JP2022516639A - ネオエピトープを標的とするワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも１つのネオエピトープ、および溶媒と混合したカチオン性リポソームアジュバントを利用したワクチン接種方法を提供するものである。また、当該方法で使用するための単位用量および組成物も提供する

Description

発明の分野
本発明は、免疫療法の分野に関する。特に、本発明は腫瘍性疾患の処置のための治療免疫技術に関する。

発明の背景
患者における悪性腫瘍の処置は、伝統的に外科手術、放射線治療、および／または、非悪性細胞の死滅を上回って悪性細胞を優先的に死滅させることを狙いとした投与レジメンにおける、細胞傷害性薬剤を用いた化学療法によって、悪性組織の根絶／除去することに焦点を当ててきた

細胞傷害性薬剤の使用に加えて、より最近のアプローチでは、従来の化学療法によって現れる全身の副作用を軽減するために、がん細胞において特異的な生物学的なマーカーを標的とすることに焦点を当てている。がん関連抗原を標的としたモノクローナル抗体療法は、多くの悪性腫瘍において、平均余命の延長に非常に効果的であることを示した。成功した薬ではあるが、がん関連抗原を標的とするモノクローナル抗体は、その性質上、知られた、複数の患者で見られる発現産物を標的とするようにのみ開発され得る、つまり、下記を参照するように、多くのがん特異的抗原は、一人の患者由来の腫瘍においてのみでしか見られないため、がん特異的抗原の大多数はこの種の治療法で取り扱うことができない。

早くも１９５０年代後半に、ＢｕｒｎｅｔおよびＴｈｏｍａｓによって提唱された免疫監視理論では、リンパ球が、変化した抗原決定基を示す自家細胞－がん細胞を含む－を認識および排除する事を示唆し、および今日では免疫系が発がんを高度に阻害することが一般的に受け入れられている。しかし、免疫監視は１００％有効ではなく、がん細胞を排除する免疫系の能力を改善する／刺激するような、がん療法を考案する事は継続的な課題である。

１つのアプローチは、がん関連抗原に対する免疫を導入する事であり、このアプローチは有効な可能性が有るが、限られた数の抗原しか対処できないという、抗体療法と同様の欠点を負っている。

全てとは言わないが、多くの腫瘍は変異を発現している。これらの変異は、新規の標的抗原（ネオ抗原）を作りだす可能性があり、臨床的に適切な時間内にネオ抗原およびその抗原決定基を同定する事が可能であれば、ネオ抗原は、特異的Ｔ細胞免疫療法において有効である可能性がある。現代技術では、細胞のゲノムをすべてシーケンスする事、および、変化した、または新たな発現産物の存在を解析する事が可能であるため、ネオ抗原に基づく個別化ワクチンの設計が可能である。しかし、満足のいく臨床的なエンドポイントを提供しようとする試みは、今日まで失敗に終わっている。

よって、ワクチン接種した個体において、ネオ抗原を効果的に標的とし得る、および臨床的に顕著な免疫応答を誘導し得る抗ガンワクチンを提供する必要がある。

発明の目的
ネオエピトープを含むネオ抗原に対する、治療に有効な免疫応答を誘導するための方法を提供する事は、本発明の実施形態の目的である。さらに、がん免疫療法に使用され得るネオエピトープ材料を含む組成物を提供する事もまた目的である。

発明の概要
ネオペプチドを特定のカチオン性リポソームアジュバントと一緒に製剤化する事、および、かかる製剤を比較的高い投与量のネオペプチドを用いて投与する事によって、ワクチン接種した個体において、免疫応答が改善する事を本発明者らは見出した。これにより、発現産物を含むネオエピトープの発現によって特徴づけられるがんの、がん免疫療法における改善が供されると考えられる。

よって、第１の態様において、本発明は、哺乳類の患者において腫瘍、例えば悪性腫瘍を処置する方法に関し、ここで腫瘍は、患者において、非腫瘍性細胞では示されないＴ細胞エピトープ（ネオエピトープ）を示し、ここで、該方法は以下を含むリポソーム組成物を免疫学的有効量投与する事を含む：
１）患者の腫瘍細胞のネオエピトープのアミノ酸配列を含む、少なくとも１つのペプチド（ネオペプチド）、
２）溶媒、および
３）カチオン性リポソームアジュバント。

本発明の第２の態様は免疫原性組成物の単位用量に関し、上記単位用量には、患者の腫瘍細胞のネオエピトープのアミノ酸配列を含む、免疫学的有効量の少なくとも１つのペプチド（ネオペプチド）、カチオン性リポソームアジュバント、および溶媒を含む。

本発明の第３の態様は本発明の第１の態様の部分として投与されるリポソーム組成物の特徴を持つリポソーム組成物に関する。

関連する態様は、治療および予防療法における使用のための、特に本発明の第１の態様の方法における使用のための、第２の態様の単位用量ならびに第３の態様の組成物に関する。

図面のレジェンド
図１：実施例１における免疫試験の実験計画。 マウスは連続した日における免疫を含むクラスタープライミングを受けるか、または従来のプライム－ブーストレジメンに従って免疫された。Ｃ２２の投与量および免疫の日数を図に示した。Ｉｐ：腹腔内投与

図２：ＭＨＣＩ多量体アッセイの概要。 ＭＨＣクラスＩ分子を生産し、および、該分子をＵＶ光にさらすことによってＣ２２最小エピトープＫＦＫＡＳＲＡＳＩと交換された、安定化ペプチドをロードした。該ＭＨＣＩ分子を蛍光標識されたストレプトアビジンに結合させ、多量体化した。ネオペプチドにポジティブなＣＤ８＋Ｔ細胞を同定するために、血液細胞を、多量体で、ならびに蛍光色素をコンジュゲートした抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、および抗ＣＤ８抗体で共染色した。そしてサンプルをフローサイトメトリーで解析し、およびＭＨＣ：Ｃ２２ポジティブなＣＤ８＋のフラクションを算出した。

図３：２１日目の全血におけるネオペプチド特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の検出。 図３Ａは、初回免疫から２１日後の各群の２匹のマウス由来の血液中の、多量体ポジティブなＣＤ８＋の割合を示す。巡回しているＣ２２特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＡＦ０９ｂと共に配合された１０．０および５０．０μｇのＣ２２で免疫されたマウスにおいて、免疫スケジュールとは無関係に、検出された。各群の２匹のマウス由来の血液のみを染色した。図３ＢおよびＣでは、フローサイトメトリー解析からの代表的なプロットを示し、図３Ｂではコントロールを示した。 同上。

図４：エンドポイントである２８日目における全血中のネオペプチド特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の検出。 図４Ａは、初回免疫から２８日後の各群の２匹のマウス由来の血液中の、多量体ポジティブなＣＤ８＋の割合を示す。巡回しているＣ２２特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＡＦ０９ｂと共に配合された１０．０および５０．０μｇのＣ２２で免疫されたマウスにおいて、免疫スケジュールとは無関係に、検出された。また、２．０μｇのＣ２２でクラスタープライミングされたマウスのフラクションにおける少しの増加が見られた。図４ＢおよびＣは、フローサイトメトリー解析からの代表的なプロットを示し、図４Ｂではコントロールを示した。 同上。

図５：ネオペプチド特異的な脾臓のＣＤ８＋Ｔ細胞の検出。 図５Ａは、クラスタープライミングされたマウスのエンドポイント（初回免疫から２８日後）における、多量体ポジティブな脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。Ｃ２２特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＡＦ０９ｂと共に配合された１０．０および５０．０μｇのＣ２２で免疫されたマウスにおいて検出された。図５ＢおよびＣはフローサイトメトリー解析からの代表的なプロットを示し、図５Ｂではネガティブコントロールを示した。 同上。

図６：「患者１」での免疫のデータ。 Ａ：ネオエピトープを含むワクチンの９ペプチドで刺激した、免疫後のＰＢＭＣからのＩＦＮ－γ放出を示すＥＬＩＳＰＯＴデータ。健康コントロール群は、コントロールドナー由来のＰＢＭＣを用いた並行実験のデータ。ＣＡ０１９は２倍量で投与した。 Ｂ：腹腔内免疫後に得られたＰＢＭＣのフローサイトメトリーデータ。左側のパネルは非刺激ＰＢＭＣからのＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ放出を示し、中央のパネルは無関係なペプチドで刺激したＰＢＭＣからのＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ放出を示し、右側のパネルはワクチンの９つのペプチドで刺激したＰＢＭＣからのＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ放出を示す。

図７：「患者２」での免疫のデータ。 Ａ：免疫前に得られたＰＢＭＣをネオエピトープ含有ワクチンの５つのペプチドで刺激したときのＩＦＮ－γ放出を示すＥＬＩＳＰＯＴデータ。健康コントロールは、コントロールドナーのＰＢＭＣを用いた並行実験のデータ。Ｂ：腹腔内免疫後およびネオエピトープ含有ワクチンの５つのペプチドで刺激した後に得られたＰＢＭＣからのＩＦＮ－γ放出を示すＥＬＩＳＰＯＴデータ。健康コントロール群は、コントロールドナーのＰＢＭＣを用いた並行実験のデータ。 Ｃ：免疫前に得られたＰＢＭＣからの、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ放出のフローサイトメトリーデータ。左側のパネルは非刺激のＰＢＭＣからの放出を示し、中央のパネルは無関係なペプチドで刺激したＰＢＭＣからの放出を示し、右側のパネルはワクチンの５つのペプチドで刺激したＰＢＭＣからの放出を示す。Ｄ：腹腔内免疫後に得られたＰＢＭＣからの、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ放出のフローサイトメトリーデータ。左側のパネルは非刺激のＰＢＭＣからの放出を示し、中央のパネルは無関係なペプチドで刺激したＰＢＭＣからの放出を示し、右側のパネルはワクチンの５つのペプチドで刺激したＰＢＭＣからの放出を示す。

本発明の詳細な開示
定義
「がん特異的」抗原とは、個体の非腫瘍体細胞において発現産物として現れないが、個体のがん細胞においては発現産物として現れる抗原である。これは「がん関連の」抗原とは対照的であり、「がん関連の」抗原は、正常な体細胞にも低濃度で現れるが、少なくとも一部の腫瘍細胞には高濃度で見られる抗原のことである。

「アジュバント」という用語は、ワクチン技術におけるその通常の意味を有する、すなわち、１）自身ではワクチンの免疫原に対する特異的な免疫応答を起こすことができないが、２）にも関わらず免疫原に対する免疫応答を増強し得る、物質または物質の組成物である。言い換えると、アジュバント単体でのワクチン接種では免疫原に対する免疫応答を引き起こさず、免疫原によるワクチン接種は免疫原に対する免疫応答を亢進し得る、またはし得ない場合もあるが、しかし免疫原とアジュバントを併用したワクチン接種は免疫原単体に誘導されるよりも強い免疫原に対する免疫応答を誘導する。

「ＣＡＦ０９」（カチオン性アジュバント製剤０９）は免疫学的アジュバントリポソーム製剤であり、第４級アンモニウム界面活性剤であるＮ，Ｎ－ジメチル－Ｎ，Ｎ－ジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）のリガンドとして作用する合成３－ヒドロキシ－２－テトラデシル－オクタデカン酸－２，３－ジヒドロキシプロピルエステル（モノミコリルグリセロール、「ＭＭＧ」）、およびトール様受容体（ＴＬＲ）のリガンドとして作用するポリイノシン酸－ポリシチジル酸（ナトリウム塩）（「ｐｏｌｙＩＣ」または「ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）」）を含む。ＣＡＦ０９を含む多数のＣＡＦファミリーアジュバントは、ＵＳ２０１４／０１１２９７９およびＵＳ２０１６／０２２８５２８に詳細に開示されている。ＤＤＡ：ＭＭＧ：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の相対量（ｗ：ｗ：ｗ）は、５：１：１である。

「ＣＡＦ０９ｂ」はＣＡＦ０９の、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の相対量をＵＳ２０１４／０１１２９７９に開示されるＣＡＦ０９においての約１／４の量にまで減らしたバージョンであって、ＤＤＡ：ＭＭＧ：ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の相対量（ｗ：ｗ：ｗ）はよって２０：４：１であり、典型的なヒトへの用量にはＤＤＡ６２５μｇ、ＭＭＧ１２５μｇ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３１．２５μｇがそれぞれ含まれる。

「ネオエピトープ」は、ネオエピトープをコードする遺伝子の欠失によって、個体における通常の体細胞由来の発現産物として存在しないが、同個体の変異した細胞（例えばがん細胞）において発現産物として存在する、抗原決定基（典型的にはＭＨＣクラスＩまたはＩＩに拘束されるエピトープ）である。その結果、ネオエピトープは免疫学的な観点からみて、自己起源にも関わらず真に非自己であって、およびそのためネオエピトープが発現産物を構成する個体において、ネオエピトープは、がん特異的抗原として特徴づけられ得る。非自己であるため、ネオエピトープは、個体において特異的な適応免疫応答を引き起こし得る可能性があり、その際、誘発される免疫応答はネオエピトープを有する抗原および細胞に対して特異的である。一方、ネオエピトープは、同じネオエピトープが他の個体で発現産物となる可能性が低いため、個体に対して特異的である。このように、ネオエピトープは、例えばがん特異的抗原のエピトープ、とは異なるいくつかの特徴がある：後者は典型的に、同じ種類の複数の癌に見られる（活性化されたがん遺伝子からの発現産物である可能性があるため）、および／または、がん細胞における関連遺伝子の過剰発現によって、わずかな量ではあるが、非悪性細胞において存在し得る。

「ネオペプチド」は自身の配列内に本文中で定義されるネオエピトープを含むペプチド（すなわち約５０アミノ酸残基までのポリアミノ酸）である。ネオペプチドは典型的には「天然」である、すなわち該ネオペプチドのアミノ酸配列全体が個体から単離され得る発現産物のフラグメントを構成するが、しかしネオペプチドはまた、「人工的」なもので有り得る、つまりネオエピトープの配列、および少なくとも１つが該ネオエピトープの配列と天然に関連していない１つまたは２つの付加アミノ酸配列によって構成されることを意味する。後者の場合において、付加アミノ酸配列は、単にネオエピトープの担体として働くか、またはさらにネオエピトープの免疫原性を向上させ得る（例えば、ネオペプチドの生物学的な半減期を改善する、または可溶性を変える事で、抗原提示細胞によるネオペプチドの処理を促進する。）

「アミノ酸配列」という用語は、ペプチドおよびタンパク質中で、ペプチド結合によって連結した、アミノ酸残基の順番である。配列は慣習的にＮ末端からＣ末端の方向に記載される。

「免疫原性の担体」は免疫原／ハプテンに対する免疫応答の誘発を増強するまたは可能にするために、免疫原またはハプテンと結合し得る分子または部分である。免疫原性の担体は、従来的には、自身の権能では免疫原性が不十分な免疫原／ハプテンに融合またはコンジュゲートし得る比較的大きな分子（例えば、破傷風トキソイド、ＫＬＨ、ジフテリアトキソイドなど）であって、典型的には、免疫原性の担体は、免疫原および免疫原性の担体によって構成される、Ｔヘルパーリンパ球に結合した物質に対する強力なＴヘルパーリンパ球の応答を誘発し得る、よってこれはＢリンパ球および細胞傷害性リンパ球による免疫原に対しての増強した応答を供する。より最近では、大きな担体分子は、無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ） Ｔヘルパーエピトープと呼ばれる、すなわち、集団のＨＬＡハプロタイプの大部分に認識される、およびＴヘルパーリンパ球の応答を誘発する、より短いペプチドにある程度代替されている。

「Ｔヘルパーリンパ球応答」は、ペプチドによって誘発される免疫応答であって、該ペプチドは抗原提示細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、ＨＬＡクラスＩＩ分子）に結合する事ができ、および、該ペプチドおよび該ペプチドを提示するＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体を、Ｔ細胞受容体が認識する結果として、動物種においてＴヘルパーリンパ球を刺激する。

「免疫原」は宿主の免疫系が免疫原に直面している宿主において、適応免疫応答を誘導し得る物質である。このように、免疫原はより大きな「抗原」族のサブセットであって、免疫系によって特異的に認識され得る（例えば、抗体に結合される場合、または代わりにＭＨＣ分子に結合した抗原のフラグメントが、Ｔ細胞受容体に認識される場合）物質であるが、免疫応答を誘導できる必要はない、しかし、抗原は常に免疫を誘発し得る、つまり抗原に対しての確立した免疫記憶を有する宿主は、該抗原に対して特異的な免疫応答を起こすことになる。

「ハプテン」とは、免疫応答を誘導および誘発できないが、免疫原性の担体とコンジュゲートすると、該ハプテンを認識する抗体またはＴＣＲが、免疫系とハプテン担体コンジュゲートの接触によって誘導され得る、小分子である。

「適応免疫応答」とは抗原または免疫原との接触に対応した免疫応答であって、免疫応答は、抗原／免疫原の抗原決定基に特異的である。適応免疫応答の例は、抗原特異的抗体の生産の誘導、またはＴヘルパーリンパ球または細胞傷害性リンパ球の抗原特異的な誘導／活性化である。

「防御的、適応免疫応答」とは抗原による免疫（人工的または天然に）への反応として対象内で誘導される抗原特異的免疫応答であって、該免疫応答はその後の抗原、または抗原を含む病理関連剤の挑戦から対象を防御し得る。典型的には、予防接種は１つまたはいくつかの病原に対する防御的適応免疫応答を確立することを目的とする。

「免疫系の刺激」とは、物質または物質の組成物が一般的で非特異的な免疫刺激作用を示すことを意味する。多くのアジュバントおよび推定アジュバント（例えば特定のサイトカイン）は免疫系を刺激する能力を共有する。免疫刺激剤を使用した結果として、免疫系の「覚醒度（ａｌｅｒｔｎｅｓｓ）」が高まる、つまり、免疫原を単独で使用した場合と比較して、同時またはその後の免疫原による免疫が、顕著により効果的な免疫応答を誘導する。

「ポリペプチド」という用語は、本文の文脈において、２から５０アミノ酸残基の短いペプチド、５０から１００アミノ酸残基のオリゴペプチド、および１００アミノ酸残基以上のポリぺプチドのいずれもを意味することを意図する。さらに、該用語はまた、タンパク質、すなわち、少なくとも１つのポリペプチドを含む機能性生体分子を含むことも意図しており、機能性生体分子が、少なくとも２つのポリペプチドを含む場合には、これらは複合体を形成していても、共有結合をしていても、非共有結合をしていてもよい。また、タンパク質中のポリペプチドは、グリコシル化され得る、および／または脂質化され得る、および／または、補欠分子族を有し得る。

本発明の特定の実施形態。
本発明の処置方法－第１の態様
本発明の第１の態様の方法は、一般的に免疫の導入に関し、およびそのようなものとしてまた、疾患の処置、予防、改善に関する方法を伴い、特に、がんの処置および改善に関する方法を伴う。つまり、本発明の第１の態様は一般的に、哺乳類患者における腫瘍性疾患、例えば悪性腫瘍性疾患を処置する方法に関し、ここで、該腫瘍の細胞は、患者において、非腫瘍性の細胞は示さないＴ細胞エピトープ（ネオエピトープ）を示し、該方法は、
１）患者の腫瘍細胞のネオエピトープのアミノ酸配列を含む少なくとも１つのペプチド（ネオペプチド）、
２）溶媒、および
３）カチオン性リポソームアジュバント
を含むリポソーム組成物を免疫学的有効量投与することを含む。

多くのカチオン性リポソームアジュバントが知られている。これらの内、本発明において好ましいものは、デンマークのＳｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで開発され、およびＣＡＦ（カチオン性アジュバント製剤）として知られる免疫アジュバントのラインの一部である；最近のレビューにはＣＡＦラインのアジュバントの一般的な特徴が記載されている：Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＧＫ ｅｔ ａｌ．（２０１８），Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３９：４－１３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｍｉｍ．２０１８．１０．００．。全てのＣＡＦは界面活性剤ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）を含むことで特徴づけられ、およびほとんどのＣＡＦはリポソーム製剤（ＣＡＦ０１、ＣＡＦ０４、ＣＡＦ０５、ＣＡＦ０６、ＣＡＦ０９、ＣＡＦ１０、およびＣＡＦ１１）として存在するが、少数の最近開発されたＣＡＦは油（スクワレン）を含むエマルジョンの形態（ＣＡＦ１９およびＣＡＦ２４）である。

特に興味深いカチオン性リポソームアジュバントは、本発明において、ＤＤＡ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、およびＭＭＧ（３－ヒドロキシ－２－テトラデシル－オクタデカン酸－２，３－ジヒドロキシプロピルエステルなどの、ＭＭＧの合成アナログを含む）を含む、またはそれからなるものである。言い換えると、それらはＣＡＦ０９アジュバントである。

好ましいカチオン性リポソームアジュバントにおいて、ＤＤＡ：ＭＭＧ比は５：１（ｗ／ｗ）であり、およびＤＤＡ：ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）比は５：１から２０：１（ｗ／ｗ）の間である。例えば、本発明において、「伝統的な」ＣＡＦ０９の場合には、ＤＤＡ：ＭＭＧ：ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の相対重量は５：１：１で有り得る、およびＣＡＦ０９ｂアジュバントの場合には、ＤＤＡ：ＭＭＧ：ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の相対重量は２０：４：１で有り得る。

ネオペプチドのワクチンへの製剤化を促進するために、ネオペプチドは水溶性であることが好ましい。この目的のために、ネオペプチドは、それらをワクチン製剤に包含する前に、特定の溶解度基準を満たすよう慎重に選択される。例えば、少なくとも１つのネオペプチドが、ＮＴＵ（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ ｕｎｉｔ）を欧州薬局方のセクション２．２．１に従って測定した場合に、５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含む２５ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．４中の１．０ｍｇ／ｍｌネオペプチドが、最大で５０のＮＴＵを呈する、および２５ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．４ および０．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中の０．１ｍｇ／ｍｌのネオペプチドが最大で２５ＮＴＵを呈する、という意味で水溶性であることは好ましい。

より具体的には、ネオペプチドを、６２０ｎｍにおける分光光度測定に関するアッセイにおいて試験し、様々な濃度でのＴＲＩＳ緩衝液中のペプチド溶液のオパレセンス（ｏｐａｌｅｓｃｅｎｃｅ）（すなわち濁度）の程度を決定し、およびそこから、対応するＮＴＵ値（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｏｐａｌｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ， Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ； ＥＰＰＯＳ０１を用いた参照懸濁液測定からの検量線を使用）を計算する。これは、所定のネオペプチドが「可溶性」（０．１ｍｇ／ｍＬの濃度でＮＴＵ＜２５；１．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＮＴＵ＜５０）であるか、「不溶性」（０．１ｍｇ／ｍＬの濃度でＮＴＵ＞２５；１．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＮＴＵ＞５０）であるか評価するために使用し得る。この方法は，天然のＬ－アミノ酸（典型的にはシステイン残基を除く）からなるＨＰＬＣ精製（純度＞９５％）された直鎖状ペプチドを，ＴＲＩＳ緩衝液（０．５％ＤＭＳＯを含む）に、各試験ペプチドを０．１ｍｇ／ｍｌとして配合し，その溶解度を決定するために使用される。また、試験サンプルは０．１～４．０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で測定され得る。例えば、この場合、ネオペプチドを２０ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに溶解し、その後５倍、１０倍、２０倍、および２００倍に段階希釈して、ＴＲＩＳ緩衝液で４．０、２．０、１．０、０．１ｍｇ／ｍｌになるようにする。

そして、比濁法アッセイはＰｈ Ｅｕｒ ２．２．１に基づいてサンプルの透明度を決定する。ネオペプチドが不溶性であれば、凝集または粒子が形成され、これらは、光が６２０ｎｍにおいてサンプルを通過する際の散乱の増加を調べることによって測定される。そして測定値は標準曲線と比較され、単一ペプチドの可溶性を示す最終的なＮＴＵスコアが決定される。単一ペプチドの可溶性を決定するための１つの手順は以下である

単一ペプチドの重量を測定し、２０ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに溶解する。
１．０ｍｇ／ｍＬサンプル：２５μｌの２０ｍｇ／ｍｌサンプルを４７５μｌの２５ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ＝７．４中に希釈し、１、０ｍｇ／ｍｌ（最終５％ＤＭＳＯ）にする。
０．１ｍｇ／ｍＬサンプル：２．５μｌの２０ｍｇ／ｍｌサンプルを４９７、５μｌの２５ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ＝７．４中に希釈し、０．１ｍｇ／ｍｌ（最終０．５％ＤＭＳＯ）にする。
ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌの希釈したサンプルをいれ、凝集を示す６２０ｎｍにおける光学濃度を測定する。
標準曲線の線形回帰によってＮＴＵ値を算出する。

リポソーム組成物における好ましいネオペプチドを提供するために、複数のネオペプチドの混合物においてさらなる溶解度アッセイを行う：少なくとも１つのネオペプチドが、複数のネオペプチドと、５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含む２５ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．４との混合物中に存在している場合に、滅菌濾過の対象にすると、その濃度が最大で５０％減少を示し、ここで、各複数のペプチドが、滅菌濾過前の混合物中で０．１ｍｇ／ｍｌの濃度であることが好ましい。このアプローチは、他のネオペプチドと凝集し得るためにワクチンにより適さないと示され得るネオペプチドのリポソーム組成物からの排除を提供するが、このことを立証するために、上記の単一のネオペプチドに対する比濁法を容易には使用できない。

一般的に、ワクチンを可能な限り効果的にするために、本方法は複数のネオペプチドの使用に基づく。典型的には、リポソーム組成物中のネオペプチドの数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０個のネオペプチドから選択されるが、原理的には、リポソーム組成物の物理化学的特性が許す限り、その数は多くてもよい。

複数のネオペプチドは当業者に知られたいくつかの方法のうちの１つで同定される。最も単純なアプローチは、患者の悪性細胞のサンプル由来のゲノムをシーケンス（典型的には、「ディープシーケンシング」による）し、およびｉｎ ｓｌｉｃｏで患者の通常細胞、または標準の「健康な」ゲノムから得た全ゲノムシーケンス（同様に、典型的には、「ディープシーケンシング」によって）と比較することである。その後、２つのシーケンスデータセットにおける違いを解析し、１）発現する（すなわちオープンリーディングフレームの部分である）、および２）通常、患者で見られないＴ細胞エピトープを含む発現産物を供する、変異候補を探す。このために、Ｔ細胞エピトープの予測が、ＭＨＣに拘束された配列のみを正しく提供することを保証するために、一般的に患者のＭＨＣ型に関するデータが含まれる。ＭＨＣ結合予測を含むＴ細胞エピトープ予測法の概要は、例えば、Ｄｅｓａｙ ＤＶ ａｎｄ Ｋｕｌｋａｍｉ－Ｋａｌｅ Ｕ （２０１４）， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １１８４： ３３３－３６４ （ｄｏｉ： １０．１００７／９７８－１－４９３９－１１１５－８＿１９） および、Ｓｏｒｉａ－Ｇｕｅｒｒａ ＲＥ ｅｔ ａｌ． （２０１５）， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５３： ４０５－４１４ （ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｊｂｉ．２０１４．１１．００３）において見ることができる。

ネオエピトープの同定と選択を最適化するために、この目的のために利用できる任意の予測方法が実際に有効である。最先端の予測アルゴリズムの１例は、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０／；Ｊｕｒｔｚ Ｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１７），ｊｉ１７００８９３；ＤＯＩ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１７００８９３）である。この方法は、従来のＭＳ由来リガンドおよびｐＭＨＣ親和性データの組み合わせにおいて学習される。他の例は、ＮｅｔＭＨＣｓｔａｂｐａｎ－１．０（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｓｔａｂｐａｎ－１．０／；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｃｅｐｔｅｄ ｆｏｒ Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｊｕｎｅ ２０１６）である。この方法は、各ペプチドを合成する、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＨＣ分子に複合体化させるアッセイを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐＭＨＣ安定性測定のデータセットで学習される。このアッセイにおいて細胞処理は行われず、およびｐＭＨＣ安定性が測定される環境は幾分か人工的である。本方法は、一般的にはＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０よりも精度が低い。米国特許１０、０５５、５４０号は従来のＭＳで検出されたリガンドを用いたネオエピトープの同定のための方法を記載する。同様の技術を用いたその他の特許出願は、ＷＯ２０１９／１０４２０３、ＷＯ２０１９／０７５１１２、ＷＯ２０１８／１９５３５７（ＭＨＣクラスＩＩ特異的）、およびＷＯ２０１７１０６６３８である。最後に、ＭＨＣｆｌｕｒｒｙ：（ＤＯＩ： ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｓ．２０１８．０５．０１４；ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｏｐｅｎｖａｘ／ｍｈｃｆｌｕｒｒｙ）は、ＭＳで検出されたリガンドデータとｐＭＨＣ親和性で学習されたＮｅｔＭＨＣｐａｎのようなものである。また、ペプチド－ＭＨＣクラスＩＩ相互作用予測法は、最近の出版物であるＧａｒｄｅ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ＤＯＩ： ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２５１－０１９－０１１２２－ｚに開示される。この出版物では、ＭＨＣクラスＩＩから溶出した天然処理ペプチドを学習のセットの一部として使用し、およびリガンドとして確認された場合は１、ネガティブな場合は０の結合対象値を割り当てる。

一般的に、これらの予測システムは人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）を採用している：ＡＮＮは非線形の相関関係を同定し得る：非線形の相関関係の定量化は、単純な計算では計算が困難であるため、容易な仕事ではない。これは主に、非線形の相関関係が、線形の相関関係よりも多くのパラメーターで記述され、およびおそらく全ての特徴をまとめて考慮した際に初めて現れるためである。よって、特徴間の依存関係を捉えるためには、全ての特徴を考慮に入れる必要がある。

選択されたネオエピトープが効果的な免疫応答を供する可能性をさらに向上させるために、どちらも２０１９年９月１３日に出願された欧州特許出願番号１９１９７２９５．９および１９１９７３０６．４に開示される技術を好ましくは使用し得る。これらの出願は、ペプチドとＭＨＣ分子間の結合の安定性が決定され得ることを可能にする、およびネオエピトープの検出および選択の一部として、ネオエピトープのＭＨＣ結合安定性を決定することを可能にする、技術を開示する。簡単に言うと、安定性の決定から得られたデータは、例えばＡＮＮの学習セットに用いる、およびＡＮＮはその後、関連したＭＨＣ分子に対する予測された結合安定性にしたがって、同定されたペプチドを順位付けし得る。

したがって、本発明において、本文中で議論された少なくとも一つのネオペプチドが、腫瘍細胞中で同定されたネオエピトープの中から、平均以上、例えば、上位１／４以上のＭＨＣ結合安定性を示すネオエピトープを含むことは、好ましい。このネオペプチドに含まれるネオエピトープの特定の選択は、欧州特許出願番号１９１９７２９５．９および１９１９７３０６．４に開示される技術によって促進される。本発明において、同定された（長い）ネオペプチドは、最終的に患者に投与される最終製品の特徴および／または製造および／または安定性を最適化するために、都合のよい場合には、切断されたバージョンとして調製し得る。したがって、この好ましい実施形態では、任意の同定されたネオペプチドに対して、以下の切断規則が一般的に適用される。

もしもネオペプチドが配列中のどこかにＣを含んでいたなら、該Ｃを取り除くように、好ましくは元のネオエピトープの最長断片を残すように切断する。例えば、以下のように：ＱＩＥＴＱＣＲＫＦＫＡＳＲＡＳＩＬＳＥＭＫＭＬＫＥＫＲ（配列番号１７）
→ＲＫＦＫＡＳＲＡＳＩＬＳＥＭＫＭＬＫＥＫＲ（配列番号１８）

もしもＮ末端にＱかＮがあるときは、該Ｑ／Ｎを取り除く。例えば、以下のように：
ＱＩＥＴＱＱＲＫＦＫＡＳＲＡＳＩＬＳＥＭＫＭＬＫＥＫＲ（配列番号１９）
→ＩＥＴＱＱＲＫＦＫＡＳＲＡＳＩＬＳＥＭＫＭＬＫＥＫＲ（配列番号２０）、
およびＮＩＥＴＱＱＲＫＦＫＡＳＲＡＳＩＬＳＥＭＫＭＬＫＥＫＲ（配列番号２１）
→ＩＥＴＱＱＲＫＦＫＡＳＲＡＳＩＬＳＥＭＫＭＬＫＥＫＲ（配列番号２０）。

もしもネオペプチドが、Ｎ末端にＤＧモチーフを含む場合、Ｇを残したまま、Ｄを取り除く、例えば、以下のように：
ＤＧＥＴＱＱＲＫＦＫＡＳＲＡＳＩＬＳＥＭＫＭＬＫＥＫＲ （配列番号２２）
→ＧＥＴＱＱＲＫＦＫＡＳＲＡＳＩＬＳＥＭＫＭＬＫＥＫＲ （配列番号２３）

その結果、本文中で開示される組成物中の有用な免疫原として本文中で議論されるネオペプチドは、システイン残基を含まず、および／またはＮ末端のアミノ酸残基としてＱおよびＮを含まず、および／またはＮ末端にアミノ酸配列ＤＧを含まないことになる。特に好ましい実施形態では、組成物中のどのネオペプチドもシステイン残基を含まず、組成物中のどのネオペプチドもＮ末端のアミノ酸残基としてＱまたはＮを含まず、組成物中のどのネオペプチドもそのＮ末端にアミノ酸配列ＤＧを含まない。

同定に続いて、（複数の）ネオペプチドは合成され、および好ましくは上記で議論された、リポソーム製剤中への組み込みの前に可溶性を決定するための方法の対象となる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのネオペプチドはリポソーム組成物中の不連続相と優先的に関連している、すなわち、少なくとも１つのネオペプチドは、それらが連続相（溶媒）中に存在しているよりも顕著に高い程度で、リポソームに捉えられている、または結合している。その他の実施形態では、少なくとも１つのネオペプチドは、リポソーム組成物中のリポソームに関連するまたは結合する代わりに、リポソーム組成物の連続相に優先的に溶解している。

典型的には、免疫学的有効量は、複数回患者に投与される；典型的には、これは免疫学的有効量が、少なくとも１日隔てられた１連の別々の投与で投与されることを伴う。この態様の好ましい実施形態では、免疫スキームは哺乳類（例えば、ヒト）が１回のプライミング投与および１回以上の後のブースター投与を受ける事を含むが、同等に魅力的な代替案は「クラスター免疫」、すなわち、記憶免疫応答が確立する前に、免疫レジメンの初期に、短い間隔で免疫原の用量を繰り返し投与する；そしてその後、プライム－ブースト免疫レジメンにおいて使用される従来のブースター免疫に似た、遅くの免疫を行う、という免疫スキームを使用することである。

免疫学的有効量が本文中で議論される組成物の比較的大きな容積を構成するような場合において、免疫学的有効量を何度かの「サブ投与」として投与する事が有利である、すなわち、免疫学的有効量を２以上の部分に分割し、それぞれが典型的には患者の別の位置に投与される。例えば、２０００μｌの容積の免疫原性組成物を、注射によって投与する場合、異なる注射部位での、２回の実質的に同時な（すなわち同じ１２時間以内に）注射として行うと好都合である。

リポソーム組成物は、医薬的に許容できる担体を含み得る。「医薬的に許容できる担体」という用語は、治療剤、例えばポリペプチド、の投与のための担体を指す。この用語は、それ自体が組成物を受ける個体にとって有害な抗体の生産を誘導しない、および過度な毒性なしに投与され得る、任意の医薬的な担体を指す。適切な担体は、例えばタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、および不活化ウイルス粒子などの、大きく、ゆっくりと代謝される高分子であってよい。かかる担体は当業者によく知られている。

医薬的に許容できる塩もまた、賦形剤として使用され得る、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩や、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩。医薬的に許容できる賦形剤の詳細な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＭａｃｋＰｕｂ．Ｃｏ．，ＮＪ． １９９１）から入手できる。

リポソーム組成物中の医薬的に許容できる担体は、例えば水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体を含んでいてよい。加えて、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、かかるビヒクル中に存在してよい。典型的には、リポソーム組成物は液体溶液または懸濁液のどちらかとして、注射剤として調製される；注射の前に液体ビヒクル中に溶解させる、または懸濁させるのに適した固体の形状としても調製されてよい。リポソームは、医薬的に許容できる担体の定義内に含まれる。

本発明の第１の態様において、リポソーム組成物中の溶媒は典型的には水性であり、および好ましくはヒトの生理的な範囲にｐＨを保持する緩衝溶媒である。ネオペプチドは好都合には保存され、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に最初に溶解されるので、この溶媒成分は、好ましくは比較的小さな濃度ではあるが、リポソーム組成物中の溶媒中に存在する。さらに、水性溶媒中に使用される緩衝剤は典型的にはＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）緩衝水性溶媒である。最後に、この溶媒は好都合には少量のグリセロールを含み得る。よって、好ましいリポソーム組成物は、１５％以下のＤＭＳＯ例えば１０％以下のＤＭＳＯ、好ましくは５％未満のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）および約２％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含む。さらに、リポソーム組成物は好都合には１５から１８ｍＭの間の、好ましくは１６．１から１６．４ｍＭの間の濃度のＴＲＩＳを含むが、ＴＲＩＳ濃度は必須ではなく、例えば５から５０ｍＭの間で変化し得ることを強調しておきたい。

典型的には、リポソーム組成物は７．０から７．６の間の範囲の、好ましくは約７．４のｐＨを有する。

本発明の第１の態様の方法において使用される特に好ましいリポソーム組成物は以下を含む、またはそれからなる：
１）ネオペプチドあたりの濃度が１００μｇ／ｍｌである複数のネオペプチド
２）５％（ｖ／ｖ）未満の濃度である、ＤＭＳＯ
３）約１２５０μｇ／ｍｌ ＤＤＡ、
４）約２５０μｇ／ｍｌ ＭＭＧ、
５）約６２．５μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、
６）約２％（ｖ／ｖ）グリセロール、および
７）約１６．２５ｍＭ 、ｐＨ約７．４のＴＲＩＳ。

第１の態様の方法を実行する際、投与される各ネオペプチドの免疫学的有効量は、好ましくは少なくとも１０μｇ、例えば、少なくともまたは多くとも１５、少なくともまたは多くとも２０、少なくともまたは多くとも２５、少なくともまたは多くとも３０、少なくともまたは多くとも３５、少なくともまたは多くとも４０、少なくともまたは多くとも４５、少なくともまたは多くとも５０、少なくともまたは多くとも少なくともまたは多くとも５５、少なくともまたは多くとも６０、少なくともまたは多くとも６５、少なくともまたは多くとも７０、少なくともまたは多くとも７５、少なくともまたは多くとも８０、少なくともまたは多くとも８５、少なくともまたは多くとも９０、少なくともまたは多くとも９５、少なくともまたは多くとも１００、少なくともまたは多くとも１０５、少なくともまたは多くとも１１０、少なくともまたは多くとも１１５、少なくともまたは多くとも１２０、少なくともまたは多くとも１２５、少なくともまたは多くとも１３０、少なくともまたは多くとも１３５、少なくともまたは多くとも１４０、少なくともまたは多くとも１４５、少なくともまたは多くとも１５０、少なくともまたは多くとも１５５、少なくともまたは多くとも１６０、少なくともまたは多くとも１６５、少なくともまたは多くとも１７０、少なくともまたは多くとも１７５、少なくともまたは多くとも１８０、少なくともまたは多くとも１８５、少なくともまたは多くとも１９０、少なくともまたは多くとも１９５、少なくともまたは多くとも２００、少なくともまたは多くとも２０５、少なくともまたは多くとも２１０、少なくともまたは多くとも２１５、少なくともまたは多くとも２２０、少なくともまたは多くとも２２５、少なくともまたは多くとも２３０、少なくともまたは多くとも２３５、少なくともまたは多くとも２４０、少なくともまたは多くとも２４５、少なくともまたは多くとも２５０、少なくともまたは多くとも２５５、少なくともまたは多くとも２６０、少なくともまたは多くとも２６５、少なくともまたは多くとも２７０、少なくともまたは多くとも２７５、少なくともまたは多くとも２８０、少なくともまたは多くとも２８５、少なくともまたは多くとも２９０、少なくともまたは多くとも２９５、少なくともまたは多くとも３００、少なくともまたは多くとも３０５、少なくともまたは多くとも３１０、少なくともまたは多くとも３１５、少なくともまたは多くとも３２０、少なくともまたは多くとも３２５、少なくともまたは多くとも３３０、少なくともまたは多くとも３３５、少なくともまたは多くとも３４０、少なくともまたは多くとも３４５、少なくともまたは多くとも３５０、少なくともまたは多くとも３５５、少なくともまたは多くとも３６０、少なくともまたは多くとも３６５、少なくともまたは多くとも３７０、少なくともまたは多くとも３７５、少なくともまたは多くとも３８０、少なくともまたは多くとも３８５、少なくともまたは多くとも３９０、少なくともまたは多くとも３９５、および少なくともまたは多くとも４００μｇである。よって、好ましくは、各投与されるペプチドの免疫学的有効量は、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、および４００μｇからなる群より選択される。

これに関して、ヒトへの免疫あたりに投与されるリポソーム組成物の容積は、典型的には４００から２０００μｌの間であり、典型的な容積は、約４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１０１０、１０２０、１０３０、１０４０、１０５０、１０６０、１０７０、１０８０、１０９０、１１００、１１１０、１１２０、１１３０、１１４０、１１５０、１１６０、１１７０、１１８０、１１９０、１２００、１２１０、１２２０、１２３０、１２４０、１２５０、１２６０、１２７０、１２８０、１２９０、１３００、１３１０、１３２０、１３３０、１３４０、１３５０、１３６０、１３７０、１３８０、１３９０、１４００、１４１０、１４２０、１４３０、１４４０、１４５０、１４６０、１４７０、１４８０、１４９０、１５００、１５１０、１５２０、１５３０、１５４０、１５５０、１５６０、１５７０、１５８０、１５９０、１６００、１６１０、１６２０、１６３０、１６４０、１６５０、１６６０、１６７０、１６８０、１６９０、１７００、１７１０、１７２０、１７３０、１７４０、１７５０、１７６０、１７７０、１７８０、１７９０、１８００、１８１０、１８２０、１８３０、１８４０、１８５０、１８６０、１８７０、１８８０、１８９０、１９００、１９１０、１９２０、１９３０、１９４０、１９５０、１９６０、１９７０、１９８０、１９９０、および２０００μｌである。上記で示されるように、免疫学的有効量のリポソーム組成物の各投与は、少なくとも２回のサブ投与、特に１回の免疫あたり２回のサブ投与とすることができる；この場合、免疫学的有効量は関連する数のフラクションに分割され、および各フラクションはよって典型的には異なる部位に投与される。例えば、２０００μｌを投与する場合、これは好ましくは、１０００μｌの組成物の２回のサブ投与として、好ましくは患者の異なる位置において行われる。

本文中で言及するように、本発明の好ましいワクチンは細胞性免疫を誘導する、特にＣＤ８＋Ｔ細胞応答、特にＣＴＬ応答を誘導するが、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導することもまた価値がある。

投与経路に関して、ペプチドベースのワクチンの投与に好都合な、および効果的な任意の経路が使用され得る。好ましい経路は皮内、皮下、腹腔内、および筋肉内の経路であるが、肺内、眼内、髄腔内、脳内の経路もまた可能である。

組成物の単位用量－第２の態様
本発明の第２の態様は、（リポソーム）組成物の単位用量に関し、前記単位用量は、患者の腫瘍細胞のネオエピトープのアミノ酸配列を含む免疫学的有効量の少なくとも１つのペプチド（ネオペプチド）、カチオン性リポソームアジュバント、および緩衝溶媒、を含む。一般的に、単位用量の組成物の性質および構成要素は本発明の第１の態様において使用された組成物の性質および構成要素に対応しており、および一般的に、上記に開示されたリポソーム組成物に関連する全ての考察および詳細は、単位用量を形成する組成物に準用される。

したがって、この方法が、上記で議論した特定の好ましい量のネオペプチドの投与を伴うという事実に沿って、単位用量は、好ましくは、少なくとも１０μｇ、例えば、少なくともまたは多くとも１５、少なくともまたは多くとも２０、少なくともまたは多くとも２５、少なくともまたは多くとも３０、少なくともまたは多くとも３５、少なくともまたは多くとも４０、少なくともまたは多くとも４５、少なくともまたは多くとも５０、少なくともまたは多くとも少なくともまたは多くとも５５、少なくともまたは多くとも６０、少なくともまたは多くとも６５、少なくともまたは多くとも７０、少なくともまたは多くとも７５、少なくともまたは多くとも８０、少なくともまたは多くとも８５、少なくともまたは多くとも９０、少なくともまたは多くとも９５、少なくともまたは多くとも１００、少なくともまたは多くとも１０５、少なくともまたは多くとも１１０、少なくともまたは多くとも１１５、少なくともまたは多くとも１２０、少なくともまたは多くとも１２５、少なくともまたは多くとも１３０、少なくともまたは多くとも１３５、少なくともまたは多くとも１４０、少なくともまたは多くとも１４５、少なくともまたは多くとも１５０、少なくともまたは多くとも１５５、少なくともまたは多くとも１６０、少なくともまたは多くとも１６５、少なくともまたは多くとも１７０、少なくともまたは多くとも１７５、少なくともまたは多くとも１８０、少なくともまたは多くとも１８５、少なくともまたは多くとも１９０、少なくともまたは多くとも１９５、少なくともまたは多くとも２００、少なくともまたは多くとも２０５、少なくともまたは多くとも２１０、少なくともまたは多くとも２１５、少なくともまたは多くとも２２０、少なくともまたは多くとも２２５、少なくともまたは多くとも２３０、少なくともまたは多くとも２３５、少なくともまたは多くとも２４０、少なくともまたは多くとも２４５、少なくともまたは多くとも２５０、少なくともまたは多くとも２５５、少なくともまたは多くとも２６０、少なくともまたは多くとも２６５、少なくともまたは多くとも２７０、少なくともまたは多くとも２７５、少なくともまたは多くとも２８０、少なくともまたは多くとも２８５、少なくともまたは多くとも２９０、少なくともまたは多くとも２９５、少なくともまたは多くとも３００、少なくともまたは多くとも３０５、少なくともまたは多くとも３１０、少なくともまたは多くとも３１５、少なくともまたは多くとも３２０、少なくともまたは多くとも３２５、少なくともまたは多くとも３３０、少なくともまたは多くとも３３５、少なくともまたは多くとも３４０、少なくともまたは多くとも３４５、少なくともまたは多くとも３５０、少なくともまたは多くとも３５５、少なくともまたは多くとも３６０、少なくともまたは多くとも３６５、少なくともまたは多くとも３７０、少なくともまたは多くとも３７５、少なくともまたは多くとも３８０、少なくともまたは多くとも３８５、少なくともまたは多くとも３９０、少なくともまたは多くとも３９５、および少なくともまたは多くとも４００μｇの各ネオペプチドを含み、および好ましくは１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、および４００μｇから選択された量の各ネオペプチドを含む－ただし、含まれるネオペプチドの総質量の上限は、組成物の物理化学的特性によって設定されることを再度記す。

同様に、投与されるリポソーム組成物の好ましい容積に沿って、単位用量は、好ましくは４００から２０００μｌの間、例えば４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１０１０、１０２０、１０３０、１０４０、１０５０、１０６０、１０７０、１０８０、１０９０、１１００、１１１０、１１２０、１１３０、１１４０、１１５０、１１６０、１１７０、１１８０、１１９０、１２００、１２１０、１２２０、１２３０、１２４０、１２５０、１２６０、１２７０、１２８０、１２９０、１３００、１３１０、１３２０、１３３０、１３４０、１３５０、１３６０、１３７０、１３８０、１３９０、１４００、１４１０、１４２０、１４３０、１４４０、１４５０、１４６０、１４７０、１４８０、１４９０、１５００、１５１０、１５２０、１５３０、１５４０、１５５０、１５６０、１５７０、１５８０、１５９０、１６００、１６１０、１６２０、１６３０、１６４０、１６５０、１６６０、１６７０、１６８０、１６９０、１７００、１７１０、１７２０、１７３０、１７４０、１７５０、１７６０、１７７０、１７８０、１７９０、１８００、１８１０、１８２０、１８３０、１８４０、１８５０、１８６０、１８７０、１８８０、１８９０、１９００、１９１０、１９２０、１９３０、１９４０、１９５０、１９６０、１９７０、１９８０、１９９０、および２０００μｌからなる。

同様に、単位用量には多くのネオペプチドを含み、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０個から選択される数のネオペプチドを含むが、リポソーム組成物の物理化学的性質が許容するならばその数は多くてもよい。

本発明の組成物－第３の態様
本発明の第１の態様で使用されるリポソーム組成物は、それ自体が発明であると考えられる。したがって、本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様の文脈において開示されるリポソーム組成物に関し、および第１の態様においてなされた全ての開示が、それらがリポソーム組成物の性質および構成要素に関する限り、本発明の第３の態様に準用される。

その他の態様
特許請求の範囲から明らかなように、本発明はまた、治療において使用するための、特に、第１の態様の方法において使用するための、第２の態様の単位用量、または第３の態様の組成物に関する。同様に、本発明は、本発明の第１の態様の任意の方法において使用するための医薬組成物の製造のための、第２の態様の単位用量または第３の態様のリポソーム組成物の使用を含む。

実施例１
ＣＡＦ０９ｂアジュバント中のペプチドによる、ネオエピトープ特異的なＴ細胞の誘導
近年の非公開の２つの前臨床腫瘍試験では（データは非提示）、予測されるいくつかのネオペプチド各２．０μｇと混合したアジュバントＣＡＦ０９ｂからなるワクチンによる免疫は、該ネオペプチドの由来である腫瘍の成長を阻害しないことがわかった。

本研究では、１つのネオペプチド（本文中でＣ２２と呼ぶ）をさらに高い用量で試験した。Ｃ２２の最小エピトープが定義されており、よってＭＨＣＩ多量体染色によってネオペプチド特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の検出が可能である。Ｃ２２はアミノ酸配列ＱＩＥＴＱＱＲＫＦＫＡＳＲＡＳＩＬＳＥＭＫＭＬＫＥＫＲ（配列番号１）を有し、最小ＭＨＣクラスＩ拘束エピトープは、下線を引いた９アミノ酸ＫＦＫＡＳＲＡＳＩ（配列番号２）によって構成される。

よって本研究の目的は以下である
ｉ）ＣＡＦ０９ｂと混合した高いネオペプチドの用量が、ネオペプチド特異的な脾臓Ｔ細胞を誘導するのかを試験する。
ｉｉ）ネオペプチド特異的なＣＤ８＋細胞を、非濃縮全血サンプルにおいて検出し得るかを試験することであり、これは経時的な応答の追跡を可能にする。
ｉｉｉ）「クラスタープライミング」が、標準的なプライム－ブースト免疫よりも優れているか試験する。

ペプチドベースワクチンによるＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を促進するという観点から、Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＳＳＩ）は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両者で誘導が見られた、カチオン性リポソームアジュバントＣＡＦ０９ｂを開発した。このリポソームは、反発／安定および細胞への侵入を促進するための、正電荷のジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、ＣＤ４＋細胞生成のためのＰＡＭＰシグナルとしてのモノミコイルグリセロール（ＭＭＧ）、および反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する可能性のあるトール様受容体３アゴニスト、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（「ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）」）からなる。

ネオペプチドを、マウスの大腸がん細胞株ＣＴ２６およびＢＡＬＢ／ｃマウス由来の通常組織サンプルの全エキソンシーケンシングによって、およびがん細胞でのみ見られたペプチドを選択することによって、同定した。

本実験の目的は、ＣＡＦ０９ｂアジュバントと混合した予測されるネオペプチドがマウスにおいて反応性Ｔ細胞を誘導し得るか試験する事である。

Ｗｉｃｋ ＤＡ ｅｔ ａｌ．（２０１１）の論文、Ｖａｃｃｉｎｅ２９（５）：９８４－９９３によると、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と混合した、３．７μｇのＨＰＶ Ｅ７由来の１９アミノ酸残基のペプチドによるクラスタープライミングは従来のプライム－ブースト免疫よりも優れていたことが報告されている。加えて、Ｏｔｔ ＰＡ ｅｔ ａｌ．（２０１７）による最近の論文、Ｎａｔｕｒｅ ５４７（７６６２）：２１７－２２１によると、Ｈｉｌｔｏｎｏｌアジュバントとネオペプチドによってクラスタープライミングした黒色腫患者において臨床的な応答が報告されている。

したがって、ネオペプチドによるクラスタープライミングは、標準的なプライムブースト免疫と比較してより強い応答を引き起こすという仮説が立てられた。

材料および方法
ＢＡＬＢ／ｃマウス
６－８週齢のＢＡＬＢ／ｃ ＪｒＪ メスのマウスを、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓから入手した。このマウスを、実験の開始前に１週間順化させた。このマウスは、水と標準的な飼料へのアクセスは自由であった。実験は、欧州指令（２０１０／６３／ＥＵ）よりも厳格であり、よってこれに完全に準拠している、デンマーク動物実験法に基づき、デンマーク動物実験検査局からのライセンス２０１７－１５－０２０１－０１３３８に基づいて実施された。マウスには個体識別のために耳タグが付けられた。

実験設計－マウスの割り当ておよび処置
「ケージ効果」を避けるため、全処置群を各ケージに入れた。第１、第２、第３、および第４群（クラスター免疫群）のマウスを、０日目、１日目、２日目、３日目、７日目、１４日目、および２１日目に、ＣＡＦ０９ｂと混合したＣ２２をそれぞれ０．４、２．０、１０．０、および５０．０μｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．）で免疫した。対応するグループ（５、６、７、および８）には、０、１４、２１日目に、第１、第２、第３、および第４群が受けたものと同一の溶液を用いて、従来のプライム－ブースト戦略に従ってワクチン接種を行った。マウスへの投与量は、すべてのワクチンで２００μｌとした。詳細は図１を参照。

ワクチンの配合
Ｃ２２ペプチドはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社によって合成され、凍結乾燥品として０．８ｍｇずつに分注された。該ペプチドは、各分注に８０μｌのＤＭＳＯを加えて、１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにＤＭＳＯに溶解させた。そして、保存ペプチドを滅菌水で１０倍に希釈した（８０μｌの保存ペプチド＋７２０μｌの滅菌水）。各投与日ごとにペプチドを調製し、使用するまで－２０℃で保存した。免疫当日、ペプチドを解凍し、ＴＲＩＳ緩衝液およびＣＡＦ０９ｂを示した容量で添加した。マウスへの最終的なワクチンは、１回あたり２００μｇのＤＤＡ、４０μｇのＭＭＧ、１０μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含んでいた。ワクチンの配合のさらなる詳細については、以下の表を参照。

脾臓由来の単一細胞懸濁液の作成
エンドポイントでは、試験に参加した全マウスの脾臓を回収した。以下のプロトコルに従って、単一細胞の懸濁液を作成した。

材料
ＲＰＭＩ （Ｇｉｂｃｏ ＲＰＭＩ １６４０）
ＦＣＳ （Ｇｉｂｃｏ）
１０ｘＲＢＣ溶解緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４２０３０１）
７０μｍセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃４３１７５）
ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃ チューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、＃１３０－０９３－２３７）
５０ｍｌチューブ
クライオバイアル

器具
ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳディソシエーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）
ＬＡＦベンチ
Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙまたはその他の凍結用ボックス

手順
１：組織を、Ｒ１０（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ）を入れた、あらかじめラベルしたＣチューブに回収する。
推奨：脾臓１個あたり３ｍｌの培地を用いる。処理するまで氷上で保管する。無菌状態を保つ。
２：Ｃチューブをしっかりと閉め、逆さにしてｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳディソシエーターのスリーブに装着する。プログラムｍ＿ｓｐｌｅｅｎ＿０１を実行する（チューブあたり１－２個の脾臓の場合）。
３：（任意）ディソシエーション後にＣチューブの短時間の遠心分離を行い、チューブの底に溜まったサンプル材料を回収する。
４：７０μｍのセルストレーナーを、あらかじめラベルした５０ｍｌチューブの上に置き、Ｒ１０でプレウェットする。
５：Ｃチューブに入ったサンプルを再懸濁し、細胞懸濁液を７０μｍセルストレーナーにアプライする。
６：（任意）２ｍｌのＲ１０でＣチューブを洗浄し、セルストレーナーにアプライして残留細胞を得る。
７：５ｍｌのＲ１０でセルストレーナーを洗浄する。残った液をフィルターの底からピペッティングすることを忘れずに行う。
８：細胞を遠心分離する：１５００ｒｐｍ、５分、４℃。上澄み液を捨てる。ペレットを砕く。
９：（任意）１ｍｌの１ｘＲＢＣＬ緩衝液（１０ｘストック、ＰＢＳで希釈）を用いて赤血球の溶解を２分間行う。５ｍｌのＲ１０で洗浄し、ＲＢＣＬ緩衝液から細胞を取り出します。
１０：１ｍｌのＲ１０で再懸濁し、細胞を数える。
１１：再度、５ｍｌのＲ１０で洗浄する。
（任意）追加で７０μｍのセルストレーナーでろ過し、ゴミがあれば取り除く。
１２：細胞を、ＦＣＳ＋１０％ＤＭＳＯに、適切な濃度（例：２０ｘ１０^６細胞／ｍｌ）で再懸濁する。
１３：１ｍｌの細胞懸濁液をあらかじめラベルしたクライオバイアルに分注する。
１４：細胞をＭｒ．Ｆｒｏｓｔｙに移し、－８０℃で２４時間置いた後、窒素保存に移す。

Ｃ２２特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するために、全ＥＤＴＡ血液サンプルおよび脾細胞を、Ｃ２２配列の２７アミノ酸中に埋め込まれた最も強いＭＨＣＩ結合体、として同定されたＣ２２由来の最小ペプチドＫＦＫＡＳＲＡＳＩ（配列番号２）、をロードした、蛍光標識したＭＨＣＩ多量体を用いて染色した。ＭＨＣＩ多量体アッセイを図２に示す。詳細な染色プロトコルは以下である。

材料
エッペンドルフチューブ
ディープ９６ウェルプレート（２ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、＃５７５６５３）
１０ｘ溶解溶液（ＢＤ＃３４９２０２）
Ｃ２２ ＡＰＣおよびＰＥで標識したＭＨＣ多量体、ならびに無関係（Ｃ３０） ＡＰＣおよびＰＥで標識したＭＨＣ多量体
ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ）

手順
１：マウスから採血する：静脈穿刺（尾または伏在静脈）をＥＤＴＡコーティングチューブ－ＢＤバキュテイナＥＤＴＡ採血管に入れる
２：ディープ９６ウェルプレートに入れた血液５０μｌを、プレートの設定に従って染色する。
３：解凍後の多量体をスピンする（クイックスピン）。
４：エッペンドルフチューブで、各多量体１μｌを２９μｌのＦＡＣＳ緩衝液（１サンプルあたり）で希釈する。
５：多量体をエッペンドルフチューブでスピンする（３３００ｇ、５分）。
６：プレートの設定に従って、３０μｌの希釈した多量体を加える。プレートの設定に従い、３０μｌ ＦＡＣＳ緩衝液を「多量体なしのサンプル」に加える。
６．１：多量体チューブ内のペレットは、ＭＨＣ多量体の凝集体を含んでいる可能性があるので避ける。
７：プレートの設定にしたがって、設定サンプルに５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液を加える。
８：暗所で１５分間、３７℃でインキュベートする。
９：１μｌの抗ＣＤ１６／ＣＤ３２を加えてＦＣの結合をブロックし、暗所で１０分間、室温でインキュベートする。
１０：抗体マスターミックスを計算通りに作成する－付録２参照
１１：プレートの設定に従い、２０μｌの抗体マスターミックスをウェルに加えて染色します。
１２：４℃で３０分インキュベートする。
１３：赤血球を溶解するために、ウェルあたり１ｍｌの溶解／固定液（Ｈ２Ｏで希釈）を加えます。暗所で５－１０分、室温でインキュベートする。
１４：ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄する（１５００ｒｐｍで５分間スピン）。
１５：２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液でＦＡＣＳチューブに移す。
１６：フローサイトメーターで解析する。

結果
循環しているネオペプチド特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の検出
２１日目に、ＥＤＴＡ血液を採取し、上記および図２に概説するアッセイに従って、ＭＨＣＩ多量体で染色した。全血サンプルでネオペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出する初めての試みであったため、各群２匹のマウスのサンプルのみを解析した；したがって、この解析はパイロット実験と考えられた。エンドポイント（２８日目）には、実験におけるすべてのマウスの血液をサンプルとした。

２１日目において、クラスタープライミングおよび標準プライム－ブーストスケジュールの両者で用量依存的な応答が観察された；ネオペプチド特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＡＦ０９ｂと混合した１０．０および５０．０μｇのＣ２２を投与したマウスにおいて検出され、より低用量ではネオペプチド特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を全く引き起こさなかった（図３）。エンドポイントにおいて、マウスはさらに１度ブーストされたにも関わらず、応答は２１日目と同様であった（図４）。注目すべきことに、エンドポイントにおいて、標準プライム－ブーストスケジュールではペプチド特異的なＣＤ８＋細胞はほとんど見られなかったのに対して、２．０μｇのＣ２２をクラスタープライミングしたマウスの血液中に、低頻度のＭＨＣ：Ｃ２２ポジティブなＣＤ８＋細胞が検出された

アッセイの特異性を調べるため、ＣＡＦ０９ｂを投与したマウスの血液を、ＭＨＣ：Ｃ２２多量体で染色した。これらのサンプルにおいて、シグナルは検出されなかった。同様に、ネオペプチド由来の無関係なペプチド（「Ｃ２５」と呼ぶ）をロードしたＭＨＣＩ４量体で染色した血液サンプルもネガティブであり、アッセイの特異性が高いことを示す。

ネオペプチド特異的な脾臓のＣＤ８＋Ｔ細胞の検出
初回免疫後、２８日の終了日に、マウス由来の脾臓を回収し、単一細胞懸濁液を調製し、－８０℃で保存した。加えて、脾臓は、２匹のナイーブマウスおよび２匹のＣＡＦ０９ｂをｉ．ｐ．投与されたマウス由来のものを含む。

終了日に、クラスタープライミングマウス由来の脾細胞のみを解析した。

ネオペプチド特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は、１０．０および５０．０μｇのＣ２２＋ＣＡＦ０９ｂで免疫されたマウス由来の脾臓において検出され、一方より低用量では検出可能な応答を誘導しなかった。全血サンプルにおいて観察結果と同様に、ネオペプチド特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＡＦ０９ｂ投与マウスでは検出されなかった。加えて、無関係なペプチド（「Ｃ２５」と呼ぶ）をロードしたＭＨＣ４量体で脾細胞を染色した際、シグナルは観察されなかった。図５を参照。

動物の健康状態
ワクチンがマウスの一般的な健康状態に与える影響をモニターするため、ワクチン接種後、動物を注意深く検査し、実験全体を通して少なくとも週に３回体重を測定した。免疫直後、マウスは腹痛の兆候を示したが、１－２時間以内には収まり、その後それらは通常のふるまいに戻った。連続した日における免疫が、標準プライム－ブーストに比べて、マウスの健康状態に顕著な影響を与える事はなかった。両方の実験設定において、マウスは、１回目の免疫後に初期体重の約５％を失ったが、その後の免疫は体重に影響を与えなかった（データは非提示）。

ディスカッション
ＣＡＦ０９ｂと混合した１０．０および５０．０μｇのＣ２２による免疫は、ＭＨＣＩ４量体染色によって同定されるネオペプチド特異的なＣＤ８＋細胞を強く誘導したが、低用量では意外にも誘導しなかった。一方、従来のプライム－ブーストスケジュールと比較して、クラスタープライミングの顕著な利点は観察されなかった。しかし、２．０μｇのＣ２２への応答において、従来のプライム－ブーストと比較して、クラスタープライミングで少し増加することが観察された。

ＣＡＦ０９ｂを含むワクチンを免疫されたマウスは、それらの初期体重の約５％を失ったが、これはワクチン中に生理活性成分が含まれる事を示唆する。ワクチンの一般的なマウスの健康への影響は、クラスタープライミングおよびプライム－ブースト方法の両方において、体重の減少は一時的なものであり、３－４日以内に全マウスが基準値に戻ったことから、許容できるものであると考えられる。

実施例２
臨床試験の予備データ
ネオエピトープを標的とした本発明のアプローチを試験する、第１／２ａ相の臨床試験が、２０１９年３月に患者への最初の投与をもって開始された。この試験は悪性黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および膀胱がんの患者を含む。

簡単に説明すると、処置は、悪性細胞由来の一群のネオエピトープが各登録した患者において同定され、その後本発明に従ってネオエピトープが合成され、配合され、および患者に投与されることを伴う；最初に、腹腔内に２週間の間隔をおいて３回免疫し、およびその後、最後の腹腔内への投与から２週間の休止を挟んで、２週間の間隔をおいて３回の筋肉内への免疫を行う。よって、全てのワクチン接種は好ましい２週間の間隔で行われる。

以下のデータは、腹腔内への免疫の終了後であり、筋肉内への免疫の前の、２人の患者から取得した。

患者１および２それぞれは、患者の悪性組織におけるアミノ酸配列を含むネオエピトープとして同定されたペプチドのプールから調製されたワクチンを用いて３回の腹腔内への免疫を受けた。

患者１について、ペプチドプールは、ＤＭＳＯに溶解させた以下の９ペプチド（配列番号３－１１）を含む。

患者２について、ペプチドプールは、ＤＭＳＯに溶解させた以下の５ペプチド（配列番号１２－１６）を含む。

アスタリスクでマークしたペプチドは、残りのペプチドと比べて、約２倍の濃度で各プールに含まれていた。低濃度のペプチドの測定濃度は１．６から１．８ｍｇ／ｍｌの間の範囲であったが、高濃度のペプチドは、３．１から３．５ｍｇ／ｍｌの間の範囲の濃度であった。

ワクチンを、０．１２ｍｌの患者のペプチドプール組成物を、１．０８ｍｌの２５ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液で希釈する事により調製した。この溶液から、１ｍｌのＴＲＩＳ緩衝プール希釈溶液を１ｍｌのＣＡＦ０９ｂと混合し、ワクチン組成物を作成した。１×用量でのＩＰ投与として、免疫あたり０．５０ｍｌのワクチン組成物を腹腔内に注入した。

最初の腹腔内への免疫の直前に、各患者から血液を採取し、３回の腹腔内への免疫後、最初の筋肉内への免疫の直前においても同様に血液を採取した。そしてこれらの血液サンプル由来のＰＢＭＣ細胞を免疫前および腹腔内免疫後のＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＣＳ／再刺激アッセイの対象とした。

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは反応性Ｔ細胞を間接的に検出するための標準的な技術であり、患者から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をワクチンの各ペプチドで刺激する、ＥＬＩＳＡ法に似た設定において、分泌されたサイトカイン（この場合、ＩＦＮ－γ）が測定される。

ＩＣＳ／再刺激アッセイでは、患者由来のＰＢＭＣが、ワクチンペプチドのプール全体によって刺激され、およびその後フローサイトメトリーによる細胞計数の対象となるが、これは、それらにおいて細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）およびサイトカイン（ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α）の存在を試験することで、サイトカインを放出するＴ細胞の亜集団の存在を検出する。

これらの実験から得られた結果を以下にまとめる：
患者１：免疫前の実験では、ＩＦＮ－γのＥＬＩＳＰＯＴおよびＩＣＳ／再刺激アッセイのいずれも、ポジティブコントロールと比較して、顕著な数の、任意のワクチンペプチドに対する反応性Ｔ細胞の存在を示さなかった（データは非提示）。対照的に、腹腔内免疫後の実験では、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、９つのワクチンペプチドの内の４つに対する反応性Ｔ細胞の存在が示され（図６Ａ）、およびＩＣＳ／再刺激アッセイにおいてはＣＤ８＋細胞（データは非提示）ではなく、ＩＮＦγおよびＴＮＦ－α ＣＤ４＋細胞（図６Ｂ）の存在を示した。倍の用量のペプチドについて、ＥＬＩＳＰＯＴで最も強いＩＦＮ－γ応答が見られた。

患者２：免疫前の実験では、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴおよびＩＣＳ／再刺激アッセイのいずれも、ポジティブコントロールと比較して、顕著な数の、任意のワクチンペプチドに対する反応性Ｔ細胞の存在を示さなかった（図７Ａおよび７Ｃ、後者はＣＤ４＋細胞についてのデータのみを示す）。対照的に、腹腔内免疫後の実験では、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、５つのワクチンペプチドの内の３つに対する反応性Ｔ細胞の存在が示され（図７Ｂ）、およびＩＣＳ／再刺激アッセイにおいてはＣＤ８＋細胞（データは非提示）ではなく、ＩＮＦγおよびＴＮＦ－α ＣＤ４＋細胞（図７Ｄ）の存在を示した。倍の用量のペプチドについて、ＥＬＩＳＰＯＴで最も強いＩＦＮ－γ応答が見られた。

いずれの患者においても、ネオエピトープを含むカクテルワクチンは、適応免疫応答を誘導すると結論付ける事ができる。

Claims (34)

1. 哺乳類患者における腫瘍、例えば悪性腫瘍を処置する方法であって、ここで、該腫瘍は患者における非腫瘍性の細胞は示さないＴ細胞エピトープ（ネオエピトープ）を示し、ここで、該方法は
   １）患者の腫瘍性細胞のネオエピトープのアミノ酸配列を含む少なくとも１つのペプチド（ネオペプチド）、
   ２）溶媒、および
   ３）カチオン性リポソームアジュバント
   を含むリポソーム組成物を免疫学的有効量投与することを含む、方法。
2. 該カチオン性リポソームアジュバントは、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））、およびモノミコリルグリセロール（ＭＭＧ）またはその合成アナログ、例えば３－ヒドロキシ－２－テトラデシル－オクタデカン酸－２，３－ジヒドロキシプロピルエステルなどを含むまたはそれからなる、請求項１に記載の方法。
3. ＤＤＡ：ＭＭＧ比が５：１（ｗ／ｗ）であり、およびＤＤＡ：ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）比が５：１から２０：１（ｗ／ｗ）の間である、請求項２に記載の方法。
4. ＤＤＡ：ＭＭＧ：ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の相対重量が５：１：１である、請求項３に記載の方法。
5. ＤＤＡ：ＭＭＧ：ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の相対重量が２０：４：１である、請求項３に記載の方法。
6. ＮＴＵ（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ ｕｎｉｔ）を欧州薬局方のセクション２．２．１に従って測定した場合に、該少なくとも１つのネオペプチドが
   ５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含む２５ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．４中の１．０ｍｇ／ｍｌネオペプチドが、最大で５０のＮＴＵを呈する、および
   ２５ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．４ および０．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中の０．１ｍｇ／ｍｌのネオペプチドが最大で２５のＮＴＵを呈する、という意味で水溶性である、前述の請求項の何れか１項に記載の方法。
7. 該少なくとも１つのネオペプチドが、複数のネオペプチドおよび５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含む２５ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．４との混合物中に存在している場合に、滅菌濾過の対象にすると、その濃度が最大で５０％の減少を示す、前述の請求項の何れか１項に記載の方法であって、ここで、該複数のペプチドのそれぞれが、滅菌濾過前の混合物中で０．１ｍｇ／ｍｌの濃度である、方法。
8. ネオペプチドの数が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０個のネオペプチドから選択される、前述の請求項の何れか１項に記載の方法。
9. 該少なくとも１つのネオペプチドが、腫瘍細胞において同定されたネオエピトープの中で平均以上、例えば上位４分の１に入る、ＭＨＣ結合安定性を示すネオエピトープを含む、前述の請求項の何れか１項に記載の方法。
10. 該少なくとも１つのネオペプチドがシステイン残基を含まない、前述の請求項の何れか１項に記載の方法。
11. 該少なくとも１つのネオペプチドが、Ｎ末端アミノ酸残基としてＱおよびＮを含まない、前述の請求項の何れか１項に記載の方法。
12. 該少なくとも１つのネオペプチドがＮ末端においてアミノ酸配列ＤＧを含まない、前述の請求項の何れか１項に記載の方法。
13. 該少なくとも１つのネオペプチドがリポソーム組成物中の不連続相と優先的に関連する、前述の請求項の何れか１項に記載の方法。
14. 該少なくとも１つのネオペプチドがリポソーム組成物の連続相中に優先的に溶解される、請求項１－１３の何れか１項に記載の方法。
15. 該免疫学的有効量が患者に複数回投与される、前述の請求項の何れか１項に記載の方法。
16. 別々の投与が少なくとも１日隔てられる、請求項１５に記載の方法。
17. 該溶媒がＴＲＩＳ緩衝液中にＤＭＳＯおよびグリセロールを含む、前述の請求項の何れか１項に記載の方法。
18. 該リポソーム組成物が、１５％未満のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）および約２％（ｖ／ｖ）グリセロール、例えば、１０％以下のＤＭＳＯおよび約２％グリセロール、または５％未満のＤＭＳＯおよび約２％グリセロールを含む、請求項１７に記載の方法。
19. 該リポソーム組成物が、２０から５０ｍＭの間の、例えば１５から１８ｍＭの間の、好ましくは１６．１から１６．４ｍＭの間の濃度のＴＲＩＳを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
20. 該リポソーム組成物が、７．０から７．６の間の範囲の、好ましくは約７．４のｐＨを有する、前述の請求項の何れか１項に記載の方法。
21. 該リポソーム組成物が以下を含む、またはそれからなる前述の請求項の何れか１項に記載の方法：
    １）ネオペプチドあたりの濃度が１００μｇ／ｍｌである複数のネオペプチド
    ２）５％（ｖ／ｖ）未満の濃度である、ＤＭＳＯ
    ３）約１２５０μｇ／ｍｌ ＤＤＡ、
    ４）約２５０μｇ／ｍｌ ＭＭＧ、
    ５）約６２．５μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、
    ６）約２％（ｖ／ｖ）グリセロール、および
    ７）１６．２５ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．４。
22. 投与される各ネオペプチドの免疫学的有効量が少なくとも１０μｇ、例えば、少なくともまたは多くとも１５、少なくともまたは多くとも２０、少なくともまたは多くとも２５、少なくともまたは多くとも３０、少なくともまたは多くとも３５、少なくともまたは多くとも４０、少なくともまたは多くとも４５、少なくともまたは多くとも５０、少なくともまたは多くとも少なくともまたは多くとも５５、少なくともまたは多くとも６０、少なくともまたは多くとも６５、少なくともまたは多くとも７０、少なくともまたは多くとも７５、少なくともまたは多くとも８０、少なくともまたは多くとも８５、少なくともまたは多くとも９０、少なくともまたは多くとも９５、少なくともまたは多くとも１００、少なくともまたは多くとも１０５、少なくともまたは多くとも１１０、少なくともまたは多くとも１１５、少なくともまたは多くとも１２０、少なくともまたは多くとも１２５、少なくともまたは多くとも１３０、少なくともまたは多くとも１３５、少なくともまたは多くとも１４０、少なくともまたは多くとも１４５、少なくともまたは多くとも１５０、少なくともまたは多くとも１５５、少なくともまたは多くとも１６０、少なくともまたは多くとも１６５、少なくともまたは多くとも１７０、少なくともまたは多くとも１７５、少なくともまたは多くとも１８０、少なくともまたは多くとも１８５、少なくともまたは多くとも１９０、少なくともまたは多くとも１９５、少なくともまたは多くとも２００、少なくともまたは多くとも２０５、少なくともまたは多くとも２１０、少なくともまたは多くとも２１５、少なくともまたは多くとも２２０、少なくともまたは多くとも２２５、少なくともまたは多くとも２３０、少なくともまたは多くとも２３５、少なくともまたは多くとも２４０、少なくともまたは多くとも２４５、少なくともまたは多くとも２５０、少なくともまたは多くとも２５５、少なくともまたは多くとも２６０、少なくともまたは多くとも２６５、少なくともまたは多くとも２７０、少なくともまたは多くとも２７５、少なくともまたは多くとも２８０、少なくともまたは多くとも２８５、少なくともまたは多くとも２９０、少なくともまたは多くとも２９５、少なくともまたは多くとも３００、少なくともまたは多くとも３０５、少なくともまたは多くとも３１０、少なくともまたは多くとも３１５、少なくともまたは多くとも３２０、少なくともまたは多くとも３２５、少なくともまたは多くとも３３０、少なくともまたは多くとも３３５、少なくともまたは多くとも３４０、少なくともまたは多くとも３４５、少なくともまたは多くとも３５０、少なくともまたは多くとも３５５、少なくともまたは多くとも３６０、少なくともまたは多くとも３６５、少なくともまたは多くとも３７０、少なくともまたは多くとも３７５、少なくともまたは多くとも３８０、少なくともまたは多くとも３８５、少なくともまたは多くとも３９０、少なくともまたは多くとも３９５、および少なくともまたは多くとも４００μｇである、前述の請求項の何れか１項に記載の方法。
23. 投与される各ペプチドの免疫学的有効量が、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、および４００μｇからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
24. リポソーム組成物の免疫学的有効量が４００から２０００μｌの間、例えば、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１０１０、１０２０、１０３０、１０４０、１０５０、１０６０、１０７０、１０８０、１０９０、１１００、１１１０、１１２０、１１３０、１１４０、１１５０、１１６０、１１７０、１１８０、１１９０、１２００、１２１０、１２２０、１２３０、１２４０、１２５０、１２６０、１２７０、１２８０、１２９０、１３００、１３１０、１３２０、１３３０、１３４０、１３５０、１３６０、１３７０、１３８０、１３９０、１４００、１４１０、１４２０、１４３０、１４４０、１４５０、１４６０、１４７０、１４８０、１４９０、１５００、１５１０、１５２０、１５３０、１５４０、１５５０、１５６０、１５７０、１５８０、１５９０、１６００、１６１０、１６２０、１６３０、１６４０、１６５０、１６６０、１６７０、１６８０、１６９０、１７００、１７１０、１７２０、１７３０、１７４０、１７５０、１７６０、１７７０、１７８０、１７９０、１８００、１８１０、１８２０、１８３０、１８４０、１８５０、１８６０、１８７０、１８８０、１８９０、１９００、１９１０、１９２０、１９３０、１９４０、１９５０、１９６０、１９７０、１９８０、１９９０、および２０００μｌである、前述の請求項の何れか１項に記載の方法。
25. 免疫学的有効量のリポソーム組成物の各投与が少なくとも２回のサブ投与、特に１回の免疫あたり２回のサブ投与である、請求項２４に記載の方法。
26. １０００μｌの２回のサブ投与として、２０００μｌが投与される請求項２５に記載の方法。
27. 免疫原性の組成物の単位用量であって、前記単位用量が、患者の腫瘍性の細胞のネオエピトープのアミノ酸配列、カチオン性リポソームアジュバント、および溶媒を含む、免疫学的有効量の少なくとも１つのペプチド（ネオペプチド）を含む、単位用量。
28. 該組成物が請求項２－２１の何れか１項で定義される、請求項２７に記載の単位用量。
29. 少なくとも１０μｇ、例えば、少なくともまたは多くとも１５、少なくともまたは多くとも２０、少なくともまたは多くとも２５、少なくともまたは多くとも３０、少なくともまたは多くとも３５、少なくともまたは多くとも４０、少なくともまたは多くとも４５、少なくともまたは多くとも５０、少なくともまたは多くとも少なくともまたは多くとも５５、少なくともまたは多くとも６０、少なくともまたは多くとも６５、少なくともまたは多くとも７０、少なくともまたは多くとも７５、少なくともまたは多くとも８０、少なくともまたは多くとも８５、少なくともまたは多くとも９０、少なくともまたは多くとも９５、少なくともまたは多くとも１００、少なくともまたは多くとも１０５、少なくともまたは多くとも１１０、少なくともまたは多くとも１１５、少なくともまたは多くとも１２０、少なくともまたは多くとも１２５、少なくともまたは多くとも１３０、少なくともまたは多くとも１３５、少なくともまたは多くとも１４０、少なくともまたは多くとも１４５、少なくともまたは多くとも１５０、少なくともまたは多くとも１５５、少なくともまたは多くとも１６０、少なくともまたは多くとも１６５、少なくともまたは多くとも１７０、少なくともまたは多くとも１７５、少なくともまたは多くとも１８０、少なくともまたは多くとも１８５、少なくともまたは多くとも１９０、少なくともまたは多くとも１９５、少なくともまたは多くとも２００、少なくともまたは多くとも２０５、少なくともまたは多くとも２１０、少なくともまたは多くとも２１５、少なくともまたは多くとも２２０、少なくともまたは多くとも２２５、少なくともまたは多くとも２３０、少なくともまたは多くとも２３５、少なくともまたは多くとも２４０、少なくともまたは多くとも２４５、少なくともまたは多くとも２５０、少なくともまたは多くとも２５５、少なくともまたは多くとも２６０、少なくともまたは多くとも２６５、少なくともまたは多くとも２７０、少なくともまたは多くとも２７５、少なくともまたは多くとも２８０、少なくともまたは多くとも２８５、少なくともまたは多くとも２９０、少なくともまたは多くとも２９５、少なくともまたは多くとも３００、少なくともまたは多くとも３０５、少なくともまたは多くとも３１０、少なくともまたは多くとも３１５、少なくともまたは多くとも３２０、少なくともまたは多くとも３２５、少なくともまたは多くとも３３０、少なくともまたは多くとも３３５、少なくともまたは多くとも３４０、少なくともまたは多くとも３４５、少なくともまたは多くとも３５０、少なくともまたは多くとも３５５、少なくともまたは多くとも３６０、少なくともまたは多くとも３６５、少なくともまたは多くとも３７０、少なくともまたは多くとも３７５、少なくともまたは多くとも３８０、少なくともまたは多くとも３８５、少なくともまたは多くとも３９０、少なくともまたは多くとも３９５、および少なくともまたは多くとも４００μｇの各ネオペプチドを含み、および好ましくは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、および４００μｇの各ネオペプチドの量から選択される量を含む、請求項２７－２８に記載の単位用量。
30. ４００から２０００μｌの間、例えば、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１０１０、１０２０、１０３０、１０４０、１０５０、１０６０、１０７０、１０８０、１０９０、１１００、１１１０、１１２０、１１３０、１１４０、１１５０、１１６０、１１７０、１１８０、１１９０、１２００、１２１０、１２２０、１２３０、１２４０、１２５０、１２６０、１２７０、１２８０、１２９０、１３００、１３１０、１３２０、１３３０、１３４０、１３５０、１３６０、１３７０、１３８０、１３９０、１４００、１４１０、１４２０、１４３０、１４４０、１４５０、１４６０、１４７０、１４８０、１４９０、１５００、１５１０、１５２０、１５３０、１５４０、１５５０、１５６０、１５７０、１５８０、１５９０、１６００、１６１０、１６２０、１６３０、１６４０、１６５０、１６６０、１６７０、１６８０、１６９０、１７００、１７１０、１７２０、１７３０、１７４０、１７５０、１７６０、１７７０、１７８０、１７９０、１８００、１８１０、１８２０、１８３０、１８４０、１８５０、１８６０、１８７０、１８８０、１８９０、１９００、１９１０、１９２０、１９３０、１９４０、１９５０、１９６０、１９７０、１９８０、１９９０、および２０００μｌからなる、請求項２７－２９の何れか１項に記載の単位用量。
31. ネオペプチドの数が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０から選択される、請求項２７－３０の何れか１項に記載の単位用量。
32. 請求項１－２１の何れか１項で定義される組成物。
33. 医薬としての使用のための請求項２７－３１の何れか１項に記載の単位用量または請求項３２に記載の組成物。
34. 請求項１－２４の何れか１項に記載の方法における使用のための請求項２７－３１の何れか１項に記載の単位用量または請求項３２に記載の組成物。

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