JP2022513375A - ＮＡＭＰＴｉ感受性のバイオマーカーとしてのＰＰＭ１Ｄ変異の同定法 - Google Patents
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- PEBYEZPDLXGJMY-UHFFFAOYSA-N CC[N](C)(C(N)=N)I Chemical compound CC[N](C)(C(N)=N)I PEBYEZPDLXGJMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
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Abstract
本発明は、少なくとも1種類のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ (NAMPT) 阻害剤を対象に投与し、それによって、プロテインホスファターゼMg2+/Mn2+依存性1D (PPM1D)が上昇しているがんを処置する段階を含む、対象のがんを処置する方法を提供する。TIFF2022513375000008.tif39128
Description
関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C. §119(e)の下で、2018年10月22日に出願された米国仮特許出願第62/748,911号に対する優先権を主張するものであり、その出願はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、35 U.S.C. §119(e)の下で、2018年10月22日に出願された米国仮特許出願第62/748,911号に対する優先権を主張するものであり、その出願はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
発明の背景
プロテインホスファターゼMg2+/Mn2+依存性1D (PPM1D) 遺伝子は、Wip1としても公知であり、主にDNA損傷応答 (DDR) および細胞チェックポイント経路に関与する多くのタンパク質を脱リン酸化するセリン／スレオニンホスファターゼをコードする。20年以上前に発見されて以来、PPM1Dは十分に確立されたがん遺伝子となっており、乳がん、卵巣がん、消化器がん、および脳がんを含む多様な範囲のがんで増幅または過剰発現されて見出される。その後、PPM1DのC末端における切断変異が、一部のがんにおいて、最も注目すべきはびまん性内在性橋膠腫 (DIPG) を含む小児神経膠腫において、同定された。これらの変異は、PPM1Dのタンパク質安定性を著しく強化し、これは同様にそのホスファターゼ活性を高める。PPM1Dの細胞機能の特徴付けにもかかわらず、腫瘍形成におけるその役割については、まだ理解されていないことが数多くある。さらに複雑なことに、PPM1D切断型変異を含む同質遺伝子的なグリア細胞株が存在せず、その発がん性の役割を調べる能力が限定される。最後に、いくつかのPPM1D阻害剤が実験ツールとして開発されてきたが、そのインビトロでの成功はまだ臨床に結びついていない。がんを処置するために使用できる新規の化合物および組成物が、当技術分野において必要である。本開示は、この必要性に対処するものである。
プロテインホスファターゼMg2+/Mn2+依存性1D (PPM1D) 遺伝子は、Wip1としても公知であり、主にDNA損傷応答 (DDR) および細胞チェックポイント経路に関与する多くのタンパク質を脱リン酸化するセリン／スレオニンホスファターゼをコードする。20年以上前に発見されて以来、PPM1Dは十分に確立されたがん遺伝子となっており、乳がん、卵巣がん、消化器がん、および脳がんを含む多様な範囲のがんで増幅または過剰発現されて見出される。その後、PPM1DのC末端における切断変異が、一部のがんにおいて、最も注目すべきはびまん性内在性橋膠腫 (DIPG) を含む小児神経膠腫において、同定された。これらの変異は、PPM1Dのタンパク質安定性を著しく強化し、これは同様にそのホスファターゼ活性を高める。PPM1Dの細胞機能の特徴付けにもかかわらず、腫瘍形成におけるその役割については、まだ理解されていないことが数多くある。さらに複雑なことに、PPM1D切断型変異を含む同質遺伝子的なグリア細胞株が存在せず、その発がん性の役割を調べる能力が限定される。最後に、いくつかのPPM1D阻害剤が実験ツールとして開発されてきたが、そのインビトロでの成功はまだ臨床に結びついていない。がんを処置するために使用できる新規の化合物および組成物が、当技術分野において必要である。本開示は、この必要性に対処するものである。
1つの局面において、本発明は、少なくとも1種類のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ (NAMPT) 阻害剤を対象に投与し、それによってがんを処置する段階を含む、対象のがんを処置する方法であって、対象のがんから採取された生検試料において、プロテインホスファターゼMg2+/Mn2+依存性1D (PPM1D)が上昇している、前記方法を提供する。
様々な態様において、前記方法は、対象から採取されたがん細胞試料において、参照レベルと比較して上昇したレベルのPPM1Dを検出する段階をさらに含む。
様々な態様において、がんは、PPM1D遺伝子における1つまたは複数の変異を含む。
様々な態様において、PPM1DはC末端切断変異を含む。
様々な態様において、少なくとも1種類のNAMPT阻害剤は、OT-82、KPT-9274、FK866、GNE-618、LSN-3154567、FK866、STF31、GPP78、およびSTF118804からなる群より選択される。
様々な態様において、がんは、乳がん、卵巣がん、消化器がん、脳がん、髄芽腫、または小児神経膠腫である。
様々な態様において、前記方法は、少なくとも1種類の付加的なニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NAD) 枯渇処置を対象に施す段階をさらに含む。
様々な態様において、付加的なNAD枯渇処置は、テモゾロミド、エトポシド、イリノテカン、および放射線療法からなる群より選択される。
様々な態様において、前記方法は、補足的なニコチンアミドを対象に投与する段階をさらに含む。
様々な態様において、有効量のNAMPT阻害剤は、少なくとも1種類の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物の状態で対象に投与される。
様々な態様において、対象は哺乳動物である。
様々な態様において、対象はヒトである。
本発明の例示的な態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読んだ場合に、より良く理解されるであろう。本発明を例証するために、ある特定の例示的な態様を図面に示してある。しかしながら、本発明が、図面中に示されている態様の厳密な配置および手段に限定されないことが理解されるべきである。
図1A～1J：PPM1D変異不死化ヒトアストロサイトは、NAMPT阻害剤に感受性がある。図1A：小児HGGにおいて以前に同定された（参考文献8、9、10）PPM1D切断変異（青丸）。ヒトアストロサイトにおいてCRISPRで改変された変異を赤矢印で示す。図1B：親アストロサイト (Par.)、単離された野生型アストロサイトクローン (WT iso.)、および4つの異なる、単離されたCRISPR改変PPM1D切断型 (PPM1Dtrnc.) アストロサイトにおける、PPM1D全長（完全な矢印）および切断型（矢頭）タンパク質発現の免疫ブロット。図1C：シクロヘキシミド (CHX) およびMG132処理後のPPM1D発現の免疫ブロット。図1D：cの実験の定量化（n＝3回の生物学的に独立した実験、スチューデントのT検定による* p＜0.05、** p＜0.0l）。図1E：10Gy電離放射線 (IR) による処理が+/-の、細胞のγH2AXフォーカスの代表的な画像。図1F: 未処理、IR処理、およびIR＋50 nM PPM1D阻害剤GSK2830371 (PPM1Di) の同時処理におけるγH2AXフォーカスの定量化；（n＝4つの生物学的に独立した試料、スチューデントのT検定による** p＜0.001）。図1G：試験した小分子阻害剤のライブラリーの算出されたIC50比（親／PPM1Dtrnc.）。図1H：FK866処理の72時間後の、野生型（Par.アストロサイトおよびWT iso.）ならびに3つのPPM1Dtrnc.細胞株の生存率評価（n＝3つの生物学的に独立した試料）。図1I：異なるNAMPT阻害剤に対する、親アストロサイト（黒のハイライト）およびPPM1Dtrnc.アストロサイト（赤のハイライト）の算出されたIC50値；バーの長さは、PPM1D変異細胞に対する所与の薬物の選択性ウィンドウを表す（n＝2回の生物学的に独立した実験）。図1J：72時間のFK866処理に応答した細胞株の生存率解析（n＝3つの生物学的に独立した試料）。エラーバーはすべて、平均値の標準偏差を表す。
図1-1の説明を参照のこと。
図2A～2K：変異PPM1D誘導性のNAPRT欠損は、NAMPT阻害に対する感受性を駆動する。図2A：NAD生合成に関与する酵素および代謝物の図解モデル。NA：ニコチン酸；NAAD：ニコチン酸アデニンジヌクレオチド；NAD：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド；NADP：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸；NAM：ニコチンアミド；NAMN：ニコチン酸モノヌクレオチド；NAR: ニコチン酸リボシド；NMN：ニコチンアミドモノヌクレオチド；NR：ニコチンアミドリボシド；QA：キノリン酸；Trp：トリプトファン。図2B：親アストロサイト細胞株および2つの異なるPPM1Dtrnc.アストロサイト細胞株におけるNAD関連代謝物のヒートマップ。図2C：野生型およびPPM1Dtrnc.アストロサイトにおけるNADの定量化（n＝3つの生物学的に独立した試料、スチューデントのT検定による**** p＜0.0001）。図2D：10nM FK866処理後のNADレベルの相対的変化倍率（n＝3つの生物学的に独立した試料、スチューデントのT検定による*** p＜0.001）。図2E：PPM1Dtrnc.アストロサイトにおけるFK866処理に及ぼすNRの拮抗作用をモデル化したBliss 3D表面プロット。図2F：スクランブル対照 (scrbl) またはNAPRT siRNAのいずれかで処理した後、FK866で処理した親アストロサイトの細胞生存率解析（n＝2つの生物学的に独立した試料、スチューデントのT検定による**** p＜0.0001）。図2G：同質遺伝子的アストロサイト、ならびにWTおよび変異PPM1Dを安定的に過剰発現するアストロサイト（それぞれOEFLおよびOEtrnc.）の免疫ブロット。PPM1Dの全長（完全な矢印）、CRISPR改変（黒い矢頭）、および異所性変異体（白い矢頭）のサイズを示してある。図2H：FK866処理に対する同質遺伝子的アストロサイトおよび安定的NAPRT発現PPM1Dtrnc.アストロサイト（PPM1Dtrnc.＋NAPRT）の生存率評価（n＝4つの生物学的に独立した試料、スチューデントのT検定による*** p＜0.001、**** p＜0.0001）。図2I：以前に記載された野生型およびPPM1D変異アストロサイトならびに患者由来のSU-DIPG細胞株の免疫ブロット。図2J：FK866で120時間処理した後のSU-DIPG細胞株の生存率評価（n＝3つの生物学的に独立した試料）。図2K：未処理のまたは10nM FK866で処理したjのスフェロイド培養物からの代表的な画像。エラーバーはすべて、平均値の標準偏差を表す。
図2-1の説明を参照のこと。
図3A～3F：エピジェネティック事象はPPM1D変異神経膠腫モデルにおいてNAPRT発現をサイレンシングする。図3A：野生型アストロサイト（灰色）および変異PPM1D発現アストロサイト（赤色）ならびにDIPG細胞株における、qPCRによるNAPRT転写物レベルの定量化（n＝3つの生物学的に独立した試料、スチューデントのT検定による** p＜0.01、*** p＜0.001）。図3B：NAPRTプロモーターにおける一般的なヒストン3修飾のクロマチン免疫沈降 (ChIP)；IgG対照に対する濃縮倍率として定量化（n＝4つの生物学的に独立した試料、スチューデントのT検定による** p＜0.01、**** p＜0.0001）。図3C：NAPRTプロモーターから免疫沈降されたメチル化DNA (5-meC) およびヒドロキシメチル化DNA (5hmC) の定量化（n＝2つの生物学的に独立した試料、スチューデントのT検定による** p＜0.01）。図3D：バイサルファイト変換後のアストロサイトおよびSU-DIPG細胞株内のNAPRTプロモーターの配列決定クロマトグラム；矢印は潜在的なCpGメチル化部位を示す。図3E：異なるアストロサイトおよびDIPGモデルにわたる、390個の最も有意な可変的Infiniumメチル化EPICアレイプローブのヒートマップおよびクラスタリング解析。図3F：NAPRT CpGアイランドプロモーター領域内に位置するメチル化アレイプローブのヒートマップおよび階層的クラスタリング解析。エラーバーはすべて、平均値についての95%信頼区間を表す。
図3-1の説明を参照のこと。
図3-1の説明を参照のこと。
図4A～4D：NAMPT阻害剤は、PPM1D変異異種移植片に対してインビボで有効な作用物質である。図4A：4日間投与した後3日間休薬するという3サイクルで媒体または20mg/kg FK866 BIDで処置したNSGマウスにおける、連続移植されたPPM1Dtrnc.異種移植片の腫瘍増殖の変化倍率（n＝動物7匹、マン・ホイットニーU検定による*** p＜0.001、エラーバーは平均値の標準偏差を表す）。矢印は処置サイクルの開始を示す。図4B：aからの異種移植片腫瘍増殖のカプラン・マイヤープロットであり、矢印は処置サイクルの開始を示す（ログランク（マンテル・コックス）検定によるp＜0.000l）。図4C：PNOC003 DIPGコホート (31) 試料のNAPRT発現レベル。図4D：NAD産生のNAMPTへの変異PPM1D誘導性の依存、およびFK866などのNAMPT阻害剤による合成致死の機構を示すモデル。
図5A～5G：PPM1D変異アストロサイトはNAMPT阻害剤に感受性がある図5A：親細胞株およびPPM1Dtrnc.細胞株からのPPM1Dエクソン6の領域内の配列決定クロマトグラム。図5B：放射線照射に応答した親細胞株およびPPM1Dtrnc.細胞株の免疫ブロット。PPM1Dの全長（完全な矢印）およびCRISPR改変（矢頭）のサイズを示してある。図5C：放射線照射 (IR) 後のγH2AXフォーカスの定量化（n＝4つの独立した試料）。図5D：3種類の異なるNAMPT阻害剤（GPP78、STF 118804、およびSTF31）で72時間処理した後の細胞株の生存率評価（n＝3つの独立した試料）。図5E：アストロサイト細胞株におけるPPM1D転写物レベルの定量化（n＝4つの独立した試料）。図5F：野生型 (OEFL) または変異 (OEtrnc.) PPM1Dを安定的に発現するアストロサイトの免疫ブロット。PPM1Dの全長（完全な矢印）、CRISPR編集（黒い矢頭）、および異所性発現変異タンパク質（白い矢頭）のサイズを示してある。図5G：DMSOまたはFK866処理の72時間後の、親および変異アストロサイトからのH33342で染色された核の代表的なウェル。エラーバーは平均値の標準偏差を表す。
図5-1の説明を参照のこと。
図6A～6L：PPM1Dtrnc.アストロサイトにおけるNADメタボロームの減少は、NAMPT阻害剤感受性をもたらす。図6A：親およびPPM1Dtrnc.アストロサイトにおけるNADPの定量化（n＝3つの独立した試料、スチューデントのT検定による*** p＜0.001）。図6B：10nM FK866で24時間処理した後のNADPレベルの相対的変化倍率（n＝3つの独立した試料、スチューデントのT検定による** p＜0.01）。図6C：50μMニコチンアミドリボシド (NR) を24時間外因的に添加した後のNADの定量化（n＝3つの独立した試料、スチューデントのT検定による* p＜0.05、** p＜0.01）。図6D：10nM FK866および表示用量のNRで24時間処理した後のアストロサイトにおける正規化NADレベル（n＝2つの独立した試料）。図6E：PPM1Dtrnc.アストロサイトにおけるFK866処理に及ぼすNRの拮抗作用のBlissモデルマトリックス。図6F：FK866とNRの72時間の同時処理後のPPM1Dtrnc.アストロサイトの生存率評価。図6Gおよび図6J：PPM1Dtrnc.におけるFK866処理に及ぼすNAM（図6G）またはNA（図6J）の拮抗作用をモデル化したBliss 3D表面プロット。図6Hおよび図6K：PPM1Dtrnc.におけるFK866処理に及ぼすNAM（図6H）またはNA（図6K）の拮抗作用のBlissモデルマトリックス。図6Iおよび図6L：FK866とNAM（図6I）またはNA（図6L）の72時間の同時処理後のPPM1Dtrnc.アストロサイトの生存率評価。エラーバーは平均値の標準偏差を表す。
図6-1の説明を参照のこと。
図6-1の説明を参照のこと。
図7A～7E：NAPRTの欠損は、NAMPT阻害剤に対するPPM1D変異アストロサイトの感受性を駆動する。図7A：NAD生合成関連酵素を標的とする一連のsiRNAをトランスフェクトした後のFK866処理に対する親アストロサイト（左側）およびPPM1Dtrnc.アストロサイト（右側）の正規化生存率。（n＝2つの独立した試料）。図7B：異なるNAPRT標的化siRNAで処理した後のNAPRTタンパク質レベルの免疫ブロット。図7C：FK866で72時間処理したb.の細胞株の生存率解析（n＝4つの独立した試料）。図7D：NAPRTの安定的発現が+/-の親およびPPM1Dtrnc.アストロサイトの免疫ブロット。図7E：FK866で72時間処理した際の、Par.アストロサイト、PPM1Dtrncs.、およびNAPRT発現PPM1Dtrnc. (PPM1Dtrnc.＋NAPRT) 細胞株の生存率評価（n＝4つの独立した試料）。エラーバーは平均値の標準偏差を表す。
図7-1の説明を参照のこと。
図8A～8C：患者由来のSU-DIPG-XXXVスフェロイド細胞株は、切断型PPM1D変異を有し、NAMPT阻害剤に感受性がある。図8A：SU-DIPG-IV、SU-DIPG-XIII、およびSU-DIPG-XVIIスフェロイド細胞株からのPPM1Dエクソン6の領域内の配列決定クロマトグラム。図8B：SU-DIPG-XXXVにおけるPPM1D切断型変異のクロマトグラム。図8C：ニコチン酸 (NA) を含む (+NA) またはNAを欠く (-NA) 培養液中でのFK866に対するSU-DIPGスフェロイドの生存率評価（n＝3つの独立した試料）。エラーバーは平均値の標準偏差を表す。
図8Aの説明を参照のこと。
図8Aの説明を参照のこと。
図9A～9E：U2OSおよびMCF7細胞株は、PPM1D変化を含み、NAPRT転写をサイレンシングし、かつNAMPT阻害剤に感受性がある。図9A：同質遺伝子的アストロサイト、U2OS、およびMCF7細胞株の免疫ブロット。図9Bおよび図9C：aからの細胞パネルにおけるPPM1D（図9B）およびNAPRT（図9C）の正規化mRNA発現（n＝4つの独立した試料）。エラーバーは、平均値についての95%信頼区間を表す。（図9D）バイサルファイト変換後のU2OSおよびMCF7細胞株内のNAPRTプロモーターの配列決定クロマトグラム；矢印は潜在的なCpGメチル化部位を示す。(図9E) FK866で96時間処理した後の同質遺伝子的アストロサイト、U2OS、およびMCF7細胞株の生存率評価（n＝3つの独立した試料）。エラーバーは平均値の標準偏差を表す。
図10A～10E：PPM1D変異を有するDIPGモデル細胞株は、NAPRT発現が減少し、p53発現を維持している。図10A 図3Eにおける患者由来のDIPG細胞株の変異状態を示す表；NDは利用可能なデータがないことを示す。図10B：モデルDIPG細胞株のNAPRT発現レベル。図10C NAPRTおよびH3K27Mの発現に関する、選択されたアストロサイトおよびDIPG細胞株の免疫ブロット。図10D：FK866で120時間処理した後のHSJD-DIPG-007細胞株の生存率（n＝5つの独立した試料）。エラーバーは平均値の標準偏差を表す。図10E：p53およびH3K27Mの発現に関するDIPG細胞株パネルの免疫ブロット。
図11A～11E：変異PPM1D誘導性の過剰メチル化は、IDH1変異アストロサイトで見られるG-CIMPとは異なる。図11Aおよび図11B：アストロサイト（図11A）およびDIPG（図11B）細胞株における、上位2%の有意に可変的なメチル化プローブの階層的クラスタリング。（図11C）PPM1D変異アストロサイトとIDH1変異アストロサイトにおける、上位2%の有意に可変的なCpGアイランドプローブセットの比較。図11D：WTおよびPPM1D変異アストロサイトにおける全体的5-ヒドロキシメチルシトシンの正規化レベル（n＝4つの独立した試料）。エラーバーは、平均値についての95%信頼区間を表す。図11E：様々な用量のデシタビン (DCT) またはアザシチジン (azaC) で72時間処理した後の、親およびPPM1Dtrnc.アストロサイトの免疫ブロット。
図12A～12E：PPM1D変異腫瘍におけるNAMPT阻害剤のインビボ有効性。図12A：矢印によって示されるように4日間の3サイクルで媒体または20mg/kg FK866 BIDで処置したNOD scid γマウスにおける、生物発光イメージング (BLI) シグナルの測定値としてのPPM1Dtrnc.腫瘍量（n＝10匹の独立した動物、エラーバーはSEを表す、マン・ホイットニーU検定による** p＜0.01、*** p＜0.001）。図12B 媒体およびFK866で処置したマウスの処置期間中の代表的なBLI画像。図12C：注射の2ヶ月後の、a.において抽出された腫瘍からの腫瘍質量測定値（n＝14個の独立した腫瘍、スチューデントのT検定による**** p＜0.0001）。図12D：注射の12日後の、PPM1Dtrnc.細胞株異種移植片と、連続移植されたPPM1D変異異種移植片との間のBLIシグナル強度の比較（n＝17個の独立した腫瘍、スチューデントのT検定による** p＜0.0l）。エラーバーは平均値の標準偏差を表す。図12E：表示の処置の3週間前または3週間後の、連続移植されたPPM1D変異異種移植片の代表的なBLI画像。
図13A～13E：PPM1D変異の非神経膠腫腫瘍の処置に対するNAMPT阻害剤の適用性。図13A：媒体またはFK866で処置した、U2OS細胞株異種移植片を保有する胸腺欠損ヌードマウスの腫瘍体積測定値。FK866処置は、矢印によって示された、週4日の3サイクルの20mg/kg BIDからなった（n＝15匹の独立した動物、マン・ホイットニーU検定による**** p＜0.0001）。エラーバーは平均値の標準偏差を表す。図13B：図13Aに記載の処置期間中に各マウスについて測定された体重の変化パーセント。図13C：PNOC003 DIPGコホート (31) 腫瘍試料からのNAPRTおよびPPM1Dの発現レベル。図13D: 図13Cのコホートからの野生型とPPM1D変異のDIPG腫瘍におけるNAPRT発現レベルの比較。図13E：PPM1Dの増幅を有することが一般的に見出されるがんサブタイプにおける、PPM1D高発現腫瘍と低発現腫瘍におけるNAPRT発現レベルの比較（左側）；PPM1D発現のヒストグラム（右側）。スチューデントのT検定による* p＜0.05、** p＜0.01
図13-1の説明を参照のこと。
発明の詳細な説明
本発明は、一部には、PPM1D活性のレベルが上昇したがんをNAMPT阻害剤で効果的に処置することができるという予想外の発見に関する。理論によって制限されることは望まないが、本明細書で提示されるデータにより、これは、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ (NAPRT) をサイレンシングすることにより、細胞においてNADを産生するための主要な経路の1つが遮断されることに起因し得ることが示される。このことから、NADを産生するためのNAMPT経路は細胞の生存に不可欠となり、そのため、この経路を阻害することで、NAPRTに関連したNAD産生に依存できる非がん性細胞を残しながら、依存できないがん細胞を選択的に死滅させることができる。
本発明は、一部には、PPM1D活性のレベルが上昇したがんをNAMPT阻害剤で効果的に処置することができるという予想外の発見に関する。理論によって制限されることは望まないが、本明細書で提示されるデータにより、これは、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ (NAPRT) をサイレンシングすることにより、細胞においてNADを産生するための主要な経路の1つが遮断されることに起因し得ることが示される。このことから、NADを産生するためのNAMPT経路は細胞の生存に不可欠となり、そのため、この経路を阻害することで、NAPRTに関連したNAD産生に依存できる非がん性細胞を残しながら、依存できないがん細胞を選択的に死滅させることができる。
定義
特に定義されない限り、本明細書で用いられる専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料は記載されるものである。本明細書で用いられる場合、以下の用語はそれぞれ、この項でそれに関連付けられる意味を有する。
特に定義されない限り、本明細書で用いられる専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料は記載されるものである。本明細書で用いられる場合、以下の用語はそれぞれ、この項でそれに関連付けられる意味を有する。
一般に、本明細書で用いられる命名法、ならびに細胞培養、分子遺伝学、薬理学、および有機化学における実験手順は、当技術分野において周知でありかつ一般的に用いられるものである。
生化学的および／または生物学的操作には、標準的な技法が用いられる。技法および手順は一般に、当技術分野における従来法、ならびに本書の全体にわたって提供される様々な一般的参考文献（例えば、Sambrook and Russell, 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY、およびAusubel et al., 2002, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY）に従って行われる。
「1つの (a)」および「1つの (an)」という冠詞は、本明細書において、その冠詞の文法的目的語の1つまたは2つ以上（すなわち、少なくとも1つ）を指すように用いられる。例として、「1つの要素」は1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
量、時間的長さ等などの測定可能な値に言及する場合に本明細書で用いられる「約」は、特定の値からの±20%または±10%、より好ましくは±5%、さらにより好ましくは±1%、一層より好ましくは±0.1%の変動を包含するものとするが、これは開示された方法を実施する上でそのような変動が妥当なためである。
患者が経験する疾患または障害の少なくとも1つの徴候または症状の重症度または頻度が低下する場合に、疾患または障害は「軽減」される。
本明細書で用いられる場合、「アナログ」、「類似体」、または「誘導体」という用語は、1つまたは複数の化学反応によって親の化合物または分子から作製された化学化合物または分子を指すものとする。したがって、アナログは、本明細書に記載される小分子阻害剤のものと類似した構造を有する構造体であり得るか、または本明細書に記載される小分子の骨格に基づき得るが、ある特定の構成要素または構造構成に関してそれとは異なり、代謝的に類似のまたは反対の作用を有する場合がある。
本明細書で用いられる場合、「結合」という用語は、これらに限定されないが、酵素と基質、抗体と抗原、DNA鎖とそれらの相補鎖などの、分子の互いの付着を指す。結合は、分子表面の部分の形状および化学的性質が相補的であるために生じる。よく用いられる喩えは、酵素がどのようにその基質の周りに適合するかを説明するために用いられる「鍵と鍵穴」である。
本明細書で用いられる場合、「生検試料」という用語は、生検によって対象から採取された任意の種類の試料、または対象のがん性増殖と関連した組織、細胞、もしくは液体を含む任意の試料を意味する。
遺伝子、タンパク質、または化学反応に適用される場合に本明細書で用いられる「上昇した」という用語は、遺伝子、タンパク質、または反応の発現、活性、または濃度が、適切な対照と比較してより高いことを意味する。
「阻害する」という語句は、本明細書で用いられる場合、分子、反応、相互作用、遺伝子、mRNA、および／もしくはタンパク質の発現、安定性、機能、もしくは活性を測定可能な量だけ減少させること、または完全に妨げることを意味する。阻害剤は、例えば、タンパク質、遺伝子、およびmRNAに結合して、部分的にまたは完全に刺激を遮断し、活性化を減少させ、妨げ、遅延させ、不活性化し、脱感作し、または安定性、発現、機能、および活性を下方制御する化合物、例えばアンタゴニストである。
本明細書で用いられる場合、「ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド枯渇処置」または「NAD枯渇処置」という用語は、対象において全体的にまたは局所的にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NAD) のレベルを低下させる処置を意味する。様々な態様において、NAD枯渇治療は、テモゾロミドおよび／または放射線療法の施行と組み合わせることができる。
本明細書で用いられる場合、「ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ」または「NAMPT」という用語は、ヒト相同体についてUniProtアクセッション番号P43490を有し、かつアミノ酸配列：
SEQ ID NO：15
を有するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子またはタンパク質を指す。
SEQ ID NO：15
本明細書で用いられる場合、「ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤」または「NAMPT阻害剤」という用語は、NAMPTを阻害する任意の作用物質を指す。様々な態様において、NAMPT阻害剤は、低分子干渉RNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸ベースの阻害剤であってよい。様々な態様において、NAMPT阻害剤は小分子であってよい。
「患者」、「対象」、「個体」等という用語は、本明細書において互換的に使用され、本明細書に記載される方法に適している任意の動物、またはインビトロもしくはインサイチューにかかわらずその細胞を指す。ある特定の非限定的な態様において、患者、対象、または個体はヒトである。
本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、本発明において有用な化合物を、その意図された機能を果たし得るように患者内または患者へ運搬または輸送することに関与する、液体または固体の増量剤、安定剤、分散剤、懸濁化剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒、または封入材料などの、薬学的に許容される材料、組成物、または担体を意味する。典型的には、そのような構築物は、ある器官または身体の一部から別の器官または身体の一部に運搬または輸送される。各担体は、本発明において有用な化合物を含む製剤の他の成分と適合し、かつ対象に有害ではないという意味で、「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロースなど；デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなど；粉末トラガカントゴム；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばカカオ脂および坐剤ろうなど；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油など；グリコール、例えばプロピレングリコールなど；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなど；エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；界面活性剤；アルギン酸；発熱物質不含の水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに薬学的製剤において用いられるその他の非毒性適合性物質が含まれる。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される担体」には、本発明において有用な化合物の活性と適合し、かつ患者に対して生理学的に許容される、ありとあらゆるコーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤等もまた含まれる。補足的な活性化合物を組成物中に組み入れることもできる。「薬学的に許容される担体」には、本発明において有用な化合物の薬学的に許容される塩がさらに含まれ得る。本発明の実施において使用される薬学的組成物中に含まれ得るその他の付加的な成分は、当技術分野において公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA) に記載されている。
本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される塩」または「治療的に許容される塩」という言語は、その無機酸もしくは無機塩基、有機酸もしくは有機塩基、溶媒和物、水和物、または包接化合物を含む、薬学的に許容される非毒性の酸から調製された投与化合物の塩を指す。
「薬学的有効量」および「有効量」という用語は、無毒であるが、所望の生物学的結果をもたらすのに十分な作用物質の量を指す。結果は、疾患もしくは障害の徴候、症状、もしくは原因の低下および／もしくは軽減、または生物学的系の任意の他の所望の変化であってよい。任意の個々の症例における適切な有効量は、日常的な実験を用いて当業者によって決定され得る。
本明細書で用いられる場合、「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合を介して連結されている、アミノ酸残基、その関連する天然に存在する構造変種、および合成の天然に存在しないアナログから構成されたポリマーを指す。合成ポリペプチドは、例えば自動ポリペプチド合成機を用いて合成され得る。
本明細書で用いられる場合、「プロテインホスファターゼMg2+/Mn2+依存性1D」または「PPM1D」という用語は、ヒト相同体についてUniProtアクセッション番号A0A0S2Z4M2を有し、かつアミノ酸配列：
SEQ ID NO：16
を有するプロテインホスファターゼMg2+/Mn2+依存性1D遺伝子またはタンパク質を意味する。
SEQ ID NO：16
「特異的に結合する」という用語は、本明細書で用いられる場合、別の分子または特徴を認識しそれに結合するが、試料中の他の分子または特徴を実質的に認識せずそれに結合しない、抗体などの分子を意味する。
本明細書で用いられる場合、「疾患または障害を処置すること」は、疾患または障害の症状を患者が経験する頻度を減少させることを意味する。疾患および障害は、本明細書において互換的に使用される。
本明細書で用いられる場合、「処置」または「処置すること」という用語は、予防および／または治療を包含する。したがって、本発明の組成物および方法は、治療適用に限定されず、予防適用においても使用することができる。そのため、状態、障害、または病態を「処置すること」またはその「処置」には、(i) 状態、障害、または病態に罹患しているかまたはなりやすい可能性があるが、状態、障害、または病態の臨床症状または不顕性症状をまだ経験していないまたは示していない対象において発生する状態、障害、または病態の臨床症状の出現を予防するかまたは遅延させること、(ii) 状態、障害、または病態を阻害すること、すなわち、疾患またはその少なくとも1つの臨床症状もしくは不顕性症状の発生を停止させるかまたは減少させること、あるいは (iii) 疾患を緩和すること、すなわち、状態、障害、もしくは病態、またはその臨床症状もしくは不顕性症状の少なくとも1つの退行を引き起こすことが含まれる。
本明細書で用いられる場合、「野生型」という用語は、天然に存在する種のメンバーの大部分に特有であり、変異体の遺伝子型および表現型と対照的である遺伝子型および表現型を指す。
範囲：本開示を通して、本発明の様々な局面は範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は、単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する確固たる限定として解釈されるべきでないことが、理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値をすべて具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、1～6などの範囲の記載は、1～3、1～4、1～5、2～4、2～6、3～6等などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5，5.3、および6を具体的に開示していると見なされるべきである。このことは、範囲の幅にかかわらずあてはまる。
処置の方法
理論によって制限されることは望まないが、本発明は、一部には、実施例1および図1A～4Dに示されるように、プロテインホスファターゼMg2+/Mn2+依存性1D (PPM1D) のレベルの上昇を示すがんが、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ (NAMPT) 阻害剤による処置に感作されるという予想外の発見に基づく。したがって、1つの局面において、本発明は、少なくとも1種類のNAMPT阻害剤の有効量を対象に投与し、それによってがんを処置する段階を含む、対象のがんを処置する方法であって、対象のがんから採取された生検試料においてPPM1Dが上昇している、前記方法を提供する。
理論によって制限されることは望まないが、本発明は、一部には、実施例1および図1A～4Dに示されるように、プロテインホスファターゼMg2+/Mn2+依存性1D (PPM1D) のレベルの上昇を示すがんが、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ (NAMPT) 阻害剤による処置に感作されるという予想外の発見に基づく。したがって、1つの局面において、本発明は、少なくとも1種類のNAMPT阻害剤の有効量を対象に投与し、それによってがんを処置する段階を含む、対象のがんを処置する方法であって、対象のがんから採取された生検試料においてPPM1Dが上昇している、前記方法を提供する。
PPM1D活性が上昇している正確な理由は、本発明の様々な態様の実施にとって重要ではない。様々な態様においては、PPM1Dタンパク質の濃度がより高いため、PPM1D活性が対照と比較して高くなっている可能性がある。いくつかの態様では、これはPPM1Dの産生の増加に起因し、他の態様では、これはPPM1Dの分解の減少に起因する。
PPM1Dにおけるある特定の変異は、過度に安定した形態のタンパク質を生じさせ、最終的な結果として、がん細胞内でPPM1D活性が高くなる。過度に安定したPPM1Dをもたらす変異の性質は重要ではない。この変種は、PPM1DにおけるC末端切断変異と関連づけられている。したがって、様々な態様において、PPM1DはC末端切断変異を含む。
様々な態様において、前記方法は、対象から採取された生検試料において、上昇したレベルのPPM1Dを検出する段階をさらに含む。試料は、当技術分野で公知の任意の手段を用いて、非限定的な例として生検によって採取することができる。当業者が認識するように、対象のがんもしくはがん細胞のサブセットまたは腫瘍もしくは他のがん性増殖においてPPM1Dが上昇していることを決定する種々の方法が存在する。これらはすべて、本発明の方法において企図され、含まれる。非限定的な例として、PPM1D遺伝子が増幅されてもよいし、PPM1D mRNAのレベルが増幅されてもよいし、またはPPM1Dタンパク質の安定性が強化されてもよい。
本発明の様々な態様において、様々なNAMPT阻害剤を利用することができる。様々な態様において、1つまたは複数のNAMPT阻害剤は、OT-82、KPT-9274、GNE-618、LSN-3154567、FK866、STF31、GPP78、STF118804、GMX-1778、GNE-617、およびA-1293201からなる群より選択される。その他の適切なNAMPT阻害剤は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2017/0174704号に開示されている。これらの化合物の構造を以下に示す。
PPM1Dのレベルの上昇を示す任意のがんを、本発明の方法の様々な態様を用いて処置することができる。様々な態様において、がんは、乳がん、卵巣がん、消化器がん、髄芽腫、または脳がんである。様々な態様において、がんは小児神経膠腫であってよい。
実施例1においてさらに考察されるように、さらなるNAD枯渇処置は、高レベルのPPM1Dを有するがん細胞のNAMPT阻害剤に対する感受性を高める可能性がある。したがって、様々な態様において、前記方法は、少なくとも1種類の付加的なニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NAD) 枯渇処置を対象に施す段階をさらに含む。様々な態様において、付加的なNAD枯渇処置は、テモゾロミド、エトポシド、イリノテカン、および放射線療法の施行からなる群より選択される。
補足的なニコチンアミドの投与は、PPM1Dのレベルが上昇したがんに関して、NAMPT阻害剤の治療指数をさらに高める可能性がある。理論によって制限されることは望まないが、これは、健常な細胞は、NAサルベージ経路を通じたNADの産生を介して、NADの産生のために補足的なニコチンアミドを使用することができる一方で、がん細胞はそれができないためであると考えられ、その理由は、上昇したPPM1DがNAPRTサイレンシングを介してこの経路を遮断することが判明したからである。したがって、様々な態様において、前記方法は、補足的なニコチンアミドを対象に投与する段階をさらに含む。
様々な態様において、NAMPT阻害剤は、少なくとも1種類の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物の状態で対象に投与される。様々な態様において、対象は哺乳動物である。様々な態様において、対象はヒトである。
投与／投与量／製剤
投与計画は、有効量を構成するものに影響を及ぼし得る。治療用製剤は、本発明において企図される疾患または障害が発症する前または後のいずれかに、対象に投与することができる。さらに、いくつかの分割投与量および時差投与量を毎日もしくは逐次的に投与してもよく、または用量は連続注入してもよいし、もしくはボーラス注射であってもよい。さらに、治療用製剤の投与量は、治療状況または予防状況の緊急性によって示されるように、比例して増減させることができる。
投与計画は、有効量を構成するものに影響を及ぼし得る。治療用製剤は、本発明において企図される疾患または障害が発症する前または後のいずれかに、対象に投与することができる。さらに、いくつかの分割投与量および時差投与量を毎日もしくは逐次的に投与してもよく、または用量は連続注入してもよいし、もしくはボーラス注射であってもよい。さらに、治療用製剤の投与量は、治療状況または予防状況の緊急性によって示されるように、比例して増減させることができる。
患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトへの本発明の組成物の投与は、本発明において企図される疾患または障害を処置するのに有効な投与量および期間で、公知の手順を使用して行うことができる。治療効果を達成するために必要な治療用化合物の有効量は、患者の疾患または障害の状態；患者の年齢、性別、および体重；ならびに本発明において企図される疾患または障害を処置する治療用化合物の能力などの要因によって変動し得る。最適な治療応答をもたらすように、投与計画を調整することができる。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例して減少させてもよい。本発明の治療用化合物の有効用量範囲の非限定的な例は、約1からおよび5,000 mg／kg体重／日である。本発明の実施に有用な薬学的組成物は、ng／kg／日からおよび100 mg／kg／日の用量を送達するように投与することができる。ある特定の態様において、本発明は、哺乳動物において本発明の化合物の1μMからおよび10μMの濃度をもたらす用量の投与を想定する。当業者は、関連性のある要因を検討し、過度の実験を行うことなく治療用化合物の有効量に関する決定を行うことができるであろう。
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性を示すことなく、特定の患者、組成物、および投与様式に対する所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように、変更することができる。
特に、選択される投与量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、投与の時間、化合物の排出速度、処置の持続時間、化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態、および過去の病歴、ならびに医学分野において周知である同様の要因などを含む、種々の要因に依存する。
当技術分野における通常の技術を有する医師、例えば内科医または獣医は、必要な薬学的組成物の有効量を容易に決定し処方することができる。例えば、内科医または獣医は、薬学的組成物において用いる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルから開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増やすことができる。
特定の態様においては、投与の簡便性および投与量の均一性のために、化合物を単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で用いられる単位剤形とは、処置されるべき患者に対する単位投与量として適した、物理的に分離した単位を指し；各単位は、必要な薬学的媒体と共に、所望の治療効果を生じるように算出された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形は、(a) 治療用化合物の独自の特徴、および達成されるべき特定の治療効果、ならびに (b) 本発明において企図される疾患または障害の処置のためにそのような治療用化合物を調合／製剤化する分野に固有の制約によって規定され、これらに直接依存する。
ある特定の態様において、本発明の組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤または担体を用いて製剤化される。他の態様において、本発明の薬学的組成物は、治療有効量の本発明の化合物および薬学的に許容される担体を含む。
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロプレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、ならびに植物油を含む溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム、またはマンニトールおよびソルビトールなどの多価アルコールを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
ある特定の態様において、本発明の組成物は、1日に1～5回またはそれ以上の範囲の投与量で、患者に投与される。他の態様において、本発明の組成物は、1日に1回、2日に1回、3日に1回から、1週間に1回、および2週間に1回を含むがこれらに限定されない投与量の範囲で、患者に投与される。本発明の様々な組み合わせ組成物の投与頻度は、年齢、処置されるべき疾患または障害、性別、全般的健康、およびその他の要因を含むがこれらに限定されない多くの要因に応じて個体間で変動することが、当業者には容易に明白である。したがって、本発明は、任意の特定の投与計画に限定されると解釈されるべきでなく、任意の患者に投与されるべき正確な投与量および組成物は、患者に関する他のすべての要因を考慮して、主治医によって決定される。
投与のための本発明の化合物は、約1μg～約10,000 mg、約20μg～約9,500 mg、約40μg～約9,000 mg、約75μg～約8,500 mg、約150μg～約7,500 mg、約200μg～約7,000 mg、約3050μg～約6,000 mg、約500μg～約5,000 mg、約750μg～約4,000 mg、約1 mg～約3,000 mg、約10 mg～約2,500 mg、約20 mg～約2,000 mg、約25 mg～約1,500 mg、約30 mg～約1,000 mg、約40 mg～約900 mg、約50 mg～約800 mg、約60 mg～約750 mg、約70 mg～約600 mg、約80 mg～約500 mg、およびそれらの間のありとあらゆる全体的または部分的増分の範囲内であってよい。
いくつかの態様において、本発明の化合物の用量は、約1 mgからおよび約2,500 mgである。いくつかの態様において、本明細書に記載される組成物中で用いられる本発明の化合物の用量は、約10,000 mg未満、または約8,000 mg未満、または約6,000 mg未満、または約5,000 mg未満、または約3,000 mg未満、または約2,000 mg未満、または約1,000 mg未満、または約500 mg未満、または約200 mg未満、または約50 mg未満である。同様に、いくつかの態様において、本明細書に記載される第2の化合物の用量は、約1,000 mg未満、または約800 mg未満、または約600 mg未満、または約500 mg未満、または約400 mg未満、または約300 mg未満、または約200 mg未満、または約100 mg未満、または約50 mg未満、または約40 mg未満、または約30 mg未満、または約25 mg未満、または約20 mg未満、または約15 mg未満、または約10 mg未満、または約5 mg未満、または約2 mg未満、または約1 mg未満、または約0.5 mg未満、およびそれらのありとあらゆる全体的または部分的増分である。
ある特定の態様において、本発明は、治療有効量の本発明の化合物を、単独でまたは第2の薬学的作用物質と組み合わせて保持する容器と；本発明において企図される疾患または障害の1つまたは複数の症状を処置、予防、または軽減するために化合物を使用するための説明書とを含む、包装された薬学的組成物を対象とする。
製剤は、従来の賦形剤、すなわち、経口、非経口、経鼻、静脈内、皮下、経腸、または当技術分野で公知の任意の他の適切な投与様式に適した薬学的に許容される有機または無機の担体物質と混合して用いることができる。薬学的調製物は滅菌し、所望により、補助剤、例えば、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色物質、着香物質、および／または芳香物質等と混合してもよい。それらはまた、所望の場合には、他の活性薬剤、例えば抗線維化剤と組み合わせてもよい。
本発明の組成物のいずれかの投与経路には、経口、経鼻、直腸、腟内、非経口、頬側、舌下、または局所が含まれる。本発明において使用するための化合物は、経口または非経口、例えば、経皮、経粘膜（例えば、舌下、舌、（経）頬側、（経）尿道、膣（例えば、経膣および膣周囲）、鼻腔（内）、ならびに（経）直腸）、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内、くも膜下腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入、ならびに局所投与などの、任意の適切な経路による投与のために製剤化することができる。
適切な組成物および剤形には、例えば、錠剤、カプセル剤、カプレット剤、丸剤、ゲルカプセル剤、トローチ剤、分散剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、顆粒剤、ビーズ剤、経皮パッチ剤、ゲル剤、散剤、ペレット剤、マグマ剤、舐剤、クリーム剤、ペースト剤、硬膏剤、ローション剤、ディスク剤、坐剤、経鼻または経口投与用液体スプレー剤、吸入用乾燥粉末製剤またはエアロゾル製剤、膀胱内投与用組成物および製剤等が含まれる。本発明において有用な製剤および組成物は、本明細書に記載される特定の製剤および組成物に限定されないことが理解されるべきである。
経口投与
経口適用には、錠剤、糖衣錠剤、液剤、液滴剤、坐剤、またはカプセル剤、カプレット剤、およびゲルカプセル剤が特に適している。経口使用が意図される組成物は、当技術分野で公知の任意の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、錠剤の製造に適した不活性で非毒性の薬学的賦形剤からなる群より選択される1つまたは複数の作用物質を含み得る。そのような賦形剤には、例えば、不活性希釈剤、例えばラクトースなど；造粒剤および崩壊剤、例えばトウモロコシデンプンなど；結合剤、例えばデンプンなど；ならびに滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムが含まれる。錠剤はコーティングしなくてもよいし、または外観を美しくするためもしくは活性成分の放出を遅延させるために公知の技法によってコーティングしてもよい。経口使用のための製剤はまた、活性成分が不活性希釈剤と混合された硬ゼラチンカプセルとして提示されてもよい。
経口適用には、錠剤、糖衣錠剤、液剤、液滴剤、坐剤、またはカプセル剤、カプレット剤、およびゲルカプセル剤が特に適している。経口使用が意図される組成物は、当技術分野で公知の任意の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、錠剤の製造に適した不活性で非毒性の薬学的賦形剤からなる群より選択される1つまたは複数の作用物質を含み得る。そのような賦形剤には、例えば、不活性希釈剤、例えばラクトースなど；造粒剤および崩壊剤、例えばトウモロコシデンプンなど；結合剤、例えばデンプンなど；ならびに滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムが含まれる。錠剤はコーティングしなくてもよいし、または外観を美しくするためもしくは活性成分の放出を遅延させるために公知の技法によってコーティングしてもよい。経口使用のための製剤はまた、活性成分が不活性希釈剤と混合された硬ゼラチンカプセルとして提示されてもよい。
経口投与のために、本発明の化合物は、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、トウモロコシデンプン、ラクトース、微結晶セルロース、もしくはリン酸カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、もしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて、従来の手段によって調製された錠剤またはカプセル剤の形態であってよい。所望により、錠剤は、適切な方法、ならびにColorcon、West Point, Pa. から入手可能なOPADRY（商標）フィルムコーティングシステム（例えば、OPADRY（商標）OYタイプ、OYCタイプ、Organic Enteric OY-Pタイプ、Aqueous Enteric OY-Aタイプ、OY-PMタイプ、およびOPADRY（商標）White、32K18400）などのコーティング材料を用いてコーティングしてもよい。経口投与用の液体調製物は、液剤、シロップ剤、または懸濁剤の形態であってよい。液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、または硬化食用油)；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム)；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、またはエチルアルコール）；および保存剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤を用いて、従来の手段によって調製することができる。
造粒技法は、活性成分の出発粉末またはその他の粒子材料を修飾するために、薬学の分野において周知である。粉末を、典型的には、結合材料と混合して、「造粒物」と称される、より大きな永続的に流動性の集塊物または顆粒にする。例えば、溶媒を用いる「湿式」造粒工程は、一般に、粉末を結合材料と混合し、湿った顆粒状塊の形成をもたらす条件下で水または有機溶媒により加湿し、次いでそこから溶媒を蒸発させなければならないことを特徴とする。
溶融造粒は、一般に、本質的に水または他の液体溶媒を添加せずに、粉末またはその他の材料の造粒を促進するための、室温で固体または半固体である（すなわち、比較的低い軟化点または融点範囲を有する）材料の使用にある。低融点固体は、融点範囲の温度まで加熱すると、液化して結合剤または造粒媒質として作用する。液化した固体はそれ自体、それと接触している粉末材料の表面上に広がり、冷却すると固体顆粒状塊を形成し、その中で初期材料が共に結合される。次いで、得られた溶融造粒物を、経口剤形を調製するために、打錠機に提供するかまたはカプセル化することができる。溶融造粒は、固体分散物または固溶体を形成することにより、活性物質（すなわち、薬物）の溶解速度および生物学的利用能を改善する
米国特許第5,169,645号は、改善された流動特性を有する直接圧縮可能なロウ含有顆粒を開示している。顆粒は、ロウをある特定の流動改善添加剤と溶融混合し、続いて混合物を冷却し造粒して得られる。ある特定の態様では、ロウと添加剤との溶融組み合わせのうちロウ自体のみが溶融し、他の場合には、ロウおよび添加剤の両方が溶融する。
本発明はまた、本発明の1つまたは複数の化合物の遅延放出を提供する層、および本発明において企図される疾患または障害の処置のための薬物の即時放出を提供するさらなる層を含む、多層錠剤を含む。ロウ／pH感受性ポリマー混合物を用いて、その中に活性成分が封入された胃不溶性組成物を得ることができ、その遅延放出が確実になる。
非経口投与
本明細書で用いられる場合、薬学的組成物の「非経口投与」には、対象の組織の物理的突破および組織内の突破口を通した薬学的組成物の投与を特徴とする任意の投与経路が含まれる。したがって、非経口投与には、組成物の注射、外科的切開を通した組成物の適用、組織を貫通する非外科的創傷を通した組成物の適用等による薬学的組成物の投与が含まれるが、これらに限定されない。特に、非経口投与は、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉注射内、胸骨内注射、および腎臓透析注入技法を含むがそれらに限定されないことが企図される。
本明細書で用いられる場合、薬学的組成物の「非経口投与」には、対象の組織の物理的突破および組織内の突破口を通した薬学的組成物の投与を特徴とする任意の投与経路が含まれる。したがって、非経口投与には、組成物の注射、外科的切開を通した組成物の適用、組織を貫通する非外科的創傷を通した組成物の適用等による薬学的組成物の投与が含まれるが、これらに限定されない。特に、非経口投与は、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉注射内、胸骨内注射、および腎臓透析注入技法を含むがそれらに限定されないことが企図される。
非経口投与に適した薬学的組成物の製剤は、滅菌水または滅菌等張生理食塩水などの、薬学的に許容される担体と組み合わせた活性成分を含む。そのような製剤は、ボーラス投与または持続投与に適した形態で調製、包装、または販売することができる。注射用製剤は、アンプル中、または保存剤を含む複数回用量容器中など、単位剤形で調製、包装、または販売することができる。非経口投与用の製剤には、油性または水性媒体中の懸濁剤、液剤、乳剤、ペースト剤、および埋め込み型の持続放出または生分解性製剤が含まれるが、それらに限定されない。そのような製剤は、懸濁化剤、安定化剤、または分散剤を含むがそれらに限定されない1種類または複数種類の付加的な成分をさらに含み得る。非経口投与用製剤のある特定の態様において、活性成分は、再構成組成物の非経口投与の前に適切な媒体（例えば、発熱物質不含の滅菌水）で再構成するための乾燥（すなわち、粉末または顆粒）形態で提供される。
薬学的組成物は、滅菌注射用の水性または油性懸濁剤または液剤の形態で調製、包装、または販売することができる。この懸濁剤または液剤は、公知の技術に従って製剤化することができ、活性成分に加えて、本明細書に記載の分散剤、湿潤剤、または懸濁化剤などの付加的な成分を含み得る。そのような滅菌注射用製剤は、例えば水または1,3-ブタンジオールなどの、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒を用いて調製することができる。その他の許容される希釈剤および溶媒には、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、および合成モノグリセリドまたはジグリセリドなどの固定油が含まれるが、それらに限定されない。有用なその他の非経口的に投与可能な製剤には、活性成分を微結晶形態で、リポソーム調製物中に、または生分解性ポリマー系の構成要素として含む製剤が含まれる。持続放出または埋め込み用の組成物は、乳濁液、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、または難溶性塩などの、薬学的に許容されるポリマーまたは疎水性材料を含み得る。
付加的な投与形態
本発明の付加的な剤形には、米国特許第6,340,475号；第6,488,962号；第6,451,808号；第5,972,389号；第5,582,837号；および第5,007,790号に記載される剤形が含まれる。本発明の付加的な剤形には、米国特許出願第20030147952号；第20030104062号；第20030104053号；第20030044466号；第20030039688号；および第20020051820号に記載される剤形もまた含まれる。本発明の付加的な剤形には、PCT出願番号 WO 03/35041；WO 03/35040；WO 03/35029；WO 03/35177；WO 03/35039；WO 02/96404；WO 02/32416；WO 01/97783；WO 01/56544；WO 01/32217；WO 98/55107；WO 98/11879；WO 97/47285；WO 93/18755；およびWO 90/11757に記載される剤形もまた含まれる。
本発明の付加的な剤形には、米国特許第6,340,475号；第6,488,962号；第6,451,808号；第5,972,389号；第5,582,837号；および第5,007,790号に記載される剤形が含まれる。本発明の付加的な剤形には、米国特許出願第20030147952号；第20030104062号；第20030104053号；第20030044466号；第20030039688号；および第20020051820号に記載される剤形もまた含まれる。本発明の付加的な剤形には、PCT出願番号 WO 03/35041；WO 03/35040；WO 03/35029；WO 03/35177；WO 03/35039；WO 02/96404；WO 02/32416；WO 01/97783；WO 01/56544；WO 01/32217；WO 98/55107；WO 98/11879；WO 97/47285；WO 93/18755；およびWO 90/11757に記載される剤形もまた含まれる。
制御放出製剤および薬物送達系
ある特定の態様において、本発明の製剤は、短期放出製剤、急速オフセット放出製剤、ならびに制御放出製剤、例えば、持続放出製剤、遅延放出製剤、およびパルス放出製剤であってよいが、それらに限定されない。
ある特定の態様において、本発明の製剤は、短期放出製剤、急速オフセット放出製剤、ならびに制御放出製剤、例えば、持続放出製剤、遅延放出製剤、およびパルス放出製剤であってよいが、それらに限定されない。
持続放出という用語は、その従来の意味で使用され、長期にわたって薬物の徐放をもたらし、かつ必ずしもその必要はないが、長期にわたって薬物の実質的に一定の血中レベルをもたらし得る薬物製剤を指す。その期間は1ヶ月またはそれ以上の長さであってよく、ボーラス形態で投与された同量の作用物質よりも長い放出であるべきである。
持続放出のために、化合物に持続放出特性をもたらす適切なポリマーまたは疎水性材料を用いて、化合物を製剤化することができる。したがって、本発明の方法において使用するための化合物は、微小粒子の形態で例えば注射によって、またはオブラートもしくはディスクの形態で埋め込みによって投与することができる。
ある特定の態様において、本発明の化合物は、持続放出製剤を使用して、単独でまたは別の薬学的作用物質と組み合わせて患者に投与される。
遅延放出という用語は、その従来の意味で使用され、薬物投与に続くいくらかの遅延の後に薬物の最初の放出をもたらし、かつ必ずしもその必要はないが、約10分から最大約12時間までの遅延を含み得る薬物製剤を指す。
パルス放出という用語は、その従来の意味で使用され、薬物投与後に薬物のパルス状血漿プロファイルを生じるような様式で薬物の放出をもたらす薬物製剤を指す。
即時放出という用語は、その従来の意味で使用され、薬物投与後直ちに薬物の放出をもたらす薬物製剤を指す。
本明細書で用いられる場合、短期とは、薬物投与後の、
約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分、およびこれらのうちの任意または全てのものの、全体的または部分的増分までの、ならびに、
約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分、およびこれらのうちの任意または全てのものの、全体的または部分的増分を含む、
任意の期間を指す。
約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分、およびこれらのうちの任意または全てのものの、全体的または部分的増分までの、ならびに、
約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分、およびこれらのうちの任意または全てのものの、全体的または部分的増分を含む、
任意の期間を指す。
本明細書で用いられる場合、急速オフセットとは、薬物投与後約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分まで、およびそれを含む任意の期間、ならびにそのありとあらゆる全体的または部分的増分を指す。
投薬
本発明の化合物の治療有効量または用量は、患者の年齢、性別、および体重、患者の現在の医学的状態、ならびに本発明において企図される疾患または障害の進行に依存する。当業者は、これらおよびその他の要因に応じて適切な投与量を決定することができる。
本発明の化合物の治療有効量または用量は、患者の年齢、性別、および体重、患者の現在の医学的状態、ならびに本発明において企図される疾患または障害の進行に依存する。当業者は、これらおよびその他の要因に応じて適切な投与量を決定することができる。
本発明の化合物の適切な用量は、1日当たり約0.01 mg～約5,000 mg、例えば、1日当たり約0.1 mg～約1,000 mg、例えば、約1 mg～約500 mg、例えば、約5 mg～約250 mgの範囲内であってよい。用量は、1回の投与、または複数回の投与、例えば1日に1～4回またはそれ以上で投与することができる。複数回の投与を用いる場合、各投与の量は同じであってもよいし、または異なってもよい。例えば、1日当たり1 mgの用量を、2回の0.5 mg用量として、投与の間に約12時間の間隔をおいて投与することができる。
1日に投与される化合物の量は、非限定的な例において、毎日、隔日、2日ごと、3日ごと、4日ごと、または5日ごとに投与されてもよいと理解される。例えば、隔日投与の場合、1日当たり5 mgの用量を月曜日に開始し、1日当たり5 mgの1回目の後続用量を水曜日に投与し、1日当たり5 mgの2回目の後続用量を金曜日に投与することができ、以下同様である。
患者の状態が改善している場合には、医師の裁量により、本発明の阻害剤の投与を任意に持続的に与えるか；あるいは投与している薬物の用量をある特定の期間、一時的に減少させるかまたは一時的に中止する（すなわち、「休薬期間」）。休薬期間の長さは、一例として、2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、12日、15日、20日、28日、35日、50日、70日、100日、120日、150日、180日、200日、250日、280日、300日、320日、350日、または365日を含む、2日～1年の間で任意に変動する。休薬期間中の用量減少は、一例として、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%を含む、10%～100%を含む。
ひとたび患者の状態が改善したならば、必要に応じて維持用量を投与する。その後、投与量もしくは投与頻度またはその両方を、疾患または障害に応じて、疾患の改善が保持されるレベルまで減少させる。ある特定の態様において、患者は、症状および／または感染の任意の再発時に長期的な間欠的処置を必要とする。
本発明の方法において使用するための化合物は、単位剤形に製剤化することができる。「単位剤形」という用語は、処置を受けている患者の単位投与量として適切な、物理的に分離した単位を指し、各単位は、任意に適切な薬学的担体と共に、所望の治療効果を生じるように算出された所定量の活性材料を含む。単位剤形は、1回の1日用量、または複数回の1日用量（例えば、1日に約1～4回もしくはそれ以上）のうちの1つのためのものであってよい。複数回の1日用量を用いる場合、単位剤形は各用量について同じであってもよいし、または異なってもよい。
そのような治療計画の毒性および治療有効性は、これらに限定されないがLD50（集団の50%に対して致死的な用量）およびED50（集団の50%で治療的に有効な用量）の決定を含め、細胞培養物または実験動物において任意に決定される。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、これはLD50とED50との間の比として表される。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトに使用するための投与量の範囲を規定する上で任意に用いられる。そのような化合物の投与量は、毒性が最小限のED50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる剤形および使用される投与経路に応じて、この範囲内で任意に変動する。
当業者は、日常的実験だけを用いて、本明細書に記載される特定の手順、態様、特許請求の範囲、および実施例に対する多くの等価物を認識するか、または確認し得るであろう。そのような等価物は本発明の範囲内であると見なされ、本明細書に添付の特許請求の範囲によって包含される。例えば、溶媒、触媒、圧力、大気条件、および還元剤／酸化剤などの、反応時間、反応サイズ／体積、および実験試薬を含むがそれらに限定されない反応条件の、当技術分野において認められている代替物による、日常的実験だけを用いての改変は、本出願の範囲内であることが理解されるべきである。
値および範囲が本明細書において提供される場合は常に、これらの値および範囲によって包含されるすべての値および範囲が、本発明の範囲内に包含されるものとすることが理解されるべきである。さらに、これらの範囲内に入るすべての値、および値の範囲の上限または下限もまた、本出願によって企図される。
以下の実施例は、本発明の局面をさらに例示する。しかしながら、それらは決して本明細書に記載の本発明の教示または開示を限定するものではない。
以下の実験例を参照することにより、本発明をさらに詳述する。これらの実施例は説明のために提供するにすぎず、特に指定のない限り、限定を意図するものではない。したがって、本発明は以下の実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかとなるありとあらゆる変化形を包含すると解釈されるべきである。
以下の実施例において用いた材料および方法をここに記載する。
細胞培養の材料および技法
hTert/E6/E7不死化ヒトアストロサイトは、Dr. Timothy Chanの研究室から入手したものであり、以前に特性が明らかになっている。特に断りのない限り、アストロサイトは、DMEM、高グルコース (ThermoFisher Scientific/Gibco)＋10% FBS (Gibco) 中で、接着性の単層として増殖させた。U2OS細胞はATCCから購入し、DMEM、高グルコース＋10% FBS中で増殖させた。MCF7細胞は、10% FBSを添加したRPMI1640 (ThermoFisher Scientific/Gibco) 中で増殖させた。HSJD-DIPG-007、HSJD-DIPG-008、およびSU-DIPG株はすべて、増殖因子：B27サプリメント (Gibco/ThermoFisher)）、ヒトEGF (Sigma)、ヒトFGF (Sigma)、ヒトPDGF (Sigma)、ヘパリン (Stemcell Technologies) を添加し、かつ表示の通りにニコチン酸 (Sigma) を添加したまたは添加していないTumor Stem Media Base（DMEM/F12およびNeurobasal培地）中で培養した。
hTert/E6/E7不死化ヒトアストロサイトは、Dr. Timothy Chanの研究室から入手したものであり、以前に特性が明らかになっている。特に断りのない限り、アストロサイトは、DMEM、高グルコース (ThermoFisher Scientific/Gibco)＋10% FBS (Gibco) 中で、接着性の単層として増殖させた。U2OS細胞はATCCから購入し、DMEM、高グルコース＋10% FBS中で増殖させた。MCF7細胞は、10% FBSを添加したRPMI1640 (ThermoFisher Scientific/Gibco) 中で増殖させた。HSJD-DIPG-007、HSJD-DIPG-008、およびSU-DIPG株はすべて、増殖因子：B27サプリメント (Gibco/ThermoFisher)）、ヒトEGF (Sigma)、ヒトFGF (Sigma)、ヒトPDGF (Sigma)、ヘパリン (Stemcell Technologies) を添加し、かつ表示の通りにニコチン酸 (Sigma) を添加したまたは添加していないTumor Stem Media Base（DMEM/F12およびNeurobasal培地）中で培養した。
（表１）
CRISPR/Cas9ゲノム編集およびプラスミド
CRISPR/Cas9ゲノム編集は、Cas9 (Addgene #43861) および改変ガイドRNA (gRNA) 構築物 (Addgene #43860) の両方の発現を用いてアストロサイトで行った。PPM1D gRNA配列は表1で入手可能であり、合成してアニーリングし、gRNAプラスミドにライゲーションした。次いで、両構築物をヌクレオフェクション (Lonza) によりアストロサイトに同時トランスフェクトし、細胞を72時間インキュベートした後、回収し単離した。単離されたクローンは、単一細胞希釈アプローチによってもたらされ、96ウェルプレートの個々のウェルから増殖させた。変異PPM1Dの配列および発現に関するクローンのスクリーニングは、以下に記載されるように、高解像度融解解析スクリーニング法を用いて、およびウェスタンブロットブロッティングによって行った。
CRISPR/Cas9ゲノム編集は、Cas9 (Addgene #43861) および改変ガイドRNA (gRNA) 構築物 (Addgene #43860) の両方の発現を用いてアストロサイトで行った。PPM1D gRNA配列は表1で入手可能であり、合成してアニーリングし、gRNAプラスミドにライゲーションした。次いで、両構築物をヌクレオフェクション (Lonza) によりアストロサイトに同時トランスフェクトし、細胞を72時間インキュベートした後、回収し単離した。単離されたクローンは、単一細胞希釈アプローチによってもたらされ、96ウェルプレートの個々のウェルから増殖させた。変異PPM1Dの配列および発現に関するクローンのスクリーニングは、以下に記載されるように、高解像度融解解析スクリーニング法を用いて、およびウェスタンブロットブロッティングによって行った。
発現構築物の作製および組込み
hWIP1野生型プラスミド (Addgene # 28105)。次いで、PPM1DをhWIP1から改変phCMV1発現構築物にサブクローニングして、PPM1D OEFLを作製した。表1に記載されたプライマーと共に部位特異的変異誘発を用いてこの構築物を改変し、R458fs変異を導入してPPM1D OEtrnc.を作製した。すべての構築物を大腸菌 (E. coli) で増幅させ、MidiPrepキット (Qiagen) を用いて精製し、上記のように細胞株にヌクレオフェクトした。安定的な細胞株をG418 (Gibco/ThermoFisher) で選択し、単一細胞培養物からさらに単離した。hWIP1 D314Aホスファターゼデッド発現構築物 (Addgene # 28106) もまた、上記のように増幅させて精製し、実験前に親アストロサイトにヌクレオフェクトした。NAPRT発現構築物はGenScript (OHu28558D) から購入し、上記のように増幅させて精製した。プラスミドをPPM1Dtrnc.アストロサイトにヌクレオフェクトし、G418で選択し、単一細胞培養物からさらに単離した。
hWIP1野生型プラスミド (Addgene # 28105)。次いで、PPM1DをhWIP1から改変phCMV1発現構築物にサブクローニングして、PPM1D OEFLを作製した。表1に記載されたプライマーと共に部位特異的変異誘発を用いてこの構築物を改変し、R458fs変異を導入してPPM1D OEtrnc.を作製した。すべての構築物を大腸菌 (E. coli) で増幅させ、MidiPrepキット (Qiagen) を用いて精製し、上記のように細胞株にヌクレオフェクトした。安定的な細胞株をG418 (Gibco/ThermoFisher) で選択し、単一細胞培養物からさらに単離した。hWIP1 D314Aホスファターゼデッド発現構築物 (Addgene # 28106) もまた、上記のように増幅させて精製し、実験前に親アストロサイトにヌクレオフェクトした。NAPRT発現構築物はGenScript (OHu28558D) から購入し、上記のように増幅させて精製した。プラスミドをPPM1Dtrnc.アストロサイトにヌクレオフェクトし、G418で選択し、単一細胞培養物からさらに単離した。
ウェスタンブロッティング
免疫ブロットをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写して解析した。ブロットはすべて、1×TBST (American Bio) 中の5% BSA (Gold Biotechnology) 中でブロッキングし、次いでPPM1D（SCBT F-10 sc-376257、1:1000）、GAPDH (Proteintech group HRP-60004、1:5000)、アクチン（ThermoFisher MA5-11869、1:2000）、γH2AX pS139（CST 2577、1:1000）、NAPRT（Proteintech group 66159-1-Ig、1:2000）、NAMPT（CST 86634、1:1000）、pCHK2 T68（CST 2197、1:1000）、H3K27M（CST 74829、1:1000）、またはp53（CST 9282、1:1000）に対する一次抗体で、4℃で一晩プロービングした。次いで、ブロットを1×TBSTで洗浄し、HRP結合抗マウス二次抗体（ThermoFisher 31432、1:10,000）または抗ウサギ二次抗体（ThermoFisher 31462、1:10,000）と共に室温 (RT) で1時間インキュベートした。免疫ブロットの露光は、Clarity Western ECL基質 (BioRad) を用いて行い、ChemiDoc (BioRad) イメージングシステムで画像化した。示したすべてのウェスタンブロットの、トリミングしていないかつ未処理のスキャンは、ソースデータファイルにおいて入手可能である。
免疫ブロットをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写して解析した。ブロットはすべて、1×TBST (American Bio) 中の5% BSA (Gold Biotechnology) 中でブロッキングし、次いでPPM1D（SCBT F-10 sc-376257、1:1000）、GAPDH (Proteintech group HRP-60004、1:5000)、アクチン（ThermoFisher MA5-11869、1:2000）、γH2AX pS139（CST 2577、1:1000）、NAPRT（Proteintech group 66159-1-Ig、1:2000）、NAMPT（CST 86634、1:1000）、pCHK2 T68（CST 2197、1:1000）、H3K27M（CST 74829、1:1000）、またはp53（CST 9282、1:1000）に対する一次抗体で、4℃で一晩プロービングした。次いで、ブロットを1×TBSTで洗浄し、HRP結合抗マウス二次抗体（ThermoFisher 31432、1:10,000）または抗ウサギ二次抗体（ThermoFisher 31462、1:10,000）と共に室温 (RT) で1時間インキュベートした。免疫ブロットの露光は、Clarity Western ECL基質 (BioRad) を用いて行い、ChemiDoc (BioRad) イメージングシステムで画像化した。示したすべてのウェスタンブロットの、トリミングしていないかつ未処理のスキャンは、ソースデータファイルにおいて入手可能である。
インビトロでの化学的処理およびIR処理
PPM1Dtrnc.アストロサイトを50μg/mLシクロヘキシミドまたは10μM MG132（いずれもSigma）で表示の時間処理した。次いで、細胞を洗浄し、ペレット化し、および溶解して、続いて上記のように免疫ブロッティングアプローチを行った。免疫ブロット強度の定量化は、ImageJソフトウェアを用いて算出し、複数 (n＝3) のブロットからなった。細胞の照射は、X-RAD KV照射器 (Precision X-ray) を用いて行い、処理は非分割の10Gy線量からなった。GSK2830371 (Selleckchem) によるPPM1D阻害剤処理は、IRの24時間前の50nM処理からなった。FK866 (Selleckchem)、GPP78 (Tocris Bioscience)、STF118804 (Tocris Bioscience)、STF31 (Tocris Bioscience)、5-アザシチジン (Selleckchem)、およびデシタビン (Selleckchem) は、DMSOに溶解し、表示の通りに処理に使用した。ニコチンアミドリボシド (ChromaDex Inc.) およびニコチンアミド (Sigma) は水に溶解し、一方ニコチン酸 (Sigma) はPBSに溶解した後、表示の通りに単独でまたはFK866と組み合わせて処理を行った。
PPM1Dtrnc.アストロサイトを50μg/mLシクロヘキシミドまたは10μM MG132（いずれもSigma）で表示の時間処理した。次いで、細胞を洗浄し、ペレット化し、および溶解して、続いて上記のように免疫ブロッティングアプローチを行った。免疫ブロット強度の定量化は、ImageJソフトウェアを用いて算出し、複数 (n＝3) のブロットからなった。細胞の照射は、X-RAD KV照射器 (Precision X-ray) を用いて行い、処理は非分割の10Gy線量からなった。GSK2830371 (Selleckchem) によるPPM1D阻害剤処理は、IRの24時間前の50nM処理からなった。FK866 (Selleckchem)、GPP78 (Tocris Bioscience)、STF118804 (Tocris Bioscience)、STF31 (Tocris Bioscience)、5-アザシチジン (Selleckchem)、およびデシタビン (Selleckchem) は、DMSOに溶解し、表示の通りに処理に使用した。ニコチンアミドリボシド (ChromaDex Inc.) およびニコチンアミド (Sigma) は水に溶解し、一方ニコチン酸 (Sigma) はPBSに溶解した後、表示の通りに単独でまたはFK866と組み合わせて処理を行った。
γH2AXフォーカスの染色および画像化
アストロサイト細胞株を播種し、一晩インキュベートした後に放射線照射した。次いで、表示の時点でプレートを収集し、固定し、透過処理／ブロッキングし、蛍光イメージングのために一次抗体および二次抗体で染色した。固定は、固定用緩衝液（PBS中の4%パラホルムアルデヒドおよび0.02% TritonX100）中での20分間のRTインキュベーションで行った。続いて細胞を1×PBSで洗浄し、その後、インキュベーション緩衝液（PBS中の5% BSAおよび0.5% TritonX100）中で1時間、共有の透過処理およびブロッキング段階を行った。γH2AX pSl39に対する一次抗体 (Millipore 05-636) を、インキュベーション緩衝液で1:1000に希釈して添加し、4℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、その後、二次緩衝液（PBS中の0.5% TritonX100）中のalexafluor結合二次抗体（ThermoFisher A21425またはA11029、1:10,000）および核色素である1μg/mL Hoechst 33342 (Sigma) と共に1時間のRTインキュベーションを行った。プレートを再度洗浄し、Cytation3イメージングシステム (BioTek) を用いてPBS中で画像化した。画像はGen5 v2.09ソフトウェア (BioTek) を用いてつなぎ合わせ、CellProfiler画像処理ソフトウェアを用いてフォーカス数および細胞数の両方をカウントした。
アストロサイト細胞株を播種し、一晩インキュベートした後に放射線照射した。次いで、表示の時点でプレートを収集し、固定し、透過処理／ブロッキングし、蛍光イメージングのために一次抗体および二次抗体で染色した。固定は、固定用緩衝液（PBS中の4%パラホルムアルデヒドおよび0.02% TritonX100）中での20分間のRTインキュベーションで行った。続いて細胞を1×PBSで洗浄し、その後、インキュベーション緩衝液（PBS中の5% BSAおよび0.5% TritonX100）中で1時間、共有の透過処理およびブロッキング段階を行った。γH2AX pSl39に対する一次抗体 (Millipore 05-636) を、インキュベーション緩衝液で1:1000に希釈して添加し、4℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、その後、二次緩衝液（PBS中の0.5% TritonX100）中のalexafluor結合二次抗体（ThermoFisher A21425またはA11029、1:10,000）および核色素である1μg/mL Hoechst 33342 (Sigma) と共に1時間のRTインキュベーションを行った。プレートを再度洗浄し、Cytation3イメージングシステム (BioTek) を用いてPBS中で画像化した。画像はGen5 v2.09ソフトウェア (BioTek) を用いてつなぎ合わせ、CellProfiler画像処理ソフトウェアを用いてフォーカス数および細胞数の両方をカウントした。
薬物スクリーニングおよび細胞生存率の測定
不死化ヒトアストロサイト、MCF7、およびU2OS細胞株のインビトロ細胞生存率の評価は、本発明者らのグループによって開発された、以前に記載されたハイコンテント顕微鏡プラットフォームを用いて行った。簡潔に説明すると、細胞を96ウェルプレートに細胞2000個／ウェルの密度でプレーティングし、一晩インキュベートした。薬物処理または媒体 (0.5% DMSO) 対照を施行し、細胞を表示の通り72～96時間インキュベートした。次いで、プレートをPBSで洗浄し、氷冷70%エタノールで4℃で2時間固定した。エタノールを除去した後、プレートを再度PBSで洗浄し、1μg/mL Hoechst 33342 (Sigma) でRTで30分間染色した。Cytation3イメージャー (BioTek) を用いて細胞を画像化し、上記のように画像をつなぎ合わせて解析した。薬物処理条件と媒体処理条件を比較して、生存率評価を行った。SU-DIPGおよびHSJD-DIPG-007スフェロイドの生存率は、製造業者のプロトコールに従ってCytoTox-Glo (Promega) を用いて評価した。スフェロイドはFK866で120時間処理した後、この方法を用いて解析した。IC50の算出は、GraphPad Prismを用いて、［阻害剤］対反応‐可変勾配4パラメータ非線形回帰にデータをフィットさせることにより行った（代表的な図に示される）。
不死化ヒトアストロサイト、MCF7、およびU2OS細胞株のインビトロ細胞生存率の評価は、本発明者らのグループによって開発された、以前に記載されたハイコンテント顕微鏡プラットフォームを用いて行った。簡潔に説明すると、細胞を96ウェルプレートに細胞2000個／ウェルの密度でプレーティングし、一晩インキュベートした。薬物処理または媒体 (0.5% DMSO) 対照を施行し、細胞を表示の通り72～96時間インキュベートした。次いで、プレートをPBSで洗浄し、氷冷70%エタノールで4℃で2時間固定した。エタノールを除去した後、プレートを再度PBSで洗浄し、1μg/mL Hoechst 33342 (Sigma) でRTで30分間染色した。Cytation3イメージャー (BioTek) を用いて細胞を画像化し、上記のように画像をつなぎ合わせて解析した。薬物処理条件と媒体処理条件を比較して、生存率評価を行った。SU-DIPGおよびHSJD-DIPG-007スフェロイドの生存率は、製造業者のプロトコールに従ってCytoTox-Glo (Promega) を用いて評価した。スフェロイドはFK866で120時間処理した後、この方法を用いて解析した。IC50の算出は、GraphPad Prismを用いて、［阻害剤］対反応‐可変勾配4パラメータ非線形回帰にデータをフィットさせることにより行った（代表的な図に示される）。
siRNAトランスフェクションおよび生存率解析
個々のNAPRT標的化siRNAはDharmacon Inc. (Horizon Discovery) に発注し、その標的配列を表1に記載した。合成致死生存率スクリーニングに使用したsiRNAのパネルは、手動選択してDharmacon Inc. に発注し、それぞれが遺伝子当たり最大4つまでの特有なsiRNAを含むON-TARGET plus混合物中に提供した。製造業者のプロトコールに従ってLipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) を用いて、2×105個のアストロサイトに異なるsiRNA（200nM最終濃度）を逆トランスフェクトした。個々のsiRNAについて、細胞を72時間インキュベートし、ペレット化し、および溶解して、免疫ブロッティングを行った。siRNAスクリーニングについては、細胞を24時間インキュベートし、異なる条件のプレートに分割し、そこでさらに24時間インキュベートした。次いで、記載された用量のFK866で細胞を処理し、上記の画像ベースのパイプラインを用いて、薬物処理の72時間後に生存率を評価した。生存率の測定は、各siRNAについて行い、FK866未処理条件に対して正規化した。
個々のNAPRT標的化siRNAはDharmacon Inc. (Horizon Discovery) に発注し、その標的配列を表1に記載した。合成致死生存率スクリーニングに使用したsiRNAのパネルは、手動選択してDharmacon Inc. に発注し、それぞれが遺伝子当たり最大4つまでの特有なsiRNAを含むON-TARGET plus混合物中に提供した。製造業者のプロトコールに従ってLipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) を用いて、2×105個のアストロサイトに異なるsiRNA（200nM最終濃度）を逆トランスフェクトした。個々のsiRNAについて、細胞を72時間インキュベートし、ペレット化し、および溶解して、免疫ブロッティングを行った。siRNAスクリーニングについては、細胞を24時間インキュベートし、異なる条件のプレートに分割し、そこでさらに24時間インキュベートした。次いで、記載された用量のFK866で細胞を処理し、上記の画像ベースのパイプラインを用いて、薬物処理の72時間後に生存率を評価した。生存率の測定は、各siRNAについて行い、FK866未処理条件に対して正規化した。
NADメタボロームの定量化
NADメタボロームは、LC-MS/MSを用いて、Hypercarbおよび13C代謝物標準物質での2回の分離を用いて、定量的に解析した。その後のNADレベルの解析は、製造業者の仕様書に従ってNAD/NADH定量化キット (Sigma) を用いて行った。
NADメタボロームは、LC-MS/MSを用いて、Hypercarbおよび13C代謝物標準物質での2回の分離を用いて、定量的に解析した。その後のNADレベルの解析は、製造業者の仕様書に従ってNAD/NADH定量化キット (Sigma) を用いて行った。
Me/hME-DIP、バイサルファイト変換、および全体的5-hmC検出
ゲノムDNAをWizardゲノムDNA精製キット (Promega) を用いて精製し、続いて免疫沈降させるかまたはバイサルファイト変換した。免疫沈降アッセイは、推奨されたプロトコールに従ってMe-DIPおよびhMe-DIPキット (Active Motif) を用いて行った。免疫沈降させたDNAをフェノール／クロロホルムで抽出し、以下に記載されるように定量的PCR (qPCR) を用いて解析した。バイサルファイト変換は、EpiMarkバイサルファイト変換キット (NEB) により行った。次いで、修飾されたDNAを、EpiMark Hot Start Taq DNAポリメラーゼ (NEB) を用いて、表1に記載されたプライマーで増幅し、PCR精製キット (Qiagen) で精製した。次いで、NAPRTプロモーターのサンガー配列決定によりメチル化を評価した。全体的5-ヒドロキシメチルシトシンレベルは、製造業者のプロトコールに従って全体的5-hmC定量化キット (Active Motif) により評価した。
ゲノムDNAをWizardゲノムDNA精製キット (Promega) を用いて精製し、続いて免疫沈降させるかまたはバイサルファイト変換した。免疫沈降アッセイは、推奨されたプロトコールに従ってMe-DIPおよびhMe-DIPキット (Active Motif) を用いて行った。免疫沈降させたDNAをフェノール／クロロホルムで抽出し、以下に記載されるように定量的PCR (qPCR) を用いて解析した。バイサルファイト変換は、EpiMarkバイサルファイト変換キット (NEB) により行った。次いで、修飾されたDNAを、EpiMark Hot Start Taq DNAポリメラーゼ (NEB) を用いて、表1に記載されたプライマーで増幅し、PCR精製キット (Qiagen) で精製した。次いで、NAPRTプロモーターのサンガー配列決定によりメチル化を評価した。全体的5-ヒドロキシメチルシトシンレベルは、製造業者のプロトコールに従って全体的5-hmC定量化キット (Active Motif) により評価した。
定量的PCR (qPCR)
mRNA転写物をRNAeasyキット (Qiagen) を用いて細胞から精製し、続いてHigh Capacity cDNA逆転写キット (Applied Biosystems) を用いて逆転写した。PPM1D遺伝子およびNAPRT遺伝子発現レベルは、製造業者のプロトコールに従って、TaqMan蛍光プローブ（いずれもApplied Biosystemsによる）：PPM1D (4331182)、NAPRT (4351372)、およびアクチン (4333762F) を用いたqPCRにより評価した。アクチンを参照遺伝子として用いてΔΔCt比較により、発現レベル変化倍率を算出した。NAPRTプロモーター領域は、Fast Start Universal SYBR Green Master with ROX (Roche) および表1に記載されたプライマーを用いるqPCRにより定量化した。qPCR反応はすべて、StepOnePlusリアルタイムPCRシステム (Applied Biosystems) で実行した。
mRNA転写物をRNAeasyキット (Qiagen) を用いて細胞から精製し、続いてHigh Capacity cDNA逆転写キット (Applied Biosystems) を用いて逆転写した。PPM1D遺伝子およびNAPRT遺伝子発現レベルは、製造業者のプロトコールに従って、TaqMan蛍光プローブ（いずれもApplied Biosystemsによる）：PPM1D (4331182)、NAPRT (4351372)、およびアクチン (4333762F) を用いたqPCRにより評価した。アクチンを参照遺伝子として用いてΔΔCt比較により、発現レベル変化倍率を算出した。NAPRTプロモーター領域は、Fast Start Universal SYBR Green Master with ROX (Roche) および表1に記載されたプライマーを用いるqPCRにより定量化した。qPCR反応はすべて、StepOnePlusリアルタイムPCRシステム (Applied Biosystems) で実行した。
Infiniumメチル化EPICアレイおよび解析
50～500ngのゲノムDNAをバイサルファイト変換し、製造業者の説明書に従ってIlluminaヒトEPICビーズアレイ (850k) プラットフォームを用いて、ゲノムワイドなメチル化パターンについて解析した。NAPRT特異的プローブについて、Genome Studio v1.9を用いてデータを処理して解析し、下流の解析用にすべてのプローブについてメチル化β値を作成した。全体的な過剰メチル化の評価は、偽発見補正 (FDR) および絶対β値閾値と共にLimma Rパッケージのt検定モデルを用いて行い、PPM1D変異体試料と野生型試料の間でメチル化の差が有意に達したプローブ（有意に可変的なプローブまたはSVPとしても公知である）を同定した。上記のように、データセットから差異に基づいて上位2%の最も可変的なプローブリストを選択して解析し、CpGアイランドプローブおよびΔβ 0.2でフィルターをかけ、同様に処理された公的に利用可能なデータとの比較に使用した。
50～500ngのゲノムDNAをバイサルファイト変換し、製造業者の説明書に従ってIlluminaヒトEPICビーズアレイ (850k) プラットフォームを用いて、ゲノムワイドなメチル化パターンについて解析した。NAPRT特異的プローブについて、Genome Studio v1.9を用いてデータを処理して解析し、下流の解析用にすべてのプローブについてメチル化β値を作成した。全体的な過剰メチル化の評価は、偽発見補正 (FDR) および絶対β値閾値と共にLimma Rパッケージのt検定モデルを用いて行い、PPM1D変異体試料と野生型試料の間でメチル化の差が有意に達したプローブ（有意に可変的なプローブまたはSVPとしても公知である）を同定した。上記のように、データセットから差異に基づいて上位2%の最も可変的なプローブリストを選択して解析し、CpGアイランドプローブおよびΔβ 0.2でフィルターをかけ、同様に処理された公的に利用可能なデータとの比較に使用した。
クロマチン免疫沈降 (ChIP)
ChIPアッセイは、ウサギIgG抗体 (CST 2729) を濃縮対照として、ChIP-IT Expressキット (Active Motif) を用いて行った。NAPRTプロモーターのqPCR解析は、上記の通りに行った。使用したChIP抗体：製造業者によって推奨されるChIP用の希釈での、H3K4me1 (Abcam ab8895)、H3K4me3 (CST 9751)、H3K27me3 (CST 9733)、およびH3K27ac（Abcam、ab4729）。
ChIPアッセイは、ウサギIgG抗体 (CST 2729) を濃縮対照として、ChIP-IT Expressキット (Active Motif) を用いて行った。NAPRTプロモーターのqPCR解析は、上記の通りに行った。使用したChIP抗体：製造業者によって推奨されるChIP用の希釈での、H3K4me1 (Abcam ab8895)、H3K4me3 (CST 9751)、H3K27me3 (CST 9733)、およびH3K27ac（Abcam、ab4729）。
動物の取扱いおよびインビボ試験
NOD scid γ（NSG、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ雌マウス 3～4週齢）マウスにおいて、アストロサイト異種移植片試験を行った。細胞株異種移植片のために、ホタルルシフェラーゼ（Cellomics Technologyのレンチウイルスプラスミド；PLV-10003）を安定的に発現する5×106個のWTまたはPPM1Dtrnc.アストロサイトを、0.2mLの総量でMatrigel（Corning、47743-722）と混合した。細胞-マトリゲル懸濁液を、剃毛したNSGマウスの右側腹部および左側腹部の両方に皮下注射した。マウスを処置群に無作為に振り分け、腫瘍の量および増殖を、以下に記載されるようにBLI強度により週に1回測定した。FK866は、80mg/mlの濃度でDMSOに可溶化した。次いで、マウスにこの薬物を、10%シクロデキストリン中に20mg/kgで1日2回、4日間腹腔内投与し、これを週1回、3週間繰り返した。処置は、1ヶ月の増殖後に開始した。処置の完了後に腫瘍を摘出し、各腫瘍の質量を測定した。連続移植された異種移植片は、NSGマウスにおいてPPM1Dtrnc.細胞株異種移植片を連続して移植することにより作製した。上記のように、Matrigelを用いて5×106個の細胞の皮下側腹部注射を行った。マウスを処置群に無作為に振り分け、標準的なノギスベースの技法を用いて腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は、長さ×幅2×0.52として算出した。U2OSの異種移植片試験は、胸腺欠損ヌードマウスで行った。5×106個の細胞を各動物の右側腹部に皮下注射し、18日間増殖させてから処置した。マウスを処置群に無作為に振り分け、ノギス測定および体積算出によって腫瘍量を評価した。FK866は上記のように調製して投与した。
NOD scid γ（NSG、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ雌マウス 3～4週齢）マウスにおいて、アストロサイト異種移植片試験を行った。細胞株異種移植片のために、ホタルルシフェラーゼ（Cellomics Technologyのレンチウイルスプラスミド；PLV-10003）を安定的に発現する5×106個のWTまたはPPM1Dtrnc.アストロサイトを、0.2mLの総量でMatrigel（Corning、47743-722）と混合した。細胞-マトリゲル懸濁液を、剃毛したNSGマウスの右側腹部および左側腹部の両方に皮下注射した。マウスを処置群に無作為に振り分け、腫瘍の量および増殖を、以下に記載されるようにBLI強度により週に1回測定した。FK866は、80mg/mlの濃度でDMSOに可溶化した。次いで、マウスにこの薬物を、10%シクロデキストリン中に20mg/kgで1日2回、4日間腹腔内投与し、これを週1回、3週間繰り返した。処置は、1ヶ月の増殖後に開始した。処置の完了後に腫瘍を摘出し、各腫瘍の質量を測定した。連続移植された異種移植片は、NSGマウスにおいてPPM1Dtrnc.細胞株異種移植片を連続して移植することにより作製した。上記のように、Matrigelを用いて5×106個の細胞の皮下側腹部注射を行った。マウスを処置群に無作為に振り分け、標準的なノギスベースの技法を用いて腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は、長さ×幅2×0.52として算出した。U2OSの異種移植片試験は、胸腺欠損ヌードマウスで行った。5×106個の細胞を各動物の右側腹部に皮下注射し、18日間増殖させてから処置した。マウスを処置群に無作為に振り分け、ノギス測定および体積算出によって腫瘍量を評価した。FK866は上記のように調製して投与した。
腫瘍量の生物発光イメージング
生物発光イメージング (BLI) は、製造業者のプロトコールに従ってIVISスペクトラムインビボイメージングシステム (PerkinElmer) を用いて実施した。画像は週に1回撮影し、d-ルシフェリン（l50mg/kg動物体重）の腹腔内注射の15分後に取得した。BLIフラックス（光子／秒）の定量化は、各腫瘍について関心領域 (ROI) を同定し、次いでこれを取り囲み、バックグラウンド補正し、BLIシグナルを測定することによって行った。右側腹部および左側腹部の両方の腫瘍を各マウスについて全体で平均化し、その後、処置群の比較および解析に使用した。代表的な生物発光画像はすべて、標準的な発光スケールを用いて作成し、背景の物体を除去するためにトリミングした。
生物発光イメージング (BLI) は、製造業者のプロトコールに従ってIVISスペクトラムインビボイメージングシステム (PerkinElmer) を用いて実施した。画像は週に1回撮影し、d-ルシフェリン（l50mg/kg動物体重）の腹腔内注射の15分後に取得した。BLIフラックス（光子／秒）の定量化は、各腫瘍について関心領域 (ROI) を同定し、次いでこれを取り囲み、バックグラウンド補正し、BLIシグナルを測定することによって行った。右側腹部および左側腹部の両方の腫瘍を各マウスについて全体で平均化し、その後、処置群の比較および解析に使用した。代表的な生物発光画像はすべて、標準的な発光スケールを用いて作成し、背景の物体を除去するためにトリミングした。
DIPG発現データ
Pacific Pediatric Neuro-Oncology Consortium (PNOC) NCT02274987試験のデータは、29例の新たに診断されたDIPG症例からのPPM1DおよびNAPRTの発現レベルを含んでいた。RNA配列決定は、製造業者のプロトコールに従ってIllumina HiSeqを用いて行い、転写物の存在量を算出するために使用した。ピアソンの相関rは、GraphPad Prismを用いて算出した。HSJD-DIPG株および付加的なDIPGモデル細胞株のデータは、Affymetrix AgilentおよびIlluminaの発現アレイならびにRNASeqから照合された、以前に公表されたデータセットから取得した。
Pacific Pediatric Neuro-Oncology Consortium (PNOC) NCT02274987試験のデータは、29例の新たに診断されたDIPG症例からのPPM1DおよびNAPRTの発現レベルを含んでいた。RNA配列決定は、製造業者のプロトコールに従ってIllumina HiSeqを用いて行い、転写物の存在量を算出するために使用した。ピアソンの相関rは、GraphPad Prismを用いて算出した。HSJD-DIPG株および付加的なDIPGモデル細胞株のデータは、Affymetrix AgilentおよびIlluminaの発現アレイならびにRNASeqから照合された、以前に公表されたデータセットから取得した。
統計解析および有意性
特に記載のない限り、データはMicrosoft ExcelおよびGraphPad Prismソフトウェアで解析した。2群間の比較には、有意性に関するスチューデントの両側T検定を使用し、*＝p＜0.05、**＝p＜0.01、***＝p＜0.001、****＝p＜0.0001で有意であると記載した。腫瘍増殖曲線を評価するにはマン・ホイットニー検定を使用し、上記と同じ有意性の表記を用いた。カプラン・マイヤープロットによって測定された腫瘍遅延の有意性を評価するには、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用した。示されたエラーバーはすべて、特に指示がない限り、平均値の標準偏差である。
特に記載のない限り、データはMicrosoft ExcelおよびGraphPad Prismソフトウェアで解析した。2群間の比較には、有意性に関するスチューデントの両側T検定を使用し、*＝p＜0.05、**＝p＜0.01、***＝p＜0.001、****＝p＜0.0001で有意であると記載した。腫瘍増殖曲線を評価するにはマン・ホイットニー検定を使用し、上記と同じ有意性の表記を用いた。カプラン・マイヤープロットによって測定された腫瘍遅延の有意性を評価するには、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用した。示されたエラーバーはすべて、特に指示がない限り、平均値の標準偏差である。
実施例1：
PPM1D変異アストロサイトはNAMPT阻害剤に感受性がある
その後の生物学的研究用のPPM1D変異モデルを開発するために、CRISPR/Cas9ゲノム編集を用いて、内因性のPPM1D切断変異 (PPM1dtrncs.) を保有する同質遺伝子的不死化ヒトアストロサイトを作製した。ヘテロ接合性の切断型変異を、DIPGにおいて見られるものと同様のC末端位置において、PPM1D遺伝子座のエクソン6に導入した（図1A）。次いで、単一細胞PPM1dtrnc.クローンを単離し、切断型PPM1Dタンパク質をコードするフレームシフト変異の存在を確認した（図5A）。予測通り、切断型PPM1Dは変異細胞において高発現し（図1B）、野生型 (WT) の全長形態のタンパク質と比較して実質的により長い半減期を維持した（図1Cおよび1D）。PPM1Dタンパク質の安定性の向上は、電離放射線 (IR) への曝露後のウェスタンブロット（図5B）ならびにγH2AXフォーカス形成アッセイ（図1Eおよび図5C）によって測定された、重要なPPM1D標的であるγH2AXおよびpCHK2 (T68) の活発な脱リン酸化によって見られるように、ホスファターゼ活性の増強と相関していた。重要なことには、これらの違いは、PPM1Dの阻害剤として公知のGSK2830371による処理によって消失した（図1F）。
PPM1D変異アストロサイトはNAMPT阻害剤に感受性がある
その後の生物学的研究用のPPM1D変異モデルを開発するために、CRISPR/Cas9ゲノム編集を用いて、内因性のPPM1D切断変異 (PPM1dtrncs.) を保有する同質遺伝子的不死化ヒトアストロサイトを作製した。ヘテロ接合性の切断型変異を、DIPGにおいて見られるものと同様のC末端位置において、PPM1D遺伝子座のエクソン6に導入した（図1A）。次いで、単一細胞PPM1dtrnc.クローンを単離し、切断型PPM1Dタンパク質をコードするフレームシフト変異の存在を確認した（図5A）。予測通り、切断型PPM1Dは変異細胞において高発現し（図1B）、野生型 (WT) の全長形態のタンパク質と比較して実質的により長い半減期を維持した（図1Cおよび1D）。PPM1Dタンパク質の安定性の向上は、電離放射線 (IR) への曝露後のウェスタンブロット（図5B）ならびにγH2AXフォーカス形成アッセイ（図1Eおよび図5C）によって測定された、重要なPPM1D標的であるγH2AXおよびpCHK2 (T68) の活発な脱リン酸化によって見られるように、ホスファターゼ活性の増強と相関していた。重要なことには、これらの違いは、PPM1Dの阻害剤として公知のGSK2830371による処理によって消失した（図1F）。
DDR経路におけるPPM1Dの役割を考慮して、本発明者らのグループが以前に説明した方法論を用いて、重要なDNA修復タンパク質および代謝タンパク質に対する一連の阻害剤を用いた小分子合成致死スクリーニングを行った。このスクリーニングにより、PPM1D変異とニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ (NAMPT) 阻害剤であるFK866との間に合成致死的な相互作用が同定された（図1G；表2）。この予想外のNAMPT阻害剤感受性は、3種類の異なるPPM1dtrnc.細胞株において（図1H）、ならびに構造的に異なる3種類のNAMPT阻害剤：STF31、GPP78、およびSTF118804によっても確認され（図1I；図5D）、このことから、本発明者らの当初の知見が裏付けられ、この効果がNAMPT活性のオンターゲット阻害の結果であることが立証された。さらに、親アストロサイト細胞株におけるWTまたは変異PPM1Dのいずれかの安定的な過剰発現（それぞれPPM1D OEFLまたはOEtrnc.）は、FK866合成致死を付与するのに十分であり、このことから、この相互作用がPPM1Dの総活性の増加により特異的に駆動され、変異タンパク質の新形態の役割ではないことが確認された（図1J；図5E～5G）。加えて、ホスファターゼデッド変異体 (PPM1D D314A) を発現させても、本発明者らのアストロサイトモデルにおいてFK866感受性は得られず、このことから、この合成致死の誘導がPPM1D活性の増加に依存していることがさらに検証された。
（表２）合成致死薬物スクリーニング化合物およびIC50比
PPM1Dtrncs.におけるNADレベルの低下はNAMPT i感受性を駆動する
次に、変異PPM1D誘導性のNAMPT阻害剤 (NAMPTi) 合成致死の分子的基盤を調べようとした。NAMPTは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NAD) を形成するためのニコチンアミド (NAM) のサルベージにおける律速段階を触媒する（図2A）。したがって、この重要な代謝経路の潜在的変動をより良く理解するために、本発明者らのWTおよびPPM1Dtrnc.アストロサイトモデルにおいてNADメタボロームを定量化したいと考えた。PPM1D変異が、NADレベルおよびNADPレベルの顕著な低下を含む、多くのNAD関連代謝物の実質的な減少を誘導することが判明した（図2B、2C；図6A）。これら2つの補助因子の維持は、細胞の生体エネルギーおよび増殖に重要であるため、NAMPT阻害がNADおよびNADPの両方の量ならびに細胞生存率に及ぼす影響を調べた。FK866で処理したWTアストロサイトでは、NADおよびNADPの両方の細胞プールが著しく減少したのに対して、PPM1Dtrnc.細胞ではその減少が顕著により大きく（図2D；図6B）、このことから、変異PPM1Dの設定ではNAMPT活性への依存性が高まっていることが示された。次いで、ニコチンアミドリボシド (NR) がNAMPT阻害を回避し、結果としてPPM1Dtrnc.アストロサイトにおいてNADのレベルを救済できるかどうかを試験した。実際に、NR処理は基礎のNADレベルを十分に上昇させ（図6Cおよび図6D）、PPM1Dtrnc.細胞におけるFK866の細胞毒性効果を完全に軽減した（図2E；補足図6Eおよび図6F）。同様の結果は、NAMの外因的処理でも見られ、これはPPM1Dtrnc.細胞におけるFK866の細胞毒性に強く拮抗した（図6G～6I）。興味深いことに、NAによる外因的処理はFK866誘導性の細胞死を妨げず、このことから、Preiss Handlerサルベージ経路における潜在的代謝障害が示された（図6J～6L）。総合すると、これらのデータから、変異PPM1DはNADメタボロームおよび特にNADレベルの低下を誘導し、これはNAMPT阻害によってさらに増強され得、その結果PPM1D変異細胞の選択的な死滅が生じることが示唆される。
次に、変異PPM1D誘導性のNAMPT阻害剤 (NAMPTi) 合成致死の分子的基盤を調べようとした。NAMPTは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NAD) を形成するためのニコチンアミド (NAM) のサルベージにおける律速段階を触媒する（図2A）。したがって、この重要な代謝経路の潜在的変動をより良く理解するために、本発明者らのWTおよびPPM1Dtrnc.アストロサイトモデルにおいてNADメタボロームを定量化したいと考えた。PPM1D変異が、NADレベルおよびNADPレベルの顕著な低下を含む、多くのNAD関連代謝物の実質的な減少を誘導することが判明した（図2B、2C；図6A）。これら2つの補助因子の維持は、細胞の生体エネルギーおよび増殖に重要であるため、NAMPT阻害がNADおよびNADPの両方の量ならびに細胞生存率に及ぼす影響を調べた。FK866で処理したWTアストロサイトでは、NADおよびNADPの両方の細胞プールが著しく減少したのに対して、PPM1Dtrnc.細胞ではその減少が顕著により大きく（図2D；図6B）、このことから、変異PPM1Dの設定ではNAMPT活性への依存性が高まっていることが示された。次いで、ニコチンアミドリボシド (NR) がNAMPT阻害を回避し、結果としてPPM1Dtrnc.アストロサイトにおいてNADのレベルを救済できるかどうかを試験した。実際に、NR処理は基礎のNADレベルを十分に上昇させ（図6Cおよび図6D）、PPM1Dtrnc.細胞におけるFK866の細胞毒性効果を完全に軽減した（図2E；補足図6Eおよび図6F）。同様の結果は、NAMの外因的処理でも見られ、これはPPM1Dtrnc.細胞におけるFK866の細胞毒性に強く拮抗した（図6G～6I）。興味深いことに、NAによる外因的処理はFK866誘導性の細胞死を妨げず、このことから、Preiss Handlerサルベージ経路における潜在的代謝障害が示された（図6J～6L）。総合すると、これらのデータから、変異PPM1DはNADメタボロームおよび特にNADレベルの低下を誘導し、これはNAMPT阻害によってさらに増強され得、その結果PPM1D変異細胞の選択的な死滅が生じることが示唆される。
PPM1D変異DIPGモデルはNAPRT遺伝子発現をサイレンシングする
PPM1Dtrnc.細胞におけるNAD枯渇の根本的な原因を理解するために、本発明者らの同質遺伝子的アストロサイトにおいて、NAD合成経路および消費経路に関与する重要な酵素を標的とする集中的合成致死siRNAスクリーニングを行った。FK866感受性をエンドポイントとして用いて、その消失が、変異PPM1DとNAMPT阻害との間で以前に同定された合成致死的相互作用を表現型模写する遺伝子を同定することを目的とした。このスクリーニングから、siRNA媒介性のニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ (NAPRT) のノックダウンが、FK866処理に対する親アストロサイト細胞株の重度の感受性を誘導することが判明した（図2F；図7A）。さらなるNAPRT siRNAを用いてこれらの知見を確認し、NAPRTノックダウンの程度とFK866感受性との間の強い相関関係がさらに明らかになった（図7B、図7C）。NAPRTは、NADの産生においてNAMPTと相補的な役割を果たしており、以前の研究では、NAPRT発現とNAMPT阻害剤感受性が逆相関していた。驚くべきことに、NAPRTタンパク質の発現が、本発明者らのPPM1Dtrnc.細胞株ならびにPPM1D過剰発現（OEFLおよびはOE trnc.）細胞株において検出不可能であることが判明した（図2G）。この重大な欠損がNAMPT阻害剤感受性をもたらすかどうかを判定するために、PPM1Dtrnc.細胞にNAPRTを再導入した。NAPRTの安定的な異所性発現は、NAMPT阻害によって起こる細胞毒性を完全に救済し、WT細胞において一般的に見られる抵抗性を反映していた（図2H；図7D、7E）。まとめると、これらの知見から、変異PPM1DがNAPRT発現の消失を駆動し、これが最終的に重度のNAMPT阻害剤感受性を誘導することが示唆される。
PPM1Dtrnc.細胞におけるNAD枯渇の根本的な原因を理解するために、本発明者らの同質遺伝子的アストロサイトにおいて、NAD合成経路および消費経路に関与する重要な酵素を標的とする集中的合成致死siRNAスクリーニングを行った。FK866感受性をエンドポイントとして用いて、その消失が、変異PPM1DとNAMPT阻害との間で以前に同定された合成致死的相互作用を表現型模写する遺伝子を同定することを目的とした。このスクリーニングから、siRNA媒介性のニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ (NAPRT) のノックダウンが、FK866処理に対する親アストロサイト細胞株の重度の感受性を誘導することが判明した（図2F；図7A）。さらなるNAPRT siRNAを用いてこれらの知見を確認し、NAPRTノックダウンの程度とFK866感受性との間の強い相関関係がさらに明らかになった（図7B、図7C）。NAPRTは、NADの産生においてNAMPTと相補的な役割を果たしており、以前の研究では、NAPRT発現とNAMPT阻害剤感受性が逆相関していた。驚くべきことに、NAPRTタンパク質の発現が、本発明者らのPPM1Dtrnc.細胞株ならびにPPM1D過剰発現（OEFLおよびはOE trnc.）細胞株において検出不可能であることが判明した（図2G）。この重大な欠損がNAMPT阻害剤感受性をもたらすかどうかを判定するために、PPM1Dtrnc.細胞にNAPRTを再導入した。NAPRTの安定的な異所性発現は、NAMPT阻害によって起こる細胞毒性を完全に救済し、WT細胞において一般的に見られる抵抗性を反映していた（図2H；図7D、7E）。まとめると、これらの知見から、変異PPM1DがNAPRT発現の消失を駆動し、これが最終的に重度のNAMPT阻害剤感受性を誘導することが示唆される。
不死化正常ヒトアストロサイトでの本発明者らの研究を補完するために、次いで、本発明者らの知見が、より臨床的に関連している腫瘍モデルで再現できるかどうかを試験した。この目的のために、以前に記載された患者由来のDIPGスフェロイド培養物の収集物においてNAPRT発現を調べた。これらのDIPG株のうちの1つであるSU-DIPG-XXXVは、PPM1DにS432fs変異を含み（図8A、図8B）、このタンパク質の過度に安定した切断型を顕著に発現していた（図2I）。PPM1Dtrnc.アストロサイトと同様に、SU-DIPG-XXXVもまたNAPRT遺伝子発現を完全に欠いていることが判明した。残りのWT株は高レベルのNAPRT発現を維持していたため、この欠損はDIPG細胞パネルの中で特有であった。不死化アストロサイトにおける本発明者らの知見と一致して、SU-DIPG-XXXVはまたFK866処理に対して極めて感受性が高く（図2Jおよび2K）、細胞毒性量は低い1桁のナノモル範囲内であった。対照的に、3つのWT DIPG株はFK866処理に対して抵抗性であり、このことから、NAMPT阻害剤感受性がPPM1Dの変異状態に依存することが強調された。注目すべきことには、これらのDIPG細胞株をニコチン酸 (NA) を欠く培養液で培養すると、試験したすべてのSU-DIPGスフェロイド培養物においてFK866に対する強い感受性が誘導され（図8C）、このことから、神経膠腫においてNAMPT阻害剤合成致死を媒介する上での、NAサルベージなどの代替のNAD生合成経路の重要性が確認された。
エピジェネティック事象はPPM1D変異モデルにおいてNAPRT発現をサイレンシングする
次に、変異PPM1DがNAPRT発現を抑制する機構を同定しようとした。WT DIPG株（SU-DIPG-IV、XIII、およびXVII）ではNAPRT mRNAが高発現していたのに対して、試験したすべてのPPM1D変異アストロサイトおよびDIPGモデル（PPM1Dtrnc.、PPM1D0E、およびSU-DIPG-XXXV）では、NAPRT転写物レベルが有意に低下していることが判明し（図3A）、このことから、NAPRT遺伝子の保存された転写抑制の存在が示された。転写サイレンシングはエピジェネティック因子によって制御される場合が多いため、次に、WTおよびPPM1D変異アストロサイトにおいて、NAPRTプロモーターにおける異なるヒストンマークの占有率を調べた。クロマチン免疫沈降 (ChIP) を用いて、PPM1D変異細胞におけるNAPRTの転写抑制が、重要な活性化クロマチンマークであるH3K4me3およびH3K27acの実質的な減少と相関することが判明した（図3B）。H3K4me3およびH3K27acの占有率が低下すると、部位特異的なDNAメチル化が増加し得ることが、以前に示されている。加えて、NAPRTプロモーターは、新規のDNAメチル化を起こしやすいCpGアイランド内に存在する。そこで、変異PPM1Dが、NAPRT遺伝子のプロモーターにおけるDNAメチル化を調節することによりそのサイレンシングを誘導する可能性を考えた。この仮説を試験するため、それぞれMe-DIPアッセイおよびhMe-DIPアッセイを用いて、NAPRTプロモーター内からメチル化シトシン塩基およびヒドロキシメチル化シトシン塩基を免疫沈降させ、定量化した。この研究から、PPM1Dtrnc.アストロサイトのNAPRTプロモーターにおいて、ヒドロキシメチル化ではなくDNAメチル化の顕著な増加が検出された（図3C）。この知見は、本発明者らのアストロサイトおよびDIPGモデルのバイサルファイト変換および配列決定によってさらに確認され、これは、すべてのPPM1D変異細胞株における広範なNAPRTプロモーター過剰メチル化を明らかにした（図3D）。この効果がDIPGおよびアストロサイトモデルに特異的に限定されるかどうかを確かめるため、いずれも内因性のPPM1D変化を含む骨肉腫細胞株U2OS (R458fs) および乳がん細胞株MCF7（PPM1D増幅）において本発明者らの結果を検証した（図9Aおよび9B）。PPM1Dtrnc.アストロサイトと同様に、U2OS細胞およびMCF7細胞において、NAPRTプロモーターの広範な過剰メチル化と一致して、NAPRT転写の実質的な遺伝子サイレンシングが起こることが判明した。（図9Cおよび9D）。さらに、両細胞株は、FK866処理に対して強い感受性を示し、これはPPM1Dtrnc.アストロサイトおよび記載されたその他のPPM1D変異DIPGモデルに匹敵した（図9E）。
次に、変異PPM1DがNAPRT発現を抑制する機構を同定しようとした。WT DIPG株（SU-DIPG-IV、XIII、およびXVII）ではNAPRT mRNAが高発現していたのに対して、試験したすべてのPPM1D変異アストロサイトおよびDIPGモデル（PPM1Dtrnc.、PPM1D0E、およびSU-DIPG-XXXV）では、NAPRT転写物レベルが有意に低下していることが判明し（図3A）、このことから、NAPRT遺伝子の保存された転写抑制の存在が示された。転写サイレンシングはエピジェネティック因子によって制御される場合が多いため、次に、WTおよびPPM1D変異アストロサイトにおいて、NAPRTプロモーターにおける異なるヒストンマークの占有率を調べた。クロマチン免疫沈降 (ChIP) を用いて、PPM1D変異細胞におけるNAPRTの転写抑制が、重要な活性化クロマチンマークであるH3K4me3およびH3K27acの実質的な減少と相関することが判明した（図3B）。H3K4me3およびH3K27acの占有率が低下すると、部位特異的なDNAメチル化が増加し得ることが、以前に示されている。加えて、NAPRTプロモーターは、新規のDNAメチル化を起こしやすいCpGアイランド内に存在する。そこで、変異PPM1Dが、NAPRT遺伝子のプロモーターにおけるDNAメチル化を調節することによりそのサイレンシングを誘導する可能性を考えた。この仮説を試験するため、それぞれMe-DIPアッセイおよびhMe-DIPアッセイを用いて、NAPRTプロモーター内からメチル化シトシン塩基およびヒドロキシメチル化シトシン塩基を免疫沈降させ、定量化した。この研究から、PPM1Dtrnc.アストロサイトのNAPRTプロモーターにおいて、ヒドロキシメチル化ではなくDNAメチル化の顕著な増加が検出された（図3C）。この知見は、本発明者らのアストロサイトおよびDIPGモデルのバイサルファイト変換および配列決定によってさらに確認され、これは、すべてのPPM1D変異細胞株における広範なNAPRTプロモーター過剰メチル化を明らかにした（図3D）。この効果がDIPGおよびアストロサイトモデルに特異的に限定されるかどうかを確かめるため、いずれも内因性のPPM1D変化を含む骨肉腫細胞株U2OS (R458fs) および乳がん細胞株MCF7（PPM1D増幅）において本発明者らの結果を検証した（図9Aおよび9B）。PPM1Dtrnc.アストロサイトと同様に、U2OS細胞およびMCF7細胞において、NAPRTプロモーターの広範な過剰メチル化と一致して、NAPRT転写の実質的な遺伝子サイレンシングが起こることが判明した。（図9Cおよび9D）。さらに、両細胞株は、FK866処理に対して強い感受性を示し、これはPPM1Dtrnc.アストロサイトおよび記載されたその他のPPM1D変異DIPGモデルに匹敵した（図9E）。
PPM1D変異は全体的なCpGアイランド過剰メチル化を促進する
次に、変異PPM1D誘導性のNAPRT遺伝子サイレンシングが、局所的な事象であるのか、またはより全体的な現象の一部であるのかを調べた。WTおよびPPM1D変異細胞株の本発明者らのパネル全体において、ならびに3つの付加的なPPM1D変異DIPG株：HSJD-DIPG-007、HSJD-DIPG-008、およびHSJD-DIPG-14b；これらはすべて、NAPRT (27) の発現低下および／またはFK866処理に対する感受性を維持する（図10A～10D）、において、全ゲノムメチル化プロファイリングを行った。IlluminaヒトEPICビーズアレイ (850k) からのメチル化の結果により、試験したすべてのPPM1D変異細胞株にわたるCpGアイランド過剰メチル化の実質的な増加が明らかになった。390個の最も有意な可変プローブ (SVP) のうち、WT細胞株では103個 (26%) しか過剰メチル化されていなかったのに対して、PPM1D変異株（PPM1Dtrnc.、PPM1D0E、SU-DIPG-XXXV、HSJD-DIPG-007、HSJD-DIPG-008、およびHSJD-DIPG-14b）では287個 (74%) が過剰メチル化されていた（図3E）。加えて、その後このデータセットから、NAPRT遺伝子座内の個々のプローブを同定し、解析した。PPM1D変異アストロサイトおよびDIPG培養物では、NAPRTのCpGアイランドプロモーター領域内に存在する7つの部位すべてが重度にメチル化されており、二変量相関解析により、6つの変異細胞のうち5つが、試験したWT株とは別にクラスター化された（図3F）。興味深いことに、HSJD-DIPG-14bでは、NAPRTプロモーター内の全体的なメチル化の程度はより低いにもかかわらず、この株はそれでもなお、前述のSVPにわたって過剰メチル化を示し、全ゲノムメチル化解析ではその他のPPM1D変異株と同様にクラスター化された。注目すべきことには、試験したすべてのDIPG株が、腫瘍試料においてPPM1D切断型変異と共存する場合の多い内因性のヒストン3 K27M変異を保有していた（図10Aおよび10E）。H3.1またはH3.3 K27M変異を全体的なDNA低メチル化と関連づける以前の報告にもかかわらず、本発明者らの結果は、PPM1Dの切断変化が実際にこの効果を克服し、代わりにゲノムのCpGアイランドの過剰メチル化を駆動し得ることを示唆する。
次に、変異PPM1D誘導性のNAPRT遺伝子サイレンシングが、局所的な事象であるのか、またはより全体的な現象の一部であるのかを調べた。WTおよびPPM1D変異細胞株の本発明者らのパネル全体において、ならびに3つの付加的なPPM1D変異DIPG株：HSJD-DIPG-007、HSJD-DIPG-008、およびHSJD-DIPG-14b；これらはすべて、NAPRT (27) の発現低下および／またはFK866処理に対する感受性を維持する（図10A～10D）、において、全ゲノムメチル化プロファイリングを行った。IlluminaヒトEPICビーズアレイ (850k) からのメチル化の結果により、試験したすべてのPPM1D変異細胞株にわたるCpGアイランド過剰メチル化の実質的な増加が明らかになった。390個の最も有意な可変プローブ (SVP) のうち、WT細胞株では103個 (26%) しか過剰メチル化されていなかったのに対して、PPM1D変異株（PPM1Dtrnc.、PPM1D0E、SU-DIPG-XXXV、HSJD-DIPG-007、HSJD-DIPG-008、およびHSJD-DIPG-14b）では287個 (74%) が過剰メチル化されていた（図3E）。加えて、その後このデータセットから、NAPRT遺伝子座内の個々のプローブを同定し、解析した。PPM1D変異アストロサイトおよびDIPG培養物では、NAPRTのCpGアイランドプロモーター領域内に存在する7つの部位すべてが重度にメチル化されており、二変量相関解析により、6つの変異細胞のうち5つが、試験したWT株とは別にクラスター化された（図3F）。興味深いことに、HSJD-DIPG-14bでは、NAPRTプロモーター内の全体的なメチル化の程度はより低いにもかかわらず、この株はそれでもなお、前述のSVPにわたって過剰メチル化を示し、全ゲノムメチル化解析ではその他のPPM1D変異株と同様にクラスター化された。注目すべきことには、試験したすべてのDIPG株が、腫瘍試料においてPPM1D切断型変異と共存する場合の多い内因性のヒストン3 K27M変異を保有していた（図10Aおよび10E）。H3.1またはH3.3 K27M変異を全体的なDNA低メチル化と関連づける以前の報告にもかかわらず、本発明者らの結果は、PPM1Dの切断変化が実際にこの効果を克服し、代わりにゲノムのCpGアイランドの過剰メチル化を駆動し得ることを示唆する。
IDH1 R132H変異神経膠腫は、よく知られているように、がん代謝物2-HGによるDNA脱メチル化TETタンパク質の競合阻害に起因する神経膠腫関連CpGアイランドメチル化形質（またはG-CIMP）を示す。本発明者らのPPM1D変異DIPGモデルで観察された過剰メチル化事象が、IDH1変異細胞株で見られたものに匹敵するのかどうかを理解するために、上位2%の有意に可変的なCpGアイランドメチル化アレイプローブを解析して、以前に公表されたIDH1変異体のデータセットと比較した（図11Aおよび11B）。PPM1D変異細胞株およびIDH1変異細胞株では、それらの親アストロサイト対照と比較して、同程度の割合の過剰メチル化プローブが同定されたが（PPM1D変異アストロサイトおよびIDH1変異アストロサイトについてそれぞれ79.4%および63.9%）、驚くべきことに、2つの操作された変異株間で重複はほとんどないことが判明した（図11C）。さらに、TET酵素活性の産物である全体的5-ヒドロキシメチルシトシン (5-hmC) を調べたところ、WTアストロサイトとPPM1D変異アストロサイトの間で5-hmcレベルに有意差がないことが判明し、このことから、これらの変異細胞株では異なる機構がゲノム過剰メチル化の発生を駆動している可能性あることが示された（図11D）。最後に、DNA脱メチル化剤であるデシタビン (DCT) およびアザシチジン (azaC) によるPPM1Dtrnc.細胞の処理は、これらの細胞においてNAPRTの遺伝子サイレンシングを元に戻すことができず、本発明者らの結果はIDH1変異細胞株での以前の研究とはさらに異なった（図11E）。全体として、これらの知見から、PPM1D変異は、CpGアイランド過剰メチル化およびNAPRT遺伝子サイレンシングを伴う、IDH1変異神経膠腫で見られるものとは異なる全体的なDNAメチル化の特有なパターンを駆動することが実証される。
NAMPTiはPPM1Dmut異種移植片に対してインビボで有効である
次に、変異PPM1D誘導性のNAMPT阻害剤感受性がインビボで再現され得るかどうかを試験した。NOD scid γ (NSG) マウスに親細胞およびPPM1Dtrnc.細胞の両方を皮下注射し、生物発光イメージング (BLI) を用いて腫瘍増殖をモニターした。親アストロサイトは6ヶ月後に腫瘍を形成することができなかったが、PPM1Dtrnc.アストロサイトの側腹部注射は、30日以内に腫瘍形成をもたらした。著しくは、これらのマウスをFK866で処置すると、3週間後に腫瘍量の急速な減少（変化倍率＝4.93、マン・ホイットニーのU検定によりp＝0.0003）が誘導された（図12Aおよび12B）。これらのデータは、FK866による処置後の最終的な腫瘍質量が媒体単独に対して実質的により少ないこと（変化倍率＝3.1、マン・ホイットニーのU検定によりp＜0.0001）と相関した（図12C）。PPM1Dtrnc.異種移植片のサイズおよび増殖速度により、代替の測定技法の使用が制限されるため、連続移植されたPPM1D変異アストロサイト異種移植片モデルを作製した。これらのPPM1D変異異種移植片は、側腹部注射の12日以内に測定可能な腫瘍を形成し（図12D）、急速に増殖し、よって直接的な腫瘍体積を評価することが可能になる。これらのマウスをFK866で処置すると、媒体対照と比較して、ノギスおよびBLIの両方により測定して、全体の腫瘍サイズが大幅に減少し（変化倍率＝17.1、マン・ホイットニーのU検定によりp＜0.0002）（図4A；図12E）、腫瘍増殖が有意に遅延した（ログランク（マンテル・コックス）検定によりp＜0.0001）（図4B）。U2OS細胞株の異種移植でも同様の結果が得られ、この場合もやはりFK866処置に対する有意な感受性を示した（変化倍率＝5.86、マン・ホイットニーのU検定によりp＜0.000l）（図13A）。重要なことには、NAMPT阻害剤は用量関連性の毒性と関連づけられているため、投薬スケジュール全体を通して、試験におけるすべてのマウスの健康状態および体重を追跡したところ、その期間中に治療群間で体重に有意差は検出されなかった（図13B）。全体として、本発明者らのデータは、インビトロでFK866を用いて見られた合成致死を強く支持し、PPM1D変異腫瘍の処置のためのNAMPT阻害剤の潜在的有効性を実証する。
次に、変異PPM1D誘導性のNAMPT阻害剤感受性がインビボで再現され得るかどうかを試験した。NOD scid γ (NSG) マウスに親細胞およびPPM1Dtrnc.細胞の両方を皮下注射し、生物発光イメージング (BLI) を用いて腫瘍増殖をモニターした。親アストロサイトは6ヶ月後に腫瘍を形成することができなかったが、PPM1Dtrnc.アストロサイトの側腹部注射は、30日以内に腫瘍形成をもたらした。著しくは、これらのマウスをFK866で処置すると、3週間後に腫瘍量の急速な減少（変化倍率＝4.93、マン・ホイットニーのU検定によりp＝0.0003）が誘導された（図12Aおよび12B）。これらのデータは、FK866による処置後の最終的な腫瘍質量が媒体単独に対して実質的により少ないこと（変化倍率＝3.1、マン・ホイットニーのU検定によりp＜0.0001）と相関した（図12C）。PPM1Dtrnc.異種移植片のサイズおよび増殖速度により、代替の測定技法の使用が制限されるため、連続移植されたPPM1D変異アストロサイト異種移植片モデルを作製した。これらのPPM1D変異異種移植片は、側腹部注射の12日以内に測定可能な腫瘍を形成し（図12D）、急速に増殖し、よって直接的な腫瘍体積を評価することが可能になる。これらのマウスをFK866で処置すると、媒体対照と比較して、ノギスおよびBLIの両方により測定して、全体の腫瘍サイズが大幅に減少し（変化倍率＝17.1、マン・ホイットニーのU検定によりp＜0.0002）（図4A；図12E）、腫瘍増殖が有意に遅延した（ログランク（マンテル・コックス）検定によりp＜0.0001）（図4B）。U2OS細胞株の異種移植でも同様の結果が得られ、この場合もやはりFK866処置に対する有意な感受性を示した（変化倍率＝5.86、マン・ホイットニーのU検定によりp＜0.000l）（図13A）。重要なことには、NAMPT阻害剤は用量関連性の毒性と関連づけられているため、投薬スケジュール全体を通して、試験におけるすべてのマウスの健康状態および体重を追跡したところ、その期間中に治療群間で体重に有意差は検出されなかった（図13B）。全体として、本発明者らのデータは、インビトロでFK866を用いて見られた合成致死を強く支持し、PPM1D変異腫瘍の処置のためのNAMPT阻害剤の潜在的有効性を実証する。
最後に、DIPG生検標本のコホート内からの遺伝子発現データ (31) を用いて、PPM1DとNAPRTのmRNAレベルの間に強い逆相関があること（図13C）、および公知のPPM1D変異腫瘍試料ではNAPRT発現が減少する傾向があることが同定された（図4C；図13D）。並行して、cBioPortalから公的に利用可能な患者由来のがん遺伝子発現データを、脳、***、および卵巣を含む、PPM1Dが増幅して見られる場合の多い腫瘍サブタイプにわたって解析した。そこから、PPM1D低発現の腫瘍と高発現の腫瘍との間で、NAPRT発現が統計的に有意に異なるという傾向が同定され（図13E）、これにより、このがん遺伝子の発現を潜在的に実施可能でかつ創薬可能な標的と関連づける、多様な一連の悪性腫瘍にわたるさらなる確証がもたらされた。
要するに、本発明者らの結果により、全体的なDNAメチル化を駆動し、NAPRT遺伝子サイレンシングを引き起こすという、PPM1D変異のこれまで知られていなかった役割が証明される。NAPRTは、Preiss-Handler NA サルベージ経路の第一段階を触媒してNADを生成する。したがって、変異PPM1D誘導性のNAPRTのサイレンシングは、NADメタボロームの減少を引き起こす。NAPRTが消失することで、PPM1D変異細胞は、生存のために他のNAD生成経路、主に、NAMPTによって媒介されるNAMサルベージ経路に完全に依存することが必要となる。結果として、NAMPT阻害剤を用いて、PPM1D変異細胞を選択的に標的とし、死滅させることができる（図4D）。加えて、NAMPT阻害剤合成致死は、高レベルの切断型または全長PPM1Dを発現している多種多様な一連の細胞で観察された。PPM1Dは多様な範囲のがんにおいて増幅または過剰発現されるため、この知見により幅広い臨床適用性が示唆される。
NAMPT阻害剤は臨床治験で試験されてきたが、予後バイオマーカーの欠如および用量制限血液毒性のために、臨床へのさらなる進歩が妨げられてきた。本発明者らの研究により、臨床的に関連するバイオマーカーであるPPM1D変異が明らかになり、これを、NAMPT阻害剤ベースの治療戦略を用いる、分子情報に基づく患者の個別化処置に使用することができる。さらに、以前の研究により、テモゾロミドおよび放射線治療などの多くのDNA損傷剤もまた、細胞のNADレベルを枯渇させることが示唆されている。これらの作用物質は、PPM1D変異を保有する腫瘍（例えば、DIPG）を処置するために一般的に使用されるため、それらをNAMPT阻害剤と併用して、腫瘍選択的な細胞毒性をさらに高めることができると考えられる。最近の報告により、NAの同時投与が、NAサルベージ経路を通じたNADの産生を介して、NAMPT阻害剤に関連した血液毒性を軽減し得ることが示唆されている。変異PPM1Dが腫瘍特異的なNAPRTサイレンシングによってこの経路を遮断するという本発明者らの知見に基づき、NAの補充は、NAMPT阻害に関連した治療指数をさらに高めるための効果的なアプローチであると考えられる。最後に、本発明者らの結果から、特にDIPGにおける、CpGアイランド過剰メチル化事象の特有なパターンが明らかになる。この知見は、成人神経膠腫におけるIDH1/2変異と関連するものを想起させるが、それとは生物学的に異なる。全体として、本発明者らの研究により、腫瘍関連の変異が全体的なDNA過剰メチル化事象を駆動し得るという、完全に独立した経路が実証され、神経膠腫の生物学における異常なメチル化の分子的結果にさらなる光が当てられる。
本明細書において引用されたありとあらゆる特許、特許出願、および出版物の開示内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。具体的な態様を参照しながら本発明を開示してきたが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の他の態様および変化形が当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような態様および同等の変化形をすべて含むと解釈されるように意図される。
Claims (12)
- 少なくとも1種類のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ (NAMPT) 阻害剤を対象に投与し、それによってがんを処置する段階
を含む、対象のがんを処置する方法であって、
対象のがんから採取された生検試料において、プロテインホスファターゼMg2+/Mn2+依存性1D (PPM1D)が上昇している、前記方法。 - 対象から採取されたがん細胞試料において、参照レベルと比較して上昇したレベルのPPM1Dを検出する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- がんが、PPM1D遺伝子における1つまたは複数の変異を含む、請求項1または2に記載の方法。
- PPM1DがC末端切断変異を含む、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1種類のNAMPT阻害剤が、OT-82、KPT-9274、FK866、GNE-618、LSN-3154567、FK866、STF31、GPP78、およびSTF118804からなる群より選択される、請求項1～4のいずれか一項に記載の方法。
- がんが、乳がん、卵巣がん、消化器がん、脳がん、髄芽腫、または小児神経膠腫である、請求項1～5のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1種類の付加的なニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NAD) 枯渇処置を対象に施す段階をさらに含む、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
- 付加的なNAD枯渇処置が、テモゾロミド、エトポシド、イリノテカン、および放射線療法からなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
- 補足的なニコチンアミドを対象に投与する段階をさらに含む、請求項1～8のいずれか一項に記載の方法。
- 有効量のNAMPT阻害剤が、少なくとも1種類の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物の状態で対象に投与される、請求項1～9のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が哺乳動物である、請求項1～10のいずれか一項に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項1～11のいずれか一項に記載の方法。
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