CN111925990B - 一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞及其制备方法 - Google Patents

一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111925990B
CN111925990B CN202010907918.XA CN202010907918A CN111925990B CN 111925990 B CN111925990 B CN 111925990B CN 202010907918 A CN202010907918 A CN 202010907918A CN 111925990 B CN111925990 B CN 111925990B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
muc16
car
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010907918.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN111925990A (zh
Inventor
陈立
贾明明
黎小珠
王旭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Likang Life Technology Co ltd
Original Assignee
Beijing Likang Life Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Likang Life Technology Co ltd filed Critical Beijing Likang Life Technology Co ltd
Priority to CN202010907918.XA priority Critical patent/CN111925990B/zh
Publication of CN111925990A publication Critical patent/CN111925990A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111925990B publication Critical patent/CN111925990B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

本发明公开了一种对卵巢癌的Anti‑MUC16 CAR‑T细胞，包括，Anti‑MUC16的单链抗体的核酸序列、CD8跨膜区核酸序列，4‑1BB胞内信号区核酸序列、CD3Z胞内信号区核酸序列、IL‑12核酸序列。还提供了制备该细胞的方法，（1）Anti‑MUC16 CAR嵌合抗原受体的载体合成；（2）病毒包装及慢病毒滴度的测定；（3）Anti‑MUC16 CAR‑T细胞的制备；（4）Anti‑MUC16 CAR‑T细胞的功能检测。其优点在于，本发明选取抗MUC16特异性跨膜区表位的抗体，结合目前CAR‑T基因手段，制备出能够特异性识别和杀伤卵巢肿瘤的T细胞，有希望为卵巢癌的治愈提供一个新的治疗方法。

Description

一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体为一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞及其制备方法。
背景技术
卵巢癌是一种常见的恶性肿瘤，在全世界范围内致死率较高，由于患者在前期没有明显临床症状，临床缺乏确定的检验手段，通常在确诊时候肿瘤已经恶化，导致该疾病治疗难度大、治愈率较低。MUC16是一种高分子量糖蛋白，是一种跨膜蛋白，目前有科学家认为MUC16是早期诊断卵巢癌的重要肿瘤指标，并广泛应用于临床。近来研究发现，MUC16的异常过表达与卵巢癌的不良预后和发生发展密切相关，MUC16通过与间皮素结合促进卵巢癌远处转移，并且通过抑制肿瘤细胞和免疫细胞形成免疫突触帮助卵巢癌细胞实现免疫逃逸。从而MUC16在卵巢癌中的过表达促进肿瘤细胞的增殖、迁移和转移，促进卵巢癌的发生发展。
嵌合抗原受体T细胞(Chimericantigen receptor T cell,简称：CAR-T)是目前免疫细胞治疗技术常用方法之一，通过提取患者体内的T淋巴细胞，将T淋巴细胞在体外进行基因整合修饰，使T淋巴细胞带有能识别肿瘤细胞并能同时激活T淋巴细胞的嵌合抗体，被改造培养的T细胞进行大量扩增并回输到病人体内，改造的T细胞获得特异性识别和杀伤肿瘤细胞的能力，精准的杀伤肿瘤细胞，最终达到清除肿瘤的效果。但修饰的T细胞可能会表现出过度的活性，导致一些临床副作用和毒性。
如何能够得到特异性识别和精准杀伤，尽量减少副作用和毒性。是本领域技术人员一致探索的方向。
发明内容
为解决现有技术中针对卵巢癌提供一种精准杀伤、尽量减少副作用和毒性的治疗方法的问题，本发明公开了一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞及其制备方法，实现的目的为本发明选取抗MUC16特异性跨膜区表位的抗体，结合目前CAR-T基因手段，制备出能够特异性识别和杀伤卵巢肿瘤的T细胞，有希望为卵巢癌的治愈提供一个新的治疗方法。
为了实现上述目的，本发明公开的技术方案为：本发明提供的一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞，该细胞包括，Anti-MUC16的单链抗体的核酸序列、CD8跨膜区核酸序列，4-1BB胞内信号区核酸序列、CD3Z胞内信号区核酸序列、IL-12核酸序列，所述各核酸序列依次见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。
进一步的，本发明还提供了制备所述CAR-T细胞的方法，包括如下步骤：(1)Anti-MUC16-CAR嵌合抗原受体的载体合成：编码Anti-MUC16的单链抗体的核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.1，编码CD8跨膜区核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.2，编码4-1BB胞内信号区核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.3，编码CD3Z胞内信号区核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.4，编码IL-12核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.5，将scFV-CD8-4-1BB-CD3Z-IL12引进合成到慢病毒表达载体pCDH载体上，通过测序鉴定，从而完成对嵌合抗原受体慢病毒表达载体的构建；
(2)病毒包装及慢病毒滴度的测定：
(21)慢病毒包装：用含质量浓度为10％FBS的DMEM培养液培养慢病毒包装所用的293T细胞处于对数生长期，将其用胰酶进行消化，重新接种于10cm的细胞培养皿，次日，细胞汇率度处于80％-90％，更换新鲜的完全培养基(含质量浓度为10％FBS的DMEM培养液)，取含有scFV-CD8-4-1BB-CD3Z-IL12序列的pCDH-EF1-CAR-IL12穿梭质粒30ug加入至0.5mL无血清DMEM中、取包装质粒PG-p1-VSVG 6ug、PG-p1-RRE 7.5ug与PG-p1-REV 6ug加入至0.5mL无血清DMEM中，混匀，室温静置5min，将两管质粒稀释液轻轻混匀，室温静置20min，将转染混合物逐滴加入至细胞培养皿中，轻轻晃匀后，将293T细胞置于37度、C02培养箱静置培养6小时，6小时后，细胞更换新鲜的的完全培养基(含质量浓度为10％FBS的DMEM培养液)，将细胞置于37度、C02培养箱静置培养48小时，第48小时，收取病毒细胞，离心力400g，离心5min，去除细胞及死细胞碎片，将上清液加入至截留量为100kd的超滤浓缩管中，对慢病毒上清进行浓缩，离心力4000g，4度离心30min，收取病毒浓缩液，分装冻存于-80度超低温冰箱；
(22)慢病毒滴度的测定：24孔板，每孔种10000个3T3细胞，加入含质量浓度为10％FBS的DMEM培养基1毫升，12小时后第一个孔加入500微升的病毒上清，然后三倍梯度往下稀释，做5-6个梯度，3天后用流式细胞仪检测，计算病毒滴度；
(3)Anti-MUC16 CAR-T细胞的制备：
(31)外周血单个核细胞的分离：抽取卵巢癌病人外周全血至肝素钠真空采血管，将抗凝全血进行离心，2000g，室温离心10min，去除自体血浆，细胞沉淀加入PBS+0.5％HSA进行稀释到终体积20mL，充分混匀，将人外周血淋巴细胞分离管按800g，室温离心1min，用25ml移液管吸取稀释后血液，缓慢加到人外周血淋巴细胞分离管中，800g，4℃离心15min，分离PBMC，用10ml移液管吸取并弃去上层澄清的液体，之后缓慢将PBMC层转入到新的50ml离心管内，补充PBS+0.5％HSA至50ml，混匀，400g，升5降5，4℃离心10min，清洗PBMC，弃上清，用10ml移液管吸取20ml PBS+质量浓度为0.5％HSA重悬细胞，吹打混匀，细胞计数后，400g，离心10min，加入冻存液，进行细胞冻存；
(32)取新鲜或复苏过夜的PBMC细胞，使用anti-Human-CD3抗体对细胞进行表面染色，流式上机检测，计算CD3+T淋巴细胞比例，获得CD3+T淋巴细胞总数，使用CD3/CD28免疫磁珠与CD3+T淋巴细胞进行混合，数量比例为磁珠：CD3+T淋巴细胞＝3:1，翻转摇床上室温反应30min，使用磁铁去除上清悬液,加入2mL X-VIVO-15培养液，其中包含100U/mL的IL-2细胞因子，吹打混匀后，将细胞与磁珠结合物，同时加入细胞培养板中，置于37度培养箱培养；
(33)第二天，富集获得的CD3+细胞进行计数，按每105细胞数加入0.1mL慢病毒上清，补X-VIVO培养基(含100U/mL IL-2)400ul，并加入终浓度为8ug/mL的polybrene至感染细胞孔，对细胞进行离心感染，1500g，30度，离心1.5小时，离心完毕后，将培养板置于CO2培养箱培养5小时，然后补足X-VIVO培养基(含100U/mL IL-2)至2mL，CO2培养箱培养过夜，次日换液处理，后面根据细胞生长情况进行细胞计数与CAR-T细胞的功能检测；
(4)Anti-MUC16 CAR-T细胞的功能检测：Anti-MUC16 CAR-T细胞与蛋白结合能力的检测：通过瞬时转染pTT5-MUC16-Flag质粒至293T细胞，使得293T培养上清能分泌表达MUC16-Flag蛋白，培养上清经过浓缩、定量后，获得MUC16-Flag蛋白粗品，分别取105的CAR-T细胞与MOCK-T细胞，与MUC16-Flag蛋白粗品100uL进行4度孵育30min，加入1mL含2％牛血清的PBS清洗细胞，400g，室温离心5min，弃上清；加入2uL anti-Flag-APC流式抗体4度孵育15min，加入1mL含2％牛血清的PBS清洗细胞，400g，室温离心5min，弃上清；加入200uL含2％牛血清的PBS重悬细胞，流式上机检测阳性CAR-T细胞的表达率。
综上，本发明所具有的益效果包括：本发明提供的抗MUC16单链抗体是抗特异性跨膜区的结合部位，特异性强，杀伤卵巢肿瘤细胞精准，其嵌合抗原受体T细胞可以转移识别MUC16的恶性肿瘤细胞，具有较强的特异性，并且嵌合抗原受体在目前现有基础上，加入外源IL-12分泌刺激，以解除体内免疫抑制微环境，增强嵌合抗原受体抗肿瘤的功能。
附图说明
图1为本发明Anti-MUC16-CAR嵌合抗原受体结构示意图；
图2为本发明Anti-MUC16-CAR嵌合抗原受体表达载体图谱；
图3为本发明Anti-MUC16-CAR T细胞未与MUC16-Flag蛋白结合的流式实验图；
图4为本发明Anti-MUC16-CAR T细胞与MUC16-Flag蛋白结合的流式实验图；
图5为本发明未过表达MUC16-GFP基因的靶细胞SKOV3的流式实验图；
图6为本发明稳定过表达MUC16-GFP基因的靶细胞SKOV3的流式实验图；
图7为本发明MOCK-T细胞与CAR-T-IL12细胞对靶细胞SKOV3与SKOV3-MUC16-GFP杀伤效果的实验图；
图8为本发明MOCK-T细胞与CAR-T-IL12细胞对靶细胞SKOV3与SKOV3-MUC16-GFP在杀伤过程中释放的干扰素γ(IFN-γ)含量对比图；
图9为本发明MOCK-T细胞与CAR-T-IL12细胞对人树突状细胞DCS杀伤效果的实验图；
图10为本发明MOCK-T细胞与CAR-T-IL12细胞人卵巢正常上皮细胞IOSE80杀伤效果的实验图；
图11为本发明MOCK-T细胞与CAR-T-IL12细胞对人卵巢微血管内皮细胞HOMEC杀伤效果的实验图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。在没有特殊说明的情况下，本发明的操作采用的均是现有技术。
实施例一：本发明提供的一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞，该细胞包括，Anti-MUC16的单链抗体的核酸序列、CD8跨膜区核酸序列，4-1BB胞内信号区信号区核酸序列、CD3Z胞内信号区区核酸序列、IL-12核酸序列，所述各核酸序列依次见SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。
上述细胞制备方法包括：(1)Anti-MUC16-CAR嵌合抗原受体的载体合成：编码Anti-MUC16的单链抗体的核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.1，编码CD8跨膜区核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.2，编码4-1BB胞内信号区核酸序列，编码的该序列见SEQ IDNO.3，编码CD3Z胞内信号区核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.4，编码IL-12核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.5，将scFV-CD8-4-1BB-CD3Z-IL12引进合成到慢病毒表达载体pCDH载体上，通过测序鉴定，构建的所述嵌合抗原受体的结构如图1所示，其构建的表达载体图谱如图2所示，从而完成对嵌合抗原受体慢病毒表达载体的构建，该构建方法可采用现有技术任意一种方法，利用分子克隆技术，双酶切pCDH表达载体和scFV-CD8-4-1BB-CD3Z-IL12，再使用T4连接酶将二者进行连接，完成嵌合抗原受体慢病毒表达载体的构建。
(2)病毒包装及慢病毒滴度的测定：
(21)慢病毒包装：用含质量浓度为10％FBS的DMEM培养液培养慢病毒包装所用的293T细胞处于对数生长期，将其用胰酶进行消化，重新接种于10cm的细胞培养皿，次日，细胞汇率度处于80％-90％，更换新鲜的完全培养基(含质量浓度为10％FBS的DMEM培养液)，取含有scFV-CD8-4-1BB-CD3Z-IL12序列的pCDH-EF1-CAR-IL12穿梭质粒30ug加入至0.5mL无血清DMEM中、取包装质粒PG-p1-VSVG 6ug、PG-p1-RRE 7.5ug与PG-p1-REV 6ug加入至0.5mL无血清DMEM中，混匀，室温静置5min，将两管质粒稀释液轻轻混匀，室温静置20min，将转染混合物逐滴加入至细胞培养皿中，轻轻晃匀后，将293T细胞置于37度、C02培养箱静置培养6小时，6小时后，细胞更换新鲜的的完全培养基(含质量浓度为10％FBS的DMEM培养液)，将细胞置于37度、C02培养箱静置培养48小时，第48小时，收取病毒细胞，离心力400g，离心5min，去除细胞及死细胞碎片，将上清液加入至截留量为100kd的超滤浓缩管中，对慢病毒上清进行浓缩，离心力4000g，4度离心30min，收取病毒浓缩液，分装冻存于-80度超低温冰箱；
(22)慢病毒滴度的测定：24孔板，每孔种10000个3T3细胞，加入含质量浓度为10％FBS的DMEM培养基1毫升，12小时后第一个孔加入500微升的病毒上清，然后三倍梯度往下稀释，做5-6个梯度，3天后用流式细胞仪检测，计算病毒滴度；
(3)Anti-MUC16 CAR-T细胞的制备：
(31)外周血单个核细胞的分离：抽取卵巢癌病人外周全血至肝素钠真空采血管，将抗凝全血进行离心，2000g，室温离心10min，去除自体血浆，细胞沉淀加入PBS+0.5％HSA进行稀释到终体积20mL，充分混匀，将人外周血淋巴细胞分离管按800g，室温离心1min，用25ml移液管吸取稀释后血液，缓慢加到人外周血淋巴细胞分离管中，800g，4℃离心15min，分离PBMC，用10ml移液管吸取并弃去上层澄清的液体，之后缓慢将PBMC层转入到新的50ml离心管内，补充PBS+0.5％HSA至50ml，混匀，400g，升5降5，4℃离心10min，清洗PBMC，弃上清，用10ml移液管吸取20ml PBS+质量浓度为0.5％HSA重悬细胞，吹打混匀，细胞计数后，400g，离心10min，加入冻存液，进行细胞冻存；
(32)取新鲜或复苏过夜的PBMC细胞，使用anti-Human-CD3抗体对细胞进行表面染色，流式上机检测，计算CD3+T淋巴细胞比例，获得CD3+T淋巴细胞总数，使用CD3/CD28免疫磁珠与CD3+T淋巴细胞进行混合，数量比为磁珠：CD3+T淋巴细胞＝3:1，翻转摇床上室温反应30min，使用磁铁去除上清悬液,加入2mL X-VIVO-15培养液，其中包含100U/mL的IL-2细胞因子，吹打混匀后，将细胞与磁珠结合物，同时加入细胞培养板中，置于37度培养箱培养；
(33)第二天，富集获得的CD3+细胞进行计数，按每105细胞数加入0.1mL慢病毒上清，补X-VIVO培养基(含100U/mL IL-2)400ul，并加入终浓度为8ug/mL的polybrene至感染细胞孔，对细胞进行离心感染，1500g，30度，离心1.5小时，离心完毕后，将培养板置于CO2培养箱培养5小时，然后补足X-VIVO培养基(含100U/mL IL-2)至2mL，CO2培养箱培养过夜，次日换液处理，后面根据细胞生长情况进行细胞计数与CAR-T细胞的功能检测；
(4)Anti-MUC16 CAR-T细胞的功能检测：Anti-MUC16 CAR-T胞与蛋白结合能力的检测：通过瞬时转染pTT5-MUC16-Flag质粒至293T细胞，使得293T培养上清能分泌表达MUC16-Flag蛋白，培养上清经过浓缩、定量后，获得MUC16-Flag蛋白粗品，分别取105的CAR-T细胞与MOCK-T细胞，与MUC16-Flag蛋白粗品100uL进行4度孵育30min，加入1mL含2％牛血清的PBS清洗细胞，400g，室温离心5min，弃上清；加入2uL anti-Flag-APC流式抗体4度孵育15min，加入1mL含2％牛血清的PBS清洗细胞，400g，室温离心5min，弃上清；加入200uL含2％牛血清的PBS重悬细胞，流式上机检测阳性CAR-T细胞的表达率。以此来检测Anti-MUC16CAR-T细胞是否构建成功，其结果如图3、图4所示，由图3、图4可以看出Anti-MUC16 CAR-T细胞已经成功表达Anti-MUC16-CAR分子，表达率约为43％。
以下为Anti-MUC16 CAR-T细胞体外抗肿瘤效果的检测：
1.1过表达MUC16的卵巢癌细胞系SKOV3的构建：使用pCDH-MUC16-GFP慢病毒穿梭质粒20ug与包装质粒PG-p1-VSVG 6ug、PG-p1-RRE 7.5ug与PG-p1-REV 6ug通过共转染293T一个10cm平皿细胞，48小时收获慢病毒。使用慢病毒原液1:1稀释感染SKOV3细胞，2天后收细胞，流式上机检测GFP的表达。通过单克隆筛选与检测，获得稳定过表达MUC16的卵巢癌细胞系SKOV3，同时带有GFP荧光标签，用于后续的检测，完成靶细胞SKOV3-MUC16-GFP的构建，其结果如图5、图6所示。
1.2CCK-8细胞增殖法检测Anti-MUC16 CAR-T细胞的杀伤效果：
按细胞数10000个细胞/孔接种靶细胞SKOV3-MUC16-GFP于96孔平底培养板，细胞贴壁过夜。拍干培养板，并按T:E 1:0、1:1、1:5、1:10、1:20、1:50加入Anti-MUC16 CAR-T细胞和未感染慢病毒的MOCK-T细胞，37度共培养24小时。甩干板子，加入200ul PBS洗净残余死细胞，弃上清，重复洗板3遍，拍干。加入含10％CCK-8溶液的X-VIVO培养基100uL/孔，置于CO2培养箱孵育1.5小时，培养板在酶标仪OD450nm处读数。杀伤率＝1-(靶细胞加效应细胞实验组OD值)/(靶细胞对照组OD值)，通过计算并与MOCK-T组比较杀伤率，得到Anti-MUC16CAR-T具有明显杀伤卵巢癌SKOV3-MUC16-GFP靶细胞的能力，其结果如图7所见。
1.3杀伤共培养体系中的释放的细胞因子干扰素γ(IFN-γ)水平检测：
使用达科为人IFN-γElisa Kit(货号：1110002)对杀伤的共培养体系上清中IFN-γ因子进行检测。加样：100uL/well加入稀释后的Cytokine standard至标准品孔，样品使用Dilution Buffer稀释10倍，100uL/well加入样本至样本孔，100L/well加入DilutionbufferR(1×)至空白对照。加检测抗体：50uL/well加入Biotinylated antibody工作液，混匀后盖上封板膜，室温(18-25℃)孵育2小时。洗板：扣去孔内液体，300uL/well加入1×Washing buffer工作液；停留1分钟后弃去孔内液体。重复3次，每一次在滤纸上扣干。加酶：100uL/well加入Streptavidin-HRP工作液，盖上封板膜，室温(18-25℃)孵育20分钟。重复洗板步骤3遍，显色：100uL/well加入TMB，室温(18-25℃)避光孵育5-30分钟，根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应。通常显色10-20分钟可以达到很好的效果。终止反应100uL/well迅速加入Stop solution终止反应。使用酶标仪OD450nm处读板，计算IFN-γ浓度。Anti-MUC16-CAR-T细胞组效靶比越高的细胞上清分泌的IFN-γ的浓度水平越高，同时对比MOCK-T组，明显高于MOCK-T组，Anti-MUC16-CAR-T细胞具有明显杀伤靶细胞SKOV3-MUC16-GFP的能力，其结果如图8所示。
1.4使用CCK-8法对Anti-MUC16 CAR-T细胞对人正常细胞的毒副作用检测：
按细胞数10000个细胞/孔分别接种人卵巢微血管内皮细胞HOMEC、人卵巢正常上皮细胞IOSE80、人树突状细胞DCS于96孔平底培养板，细胞贴壁过夜。拍干培养板，并按T:E1:0、1:1、1:5、1:10加入Anti-MUC16 CAR-T细胞和未感染慢病毒的MOCK-T细胞，37度共培养24小时。甩干板子，加入200ul PBS洗净残余死细胞，弃上清，重复洗板3遍，拍干。加入含10％CCK-8溶液的X-VIVO培养基100uL/孔，置于CO2培养箱孵育1.5小时，培养板在酶标仪OD450nm处读数。杀伤率＝1-(靶细胞加效应细胞实验组OD值)/(靶细胞对照组OD值)，通过计算并与MOCK-T组比较杀伤率。CAR-T细胞对三种人正常细胞无明显杀伤作用，CAR-T的毒副作用较小，其结果如9-11所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京立康生命科技有限公司
<120> 一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞及其制备方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 750
<212> DNA
<213> Anti-MUC16的单链抗体的核酸序列(Homo sapiens)
<400> 1
gtgaagctgc aggagtcagg gggaggcttc gtgaagcctg gagggtccct caaagtctcc 60
tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatgccatgt cctgggttcg cctgagtccg 120
gagatgaggc tggagtgggt cgcaaccatt agcagtgctg gtggttacat cttctattct 180
gacagtgtgc agggacgatt caccatttcc agagacaatg ccaagaacac cctgcacctg 240
caaatgggca gtctgaggtc tggggacacg gccatgtatt actgtgcaag gcagggattt 300
ggtaactacg gtgattacta tgctatggac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360
tcctcaggtg gaggtggatc aggtggaggt ggatctggtg gaggtggatc tgacattgag 420
ctcacccagt ctccatcctc cctggctgtg tcagcaggag agaaggtcac tatgagctgc 480
aaatccagtc agagtctgct caacagtaga acccgaaaga accagttggc ttggtaccag 540
caaaaaccag gacagtctcc tgaactgctg atctactggg catccactag gcaatctgga 600
gtccctgatc gcttcacagg cagtggatct gggacagatt tcactctcac catcagcagt 660
gtgcaggctg aagacctggc agtttattac tgccagcaat cttataatct actcacgttc 720
ggtcctggga ccaagctgga gatcaaacgg 750
<210> 2
<211> 258
<212> DNA
<213> CD8跨膜区核酸序列(Homo sapiens)
<400> 2
gcggccgcat tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 60
ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 120
cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 180
atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 240
tactgcaacc acaggaac 258
<210> 3
<211> 126
<212> DNA
<213> 4-1BB胞内信号区核酸序列(Homo sapiens)
<400> 3
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 4
<211> 336
<212> DNA
<213> CD3Z胞内信号区核酸序列(Homo sapiens)
<400> 4
agagtgaagt tcagcaggag cgcagagccc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 5
<211> 1623
<212> DNA
<213> IL-12核酸序列(Homo sapiens)
<400> 5
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagtggtggc ggtggaagcg gcggtggcgg aagcggcggt 1020
ggcggcagca gaaacctccc cgtggccact ccagacccag gaatgttccc atgccttcac 1080
cactcccaaa acctgctgag ggccgtcagc aacatgctcc agaaggccag acaaactcta 1140
gaattttacc cttgcacttc tgaagagatt gatcatgaag atatcacaaa agataaaacc 1200
agcacagtgg aggcctgttt accattggaa ttaaccaaga atgagagttg cctaaattcc 1260
agagagacct ctttcataac taatgggagt tgcctggcct ccagaaagac ctcttttatg 1320
atggccctgt gccttagtag tatttatgaa gacttgaaga tgtaccaggt ggagttcaag 1380
accatgaatg caaagcttct gatggatcct aagaggcaga tctttctaga tcaaaacatg 1440
ctggcagtta ttgatgagct gatgcaggcc ctgaatttca acagtgagac tgtgccacaa 1500
aaatcctccc ttgaagaacc ggatttttat aaaactaaaa tcaagctctg catacttctt 1560
catgctttca gaattcgggc agtgactatt gatagagtga tgagctatct gaatgcttcc 1620
taa 1623

Claims (1)

1.一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞，其特征在于，该细胞包括，Anti-MUC16的单链抗体的核酸序列、CD8跨膜区核酸序列，4-1BB胞内信号区核酸序列、CD3Z胞内信号区核酸序列、IL-12核酸序列，所述各核酸序列依次见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；
所述CAR-T细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)Anti-MUC16-CAR嵌合抗原受体的载体合成：编码Anti-MUC16的单链抗体的核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.1，编码CD8跨膜区核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.2，编码4-1BB胞内信号区核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.3，编码CD3Z胞内信号区核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.4，编码IL-12核酸序列，编码的该序列见SEQ ID NO.5，将scFV-CD8-4-1BB-CD3Z-IL12引进合成到慢病毒表达载体pCDH载体上，通过测序鉴定，从而完成对嵌合抗原受体慢病毒表达载体的构建；
(2)病毒包装及慢病毒滴度的测定：
(2-1)慢病毒包装：用含质量浓度为10％FBS的DMEM培养液培养慢病毒包装所用的293T细胞处于对数生长期，将其用胰酶进行消化，重新接种于10cm的细胞培养皿，次日，细胞汇率度处于80％-90％，更换新鲜的完全培养基，含质量浓度为10％FBS的DMEM培养液，取含有scFV-CD8-4-1BB-CD3Z-IL12序列的pCDH-EF1-CAR-IL12穿梭质粒30 μ g 加入至0.5mL无血清DMEM中、取包装质粒PG-p1-VSVG 6 μ g 、PG-p1-RRE 7.5 μ g 与PG-p1-REV 6 μ g 加入至0.5mL无血清DMEM中，混匀，室温静置5min，将两管质粒稀释液轻轻混匀，室温静置20min，将转染混合物逐滴加入至细胞培养皿中，轻轻晃匀后，将293T细胞置于37度、C02培养箱静置培养6小时，6小时后，细胞更换新鲜的的完全培养基，含质量浓度为10％FBS的DMEM培养液，将细胞置于37度、C02培养箱静置培养48小时，第48小时，收取病毒细胞，离心力400g，离心5min，去除细胞及死细胞碎片，将上清液加入至截留量为100kd的超滤浓缩管中，对慢病毒上清进行浓缩，离心力4000g，4度离心30min，收取病毒浓缩液，分装冻存于-80度超低温冰箱；
(2-2)慢病毒滴度的测定：24孔板，每孔种10000个3T3细胞，加入含质量浓度为10％FBS的DMEM培养基1毫升，12小时后第一个孔加入500微升的病毒上清，然后三倍梯度往下稀释，做5-6个梯度，3天后用流式细胞仪检测，计算病毒滴度；
(3)Anti-MUC16 CAR-T细胞的制备：
(3-1)外周血单个核细胞的分离：抽取卵巢癌病人外周全血至肝素钠真空采血管，将抗凝全血进行离心，2000g，室温离心10min，去除自体血浆，细胞沉淀加入PBS+0.5％HSA进行稀释到终体积20mL，充分混匀，将人外周血淋巴细胞分离管按800g，室温离心1min，用25ml移液管吸取稀释后血液，缓慢加到人外周血淋巴细胞分离管中，800g，4℃离心15min，分离PBMC，用10ml移液管吸取并弃去上层澄清的液体，之后缓慢将PBMC层转入到新的50ml离心管内，补充PBS+0.5％HSA至50ml，混匀，400g，升5降5，4℃离心10min，清洗PBMC，弃上清，用10ml移液管吸取20ml PBS+质量浓度为0.5％HSA重悬细胞，吹打混匀，细胞计数后，400g，离心10min，加入冻存液，进行细胞冻存；
(3-2)取新鲜或复苏过夜的PBMC细胞，使用anti-Human-CD3抗体对细胞进行表面染色，流式上机检测，计算CD3+T淋巴细胞比例，获得CD3+T淋巴细胞总数，使用CD3/CD28免疫磁珠与CD3+T淋巴细胞进行混合，数量比为磁珠：CD3+T淋巴细胞＝3:1，翻转摇床上室温反应30min，使用磁铁去除上清悬液,加入2mL X-VIVO-15培养液，其中包含100U/mL的IL-2细胞因子，吹打混匀后，将细胞与磁珠结合物，同时加入细胞培养板中，置于37度培养箱培养；
(3-3)第二天，富集获得的CD3+细胞进行计数，按每105细胞数加入0.1mL慢病毒上清，补X-VIVO培养基，含100U/mL IL-2 400 μ l ，并加入终浓度为8 μ g /mL的polybrene至感染细胞孔，对细胞进行离心感染，1500g，30度，离心1.5小时，离心完毕后，将培养板置于CO2培养箱培养5小时，然后补足X-VIVO培养基，含100U/mL IL-2至2mL，CO2培养箱培养过夜，次日换液处理，后面根据细胞生长情况进行细胞计数与CAR-T细胞的功能检测；
(4)Anti-MUC16 CAR-T细胞的功能检测：Anti-MUC16 CAR-T细胞与蛋白结合能力的检测：通过瞬时转染pTT5-MUC16-Flag质粒至293T细胞，使得293T培养上清能分泌表达MUC16-Flag蛋白，培养上清经过浓缩、定量后，获得MUC16-Flag蛋白粗品，分别取105的CAR-T细胞与MOCK-T细胞，与MUC16-Flag蛋白粗品100 μ L 进行4度孵育30min，加入1mL含2％牛血清的PBS清洗细胞，400g，室温离心5min，弃上清；加入2 μ L anti-Flag-APC流式抗体4度孵育15min，加入1mL含2％牛血清的PBS清洗细胞，400g，室温离心5min，弃上清；加入200 μ L 含2％牛血清的PBS重悬细胞，流式上机检测阳性CAR-T细胞的表达率。
CN202010907918.XA 2020-09-02 2020-09-02 一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞及其制备方法 Active CN111925990B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010907918.XA CN111925990B (zh) 2020-09-02 2020-09-02 一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010907918.XA CN111925990B (zh) 2020-09-02 2020-09-02 一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111925990A CN111925990A (zh) 2020-11-13
CN111925990B true CN111925990B (zh) 2022-08-26

Family

ID=73310142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010907918.XA Active CN111925990B (zh) 2020-09-02 2020-09-02 一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111925990B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112553289A (zh) * 2020-12-17 2021-03-26 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) 一种评价car-t细胞有效性的方法
CN114908033A (zh) * 2022-04-18 2022-08-16 广东莱迪生物医药研究院有限公司 一种大批量磁珠分选细胞的方法
CN115819613B (zh) * 2022-05-10 2023-10-20 四川大学华西医院 基于msln前体蛋白构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用
CN115322968A (zh) * 2022-09-21 2022-11-11 东莞市东南部中心医院 一种car-t细胞的培养体系及应用和培养方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL298125A (en) * 2013-02-26 2023-01-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Preparations and methods for immunotherapy
EP3661954B1 (en) * 2017-08-03 2022-02-09 Amgen Inc. Interleukin-21 muteins and methods of treatment
CN110527667A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向muc16的嵌合抗原受体和嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110526974A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向muc16的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
EP3827013A4 (en) * 2018-07-26 2022-05-25 TCR2 Therapeutics Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TCR REPROGRAMMING USING TARGET-SPECIFIC FUSION PROTEINS
CN113166268A (zh) * 2018-12-19 2021-07-23 瑞泽恩制药公司 双特异性抗muc16 x抗cd28抗体以及其用途
CN111234032B (zh) * 2019-12-12 2021-07-23 首都医科大学附属北京妇产医院 用于治疗卵巢癌的双靶点嵌合抗原受体及制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111925990A (zh) 2020-11-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111925990B (zh) 一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞及其制备方法
CN106636090B (zh) 人源白细胞介素6的siRNA、重组表达CAR-T载体及其构建方法和应用
JP2021522860A (ja) キメラ抗原受容体で修飾されたγδ Ｔ細胞を生産する方法
CN109111525B (zh) 一种hla-g嵌合抗原受体、编码序列和表达载体以及应用
CN112098660A (zh) 新型冠状病毒中和性抗体检测试剂盒
CN112521502A (zh) 一种抗IL-13Rα2的纳米抗体及其编码序列和应用
CN112251412B (zh) 一种靶向bcma的嵌合抗原受体t细胞及其应用
CN114230658A (zh) 新型冠状病毒特异性t细胞受体和其用途
CN112626027A (zh) 一种Treg细胞培养方法
CN111171160A (zh) 基于TGF-β改造的嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞
CN113604507A (zh) 靶向胃癌细胞特异性高表达蛋白msln的car载体及其构建方法和应用
CN114957484A (zh) 靶向实体肿瘤细胞b7-h3蛋白的car载体、car-t细胞及其构建方法和应用
CN111073858A (zh) 一种yap1基因修饰的间充质干细胞及其制备方法
CN113652452A (zh) 靶向卵巢癌细胞特异性高表达蛋白b7-h3的car载体及其构建方法和应用
US7731969B1 (en) Methods for developing and producing antigen-specific antibody-producing cells
CN110093376B (zh) 一种lrfft1细胞的构建方法
WO2023083224A1 (en) The construction of a new virus vector packaging cell line of high productivity
CN109232742B (zh) 一种嵌合抗原受体及其应用
CN114671957A (zh) 一种靶向实体瘤的car-t细胞的构建方法和应用
CN108107204B (zh) 一种检测car-t细胞数的方法
CN113832190A (zh) 一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法及其应用
CN112725273A (zh) 一种nk细胞及其制备方法和应用
CN116286656A (zh) 一种分泌ctla-4纳米抗体靶向fap新型car t细胞制备方法和应用
CN111286512A (zh) 靶向人源化酪氨酸激酶孤儿受体1的嵌合抗原受体及其用途
CN116445416B (zh) 一种基因修饰的car-nk细胞及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant