑制パルスの各部分に位相パターンを刷り込むために、空間的に変動することがある。一部の例では、位相マスクは、液晶空間光変調器のような適応式位相マスクとすることができる。適応式位相マスクは、局所的な光路長を位相マスクの位置における励起／抑制パルスの位相パターンおよび／または強度分布へ適合させるように構成されうる。

位相マスクは例えば、抑制波長で第１光路長を有する円形または楕円形の内側部分と、抑制波長で第２光路長を有する環状の外側部分を含みうる。内側部分は例えば第１半径Ｒ_１を有する円とすることができて、環状の外側部分は例えば内側半径Ｒ_１および外側半径Ｒ_２を有する、内側部分を囲むリングとすることができる。位相マスクは例えばＢＫ７ガラスや溶融石英のような材料からなる均一な組成を持つことができて、内側部分で第１厚さ、外側部分で第２厚さを持つことができる。一例では、第１厚さはゼロとすることができる、つまり内側部分は位相マスクにおいて穴とすることができる。あるいは、またはさらに、位相マスクは、内側部分と外側部分で例えば外側部分でより大きな屈折率を有する材料、内側部分でより小さな屈折率を有する材料、という異なる材料から成る、または異なる材料を含むことができる。

第１光路長と第２光路長の間の差分は、ｍを整数として、例えば（ｍ＋０．４５）λ_ｄ～（ｍ＋０．５５）λ_ｄとすることができて、好ましくは（ｍ＋０．４９５）λ_ｄ～（ｍ＋０．５０５）λ_ｄとすることができる。これにより、０．９π～１．１πの有効位相差Δφ、好ましくは０．９９π～１．０１πの有効位相差Δφを実現することができる。一例では、ｍは、例えば抑制波長に対応する期間の５倍より大きな遅延時間を生じさせるために、５より大きくすることができる。好ましい実施形態では、ｍは、例えば抑制波長に対応する期間の５０倍より大きい遅延時間、好ましくは抑制波長に対応する期間の２００倍より大きい遅延時間を生じさせるために、５０より大きくすることができて、好ましくは２００より大きくすることができる。

パルス整形器は、励起部分および／または抑制部分のパルス幅を圧縮および／または伸長するよう構成されうる。パルス整形器は、波長依存の光路長を有する分散相マスクを含みうる。一例では、位相マスクは第１領域および第２領域を含み、第１領域は負分散を有し、第２領域は正分散を有する。正（負）分散は波長と共に増加する（減少する）光路長に対応する。

パルス整形器はさらに、位相パターンを励起部分および／または抑制部分へ刷り込むよう構成されうる。パルス整形器は、位相パターンを励起部分および／または抑制部分へ刷り込むように構成されている、空間的に変動する光路長を有する位相マスクを含みうる。一例では、位相マスクは、伝搬方向の周りの方位角方向で０から２πまで線形に増加する位相を有する位相パターンである渦状位相パターンを抑制部分へ刷り込むよう構成される。

装置はさらに、励起／抑制パルスを放射するように構成されている抑制レーザー光源を含みうる。抑制レーザー光源は、例えばピコ秒レーザー光源やフェムト秒レーザー光源などのパルスレーザー光源とすることができる。抑制レーザー光源は、例えばモード同期レーザー光源またはＱ―スイッチレーザー光源とすることができる。好ましい実施形態では、抑制レーザー光源は利得スイッチ駆動レーザー光源であり、例えばレーザーダイオードへの注入電流を調整して複数のパルスを生成するように構成されている利得スイッチ駆動ダイオードレーザーである。他の例では、抑制レーザー光源は、連続波レーザー光源と、連続波レーザー光源により放射されるレーザー光を変調して励起／抑制パルスを生成するように構成されているパルス整形部とを含みうる。パルス整形部は、例えば機械式シャッター、音響光学変調器、電気光学変調器、またはこれらの組み合わせを含みうる。励起／抑制パルスのパルス幅は、例えば１００ｆｓ～１０ｎｓの範囲とすることができて、好ましくは１ｐｓ～１ｎｓの範囲とすることができる。抑制波長は、例えば４００ｎｍ～２２００ｎｍとすることができる。抑制レーザー光源は、例えば励起／抑制パルスの空間強度分布を調整するために、ビーム整形素子をさらに含みうる。一例では、抑制レーザー光源は、ガウス分布の強度プロファイル、またはフラットトップの強度プロファイルを有する励起／抑制レーザーパルスを放射するよう構成されうる。抑制レーザー光源はさらに、励起／抑制パルスのパルスエネルギーまたはパルス幅を調整するよう構成されうる。一部の例では、抑制レーザー光源の波長は調節可能とすることができる。

好ましい実施形態では、パルス整形器は、励起部分の平均パルス出力が抑制部分の平均パルス出力の９０％～１１０％、好ましくは９９％～１０１％となるように、励起／抑制パルスを分割するよう構成される。パルス整形器は、特にパルス整形器の位置における励起／抑制パルスの空間強度プロファイルに適合させることができる。例えば、パルス整形器が前述したような２つの領域を有する位相マスクを含む場合、これらの領域の大きさを、励起部分および／または抑制部分の平均パルス出力を制御するように適合させることができる。一例では、半径Ｒ_１は、励起部分および抑制部分が同じ平均パルス出力を持つように、適合させることができる。同等の平均パルス出力は、例えば第２時刻における焦点での励起／抑制パルスの強度を低減するのに有利となりうる。

装置は、励起／抑制パルスを焦点へ集光するように構成されている対物レンズをさらに含みうる。対物レンズは、例えば、０．５より大きい開口数を有する高ＮＡの対物レンズとすることができる。好ましくは、対物レンズは、焦点における励起／抑制パルスの強度分布のウエストが第１時刻および／または第２時刻における抑制波長λ_ｄより小さくなるように、励起部分および抑制部分を集光するよう構成される。

また、装置は、励起波長λ_ｅｘｃを有する、励起／抑制パルスに空間的に重ね合わせられる補助励起パルスを放射するように構成されている励起レーザー光源も含みうる。励起レーザー光源は、例えばピコ秒レーザー光源やフェムト秒レーザー光源などのパルスレーザー光源とすることができる。励起レーザー光源は、例えばモード同期レーザー光源またはＱ―スイッチレーザー光源とすることができる。好ましい実施形態では、励起レーザー光源は利得スイッチ駆動レーザー光源であり、例えばレーザーダイオードへの注入電流を調整して複数のパルスを生成するように構成されている利得スイッチ駆動ダイオードレーザーである。他の例では、励起レーザー光源は、連続波レーザー光源と、連続波レーザー光源により放射されるレーザー光を変調して補助励起パルスを生成するように構成されているパルス整形部とを含みうる。パルス整形部は、例えば機械式シャッター、音響光学変調器、電気光学変調器、またはこれらの組み合わせを含みうる。補助励起パルスのパルス幅は、例えば５０ｆｓ～１０ｐｓの範囲とすることができて、好ましくは１００ｆｓ～１ｐｓの範囲とすることができる。励起波長は、例えば４００ｎｍ～２２００ｍとすることができる。励起レーザー光源はさらに、補助励起パルスのパルスエネルギーまたはパルス幅を調整するよう構成されうる。一部の例では、励起レーザー光源の波長は調節可能とすることができる。補助励起パルスを励起／抑制パルスに空間的に重ね合わせるために、装置は、例えば補助励起パルスおよび励起／抑制パルスが同じ光軸に沿って伝搬するように補助励起パルスと励起／抑制パルスを重ね合わせるための、ダイクロイックミラーやビームスプリッタのような光学素子を含みうる。重ね合わせ用の光学素子は、例えば焦点において補助励起パルスと励起／抑制パルスの空間的な重なりを最適化するために、調整可能とすることができる。別の例では、装置は、例えば補助励起パルスと励起／抑制パルスがいずれも異なる光軸に沿って伝搬している場合に励起／抑制パルスの焦点で補助励起パルスを励起／抑制パルスに重ね合わせるために、補助励起パルスを焦点へ合わせるように構成されている調整可能なミラーのような調整可能な光学素子を含みうる。

さらに、装置は、補助励起パルスが励起／抑制パルスの励起部分に時間的に重ね合わせられるように、補助励起パルスの放射時間および／または励起／抑制パルスの放射時間を調整するように構成されている制御部を含みうる。制御部は、例えばそれぞれのパルスの放射を引き起こすためにトリガー信号を抑制レーザー光源および／または放射レーザー光源へ送信するよう構成されうる。一例では、抑制レーザー光源および／または励起レーザー光源は調整可能な光学利得を有する利得スイッチ駆動レーザー光源とすることができて、制御部は、例えばレーザーダイオードへの注入電流を制御してそれぞれのパルスを生成することで利得を制御し、放射時間を調整するよう構成されうる。別の例では、抑制レーザー光源および／または励起レーザー光源は、調整可能な減衰器を有するＱ－スイッチレーザーとすることができて、制御部は調整可能な減衰器を制御するよう構成されうる。さらに別の例では、制御部は、音響光学変調器、電気光学変調器、機械式シャッター、またはこれらの組み合わせを制御して、補助励起パルスの放射時間および／または励起／抑制パルスの放射時間を調整するよう構成されうる。さらに別の例では、制御部は、補助励起パルスおよび／または励起／抑制パルスの光路長を変更することで放射時間を調整するよう構成されうる。制御部は、例えばフィードバックループを使って放射時間を調整するために、励起レーザー光源からのパルスと抑制レーザー光源からのパルスの間の遅延時間を決定するよう構成されうる。制御部はさらに、励起／抑制パルスおよび／または補助励起パルスのパルスエネルギー、パルス幅、反復率、および／または、波長を調整するよう構成されうる。

好ましい実施形態では、励起波長は抑制波長とは異なる。好ましくは、励起波長に対応する光子エネルギーと抑制波長に対応する光子エネルギーの間の差分は、画像マーカーのストークスシフトより大きい。これは、例えば前述したような２光子励起スキームの実現を容易にすることができて、励起／抑制パルス自体によって誘導される２光子遷移を防ぎながら、画像マーカーが補助励起パルスおよび励起／抑制パルスの励起部分による２光子遷移によって励起される。一例では、励起波長と抑制波長の間の差分は５０ｎｍより大きくすることができて、好ましくは１００ｎｍより大きくすることができる。

一例では、遅延時間Δｔは補助励起パルスのパルス幅の７５％～１２５％とすることができて、好ましくは９０％～１１０％とすることができる。さらに、制御部は、補助励起パルスと励起／抑制パルスの励起部分の間の遅延時間が補助励起パルスのパルス幅の２５％未満、好ましくは１０％未満となるように、補助励起パルスの放射時間、および／または、励起／抑制パルスの放射時間を調整するよう構成されうる。

以下では、本発明およびその例示の実施形態の詳細な説明が図を参照して与えられる。図は以下の図式を示す。
本発明の例示の一実施形態に係る誘導放出抑制顕微鏡法のためのパルス整形装置である。 本発明の一実施形態に係る補助励起パルスならびに励起／抑制パルスの励起部分および抑制部分を含むパルス列である。 図２Ａの励起部分および抑制部分の電界である。 本発明の例示の一実施形態に係る励起／抑制パルスの第１時刻における焦点での強度分布である。 図３Ａの励起／抑制パルスの第２時刻における焦点での強度分布である。 本発明の一実施形態に係る画像マーカーのエネルギースペクトルである。 本発明の一実施形態に係る位相マスクである。 本発明の例示の一実施形態に係る誘導放出抑制顕微鏡法のためのパルス整形方法である。

図１は、本発明の例示の一実施形態に係る誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡法のためのパルス整形装置１００を表す。装置１００は、入射する光励起／抑制パルス１０４を励起部分１０４ａと抑制部分１０４ｂへ分割するよう構成されているパルス整形器１０２を含む。パルス整形器１０２は、励起／抑制パルス１０４を時間的に分割するよう構成され、つまり励起部分１０４ａおよび抑制部分１０４ｂはいずれも光軸１０６に沿って伝搬するが、遅延時間Δｔだけ離れている。それに応じて、励起部分１０４ａおよび抑制部分１０４ｂの光軸１０６上の所与の点への到達時間は、図２ａを参照して以下でより詳細に述べられるようにΔｔだけ離れている。パルス整形器１０２はさらに励起部分１０４ａと抑制部分１０４ｂの間の有効位相差Δφを作り出すよう構成され、有効位相差Δφは、図２Ｂを参照して以下で詳述されるように、各電界間の位相差で０～２πである。パルス整形器１０２は、図５を参照して以下でより詳細に説明される。

装置１００はさらに、抑制波長λ_ｄを有する励起／抑制パルス１０４を生成するように構成されている抑制レーザー光源１０８を含みうる。抑制レーザー光源１０８は、例えばピコ秒レーザー光源やフェムト秒レーザー光源などのパルスレーザー光源とすることができる。抑制レーザー光源１０８は、例えばモード同期レーザー光源またはＱ―スイッチレーザー光源とすることができる。一例では、抑制レーザー光源１０８は利得スイッチ駆動レーザー光源であり、例えばレーザーダイオードへの注入電流を調整して複数のパルスを生成するように構成されている利得スイッチ駆動ダイオードレーザーである。他の例では、抑制レーザー光源１０８は、連続波レーザー光源と、連続波レーザー光源により放射されるレーザー光を変調して励起／抑制パルス１０４を生成するように構成されているパルス整形部とを含みうる。パルス整形部は、例えば機械式シャッター、音響光学変調器、電気光学変調器、またはこれらの組み合わせを含みうる。一部の例では、抑制レーザー光源１０８の波長は調節可能とすることができる。抑制レーザー光源１０８は、特に複数のレーザーパルス、例えば励起／抑制パルスの列を生成するよう構成されうる。抑制レーザー光源１０８は、例えばチタンサファイアレーザー、ダイオードレーザー、またはＮｄ：ＹＡＧレーザーとすることができて、抑制波長λ_ｄは例えば４００ｎｍ～２２００ｎｍとすることができる。

装置１００はさらに、励起波長λ_ｅｘｃを有する補助励起パルス１１２を生成するように構成されている励起レーザー光源１１０を含みうる。好ましくは、励起波長λ_ｅｘｃは抑制波長λ_ｄとは異なる。励起レーザー光源１１０は、例えばピコ秒レーザー光源やフェムト秒レーザー光源などのパルスレーザー光源とすることができる。励起レーザー光源１１０は、例えばモード同期レーザー光源またはＱ―スイッチレーザー光源とすることができる。一例では、励起レーザー光源１１０は利得スイッチ駆動レーザー光源であり、例えばレーザーダイオードへの注入電流を調整して複数のパルスを生成するように構成されている利得スイッチ駆動ダイオードレーザーである。他の例では、励起レーザー光源１１０は、連続波レーザー光源と、連続波レーザー光源により放射されるレーザー光を変調して補助励起パルス１１２を生成するように構成されているパルス整形部（図示せず）とを含みうる。パルス整形部は、例えば機械式シャッター、音響光学変調器、電気光学変調器、またはこれらの組み合わせを含みうる。一部の例では、励起レーザー光源１１０の波長は調節可能とすることができる。励起レーザー光源１１０は、特に複数のレーザーパルス、例えば補助励起パルスの列を生成するよう構成されうる。励起レーザー光源１１０は、例えばチタンサファイアレーザー、ダイオードレーザー、またはＮｄ：ＹＡＧレーザーとすることができて、励起波長λ_ｅｘｃは例えば４００ｎｍ～２２００ｎｍとすることができる。

装置１００は、励起／抑制パルス１０４と補助励起パルス１１２を空間的に重ね合わせるように構成されている光学素子１１４を含みうる。光学素子１１４はダイクロイックミラーとすることができて、例えば抑制波長λ_ｄの光を透過して励起波長λ_ｅｘｃの光を反射するダイクロイックミラーとすることができる。他の例では、光学素子１１４はビームスプリッタ、特に偏光ビームスプリッタとすることができて、励起／抑制パルス１０４と補助励起パルス１１２は異なる偏光を持つことがある。一例では、補助励起パルス１１２と励起／抑制パルス１０４は当初は直交する直線偏光を持ち、偏光ビームスプリッタにより重ね合わせられる。装置１００は、パルス１１２およびパルス１０４が重ね合わせ後に通過して直交する直線偏光から反対方向の円偏光へ変換される、四分の一波長板をさらに含みうる。これは、例えば画像マーカーの励起、特に補助励起パルス１１２の光子のみ、または励起部分１０４ａの光子のみによる単色の２光子励起を抑制するのに有利となりうる。

装置１００は、補助励起パルス１１２の放射時間、および／または、励起／抑制パルス１０４の放射時間を調整するように構成されている制御部１１６をさらに含みうる。制御部１１６は特に、補助励起パルス１１２が励起／抑制パルス１０４の励起部分１０４ａと空間的に重ね合わせられた後に時間的に重ね合わせられる、つまり補助励起パルス１１２と励起部分１０４ａの間の遅延時間が補助励起パルス１１２のパルス幅より小さくなるように、放射時間を調整するよう構成されうる。放射時間を調整するため、制御部１１６は、例えばトリガー信号を励起レーザー光源１１０および／または抑制レーザー光源１０８へ送信するよう構成されうる。一例では、励起レーザー光源１１０および／または抑制レーザー光源１０８は調整可能な光学利得を有する利得スイッチ駆動レーザー光源とすることができて、制御部１１６は、例えばレーザーダイオードへの注入電流を制御してそれぞれのパルスを生成することで利得を制御し、放射時間を調整するよう構成されうる。一例では、励起レーザー光源１１０および／または抑制レーザー光源１０８は、調整可能な減衰器を有するＱ－スイッチレーザーとすることができて、制御部１１６は調整可能な減衰器を制御するよう構成されうる。別の例では、励起レーザー光源１１０および／または抑制レーザー光源１０８のパルス整形部は音響光学変調器を含むことができて、制御部１１６は音響光学変調器を制御するよう構成されうる。さらに別の例では、制御部１１６は、補助励起パルス１１２および／または励起／抑制パルス１０４の光路長を変更することで、放射時間を調整するよう構成されうる。制御部１１６はさらに、励起／抑制パルス１０４および／または補助励起パルス１１２のパルスエネルギー、パルス幅、反復率、および／または波長を調整するよう構成されうる。

装置１００は、励起／抑制パルス１０４および補助励起パルス１１２を、例えばサンプル１２２を撮像するために、焦点１２０へ集光するように構成されている対物レンズ１１８をさらに含みうる。対物レンズ１１８は、例えば０．５より大きい開口数を有する高ＮＡの対物レンズとすることができる。対物レンズ１１８は、例えば励起／抑制パルス１０４および補助励起パルス１１２をサンプル１２２へ集光するために、焦点１２０を光軸１０６に沿って移動させるように構成されうる。また、装置１００は、例えばサンプル１２２全体にわたって焦点１２０を走査するために、光軸１０６と垂直な撮像面内で焦点１２０を走査するように構成されている走査部（図１には示されていない）も含みうる。走査部は、例えば圧電駆動式ミラー、音響光学偏向器、またはデジタルマイクロミラーデバイスのような調整可能な光学素子を含みうる。サンプル１２２は、例えばサンプル１２２の特定の構成要素をラベル付けするために、画像マーカーを含みうる。画像マーカーは特に蛍光色素分子とすることができて、例えば蛍光タンパク質や窒素－空孔中心とすることができる。装置１００は、例えばサンプル１２２内の画像マーカーの分布を判定するのに使用することができる。

装置１００は、サンプル１２２から放射された光、例えば蛍光発光を検出するように構成されている検出器１２４をさらに含みうる。検出器１２４は点状検出器、例えばフォトダイオードとすることができる、あるいはカメラ、例えばＣＣＤカメラやＣＭＯＳカメラとすることができる。サンプル１２２から放射された蛍光発光を分離するため、例えば蛍光発光を励起／抑制パルス１０４または補助励起パルス１１２の散乱光から分離するために、分割要素１２６を検出器１２４の前に置くことができる。分割要素１２６は、例えばダイクロイックミラーや、透過および／または反射に波長依存性がある光学フィルタとすることができる。装置１００は、偏光を選択的に検出するために、偏光光学素子、例えば波長板および／または偏光子をさらに含みうる。これは、補助励起パルス１１２および反対方向の円偏光を持つ励起部分１０４ａによる励起と併用することで、例えば単一パルスによる単色の２光子励起から生じる、バックグラウンド信号を抑制するのに有利となりうる。

図２Ａは、本発明の一実施形態に係る、例えば装置１００で生成しうる例示のパルス列を示す。パルス列は、補助励起パルス１１２、ならびに励起／抑制パルス１０４の励起部分１０４ａおよび抑制部分１０４ｂを含む。パルスのそれぞれに対して、それぞれの平均強度Ｉの発展が時間の関数として図式で示されており、平均強度Ｉは所与の時点における光軸１０６と垂直な平面にわたって平均化された強度である。平面は、例えば焦点１２０を含む平面とすることができる。

補助励起パルス１１２はパルス幅ｔ_ｅｘｃを有し、例えば第１時刻ｔ_１を中心として焦点１２０に到達することができる。パルス幅ｔ_ｅｘｃは、例えば０．１ｐｓ～１ｐｓとすることができる。励起／抑制パルス１０４は、パルス整形器１０２により励起部分１０４ａと抑制部分１０４ｂへ分割される。励起部分１０４ａおよび抑制部分１０４ｂは遅延時間Δｔだけ離れている。好ましくは、励起／抑制パルス１０４は、励起部分１０４ａが抑制部分１０４ｂより前に焦点に到達するように分割される。抑制部分１０４ｂは、例えば第２時刻ｔ_２を中心として焦点に到達することができる。好ましくは、補助励起パルス１１２は励起部分１０４ａに時間的に重ね合わせられる。一例では、補助励起パルス１１２と励起部分１０４ａの間の遅延時間は、補助励起パルス１１２のパルス幅ｔ_ｅｘｃの２５％より小さく、好ましくは１０％より小さい。好ましい実施形態では、遅延時間Δｔは補助励起パルス１１２のパルス幅ｔ_ｅｘｃの７５％～１２５％であり、好ましくは９０％～１１０％である。これにより、サンプル１２２内の画像マーカーの、補助励起パルスの終端より後でかつ抑制パルス１０４ｂが到達するより前に到達する励起部分１０４ａの一部によって励起された状態の抑制を弱めることができる。

励起／抑制パルス１０４はパルス幅ｔ_ｄを有する。好ましくは、パルス幅ｔ_ｄは、例えば励起／抑制パルス１０４による退出状態を確実に効果的に抑制するために、ｔ_ｅｘｃより大きい。パルス幅ｔ_ｄは、例えば１ｐｓ～１０００ｐｓとすることができる。好ましい実施形態では、例えば励起部分１０４ａの終端より後に到達する抑制部分１０４ｂの一部による退出状態の抑制を弱めるために、パルス幅ｔ_ｄは遅延時間Δｔよりはるかに大きい。一例では、遅延時間Δｔはパルス幅ｔ_ｄの１０％未満であり、好ましくは２％未満である。他の例では、遅延時間Δｔはパルス幅ｔ_ｄと同じオーダー、例えばｔ_ｄの１０％～５０％とすることができる。これにより、例えば以下で詳述されるバックグラウンド除去法を実現することが可能となりうる。励起部分１０４ａおよび抑制部分１０４ｂのパルス幅はｔ_ｄと等しくてもよい。他の例では、パルス整形器１０２は、励起部分１０４ａおよび／または抑制部分１０４ｂのパルス幅を変更するよう構成されうる。パルス形状１０２は、励起部分１０４ａおよび／または抑制部分１０４ｂのパルス幅が図５を参照して以下で詳述するようにｔ_ｄより短くなる、またはｔ_ｄより大きくなるように、例えば励起部分１０４ａおよび／または抑制部分１０４ｂを圧縮する、または伸長するよう構成されうる。

図２Ｂは、励起部分１０４ａおよび抑制部分１０４ｂの電界Ｅ、例えば時刻ｔ_２の辺りでの焦点１２０での電界を時間の関数として表す。図２Ｂに示される期間は、励起／抑制パルス１０４のパルス幅ｔ_ｄと比べて非常に小さいことがあり、抑制波長λ_ｄに応じて、例えば５ｆｓ～１５ｆｓでありうる。パルス整形器１０２は、励起部分１０４ａの電界と抑制部分１０４ｂの電界の間の有効位相差Δφを、それぞれの電界が位相のずれた状態で振動するように作り出すよう構成される。有効位相差Δφにより励起部分１０４ａと抑制部分１０４ｂがどのように干渉するかを決定することができて、したがって結果として生じる焦点１２０付近の励起／抑制パルス１０４の強度分布を決定することができる。図２Ｂに示される例では、有効位相差はΔφ＝πであり、励起部分１０４ａと抑制部分１０４ｂは相殺的干渉をする。

遅延時間Δｔおよび有効位相差Δφは、焦点１２０付近の励起／抑制パルス１０４の強度分布が時間的にどのように発展するかを決定する。遅延時間Δｔおよび有効位相差Δφは、励起／抑制パルス１０４が焦点１２０へ集光される場合に第１時刻ｔ_１に焦点１２０で極大値を有する強度分布と第２時刻ｔ_２に焦点１２０で極小値を有する強度分布を持つように選択される。第１時刻ｔ_１における焦点１２０の周囲の励起／抑制パルス１０４の強度分布３０１および第２時刻ｔ_２における対応する強度分布３０２の図式が図３Ａ、図３Ｂにそれぞれ示されている。いずれの図においても、主となる図はそれぞれｒ－ｚ平面における強度分布３０１、３０２を表し、ｚは光軸１０６に沿った座標であり、ｒは光軸１０６と垂直な半径方向の座標である。縞模様の領域は、強度が特定の閾値強度より大きい、例えば各強度分布の最大強度の１／ｅ^２より大きい範囲を示す。上の図は光軸に沿った強度分布３０１ｚ、３０２ｚをｚの関数として表し、右側の図は半径方向に沿った強度分布３０１ｒ、３０２ｒをｒの関数として表す。

図２Ａに示される例では、抑制部分１０４ｂは第１時刻ｔ_１にはまだ焦点１２０に到達しておらず、したがって励起／抑制パルス１０４の強度分布３０１は励起部分１０４ａの強度分布に対応し、励起部分１０４ａは対物レンズ１１８により焦点１２０へ集光される。好ましくは、励起部分１０４ａの強度分布３０１は焦点１２０において最大値を持つ。励起部分１０４ａの強度分布３０１は、例えば半径方向でガウス分布、またはエアリーパターンとすることができる。一部の例では、強度分布３０１は光軸に対して回転対称でありうる。励起部分１０４ａの強度分布３０１および補助励起パルス１１２の強度分布３０１は、例えば励起部分１０４ａと補助励起パルス１１２の空間的な重なりを最大化するために、互いに適合させることができる。好ましくは、励起部分１０４ａは画像マーカーを励起することができる領域を最小化するために強く集光される。一例では、焦点における強度分布３０１のウエストは、抑制波長λ_ｄより小さい。

第２時刻ｔ_２における強度分布３０２は、焦点１２０において極小値を示す。図３Ｂに示される例では、強度分布３０２はｚおよびｒの両方に沿って２つの最大値により囲まれた最小値を有する二重ピーク構造を有する。一部の例では、強度分布３０２は光軸に対して回転対称でありうる。それに応じて、強度分布３０２は、光軸と垂直な平面で、高い強度の領域により囲まれる中心部で最小値を有するドーナツ状の形状を示すことがある。一例では、焦点１２０における強度は強度分布３０２の最大値の１％未満とすることができて、好ましくは０．１％未満とすることができる。

図２Ａに示される例では、励起部分１０４ａおよび抑制部分１０４ｂがいずれも第２時刻ｔ_２に焦点１２０に到達し、この２つの部分が干渉して強度分布３０２が形成される。したがって、強度分布３０２は有効位相差Δφ、ならびに、励起部分１０４ａの強度分布および抑制部分１０４ｂの強度分布に依存しうる。有効位相差Δφは、励起部分１０４ａと抑制部分１０４ｂが焦点１２０で相殺的干渉をするように選択することができる。一例では、有効位相差Δφは０，９π～１．１π、好ましくは０．９９π～１．０１πである。励起部分１０４ａの平均パルス出力は、焦点１２０における励起部分１０４ａの強度が焦点１２０における抑制部分１０４ｂの強度の９０％～１１０％、好ましくは９９％～１０１％となるように、選択することができる。

一部の例では、励起部分１０４ａは、第３時刻には抑制部分１０４ｂだけが存在するように、抑制部分１０４ｂより前に焦点１２０を通過する。したがって、第３時刻における強度分布は抑制部分１０４ｂの強度分布に対応しうる。第３時刻における焦点１２０での強度は、第２時刻における強度より大きいことがある。一例では、抑制部分１０４ｂの強度分布は焦点１２０において極大値を示すことがある。これにより、焦点１２０の付近の励起された画像マーカーを抑制することができる。これは、追加のレーザーパルスを必要とすることなしに、例えばバックグラウンド除去法へ使用することができる。バックグラウンド信号は、第３時刻の周辺の期間、または第３時刻の後の期間にサンプルから放射された光を測定し、これを第２時刻の周辺の期間に測定されたサンプルからの蛍光信号から差し引きしうることで、決定することができる。

他の例では、励起部分１０４ａは第２時刻ｔ_２においてすでに焦点１２０を通過していることがあり、したがって、強度分布３０２は抑制部分１０４ｂの強度分布に対応しうる。抑制部分１０４ｂの位相パターンおよび／または強度分布は、抑制部分１０４ｂの強度分布が焦点１２０で最小値を示すように選択することができる。一例では、パルス整形器１０２は、以下で詳述するように、渦状位相パターンを抑制部分１０４ｂへ刷り込むよう構成される。

図４は、サンプル１２２、例えばサンプル１２２の特定の構成要素をラベル付けするのに使用しうる画像マーカーのエネルギー準位図またはエネルギースペクトル４００の一例を表す。エネルギースペクトル４００は、電子基底状態マニホールド４０２および電子励起状態マニホールド４０４を含み、これらのそれぞれは複数のサブ振動状態を含みうる。電子基底状態マニホールド４０２は、例えば振動基底状態４０２ａと複数の振動励起状態４０２ｂを含むことができる。同様に、電子励起状態マニホールド４０２は、振動基底状態４０４ａと複数の振動励起状態４０４ｂを含むことができる。

好ましい実施形態では、光抑制周波数ν_ｄに対応する抑制波長λ_ｄおよび光励起周波数ν_ｅｘｃに対応する励起波長λ_ｅｘｃは、励起周波数ν_ｅｘｃと抑制周波数ν_ｄの和が電子基底状態マニホールド４０２と電子励起状態マニホールド４０４の間の遷移、例えば状態４０２ａと振動励起状態４０４ｂのうちの一つとの間の遷移と共鳴するように、選択される。この場合、電子基底状態マニホールド４０２と電子励起状態マニホールド４０４の間の２光子遷移は、補助励起パルス１１２からの光子と励起／抑制パルス１０４、例えば励起部分１０４ａからの光子を同時に吸収することで励起されうる。したがって、画像マーカーの励起確率は、画像マーカーの位置における補助励起パルス１１２の強度および励起／抑制パルス１０４の励起部分１０４ａの強度に依存しうる。それゆえ、補助励起パルス１１２と励起部分１０４ａを正確に重ね合わせることは、励起確率を向上させるのに有利となりうる。さらに、励起確率の強度への非線形な依存、つまり補助励起パルス１１２および励起部分１０４ａの両方の強度への依存により、画像マーカーの励起を強度分布３０１の広がりよりも小さい焦点１２０の周りの領域へ制限することができて、これは撮像の分解能を改善するのに有利となりうる。前述したように、励起波長λ_ｅｘｃは、画像マーカーを２色の２光子遷移によって励起できるように、好ましくは抑制波長λ_ｄとは異なる。これは、例えば励起波長λ_ｅｘｃと抑制波長λ_ｄの間の差分を電子励起状態マニホールド４０４のスペクトル幅より大きくなるように選ぶことで、補助励起パルスおよび／または励起／抑制パルスによる単色の２光子励起を防ぐのに有利となりうる。加えて、２色の２光子励起により、励起波長λ_ｅｘｃおよび／または抑制波長λ_ｄをエネルギースペクトル４００へ適合させることができるので、多種多様な画像マーカーが使用しやすくなる。

抑制波長λ_ｄは、電子基底状態マニホールド４０２と電子励起状態マニホールド４０４の間の単一光子遷移、好ましくは電子励起状態マニホールド４０４の振動基底状態４０４ａと振動励起状態４０２ｂの間の遷移と共鳴しうる。このようにして、状態４０４ａへ迅速に緩和することが可能な、励起された画像マーカーは、例えばサンプル１２２内の環境との相互作用を通じて、励起／抑制パルス１０４により誘導される誘導放出により、基底状態マニホールド４０２へ移動させることができる。この後の基底状態４０２ａへの緩和によって、励起／抑制パルス１０４による再励起を防ぐことができる。画像マーカーの抑制確率は、画像マーカーの位置における励起／抑制パルス１０４の時間平均強度に非線形に依存しうる。励起された画像マーカーが電子励起状態マニホールド４０４に留まる確率は、例えば時間平均強度と共に指数関数的に減少することがある。それに応じて、焦点１２０に近い画像マーカーだけが励起状態マニホールド４０４に留まることができて、その後、発光周波数ν_ｓに対応する発光波長λ_ｓでの自然放出により、基底状態マニホールド４０２へ緩和する。自然放出された光子は、例えば検出器１２４により検出することができる。

励起／抑制パルス１０４を分割して有効位相差Δφを作り出すため、パルス整形器１０２は、例えば抑制波長で空間的に変動する光路長を有する位相マスク、例えば図１に示されるように励起／抑制パルス１０４が通過する透過型位相マスクや励起／抑制パルス１０４が反射される反射型位相マスクを含みうる。図５は透過型位相マスク５００の一例を表す。位相マスク５００は例えば２つの領域５０２、５０４を含むことがあり、領域５０２を通過する励起／抑制パルス１０４の一部が励起部分１０４ａを形成し、領域５０４を通過する励起／抑制パルス１０４の一部が抑制部分１０４ｂを形成する。

位相マスク５００は、例えば領域５０２内に抑制波長で第１光路長、領域５０４内に抑制波長で第２光路長を持ちうる。光路長により、抑制波長の光が位相マスク５００を通過する際に得る位相シフトが決定される。したがって、第１光路長と第２光路長の間の差分Δｌによって、励起部分１０４ａと抑制部分１０４ｂの間の遅延時間Δｔおよび有効位相差Δφが決定されうる。光路長間の差分は、ｍが整数で０≦δｍ＜１として、Δｌ＝（ｍ＋δｍ）λ_ｄと表すことができる。そして遅延時間ΔｔはΔｔ＝（ｍ＋δｍ）／ν_ｄで与えられ、有効位相差ΔφはΔφ＝２πδｍで与えられる。一例では、δｍは０．４５～０．５５とすることができて、好ましくは０．４９５～０．５０５とすることができる。整数部ｍは、例えば５より大きくすることができて、一部の例では、５０より大きく、好ましくは２００より大きくすることができる。

光路長間の差分は、例えば位相マスク５００の領域５０２および領域５０４で異なる厚さ、例えば領域５０２では第１厚さ、領域５０４では第２厚さを使うことで実現することができる。あるいは、またはさらに、位相マスク５００は、領域５０２と領域５０４で異なる材料、特に異なる屈折率を有する材料を含みうる。一例では、領域５０２は領域５０４内の穴、または切り抜き部とすることができる。位相マスク５００は、例えばＢＫ７ガラスおよび／または溶融石英を含みうる。領域５０２、５０４のそれぞれにおける光路長は一定とすることができる。他の例では、光路長は、例えば励起／抑制パルス１０４の各部分に位相パターンを刷り込むために、一方または両方の領域内で空間的に変動することがある。一例では、方位角方向周辺に２πの位相シフトを有する渦状位相パターンを、例えば励起部分１０４ａのパルス幅が遅延時間Δｔより短い場合に第２時刻ｔ_２において焦点１２０周辺のドーナツ状強度分布を作り出すように、抑制部分１０４ｂに刷り込むことができる。一部の例では、位相マスク５００は適応式位相マスク、例えば液晶空間光変調器とすることができて、領域５０２、５０４の大きさ、形状、および／または、位置を調整するよう構成されうる。また、適応式位相マスクは、局所的な光路長を位相マスク５００の位置における励起／抑制パルス１０４の位相パターンおよび／または強度分布へ適合させるようにも構成されうる。

位相マスク５００は、例えば励起部分１０４ａおよび／または抑制部分１０４ｂを圧縮する、または伸長するために、分散状態、つまり波長依存の光路長を示すことがある。領域５０２は、例えば波長と共に減少する光路長に対応する負分散を示すことがある。これにより、励起部分１０４ａは励起部分１０４のパルス幅が励起／抑制パルス１０４のパルス幅ｔ_ｄより短くなるように圧縮されうる。励起部分１０４ａは、例えば補助励起パルス１１２と同様のパルス幅を持つことができる。さらに、またはあるいは、領域５０４は、例えば波長と共に増加する光路長に対応する正分散を示すことがある。これにより、抑制部分１０４ｂは抑制部分１０４ｂのパルス幅が励起／抑制パルス１０４のパルス幅ｔ_ｄより長くなるように伸長、またはチャープされうる。一例では、励起部分１０４ａのパルス幅および／または抑制部分１０４ｂのパルス幅は、励起部分１０４ａのパルス幅が遅延時間Δｔより小さい、例えば励起部分１０４ａが第２時刻ｔ_２にすでに焦点１２０を通過しているように、調整される。それに応じて、領域５０４は、第２時刻ｔ_２において焦点１２０周辺の半径方向平面内でドーナツ状強度分布を作り出すように、渦状位相パターンを抑制部分１０４ａに刷り込むよう構成されうる。

領域５０２、５０４の大きさ、形状、および位置は、第１時刻ｔ_１および第２時刻ｔ_２においてそれぞれ所望の強度分布３０１、３０２を焦点１２０周辺で作り出すよう調整することができる。特に、領域５０２、５０４は位相マスク５００の位置における励起／抑制パルス１０４の強度分布に適合させることができる。領域５０２、５０４は、例えば焦点１２０における強度を低減するため、例えば励起部分１０４ａの平均パルス出力が抑制部分１０４ｂの平均パルス出力の９０％～１１０％、好ましくは９９％～１０１％となるように選択されうる。図５に示される例では、領域５０２は半径Ｒ_１を有する円形状で、内側半径Ｒ_１および外側半径Ｒ_２を有する円環形状である領域５０４に囲まれている。半径Ｒ_１、Ｒ_２は、例えば励起部分１０４ａおよび／または抑制部分１０４ｂの平均パルス出力を制御するため、位相マスク５００の位置における励起／抑制パルス１０４の強度分布に適合させることができる。図５に示される位相マスク５００に対して、πの有効位相差Δφは励起部分１０４ａと抑制部分１０４ｂが焦点１２０で相殺的干渉をするように用いることができる。他の例では、領域５０２、５０４の形状は異なっていてもよく、例えば楕円形や六角形であってもよい。

さらに、またはあるいは、パルス整形器１０２は他の光学素子を含みうる。一例では、パルス整形器１０２は励起／抑制パルス１０４を逆反射するように構成されているミラーを含みうる。位相マスク５００と同様に、ミラーは異なる厚さを有する２つの領域を含み、この２つの領域は、例えばこれらの領域で反射される励起／抑制パルス１０４の複数の部分の間の遅延時間Δｔおよび／または有効位相差Δφを作り出すために、光軸１０６に沿って異なる位置に置かれる。他の例では、パルス整形器１０２は電気光学変調器、例えば空間的に変動する電界を用いる電気光学変調器、および／または、異なる電気光学特性を有する２つの領域を備える活性媒体を含みうる。また、パルス整形器１０２は、例えば励起部分１０４ａおよび／または抑制部分１０４ｂを時間的に伸長する、または圧縮するために、追加のパルス整形要素も含みうる。

図６は、本発明の例示の一実施形態に係る誘導放出抑制顕微鏡法のためのパルス整形方法６００のフローチャートを表す。方法６００は、例えば装置１００を用いて実行することができて、図１を参照して以下で説明される。しかし、これは制限することを目的としておらず、方法６００は任意の他の適切な装置を用いて実行することができる。図６に示されるフローチャートのステップの順序は一具体例を構成するに過ぎず、方法６００は特定の実行順序に限定されない。技術的に可能である限り、ステップの順番を変えることができて、方法およびその任意の実施形態は任意の順序でこれらのステップを行うことができる。特に、複数のステップを少なくとも部分的に同時に行ってもよい。

方法６００は、６０２において、例えば励起レーザー光源１１０を使って、補助励起パルス１１２を生成することを含みうる。一部の例では、励起レーザー光源１１０は、例えば励起／抑制パルス１０４と補助励起パルス１１２との間の遅延時間を制御するために、前述したように制御部１１６に誘発されて補助励起パルス１１２を生成することができる。補助励起パルス１１２を生成することには、補助励起パルス１１２のパルスエネルギー、パルス形状、パルス幅、位相パターン、および／または、空間強度分布を調整することをさらに含みうる。励起波長λ_ｅｘｃは、例えば図４を参照して前述したように、サンプル１２２内の画像マーカーのエネルギースペクトルに適合させることができる。

６０４において、励起／抑制パルス１０４は例えば抑制レーザー光源１０８を使って生成される。一部の例では、抑制レーザー光源１０８は、例えば励起／抑制パルス１０４と補助励起パルス１１２との間の遅延時間を制御するために、前述したように制御部１１６に誘発されて励起／抑制パルス１０４を生成することができる。励起／抑制パルス１０４を生成することには、励起／抑制パルス１０４のパルスエネルギー、パルス形状、パルス幅、位相パターン、および／または、空間強度分布を調整することをさらに含みうる。励起／抑制パルス１０４は、例えば光軸１０６と垂直なガウス分布の強度プロファイルまたはフラットトップの強度プロファイルを有することができる。抑制波長λ_ｄは、例えば図４を参照して前述したように、サンプル１２２内の画像マーカーのエネルギースペクトルに適合させることができる。特に、抑制波長λ_ｄは基底状態マニホールド４０２と励起状態マニホールド４０４の間の単一光子遷移と共鳴することができて、励起波長λ_ｅｘｃと抑制波長λ_ｄの組み合わせは、励起波長を有する光子および抑制波長を有する光子を伴う２光子励起が基底状態マニホールド４０２と励起状態マニホールド４０４の間の遷移と共鳴するように選択することができる。好ましくは、抑制波長λ_ｄは励起波長λ_ｅｘｃとは異なる。

６０６において、励起／抑制パルス１０４は励起部分１０４ａと抑制部分１０４ｂへ時間的に分割される。前述したように、励起部分１０４ａおよび抑制部分１０４ｂは光軸１０６に沿って伝搬し、遅延時間Δｔだけ離れている。励起／抑制パルス１０４は、例えば励起／抑制パルス１０４にパルス整形器１０２を通過させることで分割することができる。一例では、励起部分１０４ａは円形の強度分布を持ち、抑制部分１０４ｂは、例えば図５に表される位相マスク５００を使うことで、環状の強度分布を持つ。

方法６００は、６０８において、励起部分１０４ａと抑制部分１０４ｂの間の有効位相差Δφを作り出すことをさらに含む。有効位相差Δφは、例えばパルス整形器１０２を用いて励起／抑制パルス１０４を送ることで作り出すことができる。

方法６００は、６１０において、例えば光学素子１１４において、補助励起パルス１１２を励起／抑制パルス１０４の励起部分１０４ａに時間的および空間的に重ね合わせることをさらに含みうる。これには、例えば焦点１２０の周辺で補助励起パルス１１２と励起部分１０４ａの空間的な重なりを最大化するために、励起／抑制パルス１０４および／または補助励起パルス１１２の伝搬方向および／または空間強度分布を調整することを含みうる。これには、例えば焦点１２０の周辺で補助励起パルス１１２と励起部分１０４ａの間の遅延時間を最小化するために、励起／抑制パルス１０４および／または補助励起パルス１１２の放射時間および／または光路長を調整することをさらに含みうる。

６１２において、励起／抑制パルス１０４は、例えば対物レンズ１１８により、焦点１２０へ集光される。これには、補助励起パルス１１２を例えば焦点１２０へ集光することも含みうる。

前述したように、遅延時間Δｔおよび有効位相差Δφは、励起／抑制パルス１０４の強度分布が第１時刻ｔ_１に焦点１２０で極大値を持ち、第２時刻ｔ_２に焦点１２０で極小値を持つように選択される。さらに、励起部分１０４ａおよび／または抑制部分１０４ｂの位相パターン、空間的強度分布、および／または時間的強度分布は、焦点１２０の周辺で励起／抑制パルス１０４の所望の強度分布３０１、３０２が得られるように適合させることができる。

好ましい実施形態では、励起／抑制パルス１０４の強度分布は第１時刻に焦点１２０において最大値を持つ。また、補助励起パルス１１２の強度プロファイルは焦点１２０において極大値または最大値を示すことがある。好ましくは、第２時刻ｔ_２における励起／抑制パルス１０４の焦点１２０での強度は、第２時刻ｔ_２における励起／抑制パルス１０４の強度分布３０２の最大値の１％未満であり、さらに好ましくは０．１％未満である。一例では、焦点１２０周辺の強度分布３０２は長期間にわたって、例えばパルス幅ｔ_ｄの５０％超、好ましくは８０％超にわたって維持することができる。遅延時間Δｔは、例えば補助励起パルス１１２と抑制部分１０４ｂの時間的な重なりを最小化するために、例えば補助励起パルスのパルス幅ｔ_ｅｘｃの７５％～１２５％、好ましくは９０％～１１０％とすることができる。

方法６００は、サンプル１２２からの蛍光信号を、例えば焦点１２０を検出器１２４上で撮像することで、検出することをさらに含みうる。これは、例えば焦点１２０の付近にある画像マーカーの濃度を判定することを可能としうる。方法６００は、例えば異なる焦点１２０を使って、何回も繰り返すことができる。一例では、焦点１２０は、例えばサンプル１２２内の着目する領域内の画像マーカーの濃度を判定するために、着目する領域全体にわたって走査することができる。このため、連続する励起／抑制パルス１０４および補助励起パルス１１２の列を、焦点１２０を着目する領域全体にわたって走査を行いながら、それぞれレーザー光源１０８および１１０により放射することができる。

一部の実施形態では、パルス整形装置１００はパルスエッジ整形器も含みうる。パルスエッジ整形器は、例えばパルス整形器１０２に統合することができる、あるいは独立したユニットとすることができる。パルスエッジ整形器は、励起／抑制パルス１０４、励起部分１０４ａ、および／または、抑制部分１０４ｂの立ち上がり時間を調整するよう構成される。立ち上がり時間は、例えばパルスの強度がピーク強度に対して低い割合、例えば１０％からピーク強度に対して高い割合、例えば９０％まで立ち上がる時間とすることができる。パルスエッジ整形器は、特にそれぞれの立ち上がり時間を減少させるように構成することができる。好ましくは、励起部分１０４ａの調整された立ち上がり時間は遅延時間Δｔの２５％未満であり、一部の例では１０％未満である。これは、励起部分１０４の強度が、抑制部分１０４ｂが到達する前に焦点１２０付近の画像マーカーを励起するのに充分に高いことを確実にするのに有利となりうる。

パルスエッジ整形器は、例えば強度に依存する吸収率、特に光強度の増加とともに減少する吸収率を示す可飽和吸収体を含みうる。パルスエッジ整形器は、例えば半導体可飽和吸収ミラー（ＳＥＳＡＭ）または可飽和色素溶液を含みうる。さらに、またはあるいは、パルスエッジ整形器は、１つまたは複数の分散素子、例えばパルス整形器１０２に対して前述したような、正分散または負分散を有し励起／抑制パルス１０４、励起部分１０４ａ、および／または、抑制部分１０４ｂを圧縮または伸長する分散素子を含みうる。分散素子は、例えば光ファイバまたは光回折格子とすることができる。

本明細書で開示される本発明の実施形態は、例証を目的とした具体的な例を構成するに過ぎない。本発明は、様々な形で、根本的な基本特性を変更することなく、多くの変更とともに実施することができる。それゆえ、本発明は以下で述べる請求項によってのみ規定される。

１００ パルス整形装置
１０２ パルス整形器
１０４ 励起／抑制パルス
１０４ａ 励起／抑制パルスの励起部分
１０４ｂ 励起／抑制パルスの抑制部分
１０６ 光軸
１０８ 抑制レーザー光源
１１０ 励起レーザー光源
１１２ 補助励起パルス
１１４ 重ね合わせ用光学素子
１１６ 制御部
１１８ 対物レンズ
１２０ 焦点
１２２ サンプル
１２４ 検出器
１２６ 分割要素
ｔ_１ 第１時刻
ｔ_２ 第２時刻
ｔ_ｅｘｃ 補助励起パルスのパルス幅
ｔ_ｄ 励起／抑制パルスのパルス幅
Δｔ 励起部分と抑制部分の間の遅延時間
Δφ 励起部分と抑制部分の間の有効位相差
３０１ 時刻ｔ_１における励起／抑制パルスの強度分布
３０１ｒ 半径方向に切断された強度分布３０１
３０１ｚ 軸方向に切断された強度分布３０１
３０２ 時刻ｔ_２における励起／抑制パルスの強度分布
３０２ｒ 半径方向に切断された強度分布３０２
３０２ｚ 軸方向に切断された強度分布３０２
４００ 画像マーカーのエネルギースペクトル
４０２ 電子基底状態マニホールド
４０２ａ 電子基底状態マニホールドの振動基底状態
４０２ｂ 電子基底状態マニホールドの振動励起状態
４０４ 電子励起状態マニホールド
４０４ａ 電子励起状態マニホールドの振動基底状態
４０４ｂ 電子励起状態マニホールドの振動励起状態
ν_ｄ 抑制波長に対応する光周波数
ν_ｅｘｃ 励起波長に対応する光周波数
ν_ｓ 発光波長に対応する光周波数
５００ 位相マスク
５０２ 位相マスクの第１領域
５０４ 位相マスクの第２領域
Ｒ_１ 内側半径
Ｒ_２ 外側半径
６００ パルス整形方法
６０２ 補助励起パルスを生成するステップ
６０４ 励起／抑制パルスを生成するステップ
６０６ 励起／抑制パルスを励起部分と抑制部分へ分割するステップ
６０８ 励起部分と抑制部分の間の位相差を作り出すステップ
６１０ 補助励起パルスを励起／抑制パルスに重ね合わせるステップ
６１２ 励起／抑制パルスおよび補助励起パルスを焦点へ集光するステップ

Claims (25)

1. 誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡法のためのパルス整形方法であって、
   抑制波長λ_ｄを有する光励起／抑制パルス（１０４）を生成することと、
   前記励起／抑制パルス（１０４）を励起部分（１０４ａ）と前記抑制部分（１０４ｂ）へ時間的に分割することであって、前記励起部分（１０４ａ）および前記抑制部分（１０４ｂ）が光軸（１０６）に沿って伝搬し、遅延時間Δｔだけ離れるように、時間的に分割することと、
   前記励起部分（１０４ａ）と前記抑制部分（１０４ｂ）の間の有効位相差Δφを作り出すことと、
   前記励起／抑制パルス（１０４）の前記励起部分（１０４ａ）および前記抑制部分（１０４ｂ）を焦点（１２０）へ集光することと、
   を含み、
   前記遅延時間Δｔおよび前記有効位相差Δφは、前記励起／抑制パルス（１０４）の強度分布が第１時刻に前記焦点（１２０）で極大値を持ち、第２時刻に前記焦点（１２０）で極小値を持つように選択される、
   方法。
2. 前記第２時刻における前記焦点（１２０）での前記励起／抑制パルス（１０４）の強度は、前記第２時刻における前記励起／抑制パルス（１０４）の前記強度分布の最大値の１％未満であり、好ましくは０．１％未満である、請求項１に記載の方法。
3. 前記励起／抑制パルス（１０４）は、前記励起／抑制パルス（１０４）が通過する、または前記励起／抑制パルス（１０４）が反射される、空間的に変動する光路長を持つ位相マスク（５００）を使って分割される、請求項１または２に記載の方法。
4. 集光される前に、前記励起部分（１０４ａ）は円形または楕円形の強度分布を持ち、前記抑制部分（１０４ｂ）は環状の強度分布を持つ、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記有効位相差Δφは０．９π～１．１πであり、好ましくは０．９９～１．０１である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記遅延時間は前記抑制波長に対応する期間の５倍より大きく、好ましくは前記抑制波長に対応する期間の２００倍より大きい、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記励起／抑制パルス（１０４）を時間的に分割することは、前記励起部分（１０４ａ）および／または前記抑制部分（１０４ｂ）のパルス幅を圧縮および／または伸長することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記励起部分（１０４ａ）と前記抑制部分（１０４ｂ）の間の前記有効位相差Δφを作り出すことは、位相パターンを前記励起部分（１０４ａ）および／または前記抑制部分（１０４ｂ）へ刷り込むことを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記抑制波長は画像マーカーの抑制遷移と共鳴する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 励起波長λ_ｅｘｃを有する光補助励起パルス（１１２）を生成することと、
    前記光補助励起パルス（１１２）を前記励起／抑制パルス（１０４）の前記励起部分（１０４ａ）に時間的および空間的に重ね合わせることと、
    をさらに含み、
    前記励起波長および前記抑制波長は、前記励起波長を有する光子および前記抑制波長を有する光子を伴う２光子励起が前記画像マーカーの励起遷移と共鳴するように選択される、
    請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記励起波長は前記抑制波長とは異なる、請求項１０に記載の方法。
12. 前記遅延時間Δｔは前記補助励起パルス（１１２）のパルス幅の７５％～１２５％であり、好ましくは９０％～１１０％である、請求項１０または１１に記載の方法。
13. 抑制波長λ_ｄを有する光励起／抑制パルス（１０４）を励起部分（１０４ａ）と抑制部分（１０４ｂ）へ分割するよう構成されているパルス整形器（１０２）を含む、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡法のためのパルス整形装置（１００）であって、
    前記パルス整形器（１０２）は、前記励起部分（１０４ａ）および前記抑制部分（１０４ｂ）が光軸（１０６）に沿って伝搬し、遅延時間Δｔだけ離れるように、前記励起／抑制パルス（１０４）を時間的に分割するよう構成され、
    前記パルス整形器（１０２）は、前記励起部分（１０４ａ）と前記抑制部分（１０４ｂ）の間の有効位相差Δφを作り出すよう構成され、
    前記遅延時間Δｔおよび前記有効位相差Δφは、前記励起／抑制パルス（１０４）が焦点（１２０）へ集光される場合に第１時刻に前記焦点（１２０）で極大値を有する強度分布と第２時刻に前記焦点（１２０）で極小値を有する強度分布を持つようになっている、
    装置（１００）。
14. 前記パルス整形器（１０２）は抑制波長で空間的に変動する光路長を有する位相マスク（５００）を含む、請求項１３に記載の装置（１００）。
15. 前記位相マスク（５００）は、前記抑制波長で第１光路長を有する円形または楕円形の内側部分（５０２）と、前記抑制波長で第２光路長を有する環状の外側部分（５０４）を含む、請求項１４に記載の装置（１００）。
16. 前記第１光路長と前記第２光路長の間の差分は、ｍを整数とし、ｍ＞５、好ましくはｍ＞２００として、（ｍ＋０．４５）λ_ｄ～（ｍ＋０．５５）λ_ｄであり、好ましくは（ｍ＋０．４９５）λ_ｄ～（ｍ＋０．５０５）λ_ｄである、請求項１５に記載の装置（１００）。
17. 前記パルス整形器（１０２）は、前記励起部分（１０４ａ）および／または前記抑制部分（１０４ｂ）のパルス幅を圧縮および／または伸長するよう構成される、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の装置（１００）。
18. 前記パルス整形器（１０２）は、位相パターンを前記励起部分（１０４ａ）および／または前記抑制部分（１０４ｂ）に刷り込むよう構成される、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の装置（１００）。
19. 前記励起／抑制パルス（１０４）を放射するように構成されている抑制レーザー光源（１０８）をさらに含む、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の装置（１００）。
20. 前記励起部分（１０４ａ）の平均パルス出力は前記抑制部分（１０４ｂ）の平均パルス出力の９０％～１１０％、好ましくは９９％～１０１％である、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の装置（１００）。
21. 前記励起／抑制パルス（１０４）を前記焦点（１２０）へ集光するように構成されている対物レンズ（１１８）をさらに含む、請求項１３～２０のいずれか一項に記載の装置（１００）。
22. 励起波長λ_ｅｘｃを有する補助励起パルス（１１２）を放射するように構成されている励起レーザー光源（１１０）をさらに含み、前記補助励起パルス（１１２）は前記励起／抑制パルス（１０４）に空間的に重ね合わせられる、請求項１３～２１のいずれか一項に記載の装置（１００）。
23. 前記補助励起パルス（１１２）が前記励起／抑制パルス（１０４）の前記励起部分（１０４ａ）に時間的に重ね合わせられるように、前記補助励起パルス（１１２）の放射時間および／または前記励起／抑制パルス（１０４）の放射時間を調整するように構成されている制御部（１１６）をさらに含む、請求項２２に記載の装置（１００）。
24. 前記励起波長は前記抑制波長とは異なる、請求項２２または２３に記載の装置（１００）。
25. 前記遅延時間Δｔは前記補助励起パルス（１１２）の前記パルス幅の７５％～１２５％であり、好ましくは９０％～１１０％である、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の装置（１００）。

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