JP2022513125A - インターロイキン21タンパク質(il21)変異体およびその適用 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)IL21変異体またはIL21/4変異体である機能性断片1と、
(2)モノクローナル抗体機能を有する機能性断片2と、
異なる機能性断片を連結する連結ドメインと、
を含むことを特徴とする。
PCRおよびDNA消化生成物を、AxyPrep DNAゲル抽出キット(AXYGEN)によって抽出した。Transgen Plasmid Mini Kit(Transgen、China)によって、少量のプラスミドを抽出および精製した。QIAGEN Plasmid Midi Kitにより中量のプラスミドを抽出および精製した。Tiangen EndoFree Maxiプラスミドキットにより大量のプラスミドを抽出および精製した。具体的な手順は、指示に従って行った。
CHO/dhFr-(ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞):前記細胞を、5%のCO2恒温器中、37℃で、10%のウシ血清(Hyclone)、100U/mLの二重抗体、0.1mmol/lのヒポキサンチンおよび0.016mmol/lのチミンを含むIMDM培地を使用して培養した。
CHO細胞のトランスフェクション
細胞調製:前記細胞を、トランスフェクションの1日前にウェルあたり200,000細胞の量で6ウェルプレートに播種し、トランスフェクションの時点で、80%コンフルエンスに達し、均一に分布され、十分に増殖されるようにした。
細胞調製:トランスフェクションの1日前に6×105-7×105細胞/mlを播種し、トランスフェクション時の細胞濃度を1×106細胞/mlとした。
(1)真核細胞の発現および精製
標的遺伝子を含むプラスミドを293F細胞にトランスフェクトした後、前記細胞をシェーカー内で96時間連続的に培養し、その後200gで3分間遠心分離して細胞沈殿物を除去した。上清培地を回収し、10000gで15分間遠心分離して培養液中の不純物を除去し、0.45μmフィルター膜でろ過し、30kdの濃縮管中で4℃、3800rmpで遠心分離し、体積の20倍に濃縮した。
硫酸ニッケル(NiSO4)を充填したSepharose high performance(Amersham Bioscience)クロマトグラフィーカラムを使用した。5mmol/l、30mmol/l、60mmol/l、90mmol/l、120mmol/l、および250mmol/lのイミダゾールを含有する緩衝液をそれぞれ調製した。前記緩衝液中の他の成分は、20mmol/lのTris-HCL、500mmol/lのNaClおよび10%のグリセロールであった。
試料充填:標的タンパク質を含有する上清を前記ニッケルカラムに滴下し、これを2~3回繰り返した。
Protein A SefinoseTM-5ml(プレパックグラヴィティーカラム)クロマトグラフィーカラムを使用した。
結合緩衝液:0.1mol/l Na3PO4、0.15mol/l NaCl、pH7.2
溶出緩衝液:0.1mol/l クエン酸、pH2.7
中和緩衝液:1mol/l Tris-HCl、pH9.0
洗浄および平衡化:まず、前記クロマトグラフィーカラムを50mlのddH2Oで洗浄した後、50mlの溶出緩衝液で洗浄し、その後、50mlの結合緩衝液で平衡化した。
タンパク質の融解温度(Tm)の決定原理:タンパク質の温度が周囲温度と共に上昇し、融解温度(Tm)に達すると、タンパク質の立体構造が破壊され、疎水性コアを開く。染料は、疎水性領域と結合して、検出可能な蛍光を発することができる。
キメラIL21/4を安定的に発現可能なCHO細胞株の確立
(1)IL21を鋳型として用いてプライマーを設計し、IL21/4断片をオーバーラップPCRにより取得した。
(2)前記IL21/4断片を、オーバーラップPCRにより、リンカーを介してハーセプチン重鎖HCのN末端に連結し、その後、sp-IL21/4-リンカー-ハーセプチンHC断片を、本発明者らの研究室において構築された抗体ディスプレイプラスミドpFRTの重鎖部分に置換し、pFRT-ハーセプチン LC-IRES-IL21/4-リンカー-ハーセプチン HC-TM-Loxpプラスミドを構築した。プラスミドは、CHO細胞の表面上に変異体IL21/4を安定的にディスプレイすることができた。
(1)データベースを照会し、IL21受容体IL21Rα鎖の細胞外ドメインを合成し、その後、GFPを鋳型として用いたPCRによってGFP断片を増幅するようにプライマーを設計した。
(2)IL21Rα鎖の細胞外ドメインを、オーバーラップPCRによりリンカーを介してGFPのN末端に連結し、その後、sp-IL21Rα鎖の細胞外ドメインリンカー-GFP断片をpCEP4に連結し、IL21Rα-リンカー-GFP融合タンパク質を分泌・発現可能なプラスミドを構築した。
データベースを照会して、IL21受容体γc鎖の細胞外ドメインを合成し、その後、再度、mRFPを鋳型として用いたPCRによってmRFP断片を増幅するようにプライマーを設計した。γc鎖の細胞外ドメインを、オーバーラップPCRによりリンカーを介してmRFPのN末端に再度連結し、その後、sp-γc鎖の細胞外ドメインリンカーmRFP断片をpCEP4に再度連結して、γcリンカー-GFP融合タンパク質を分泌・発現可能なプラスミドを構築した。
(2)IL21の種々の変異体を安定的にディスプレイ可能なプラスミドの構築:IL21の別の変異体をCHO細胞表面に安定的にディスプレイするために、点変異PCR法を用いてプラスミドを構築した。pFRT-ハーセプチン LC-IRES-IL21/4-リンカー-ハーセプチン HC-TM-Loxpプラスミドを鋳型として使用してプライマーを設計し、IL21の異なる変異体を安定してディスプレイ可能なプラスミドを構築した。
(3)IL21変異タンパク質を分泌・発現可能なプラスミドの構築:種々のIL21変異体をディスプレイ可能なプラスミドを鋳型としてプライマーを設計し、PCR法によりIL21変異断片を増幅した後、pCEP4に連結し、IL21変異タンパク質を分泌・発現可能なプラスミドを構築した。
タンパク質設計により異なる部位にジスルフィド結合を導入することによるIL21/4の安定性に関する研究
(1)16位のILE、および70位のSERの両方をCYSに変異させ、16-70ジスルフィド結合を導入し、16clL21/4と命名した。
(2)17位のILE、および106位のSERの両方をCYSに変異させ、17-106ジスルフィド結合を導入し、17clL21/4と命名した。
(2)16位のILE、70位のSER、17位のVAL、および106位のLYSをすべてCYSに変異させ、2つのジスルフィド結合群を同時に導入し、4clL21/4と命名した。
FRT-IL21/4-ハーセプチンを鋳型として、IL21/4変異体の各々を安定的にディスプレイ可能なCHO細胞株を取得するために、まず、IL21/4変異体の各々の組換置換プラスミドを、点突然変異法により取得し、16cIL21/4-ハーセプチン、17cIL21/4-ハーセプチンおよび4cIL21/4-ハーセプチンと命名した。CHOワーキングセルに、再度、上記のプラスミド、および事前に構築したpci-2Aプラスミドを同時トランスフェクトし、組換えおよび置換の成功後に濃縮した。ディスプレイ率は、標識抗体であるマウス抗ヒトIgG-APC抗体への結合によって検出した。
IL21/4変異体の各々の予備的安定性試験
(1)細胞膜の表面にIL21変異体を安定的にディスプレイするCHO細胞を、0.02%のEDTA-PBSで消化し、血清を含む培養液で溶出し、830gで3分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を回収した。
(2)前記細胞を、4℃で予め冷却した1mlの無血清Opti-MEM培地に再懸濁し、830gで3分間遠心分離した。上清を捨て、前記細胞を回収した。その後、前記細胞を、再び4℃で予冷した無血清のOpti-MEM培地中に、約5×106細胞/50μlまで再懸濁した。
(3)前記細胞懸濁液をPCRチューブに添加し、PCR装置によって設定された温度勾配で加熱した。前記PCRチューブを、予め設定した温度で0.5時間加熱した。前記PCRチューブを4℃で15分間保持した後、取り出した。
(4)IL21受容体の細胞外ドメインを特定の割合で添加し、蛍光タンパク質融合タンパク質と完全に混合した。前記混合物を、光を避けて4℃で1時間シェーカーに保持した。
(5)前記混合物を830gで3分間遠心分離し、上清を廃棄した。4℃で予冷した新たなOpti-MEMを添加し、遠心分離し上清を捨てることにより沈殿物を2回洗浄した。次に、沈殿物を、4℃で予冷した200μlのOPTI-MEMで再懸濁した。標識細胞を、FACS Aria III(BD)またはFACS Caliburによって検出または選別した。
(1)4℃では、ネガティブコントロール群を除き、全ての群がIL21受容体IL21Rαの細胞外ドメインに結合した。変異16cIL21/4-ハーセプチンのディスプレイ率は20%であり、最も高い結合率であった。
(2)49℃で加熱した後、IL21/4-ハーセプチン群および4cIL21/4-ハーセプチン群のIL21受容体の細胞外ドメインへの結合は実質的に失われたが、変異16cIL21/4-ハーセプチン群のIL21受容体の細胞外ドメインへの結合は依然として検出可能であった。このことは、変異16cIL21/4の熱安定性が向上していることを予備的に示唆しているといえる。
野生型IL21変異体の構築と予備的安定性試験
野生型IL21分子の安定性に及ぼす、同じ位置(16位および70位)でのジスルフィド結合の導入の効果を検討するために、2つの他の構造を構築した。
IL21-ハーセプチン:野生型IL21とハーセプチンの融合タンパク質
16cIL21-ハーセプチン:IL21とハーセプチンによって構築された融合タンパク質であって、同じ位置(16位のILE、70位のSER)がCYSに変異し、ジスルフィド結合を導入されている
IL21とその変異タンパク質を取得するために、まず、プラスミドを構築した。IL21および変異コード遺伝子を、それぞれ、Hisタグを付加したPCEP4ベクタープラスミドに挿入した。IL21、16cIL21および16cIL21/4変異タンパク質を発現する3つのプラスミドをそれぞれ構築した(図7)。
理論上ジスルフィド結合を生成する2つのセグメントのアミノ酸配列は、IINVCIKおよびQLIDCVDQLKであった。酵素分解を還元状態で行った場合、ジスルフィド結合が切断され、Cがアルキル化される(分子量が57Da増加する)。2つのペプチドセグメントの質量電荷比の理論値は、それぞれ859.507および1231.635であった。図9Aに示すように、還元状態(DTTを有する)では859.587および1231.769に明らかなシグナルピークが存在したが、2つのシグナルピークは非還元状態では非常に低かった。この結果によると、DTTを添加すると、ジスルフィド結合が切断され、2つのペプチドセグメントが16cIL21/4試料タンパク質において生成されたことが示唆された。DTTを添加しないと、ジスルフィド結合は切断されず、2つのペプチドセグメントのシグナルは存在しなかった。これは、理論的予測のジスルフィド結合構造と一致した。
16cIL21/4タンパク質の16位と70位とのcys間のジスルフィド結合の形成を確認した後、IL21、16cIL21および16cIL21/4の3つのタンパク質の融解温度(Tm)を測定し、IL21と各変異タンパク質の熱安定性を決定した。結果を図10に示す。
種々のIL21変異体の生物学的活性の判定
1.KOB細胞の増殖を刺激する能力
熱安定性が向上しても、IL21、16clL21、および16clL21/4の3つのタンパク質の生物活性が維持されているかどうかを検出した。KOB細胞は、IL21受容体を発現し、IL21によって刺激されて増殖することができる。種々のIL21変異体の生物学的活性は、KOB細胞の増殖を刺激する能力によって決定することができる。具体的なプロセスは、以下の通りであった。
(1)KOB細胞の調製:KOB細胞を、5%のCO2恒温器中、37℃で、10%ウシ血清(Hyclone)および100U/mLの二重抗体を含むRPMI1640培地中で培養した。
(2)IL21および変異タンパク質の調製:IL21とHis tag付き変異タンパク質の発現プラスミドを構築し、293F細胞にトランスフェクトした。培養、発現、およびニッケルカラムによる精製の工程は、従来通りに行った。タンパク質濃度は、BCAアッセイによって決定した。
(3)生物学的活性の判定:KOB細胞を、2×104細胞/ウェルになるように96ウェルプレートに播種し、200μlの培養液、およびIL21または変異タンパク質を各ウェル添加した。IL21または変異タンパク質の勾配濃度を、0.1ng/ml、1ng/ml、および10ng/mlに設定した。前記細胞を37℃で5%のCO2恒温器中で培養し、96時間後に計数した。
繰り返しのない二元配置分散分析の結果によると、コントロール群と各タンパク質群のp値は0.05未満(p<0.05)であり、群の間に有意な差が認められた。3つのタンパク質群の間のp値は0.05以上(P>0.05)であり、3つのタンパク質群の間に有意な差は認められなかった。異なる濃度の3つのタンパク質の群の間のp値は、0.05を超え(P>0.05)、異なる濃度の3つのタンパク質の群の間に有意な差は認められなかった。
IL21の安定性の向上により動物における血漿半減期を増加できるかどうかを判定するために、IL21-ハーセプチン融合タンパク質、変異16cIL21-ハーセプチン融合タンパク質、および16cIL21/4-ハーセプチン融合タンパク質を選択し、マウスにおけるそれらの血漿半減期を検出する比較試験を行った。ハーセプチン群をコントロール群とした。結果を表4に示す:
16cIL21/4-ハーセプチン融合タンパク質の機能活性を、BT474乳癌担癌マウスモデルを用いて検出した。1.5×107ヒトBT474乳癌細胞をマウスの右腹部または背部に接種した。前記融合タンパク質を35日後に投与した。マウスにおける16cIL21/4-ハーセプチン融合タンパク質とハーセプチンの刺激によるCD8+T細胞の増殖を検出した。結果を図12に示す。16cl21/4-ハーセプチン融合タンパク質群では、腫瘍接種後約53日目に末梢血中のCD8+T細胞の割合が明らかな増加を示した。一方、ハーセプチン群のT細胞は緩やかに減少する傾向を示した。
16cIL21/4-ハーセプチン融合タンパク質の腫瘍抑制効果を、BT474乳癌担癌マウスモデルを用いて検出した。それぞれのマウスに1×107のBT474細胞(ヒト乳癌細胞)を接種した。マウスに、PBS(コントロール)、ハーセプチン(ハーセプチン単独)、16clL21/4-ハーセプチン融合タンパク質(IL-21mutant-ハーセプチン)および16clL21/4とハーセプチンの混合液(IL-21mutant+ハーセプチン)を4日に1回腹腔内注射した。各注射の用量は500μgであった。結果を図13に示す。コントロール群、ハーセプチン群、および混合溶液群と比較して、16clL21/4-ハーセプチン融合タンパク質群は腫瘍体積を有意に減少させた。
Claims (7)
- (1)野生型IL21のアミノ酸配列の16位のILEおよび70位のSERの両者が、それぞれ、CYSに変異され、前記2つの変異CYSの間にジスルフィド結合が形成され、前記野生型IL21のアミノ酸配列が配列番号1に示される、または
(2)野生型IL21のアミノ酸配列の16位のILE、17位のVAL、70位のSER、および112位のLYSの全てが、それぞれ、CYSに変異され、16位と70位との間、および17位と112位との間にジスルフィド結合の2つのグループが形成され、前記野生型IL21のアミノ酸配列が配列番号1に示される、
ことを特徴とする、インターロイキン-21(IL21)変異体。 - (1)インターロイキン-21およびインターロイキン-4キメラ(IL21/4)のアミノ酸配列の16位のILEおよび70位のSERの両者が、それぞれ、CYSに変異され、前記2つの変異CYSの間にジスルフィド結合が形成され、または
(2)インターロイキン-21およびインターロイキン-4キメラ(IL21/4)のアミノ酸配列の16位のILE、17位のVAL、70位のSER、および106位のLYSの全てが、それぞれ、CYSに変異され、16位と70位との間、および17位と106位との間にジスルフィド結合の2つのグループが形成され、
前記インターロイキン-21およびインターロイキン-4キメラタンパク質(IL21/4)のアミノ酸配列が配列番号2に示される、
ことを特徴とする、インターロイキン-21およびインターロイキン-4キメラタンパク質(IL21/4)変異体。 - 請求項1記載のIL21変異体または請求項2記載のIL21/4変異体をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド配列。
- 請求項1記載のIL21変異体または請求項2記載のIL21/4変異体を含む融合タンパク質であって、
(1)前記IL21変異体または前記IL21/4変異体である機能性断片1と、
(2)モノクローナル抗体機能を有する機能性断片2と、
異なる前記機能性断片を連結する連結ドメインと、
を含むことを特徴とする、融合タンパク質。 - 請求項1記載のIL21変異体、請求項2記載のIL21/4変異体または請求項4記載の融合タンパク質の、免疫調整または免疫活性化に用いるための医薬であるか、または抗腫瘍に用いるための医薬の製造における使用。
- 請求項1記載のIL21変異体、請求項2記載のIL21/4変異体または請求項4記載の融合タンパク質の、B細胞の分化および増殖、T細胞の分化および増殖、またはNK細胞の分化および増殖の促進に用いるための剤の製造における使用。
- 請求項1記載のIL21変異体、請求項2記載のIL21/4変異体または請求項4記載の融合タンパク質を有効成分とする医薬または医薬組成物であって、
治療有効量の前記IL21変異体、前記IL21/4変異体または前記融合タンパク質と、
必要な医薬賦形剤と、
を含む医薬または医薬組成物。
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