JP2022512986A - 間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用バイオマーカーおよびその用途 - Google Patents
間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用バイオマーカーおよびその用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022512986A JP2022512986A JP2021525205A JP2021525205A JP2022512986A JP 2022512986 A JP2022512986 A JP 2022512986A JP 2021525205 A JP2021525205 A JP 2021525205A JP 2021525205 A JP2021525205 A JP 2021525205A JP 2022512986 A JP2022512986 A JP 2022512986A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- proliferation
- stem cells
- mesenchymal stem
- hmsc
- biomarker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
- C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
- C12Y111/01015—Peroxiredoxin (1.11.1.15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01042—Chlorogenate hydrolase (3.1.1.42)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/71—Oxidoreductases (EC 1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y115/00—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15)
- C12Y115/01—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15) with NAD or NADP as acceptor (1.15.1)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、ペルオキシレドキシン(peroxiredoxin)6を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用バイオマーカーを提供する。前記ペルオキシレドキシン(peroxiredoxin)6は、間葉系幹細胞のインテグリンβ3を調節することができる。前記ペルオキシレドキシン(peroxiredoxin)6が過発現する場合、細胞増殖および移動能力が増加することができ、ペルオキシレドキシン(peroxiredoxin)6が低発現する場合、細胞増殖および移動能力が減少することができる。
本発明は、前記バイオマーカーの発現水準を測定する製剤を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用組成物を提供する。
本発明は、前記組成物を含む間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用キットを提供する。前記キットは、RT-PCRキット、競争的RP-PCRキット、リアルタイムRT-PCRキット、定量的RT-PCRキットまたはDNAチップキットでありうる。
本発明は、対象の生物学的試料から前記バイオマーカーの発現水準を測定した後、比較対照群試料の当該バイオマーカーの発現水準と比較する段階を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測のための情報提供方法を提供する。
本発明は、ペルオキシレドキシン(peroxiredoxin)6の発現量を測定して、細胞増殖および移動能力に優れた間葉系幹細胞をスクリーニングする方法を提供する。ペルオキシレドキシン(peroxiredoxin)6が過発現する場合、間葉系幹細胞の増殖、移動、付着能力が増加し、ペルオキシレドキシン(peroxiredoxin)6が低発現する場合は、間葉系幹細胞の増殖、移動、付着能力が減少する。
(材料)
Female MRL/MpJ-Faslpr/J(以下、MRL/lprと命名する)マウスは、米国Jackson Laboratoryから購入した。マウスの飼育環境は、温度21~24℃、湿度40~60%、明暗周期は12時間(点灯:08時、消灯:20時)であり、SPF(specific pathogen-free)状態を維持した。固形飼料と飲水は滅菌して自由給餌させ、すべての実験動物は、1週間動物室で適応させた後、実験に使用した。
IFN-γの測定は、R&D(#DY285-05)で提供された試験方法によって進めた。ELISA用96 wellに捕捉抗体(capture antibody)とコーティングバッファー(coating buffer)を1:250の割合で希釈して4℃で18時間コーティングした。200μlの洗浄溶液(wash solution)を利用して2回洗浄し、ブロッキングバッファー(blocking buffer)250μlをウェル(well)に入れた後、室温で2時間反応させた。その後、200μlの洗浄溶液(wash solution)を利用して2回洗浄し、試料をアッセイバッファー(assay buffer)(1X)に希釈してサンプルを準備した。各ウェル(well)にアッセイバッファー(1x)90μl、検出抗体(detection-antibody)50μlおよびスタンダード(standard)またはサンプル(sample)10μlを入れて室温で3時間反応させた。反応が終わると、洗浄溶液(wash solution)を利用して洗浄した。基質溶液(Substrate solution)100μlを各wellに入れた後、5分間反応させ、停止液(stop solution)100μlを入れて反応を中止させた。最後に450nm~570nmで値を測定した。
細胞(Cell)が70~80%のコンフルエンス(confluency)となった時点でTrypsin-EDTA(Gibco)0.125%で処理した後、5%CO2、37℃の条件下に培養した。物質処理24時間後、細胞を回収して、TRIZOL reagent(Invitrogen,MD,USA)を利用してtotal RNAをcellから分離し、260nmで吸光度の測定を通じてトータルRNA(total RNA)を定量した。
細胞溶解バッファー(Cell lysis buffer;Cell signaling technology,Danvers,MA,USA)を利用して細胞をiceに載置した状態で溶解した。4℃で12000rpmで15分間遠心分離してタンパク質を得た。ブラッドフォード(Bradford)試薬を利用してタンパク質を定量して20μgのタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル(polyacrylamide gel)を利用して75Vで電気泳動を実施した。SDS-ポリアクリルアミドゲル(polyacrylamide gel)を95Vで90分間PVDFメンブレン(membrane)に移した後、0.5%ツイン(Tween)20が含まれたTBS(TTBS)に5% nonfat dry milkを添加して1時間ブロッキング(blocking)した。ブロッキング(blocking)後、1次抗体が含まれた5%BSA/TTBSにメンブレンを入れ、4℃で1日間シェイキング(shaking)した。翌日、TTBSでメンブレンを洗浄した後、2次抗体が入っている5%BSA/TTBSにメンブレンを入れて、常温で90分間2次抗体を付着した。TTBSでメンブレンを洗浄し、ECL(Enhanced Chemiluminescence,Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ,USA)とmembraneを反応させた後、Chemi Doc XRS+machine(Bio-Rad,CA,USA)を利用してタンパク質発現程度を測定した。
トータル(total)RNA 0.3μgの濃度を利用し、42℃で1時間、95℃で5分間合成した。合成されたcDNA 3μlとprimer 10pMを利用してポリメラーゼ連鎖反応を行った。この反応の基本過程は、pre-denaturing phase、94℃、5分を行い、denaturing phase、94℃で30秒、annealing phase、56℃で30秒、elongation phase、72℃で1分を行い、post-elongation phaseを72℃で5分の条件で実施した。1%アガロースゲル(agarose gel)を作って電気泳動を実施した。
PRDX6、COX-2、iNOS、IDO、TGF-β、CCL2、CCL4、CCL5、CXCL10、CXCL12に対するmRNAの発現水準をquantitative real-time PCR(qPCR)を通じて分析した。各サンプルの相対的なmRNA量は、ハウスキーピング遺伝子(housekeeping gene)であるβ-actinのCt(threshold cycle)と比較した臨界周期(threshold cycle,Ct)を基準として計算された。
使用されたプライマー情報は、次の通りである。CCL2 forward primer 5’-ATG AAA GTC TCT GCC GCC CTT CTG T-3’、CCL2 reverse primer 5’-AGT CTT CGG AGT TTG GGT TTG CTT G-3’、CCL3 forward primer 5’-ATG CAG GTC TCC ACT GCT GCC CTT-3’、CCL3 reverse primer 5’-GCA CTC AGC TCC AGG TCG CTG ACA T-3’、CCL4 forward primer 5’-CCA AAC CAA AAG AAG CAA GC-3’、CCL4 reverse primer 5’-AGA AAC AGT GAC AGT GGA CC-3’、CCL5 forward primer 5’-GAG TAT TTC TAC ACC AGT GGC AAG-3’、CCL5 reverse primer 5’-TCC CGA ACC CAT TTC TTC TCT-3’、CXCL10 forward primer 5’-CCT GCT TCA AAT ATT TCC CT-3’、CXCL10 reverse primer 5’-CCT TCC TGT ATG TGT TTG GA-3’、CXCL12 forward primer 5’-ATG AAC GCC AAG GTC GTG GTC G-3’、CXCL12 reverse primer 5’-TGT TGT TGT TCT TCA GCC G-3’、PRDX6 forward primer 5’-GTC GCC ATG CCC GGA GGT CTG CTT C-3’、PRDX6 reverse primer 5’-AAT TGG CAG CTG ACA TCC TCT GGC TC-3’、COX-2 forward primer 5’-TCC TTG CTG TTC CCA CCC AT-3’、COX-2 reverse primer 5’-CAT CAT CAG ACC AGG CAC CA-3’、iNOS forward primer 5’-ACG TGC GTT ACT CCA CCA AC-3’、iNOS reverse primer 5’-CAT AGC GGA TGA GCT GAG CA-3’、IDO forward primer 5’-AGCC TGA TCT CAT AGA GTC TG-3’、IDO reverse primer 5’-TTA CTG CAG TCT CCA TCA CG-3’、TGF-β forward primer 5’-CAG ATC CTG TCC AAG CTG-3’、TGF-β reverse primer 5’-TCG GAG CTC TGA TGT GTT-3’、β-actin forward primer 5’-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3’、β-actin reverse primer 5’-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GA-3’。
冷たいPBSで2回細胞を洗浄(wash)した後にバインディングバッファー(Binding buffer)に1×106 cell/mlの濃度で細胞を溶解した。その後、5ml培養チューブ(culture tube)に100μlの量を移した後、5μlの量のAnnexin V Apoptosis Detection Kit(BD Pharmingen,USA)を利用して25℃、常温、暗い条件で15分間インキュベーション(incubation)過程を経て細胞を染色した。その後、400μlバインディングバッファー(Binding Buffer)溶液を添加した後に、flow cytometry(CantoII、BD Bioscience)を利用して測定した。
5%CO2が供給される37℃培養器で54時間の間培養した後、[3H]-Thymidine(Perkin Elmer,MA,USA)を1μCi/wellになるように処理した。18時間培養後、cell harvester(Inotech,Dottikonm,Switzerland)を利用して細胞中の[3H]-Thymidineの量をWallac Microbeta scintillation counter(Wallac,Turky,Finland)で測定した。
細胞移動を確認するためのイメージ撮影のためにμ-dish35mm culture dishes(ibidi GmbH,Martinsried,Germany)を利用して、MSC 3×105 cells/wellを24時間の間分注した。細胞が安定化すると、insertを除去した後、Biostation IM-Q(Nikon,Toyko,Japan)を利用して撮影した。この実験は、12時間の間2分間隔で撮影を実施し、データ分析は、Imaris 7.2 software(Bitplane Inc,South Windor,CT USA)を利用した。
MSCの移動は、5μm insert upper wellがある24-transwell plates(Costar,Corning,NY,USA)を利用した。下部チャンバー(lower chamber)には、特定のケモカインが入った培地を分注し、上部チャンバー(upper chamber)には、1×105 cells/wellのMSCを分注した。5%CO2が供給される37℃培養器に1.5時間の間培養した後、flow cytometryを利用して下部チャンバー(lower chamber)に移動したMSCの細胞数をカウント(counting)して値を表現した。
MSC運動性(motility)の測定は、hMSC(1×104 cells/well)にsiRNAを処理した後、トランスウェルプレート(transwell plate)に24時間の間分注して培養した。その後、クリスタルバイオレット(crystal violet;Sigma,USA)染色を実施して分析した。MSC浸潤性(invasion)の測定は、トランスウェルプレート(transwell plate)に15%マトリゲル(matrigel)を24時間の間コーティングした後、hMSC(1×104 cells/well)を24時間の間分注して培養した。その後、クリスタルバイオレット(crystal violet)染色を実施して分析した。
MSC拡張性(spreading)の測定は、対照群とPRDX6発現が抑制されたhMSCをそれぞれCMFDA(Invitrogen、緑色)とCMTMR(Invitrogen、赤色)で染色した。その後、それぞれの細胞をculture-Dish35mmにhMSC(0.2×105 cells/well)を分注して培養した後、タイム-ラプスイメージング(time-lapse imaging)を2分間隔で4時間の間撮影した。ムービを時間帯別にスナップショット(snapshot)をとってhMSCの付着性(adhesion)および拡張性(spreading)を観察した。
実験データ統計分析は、GraphPad Prism 5.0(GraphPad,San Diego,CA,USA)ソフトウェアを利用して分析を実施した。
8週齢と22週齢のMRL/lprマウスの脾臓と腎臓を分離して、トリゾール(Trizol)を利用してトータルRNA(total RNA)を分離した後、qPCRを行った。8週齢と22週齢のMRL/lprマウスの脾臓と腎臓を分離してタンパク質を獲得した後、ウェスタンブロット(western blot)を行った。
Human MSCとmouse MSCで、トリゾール(trizol)を利用してトータルRNA(total RNA)を分離した後、RT-PCR(図2のA)とqPCR(図2のB)を通じて遺伝子発現を確認した(図2)。PRDX6は、組織に多量で存在しており、また、human MSCとmouse MSCでも発現していることをRT-PCR(図2のA)とqPCR(図2のB)を通じて確認した。その後、MSCのPRDX6の機能的な側面を確認するために、追加実験を進めた。
タイムコース(time course)でhMSCにsiRNAを処理した後、ウェスタンブロット(western blot)を行った(図3のA)。hMSCを96ウェルプレート(well plate)に添加した後、72時間培養した。チミジン取り込み(thymidine uptake)(図3のB)と細胞カウント(cell count)(図3のC)を通じて細胞増殖を測定し、トリパンブルー染色(trypan blue staining)を通じて細胞生存能(cell viability)を測定し(図3のD)、hMSCを添加して72時間後、アネキシン(annexin)Vで細胞を染色し、FACS(Fluorescence activated cell sorter)を通じて分析した(図3のE)。
hMSCにsiRNAを処理した後、72時間の間培養した後、DCF-DA(dichlorodihydrofluorescein-diacetate)を30分間処理した後、FACS分析を実施した(図4のA)。また、hMSCを添加した後、過酸化水素を処理して72時間後に、チミジン取り込み(thymidine uptake)を通じて細胞増殖を分析した(図4のB)。
hMSC(2×104 cells/well)にsiRNAを処理した後、1時間の間添加した後、PBS(phosphate buffer saline)でウォシング(washing)した後、顕微鏡を通じて細胞数を分析した(図5のA)。また、hMSC(2×104 cells/well)にsiRNAを処理した後、4時間の間添加した後、PBSでウォシング(washing)した後、クリスタルバイオレット(crystal violet)で染色し、顕微鏡を通じて細胞数を分析した(図5のB)。対照群(control)、PRDX6-KD hMSCをそれぞれCMFDA(green)とCMTMR(red)で染色した。培養皿(Culture-Dish35mm)にhMSC(0.2×105 cells/well)を添加し、タイム-ラプスイメージング(time-lapse imaging)を2分間隔で4時間の間撮影した。ムービを時間帯別にスナップショット(snapshot)をとってhMSCの付着(adhesion)および拡張(spreading)を観察した(図5のC)。
hMSC(1×104 cells/well)にsiRNAを処理した後、トランスウェルプレート(transwell plate)に24時間の間添加し、クリスタルバイオレット(crystal violet)染色を実施して運動性(motility)を分析した(図6のA)。また、トランスウェルプレート(Transwell plate)に15%matrigelを24時間の間コーティングした後、hMSC(1×104 cells/well)を24時間の間シーディングした後、クリスタルバイオレット染色を実施して浸潤性(invasion)を分析した(図6のB)。その後、Culture-insert m-Dish35mm culture dishを利用してhMSC(70μl of 3×105 cells/ml)をシーディングし、タイム-ラプスイメージング(time-lapse imaging)を12時間の間撮影し、それぞれムービを時間帯別にスナップショット(snapshot)をとってボックスの範囲を測定し、hMSCの移動を確認した(図6のC)。
hMSCの移動(migration)にもPRDX6が影響を及ぼしたかを調べてみるために実験を進めた。hMSC(1×104 cells/well)にsiRNAを処理した後、トランスウェルプレート(transwell plate)の上部ウェル(upper well)にhMSCを添加し、下部ウェル(lower well)には、CXCL10を入れた。24時間後にクリスタルバイオレット(crystal violet)染色を実施して分析した。
hMSCにsiRNAを処理した後、48時間の間添加し、hMSCのmRNA水準とタンパク質水準をそれぞれRT-PCRおよびウェスタンブロット(western blot)を通じて分析した。hMSCのインテグリン(integrin)とMMPのmRNA水準をRT-PCRを通じて分析し(図8のA)、hMSCのインテグリンβ3とRac1の発現度をウェスタンブロットを通じて分析した(図8のBおよびC)。また、hMSCのERK、p38そしてJNKの発現度をウェスタンブロットを通じて分析した(図8のD)。
hMSCは、T細胞の機能を抑制することが知られているが、PRDX6がhMSCの免疫抑制能にも影響を及ぼすかを調べてみるために実験を進めた。hMSCにsiRNAを処理した後、hMSCとPBMC(peripheral blood mononuclear cell)をPHA(phytohemagglutinin、5ug/ml)と共に72時間共培養後、上澄み液中にあるIFN-γのタンパク質(protein)水準をELISAで分析した(図9のA)。また、hMSCをトリゾール(trizol)を利用してトータルRNA(total RNA)を分離した後、RT-PCRを通じて遺伝子発現を確認した(図9のB)。
PRDX6が過発現したmMSC(mouse MSC)を利用してPRDX6の機能を検証した。PRDX6過発現トランスジェニック(transgenic,Tg)マウスから骨髄(bone marrow)を分離して16日間培養した後、細胞表現型をFACSを通じて分析した(図10のA)。mMSCをトリゾール(trizol)を利用してトータル(total)RNAを分離した後RT-PCRを通じて遺伝子発現を確認した(図9のB)。分析結果、ワイルドタイプ(Wild type,WT)-mMSCとPRDX6-Tg mMSCの表現型は、差異がなかった(図10のA)。また、RT-PCR分析により、PRDX6-Tg mMSCが対照群のmMSCに比べてPRDX6が過発現することが確認された(図10のB)。
mMSCを96ウェルプレート(well plate)に添加した後、72時間培養し、チミジン取り込み(thymidine uptake)(図11のA)と細胞カウント(cell count)(図11のB)を通じて細胞増殖を測定した。測定結果、PRDX6-Tg mMSCが対照群に比べて細胞増殖が増加することを確認した(図11のAおよびB)。すなわち、mMSCのPRDX6が細胞増殖に影響があることを実験を通じて確認した。
PRDX6がmMSCの運動性(motility)、浸潤性(invasion)および移動性(migration)にも影響があるかを調べてみるために実験を進めた。
PRDX6がmMSCの免疫抑制能にも影響を及ぼすかを調べてみるために実験を進めた。mMSCにマウス脾臓細胞(mouse spleen cell)をコンカナバリンA(concanavalinA,ConA)と共に72時間共培養後、上澄み液中にあるIFN-γのタンパク質水準をELISAで分析した(図13のA)。mMSCをトリゾール(trizol)を利用してトータルRNA(total RNA)を分離した後、RT-PCRを通じて遺伝子発現を確認した(図13のB)。実験結果、PRDX6-Tg mMSCは、対照群hMSCと同様に、T細胞のIFN-λの分泌を抑制することが確認された(図13のA)。また、mMSCで免疫調節に関与する可溶性因子(soluble factor)であるCOX-2、NO、IDOとケモカイン(chemokine)タンパク質であるCCL2、CCL4、CCL5、CXCL10、CXCL12の発現度を確認してみた結果、2つの細胞群の差異がないことが確認された(図13のB)。すなわち、PRDX6は、mMSCの免疫抑制能に影響を与えないことが確認された。
PRDX6は、二官能性タンパク質(bifunctional protein)と知られている。PRDX6は、過酸化水素を除去する機能と共に、アラキドネート(arachidonate)でPGE2(prostaglandin E2)を生成させるiPLA2(Calcium-independent phospholipase A2)を活性化させる機能も有している。PRDX6-ノックダウン(knockdown)hMSCとPGE2との関連性を確認するために、hMSCにsiRNAを処理した後、上澄み液中にあるPGE2のタンパク質水準をELISAで分析し(図14のA)、トリゾール(trizol)を利用してhMSCでトータルRNA(total RNA)を分離した後、RT-PCRを通じて遺伝子発現を確認した(図14のB)。その後、hMSCを添加した後、PGE2を処理してから72時間後にチミジン取り込み(thymidine uptake)を通じて細胞増殖を分析した(図14のC)。
Claims (10)
- ペルオキシレドキシン(peroxiredoxin)6を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用バイオマーカー。
- 前記ペルオキシレドキシン(peroxiredoxin)6は、間葉系幹細胞のインテグリンβ3を調節することを特徴とする請求項1に記載の間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用バイオマーカー。
- 前記ペルオキシレドキシン(peroxiredoxin)6が過発現する場合、細胞増殖および移動能力が増加することを特徴とする請求項1に記載の間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用バイオマーカー。
- 請求項1に記載のバイオマーカーの発現水準を測定する製剤を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用組成物。
- 前記バイオマーカーの発現水準を測定する製剤は、前記バイオマーカーに特異的に結合するプライマーペア、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項4に記載の間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用組成物。
- 請求項4に記載の組成物を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用キット。
- 前記キットは、RT-PCRキット、競争的RP-PCRキット、リアルタイムRT-PCRキット、定量的RT-PCRキットまたはDNAチップキットであることを特徴とする請求項6に記載の間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用キット。
- 対象の生物学的試料から請求項1に記載のバイオマーカーの発現水準を測定した後、比較対照群試料の当該バイオマーカーの発現水準と比較する段階を含む、間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測のための情報提供方法。
- 前記バイオマーカー発現水準を測定する方法は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、競争的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(competitive RT-PCR)、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(real time quantitative RT-PCR)、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(quantitative RT-PCR)、RNase保護分析法(RNase protection method)、ノーザンブロッティング(Nothern blotting)またはDNAチップ方法(DNA chip technology)、ノーザンブロッティング(Nothern blotting)、免疫組織化学染色法(immunohistochemical staining)、免疫沈降分析法(immunoprecipitation assay)、補体固定分析法(complement Fixation Assay)または免疫蛍光法(immunofluorescence)であることを特徴とする請求項8に記載の間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測のための情報提供方法。
- ペルオキシレドキシン(peroxiredoxin)6の発現量を測定して、細胞増殖および移動能力に優れた間葉系幹細胞をスクリーニングする方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2018-0137579 | 2018-11-09 | ||
KR1020180137579A KR102142956B1 (ko) | 2018-11-09 | 2018-11-09 | 중간엽줄기세포의 증식 및 이동 능력 예측용 바이오마커 및 이의 용도 |
PCT/KR2019/014959 WO2020096339A1 (ko) | 2018-11-09 | 2019-11-06 | 중간엽줄기세포의 증식 및 이동 능력 예측용 바이오마커 및 이의 용도 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022512986A true JP2022512986A (ja) | 2022-02-07 |
JP7190567B2 JP7190567B2 (ja) | 2022-12-15 |
Family
ID=70612099
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021525205A Active JP7190567B2 (ja) | 2018-11-09 | 2019-11-06 | 間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用バイオマーカーおよびその用途 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220049223A1 (ja) |
EP (1) | EP3878976A4 (ja) |
JP (1) | JP7190567B2 (ja) |
KR (1) | KR102142956B1 (ja) |
WO (1) | WO2020096339A1 (ja) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009165394A (ja) * | 2008-01-15 | 2009-07-30 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | ペルオキシレドキシン6(Prx6)に対するアプタマー |
CN106370855A (zh) * | 2016-09-28 | 2017-02-01 | 吉林大学 | 基于BSaBA信号放大***的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010500047A (ja) * | 2006-08-15 | 2010-01-07 | エージェンシー フォー サイエンス,テクノロジー アンド リサーチ | 間葉系幹細胞馴化培地 |
WO2009009890A1 (en) * | 2007-07-16 | 2009-01-22 | University Health Network | Ovarian cancer biomarkers |
KR20090095304A (ko) | 2008-03-05 | 2009-09-09 | 재단법인 한국원자력의학원 | 퍼옥시레독신 6의 암 침윤 또는 전이 표적으로서의 용도 |
KR101229819B1 (ko) * | 2009-10-19 | 2013-02-08 | 코아스템(주) | 줄기세포 이동성 개선용 조성물 |
SG10201706858XA (en) * | 2013-02-28 | 2017-09-28 | Harvard College | Methods and compositions for mobilizing stem cells |
US9588122B2 (en) * | 2013-03-12 | 2017-03-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods of treating cancer sensitive to anti-EGFR therapy and modifying treatment using peroxiredoxin 6 biomarker |
KR101614010B1 (ko) * | 2014-06-13 | 2016-04-21 | 경북대학교 산학협력단 | 항산화 효소의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는, 신경세포로의 분화 유도용 조성물 |
US9528952B1 (en) | 2016-05-17 | 2016-12-27 | Westinghouse Electric Company Llc | Pulsed neutron generated prompt gamma emission measurement system for surface defect detection and analysis |
-
2018
- 2018-11-09 KR KR1020180137579A patent/KR102142956B1/ko active IP Right Grant
-
2019
- 2019-11-06 WO PCT/KR2019/014959 patent/WO2020096339A1/ko unknown
- 2019-11-06 JP JP2021525205A patent/JP7190567B2/ja active Active
- 2019-11-06 EP EP19882355.1A patent/EP3878976A4/en active Pending
- 2019-11-06 US US17/292,210 patent/US20220049223A1/en active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009165394A (ja) * | 2008-01-15 | 2009-07-30 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | ペルオキシレドキシン6(Prx6)に対するアプタマー |
CN106370855A (zh) * | 2016-09-28 | 2017-02-01 | 吉林大学 | 基于BSaBA信号放大***的绵羊过氧化物氧还酶6双抗夹心ELISA试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
LEI HUANG ET AL., STEM CELL RESEARCH & THERAPY, vol. 6, no. 77, JPN6022018717, 2015, pages 1 - 18, ISSN: 0004774663 * |
SO YONG KIM ET AL., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 283, no. 48, JPN6022018715, 28 November 2008 (2008-11-28), pages 33563 - 33568, ISSN: 0004774664 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20220049223A1 (en) | 2022-02-17 |
KR20200053993A (ko) | 2020-05-19 |
EP3878976A1 (en) | 2021-09-15 |
WO2020096339A1 (ko) | 2020-05-14 |
JP7190567B2 (ja) | 2022-12-15 |
KR102142956B1 (ko) | 2020-08-10 |
EP3878976A4 (en) | 2022-09-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6212107B2 (ja) | 脱毛障害を処置するための方法 | |
Karlsson et al. | Notch1, Jagged1, and HES5 are abundantly expressed in osteoarthritis | |
Cai et al. | Silencing of LncRNA-ANCR promotes the osteogenesis of osteoblast cells in postmenopausal osteoporosis via targeting EZH2 and RUNX2 | |
JP2018117582A (ja) | 幹細胞の品質を評価する方法及び幹細胞の品質評価用キット | |
EP2876160A1 (en) | Differentiation marker for and differentiation control for ocular cells | |
He et al. | miR-188-3p targets skeletal endothelium coupling of angiogenesis and osteogenesis during ageing | |
Conte et al. | Clearance of defective muscle stem cells by senolytics restores myogenesis in myotonic dystrophy type 1 | |
Scoumanne et al. | Specific expression and function of inositol 1, 4, 5-trisphosphate 3-kinase C (ITPKC) in wild type and knock-out mice | |
JP2008182912A (ja) | 癌幹細胞の培養方法、および癌幹細胞 | |
WO2011129427A9 (ja) | 癌の診断剤および治療剤 | |
JP7190567B2 (ja) | 間葉系幹細胞の増殖および移動能力予測用バイオマーカーおよびその用途 | |
KR100975254B1 (ko) | 줄기 세포의 분화 유도 및 분화능의 제어 | |
KR20120013693A (ko) | 혈관 형성 관련 질환 진단용 마커 및 이의 용도 | |
Reynolds et al. | Identification and characterization of a unique chondrocyte gene involved in transition to hypertrophy | |
EP3009521B1 (en) | Marker for detecting proliferation and treatment capacities of adipose-derived stem cell cultured in medium containing egf or bfgf, and use thereof | |
CN107881240B (zh) | 骨肉瘤的诊治标志物 | |
EP1072687A2 (en) | Method for testing metastatic potential and method for screening compounds with metastasis-suppressing activity | |
KR20140143880A (ko) | miRNA의 발현 증가를 이용한 성체줄기세포의 노화 억제 조성물 | |
Zhao et al. | MiR-181a regulates the chondrogenic differentiation in pig peripheral blood mesenchymal stem cells | |
CN106715684B (zh) | 具有差异gstt1表达或基因型的干细胞亚群 | |
Hatzikotoulas et al. | Genome-wide association and functional analyses identify CASC20 and KIF26B as target loci in heterotopic ossification | |
CN110215518B (zh) | PinX1及其靶分子在制备治疗肾癌的药物中的应用 | |
KR101796091B1 (ko) | 카복실 말단 조절 단백질을 포함하는 두경부암 진단용 바이오 마커 조성물 | |
KR101695099B1 (ko) | 신규한 골아세포 분화마커 및 이의 용도 | |
KR20220114774A (ko) | 침윤성 뇌암 동물 모델 및 이의 제조방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210510 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220517 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220812 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20221108 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20221205 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7190567 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |