JP2022513333A - 多重蛍光および配列決定を用いて疾患を診断するための方法 - Google Patents

多重蛍光および配列決定を用いて疾患を診断するための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、対象から得られたサンプル中に疾患関連バイオマーカーのmRNA種および/または少なくとも1種類のmiRNA種が存在するか否かを、多重蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)を介して判定する段階により、ならびに、該サンプル中に段階(a)の疾患関連バイオマーカーの該mRNA種および/または疾患関連バイオマーカーの該miRNA種が存在するか否かを、多重配列決定によって判定する段階により、疾患を診断するための方法に関する。本発明はまた、本明細書において記述および提供される診断のための方法を実施するためのキット、ならびに本明細書において記述および提供される診断のための方法を実施するためのそのようなキットの使用に関する。

Description

本発明は、対象から得られたサンプル中に疾患関連バイオマーカーのmRNA種および/または少なくとも1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、もしくは10種類超のmiRNA種が存在するか否かを、多重蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)を介して判定する段階により、ならびに、該サンプル中に段階(a)の疾患関連バイオマーカーの該mRNA種および/または疾患関連バイオマーカーの該miRNA種が存在するか否かを、多重配列決定によって判定する段階により、疾患を診断するための方法に関する。本発明はまた、本明細書において記述および提供される診断のための方法を実施するためのキット、ならびに本明細書において記述および提供される診断のための方法を実施するためのそのようなキットの使用に関する。
疾患を初期状態でかつ可能な限り確実に診断することは、その後の治療法の成功を高めるために最も重要である。バイオマーカーは、miRNA (マイクロRNA)のようなバイオマーカーを含めて、あらゆる種類の疾患の診断にとってますます重要になっている。miRNAのような豊富なバイオマーカーを検出するための適切なFISH法は、皮膚がんの検出について以前に記述されている(Renwick et al., JCI (2013), 123(6): 2694-2702)。しかしながら、そのような方法は、miRNAのような大部分が豊富かつ細胞型に特異的な核酸用に開発されており、他のバイオマーカー核酸には容易に使用されなかった。さらに、単一分子RNA FISHを含めて、現行のFISH法では、とりわけバイオマーカーの定量化のためにシグナル強度のみが定量化および使用される場合、正確な転写物量の測定が保証されない。
乳がん(BCa)は女性の全がん型の中で1位にランク付けされている。女性8人中の1人がその生涯でBCaを発症し、2017年には世界中で年間550 000人が死亡していると推定されている。米国では44 000人の女性がBCaで死亡しているが、欧州では状況がはるかに悪く、143 000人が死亡している。2017年には欧州で571 000人前後の新規患者が侵襲性BCaと診断された。大きな問題が2つある: 1. 現行の医療水準では、再診断が許可されていないことが多いこと; 2. 今日の診断試験は偽陽性(20～30%)、偽陰性(20～25%)、および過剰診断(10～20%)の結果をもたらしており、正確度および精度を欠いていること。それゆえ、BCa患者は過誤/過剰診断され、その結果、約280 000人のBCa患者(約50%)の過誤/過少/過大処置が欧州で多数のBCa死の深刻な一因となっており、患者および社会全体の社会的および経済的負担を増やすことにもなっている。
乳がん(BCa)は女性で最も一般的ながんであり、2012年には世界中で診断された新たな症例が170万例あった。この数は、加齢、汚染、閉経期ホルモンの使用、ライフスタイル、肥満などにより、2030年には2倍になると予想される。欧州での発生は約60万人であり、女性8人中の1人に影響を与えている。BCaは女性のがんによる死亡原因の第2位である。今日、BCa患者のほぼ50%が過誤診断され、後に過誤/過少/過大処置を受けてその命を危険にさらし、多くの場合には死を引き起こしている。この比率を改善するには、BCaの診断および処置を、より正確にかつ個別化する必要がある。BCaの診断が下される場合には、腫瘍サイズ、リンパ節転移、腫瘍悪性度、エストロゲン受容体状態、プロゲステロン受容体状態、形態、HER2/neu状態などのような、腫瘍学者が知る必要のある疾患の特定の特徴がある。これらの特徴が、がんの画像を作り出し、それを用いて患者に特有の処置計画を作成する。多くの場合、この情報は化学療法が効果的かどうかを判断するのに十分なほど明確ではない。腫瘍学者は、BCa患者の46%が化学療法の恩恵を受けていないことに気付いた。それらの患者(BCaが再発していない)が化学療法を受けた場合、副作用および起こりうる合併症が薬の恩恵を上回る可能性があった。最も効果的な治療法、処置期間、およびどの患者が化学療法の恩恵を受けるまたは受けないかを直接定義する、単一の診断試験から100%正確なBCa診断データを取得することは、BCaの診断、予後診断、および処置に有益であると考えられる。
しかしながら、単一試験で提供されるデータはごく限られている。BCaを診断するための従来の臨床プロトコール(IHC、H&E、血液検査など)は、完全に定量的ではない(BCaマーカーのレベルを正確に測定することができない)。それに対して、標準的な定量的RNAに基づく方法(RT-qPCR、マイクロアレイなど)は、BCaマーカーの発現レベルを測定するために組織から単離されたサンプルで実施される。しかしながら、それらは少数のBCaマーカーしか測定することができず、不均質BCaの処置に不可欠な組織形態情報を欠いている。それゆえ、腫瘍学者は、限られた数の臨床的に検証されたバイオマーカーに依存してBCa処置を選択し、定量的測定値および物理的特徴を取得するためにいくつかの試験を実施する必要がある。かくして、従来の診断では、31%のがん過誤診断に加えて10～20%の過剰診断が起きる。
さらに、信頼性の低い診断率(約50%)がある。既存のがんプロファイリング方法では、ほとんどの場合、がんマーカーを確実に測定できない。IHCを用いて組織切片で実施されたHER2状態の試験では、偽陽性/陰性率(30%超)をもたらしうる。ER/PRの偽陰性率は20～25%の範囲であり、HER2の偽陽性率は20～30%であり、過剰診断は10～20%である(ISHおよびIHCの両方から)。がんの誤分類は不必要な毒性処置につながり、死を引き起こすことが多い。
また、診断はほとんどの場合、非常に長い(4週間超)。現行の診断試験から最も正確な診断を達成するには、いくつかの試験を実施する必要があり(これは現行の医療水準では許可されていないことが多い)、さまざまな検査室が関与することが多い。これによって1ヶ月超の検査所要時間となり、偽陽性/陰性率のリスクも高くなる。他の診断ソリューション(Oncotype DX, MammaPrint, Prosigna)は、臨床情報の提供に時間がかかる。結果を受け取るまでに公式には2週間かかるが、それらの診断試験は最終的に4週間より長くかかる。
さらに、不必要な化学療法の事例が多くある(約46%)。BCaプロファイリングおよび予後診断試験が非常に限られているため、多くのBCa患者は無用の化学療法を受け、BCa患者の46%では、化学療法が不必要である。
これらのおよびさらなる欠点を克服する必要がある。それゆえ、本発明は、これらの必要性および技術的目的に対処し、本明細書において記述され、特許請求の範囲において定義されるような解決策を提供する。
本発明は、疾患を診断するための方法に関し、該方法は、
(a) 対象から得られたサンプル中に疾患関連バイオマーカーのmRNA種および/または少なくとも1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、もしくは10種類超のmiRNA種が存在するか否かを、多重蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)によって判定する段階; ならびに
(b) 該サンプル中に段階(a)の疾患関連バイオマーカーの該mRNA種および/または疾患関連バイオマーカーの該miRNA種が存在するか否かを、多重配列決定によって判定する段階
を含み、好ましくは、疾患関連バイオマーカーの該mRNA種および/または少なくとも1種類のmiRNA種が存在すると段階(a)において判定された該サンプルのその部分を、段階(b)を実施する前にレーザーキャプチャリングに供する。
本発明の方法において適用されるレーザーキャプチャリングは、好ましくは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションである。レーザーマイクロダイセクションは、例えば、視覚的選択に基づいてサンプル、特に組織切片サンプルから別個の細胞を単離することを可能にする。視覚的選択は、コンピュータおよびソフトウェア支援によるものでありうる。視覚的選択は、とりわけ、スライドスキャニング、RNA可視化、RNAバイオマーカー定量化、分光イメージング、デミキシング、多重可視化、全スライドスキャニング、画像分析を含む。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションの手段および方法は、例えば、ArcturusまたはLeica (例えばHipp et al., J Path Inform 2018; 9, 45を参照のこと)によって提供される。
好ましくは、シグナル、例えば蛍光シグナル、免疫組織化学的シグナル、またはヘマトキシリンおよび/もしくはエオシンからのシグナルは、多重FISHが実施される場合に顕微鏡検査によって検出されうる。そのような顕微鏡検査は自動化され、コンピュータおよび/またはソフトウェア支援されうる。
本発明者らは、レーザーキャプチャリングが本発明の方法によって得られた結果を著しく改善することを観察した。特に、本発明者らは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションが、不均質な組織をサンプリングすることによって導入されるバイアスを低減し、RNA FISHとRNA配列決定との間の一致を確実にすることを観察した(図6参照)。したがって、本発明の方法の状況において、多重RNA FISHを実施した後に、疾患関連バイオマーカーのmRNA種および/または少なくとも1種類のmiRNA種が存在するとRNA FISHにより判定されたサンプルのその部分を、RNAの多重配列決定を実施する前にレーザーキャプチャリング、特にレーザーキャプチャーマイクロダイセクションに供することが好ましい。それによって、1つまたは複数の疾患関連バイオマーカーのRNA FISHにおいてシグナルを示すサンプルのそれらの部分が、いわば、濃縮され、多重RNA配列決定を実施することによって潜在的な確認段階に供される。実際、多重RNA FISHによって検出されたRNAおよび/またはmiRNAが多重RNA配列決定によって(再び)検出されうるかどうか判定され、それにより多重RNA FISHによって得られた結果が確認される。多重RNA FISHによって検出されるRNAおよび/またはmiRNAが多重RNA配列決定によって(再び)検出される必要があるため、この2段階の手順により、例えば、RNA FISHおよび/またはRNA配列決定によって得られる偽陽性および/または偽陰性の結果が回避される。
本発明の方法、特にレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを実施する状況において、サンプル、特に組織切片サンプルは、スライドガラス上、好ましくは、正に帯電したスライドガラス上、フレームスライド上、PET膜を有するフレームスライド上、または膜を有するスライドガラス上に配置されることが好ましい。
レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、好ましくは添付の実施例に記述されているように行われる。
本発明の方法において用いられる好ましいサンプルは、組織切片サンプルである。組織切片サンプルは、ホルムアルデヒド固定されうるか、瞬間冷凍(FFFF)されうるか、またはホルムアルデヒド固定(FF)および/もしくはパラフィン包埋(PE)されうるか、好ましくはホルムアルデヒド固定されうるか、パラフィン包埋(FFPE)されうる。ホルムアルデヒド固定は、好ましくは、37%ホルムアルデヒド水溶液であるホルマリンによって行われる。
好ましくは、本発明の状況において用いられる場合のサンプルは、好ましくはさらにホルムアルデヒド固定されているパラフィン包埋サンプルのミクロトーム切片化によって得られる。理想的にはかつ好ましくは、ミクロトーム切片化によって得られたサンプルは、取得後に25℃～0℃の温度でインキュベートされる。実際、本発明者らは、サンプルを、好ましくはその取得後にミクロトーム切片化によって得られたサンプルを、理想的には直ちに、25℃～0℃、例えば25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、11℃、10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、4℃、3℃、2℃、1℃、または0℃、より好ましくは10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、4℃、3℃、2℃、1℃、または0℃の温度に置くことが有利であることを見出した。好ましくは、そのような温度でサンプルをインキュベートするために氷水浴が用いられうる。ミクロトーム切片化は、好ましくは添付の実施例に記述されているように行われる。
図4に示されるように、取得後、ミクロトーム切片化によって得られることが好ましい、好ましくはホルムアルデヒド固定され、パラフィン包埋されている、サンプル、好ましくは組織切片サンプルを、氷冷水浴によって達成される、25℃～0℃の温度に置く場合、サンプルに含まれる細胞からのRNA、特に低分子RNA、例えばmiRNAの拡散が抑止され、それにより高濃度のRNA、特に、低分子RNAが確実にされる。実際、図4は、ベースライン対照として機能するFFFF組織サンプルを示す。本明細書において記述されるように処理されることが好ましいサンプルは、ミクロトーム切片化によるその取得後、25℃～0℃の温度に置かれたが、先行技術の教示にしたがって調製されたサンプルは、そのような低温に置かれなかった。実際、先行技術では、ミクロトーム切片化によって得られたサンプルをそのような温度に置くことが教示されていない。むしろ、先行技術では、ミクロトーム切片化されたサンプルを平坦化するために、サンプルを約45℃～42℃の温度に直ちに置くことが教示されている。
パラフィン包埋されうるサンプルが本発明の方法によって診断される場合、それは、好ましくは、本明細書において記述される方法の段階(a)および/または段階(b)を実施する前に脱パラフィンされる。脱パラフィンは、好ましくは、本明細書に、特に添付の実施例に記述されているように達成される。
本発明は、複数のバイオマーカー(mRNA種および/または少なくとも1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、もしくは10種類超の異なるmiRNA種)の発現レベルを評価する、がん(例えば、乳がん(BCa))を含むがこれに限定されない、いくつかの疾患に対する新規の個別化された診断試験を提供する。それは、可視化技法(FISH)とそれに続く多サンプル配列決定技術を組み合わせて、高レベルの特異性および感度を有する単一の試験にする。これによって分析の偏りが低減し、単一患者のサンプルに対する複数のRNAバイオマーカー(例えばBCaの場合、例えば、9～25種類のバイオマーカー)の同時評価が可能とされる。本発明の方法は、2つの独立した定性的/定量的技術を組み合わせて、バイオマーカー分析の相互検証を可能にし、誤診を排除または大幅に低減する。次に、特定の個別化された処置および治療の長さ、ならびに、腫瘍学者が個別化された効果的な処置をデザインするのに役立つ、再発の可能性が示唆されうる。本明細書において記述および提供される本発明の方法は、異なる疾患、特にがん、好ましくは任意の固形腫瘍(例えば、乳がん)および任意の段階のがんに適用されうる。
本明細書において定義される場合、本明細書において用いられる、「マイクロRNA」、「miRNA」、または「miR」という用語は互換的に用いられ、典型的には、18～26核酸塩基長の非コードRNAを含み、これは酵素Dicerによるpre-miRNAの切断の産物でありうる。成熟miRNAの例は当技術分野において公知のmiRNAデータベース、例えばmiRBase (http://microma.sanger.ac.uk/)などにおいて見出される。
本明細書において用いられるようにおよび当技術分野において公知のように、「mRNA」という用語は、「メッセンジャーRNA」と互換的に用いられ、遺伝子発現のタンパク質産物のアミノ酸配列を規定する、リボソームにDNAからの遺伝情報を伝達するRNA分子を意味する。mRNAは、さまざまな遺伝子に固有であり、例えば腫瘍組織のような異なる種類の組織において特定の発現パターンを示しうる。
一般に、本明細書において用いられる場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸」、または「核酸分子」という用語は、同義的に解釈されるべきである。一般に、核酸分子は、とりわけ、DNA分子(cDNA、相補的DNAを含む)、RNA分子(例えば、miRNA、mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、siRNA、scRNA、snoRNA、および当技術分野において公知の他のもの)、LNA (ロックされた核酸)分子(例えば、Kaur et al., Biochem (2006), 45(23): 7347-7355を参照のこと)、オリゴヌクレオチドチオホスフェート、置換リボオリゴヌクレオチド、またはPNA (ペプチド核酸)分子を含みうる。さらに、「核酸分子」という用語は、DNAもしくはRNAまたはそのハイブリッドあるいは当技術分野において知られているその任意の修飾をいいうる(修飾の例については、例えば、US 5525711、US 471 1955、US 5792608、またはEP 302175を参照のこと)。ポリヌクレオチド配列は、一本鎖または二本鎖、線状または環状、天然または合成であってよく、いずれのサイズ制限もない。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ゲノムDNA、cDNA、ミトコンドリアDNA、mRNA、アンチセンスRNA、リボソームRNA、またはそのようなRNAもしくはキメラプラストをコードするDNAでありうる(Gamper, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 4332-4339)。ポリヌクレオチド配列は、ベクター、プラスミドの形態、またはウイルスDNAもしくはRNAの形態でありうる。上記の核酸分子に相補的である核酸分子および本明細書において記述される核酸分子にハイブリダイズすることができる核酸分子も本明細書において記述される。本明細書において記述される核酸分子は、本発明の状況における核酸分子の断片であってもよい。特に、そのような断片は機能的断片である。そのような機能的断片の例は、プライマーとして役立つことができる核酸分子である。
本明細書において用いられる場合、核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、および人工ヌクレオチドを含む、異なるタイプのヌクレオチドを含みうる。本明細書において用いられるヌクレオチドは一般に、ヌクレオシド、天然に存在するヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、および人工ヌクレオシドを含む。当技術分野において公知のように、天然に存在するヌクレオシドは、プリン塩基またはピリミジン塩基を含む。天然に存在するヌクレオシドの例としては、(デオキシ)アデノシン、(デオキシ)グアノシン、(デオキシ)ウリジン、チミジン、および(デオキシ)シチジンが挙げられる。本明細書において記述されるヌクレオチド(したがって、核酸分子)の一部としてのヌクレオシドは、一般に、任意のプリンまたはピリミジンヌクレオシドおよびその誘導体または類似体を含む構造を包含しうる。すなわち、本発明に関連して用いられる「プリンヌクレオシド」または「ピリミジンヌクレオシド」は一般に、任意の種類のプリンまたはピリミジン、ならびにそれぞれ本明細書において記述されるその誘導体または類似体、ならびに糖、例えばペントースを含む。本発明の1つの態様において、プリンヌクレオシドは、(デオキシ)アデノシン、イノシン、および(デオキシ)グアノシンならびにその誘導体または類似体からなる群より選択されうる。誘導体は、例えば、デアザプリン、アジドプリン、アルキルプリン、チオプリン、ブロモプリン、O-アルキルプリン、およびイソプリン、例えばデアザプリン、例えば7-デアザプリンなどからなる群より選択されるプリンを有するヌクレオシドでありうる。すなわち、本発明の1つの局面において、プリンヌクレオシドは、デアザプリン、アジドプリン、アルキルプリン、チオプリン、ブロモプリン、O-アルキルプリン、およびイソプリン、例えばデアザプリン、例えば7-デアザプリンなどからなる群より選択されるプリンを有するヌクレオシドでありうる。本発明の別の局面において、プリンヌクレオシドは、1-メチル(デオキシ)アデノシン、2-メチル-(デオキシ)アデノシン、N6-メチル(デオキシ)アデノシン、N6,N6-ジメチル(デオキシ)アデノシン、7-デアザ(デオキシ)アデノシン、7-デアザ-8-アザ(デオキシ)アデノシン、7-デアザ-7-ブロモ(デオキシ)アデノシン、7-デアザ-7-ヨード(デオキシ)アデノシン、8-アジド(デオキシ)アデノシン、8-ブロモ(デオキシ)アデノシン、8-ヨード(デオキシ)アデノシン、8-ブロモ-2'-デオキシ(デオキシ)アデノシン、2'-O-メチルアデノシン、イノシン、1-メチルイノシン、2'-O-メチルイノシン、1-メチル(デオキシ)グアノシン、7-メチル(デオキシ)グアノシン、N2-メチル(デオキシ)グアノシン、N2,N2-ジメチル-グアノシン、イソグアノシン、7-デアザ(デオキシ)グアノシン、7-デアザ-8-アザ(デオキシ)グアノシン、7-デアザ-7-ブロモ(デオキシ)グアノシン、7-デアザ-7-ヨード(デオキシ)グアノシン、6-チオ(デオキシ)グアノシン、O6-メチル(デオキシ)グアノシン、8-アジド(デオキシ)グアノシン、8-ブロモ(デオキシ)グアノシン、8-ヨード(デオキシ)グアノシン、2'-O-メチルグアノシン、8-アジドイノシン、7-アザイノシン、8-ブロモイノシン、8-ヨードイノシン、1-メチルイノシン、および4-メチルイノシンからなる群より選択されうる。本発明のさらなる局面において、プリンヌクレオシドは、キューオシン、アルケオシン、ワイオシンおよびN6-スレオニルカルバモイルアデノシンからなる群より選択されうる。本発明の1つの局面において、ピリミジンヌクレオシドは、(デオキシ)シチジン、(デオキシ)チミジン、(デオキシ)リボチミジン、(デオキシ)ウリジン、およびその誘導体からなる群より選択されうる。誘導体は、例えば、アルキルピリミジン、チオピリミジン、ブロモピリミジン、O-アルキルピリミジン、イソピリミジン、アセチルピリミジン ヒドロピリミジン、およびシュードピリミジンからなる群より選択されるピリミジンを有するヌクレオシドでありうる。すなわち、本発明の1つの局面において、ピリミジンヌクレオシドは、アルキルピリミジン、チオピリミジン、ブロモピリミジン、O-アルキルピリミジン、イソピリミジン、アセチルピリミジン ヒドロピリミジン、およびシュードピリミジンからなる群より選択されるピリミジンを有するヌクレオシドでありうる。本発明の別の局面において、ピリミジンヌクレオシドは、3-メチル-(デオキシ)シチジン、N4-メチル(デオキシ)シチジン、N4,N4-ジメチル(デオキシ)シチジン、イソ(デオキシ)シチジン、シュード(デオキシ)シチジン、シュードイソ(デオキシ)シチジン、2-チオ(デオキシ)シチジン、N4-アセチル(デオキシ)シチジン、3-メチル(デオキシ)ウリジン、シュード(デオキシ)ウリジン、1-メチル-シュード(デオキシ)ウリジン、5,6-ジヒドロ(デオキシ)ウリジン、2-チオ(デオキシ)ウリジン、4-チオ(デオキシ)ウリジン、5-ブロモデオキシ(デオキシ)ウリジン、2'-デオキシウリジン、4-チオ(デオキシ)チミジン、5,6-ジヒドロ(デオキシ)チミジン、O4-メチルチミジン、ジフルオロトルエン(difluortoluene)、および他の核酸塩基代用物からなる群より選択されうる。言及したように、本明細書において記述および提供されるヌクレオシドは一般に、本明細書において記述されるプリンもしくはピリミジンまたはその誘導体もしくは類似体、ならびに例えばペントースのような糖部分を含む。一般に、本明細書において記述されるプリンもしくはピリミジンヌクレオシドまたはその誘導体もしくは類似体の一部としてのペントースは、とりわけ、リボース、デオキシリボース、アラビノース、またはメチルリボース(2-O-メチルリボース(methyribose))、例えば、リボースまたはデオキシリボースでありうる。すなわち、ヌクレオシドは、例えば、(リボシル)ヌクレオシド、デソキシ(リボシル)ヌクレオシド、アラビノシルヌクレオシド、または(メチルリボシル)ヌクレオシド、例えば(リボシル)ヌクレオシドまたはデオキシ(リボシル)ヌクレオシドでありうる。
本明細書において用いられる場合、分子用語の接頭辞としての「デオキシ」および「デオキシ」という用語は、同義的に用いられ、例えば、リボースまたは他のような所与のペントース中に、酸素原子またはヒドロキシル基が存在しないことを示す。
本発明に関連して、段階(a)および段階(b)における疾患関連バイオマーカーの存在によって、好ましくは、該疾患が示される。
本発明のさらなる態様において、本明細書において記述および提供される方法は、疾患関連バイオマーカーの存在または非存在により疾患の診断を可能にする。
一般に、本発明に関連して、本明細書において記述および提供される方法で診断される疾患は、FISHで検出可能な特定のバイオマーカーの存在に結び付けられ、かつ配列決定できる任意の疾患でありうる。したがって、本発明の好ましい態様において、そのようなバイオマーカーは、各疾患に特異的な核酸分子、好ましくはmiRNAまたはmRNA、最も好ましくはmRNA分子である。本発明の1つの態様において、疾患はがんである。この状況において、がんは任意のタイプのがんでありえ、例えば、がんは固形がんである。具体的には、疾患ががんである場合、それは、例えば、固形がん(例えば、非小細胞肺がん(on-small cell lung cancer)、乳がん、結腸直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、皮膚がん、前立腺がん、脳または神経系のがん、頭頸部がん、精巣がん、肺がん、肝臓がん、腎臓がん、膀胱がん、胃腸がん、骨がん、内分泌系のがん、リンパ系のがん、線維肉腫、神経外胚葉性(neurectodermal)腫瘍、中皮腫、類表皮がん、またはカポシ肉腫)、および血液がん(例えば、白血病)でありうる。本発明の特定の態様において、疾患は乳がん(BCa)である。
本発明によれば、本明細書において記述および提供される方法によって検出されるmRNA種は、上昇または低減した発生または発現が、本明細書において記述されるように診断されるある種の疾患に特異的である任意のmRNAでありうる。その上昇または低減した発生または発現はまた、特定の病変組織、例えば、腫瘍組織に(がんに)典型的でありうる。例えば、乳がんの場合、本発明の方法によって検出される典型的なmRNA種は、HER2 (HER2、GRB7)、増殖(Ki-67、STK15、サバイビン、サイクリンB1、MYBL2)、エストロゲン(ER、PR、Bcl2、SCUBE2)、侵入(ストロメライシン3、カテプシンL2)、およびその他(GSTM1、BAG1、CD68)に特異的なものを含み、ここでHER2、ER、およびPRは本発明による最も関連性のあるマーカーを表す。本発明の方法によって存在が判定されうるさらなるmRNAマーカーは、HER2、ER、PR (最も関連性のある乳がん診断/予後診断の転写物)、NUPR1 (タキソール耐性のマーカー)、およびCSF1 (三重陰性乳がん症例における浸潤のマーカー)を含む。したがって、本発明の1つの態様において、本発明によって存在が判定されうるさらなるmRNA種は、好ましくはHER2、ER、およびPRを含めて、HER2、ER、PR、NUPR1、CSF1、GRB7、Ki-67、STK15、サバイビン、サイクリンB1、MYBL2、ER、PR、Bcl2、SCUBE2、ストロメライシン3、カテプシンL2、GSTM1、BAG1、およびCD68からなる群より選択されうる。もちろん、本発明の方法において、疾患関連バイオマーカーである任意のmRNAを、本明細書において記述されるようにその上昇または低減した発生についてアッセイすることができる。
本発明によれば、本明細書において記述および提供される方法によって検出される少なくとも1種類、2種類、3種類、またはそれ以上、例えば、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、または10種類超のmiRNA種は、本明細書において記述されるように診断されるある種の疾患に上昇または低減した発生または発現が特異的である任意のmiRNAでありうる。その上昇または低減した発生または発現はまた、特定の病変組織、例えば、腫瘍組織に(がんに)典型的でありうる。例えば、乳がんの場合、本発明の方法によって検出される典型的なmiRNA種は、miR-21、miR-29a、miR-221、およびmiR-375を含む。したがって、1つの態様において、本発明によって存在が検出されうる少なくとも1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、または10種類超のmiRNA種は、miR-21、miR-29a、miR-221、およびmiR-375からなる群より選択されうる。もちろん、本発明の方法において、疾患関連バイオマーカーである任意のmiRNAを、本明細書において記述されるようにその上昇または低減した発生についてアッセイすることができる。
本発明の1つの態様において、段階(a)は、サンプル中に疾患関連バイオマーカーのsnRNA (核内低分子RNA)種および/またはscRNA (低分子コンディショナルRNA)種が存在するか否かを、多重FISHによって判定することをさらに含む。本発明によれば、本明細書において記述および提供される方法によって検出されるsnRNAまたはscRNA種は、本明細書において記述されるように診断されるある種の疾患に上昇または低減した発生または発現が特異的である任意のsnRNAまたはscRNAでありうる。その上昇または低減した発生または発現はまた、特定の病変組織、例えば腫瘍組織に(がんに)典型的でありうる。例えば、乳がんの場合、本発明の方法によって検出される典型的なsnRNAまたはscRNA種は、U2 snRNAおよび7SL scRNA (主要な乳がんサブタイプの新規バイオマーカー対)を含む。したがって、1つの態様において、本発明によって存在が判定されうるsnRNAまたはscRNA種は、U2 snRNAおよび7SL scRNAからなる群より選択されうる。もちろん、本発明の方法において、疾患関連バイオマーカーである任意のsnRNAまたはscRNAを、本明細書において記述されるようにその上昇または低減した発生についてアッセイすることができる。
さらに、本発明によれば、対照マーカーの存在は、段階(a)において多重FISHにより判定されうる。本発明の1つの態様において、28S rRNA、ポリ(A) RNA、β-アクチン、GAPDH、RPLPO、GUS、およびTFRCからなる群より選択されるさらに1つまたは複数のRNAの存在が、対照としてFISHにより判定されうる。
本発明のさらなる態様において、段階(b)は、サンプル中に疾患関連バイオマーカーのsnRNA種および/またはscRNA種が存在するか否かを多重配列決定によって判定することをさらに含む。この状況における好ましい態様において、また段階(a)は、サンプル中に疾患関連バイオマーカーのsnRNA (核内低分子RNA)種および/またはscRNA (低分子コンディショナルRNA)種が存在するか否かを多重FISHによって判定することをさらに含む場合、段階(b)は、サンプル中に疾患関連バイオマーカーのsnRNA種および/またはscRNA種が存在するか否かを多重配列決定によって判定することをさらに含む。
本発明に関連して、本明細書において記述および提供される方法の第1の段階において、多重蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)を用いて、対象から得られたサンプル中に疾患関連バイオマーカーのmRNA種および/または少なくとも1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、もしくは10種類超のmiRNA種が存在するか否かを判定する。本明細書において用いられる場合、「多重FISH」は、当業者に知られているFISHアッセイであり(例えば、Lee et al., RNA (2011), 17(6): 1076-1089を参照のこと)、これではmRNA種および/または、少なくとも1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、もしくは10種類超の異なるmiRNA種の存在が判定される。本発明の1つの態様において、いくつかのmRNA、scRNA、snRNA、rRNA、他のRNA、および/または少なくとも1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、もしくは10種類超の異なるmiRNA種の存在が、「多重」FISHアッセイにより同時に判定される。本発明によれば、異なるRNA種の同時FISH測定は、異なる色素標識を用いて異なるRNA種が検出されうるので、多色FISHをもたらしうる。
好ましくは、多重RNA FISHは、添付の実施例に記述されるように行われる。
例えば、特に本発明の方法によって診断される疾患が乳がんである場合、本発明の1つの態様において、少なくとも1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、または10種類超のmRNA (HER2、ER、PR)の存在が同時に判定される。本発明の別の態様において、HER2、ER、および/またはPRのmRNAに加えて、(i) U2 snRNAおよび/もしくは7SL scRNA、(ii) 28SrRNAおよび/もしくはポリ(A) RNA (対照および悪性腫瘍レポーターとして)、(iii) NUPR1 (タキソール耐性マーカー)、ならびに/または(iv) CSF1 (三重陰性乳がんにおける浸潤のマーカー)の存在が、多重FISHにより同時に判定される。
本発明の別の態様において、特に本発明の方法によって診断される疾患が乳がんである場合、最大25種類のバイオマーカーの存在が、多重FISHにより同時に判定される: HER2 (HER2、GRB7)に関連するmRNAおよび/もしくはエストロゲン(ER、PR、Bcl2、SCUBE2)に関連するmRNA、ならびに、以下のクラスタ: 増殖(Ki-67、STK15、サバイビン、サイクリンB1、MYBL2)、浸潤(ストロメライシン3、カテプシンL2)、耐性(β-アクチンン、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRC)、miRNA (miR-21、miR-29a、miR-221、もしくはmiR-375のうちのいずれか1つのうちの少なくとも3つ)、および/またはその他(GSTM1、BAG1、CD68)のうちのいずれかに関連する1つまたは複数のRNA。
一般に、本発明に関連して、本明細書において記述および提供される診断方法は、生検中または手術中に除去された患者の組織(例えば、BCa組織のような、がん組織)から始めて実施される。組織を最初に多重FISHアッセイによって分析し、いくつかの(BCaでは最大9～25種類の)代表的なバイオマーカーの同時可視化および定量化を可能にする。このアッセイは、選択されたmRNAまたはmiRNA標的を認識する蛍光標識された核酸プローブ(例えば、MultiplexDX(登録商標)から入手可能)に基づいている。FISHプローブのRNAへのハイブリダイゼーションにより、一般的な蛍光顕微鏡法による単一細胞内でのバイオマーカーの可視化が可能になる。本発明の1つの態様において、本発明は、「クリックラベリング」を用いて、特定のRNA標的上の2つの近接するプローブの化学的融合に基づきFISHプローブの結合親和性を高めうる(図2参照)。したがって、RNAの蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)に用いられるプローブは、クリックケミストリーによって結合されうることが好ましい。プローブのクリックケミストリー架橋結合は、好ましくは、添付の実施例に記述されているように行われる。本発明によれば、FISHプローブの特異性によって、複数のバイオマーカー(多色FISH)の同時(多重FISH)検出およびFISHシグナル強度から導出される正確なバイオマーカーの定量化が可能になる。
当業者に公知のように、FISHでは、豊富なRNAへの比較的安定したいかなるミスハイブリダイゼーションも、特異性を低減する偽陽性シグナルをもたらすことになる。FISHアッセイでのプローブハイブリダイゼーションを、それぞれ、PCRまたはRNAiでのプライマーまたはsiRNAのハイブリダイゼーションと直接比較することはできないが、PCR中に、酵素連鎖反応を開始するために完全な結合が必要とされるプライマーの末端が、異常なPCR反応を引き起こすプライマー・標的二重鎖内のミスマッチまたはバルジに対して最も感受性が高いことは明らかである。リボソームRNA (rRNA)のような豊富なRNAへのsiRNAの1%のミスハイブリダイゼーションは無関係であるが、RNA FISHでの豊富な非特異的転写物へのそのようなレベルのミスハイブリダイゼーションは、主にrRNAシグナルをもたらすと考えられる(rRNAはmRNAよりも少なくとも1000～100,000倍豊富にあるので、rRNAへの1%のミスハイブリダイゼーションは、標的mRNAシグナルよりも最大1,000倍高いと考えられる)。したがって、プローブのミスハイブリダイゼーションは、依然として大きな技術的障壁である。
本明細書において記述される本発明の方法において用いられるプローブは、当技術分野において公知のようにFISHでの適用に適した任意の種類のものでありうる。好ましくは、プローブは核酸分子に基づく。本発明の1つの態様において、プローブはLNA分子である。プローブは、本発明の方法によって存在が決定されるRNA分子に依存して、任意の長さのものであることができる。例えば、本発明の1つの態様において、プローブは、最大40ヌクレオチド長、好ましくは、最大35、30、または20ヌクレオチド長でありうる。本発明のさらなる態様において、プローブは、少なくとも7ヌクレオチド長、好ましくは、少なくとも8、9、または10ヌクレオチド長である。
FISHでのRNA検出のためのプローブは、当技術分野において一般に公知のように設計することができる。例えば、本発明によれば、以下のパラメータが事前に設定されている: 1. 標的配列(関心対象のRNA)、2. RNA FISHプロトコールのハイブリダイゼーション温度、および3. 標的1つあたりのFISHプローブの所望の数。次に、DNA合成機の合成プログラムに後で挿入することができる配列のリストは、MultiplexDX (登録商標)によって提供されるプログラムまたは他の市販のプログラムによって作成されうる。最も豊富なRNA (例えばrRNA、ncRNA、tRNA、mt-RNA、scRNAなど)との予測されるハイブリダイゼーション挙動および最小の交差ハイブリダイゼーションに基づいて、プローブのために適切な配列が選択されうる。本発明によれば、最適なプローブは、以下の特徴を満たしうる: (a) 最も豊富なRNAとの最小化された交差ハイブリダイゼーション、ならびに(b) プローブ長さを変化させることにより等しくされたLNA/DNA融解温度(TM)/結合親和性、プローブの正確な配置、およびプローブ1つあたりのLNA含有量。選択されたハイブリダイゼーション条件に基づいて、RNA FISHプローブは、例えば、プローブ1つあたり約3～5個のLNA修飾を有する11～15 nt長のロックされた核酸(LNA)-修飾DNAプローブ(LNA/DNA)でありうる。TM予測は、例えば、DNA/DNA、DNA/RNA、およびLNA/DNA二重鎖に対してのIDT DNAオリゴ分析機により現在使用されているアルゴリズムに基づいており、標的タイプ(DNAまたはRNA)、オリゴ濃度、およびNa+濃度を主な入力パラメータとして用いうる。任意で、これは、RNA FISHプロトコールにおいて変性剤として用いられうる50%ホルムアミドに対し本発明によって改変されてもよい。
本発明の方法に関連して用いられる多重FISHの場合、例えば、短い、蛍光性の、多重標識されたLNA/DNAプローブ(約11～15 nt長、プローブ1つあたり約4～8個のフルオロフォア、標的1つあたり約20～50個のプローブ)が、任意のRNA標的(最大5 kb)の可視化に用いられうる。プローブは、例えば、自動化されたDr. Oligo 48 (http://www.biolytic.com/t-dr-oligo-48-dna-rna-oligo-synthesizer.aspx参照)もしくはDr. Oligo 768 (https://www.biolytic.com/t-dna-rna-oligo-synthesizer.aspx参照)DNA/RNA合成機または当技術分野において公知の他の手段にて、必要に応じていくつかの所望の改変を各々が伴いながら、合成され、脱保護され、かつ脱塩されうる。各蛍光多重標識プローブ(例えば、約11～15 nt)は、例えば、5 ntセグメントまたはC18スペーサー(GlenResearch)によって各々が分離された、複数(4～8個)の5-オクタジイニル-dUもしくはAbasic-Alkyneまたは他の適切な色素を含有する伸長セグメントで調製されうる。本発明によれば、これにより、アジド標識フルオロフォアまたは任意の関心対象のフルオロフォア(例えば、最も明るく、最も光溶解性（photo-soluble）および水溶性のいくつかを選択し、非特異的なタンパク質結合を回避するATTO色素、Alexa色素、Cy、BODIPY色素、DyLight色素、Cyto色素、Seta色素、RadiantDy色素、およびCF色素)で非常に強力、選択的、かつ効率的なクリックケミストリー標識化が可能になる。クリックケミストリーは、NHS-エステルケミストリーと比較した場合のその堅牢な特異性および定量的効率により、本発明によれば、プローブ1つあたり5個またはそれ以上のフルオロフォアによるプローブの多重標識化を可能にする適切なアプローチである。クリックケミストリー標識化をNHS-エステル標識化と比較すると、フルオロフォア-アジドはフルオロフォア-NHSエステルよりも33～50%高価であるが、本発明によれば、通常、オリゴによる標識化反応において約、例えば10倍過剰のNHS-エステルを使うが、1.2倍過剰のアジドしか使わなくてよいので、クリックケミストリーの方が費用効率は高くなる。
本発明によれば、本明細書において記述および提供される本発明の方法において用いられる多重FISHは、例えば、以下のように実施されうる。1つの態様において、組織細胞は、本明細書において記述されるバイオマーカーの検出の前に固定されうる。細胞および組織の固定およびその後のバイオマーカー検出のための適切な方法は当技術分野において公知であり、例えば、US 9359636、US 9005893およびUS 8394588にも記述されている。本発明によれば、2つの近接するプローブ(約15 nt長)のインサイチュークリックライゲーションにより、さらに安定な30 nt長のダブルプローブが形成され(図2参照)、続いてミスハイブリダイゼーションを標的としたストリンジェントな洗浄が行われ、これによって全プローブの完全な特異的結合を維持しながらも、ミスハイブリダイズされたプローブが完全に洗い落とされ、バックグラウンドが低減される(図2参照)。これによって少量のRNA標的でさえも特定のRNA FISHシグナルを得ることが可能になる。
上記のように、本明細書において記述される方法の段階(a)を実施する前にサンプルが固定されることが好ましい。固定は、好ましくは、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)または5-エチルチオ-1H-テトラゾール(ETT)を用いる処理によって達成されうる。そうは言っても、固定は、好ましくは、本明細書において、特に添付の実施例に記述されているように行われる。
本発明に関連して記述されるクリック標識化に関して、例えば、一方のプローブがアジドにより(3'-アミノ-修飾LNA/DNAオリゴヌクレオチドを通じて)標識され、他方が5'末端でアルキンによりタグ付けされ、オリゴヌクレオチド合成中に直接標識されうる(図2参照)。各プローブは、好ましくは、同じフルオロフォアで標識されうる。このアプローチは、図2に示されるようにインビトロで試験された。次に、プローブを結合させるために室温でクリックケミストリーが実施されうる。これによって、形成されたダブルプローブの結合親和性が大幅に増す。これが順に、ミスハイブリダイゼーションを標的としたストリンジェントな洗浄の使用を可能にすることができ、これによって、洗浄の温度を先のハイブリダイゼーション温度よりも高くすることにより15 nt長のプローブに由来するミスハイブリダイゼーションが完全に洗い落とされる(例えば、ハイブリダイゼーション温度が40℃であるなら、ストリンジェントな洗浄は45～50℃でありうる)。結合およびストリンジェントな洗浄後のダブルプローブの安定性の向上により、全てのプローブの完全かつ特異的な結合が維持されうる。本発明によれば、多重FISHアプローチは、以下のように実施されうる: 1. 40℃で15nt長のLNA/DNAプローブを用いるRNA FISH; 2. 冷却および室温で実施されるクリックケミストリー; 3. 45～50℃での(先のハイブリダイゼーション温度よりも5～10℃高い)ストリンジェントな洗浄。
本明細書において記述されるように、本明細書において記述および提供される本発明の方法に関連して用いられる多重FISHは、本明細書において記述されるいくつかのRNA種の存在の同時判定を可能にする。例えば、本発明によれば、8色多重FISHは、以下のように適用されうる。図3は8色多重FISHを描いており、スペクトルが部分的に重複している7種類またはそれ以上の異なるフルオロフォアの同時検出を可能にする。それらのRNAは異なる細胞内局在で豊富にあるため(U1, U2 snRNA: 核, mt-RNA: ミトコンドリア, 7SL scRNA: 細胞質, U3 snoRNA: 核小体, rRNA: 核小体, ポリ(A): 核/細胞質)、シグナルの特異性が可視的に判定されうる(1細胞上の特異的シグナルを示す赤色の四角形を参照のこと, 図3)。線形アンミキシングによるスペクトル画像化を用いて、スペクトル全体(全スペクトルの合計)内の全個別シグナルがほぼ等しくなければならないかどうか調べられうるが、これは、現行法で最も関連性のある制限の1つであると考えられる。以下のパラメータが本発明によって選択されうる。1. TMを等しくされた特定のプローブは相加的に検出可能であり(4プローブのシグナル強度 = 単一プローブの4倍の強度)、これによって標的1つあたりのプローブ数の制御が可能になる(シグナルが強すぎるまたは弱すぎる場合、プローブ数がそれぞれ減らされうるかまたは増やされうる)。2. プローブ数の増加が可能でない場合、量子収率の高い色素が用いられうる; 3. より強力なフルオロフォアが不十分な場合、プローブ1つあたり2倍の数のフルオロフォアが用いられうる。さらに、シグナル増幅なしで直接標識されたLNA/DNAプローブを用いることで、各RNA標的のシグナル強度を正確に定量化することが可能になる(表1参照)。正規化された相対的RNA FISH強度は、RNA配列決定データと完全に相関しており、本発明に関連して記述および提供される方法の定量化の可能性を示している。
（表１）RNA FISHに由来するncRNA低分子RNAseq配列決定カウントおよび正規化強度の比較。さまざまな組織由来の2000種類超の低分子RNA cDNAライブラリを用いて、読み取りカウントを判定した。全てのプローブを同じATTO-550色素に結合させ、約200個の細胞を含む同じウィンドウサイズを用いて強度を測定した。mRNAのポリ(A)尾部を標的とするポリ(T)プローブを、ATTO-647Nに結合させ、他のプローブと組み合わせて用い、その後にポリ(A)シグナルを用いて、以下のように強度を正規化した: ポリ(A)に対して正規化された相対蛍光強度 = [測定された強度/(プローブセット中のフルオロフォアの数＊曝露時間)]/[測定された強度/(ポリ(A)プローブ中のフルオロフォアの数＊曝露時間)。
Figure 2022513333000001
本発明によれば、シグナル定量化には、マウス28S rRNAを標的とする8種類のLNA/DNAプローブおよびマウス大脳皮質切片におけるその強度を示す表2に例示的に示されるように達しうる。プローブは、ハイブリダイゼーション温度より少なくとも10～20℃高い同様のTMによって示される同様の結合親和性を有するように設計された。表2は、全ての強度がほぼ等しいことを示し、全8種類のプローブをプールすると、個々のプローブのシグナル強度よりも8倍高い合計シグナル強度が得られることも実証している。一緒にプールされた全8種類のプローブの蛍光シグナル強度(498472)は、単一プローブに由来する全シグナル強度の合計(492126)よりも1.2%高いだけにすぎず、高い正確度を示していた。この直線的な増加は、プローブが同様の結合親和性を有し、ハイブリダイゼーション中に洗い落とされない場合(プローブのTMがハイブリダイゼーション温度より少なくとも10℃高い場合)、正確な標的定量化のために本発明の方法を使用できることを示している。
（表２）マウス28S rRNAプローブ配列。RNA FISHを用いマウス大脳皮質のニューロンにおいてマウス28S rRNAを検出するために8種類のオリゴヌクレオチドプローブを設計した。LNA残基は小文字で示されている。シグナル強度をプローブごとに個別に、組み合わせて(rRNA1～8)、およびその非存在下(ブランク)で記録した。各プローブのシグナル強度は、ブランク対照のシグナル強度よりも約100倍高かった。全8種類のプローブをプールすると、個々のプローブのシグナル強度よりも8倍高いシグナル強度が得られ、正確な標的定量化のためにRNA FISHを使用できることを示していた(Σ[rRNA1,..,rRNA8]=492126)。選択したプローブの融解温度(TM)を示す。50%ホルムアミド、1 M NaCl、50 mMホスフェート(pH 7.0)を用いてTMを測定した。50% FAおよび1 M NaClを含有するハイブリダイゼーション緩衝液中55℃で16時間、全てのプローブ(100 nM)をハイブリダイズさせた。N≧100個の細胞。
Figure 2022513333000002
miR、mRNA、DNA、cDNA、LNA、および本明細書において記述されるその他を含む核酸分子/配列、またはその部分もしくは断片に関連して本明細書において用いられる「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェント、低ストリンジェント、または非ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションに関しうる。1つの態様において、条件は、好ましくはストリンジェントである。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrook, Russell 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (2001); Current Protocols in Molecular Biology, Update May 9, 2012, Print ISSN: 1934-3639, Online ISSN: 1934-3647; Ausubel, 「Current Protocols in Molecular Biology」, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989)、またはHiggins and Hames (Eds.), 「Nucleic acid hybridization, a practical approach」, IRL Press Oxford, Washington DC, (1985)に記述されている従来のプロトコールにしたがって確立されうる。条件の設定は、十分に当業者の技術の範囲内であり、当技術分野において記述されているプロトコールにしたがって判定することができる。したがって、特異的にハイブリダイズする配列のみの検出には、通常、65℃で0.1×SSC、0.1% SDSなどのストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件(本明細書において用いられる「ストリンジェントな条件」)が必要であると考えられる。相同な配列または正確に相補的ではない配列の検出のための非ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、65℃で6×SSC、1% SDS (本明細書において用いられる「非ストリンジェントな条件」)に設定されうる。周知のように、プローブの長さおよび判定される核酸の組成は、ハイブリダイゼーション条件のさらなるパラメータを構成する。上記の条件の変化は、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを抑制するために用いられる代替のブロッキング試薬の包含および/または置換によって達成されうる。典型的なブロッキング試薬は、デンハルト試薬、BLOTTO、ヘパリン、変性サケ***DNA、および市販の独自の製剤を含む。特定のブロッキング試薬の包含には、適合性の問題により、上記のハイブリダイゼーション条件の改変が必要とされうる。本明細書において記述される本発明によれば、相同な配列または正確に相補的ではない配列の検出のための低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、65℃で6×SSC、0.5% SDS (本明細書において用いられる「低ストリンジェントな条件」)に設定されうる。周知のように、プローブの長さおよび判定される核酸の組成は、ハイブリダイゼーション条件のさらなるパラメータを構成する。
ハイブリダイズする核酸分子は、上記の分子の断片も含む。そのような断片は、本明細書において記述される阻害剤として機能する核酸分子またはその機能的断片に相当しうる。さらに、前述の核酸分子のいずれかとハイブリダイズする核酸分子は、これらの分子の相補的断片、誘導体および変種も含む。加えて、ハイブリダイゼーション複合体は、相補的GおよびC塩基間ならびに相補的AおよびT (または当業者に公知のようにRNAの場合にはU)塩基間の水素結合の形成による2つの核酸配列間の複合体(例えば、cDNA/LNA)をいう: これらの水素結合は、塩基スタッキング相互作用によってさらに安定化されうる。2つの相補的な核酸配列は逆平行の配置で水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中で(例えば、CotもしくはRot分析)または溶液中に存在する一方の核酸配列と固体支持体(例えば、細胞が固定化されている、例えば、膜、フィルタ、チップ、ピン、またはスライドガラス)に固定化された他方の核酸配列との間で形成されうる。「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対合による許容される塩および温度条件下でのポリヌクレオチドの自然な結合をいう。例えば、配列「A-G-U」は、相補的配列「U-C-A」に結合する。2つの一本鎖分子間の相補性は、一部の核酸のみが結合する「部分的」であることもあれば、一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合に完全であることもある。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に有意な影響を及ぼす。これは、核酸鎖間の結合に依存する増幅反応において特に重要である。
本明細書において記述されるRNA FISHを実施する場合、RNAのFISHを実施した後に、サンプルをヘマトキシリンおよびエオシンで染色することが好ましい。
本明細書において記述される場合、本発明の方法の状況において、とりわけ、28S rRNAおよびポリ(A) RNAが対照としてFISHにより判定される。この対照、すなわち、28S rRNAおよびポリ(A) RNAは、ポリ(A) RNAと28S rRNAの比率によってサンプル中のRNAの分解の可能性が示されるため、対照として特に興味深い。したがって、該方法の段階(a)および/または段階(b)を実施する前に、サンプルを、ポリ(A) (m)RNAと28S rRNAの比率についてチェックすることが好ましい。
実際、本発明者らは、多重RNA FISHおよび/または多重RNA配列決定を実施する前に本明細書において記述されるサンプルの品質管理が有用でありうることを観察した。驚くべきことに、本発明者らは、RNA分解に及ぼす影響がポリA (m)RNA/28S rRNAの比率によって反映されることを見出した。図5に示されるように、ポリA (m) RNA/28S rRNAの比率(蛍光活性/ユニット)を用いて、サンプル、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片サンプルにおけるRNA分解を評価することができ、1未満の比率は分解されたRNAを意味している(おそらく理想的な比率1.15は図5中で点線としてマークされている)。
したがって、本発明の方法の状況において多重RNA FISH (本明細書において言及される段階(a))および/または多重RNA配列決定(本明細書において言及される段階(b))を実施する前に、本明細書において記述されるサンプルは、ポリA (m)RNAと28S rRNAの比率が、1:1であるまたは1:1より大きいかどうか、例えば1.05 : 1、1.1 : 1、1.15 : 1、1.2 : 1、1.3 : 1、1.4 : 1、1.5: 1、2 : 1、または3 : 1であるかどうかチェックされることが好ましい。
しかしながら、別の方法では、本発明の方法の状況において多重RNA FISH (本明細書において言及される段階(a))および/または多重RNA配列決定(本明細書において言及される段階(b))を実施する前に、本明細書において記述されるサンプルは、ポリA (m)RNAと28S rRNAの比率が、1:1であるまたは1:1より小さいかどうか、例えば1 : 1.05、1 : 1.1、1 : 1.15、1 : 1.2、1 : 1.3、1 : 1.4、1 : 1.5、1 : 2、または1 : 3であるかどうかチェックされることが好ましい。
本明細書において記述されるように、本発明によって提供される方法によれば、多重FISH段階に続いて、多重配列決定段階が続く(段階(b))。したがって、FISH段階の後、段階(a) (多重FISH)の結果を確認するために、および/または各疾患を示す追加のバイオマーカーの存在を判定するために、配列決定段階が実施される。すなわち、本発明との関連において、段階(a)において存在が判定された同じバイオマーカーが段階(b)において配列決定されうるか、または段階(a)のもの以外の他のもしくは追加のバイオマーカーが段階(b)において配列決定されうる。本発明の1つの態様において、段階(a)において存在が判定された同じバイオマーカーが段階(b)において配列決定されうる。バイオマーカーの配列決定は、当技術分野において公知の方法、ならびに本明細書において記述および例示の方法によって実施されうる。例えば、本発明によれば、FISHアッセイ中に段階(a)において組織が染色された後に、かつ診断される疾患が、がん(例えば、乳がん)である場合に、腫瘍は正常組織および免疫細胞から、例えば、レーザーマイクロダイセクションによって選択的に単離されうる。次に、がん細胞の均質な集団から、全RNAを抽出し、RNAseq (Canovas et al., Sci Reports (2014), 4 (art. no. 5297), doi: 10.1038/srep05297を参照のこと)に供して、最初の分析の定量化(段階(a)の多重FISHでの可視化)を確認することができ、特定のバイオマーカーの同じまたはもっと広いパネルの存在および量を明らかにすることができる。したがって、本発明の方法の状況において、RNAの多重配列決定が実施される場合にRNAがサンプルから抽出されることが好ましい。好ましくは、RNA抽出は添付の実施例に記述のように行われる。記述の異なるRNAマーカーの配列決定は、当技術分野において公知の適切なcDNAライブラリ(配列決定用の鋳型として使われるRNA集団から合成されたDNA) (例えば、Illumina TrueSeq cDNAライブラリまたは例えばhttps://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/library-construction-kitsに記述されているClontechSMART cDNAライブラリ)に基づきうる。配列決定は、一般に、当技術分野において公知のおよび、とりわけ、例えば、Illumina TrueSeq cDNAライブラリ調製プロトコール(https://support.illumina.com/content/dam/illumine-support/documents/documentation/chemistry_documentation/samplepreps_truseq/truseqrna/truseq-rna-sample-prep-v2-guide-15026495-f.pdf)に記述のRNA配列決定法によって行われうる。好ましくは、RNA配列決定は添付の実施例に記述のように行われる。
上記のように、RNAの多重配列決定の状況において、cDNAライブラリが調製されうる。したがって、cDNAライブラリの調製には、バーコードを含む3'アダプター分子が用いられることが好ましい。好ましくは、バーコードを含むこれらの3'アダプター分子は、プレアデニル化される(preadenylated)。バーコードを含むこれらの3'アダプター分子が集合物であることも好ましい。好ましくはプレアデニル化されうる、バーコードを含むこれらの3'アダプター分子は、プールされるかまたはプールされないかのいずれかであるが、プールされるのが好ましい。より正確には、好ましくはプレアデニル化されうる、バーコードを含むこれらの3'アダプター分子の集合物は、好ましくは、プールされても、プールされなくてもよいが、プールされた集合物が好ましい。そのような集合物は、バーコードを含み、かつ好ましくはプレアデニル化されうる3'アダプター分子を少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21種類、またはそれ以上含む。
実際、大変驚いたことに、本発明者らは、多重RNA配列決定を実施する状況においてcDNAライブラリの調製に3'アダプター分子を用いる場合、バーコードを含む3'アダプター分子がRNA配列決定においてライゲーションおよび技術的バイアスを低減することを観察した。実際、本発明とは対照的に、先行技術におけるRNA配列決定のためのcDNAライブラリの調製は、バーコードを有しない3'アダプター分子を用いることによって行われる。先行技術において行われたようなcDNAライブラリ調製の場合、バーコードはcDNAライブラリの調製中に後でライゲーションされるだけである。
図7に示されるように、バーコードを含む3'アダプター、例えば、プールされたMDXバーコード付きプレアデニル化3'アダプター) (MDX-4a～c) プールされていないMDXバーコード付きプレアデニル化3'アダプター(MDX-7～MDX-9)を用いたcDNAライブラリと比較した場合に標準的な3'アダプター(サンプルI-1～I-3)を用いて作製されたcDNAライブラリは、予想された読み取りカウントに近い密度推定値(0の位置に点線として示されている)で示されるようにライゲーションバイアスを低減しないが、バーコードを含み、かつ好ましくはプレアデニル化されうる、本発明の方法の状況において用いられる3'アダプターは、予想された読み取りカウントに近い密度推定値(0の位置に点線として示されている)で示されるように、ライゲーションバイアスを低減する。ゆえに、本発明の3'アダプターは、多重RNA配列決定を実施する場合のcDNAライブラリの調製に有利である。この利点を予期することはできなかった。
本発明はさらに、本明細書において記述および提供される方法を実施するためのキットに関する。
好ましくは、キットは、スライドガラス、好ましくは、正に帯電したスライドガラス、フレームスライド、PET膜を有するフレームスライド、または膜を有するスライドガラスを含む。キットがホルムアルデヒドおよび/またはパラフィンをさらに含むことも好ましい。
キットは、好ましくは、EDCもしくはETTならびに/またはヘマトキシリンおよび/もしくはエオシンも含みうる。
キットは、好ましくは、シリコン処理されヌクレアーゼフリーの容器も含みうる。
さらに、キットは、好ましくは、RNAの蛍光インサイチューハイブリダイゼーションのためのプローブ、および/またはRNAからcDNAライブラリを調製するためのバーコードを含む3'アダプター分子をさらに含む。キットによって含まれうるバーコードを含むこれらの3'アダプター分子は、好ましくは、プレアデニル化される。
キットによって含まれることが好ましいRNA FISHのプローブは、好ましくは、HER2、ER、PR、NUPR1、CSF1、GRB7、Ki-67、STK15、サバイビン、サイクリンB1、MYBL2、ER、PR、Bcl2、SCUBE2、ストロメライシン3、カテプシンL2、GSTM1、BAG1、およびCD68に特異的でありうる。
また、キットによってさらに含まれることが好ましいRNA FISHのプローブは、好ましくは、miR-21、miR-29a、miR-221、およびmiR-375に特異的でありうる。
同様に、キットによってさらに含まれることが好ましいRNA FISHのプローブは、好ましくは、U2 snRNAおよび/または7SL scRNAに特異的でありうる。
好ましくは、対照として、キットは、28S rRNA、ポリ(A) RNA、β-アクチン、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRCに特異的なプローブも含みうる。
キットによって含まれうるバーコードを含む3'アダプター分子は、バーコードを含む3'アダプター分子の集合物であることも好ましい。好ましくは、キットによって含まれるバーコードを含む3'アダプター分子は、プールされるか、またはプールされないが、プールされないのが好ましい。
本発明はさらに、そのようなキットの使用に関する。
本発明を特徴付ける態様は、本明細書に記述され、図に示され、実施例に例示され、特許請求の範囲に反映されている。
本明細書において用いられる場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り、複数の参照を含むことに留意されなければならない。したがって、例えば、「1つの試薬(a reagent)」への言及は、1つまたは複数のそのような異なる試薬を含み、「その方法(the method)」への言及は、本明細書において記述される方法を修正または置換できる当業者に公知の等価な段階および方法への言及を含む。
そうでないことが示されない限り、要素の系列の前に置かれる「少なくとも」という用語は、この系列のあらゆる要素に言及していると理解されるべきである。当業者は、慣用的以上の実験を用いずとも、本明細書において記述される本発明の具体的態様の多くの等価物を認識するまたは確認することができるであろう。そのような等価物は、本発明によって包含されることが意図される。
「および/または」という用語は、本明細書のいずれの場所で用いられる場合でも、「および」、「または」、および「この用語によって接続される要素の全てまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
本明細書において用いられる「約」または「およそ」という用語は、示された値または範囲の20%以内、好ましくは10%以内、より好ましくは5%以内、最も好ましくは3%以内を意味する。
本明細書および以下に続く特許請求の範囲の全体を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む(comprise)」という単語、ならびに「含む(comprises)」および「含む(comprising)」のような変化形は、言及されている整数値もしくは段階または整数値もしくは段階の群を含むが、任意のその他の整数値もしくは段階または整数値もしくは段階の群を排除しないことを暗に示すものと理解されよう。本明細書において用いられる場合、「含む(comprising)」という用語は、「含有する(containing)」もしくは「含む(including)」という用語と、または本明細書において用いられる場合に時には「有する(having)」という用語と置き換えることができる。
本明細書において用いられる場合、「からなる」は、特許請求の範囲の要素の中で指定されていない任意の要素、段階、または成分を排除する。本明細書において用いられる場合、「から本質的になる」は、特許請求の範囲の基本かつ新規の特徴に実質的に影響しない材料または段階を排除しない。
そうでないことが具体的に示されない限り、本明細書の各例において、「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」という用語はいずれも、他の2つの用語のいずれかと置き換えられうる。例えば、所与の特徴、化合物、または範囲がそれぞれのより広義の用語「によって含まれる」と示される場合、そのようなより広義の用語はまた、そのような特徴、化合物、または範囲「からなり」うる。
本発明は、本明細書において記述した特定の方法論、プロトコール、および試薬などに限定されず、したがって変化しうることが理解されるべきである。本明細書において用いられる専門用語は、特定の態様を説明することのみを目的としており、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定するものと意図されない。
本明細書の本文全体を通して引用されている全ての刊行物および特許(全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造元の仕様書、説明書などを含む)は、上記であろうと下記であろうと、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本明細書のいかなる事項も、本発明が先行発明のためにそのような開示に先行する権利がないことの承認と解釈されるべきではない。参照により組み入れられる材料が本明細書と矛盾または相反する程度まで、本明細書は任意のそのような材料に優先する。
図は以下を示す。
RNA FISHおよびより短いDNAプローブを用いたFFPE乳がん細胞株の区別。HER2陽性(HCC-1954)およびHER2陰性(MDA-MB231)乳がん細胞株を区別するためにATTO-550に結合させた45 DNA (24～30 nt)、39 DNA (14～21 nt)または53 (11～15 nt) LNA/DNAプローブを使用し、染色および可視化を並行して行った。5つのrRNAプローブをATTO-488に結合させた。40℃で25%ホルムアミドおよび1 M NaClを用いて、プローブをハイブリダイズさせた。HCC-1954細胞株は、DNAプローブのrRNAミスハイブリダイゼーションのため、MDA-MB231と区別することができなかった。しかしながら、LNA/DNAプローブは最終的にHER2+細胞とHER2-細胞とを識別し、これらのプローブが特異的であることを示している。rRNAおよびHER2の曝露時間はそれぞれ80 msおよび200 msであった。スケールバー, 50μm。 インサイチュークリック標識化。例示的なセットアップ。2つの短いフルオロフォア標識隣接プローブをアジドおよびアルキンでタグ付けし、クリックケミストリーによって融合させる。ミスハイブリダイズしたプローブは、ストリンジェントな洗浄の後に、除去される。各約15 nt長のLNA/DNAプローブ(RNAとの二重鎖の)に対しTMを測定する。両方のTMは類似しており、50%ホルムアミド/1 M NaClを含有するリン酸緩衝液中で約50℃であった。 6つのncRNA、ポリ(A) RNAのRNA FISHおよびDAPI核DNA染色。HCC-1954細胞株を用いてRNA FISHを実施した。本発明者らは、それぞれ、ATTO-488、ATTO-532、ATTO-Rho12、ATTO-Rho 14、ATTO-647N、ATTO-680およびATTO-550に結合させた、U2 snRNA、7SL低分子細胞質(sc)RNA、U1 snRNA、mt-RNA、rRNA、U3 snoRNAを標的とする12～17nt長のLNA修飾DNAプローブおよびポリ(A)を標的とするポリ(T)プローブを用いた。Vectra Intelligent Slide Analysis System (PerkinElmer)を用いて、細胞をスキャンした。 サンプル処理の従来の(先行技術の)方法と比較したサンプル処理のMultiplexDX (MDX)方法。本発明の方法は、細胞からの低分子RNA (例えば、マイクロRNA)の拡散を抑止し、高濃度の低分子RNAを確実にする。マウス脳組織切片(10μm)は、直ちに処理され(0秒, ベースライン対照)ホルマリン固定され、瞬時凍結された(FFFF)組織または5、60、180、および600秒後に処理されホルマリン固定され、パラフィン包埋された(FFPE)組織のいずれかよりミクロトームを用いて得られた。MDXパラフィンリボンのみを氷冷水浴に短時間入れ、次に42℃水浴に入れてから、5秒後(MDX法、データポイントを影付きのボックスで囲んだ)または60秒、180秒、および600秒後(他の方法)にスライドガラス上に置いた。従来の(先行技術の)方法に従って処理されたパラフィンリボンは、ミクロトーム切片化から得られた後、氷冷水浴に入れられなかったことに留意されたい。組織を脱パラフィンし、乾燥し、その後にAmbion(登録商標) PureLink(登録商標) miRNA Isolation Kitを用いてマイクロRNAを抽出し、NanoDropを用いてマイクロRNAの濃度を測定した。 RNA分解の影響。室温(25℃)または高温(37℃)のいずれかで0、1、3、6、および12時間のラット肝臓組織のインキュベーション後のポリA mRNA/28S rRNA比率に及ぼすRNA分解の影響。ポリA mRNA/28S rRNAの比率(蛍光活性/ユニット)を用いて、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織中のRNA分解を評価することができ、1未満の比率は分解されたRNAを意味している(おそらく理想的な比率として1.15が点線としてマークされている)。 RNA分解の影響。室温(25℃)または高温(37℃)のいずれかで0、1、3、6、および12時間のラット肝臓組織のインキュベーション後のポリA mRNA発現の平均蛍光強度に及ぼすRNA分解の影響。時点にわたる蛍光強度の低減を示すポリA mRNA発現の共焦点顕微鏡写真。 レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LMD)は、不均質な組織をサンプリングすることによって導入されるバイアスを低減し、RNA蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH, A)とRNA配列決定(B)の間の一致を保証する。A, RNA FISHは、患者A (左パネル)における乳がん生検組織中のHer2増幅を明らかにするが、患者B (右パネル)では明らかにしない。B, Her2+細胞集団(正方形の挿入図に示されている約100個の細胞)のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションとそれに続くRNA配列決定は、RNA FISHによって評価されたHer2発現との高い一致を示している。C, 全組織サンプリングとそれに続くRNA配列決定は、不均質な細胞集団からのサンプリングのため、RNA FISHとの一致度が低いことを実証している。これは、患者AのHer2状態の不正確な診断につながり、その結果、不適切または効果のない処置につながりうる。 バーコード付きプレアデニル化3'-アダプターは、ライゲーション(A)および技術的(B)バイアスを低分子RNA配列決定において低減する。A, 962個のユニークなマイクロRNA配列の等モルプールを含むmiRXplore Universal Referenceを用いて調製された低分子RNA配列決定ライブラリの密度推定を例示するバイオリン図。標準的なコンペティター-I 3'アダプター(サンプルI-1～I-3)、プールされたMDXバーコード付きプレアデニル化3'アダプター(MDX-4a～c)またはプールされていないMDXバーコード付きプレアデニル化3'アダプター(MDX-7～MDX-9)を用いてライブラリを作製した。MDX 3'アダプターは、コンペティターI 3'アダプターと比較して、予想された読み取りカウント(0で点線として示されている)に近い密度推定によって示されるようにライゲーションバイアスを低減する。B, 箱ひげ図は、MDXバーコード付きプレアデニル化3'アダプターをプールすることにより、プールされていないMDXバーコード付きプレアデニル化3'アダプターを用いた場合にmiR-21、miR-29a、miR-221、およびmiR-375において観察される技術的バイアスが低減されることを実証している。プールされたMDXバーコード付きプレアデニル化3'アダプターは左側に示され、プールされていないMDXバーコード付きプレアデニル化3'アダプターは右側に示されていることに留意されたい。
以下の配列が本明細書において提供される。
Figure 2022513333000003
Figure 2022513333000004
Figure 2022513333000005
Figure 2022513333000006
本発明はまた、以下の項目を特徴とする。
1. (a) 対象から得られたサンプル中に疾患関連バイオマーカーのmRNA種および/または少なくとも3種類のmiRNA種が存在するか否かを、多重蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)によって判定する段階; ならびに
(b) 該サンプル中に段階(a)の疾患関連バイオマーカーの該mRNA種および/または疾患関連バイオマーカーの該miRNA種が存在するか否かを、多重配列決定によって判定する段階
を含む、疾患を診断するための方法。
2. 段階(a)が、前記サンプル中に疾患関連バイオマーカーのsnRNA種および/またはscRNA種が存在するか否かを多重FISHによって判定することをさらに含む、項目1の方法。
3. 段階(b)が、前記サンプル中に疾患関連バイオマーカーのsnRNA種および/またはscRNA種が存在するか否かを多重配列決定によって判定することをさらに含む、前記項目のいずれかの方法。
4. 段階(a)および段階(b)における疾患関連バイオマーカーの存在によって前記疾患が示される、前記項目のいずれかの方法。
5. 前記疾患関連バイオマーカーの存在または非存在により疾患の診断を可能にする、前記項目のいずれかの方法。
6. 前記疾患ががんである、前記項目のいずれかの方法。
7. 前記がんが乳がんである、項目6の方法。
8. 前記mRNAが、HER2、ER、PR、NUPR1、CSF1、GRB7、Ki-67、STK15、サバイビン、サイクリンB1、MYBL2、ER、PR、Bcl2、SCUBE2、ストロメライシン3、カテプシンL2、GSTM1、BAG1、およびCD68からなる群より選択される、前記項目のいずれかの方法。
9. 前記miRNAが、miR-21、miR-29a、miR-221、およびmiR-375からなる群より選択される、前記項目のいずれかの方法。
10. 前記snRNAがU2 snRNAである、前記項目のいずれかの方法。
11. 前記scRNAが7SL scRNAである、前記項目のいずれかの方法。
12. 28S rRNA、ポリ(A) RNA、β-アクチン、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRCからなる群より選択されるさらに1つまたは複数のRNAが、対照としてFISHにより判定される、前記項目のいずれかの方法。
13. 前記項目のいずれかの方法を実施するためのキット。
14. 項目1～12のいずれかの方法を実施するための項目13のキットの使用。
本発明は、以下の実施例によってさらに記述されるが、実施例にも実施例の任意の特定の態様にも限定されるものではない。
プローブ設計の試験
RNA FISHプローブの設計を試験して他の市販の設計と比較するために、2つの乳がん細胞株HER2+ (HCT1954)およびHER2- (MDA-MB231)を用いた。ERBB2 mRNAプローブを調製するために、Stellarisプローブ設計プログラム(Biosearch Technologies)を用いた。20 nt長のプローブの代わりに、結合親和性を高めるように45種類の24～30 nt長DNAプローブを設計し、TMを等しくするようにプローブの長さを変化させた(結果として得られるTMは50%ホルムアミド(FA), 1 M NaCl, 50 mMリン酸(pH 7.0)中48.1～56.9℃で変化した)。Stellarisによって示唆されるようにGC含量は50～64%に制限された。その後のRNA FISHでは、rRNAプローブを、シグナル特異性およびRNA含量の内部対照および標準としても使用した。その後、DNAプローブ(24～30 nt長)を5'末端または3'末端のいずれかより短縮して、rRNAのミスハイブリダイゼーション(rRNA配列の相補性を有する8 ntより長くないセグメント)を回避し、39種類の短いDNAプローブ(14～21 nt長)を得た。これらのDNAプローブの融解温度は38.8から47.1℃まで変化した。HER2+とHER2-乳がん細胞との間で小さな識別が観察されたが、rRNAのミスハイブリダイゼーションは依然として優勢であった。ミスハイブリダイゼーションを回避し、プローブの特異性を高めるために、本明細書において記述されるようにRNA FISHプローブの設計を用いて53種類の短い(11～15 nt長)直接標識LNA修飾DNA (LNA/DNA)オリゴヌクレオチドプローブを、最も豊富なRNA (rRNA、tRNA、snRNA、ミトコンドリアrRNAなど)と交差ハイブリダイズする6 nt以内の配列セグメントを有するERBB2 mRNA用に合成した。これらのLNA/DNAプローブの融解温度は44.2から52.1℃まで変化した。これらのLNA/DNAプローブは、特異的であることが最終的に示され、HCC-1954 (HER2+)乳がん細胞とMDA-MB231 (HER2-)乳がん細胞とを区別した(図1参照)。さらに、それら2つのHER2+およびHER2-細胞株の、mRNA FISHからの細胞100個のシグナル強度と、mRNAディープ配列決定からのERRB2転写物のコピー数を比較した場合、mRNA FISHからの差異はmRNA配列決定からの差異49倍と比べて51倍であった。これは、非常に高い特異性が達成されたことを示している。
RNA FISH:
注1: プロテイナーゼK透過処理、4% PFA固定、アセチル化および内因性ビオチンブロッキング段階は省略されうる。
注2: FFFF (ホルムアルデヒド固定され、新鮮凍結された)組織が用いられる場合、解凍および風乾した後に、スライドを1-メチルイミダゾール緩衝液(pH 8.0) 50 ml中25℃で2分間インキュベートし、EDC固定をすぐに開始し、段階14に進行する。
ミクロトーム切片化
1 パラフィンブロックを、サンプルを含む最適な切断面にトリミングした。
2 5μmのスライスをカットした。ナイフホルダにセクションを引き込みする(draw)ためにブラシを用いた。
3 パラフィンリボンまたは切片(スライス)を2番目のウェットブラシで氷冷水浴中に入れた(膨張しえ、シワが消える)。
4 スライドガラスを用いて、浮遊しているパラフィン切片を取り出し、パラフィンリボンを42℃の水浴中に入れて膨張し、シワが消えるまで置き、次に2番目のウェットブラシでパラフィン切片を取り出して切片を置いた。注: 42℃よりも高い温度の水浴を用いると、パラフィンが溶けるため、組織から特に短いRNAの拡散が引き起こされる可能性がある。
5 スライドガラスが完全に乾燥し、組織とスライドガラスの間に閉じ込められた水が蒸発するまで、切片を室温で少なくとも1時間乾燥させた。
6 切片を56℃で1時間ベーキングした。
脱パラフィン
7 スライドをHisto-Clear II 50 ml中で2回、25℃で5分間インキュベートした。
8 スライドを100%エタノール50 ml中25℃で2分間インキュベートした。
9 スライドを95%エタノール50 ml中で2回、25℃で1分間インキュベートした。
10 スライドを70%エタノール50 ml中25℃で1分間インキュベートした。
11 スライドを50%エタノール50 ml中25℃で1分間インキュベートした。
12 スライドを冷たい水道流水下でコプリンジャー中に保持して、すすいだ。
EDC/5-ETTによる組織の固定
注3: 長いRNA (mRNAおよびrRNA)を標的とする場合、EDC固定を省略することができるが、使用する組織が十分に保存されており、高レベルの加水分解RNAが含まれていないことを確実にする必要がある。
注4: 5'リン酸を含むtRNAを標的にする場合、EDC固定が有利であると考えられる。
13 スライドを1-メチルイミダゾール緩衝液(pH 8.0) 50 ml中25℃で2分間インキュベートした。この段階は、残存する1×TBS緩衝液を除去するためであった。
14 使用前に新鮮なEDC/5-ETT溶液を作製した。
15 加湿チャンバ内で、スライドを、表を上にしてスライドラック内に置いた。スライドを傾けて溶液をデカントすることにより、1-メチルイミダゾール緩衝液(pH 8.0)を除去した。加湿チャンバ内で、スライドを、表を上にしてスライドラック内に置いた。
16 EDC/5-ETT溶液500μlを各スライドに加え、サンプルを密閉された加湿チャンバ内にて50℃で3時間インキュベートした。
固定後の洗浄段階
17 サンプルを1×TBS 50 mlで2回、25℃で3分間洗浄した。
プローブおよびRNAのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション
18 スライドを、加湿チャンバ内のスライドラックに組織側を上にして置いた。
19 新たに調製されたハイブリダイゼーション緩衝液500μlを疎水性バリア内の各スライドに加えた。組織を完全に覆った。スライドを、密閉された加湿チャンバ内にて25℃で1時間インキュベートした。
20 スライドを傾けて溶液をデカントすることにより、ハイブリダイゼーション緩衝液を除去した。
プローブの調製およびハイブリダイゼーション
21 所望のプローブを選択し、オーブンを適切なハイブリダイゼーション温度、TMより約20℃低い温度に予熱した。
22 プローブを含有するハイブリダイゼーション溶液500μlを各スライドに加えた。mRNAプローブの濃度: 4 nM、豊富なncRNA: 10 nM、rRNAプローブ: 20 nM。
23 スライドを密閉された加湿チャンバ内にて、ハイブリダイゼーション温度(37～50℃)で6～16時間インキュベートした。
ハイブリダイゼーション後の洗浄
24 サンプルを、洗浄緩衝液1 50 mlを満たしたガラス製コプリンジャー中25℃で5～10分間2回洗浄した。注: ハイブリダイゼーション緩衝液(50% FA)を用いる場合は、洗浄緩衝液1 (50% FA)を用いるが、ハイブリダイゼーション緩衝液(25% FA)を用いる場合は、洗浄緩衝液1 (25% FA)を用いる。
25 サンプルを洗浄緩衝液2 50 ml中25℃で5分間洗浄した。
26 サンプルを1×TBS-T緩衝液50 ml中25℃で3分間すすいだ。
インサイチュークリックケミストリー架橋結合
27 エッペンドルフチューブ(スライド1枚の場合)内で、20 mM CuSO4 63μlおよび50 mMリガンドTHPTA 125μlの溶液を調製した。チューブ内の銅の終濃度は0.25 mMであり、チューブ内のリガンド1の終濃度は1.25 mMであった(リガンド対銅の比率, 5:1)。
28 100 mMアスコルビン酸ナトリウム250μlを加えた。チューブ内のアスコルビン酸ナトリウムの終濃度は5 mMであった。
29 チューブを閉じ、チューブを数回反転させて混合した(より多くの酸素が拡散するのを防ぐため)。
30 新たに調製されたCuSO4/THPTA/アスコルビン酸ナトリウム溶液400μlを各スライドに加えた。
31 スライドを、密閉された加湿チャンバ内にて、光を避けて室温で1～2時間インキュベートした。
32 サンプルを1×TBS-T 50 mlにより25℃で3分間、2回洗浄した。
必要に応じて、ストリンジェンシー洗浄
32a 洗浄緩衝液1 mlを各スライドに加えた。スライドを、密閉された加湿チャンバ内にて40～50℃(または先のハイブリダイゼーション温度よりも0～10℃高い)で5～10分間インキュベートした。注: ハイブリダイゼーション緩衝液(50% FA)を用いる場合は、洗浄緩衝液1 (50% FA)を用いるが、ハイブリダイゼーション緩衝液(25% FA)を用いる場合は、洗浄緩衝液1 (25% FA)を用いる。
32b サンプルを洗浄緩衝液2 50 ml中25℃で5分間洗浄した。
32c サンプルを1×TBS-T緩衝液50 ml中25℃で3分間すすいだ。
顕微鏡検査のためのスライドの封入
33 スライドを、加湿スライドラック内で表を上にして水平に置き、DAPI希釈標準溶液500μlを25℃で10分間各スライドに加えた。
34 スライドを1×TBS 50 ml中25℃で3分間、2回洗浄した。
35 スライドを、加湿スライドラック内で表を上にして水平に置き、2滴の封入溶液を組織切片上に加えた。
36 ガラス製のカバーガラスを組織切片の上に注意深く置いた。
37 カバーガラススライドを10分間風乾した。
38 カバーガラススライドを暗所スライドラック内に貯蔵した。
蛍光スライド画像化
39 スライドスキャン、RNA可視化、RNAバイオマーカー定量化、スペクトル画像化、デミキシング、多重可視化、全スライドスキャン、画像分析などを含むPerkin Elmer Vectra 3.0 Quantitative Pathology Imaging Systemの使用については、取扱説明書:
https://www.perkinelmer.com/Content/LST_Software_Downloads/Vectra-User-Manual-3-0-3.pdfを参照されたい。
レーザーキャプチャーマイクロダイセクション: 組織マイクロダイセクショニングおよびRNA抽出
40 RNA FISHによって先に染色および可視化された5μmの組織切片を、さらなる病理学的再検査のためにヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色した。
41 関心対象の組織部分(領域)を、顕微鏡検査およびRNA FISHとH&E画像の比較によって特定し、画像化ソフトウェアによって丸で囲み、これらのH&Eスライドをその後、Leica LMD7によってレーザーマイクロダイセクションした(https://www.leica-microsystems.com/applications/life-science/laser-microdissection/を参照のこと)。
42 シリコン処理されヌクレアーゼフリーのエッペンドルフチューブ内でのRNA抽出の前に、5～10枚の5μm切片をマイクロダイセクションした。
43 組織乾燥、RNAの損傷および技術的差異を防ぐために、組織マイクロダイセクションと同じ日に、一致した症例対照標本でRNA抽出を実施した。
44 500μlのトリゾール＠試薬を、組織片を含有するエッペンドルフチューブに加え、組織を上下にピペッティングしてホモジナイズし、組織を室温で5分間インキュベートした。
45 クロロホルム200μlを加え、15秒間激しく振とう(ボルテックス)し、サンプルを室温で3分間インキュベートした。
46 Sorvallフレスコ遠心分離機を用いて、サンプルを11,500 rpm (12,568×g)で4℃にて10分間遠心分離した。
47 相の分離後、曇った中間相または下部の着色層を乱すことなく、RNAを含有する透明な上部水相を収集した。水相のpHを酸性(約4)に設定した。
48 水相を移入し、それぞれ、溶解物およそ500μlを含有する、2本の新しいチューブに分けた。
49 氷冷イソプロピルアルコール500μlをチューブの各々に加え、氷上で30分間インキュベートし、サンプルを11,500 rpm (12,568×g)で10分間4℃にて遠心分離した。
50 上清を除去した。次に、チューブを同じ向きで再び遠心分離機に入れ、さらに10秒間回転させ、残存する液体を収集した。小さなペレットの場合、ペレットの洗浄は必要なかった。
51 より大きなペレットの場合、氷冷75% EtOH溶液500μlを加え、ペレットを乱さずにチューブを1回反転させ、遠心分離して11,500 rpm (12,568×g)で10分間4℃にて液体を収集し、液体を除去し、再び遠心分離して残留液を除去した。
52 上清を完全に除去した(すなわち、さらに10秒の回転を用いる)。RNAサンプルをミリポア水100μlに再溶解し、容量を再結合した。
53 Bioanalyzer (Agilent, Danbury, CT, USA)の全RNAチップでRNAを定量化した。
RNA配列決定:
54 マイクロダイセクションした組織(1～2μg)から抽出されたRNAのRNA配列決定は、Illumina TrueSeq cDNAライブラリ調製プロトコール: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/samplepreps_truseq/truseqrna/truseq-rna-sample-prep-v2-guide-15026495-f.pdfを用いて実施された。

Claims (47)

  1. (a) 対象から得られたサンプル中に疾患関連バイオマーカーのmRNA種および/または少なくとも1種類のmiRNA種が存在するか否かを、多重蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)によって判定する段階; ならびに
    (b) 該サンプル中に段階(a)における疾患関連バイオマーカーの該mRNA種および/または疾患関連バイオマーカーの該miRNA種が存在するか否かを、多重配列決定によって判定する段階
    を含む、疾患を診断するための方法であって、
    疾患関連バイオマーカーの該mRNA種および/または少なくとも1種類のmiRNA種が存在すると段階(a)において判定された該サンプルのその部分を、段階(b)を実施する前にレーザーキャプチャリングに供する、該方法。
  2. 段階(a)が、前記サンプル中に疾患関連バイオマーカーのsnRNA種および/またはscRNA種が存在するか否かを多重FISHによって判定することをさらに含む、請求項1記載の方法。
  3. 段階(b)が、前記サンプル中に疾患関連バイオマーカーのsnRNA種および/またはscRNA種が存在するか否かを多重配列決定によって判定することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  4. 段階(a)および段階(b)における疾患関連バイオマーカーの存在によって前記疾患が示される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  5. 前記疾患関連バイオマーカーの存在または非存在により疾患の診断を可能にする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  6. 前記疾患ががんである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  7. 前記がんが乳がんである、請求項6記載の方法。
  8. 前記mRNAが、HER2、ER、PR、NUPR1、CSF1、GRB7、Ki-67、STK15、サバイビン、サイクリンB1、MYBL2、ER、PR、Bcl2、SCUBE2、ストロメライシン3、カテプシンL2、GSTM1、BAG1、およびCD68からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  9. 前記miRNAが、miR-21、miR-29a、miR-221、およびmiR-375からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  10. 前記snRNAがU2 snRNAである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  11. 前記scRNAが7SL scRNAである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  12. 28S rRNA、ポリ(A) RNA、β-アクチン、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRCからなる群より選択されるさらに1つまたは複数のRNAが、対照としてFISHにより判定される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  13. 前記レーザーキャプチャリングがレーザーキャプチャーマイクロダイセクションである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  14. 前記サンプルが組織切片サンプルである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  15. 前記サンプルがホルムアルデヒド固定されている、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  16. 前記サンプルがパラフィン包埋されている、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  17. 前記サンプルがパラフィン包埋サンプルのミクロトーム切片化によって得られる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  18. ミクロトーム切片化によって得られた前記サンプルが、取得後に25℃～0℃の温度でインキュベートされる、請求項17記載の方法。
  19. 前記パラフィン包埋サンプルが段階(a)の前に脱パラフィンされる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  20. 前記サンプルが段階(a)の前に固定される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  21. 前記サンプルが、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)または5-エチルチオ-1H-テトラゾール(ETT)を用いる処理によって固定される、請求項20記載の方法。
  22. 多重FISHが実施される場合に蛍光シグナルが顕微鏡検査によって検出される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  23. RNAの蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)のために、クリックケミストリーによって結合されているプローブが用いられる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  24. RNAのFISHが実施された後に前記サンプルがヘマトキシリンおよびエオシンで染色される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  25. RNAの多重配列決定が実施される場合にRNAが前記サンプルから抽出される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  26. 前記方法の段階(a)および/または段階(b)を実施する前に、前記サンプルがポリA mRNAと28S rRNAの比率についてチェックされる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  27. 前記方法の段階(a)および/または段階(b)を実施する前に、ポリA mRNAと28S rRNAの比率が1:1であるまたは1:1より大きいかどうか、好ましくは1.05 : 1、1.1 : 1、1.15 : 1、1,2 : 1であるかどうか前記サンプルがチェックされる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  28. RNAの多重配列決定のために、バーコードを含む3'アダプター分子を用いることによってcDNAライブラリが調製される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  29. バーコードを含む前記3'アダプター分子がプレアデニル化されている(preadenylated)、請求項28記載の方法。
  30. バーコードを含む前記3'アダプター分子が集合物である、請求項28または29記載の方法。
  31. バーコードを含む前記3'アダプター分子がプールされている、請求項28～30のいずれか一項記載の方法。
  32. 前記請求項のいずれか一項記載の方法を実施するためのキット。
  33. スライドガラス、好ましくは、正に帯電したスライドガラス、フレームスライド、PET膜を有するフレームスライド、または膜を有するスライドガラスを含む、請求項32記載のキット。
  34. ホルムアルデヒドおよび/またはパラフィンを含む、請求項32または33記載のキット。
  35. RNAの蛍光インサイチューハイブリダイゼーションのためのプローブ、および/またはRNAからcDNAライブラリを調製するためのバーコードを含む3'アダプター分子を含む、請求項32～34のいずれか一項記載のキット。
  36. バーコードを含む前記3'アダプター分子がプレアデニル化されている、請求項35記載のキット。
  37. バーコードを含む前記3'アダプター分子が集合物である、請求項35または36記載のキット。
  38. バーコードを含む前記3'アダプター分子がプールされていない、請求項35～37のいずれか一項記載のキット。
  39. EDCまたはETTを含む、請求項32～38のいずれか一項記載のキット。
  40. ヘマトキシリンおよび/またはエオシンを含む、請求項32～39のいずれか一項記載のキット。
  41. RNAのFISHのための前記プローブが、HER2、ER、PR、NUPR1、CSF1、GRB7、Ki-67、STK15、サバイビン、サイクリンB1、MYBL2、ER、PR、Bcl2、SCUBE2、ストロメライシン3、カテプシンL2、GSTM1、BAG1、およびCD68に特異的である、請求項35～40のいずれか一項記載のキット。
  42. RNAのFISHのための前記プローブが、miR-21、miR-29a、miR-221、およびmiR-375に特異的である、請求項35～41のいずれか一項記載のキット。
  43. RNAのFISHのための前記プローブがU2 snRNAに特異的である、請求項35～42のいずれか一項記載のキット。
  44. RNAのFISHのための前記プローブが7SL scRNAに特異的である、請求項35～43のいずれか一項記載のキット。
  45. RNAのFISHのための前記プローブが対照として28S rRNA、ポリ(A) RNA、β-アクチン、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRCに特異的である、請求項35～44のいずれか一項記載のキット。
  46. シリコン処理されヌクレアーゼフリーの容器を含む、請求項32～45のいずれか一項記載のキット。
  47. 請求項1～31のいずれか一項記載の方法を実施するための請求項32～46のいずれか一項記載のキットの使用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014530612A (ja) * 2011-10-14 2014-11-20 ジ・オハイオ・ステート・ユニバーシティ 卵巣がんに関する方法および材料
KR20160147091A (ko) * 2015-06-11 2016-12-22 사회복지법인 삼성생명공익재단 위암 진단방법 및 이를 이용한 위암 진단키트

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4711955A (en) 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
CA1223831A (en) 1982-06-23 1987-07-07 Dean Engelhardt Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US20060068434A1 (en) * 2004-09-21 2006-03-30 Jay Stoerker Methods and compositions for detecting cancer using components of the U2 spliceosomal particle
US8394588B2 (en) 2009-03-11 2013-03-12 The Rockefeller University Methods to fix and detect nucleic acids
WO2013016712A2 (en) 2011-07-27 2013-01-31 The Rockefeller University Methods for fixing and detecting rna
CN103114128A (zh) * 2012-09-27 2013-05-22 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 一种新型高分辨定量多色荧光原位杂交方法及其应用
WO2015091892A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 Comprehensive Biomarker Center Gmbh Mirnas as non-invasive biomarkers for parkinson's disease
CA3008273A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 Clear Gene, Inc. Methods, compositions, kits and devices for rapid analysis of biological markers
CN106995837A (zh) * 2016-01-22 2017-08-01 益善生物技术股份有限公司 乳腺癌早期诊断试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014530612A (ja) * 2011-10-14 2014-11-20 ジ・オハイオ・ステート・ユニバーシティ 卵巣がんに関する方法および材料
KR20160147091A (ko) * 2015-06-11 2016-12-22 사회복지법인 삼성생명공익재단 위암 진단방법 및 이를 이용한 위암 진단키트

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CANCER SCIENCE, vol. 2015年2月12日，Vol. 106，No. 3, JPN6023036578, pages 307 - 314, ISSN: 0005146050 *
EXPERIMENTAL AND MOLECULAR PATHOLOGY, vol. 2006年4月，Vol. 80，No. 2, JPN6023036577, pages 183 - 191, ISSN: 0005146051 *

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