CN105695497B - 一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法及其应用。本发明公开一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法，是将重组融合蛋白和脑膜炎奈瑟球菌O‑寡糖转移酶PglL在O‑抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达，脑膜炎奈瑟球菌O‑寡糖转移酶PglL将细菌自身的多糖或外源多糖连接到重组融合蛋白上，得到细菌多糖修饰的重组融合蛋白。采用本发明的方法制备的细菌多糖修饰的重组融合蛋白免疫小鼠，可获得抗细菌多糖的特异性抗体，将这种细菌多糖修饰的重组融合蛋白用于细菌多糖蛋白结合疫苗的制备，可以避免病原菌培养的诸多问题，提高疫苗的均一性以及生产效率，降低疫苗制备的成本。

Description

一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种多糖修饰蛋白的制备方法及其应用；特别涉及一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法及其应用，属于生物医药领域。
背景技术
病原菌的O多糖(OPS)、荚膜多糖(CPS)等往往是其重要的保护性抗原，如大肠杆菌的O157型OPS，霍乱弧菌的O1型、O139型OPS，肺炎链球菌的4型、6B型、9V型、14型、18C型、19F型、23F型CPS等，金黄色葡萄球菌的CP5型和CP8型CPS，等等。许多针对多糖的抗体为病原菌的中和抗体，因此多糖疫苗的研发一直是细菌疫苗研发的重点之一。
肺炎多糖疫苗、脑膜炎多糖疫苗、流感嗜血杆菌多糖疫苗、伤寒Vi多糖疫苗等一批多糖疫苗已经上市多年。但多糖疫苗的免疫记忆和免疫原性较弱，特别是在2岁以下儿童和老年人体内尤为突出。现在这类疫苗的研发重点已转向多糖-蛋白结合疫苗，其中7价肺炎多糖-蛋白结合疫苗、4价脑膜炎结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗已经上市，一批多糖-蛋白结合疫苗正处于不同的研发阶段。但是，多糖-蛋白结合疫苗采用化学法制备，包括以下步骤：①大规模培养病原菌(或其疫苗株)，从中提取多糖；②制备并提纯白喉、破伤风等毒素蛋白，灭活后作为载体蛋白；③通过化学方法交联多糖和载体蛋白；④再次纯化交联的多糖-蛋白结合物制备疫苗。该过程存在以下问题：①大规模培养病原菌弱毒的疫苗株提取多糖存在一定安全风险，有时需要负压厂房，而对烈性病原体，往往只有在获得病原菌的减毒株后，才能通过大规模培养提取多糖；②通过化学方法提取的多糖为混合物，纯度较低，质控困难，易引起副反应；③多糖与载体蛋白交联为随机过程，产物均一性差，纯化和质量控制困难；④生产过程步骤多，得率低，成本高。
近些年来，随着测序技术和生物信息学的发展，在多种细菌中发现了天然的蛋白质糖基化修饰***，如空肠弯曲弧菌的N-糖基化修饰***、奈瑟球菌和绿脓杆菌的O-糖基化修饰***，这些糖基化修饰***中，多糖的合成途径与细菌的脂多糖和荚膜多糖的合成途径十分相似，多糖结构取决于糖基合成基因簇，而其寡糖转移酶对其转移的多糖专一性较低。其中空肠弯曲弧菌N-糖基化修饰***中的寡糖转移酶PglB对多糖底物的要求为多糖还原末端第一位糖基的C2位必须有乙酰氨基，且第二位糖基不能以β(1-4)糖苷键与其连接。而脑膜炎奈瑟球菌O-糖基化修饰***中的寡糖转移酶PglL对多糖底物无类似的要求，PglL能将还原末端第一位糖基C2位无乙酰氨基的多糖转移至蛋白的糖基化位点上，因此具有更广泛的应用前景。但目前关于PglL对蛋白底物特异性的研究较少，目前其已知的底物仅为奈瑟球菌菌毛蛋白PilE，这限制了其用于多糖修饰蛋白疫苗的制备。
发明内容
本发明的目的是提供一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法及其应用。
本发明提供一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法，是将重组融合蛋白和脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL在O-抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达，脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL将细菌自身的多糖或外源多糖连接到重组融合蛋白上，得到细菌多糖修饰的重组融合蛋白；
所述重组融合蛋白含有N端信号肽、具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段和载体蛋白序列；
所述载体蛋白为细菌毒素蛋白的无毒突变体或细菌毒素蛋白的部分片段；
所述具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段位于所述载体蛋白序列的N端或C端；
所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的氨基酸序列如SEQ ID No.26所示，或其具有类似功能的突变体；
所述细菌多糖修饰的重组融合蛋白为细菌自身的多糖修饰的重组融合蛋白或外源多糖修饰的重组融合蛋白；
所述O-抗原连接酶基因缺陷使得O抗原多糖不能连接到类脂A-核心寡糖上，从而不能形成脂多糖。
上述方法中，所述信号肽可以是PelB、DsbA、STⅡ、OmpA、PhoA、LamB、SpA、Enx等信号肽，本发明采用的是DsbA信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.32中自N端起第1位至第19位所示；
所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点为脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第63位的丝氨酸；
所述具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段为含有脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第63位丝氨酸的脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的肽段，具体为至少含有脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第55至第66位氨基酸的任意肽段，更具体为如下任一所示：
(1)SEQ ID No.32中自N端起第128位至第156位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；
(2)SEQ ID No.34中自N端起第128位至第154位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；
(3)SEQ ID No.36中自N端起第128位至第152位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；
(4)SEQ ID No.38中自N端起第128位至第150位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；
(5)SEQ ID No.40中自N端起第128位至第149位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；
(6)SEQ ID No.48中自N端起第22位至第40位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；
(7)SEQ ID No.50中自N端起第22位至第36位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；
(8)SEQ ID No.52中自N端起第22位至第33位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列。
上述任一所述的方法中，所述细菌毒素蛋白的无毒突变体为绿脓杆菌外毒素蛋白A无毒突变体；
所述细菌毒素蛋白的部分片段为霍乱毒素B亚单位或破伤风毒素C蛋白；
所述绿脓杆菌外毒素A无毒突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.46中自N端起第20位至第631位所示；
所述霍乱毒素B亚单位的氨基酸序列如SEQ ID No.32中自N端起第20位至第122位所示；
所述破伤风毒素C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.60中自N端起第20位至第455位所示。
上述任一所述的方法中，所述重组融合蛋白的氨基酸序列为如下任一所示：
(1)SEQ ID No.32所示的氨基酸序列；
(2)SEQ ID No.34所示的氨基酸序列；
(3)SEQ ID No.36所示的氨基酸序列；
(4)SEQ ID No.38所示的氨基酸序列；
(5)SEQ ID No.40所示的氨基酸序列；
(6)SEQ ID No.46所示的氨基酸序列；
(7)SEQ ID No.48所示的氨基酸序列；
(8)SEQ ID No.50所示的氨基酸序列；
(9)SEQ ID No.52所示的氨基酸序列；
(10)SEQ ID No.56所示的氨基酸序列；
(11)SEQ ID No.58所示的氨基酸序列；
(12)SEQ ID No.60所示的氨基酸序列。
上述任一所述的方法中，所述重组融合蛋白是通过重组表达载体导入所述细菌中的，所述重组表达载体是将所述重组融合蛋白的编码基因***pMMB66EH的多克隆位点间得到的；
所述重组融合蛋白的编码基因如下：
(1)所述重组融合蛋白为SEQ ID No.32所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQID No.31所示；
(2)所述重组融合蛋白为SEQ ID No.34所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQID No.33所示；
(3)所述重组融合蛋白为SEQ ID No.36所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQID No.35所示；
(4)所述重组融合蛋白为SEQ ID No.38所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQID No.37所示；
(5)所述重组融合蛋白为SEQ ID No.40所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQID No.39所示；
(6)所述重组融合蛋白为SEQ ID No.46所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQID No.45所示；
(7)所述重组融合蛋白为SEQ ID No.48所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQID No.47所示；
(8)所述重组融合蛋白为SEQ ID No.50所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQID No.49所示；
(9)所述重组融合蛋白为SEQ ID No.52所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQID No.51所示；
(10)所述重组融合蛋白为SEQ ID No.56所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQID No.55所示；
(11)所述重组融合蛋白为SEQ ID No.58所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQID No.57所示；
(12)所述重组融合蛋白为SEQ ID No.60所示的氨基酸序列时，其编码基因如SEQID No.59所示；
所述多克隆位点为EcoRⅠ和HindⅢ位点；
所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL是通过重组表达载体导入所述细菌中的，所述重组表达载体是将所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的表达盒***pET28a(+)的多克隆位点间得到的；
所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的表达盒如SEQ ID No.30所示；
所述多克隆位点为BglⅡ位点。
上述任一所述的方法中，所述外源多糖是通过含有多糖合成基因簇的重组表达载体导入所述细菌的；
所述多糖合成基因簇如SEQ ID No.79所示；
所述含有多糖合成基因簇的重组表达载体按照如下方法制备：AscⅠ与NotⅠ双酶切SEQ ID No.79所示的DNA分子，得到基因片段；AscⅠ与NotⅠ双酶切SEQ ID No.82所示的DNA分子，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，即得。
上述任一所述的方法中，所述O-抗原连接酶基因缺陷的细菌为O-抗原连接酶基因缺陷的福氏志贺氏菌、O-抗原连接酶基因缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌或O-抗原连接酶基因缺陷的大肠杆菌；
所述O-抗原连接酶基因缺陷的大肠杆菌具体为大肠杆菌K12系列菌株；
上述任一所述的方法中，所述细菌为福氏志贺氏菌时，所述将重组融合蛋白和脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL在O-抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达的方法为将含有所述重组融合蛋白的表达载体和所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的表达载体导入O-抗原连接酶基因缺陷的福氏志贺氏菌中进行诱导表达；
所述福氏志贺氏菌为毒力大质粒缺失的福氏志贺氏菌；
所述毒力大质粒缺失的的福氏志贺氏菌的制备方法具体为：将pKDinc导入所述福氏志贺氏菌中，利用不相容原理进行所述毒力大质粒的缺失，再利用pKDinc的温度敏感特性将pKDinc去除；
所述O-抗原连接酶基因为waaI基因；
所述细菌多糖修饰的重组融合蛋白为脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL将福氏志贺氏菌自身的O-多糖连接到重组融合蛋白上，得到细菌多糖修饰的重组融合蛋白。
上述任一所述的方法中，所述细菌为甲型副伤寒沙门氏菌时，所述将重组融合蛋白和脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL在O-抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达的方法为将含有所述重组融合蛋白的表达载体和所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的表达载体导入O-抗原连接酶基因缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌中进行诱导表达；
所述O-抗原连接酶基因为waaL基因；
所述细菌多糖修饰的重组融合蛋白为脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL将甲型副伤寒沙门氏菌自身的O-多糖连接到重组融合蛋白上，得到细菌多糖修饰的重组融合蛋白。
上述任一所述的方法中，所述细菌为大肠杆菌K12系列菌株时，所述将重组融合蛋白和脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL在O-抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达的方法为将含有所述重组融合蛋白的表达载体、所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的表达载体、含有多糖合成基因簇片段的表达载体导入O-抗原连接酶基因缺陷的大肠杆菌K12系列菌株中进行诱导表达；
所述O-抗原连接酶基因为waaL基因；
所述大肠杆菌K12系列菌株O抗原合成途径中的关键糖基转移酶鼠李糖转移酶基因wbbL天然***失活，不能合成自身O抗原；
所述细菌多糖修饰的重组融合蛋白为脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL将外源多糖连接到重组融合蛋白上，得到细菌多糖修饰的重组融合蛋白；
所述外源多糖是通过将含有多糖合成基因簇片段的表达载体导入所述大肠杆菌K12系列菌株进行表达得到的；
所述多糖合成基因簇如SEQ ID No.79所示；
所述含有多糖合成基因簇片段的表达载体按照如下方法制备：AscⅠ与NotⅠ双酶切SEQ ID No.79所示的DNA分子，得到基因片段；AscⅠ与NotⅠ双酶切SEQ ID No.82所示的DNA分子，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，即得。
上述任一所述的方法中，所述表达之后还有细菌裂解、离心收集上清、除盐和/或分离纯化的步骤；
所述分离纯化为离子交换层析和/或分子筛层析。
由上述任一所述的方法制备得到的细菌多糖修饰的重组融合蛋白也属于本发明的保护范围；
或，
一种由上述任一所述的方法制备得到的细菌多糖修饰的重组融合蛋白制备的疫苗也属于本发明的保护范围；
所述疫苗能引起动物体内产生抗O抗原多糖的特异性抗体；
所述疫苗具体含有氢氧化铝佐剂。
上述任一所述的方法制备得到的细菌多糖修饰的重组融合蛋白在制备能引起动物体内产生抗O抗原多糖的的特异性抗体的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
或，
上述任一所述的方法制备得到的细菌多糖修饰的重组融合蛋白在制备预防和或治疗细菌引起的疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
所述产品具体为疫苗；
所述细菌具体为福氏志贺氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌或大肠杆菌；
所述疫苗具体含有氢氧化铝佐剂。
本发明在O-抗原连接酶基因缺陷的宿主菌中，共表达脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL基因、重组融合蛋白基因，或在O-抗原连接酶基因和O抗原合成基因双缺陷的宿主菌中，共表达脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL基因、重组融合蛋白基因和外源细菌多糖合成基因簇，获得了细菌多糖修饰的重组融合蛋白。
与现有的化学交联制备多糖蛋白相比，采用本发明的方法制备的细菌多糖修饰的重组融合蛋白具有多糖结合位点均一、质量易控等优点，并且通过工程菌培养直接制备得到细菌多糖修饰的重组融合蛋白，不需要多糖制备、载体蛋白制备、化学交联等多个步骤，具有生产高效，成本低、生物安全性好等优点。采用本发明的方法制备的细菌多糖修饰的重组融合蛋白免疫小鼠，可获得抗细菌多糖的特异性抗体，将这种细菌多糖修饰的重组融合蛋白用于细菌多糖蛋白结合疫苗的制备，可以避免病原菌培养的诸多问题，提高疫苗的均一性以及生产效率，降低疫苗制备的成本。
本发明对多糖修饰蛋白疫苗的制备具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为S.flexneri 2a 301 ΔpCP的PCR鉴定。
图2为S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI的PCR鉴定。
图3为S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI的脂多糖合成缺陷银染验证。
图4为脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的三级结构。
图5为重组CTB融合蛋白糖基化情况的WB检测。
图6为重组EPA融合蛋白糖基化情况的WB检测。
图7为糖蛋白rCTB4573-OPSSf301纯化结果的SDS-PAGE和WB检测。
图8为糖蛋白rEPA4573-OPSSf301纯化结果的SDS-PAGE和WB检测。
图9为糖蛋白的免疫原性评价。
图10为多糖基化位点的重组融合蛋白糖基化修饰的WB检测。
图11为糖蛋白rTTC4573-OPSSf301的WB检测。
图12为S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL的PCR鉴定。
图13为S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL的脂多糖合成缺陷银染验证。
图14为糖蛋白rEPA4573-OPSSpty50973的WB检测。
图15为糖蛋白rCTB4573-OPSSpty50973的WB检测。
图16为E.coli W3110 ΔwaaL的PCR鉴定。
图17为糖蛋白rCTB4573-OPSEcO157的WB检测。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
pKDinc重组质粒在文献“Global Analysis of a Plasmid-Curred Shigellaflexneri Strain:New Instghts into the Interaction between the Chromosome anda Virulence Plasmid,Journal of Proteome Research,2010,9(2):843-854”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得，该质粒为温度敏感型质粒，氨苄青霉素抗性。
pMD18-T购自TaKaRa公司,货号为D101A。
pET-22b质粒购自Novagen公司，产品目录号为69744。
pKOBEG质粒在文献“A rapid method for efficient gene replacement in thefilamentous fungus Aspergillus nidulans[J].Nucleic Acids Res.2000 Nov15；28(22):E97”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得，该质粒为温度敏感型质粒，氯霉素抗性。
pCP20质粒在文献“Datsenko,K.A.and B.L.Wanner.One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products[J].Proc.natl.Acad.Sci.U.S.A,2000,97(12):6640-6645”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得，氯霉素抗性。
pET28a(+)购自Novagen。
pMMB66EH购自ATCC，编号为ATCC 37620。
pKD3在文献“Datsenko,K.A.and B.L.Wanner,One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl AcadSci U S A,2000.97(12):p.6640-5。”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。
pKD46质粒在文献“Datsenko,K.A.and B.L.Wanner,One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl AcadSci U S A,2000.97(12):p.6640-5。”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。pKD46的复制子对温度敏感，37℃培养时丢失，此质粒含有编码Red重组的三个重组酶，由***糖启动子控制。
pACYC184在文献“于梅,周建光,陈伟,等.一种可转移的重组工程***pYM-Red的建立[J].生物化学与生物物理进展,2005,32(4):359-364.”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。
Anti-His tag鼠单克隆抗体购自Sigma，货号为A7058。
anti-EPA抗体购自Sigma，货号为P2318。
兔源Anti-OPSSf301抗血清(福氏志贺菌2a型抗血清)购自日本生研株式会社，编号为210227。
兔源抗大肠杆菌O157抗血清购日本生研株式会社，编号为210753。
HRP-羊抗兔IgG购自TransGen公司，编号为HS-101-01。
CHELATING SEPH 6 FF亲和层析柱购自GE Healthcare，产品目录号为17-5203-06。
G25层析填料购自GE Healthcare。
ProteinPak DEAE8HR阳离子交换层析柱购自Waters。
Superdex 75 FPLC层析柱购自GE Healthcare，产品目录号为17-1047-01。
雌性Balb/c小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。
福氏志贺氏菌2a 301野生株(S.flexneri 2a 301)在文献“Genome sequence ofShigella flexneri 2a:insights into pathogenicity through comparison withgenomes of Escherichia coli K12 and O157,Nucl.Acids Res2002,30(20):4432-4441”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。
甲型副伤寒沙门氏菌50973株(S.paratyphi CMCC50973)购自中国医学细菌保藏管理中心。
E.coli W3110在文献“于梅,李山虎,陈伟,等.用Red介导的同源重组结合酶切改构质粒DNA[J].军事医学科学院院刊,2005,29(3):241-243.”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。
氢氧化铝佐剂Rehydragel LV购自General Chemical公司。
实施例1、一步生物交联法制备福氏志贺氏菌O-糖基化修饰的重组融合蛋白及其疫苗
志贺氏菌(Shigella spp.)俗称痢疾杆菌，作为一种具有高度传染性的革兰氏阴性肠道致病菌，主要通过侵入人结肠上皮细胞最终定位于大肠，而引起典型细菌性痢疾(发热、腹痛、里急后重、大便脓血)，而毒力大质粒则是其致病性的最主要的因素，毒力大质粒包含有大概32个与毒力有关的基因，主要包括与III型分泌***有关的mxi-spa基因、与细菌侵入上皮细胞密切相关的ipaBCD以及ipgC等毒力基因。为了将其开发为安全的宿主菌，必须先将其编码毒力因子的大质粒pCP去除，在此基础上再将O抗原连接酶基因waaI缺陷，从而开发成适于本发明的宿主菌。
一、宿主菌的改造
(一)毒力大质粒缺失株S.flexneri 2a 301 ΔpCP的构建
1、福氏志贺氏菌2a 301野生株感受态的制备
1)将福氏志贺氏菌2a 301野生株(S.flexneri 2a 301)接种于LB液体培养基中，30℃过夜培养后，将1ml培养液转接到100mL低盐LB液体培养基中，30℃培养至OD600达到0.6。
2)离心收集菌体，用灭菌的体积百分含量为10％甘油的水溶液洗涤四次，最后用400uL灭菌的体积百分含量为10％甘油的水溶液重悬细菌，即可获得电击转化用的S.flexneri 2a 301感受态细胞，分装待用。
2、毒力大质粒的缺失
1)inc是志贺氏菌毒力大质粒pCP上与其复制相关的一段序列片段，将带有inc片段的pKDinc重组质粒电转导入步骤1制备的S.flexneri 2a 301感受态细胞中，得到中间重组菌，将其命名为S.flexneri 2a 301/pKDinc。
2)将S.flexneri 2a 301/pKDinc在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中连续传代3次以上，以保证毒力大质粒的丢失，之后将培养的菌液涂布在氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上，待长出单菌落之后，提取单菌落的基因组DNA，以其为模板，分别以ipaA、ipgB、mxiD、virG的引物为引物，进行PCR扩增，通过验证毒力基因ipaA、ipgB、mxiD、virG检测毒力大质粒pCP是否丢失,同时以S.flexneri 2a 301的基因组DNA为对照，进行上述PCR扩增。
ipaA的引物如下：
ipaAp1:5’-AAGATTCTGCCTTTGGACC-3’(SEQ ID No.1)
ipaAp2:5’-GTGGTTGAAGAGTTCTGTATG-3’(SEQ ID No.2)
ipgB的引物如下：
ipgB1U:5’-TGCTTTGACGGTATACAGC-3’(SEQ ID No.3)
ipgB1L:5’-ACTTCCACAGGTTGAATTCG-3’(SEQ ID No.4)
mxiD的引物如下：
mxiDU:5’-AAGCAGGTTTCTTCTATTGG-3’(SEQ ID No.5)
mxiDL:5’-GAACACATTACCGATTACAGG-3’(SEQ ID No.6)
virG的引物如下：
VirGp1:5’-CATCAATCCGTTACTCACT-3’(SEQ ID No.7)
VirGp2:5’-ACTACCAGCAACAATACG-3’(SEQ ID No.8)
结果如图1A所示。
图1A中，301代表福氏志贺氏菌2a 301野生株S.flexneri 2a 301；301 ΔpCP代表步骤2)筛选的单菌落。
图1A表明，在福氏志贺氏菌2a 301野生株中，ipaA、ipgB、mxiD、virG基因都出现了目的扩增片段，分别为888bp的ipaA目的片段、595bp的ipgB目的片段、986bp的mxiD目的片段、777bp的virG目的片段。而在氨苄青霉素抗性筛选后的单菌落中，ipaA、ipgB、mxiD、virG基因均无扩增片段，说明毒力大质粒成功丢失，将该步骤2)筛选的单菌落(利用质粒不相容原理将毒力大质粒驱除而只保留有pKDinc质粒的重组菌)命名为S.flexneri 2a 301 ΔpCP/pKDinc。
3)再利用pKDinc质粒的温度敏感特性，将S.flexneri 2a 301 ΔpCP/pKDinc在无抗生素的液体LB培养基中42℃连续培养2代，将在无抗生素的LB固体培养基上可以生长，但在含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上不长的菌株命名为菌株S.flexneri 2a 301 ΔpCP。
提取S.flexneri 2a 301 ΔpCP的基因组DNA，按照步骤2)的方法检测毒力基因ipaA、ipgB、mxiD、virG，同时以福氏志贺氏菌2a 301野生株S.flexneri 2a 301的基因组DNA为对照，进行上述PCR扩增，结果与图1A的结果一致，在福氏志贺氏菌2a 301野生株S.flexneri 2a 301中，ipaA、ipgB、mxiD、virG基因都出现了目的扩增片段，而S.flexneri2a 301 ΔpCP中，ipaA、ipgB、mxiD、virG基因均无扩增片段，说明毒力大质粒不存在。
提取S.flexneri 2a 301 ΔpCP的基因组DNA，以inc的引物为引物进行PCR扩增，通过验证pKDinc质粒上的inc片段检测pKDinc质粒是否成功丢失,同时以福氏志贺氏菌2a301野生株S.flexneri 2a 301的基因组DNA为对照，进行上述PCR扩增。
inc的引物如下：
incF:5’-TGCGAGAGAGAGGGGATAAC-3’(SEQ ID No.9)
incR:5’-CGCCTTTTCCATCAGTTTC-3’(SEQ ID No.10)
结果如图1B所示。
图1B中，301代表福氏志贺氏菌2a 301野生株S.flexneri 2a 301；301 ΔpCP代表S.flexneri 2a 301 ΔpCP。
图1B表明，在福氏志贺氏菌2a 301野生株S.flexneri 2a 301中，具有488bp的inc基因目的片段，而S.flexneri 2a 301 ΔpCP中无目的扩增片段，说明pKDinc质粒成功丢失。
上述结果表明，S.flexneri 2a 301 ΔpCP已经丢失了毒力大质粒pCP，同时也丢失了外源的pKDinc质粒，毒力大质粒缺失株S.flexneri 2a 301 ΔpCP构建成功。
(二)O-抗原连接酶基因waaI缺陷的无毒福氏志贺氏菌S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI的制备
1、线性打靶DNA片段的制备
1)PCR引物的设计和合成
在福氏志贺氏菌2a 301waaI基因的上游(5’端)和下游(3’端)各设计一对引物，即301waaIu5/301waaIu3和301waaId5/301waaId3。其中301waaIu5具有限制性酶切位点BamHⅠ，301waaIu3具有限制性酶切位点SalⅠ，301waaId5具有限制性酶切位点HindⅢ，301waaId3具有限制性酶切位点XhoⅠ。
同时，为了验证突变体是否够构建成功，设计了基因组上waaI基因上下游同源臂以外的一对引物(301waaIw5/301waaIw3)，内部检测引物(301waaIn5/301waaIn3)，kan基因引物(Kan5/Kan3)及kan基因内部引物(Kanf5/Kanf3)，进行PCR验证，同时进行测序验证。
上述引物如表1所示。
表1引物列表1
表1中的下划线所示的序列为酶切识别位点。
2)线性打靶DNA片段的构建
(1)以S.flexneri 2a 301 ΔpCP基因组DNA为模板，用301waaIu5/301waaIu3和301waaId5/301waaId3分别扩增出waaI的上、下游同源臂up和down。
PCR程序如下：94℃10min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。
PCR扩增得到的up片段的核苷酸序列如SEQ ID No.23中自5’末端起第7-634位核苷酸所示，down片段的核苷酸序列如SEQ ID No.23中自5’末端起第2143-2822位核苷酸所示。
(2)pETKan的构建
以SEQ ID No.23中自5’末端起第641-2136位核苷酸所示的DNA分子为模板，以5’-GCGTCGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID No.24)和5’-CCAAGCTTATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’(SEQ ID No.25)为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
Sal Ⅰ和HindⅢ双酶切PCR扩增产物，得到基因片段；Sal Ⅰ和HindⅢ双酶切pET-22b质粒，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pETKan，将pETKan送测序，结果正确。
(3)BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切up片段，得到基因片段1；BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切质粒pETKan，得到载体大片段1；将基因片段1与载体大片段1连接，得到中间载体1；
HindⅢ和Xho Ⅰ双酶切down片段,得到基因片段2；HindⅢ和Xho Ⅰ双酶切中间载体1，得到载体大片段2；将基因片段2与载体大片段2连接，得到中间载体2。
(4)BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切中间载体2，得到目的打靶片段，如SEQ ID No.23所示。该打靶片段两侧为同源臂，中间含kan基因。SEQ ID No.23中自5’末端起第7-634位核苷酸为up片段，第641-2136位核苷酸为kan基因，自5’末端第2143-2822位核苷酸为down片段。
2、S.flexneri 2a 301 ΔpCP/pKOBEG的构建
由于pKOBEG质粒含有编码λ-Red重组***所需各种酶，将pKOBEG质粒电击转化至S.flexneri 2a 301 ΔpCP中，涂于含有浓度为50ug/mL的氯霉素的LB平板上，30℃培养过夜，得到的阳性克隆，将其命名为S.flexneri 2a 301 ΔpCP/pKOBEG菌株。
3、线性打靶DNA片段电击转化S.flexneri 2a 301 ΔpCP/pKOBEG
1)将S.flexneri 2a 301 ΔpCP/pKOBEG接种于含终浓度为30μg/mL氯霉素低盐LB液体培养基30℃培养过夜，并按照体积比1:100将其传代于低盐LB液体培养基，进行培养。
2)在步骤1)的培养液OD600值达到0.2时，加入终浓度为1mmol/L的L-***糖诱导Red重组***的表达。
3)待步骤2)的培养液OD600值为0.6时，取步骤1制备的浓度为300ng/μL的打靶片段电转S.flexneri 2a 301 ΔpCP/pKOBEG，得到转化后的细胞。
4)在转化后的细胞中快速加入提前预冷的1mL低盐LB液体培养基，30℃复苏2.5h左右，然后涂布于含有50ug/mL浓度的卡那霉素的LB平板，放于30℃培养箱培养过夜，筛选出阳性克隆。
5)将阳性克隆接种于含有50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，42℃培养传代两次(每次培养12h时间)，即可除去pKOBEG质粒，最终获得含卡那霉素抗性、waaI缺失突变株，将其命名为S.flexneri 2a 301 ΔpCP waaI::kan1。
4、将编码FRT位点特异性重组酶的质粒pCP20电击转入S.flexneri 2a 301 ΔpCPwaaI::kan中，在含50ug/mL浓度的氯霉素及不含卡那霉素的LB平板上30℃培养，筛选CmrKms(氯霉素抗性、卡那霉素敏感)的阳性克隆。
5、将步骤4筛选到的阳性克隆，转入液体LB中42℃培养12小时，即可获得O-抗原连接酶基因waaI缺陷的无毒福氏志贺氏菌2a 301，将其命名为S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI。
(pCP20的复制子对温度敏感，42℃培养时丢失，此质粒含有编码FLP重组酶的DNA，由温敏启动子控制，42℃培养时诱导FLP重组酶表达，同时该质粒丢失。)
(三)S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI的分子鉴定
以S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI的基因组DNA为模板，分别用一对waaI内部引物(301waaIn5/301 waaIn3)，一对waaI外部引物(301waaIw5/301waaIw3)，一对交叉引物(301waaIw5和kanf3)和kan基因引物(kan5/kan3)进行PCR扩增，同时以野生株S.flexneri2a 301基因组DNA进行上述PCR扩增，作为对照。
结果如图2所示。
图2中，301 ΔpCPΔwaaI代表S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI，野生株301代表野生株S.flexneri 2a 301；1,5:引物为waaI内部引物时的PCR产物；2,6:引物为waaI外部引物时的PCR产物；3,7:引物为waaIw5和kanf3时的PCR产物；4,8:引物为Kan基因引物时的PCR产物。
图2表明，以S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI的基因组DNA为模板，以waaI内部引物为引物进行PCR扩增，没有目的条带，以waaI外部引物为引物进行PCR扩增得到的条带比以野生株的基因组DNA为模板得到的PCR扩增条带小，以交叉引物和kan基因引物为引物也没有扩增条带。而以野生株的基因组DNA为模板，以waaI内部引物为引物进行PCR扩增，有目的条带，以交叉引物和kan基因引物为引物同样没有目的扩增条带。
上述结果证明S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI是waaI基因缺失、毒力大质粒pCP缺失、并且无抗生素基因的福氏志贺氏菌2a 301。
(四)S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI的表型鉴定
取1 mLS.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI的37℃过夜培养物，离心收集菌体，用PBS洗一次，加入100uL裂解缓冲液(该裂解液由10％SDS 2mL，2-巯基乙醇0.4mL，100％甘油1mL，2M pH6.8的Tris-HCl 5mL，10％溴酚蓝20 uL和ddH2O 1.6mL混匀得到)充分混匀，沸水煮10分钟，加4μL 20mg/mL的蛋白酶K的水溶液，60℃反应1至2小时，得到裂解液；取裂解液15ul上样，进行SDS-PAGE电泳，将胶于固定液中放置过夜，加入增敏液作用30分钟，用去离子水洗3次，每次15分钟，加硝酸银溶液作用20分钟，用去离子水洗2次，每次1分钟，加显影液进行显色，最后终止反应，用去离子水洗。
同时以野生株S.flexneri 2a 301进行上述实验，作为对照。
结果如图3所示。
图3中，301 ΔpCPΔwaaI代表S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI，301代表野生株S.flexneri 2a 301。
图3表明，S.flexneri 2a 301野生株有ladder形式的LPS条带，而S.flexneri 2a301 ΔpCPΔwaaI由于敲除了O-抗原连接酶基因waaI(waaI功能是将O抗原多糖(OPS)连接到类脂A-核心寡糖上形成脂多糖(LPS)，所以没有ladder形式的LPS条带。
二、核心肽段的确定
根据脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE(GeneBank：NC_003112.2)的三级结构，通过截取包含PilE第63位丝氨酸(S63)(该氨基酸是糖基化位点)在内的不同长度的多肽，以霍乱毒素B亚单位(CTB)(GeneBank：X76390.1)为载体蛋白，将不同长度的多肽融合至CTB的C端，或者以绿脓杆菌外毒素蛋白A无毒突变体(rEPA)为载体蛋白，将不同长度的多肽融合至其N端或C端，构建一系列重组融合蛋白，并将重组融合蛋白与脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL在S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI中共表达，取全菌蛋白做western blot，用特异性抗体检测，以确定能够使重组融合蛋白被O-糖基化修饰的最小多肽。步骤如下：
(一)脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL表达载体的构建
1、脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL(GeneBank：JN200826.1)的氨基酸序列如SEQ ID No.26所示，其DNA序列如SEQ ID No.27所示。
利用引物223tac-box5'：5’-ATCGAGATCTACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAG-3’(SEQ IDNo.28)和223tac-box3'：5’-ATCGAGATCTGTCTCATGAGCGGATACATATTTG-3’(SEQ ID No.29)扩得到PglL的表达盒，如SEQ ID No.30所示。
2、BglⅡ酶切SEQ ID No.30所示的DNA分子，得到基因片段；BglⅡ酶切pET28a(+)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pETtac28-pglL，将pETtac28-pglL送测序，结果正确。
(二)S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL菌株的构建
将pETtac28-pglL电击转化S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI，得到S.flexneri2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL菌株。
(三)能使重组融合蛋白被O糖基化修饰的核心肽段C端的确定
1、重组CTB融合蛋白表达载体的构建
根据脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的三级结构(如图4所示)，通过截取包含PilE第63位丝氨酸(S63)在内的不同长度的多肽，以CTB为载体蛋白，将不同长度的多肽融合至CTB的C端。具体方法如下：
N端从PilE的第45位的丝氨酸(S45)起始，C端至第73位赖氨酸(K73)结束，截取S45～K73的29个氨基酸，将其融合至CTB的C端；同时，截取的PilE肽段N端不变，C端依此减少2个或1个氨基酸，即将S45～E71、S45～S69、S45～A67、S45～V66、S45～G65、S45～A64的肽段分别融合至CTB的C末端，为了避免CTB与肽段之间有空间位阻效应，CTB和肽段由5个氨基酸连接。由于糖基化修饰发生于周质空间，根据GeneBack公布的霍乱毒素B亚单位(X76390.1)氨基酸序列，将其信号肽(前21位氨基酸)替换为DsbA信号肽，同时在重组融合蛋白的C端融合6×His tag标签，以便后期检测工作，从而构建一系列重组CTB重组融合蛋白rCTB4573、rCTB4571、rCTB4569、rCTB4567、rCTB4566、rCTB4565、rCTB4564。
rCTB4573的编码基因序列如SEQ ID No.31所示，其中自5’末端起第64位至第372位为CTB编码序列，388至474位为PilE的第45至73位氨基酸编码序列，第7位至第63位为DsbA信号肽编码序列。rCTB4573蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.32所示，自N端起第20至第122位CTB氨基酸序列，第123至第127位为柔性linker，第128至第156位为PilE的第45至73位氨基酸，第157至第166位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为DsbA信号肽序列。
rCTB4571的编码基因序列如SEQ ID No.33所示，其中自5’末端起第64位至第372位为CTB编码序列，388至468位为PilE的第45至71位氨基酸编码序列，第7位至第63位为DsbA信号肽编码序列。rCTB4571蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.34所示，自N端起第20至第122位CTB氨基酸序列，第123至第127位为柔性linker，第128至第154位为PilE的第45至71位氨基酸，第155至第163位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为DsbA信号肽序列。
rCTB4569的编码基因序列如SEQ ID No.35所示，其中自5’末端起第64位至第372位为CTB编码序列，388至462位为PilE的第45至69位氨基酸编码序列，第7位至第63位为DsbA信号肽编码序列。rCTB4569蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.36所示，自N端起第20至第122位CTB氨基酸序列，第123至第127位为柔性linker，第128至第152位为PilE的第45至69位氨基酸，第153至第161位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为DsbA信号肽序列。
rCTB4567的编码基因序列如SEQ ID No.37，其中自5’末端起第64位至第372位为CTB编码序列，388至456位为PilE的第45至67位氨基酸编码序列，第7位至第63位为DsbA信号肽编码序列。rCTB4567蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.38所示，自N端起第20至第122位CTB氨基酸序列，第123至第127位为柔性linker，第128至第150位为PilE的第45至67位氨基酸，第151至第159位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为DsbA信号肽序列。
rCTB4566的编码基因序列如SEQ ID No.39，其中自5’末端起第64位至第372位为CTB编码序列，388至453位为PilE的第45至66位氨基酸编码序列，第7位至第63位为DsbA信号肽编码序列。rCTB4566蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.40所示，自N端起第20至第122位CTB氨基酸序列，第123至第127位为柔性linker，第128至第149位为PilE的第45至66位氨基酸，第150至第158位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为DsbA信号肽序列。
rCTB4565的编码基因序列如SEQ ID No.41，其中自5’末端起第64位至第372位为CTB编码序列，388至450位为PilE的第45至65位氨基酸编码序列，第7位至第63位为DsbA信号肽编码序列。rCTB4565蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.42所示，自N端起第20至第122位CTB氨基酸序列，第123至第127位为柔性linker，第128至第148位为PilE的第45至65位氨基酸，第149至第157位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为DsbA信号肽序列。
rCTB4564的编码基因序列如SEQ ID No.43，其中自5’末端起第64位至第372位为CTB编码序列，388至447位为PilE的第45至65位氨基酸编码序列，第7位至第63位为DsbA信号肽编码序列。rCTB4564蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.44所示，自N端起第20至第122位CTB氨基酸序列，第123至第127位为柔性linker，第128至第147位为PilE的第45至64位氨基酸，第148至第156位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为DsbA信号肽序列。
用EcoRⅠ和HindⅢ分别双酶切SEQ ID No.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQID No.37、SEQ ID No.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43所示的DNA分子，得到各基因片段；用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pMMB66EH，得到载体大片段；将各基因片段分别与载体大片段连接，得到重组质粒，分别命名为pMMB66EH-rCTB4573、pMMB66EH-rCTB4571、pMMB66EH-rCTB4569、pMMB66EH-rCTB4567、pMMB66EH-rCTB4566、pMMB66EH-rCTB4565、pMMB66EH-rCTB4564，将重组质粒送测序，结果均正确。
2、糖基工程福氏志贺氏菌的制备
将步骤1制备的表达载体pMMB66EH-rCTB4573、pMMB66EH-rCTB4571、pMMB66EH-rCTB4569、pMMB66EH-rCTB4567、pMMB66EH-rCTB4566、pMMB66EH-rCTB4565、pMMB66EH-rCTB4564分别电转上述步骤(二)制备的S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL菌株，涂布含有终浓度为50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB双抗固体培养基，阳性克隆即糖基工程福氏志贺氏菌S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4573、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4571、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4569、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4567、S.flexneri 2a301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4566、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4565和S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4564。
3、重组CTB融合蛋白的糖基化修饰与检测
挑取各糖基工程福氏志贺氏菌S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4573、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4571、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4569、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4567、S.flexneri 2a301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4566、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4565和S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4564单克隆，接种于含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至16℃诱导20h。
次日取上述16℃诱导20h的各菌液1mL，离心取菌体，用1X还原样(50mM pH6.8Tris-HCl,1.6％SDS,0.02％溴酚蓝，8％甘油，20mM DTT)缓悬起，沸水浴10min，用15％的SDS-PAGE电泳，电泳完毕后用Bio-Lab半干转转印仪将蛋白转至PVDF膜上，20V恒压转印1h，用鼠源Anti-His tag单克隆抗体检测，结果如图5所示。
图5表明，截取的PilE肽段的C端短至V66时仍可使重组CTB融合蛋白被O糖基化修饰，但糖基化效率与其余较长肽段修饰的重组CTB融合蛋白明显减弱。
(四)能使重组融合蛋白被O糖基化修饰的核心肽段N端的确定
1、重组EPA融合蛋白表达载体的构建
根据脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的三级结构(如图4所示)，通过截取包含PilE第63位丝氨酸(S63)在内的不同长度的多肽，以rEPA为载体蛋白，将不同长度的多肽融合至rEPA的N端或C端。具体方法如下：
N端从PilE的第55位的甘氨酸(G55)起始，C端至第73位赖氨酸(K73)结束，截取G55～K73的19个氨基酸，将其融合至rEPA的N端；或者N端从PilE的第55位的甘氨酸(G55)起始，C端至第69位丝氨酸(S69)结束，截取G55～S69的15个氨基酸，将其融合至rEPA的N端；或者N端从PilE的第55位的甘氨酸(G55)起始，C端至第66位缬氨酸(V66)结束，截取G55～V66的12个氨基酸，将其融合至rEPA的N端；或者N端从PilE的第58位的脯氨酸(P58)起始，C端至第66位缬氨酸(V66)结束，截取P58～V66的9个氨基酸，将其融合至rEPA的N端；或者N端从PilE的第45位的丝氨酸(S45)起始，C端至第73位赖氨酸(K73)结束，截取S45～K73的29个氨基酸，将其融合至rEPA的C端；即将G55～K73、G55～S69、G55～V66、P58～V66的肽段分别融合至rEPA的N末端，或将S45～K73的肽段融合至rEPA的C末端。由于糖基化修饰发生于周质空间，根据GeneBack公布的绿脓杆菌外毒素A(AE004091.2)氨基酸序列，将其信号肽(前25位氨基酸)替换为DsbA信号肽，删除其553位的E，同时552位的L突变为V，同时在重组融合蛋白的C端融合6×His tag标签，以便后期检测工作，从而构建一系列重组EPA重组融合蛋白rEPA5573N、rEPA5569N、rEPA5566N、rEPA5866N、rEPA4573。
rEPA4573的编码基因序列如SEQ ID No.45所示，其中自5’末端起第64位至第1899位为rEPA编码序列，1915至2001位为PilE的第45至73位氨基酸编码序列，第7位至第63位为DsbA信号肽编码序列。rEPA4573蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.46所示，自N端起第20至第631位为rEPA氨基酸序列，第632至第636位为柔性linker，第637至第665位为PilE的第45至64位氨基酸，第666至第674位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为DsbA信号肽序列。
rEPA5573N的编码基因序列如SEQ ID No.47所示，其中自5’末端起第70至126位为PilE的第55至73位氨基酸编码序列,第133位至第1962位为rEPA编码序列，第7位至第63位为DsbA信号肽编码序列。rEPA5573N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.48所示，自N端起第22至第40位为PilE的第55至73位氨基酸，第41至第42位为柔性linker，第43至第652位为rEPA氨基酸序列，第653至第666位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为DsbA信号肽序列。
rEPA5569N的编码基因序列如SEQ ID No.49所示，其中自5’末端起第70至114位为PilE的第55至69位氨基酸编码序列,第121位至第1950位为rEPA编码序列，第7位至第63位为DsbA信号肽编码序列。rEPA5569N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.50所示，自N端起第22至第36位为PilE的第55至69位氨基酸，第37至第38位为柔性linker，第39至第648位为rEPA氨基酸序列，第649至第662位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为DsbA信号肽序列。
rEPA5566N的编码基因序列如SEQ ID No.51所示，其中自5’末端起第70至105位为PilE的第55至66位氨基酸编码序列,第112位至第1941位为rEPA编码序列，第7位至第63位为DsbA信号肽编码序列。rEPA5566N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.52所示，自N端起第22至第33位为PilE的第55至66位氨基酸，第34至第35位为柔性linker，第36至第645位为rEPA氨基酸序列，第646至第659位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为DsbA信号肽序列。
rEPA5866N的编码基因序列如SEQ ID No.53，其中自5’末端起第70至96位为PilE的第58至66位氨基酸编码序列,第103位至第1932位为rEPA编码序列，第7位至第63位为DsbA信号肽编码序列。rEPA5866N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.54所示，自N端起第22至第30位为PilE的第58至66位氨基酸，第31至第32位为柔性linker，第33至第642位为rEPA氨基酸序列，第643至第656位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为DsbA信号肽序列。
用EcoRⅠ和HindⅢ分别双酶切SEQ ID No.45、SEQ ID No.47、SEQ ID No.49、SEQID No.51、SEQ ID No.53所示的DNA分子，得到各基因片段；用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pMMB66EH，得到载体大片段；将各基因片段分别与载体大片段连接，得到重组质粒，分别命名为pMMB66EH-rEPA4573、pMMB66EH-rEPA5573N、pMMB66EH-rEPA5569N、pMMB66EH-rEPA5566N、pMMB66EH-rEPA5866N,将重组质粒送测序，结果均正确。
2、糖基工程福氏志贺氏菌的制备
将步骤1制备的表达载体pMMB66EH-rEPA4573、pMMB66EH-rEPA5573N、pMMB66EH-rEPA5569N、pMMB66EH-rEPA5566N、pMMB66EH-rEPA5866N分别电转上述步骤(二)制备的S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL菌株，涂布含有终浓度为50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB双抗固体培养基，阳性克隆即糖基工程福氏志贺氏菌S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA4573、S.flexneri 2a301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA5573N、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA5569N、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA5566N、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA5866N、。
3、重组EPA融合蛋白的糖基化修饰与检测
挑取糖基工程菌S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA4573、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA5573N、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA5569N、S.flexneri 2a301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA5566N、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA5866N单克隆，接种于含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至16℃诱导20h。
次日取上述16℃诱导20h的菌液1mL，离心取菌体，用1X还原样缓悬起，沸水浴10min，用8％的SDS-PAGE电泳，电泳完毕后用Bio-Lab半干转转印仪将蛋白转至PVDF膜上，20V恒压转印1h，用anti-EPA抗体检测，结果如图6所示。
图6表明，截取的PilE蛋白G55～K73、G55～S69、G55～V66的肽段融合到EPA蛋白N端依然成功使重组融合EPA蛋白O糖基化修饰，但随着所截取肽段的缩短，重组融合EPA蛋白的糖基化效率明显逐渐减弱。
以上结果表明，能使重组融合蛋白被O糖基化修饰的核心肽段为PilE的G55～V66，但从实际应用角度出发，本发明采用P1a的氨基酸序列(即PilE的S45～K73)(PilE的Genbank号为NC_003112.2)融合至不同载体蛋白的适当位置进行相关研究。
三、一步生物交联法制备福氏志贺氏菌O抗原多糖-重组CTB融合蛋白结合物
(一)挑取糖基工程菌S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4573单克隆，接种于含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素双抗LB培养基，37℃培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至16℃诱导20h。
(二)O多糖-重组CTB融合蛋白结合物rCTB4573-OPSSf301的纯化
1、样品预处理
取上述步骤(一)16℃诱导20h的菌体10g，加入100mL纯水，超声破菌(超声3s暂停5s，累计超声时间30min)，12000g离心，收集上清，向上清中加入上样缓冲液(20mM pH7.5Tris-HCl、0.2M NaCl、10mM咪唑)，充分搅拌，再次12000g离心，收集上清，此上清为含有O多糖-重组CTB融合蛋白结合物rCTB4573-OPSSf301的粗提液。
2、用Chelating亲和层析柱纯化样品
用Chelating亲和层析柱(Φ1.6cm*15cm)初步纯化样品。
首先用0.5M的NaOH的水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，然后用0.5M的NiSO4的水溶液平衡至少3个柱床体积，再用B1液(20mM pH7.5 Tris-HCl，0.5M NaCl，500mM咪唑)平衡至少一个柱床体积，最后用A1液(20mM pH7.5 Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑)平衡至少3个柱床体积，以上流速均为4mL/min。从A管道将步骤1得到的rCTB4573-OPSSf301的粗提液上样，再用A1液(20mM pH7.5 Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑)洗去未结合蛋白，冲洗至紫外吸收(280nM)接近于0 mAU，最后用100％B1(20mM pH7.5Tris-HCl，0.5M NaCl，500mM咪唑)洗脱，收集洗脱液30mL，得到初步纯化的样品。
3、样品除盐
用G25 fine层析柱(Φ1.6cm*30cm)将步骤2的初步纯化的样品除盐，流动相为A2液(20mM pH5.4 HAc-NaAc)。
首先用0.5M的NaOH的水溶液冲洗至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，最后用A2液平衡至少3个柱床体积，从A管道上样步骤2得到的初步纯化的样品，流动相为A2液(20mM pH5.4 HAc-NaAc)并收集样品60mL，以上流速均为4mL/min。，得到除盐后的样品。
4、用ProteinPak SP8HR阳离子交换层析柱进一步纯化rCTB4573-OPSSf301
将步骤3除盐后的样品用ProteinPak SP8HR阳离子交换层析柱进一步纯化。
首先用0.5M的NaOH的水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，然后用A2液(20mM pH5.4 HAc-NaAc)平衡至少3个柱床体积，将样品从A管道上样，用A2液洗去未结合糖蛋白，然后0～50％的B2液(A管道进A2液，B管道进B2液，纯化仪自动混合)30min内线性洗脱，并收集洗脱液，以上流速均为1mL/min。糖蛋白rCTB4573-OPSSf301的出峰位置在电导为约35～45mS/cm处，即为目的蛋白rCTB4573-OPSSf301。
将样品用12％SDS-PAGE和western blot分析，结果如图7所示。
图7的各泳道中，M为蛋白marker；破菌上清代表步骤1得到的rCTB4573-OPSSf301的粗提液；Ni代表步骤2得到的初步纯化的样品；SP8HR代表ProteinPak SP8HR阳离子交换层析柱进一步纯化的目的蛋白rCTB4573-OPSSf301；anti-His代表用Anti-His tag鼠单克隆抗体的WB图；anti-OPSSf301代表用兔源Anti-OPSSf301抗血清的WB图。
四、一步生物交联法制备福氏志贺氏菌O多糖-重组EPA融合蛋白结合物
(一)挑取糖基工程菌S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA4573单克隆，接种于含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素双抗LB培养基，37℃培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至16℃诱导20h。
(二)O多糖-重组EPA融合蛋白结合物rEPA4573-OPSSf301的纯化
1、样品预处理
取上述步骤(一)16℃诱导20h的菌体10g，加入100mL纯水，超声破菌(超声3s暂停5s，累计超声时间30min)，12000g离心，收集上清，向上清中加入加入上样缓冲液(20mMpH7.5 Tris-HCl、0.2M NaCl、10mM咪唑)，充分搅拌，再次12000g离心，收集上清，此上清为含有O抗原多糖-重组EPA融合蛋白结合物rEPA4573-OPSSf301的粗提液。
2、用Chelating亲和层析柱纯化样品
用Chelating亲和层析柱(Φ1.6cm*15cm)初步纯化样品。
首先用0.5M的NaOH的水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，然后用0.5M的NiSO4的水溶液平衡至少3个柱床体积，再用B1液(20mM pH7.5 Tris-HCl，0.5M NaCl，500mM咪唑)平衡至少一个柱床体积，最后用A1液(20mM pH7.5 Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑)平衡至少3个柱床体积，以上流速均为4mL/min。从A管道将步骤1得到的rEPA4573-OPSSf301的粗提液上样，再用A1液(20mM pH7.5 Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑)洗去未结合蛋白，最后用100％B1(20mM pH7.5Tris-HCl，0.5M NaCl，500mM咪唑)洗脱，收集洗脱液30mL，得到初步纯化的样品。
3、样品除盐
用G25 fine层析柱(Φ1.6cm*30cm)将Chelating亲和层析柱初步纯化样品除盐，流动相为A3液(20mM pH7.5 Tris-HCl)。
首先用0.5M的NaOH的水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，最后用A3液平衡至少3个柱床体积，从A管道上样步骤2得到的初步纯化的样品，并收集样品60mL，流动相为A3液(20mM pH7.5 Tris-HCl)，以上流速均为4mL/min，得到除盐后的样品。
4、用ProteinPak DEAE8HR阴离子交换层析柱进一步纯化rEPA4573-OPSSf301
将步骤3除盐后的样品用ProteinPak DEAE8HR阴离子交换层析柱(waters)进一步纯化。
首先用0.5M的NaOH的水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，然后用A3液(20mM pH7.5 Tris-HCl)平衡至少3个柱床体积，将样品从A管道上样，用A3液洗去未结合糖蛋白，然后0～50％的B3液(A管道进A3液，B管道进B3液，纯化仪自动混合)30min内线性洗脱，并收集洗脱液，以上流速均为1mL/min。糖蛋白rEPA4573-OPSSf301的出峰位置在电导为约8～18mS/cm处，得到蛋白rEPA4573-OPSSf301粗提液。
5、用Superdex 75层析柱精纯化rEPA4573-OPSSf301
将ProteinPak DEAE8HR阴离子交换层析柱纯化的样品用Superdex 75 FPLC(Φ1cm*30cm，GE公司)进一步精纯化。
首先用0.5M的NaOH的水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，然后用A4液(20mM pH7.5 PB、0.9g/100ml NaCl)平衡至少3个柱床体积，通过上样环上样蛋白rEPA4573-OPSSf3011mL粗提液，收集8～11mL流出的样品，此样品即精纯化的rEPA4573-OPSSf301，即目的蛋白rEPA4573-OPSSf301。
将样品用8％SDS-PAGE和western blot分析，同时以不转pETtac28-pglL只转pMMB66EH-rEPA4573得到的S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pMMB66EH-rEPA4573做对照。
结果如图8所示。
图8中，从左至右第1泳道代表对照蛋白；第2泳道代表步骤1得到的rEPA4573-OPSSf301的粗提液；纯化样品代表步骤5精纯化得到的目的蛋白rEPA4573-OPSSf301；考染代表纯化样品的考马斯亮蓝染色结果；Anti-his代表用Anti-His tag鼠单克隆抗体的WB图；Anti-OPSSf301代表用兔源Anti-OPSSf301抗血清的WB图。
五、rCTB4573-OPSSf301和rEPA4573-OPSSf301多糖蛋白结合疫苗的的制备及动物实验评价
(一)rCTB4573-OPSSf301和rEPA4573-OPSSf301多糖蛋白结合疫苗的的制备
将步骤三纯化的rCTB4573-OPSSf301和步骤四纯化的rEPA4573-OPSSf301过滤除菌，与氢氧化铝佐剂按照体积比9:1的比例混合，得到rCTB4573-OPSSf301和rEPA4573-OPSSf301腹腔注射样品。
(二)rCTB4573-OPSSf301和rEPA4573-OPSSf301的动物免疫及效果评价
1、O抗原(OPSSf301)的制备
先用热酚水法提取LPS(参考文献“孙洋,冯书章,祝令伟,等.肠出血性大肠杆菌O157 LPS单克隆抗体的制备与鉴定[J].中国***共患病学报,2007,23(10):971-973.”)，冻干保存，用1％冰醋酸以10mg/ml的浓度溶解，沸水浴90分钟后冷却至室温，调节pH至7.0。经64000×g离心5小时后收集上清，用去离子水彻底透析后冻干保存。
2、小鼠实验
取40只6周龄大的雌性Balb/c小鼠，随机分为以下4组：氢氧化铝组、OPSSf301组、rCTB4573-OPSSf301组和rEPA4573-OPSSf301组，其中氢氧化铝组为阴性对照，其余三组以多糖含量计量注射2.5μg的多糖；各组均分别在第1、14、28天免疫，最后一次免疫后10天后摘眼球取血。
用间接ELISA法测各组小鼠血清中抗福氏志贺氏菌2a型O抗原多糖的抗体滴度。用提取的福氏志贺氏菌2a 301株LPS包被酶联板，每孔包被10μg的LPS，其他操作步骤参见精编分子生物学实验指南[M].科学出版社,2008.。
结果如图9所示。
图9中，A1组为氢氧化铝组；OPS组代表OPSSf301组；rCTB-OPS组代表rCTB4573-OPSSf301组；rEPA4573-OPS组代表rEPA4573-OPSSf301组。
图9表明，与OPSSf301相比，步骤三纯化的rCTB4573-OPSSf301和步骤四纯化的rEPA4573-OPSSf301均能显著诱导小鼠产生抗福氏志贺氏菌2a 301的OPS(O多糖)的特异性抗体。
六、通过串联O-糖基化位点提高O多糖-重组融合蛋白中多糖的比例
(一)含两个P1a序列的重组CTB融合蛋白rCTB45732表达载体的构建
为了提高糖蛋白的多糖蛋白比例，将两个P1a(即PilE的S45～K73)的氨基酸序列串联融合至CTB的C端，合成rCTB45732。
rCTB45732的编码基因序列如SEQ ID No.55，其中自5’末端起第64位至第372位为CTB编码序列，第388位至第474位、第487位至第573位为PilE的第45至67位氨基酸编码序列，第7位至第63位为DsbA信号肽编码序列。rCTB45732蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.56所示，自N端起第20至第122位CTB氨基酸序列，第123至第127位、第157至第160位为柔性linker，第128至第156位、第161至第189位为PilE的第45至73位氨基酸，第190至第199位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为DsbA信号肽序列。
用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切SEQ ID No.55所示的DNA分子，得到基因片段；用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pMMB66EH，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，命名为pMMB66EH-rCTB45732，将重组质粒pMMB66EH-rCTB45732送测序，结果均正确。
(二)含三个P1a序列的重组EPA融合蛋白(rEPA4573NMC)表达载体的构建
为了提高糖蛋白中多糖的比例，根据EPA的空间结构，在其分子表面引入三个P1a序列(即PilE的S45～K73)，具体做法为：在rEPA的N端、C端、K240与P241之间融合共3个P1a的多肽，从而构建rEPA4573NMC。
rEPA4573NMC的编码基因序列如SEQ ID No.57，其中自5’末端起第70位至第156位、第877位至第963位、第2101位至第2187位为PilE的第45至67位氨基酸编码序列，第2188至第2217位为柔性linker和his标签编码序列，第7位至第63位为DsbA信号肽编码序列。rEPA4573NMC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.58所示。第1位至第19位为DsbA信号肽，第22位至第50位、第291位至第319位、第699位至第727位为PilE的第45至73位氨基酸，第694至698位为柔性linker，第728至736位为柔性linker和his标签序列。
用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切SEQ ID No.57所示的DNA分子，得到基因片段；用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pMMB66EH，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，命名为pMMB66EH-rEPA4573NMC，将重组质粒pMMB66EH-rEPA4573NMC送测序，结果均正确。
(三)糖基工程福氏志贺氏菌的制备
按照步骤二中(三)的糖基工程福氏志贺氏菌的制备方法，分别构建糖基工程菌S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB45732和S.flexneri 2a301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA4573NMC。
(四)rCTB45732和rEPA4573NMC在糖基工程福氏志贺氏菌中的糖基化修饰与检测
挑取糖基工程菌S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB45732和S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA4573NMC单克隆，接种于含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至16℃诱导20h。
次日取上述16℃诱导20h的菌液1mL，离心取各菌体，用1X还原样缓悬起，沸水浴10min，用SDS-PAGE电泳，电泳完毕后用Bio-Lab半干转转印仪将蛋白转至PVDF膜上，20V恒压转印1h，用Anti-His tag鼠单克隆抗体检测，结果如图10所示。
同时以S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pMMB66EH-rCTB45732、S.flexneri 2a301 ΔpCPΔwaaI/pMMB66EH-rEPA4573NMC、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4573、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA4573、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pMMB66EH-rCTB4573、S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pMMB66EH-rEPA4573作为对照。
图10表明，糖基工程菌S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB45732和S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA4573NMC表达的重组融合蛋白rCTB4573、rEPA4573发生O糖基化修饰，同时加入多个糖基化位点后，出现多簇糖基化条带表明多个位点均有效糖基化。
七、一步生物交联法制备福氏志贺氏菌O抗原多糖-重组TTC融合蛋白结合物
(一)重组TTC融合蛋白表达载体的构建
根据GeneBack公布的破伤风毒素C蛋白(AF154828.1)氨基酸序列，在其N端融合DsbA信号肽，C端融合P1a的多肽(即PilE的S45～K73)和6×His tag标签，构建重组破伤风毒素C蛋白的融合蛋白rTTC4573。
rTTC4573的编码基因序列如SEQ ID No.59所示，其中自5’末端起第64位至第1371位为TTC编码序列，第1387位至第1473位为PilE的第45至67位氨基酸编码序列，第7位至第63位为DsbA信号肽编码序列。
rTTC4573蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.60所示，自N端起第20至第455位为TTC氨基酸序列，第461至第489位为PilE的第45至73位氨基酸，第490至第498位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为DsbA信号肽序列。
用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切SEQ ID No.59所示的DNA分子，得到基因片段；用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pMMB66EH，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，命名为pMMB66EH-rTTC4573，将pMMB66EH-rTTC4573送测序，结果正确。
(二)糖基工程福氏志贺氏菌的制备
将pMMB66EH-rTTC4573转化S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL，构建糖基工程福氏志贺氏菌S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rTTC4573。
(三)rTTC4573在糖基工程福氏志贺氏菌中的糖基化修饰与检测
挑取糖基工程菌S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rTTC4573单克隆，接种于含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至25℃诱导20h。
同时以S.flexneri 2a 301 ΔpCPΔwaaI/pMMB66EH-rTTC4573进行上述诱导实验，作为对照。
次日取上述25℃诱导20h的菌液1mL，离心取各菌体，用1X还原样缓悬起，沸水浴10min，用SDS-PAGE电泳，电泳完毕后用Bio-Lab半干转转印仪将蛋白转至PVDF膜上，20V恒压转印1h，用Anti-His tag鼠单克隆抗体检测，结果如图11所示。
图11表明，底物蛋白rTTC4573在寡糖转移酶PglL的存在下，发生O糖基化修饰。
实施例2、一步生物交联法制备甲型副伤寒沙门氏菌O多糖-重组CTB融合蛋白
一、O-抗原连接酶基因waaL缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌的制备
(一)线性打靶DNA片段的制备
1、PCR引物的设计和合成
依据NCBI上甲型副伤寒沙门氏菌50973株(S.paratyphi CMCC50973)全基因组序列(NC_006511)中所列waaL基因(GeneBank号为CP000026的第3696236-3697450位)及其上、下游序列，在waaL基因的上游(5’端)和下游(3’端)各设计一对引物，即73waaLu1/73waaLu2和73waaLd1/73waaLd2。为了方便操作，限制性酶切位点BamHⅠ和SalⅠ将被添加到上游同源臂up的引物末端，限制性酶切位点HindⅢ和XhoⅠ被添加到下游同源臂down的引物末端。
同时，为了验证突变体是否够构建成功，设计了基因组上waaL基因上下游同源臂以外的一对引物(73waaLw1/73waaLw2)，内部检测引物(73waaLn1/73waaLn2)以及kan基因引物(Kan1/Kan2)进行PCR验证，同时进行测序验证。
上述引物如表2所示。
表2引物列表2
表2中的下划线所示的序列为酶切识别位点。
2、线性打靶DNA片段的构建
1)以甲型副伤寒沙门氏菌50973株基因组DNA为模板，用73waaLu1/73waaLu2和73waaLd1/73waaLd2分别扩增出waaL基因的上下游同源臂up和down。
PCR程序如下：94℃10min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。
2)pETKan的构建同实施例1。
3)BamHⅠ和SalⅠ双酶切up片段，得到基因片段3；BamHⅠ和SalⅠ双酶切质粒pETKan，得到载体大片段3；将基因片段3与载体大片段3连接，得到中间载体3；
HindⅢ和XhoⅠ双酶切down片段，得到基因片段4；HindⅢ和XhoⅠ双酶切中间载体3，得到载体大片段4；将基因片段4与载体大片段4连接，得到中间载体4。
4)用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切中间载体4，得到两侧为同源臂中间含kan基因的目的打靶DNA片段，该片段的核苷酸序列如SEQ ID No.71所示。
SEQ ID No.71中自5’末端起第7-571位核苷酸为up片段，第578-2073位核苷酸为kan基因，第2080-2543位核苷酸为down片段。
以SEQ ID No.71所示的DNA片段为模板，以73waaLu1和73waaLd2为引物，再次PCR扩增打靶片段，即可获得浓度高达300ng/μL的线性打靶DNA片段。
(二)S.paratyphi CMCC50973/pKOBEG的构建
由于pKOBEG质粒含有编码λ-Red重组***所需各种酶，将pKOBEG质粒电击转化至甲型副伤寒沙门氏菌50973感受态细胞中，涂于氯霉素抗性(pKOBEG质粒的抗性，氯霉素)的LB平板上，30℃培养过夜，得到的阳性克隆，将其命名为S.paratyphi 50973/pKOBEG菌株。
(三)线性打靶DNA片段电击转化S.paratyphi 50973/pKOBEG
1、将S.paratyphi CMCC50973/pKOBEG接种于含终浓度为30μg/mL氯霉素低盐LB液体培养基30℃培养过夜，并按照体积比1:100将其传代于低盐LB液体培养基，继续培养。
2、在步骤1的培养液在OD600值达到0.6前1h加入终浓度为1mmol/L的L-***糖诱导Red重组***的表达。
3、待步骤2的培养液OD600值为0.6时，取步骤(一)制备得到的300ng/μL的线性打靶DNA片段5μL电击转化S.paratyphi CMCC50973/pKOBEG。
4、在转化后的细胞中快速加入提前预冷的1mL低盐LB液体培养基，30℃复苏2.5h左右，然后涂布于含有50ug/mL卡那霉素的LB平板，放于30℃培养箱培养过夜，筛选出阳性克隆。
5、将阳性克隆接种于液体LB培养基(有卡那霉素抗性，浓度为50μg/mL)中，42℃培养传代两次(每次培养12h时间)，即可除去pKOBEG质粒，最终获得含卡那霉素抗性waaL缺失突变株，将其命名为S.paratyphi CMCC50973 waaL::kan。
(四)将编码FRT位点特异性重组酶的质粒pCP20电击转入S.paratyphi CMCC50973waaL::kan，在含50ug/mL氯霉素及不含卡那霉素的LB平板上30℃培养，筛选CmrKms(氯霉素抗性、卡那霉素敏感)的阳性克隆。
(五)将步骤(四)筛选到的阳性克隆，转入液体LB中42℃培养12小时，即可获得不含卡那霉素和质粒pCP20的目的基因缺失突变株，将其命名为S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL，即为脂多糖合成缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌。
二、S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL的分子鉴定
分别以S.paratyphi CMCC50973、S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL基因组DNA为模板，分别用一对waaL内部引物(73waaLn1/73waaLn2)，一对waaL外部引物(73waaLw1/73waaLw2)和kan引物(kan1/kan2)进行PCR验证。
结果如图12所示。
图12中，50973 ΔwaaL代表S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL；50973代表S.paratyphi CMCC50973。
图12表明，以S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL的基因组DNA为模板，以waaL内部引物为引物进行PCR扩增，没有目的条带；而以S.paratyphi CMCC50973的基因组DNA为模板，以waaL内部引物为引物进行PCR扩增，具有目的条带。并且由于S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL敲除了waaL基因，以S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL的基因组DNA为模板，以waaL外部引物为引物进行PCR扩增得到的条带比以S.paratyphi CMCC50973的基因组DNA为模板，以waaL外部引物为引物进行PCR扩增得到的条带小。由于最终去除了Kan抗性基因，以S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL的基因组DNA为模板，以kan引物为引物进行PCR扩增，没有目的条带。
上述结果证明成功构建waaL基因缺失、无抗生素基因的甲型副伤寒沙门氏菌50973突变株S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL。
三、S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL的表型鉴定
取1mL S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL的37℃过夜培养物，离心收集菌体，用PBS洗一次，加入100μL裂解缓冲液(该裂解液由10％SDS 2mL，2-巯基乙醇0.4mL，100％甘油1mL，2M pH6.8的Tris-HCL 5mL，10％溴酚蓝20μL，ddH2O 1.6mL混匀得到)充分混匀，沸水煮10分钟，加4μL20mg/mL的蛋白酶K的水溶液，60℃反应1至2小时，，得到裂解液；取裂解液15ul上样，进行SDS-PAGE电泳，将胶于固定液中放置过夜，加入增敏液作用30分钟，用去离子水洗3次，每次15分钟，加硝酸银溶液作用20分钟，用去离子水洗2次，每次1分钟，加显影液进行显色，最后终止反应，用去离子水洗。
同时以S.paratyphi CMCC50973进行上述实验，作为对照。
结果如图13所示。
图13中，50973 ΔwaaL代表S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL；50973代表S.paratyphi CMCC50973。
图13表明，野生株S.paratyphi CMCC50973有ladder形式的条带，而突变株因敲除了O-抗原连接酶基因waaL，由于WaaL的功能是将O抗原多糖(OPS)连接到类脂A-核心寡糖上形成脂多糖(LPS)，所以没有ladder形式的条带。
四、一步生物交联法制备甲型副伤寒沙门氏菌O多糖-重组EPA融合蛋白结合物
(一)糖基工程甲型副伤寒沙门氏菌S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA4573的构建
先后将载体pETtac28-pglL和pMMB66EH-rEPA4573电击转化宿主菌S.paratyphiCMCC50973 ΔwaaL，涂布含有终浓度为50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB双抗固体培养基，长出的克隆即为糖基工程甲型副伤寒沙门氏菌S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA4573。
(二)重组EPA融合蛋白的糖基化修饰与检测
挑取糖基工程菌S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA4573单克隆，接种于含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至25℃诱导20h，得到糖蛋白rEPA-OPSSpty50973。
次日取上述25℃诱导20h的菌液1mL，离心取菌体，用1X还原样缓悬起，沸水浴10min，用8％的SDS-PAGE电泳，电泳完毕后用Bio-Lab半干转转印仪将蛋白转至PVDF膜上，20V恒压转印1h，用anti-EPA抗体进行western-blot检测。
同时以转入pMMB66EH-rEPA4573而不转pETtac28-pglL的S.paratyphi CMCC50973ΔwaaL构建得到的S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL/pMMB66EH-rEPA4573为对照，进行上述诱导实验，作为对照。
结果如图14所示。
图14表明，底物蛋白rEPA4573在寡糖转移酶PglL的存在下，发生O糖基化修饰。
五、一步生物交联法制备甲型副伤寒沙门氏菌O多糖-重组CTB融合蛋白结合物
(一)糖基工程甲型副伤寒沙门氏菌S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4573的构建
先后将载体pETtac28-pglL和pMMB66EH-rCTB4573电击转化宿主菌S.paratyphiCMCC50973 ΔwaaL，涂布含有终浓度为50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB双抗固体培养基，长出的克隆即为糖基工程甲型副伤寒沙门氏菌S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4573。
(二)重组CTB融合蛋白的糖基化修饰与检测
挑取糖基工程菌S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rCTB4573单克隆，接种于含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至16℃诱导20h，得到糖蛋白rCTB-OPSSpty50973。
次日取上述16℃诱导20h的菌液1mL，离心取菌体，用1X还原样缓悬起，沸水浴10min，用8％的SDS-PAGE电泳，电泳完毕后用Bio-Lab半干转转印仪将蛋白转至PVDF膜上，20V恒压转印1h，用Anti-His tag鼠单克隆抗体进行western-blot检测。
同时以转入pMMB66EH-rCTB4573而不转pETtac28-pglL的S.paratyphi CMCC50973ΔwaaL构建得到的S.paratyphi CMCC50973 ΔwaaL/pMMB66EH-rCTB4573为对照，进行上述诱导实验，作为对照。
结果如图15所示。
图15表明，底物蛋白rCTB4573在寡糖转移酶PglL的存在下，发生O糖基化修饰。
实施例3、利用外源O157型大肠杆菌O多糖修饰重组CTB融合蛋白
利用外源多糖修饰重组融合蛋白时，需采用O-抗原连接酶基因和宿主O抗原合成双缺陷的细菌作为宿主，O-抗原连接酶基因缺失后，宿主菌表达的无论是自身多糖还是异源多糖均不能被宿主LPS合成途径利用，而宿主的O抗原合成缺陷则保证了糖基化修饰***只利用外源多糖修饰重组融合蛋白，而不会出现被宿主自身O抗原多糖修饰重组融合蛋白的污染现象。在此宿主菌中共表达重组融合蛋白基因、脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL基因、外源多糖合成基因簇，在寡糖转移酶PglL的催化下，外源多糖转移至重组融合蛋白上。
本实施例采用了大肠杆菌K12系列菌株为宿主菌W3110，K12系列菌株O抗原合成途径中的关键糖基转移酶鼠李糖转移酶基因wbbL天然***失活，不能合成自身O抗原，因此只需在此基础上敲除其O抗原连接酶基因waaL，便可构建O-抗原连接酶和O抗原合成双缺陷宿主菌。
一、O-抗原连接酶和O抗原合成双缺陷的宿主菌的构建
(一)线性打靶DNA片段的制备
1、PCR引物的设计和合成
根据GeneBack公布的大肠杆菌W3110株的基因组序列(AC_000091.1)设计waaL基因(第3696236-3697450位)的打靶片段。在waaL基因的上游和下游截取41bp作为同源臂，3’端为扩增两端含有FRT位点的氯霉素抗性基因的引物，从而通过PCR扩增获得两端带有waaL基因上下游41bp同源臂以及FRT位点的氯霉素抗性基因片段；同时，在waaL基因***设计引物3110waaL up 5'和3110waaL down 3'，用以鉴定waaL基因是否敲除。
上述引物如表3所示。
表3引物列表3
2、线性打靶DNA片段的构建
以质粒pKD3为模板，以3110waaLcat 5’和3110waaLcat 3'为引物进行PCR扩增，得到两端带有waaL基因上下游41bp同源臂以及FRT位点的氯霉素抗性基因片段，该片段如SEQID No.76所示。
(二)O-抗原连接酶基因waaL缺陷的大肠杆菌W3110(E.coli W3110 ΔwaaL)的获得
1、E.coli W3110/pKD46的制备
1)将E.coli W3110接于LB液体培养基中，37℃过夜培养后，按体积比1:100转接到100mL LB液体培养基中，37℃培养至OD600达到0.6。
2)离心收集菌体，用高压灭菌过的10％甘油(v/v)洗涤四次，最后用400μL的10％甘油重悬菌体，即可获得电击转化用E.coli W3110感受态细胞，分装待用。
3)将pKD46质粒(pKD46的复制子对温度敏感，37℃培养时丢失，此质粒含有编码Red重组的三个重组酶，由***糖启动子控制。)电击转化至制备的E.coli W3110感受态细胞中，涂于含终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，30℃培养过夜，得到的阳性克隆即为E.coli W3110/pKD46菌株。
2、E.coli W3110 waaL::cat的制备
1)将E.coli W3110/pKD46于30℃培养过夜，以体积比1:100传代于含100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基进行培养。
2)在OD600约为0.2时加入终浓度为0.2g/100ml的L-***糖诱导Red重组***的表达，待OD600值为0.6时，制备E.coli W3110/pKD46感受态细胞。
3)取10μL由步骤(一)得到的线性打靶DNA片段电击转化E.coli W3110/pKD46感受态细胞。
4)快速加入提前预冷的1mL LB培养基，30℃复苏2.5h左右，然后涂布于含终浓度为30μg/mL氯霉素的LB平板，放于30℃培养箱培养过夜。
5)筛选阳性克隆，提取其基因组DNA，以其为模板，以3110waaL up 5'和3110waaLdown 3'为引物进行PCR鉴定，得到PCR扩增产物。同时以E.coli W3110的基因组DNA为模板，进行上述PCR扩增，作为对照。
E.coli W3110的PCR扩增产物大小为1444bp，waaL基因被cat基因替换后的步骤5)得到的阳性克隆的PCR扩增产物大小为1246bp，将此阳性克隆命名为E.coli W3110 waaL::cat/pKD46。
6)将E.coli W3110 waaL::cat/pKD46接种于含终浓度为30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养传代三次(每次培养12h时间)，即可除去pKD46质粒，获得E.coli W3110waaL::cat菌株。
3、E.coli W3110 ΔwaaL菌株的获得
1)将pCP20电转至E.coli W3110 waaL::cat细胞，涂布含有100μg/mL浓度的氨苄青霉素的LB平板，获得W3110 waaL::cat/pCP20菌株。
2)挑取E.coli W3110 waaL::cat/pCP20单克隆于LB液体培养基，30℃培养至OD600约为0.6时转至42℃培养过夜。
(pCP20的复制子对温度敏感，42℃培养时丢失，此质粒含有编码FLP重组酶的DNA，由温敏启动子控制，42℃培养时诱导FLP重组酶表达，同时该质粒丢失。)
3)将42℃培养过夜的菌液在LB平板上划线分离单克隆，并在LB平板和含有氯霉素的LB平板上挑单克隆，选取在LB平板上生长而在含氯霉素LB平板上不生长的单克隆，将其命名为E.coli W3110 ΔwaaL，以其基因组DNA为模板，以3110waaL up 5'和3110waaL down3'进行PCR鉴定，得到PCR扩增产物。同时分别以E.coli W3110和E.coli W3110 waaL::cat的基因组DNA为模板，进行上述PCR扩增，作为对照。
结果如图16所示。
E.coli W3110的PCR扩增片段大小为1444bp，waaL基因被cat基因替换后的W3110waaL::cat的PCR扩增片段大小为1246bp，去除cat基因后的E.coli W3110 ΔwaaL的PCR扩增片段大小为316bp，图16表明，E.coli W3110 ΔwaaL构建成功。
二、重组CTB融合蛋白表达载体pMMB66EH-rCTB4573的构建同实施例1中步骤二的(三)。
三、脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL表达载体pETtac28-pglL的构建同实施例1中步骤二的(一)。
四、外源细菌多糖合成基因簇表达载体pACYC184-O157的构建
(一)根据NCBI网站上提供的O157的基因序列(GenBank:AF061251.1)，设计如下引物：
O157-5'：
5’-AGAAGGCGCGCCAAGAATGACGAATTTAAAAGCAGTTATACCGGTAGCAGGT-3’(SEQ IDNo.77)
(下划线所示序列为AscⅠ酶切识别位点)
O157-3'：
5’-ATATGCGGCCGCTTAATCCAGCCATTCGGTATGGAACACACCTTCTTT-3’(SEQ ID No.78)
(下划线所示序列为NotⅠ酶切识别位点)
(二)以大肠杆菌O157基因组DNA为模板，O157-5'和O157-3'为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为O157多糖合成基因簇片段，如SEQ ID No.79所示。
(三)根据载体质粒pACYC184的基因序列设计如下引物：
p184-5'：5’-ATATGGCGCGCCTCTGAGTTACAACAGTCCGC-3’(SEQ ID No.80)
(下划线所示序列为AscⅠ酶切识别位点)
p184-3'：5’-ATAAGCGGCCGCTTCAGGTGCTACATTTGAAG-3’(SEQ ID No.81)
(下划线所示序列为NotⅠ酶切识别位点)
(四)以pACYC184为模板，p184-5'和p184-3'为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为线性pACYC184载体片段，如SEQ ID No.82所示。
(五)AscⅠ与NotⅠ双酶切SEQ ID No.79所示的DNA分子，得到基因片段；AscⅠ与NotⅠ双酶切SEQ ID No.82所示的DNA分子，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pACYC184-O157，将pACYC184-O157送测序结果正确。
五、糖基工程大肠杆菌的构建
将pMMB66EH-rCTB4573、pETtac28-pglL和pACYC184-O157三个重组载体电转进宿主菌E.coli W3110 ΔwaaL，涂布氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素三抗LB平板，长出的克隆即糖基工程大肠杆菌E.coli W3110 ΔwaaL/pMMB66EH-rCTB4573/pETtac28-pglL/pACYC184-O157。
六、重组CTB融合蛋白rCTB4573-OPSEcO157的糖基化修饰与检测
挑取糖基工程菌E.coli W3110 ΔwaaL/pMMB66EH-rCTB4573/pETtac28-pglL/pACYC184-O157单克隆，接种于100μg/mL的氨苄青霉素、50μg/mL的卡那霉素和30μg/mL的氯霉素三抗LB培养基，37℃培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至16℃诱导20h，使其表达rCTB4573-OPSEcO157。
取上述16℃诱导20h的菌液1mL，离心取菌体，用1X还原样缓悬起，沸水浴10min，用15％的SDS-PAGE电泳，电泳完毕后用Bio-Lab半干转转印仪将蛋白转至PVDF膜上，20V恒压转印1h，用兔源抗大肠杆菌O157抗血清检测。
并以E.coli W3110 ΔwaaL/pMMB66EH-rCTB4573/pETtac28-pglL为对照。
结果如图17所示。
图17表明，底物蛋白rCTB4573在寡糖转移酶PglL和外源多糖合成基因簇的存在下，发生O糖基化修饰。

Claims (14)

1.一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法，是将重组融合蛋白和脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL在O-抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达，脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL将细菌自身的多糖连接到所述重组融合蛋白上，得到所述细菌多糖修饰的重组融合蛋白；
所述重组融合蛋白含有N端信号肽、具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段和载体蛋白序列；
所述O-抗原连接酶基因缺陷的细菌为O-抗原连接酶基因缺陷的福氏志贺氏菌、O-抗原连接酶基因缺陷的甲型副伤寒沙门氏菌；
所述载体蛋白为细菌毒素蛋白的无毒突变体或细菌毒素蛋白的部分片段；
所述细菌毒素蛋白的无毒突变体为绿脓杆菌外毒素蛋白A无毒突变体；
所述细菌毒素蛋白的部分片段为霍乱毒素B亚单位或破伤风毒素C蛋白；
所述具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段为含有脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第55位至第66位的任意肽段。
2.一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法，是将重组融合蛋白、脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL和外源多糖合成基因簇在O-抗原连接酶基因缺陷和O-抗原合成基因缺陷的细菌中共表达，脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL将外源多糖连接到所述重组融合蛋白上，得到所述细菌多糖修饰的重组融合蛋白；
所述重组融合蛋白含有N端信号肽、具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段和载体蛋白序列；
所述O-抗原连接酶基因缺陷和O-抗原合成基因缺陷的细菌为O-抗原连接酶基因缺陷和O-抗原合成基因缺陷的大肠杆菌；
所述载体蛋白为细菌毒素蛋白的无毒突变体或细菌毒素蛋白的部分片段；
所述细菌毒素蛋白的无毒突变体为绿脓杆菌外毒素蛋白A无毒突变体；
所述细菌毒素蛋白的部分片段为霍乱毒素B亚单位或破伤风毒素C蛋白；
所述具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段为含有脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第55位至第66位的任意肽段。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述含有脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第55至第66位的任意肽段为如下任一所示的肽段：
（1）SEQ ID No.32中自N端起第128位至第156位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；
（2）SEQ ID No.34中自N端起第128位至第154位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；
（3）SEQ ID No.36中自N端起第128位至第152位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；
（4）SEQ ID No.38中自N端起第128位至第150位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；
（5）SEQ ID No.40中自N端起第128位至第149位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；
（6）SEQ ID No.48中自N端起第22位至第40位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；
（7）SEQ ID No.50中自N端起第22位至第36位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；
（8）SEQ ID No.52中自N端起第22位至第33位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述绿脓杆菌外毒素A无毒突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.46中自N端起第20位至第631位所示；
所述霍乱毒素B亚单位的氨基酸序列如SEQ ID No.32中自N端起第20位至第122位所示；
所述破伤风毒素C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.60中自N端起第20位至第455位所示。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述重组融合蛋白的氨基酸序列为如下任一所示：
（1）SEQ ID No.32所示的氨基酸序列；
（2）SEQ ID No.34所示的氨基酸序列；
（3）SEQ ID No.36所示的氨基酸序列；
（4）SEQ ID No.38所示的氨基酸序列；
（5）SEQ ID No.40所示的氨基酸序列；
（6）SEQ ID No.46所示的氨基酸序列；
（7）SEQ ID No.48所示的氨基酸序列；
（8）SEQ ID No.50所示的氨基酸序列；
（9）SEQ ID No.52所示的氨基酸序列；
（10）SEQ ID No.56所示的氨基酸序列；
（11）SEQ ID No.58所示的氨基酸序列；
（12）SEQ ID No.60所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述重组融合蛋白是通过重组表达载体导入所述细菌中的，所述重组表达载体是将所述重组融合蛋白的编码基因***pMMB66EH的多克隆位点间得到的；
所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL是通过重组表达载体导入所述细菌中的，所述重组表达载体是将所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的表达盒***pET28a(+)的多克隆位点间得到的；
所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的表达盒如SEQ ID No.30所示。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述外源多糖是通过含有多糖合成基因簇的重组表达载体导入所述细菌的；
所述多糖合成基因簇如SEQ ID No.79所示；
所述含有多糖合成基因簇的重组表达载体按照如下方法制备：AscⅠ与NotⅠ双酶切SEQID No.79所示的DNA分子，得到基因片段；AscⅠ与NotⅠ双酶切SEQ ID No.82所示的DNA分子，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接即得。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述O-抗原连接酶基因缺陷和O-抗原合成基因缺陷的大肠杆菌为大肠杆菌K12系列菌株。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述表达之后还有细菌裂解、离心收集上清、除盐和/或分离纯化的步骤。
10.由权利要求1-9任一所述的方法制备得到的细菌多糖修饰的重组融合蛋白。
11.一种由权利要求1-9任一所述的方法制备得到的细菌多糖修饰的重组融合蛋白制备的疫苗。
12.权利要求1-9任一所述的方法制备得到的细菌多糖修饰的重组融合蛋白在制备能引起动物体内产生抗O多糖的特异性抗体的产品中的应用。
13.权利要求1-9任一所述的方法制备得到的细菌多糖修饰的重组融合蛋白在制备预防和/或治疗细菌引起的疾病的产品中的应用。
14.根据权利要求12或13所述的应用，其特征在于：所述产品为疫苗。
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