JP2022507693A - 心不全の治療及び予防における使用のためのリラキシン受容体1 - Google Patents
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Abstract
Description
1.対象における心不全の治療及び/又は予防における使用のための、リラキシンファミリーペプチド受容体(RXFP)ポリペプチドをコードする発現可能な核酸配列を含むポリヌクレオチド。
2.前記心不全が慢性心不全である、実施形態1に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
3.配列番号1、3、又は5の配列を含む、実施形態1又は2に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
4.前記RXFPポリペプチドが、ヒトRXFP1のアミノ酸1~766に対応するアミノ酸を少なくとも含む、実施形態1から3のいずれか1つに記載の使用のためのポリヌクレオチド。
5.前記RXFPが、RXFP1、好ましくはヒトRXFP1であり、より好ましくは配列番号2若しくは/及び4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%同一の配列を含み、好ましくは配列番号2及び/又は4のアミノ酸配列を含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載の使用のためのポリヌクレオチド。
6.前記発現が、構成的プロモーター、好ましくはCMVエンハンサーを含む構成的プロモーターによって媒介される、実施形態1から5のいずれか1つに記載の使用のためのポリヌクレオチド。
7.前記発現が、心臓細胞特異的プロモーター、好ましくは心筋細胞特異的プロモーター、より好ましくはMLC260プロモーターによって媒介される、実施形態1から6のいずれか1つに記載の使用のためのポリヌクレオチド。
8.配列番号3の配列を含み、好ましくはそれからなる、実施形態1から7のいずれか1つに記載の使用のためのポリヌクレオチド。
9.ベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス(AAV)、より好ましくはAAV9のための少なくとも1つのパッケージングシグナルを含む、実施形態1から8のいずれか1つに記載の使用のためのポリヌクレオチド。
10.ベクターパッケージング構築物、好ましくはウイルスベクターパッケージング構築物、より好ましくはアデノ随伴ウイルス(AAV)パッケージング構築物、最も好ましくはAAV9パッケージング構築物に含まれる、実施形態1から9のいずれか1つに記載の使用のためのポリヌクレオチド。
11.ベクター、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、より一層好ましくはAAV1、AAV2、AAV5、AAV6、又はAAV9ベクター、最も好ましくはAAV9ベクターに含まれる、実施形態1から10のいずれか1つに記載の使用のためのポリヌクレオチド。
12.前記使用が、前記ポリヌクレオチドの前記対象への静脈内及び/又は心臓内投与を含む、実施形態1から11のいずれか1つに記載の使用のためのポリヌクレオチド。
13.前記使用が、前記ポリヌクレオチドを含む106~1015、好ましくは108~1013個のウイルス粒子の前記対象への静脈内投与を含む、実施形態1から12のいずれか1つに記載の使用のためのポリヌクレオチド。
14.前記対象が哺乳動物、好ましくはヒトである、実施形態1から13のいずれか1つに記載の使用のためのポリヌクレオチド。
15.前記使用がRXFPアゴニストの投与をさらに含む、実施形態1から14のいずれか1つに記載の使用のためのポリヌクレオチド。
16.前記RXFPアゴニストがリラキシン又はその誘導体、好ましくはリラキシンである、実施形態1から15のいずれか1つに記載の使用のためのポリヌクレオチド。
17.心不全の治療及び/又は予防における使用のための実施形態1から16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
18.心筋細胞への指向性を有する、実施形態17に記載の使用のためのベクター。
19.ウイルスベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、より好ましくはAAV9ベクターである、実施形態17又は18に記載の使用のためのベクター。
20.心不全の治療及び/又は予防における使用のための、実施形態1から16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、実施形態1から16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドから発現したRXFPポリペプチド、及び/又は実施形態17から19のいずれか1つに記載のベクターを含む宿主細胞。
21.対象における心不全の治療における使用のためのRXFPアゴニストであって、前記治療が、実施形態1から16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、実施形態17から19のいずれか1つに記載のベクター、及び/又は実施形態20に記載の宿主細胞の前記対象への投与を含み、好ましくは前記治療に先行して、実施形態1から16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、実施形態17から19のいずれか1つに記載のベクター、及び/又は実施形態20に記載の宿主細胞が前記対象に投与される、RXFPアゴニスト。
22.実施形態1から16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、実施形態17から19のいずれか1つに記載のベクター、及び/又は実施形態20に記載の宿主細胞、並びにRXFPアゴニストを含む医薬調製物を含むキット。
23.実施形態1から16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド及び/又は実施形態17から19のいずれか1つに記載のベクターを含むデバイス。
24.対象における心不全を治療する方法であって、
i)前記対象を実施形態1から16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、実施形態17から19のいずれか1つに記載のベクター、及び/又は実施形態20に記載の宿主細胞と接触させる工程、並びに
ii)それにより心不全を治療する工程
を含む方法。
25.前記対象が哺乳動物、好ましくはヒトである、実施形態24に記載の方法。
26.心不全の治療及び/又は予防のための医薬を製造するための、実施形態1から16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、実施形態17から19のいずれか1つに記載のベクター、及び/又は実施形態20に記載の宿主細胞の使用。
RLN投与と組み合わせたRXFP1遺伝子療法は陽性変力効果を誘導し、心不全を救済する
ウイルス作製
全てのin vivo実験のためにアデノ随伴ウイルスベクター血清型9(AAV9)を生成した。ラット(ドブネズミ(Rattus norwegicus))及びヒト(ホモ・サピエンス(Homo sapiens))リラキシン受容体1(RXFP1)を発現する組換えAAVベクター:AAV9-CMV-MLC260-FLAG-Rel1Rattus(AAV9-RXFP1)及びAAV9-CMV-MLC260-FLAG-Rel1human(AAV9-huRXFP1)を生成した。最適化ラットRel1 cDNAと最適化ヒトRel1 cDNAの両方(NM_201417.1及びNM_021634.3、米国立生物工学情報センター(NCBI))を合成し、N末端FLAGタグを含むpCDNA3.1プラスミドにクローニングした。広範なin vitro検査の後、導入遺伝子カセットを短い260bpミオシン軽鎖プロモーター(MLC260)と接合した心臓筋細胞特異的サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサーの下流においてAAV移入プラスミドにサブクローニングし、全構築物を2つのITRにより挟んだ。組換えベクターを、2つのプラスミドのトランスフェクションプロトコル(Grimmら、2003、Mol. Ther. 7: 839~850)を使用して、AAV末端逆位配列組換えゲノムのAAV9カプシドへのパッケージングによって生成した。高力価ベクターをセルスタック(Corning)においてポリエチレンイミントランスフェクションを用いて作製した。48時間後、ベクターを回収し、イオジキサノール勾配における密度濾過によって精製した(Jungmannら、2017、Hum. Gene. Ther. Methods 28: 235~246)。同じ方法を使用して、ホタルルシフェラーゼを発現する対照ベクター:AAV9-CMV-MLC260-FLAG-LucFirefly(AAV9-LUC)を生成した。全てのウイルスベクターのウイルス力価を、SYBRグリーンリアルタイムPCRアッセイ(Bio-Rad)を使用して同時に定量し、1ミリリットル当たりのウイルスゲノム(vg/mL)として表した。
横行大動脈縮窄術(TAC)操作は以前に記載された(Rockmanら、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 8277~8281)。TACモデルを心不全モデルとして使用した。8週齢C57BL/6マウスの体重を操作前に測定した。TAC操作を、横行大動脈の直径をおよそ0.46mmに効果的に小さくする26ゲージ鈍針を使用して0日目に実施した(Rockmanら、1994、Proc. Natl. Acad. Sci. 91(7): 2694~2698)。心機能をTAC操作前(-2日目)、ウイルス注入前(7日目)、ポンプ植込前(28日目)、及び2か月の追跡時(55日目)に心エコー検査(Vevo 2100 VisualSonics)によって評価した(図1A及びB)。7日目に、動物をルシフェラーゼ(LUC)対照ウイルス又はRXFP1ウイルスの全身注射に対して無作為化した。浸透圧ポンプ(Alzet 2004)を、食塩水ポンプ又は組換えリラキシンポンプのいずれかを得るように動物を無作為化して28日目に植え込んだ。追跡評価を55日目に実施し、3日後に動物を屠殺した。加えて、17匹のマウスはシャム操作と、それに続く食塩水又は組換えリラキシンポンプ植込のいずれかとを受けた対照動物として役立った。
心エコー検査を、VisualSonicsのVevo 2100を使用して実施した。マウスを剃毛し、腹臥位に保持した。温超音波カップリングゲル(37℃)を剃毛した胸部に載せ、MS400トランスデューサーを当てて、2D Bモード傍胸骨長及び短軸像並びにMモード短軸像を取得した。駆出率(EF)、短縮率(FS)、左室内径(LVIDd)、及び心拍数(HR)を、MモードにおいてLV追跡機能を使用して、6回の連続した心拍から算出した。
RNA発現
RNAを、TRIzol(登録商標)試薬(Ambion)を使用して、急速凍結組織(10mg)又は細胞溶解物(2×106個の細胞)から製造業者のプロトコルに従って抽出した。1μgの総RNAを、iScript cDNA合成キット(Bio-Rad)を使用してcDNAに逆転写した。iQ SYBR Green Supermixを製造業者のプロトコルに従って使用した。反応1つ当たり15μLの最終容量は、7.5μLのiQ SYBR Green Supermix、1μLの順及び逆方向プライマーミックス(それぞれ300nMの最終濃度)、並びに6.5μLの調製した希釈cDNA(反応1つ当たり3.25ngの最終濃度)からなった。定量的リアルタイムPCRをBio-Rad CFX96リアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad)において二連で実施した。2-ΔΔCT法を使用して、試料間の相対遺伝子発現レベルを定量した。PCR産物の特異性をゲル電気泳動によって確認した。表1に列挙するプライマーをmRNA発現定量のために使用した。
組換えリラキシンH2の循環血漿レベルを、R&D Systems製の既製のリラキシンH2 Quantikine ELISAキット(DLR200)を使用して測定した。血漿試料を1:200に希釈して、アッセイの検出範囲内に留めた。50μLの陰性対照試料、陽性対照試料、標準試料、及び希釈試料を測定のために使用した。
in vitroにおけるRXFP1遺伝子療法及び組換えRLN刺激からの陽性変力性
ウイルス作製
全てのin vitro実験のためにAAV6血清型ベクターを活用した。組換えアデノ随伴ウイルスベクターAAV6-CMV-MLC260-FLAG-Rel1Rattus(AAV6-RXFP1)及びAAV6-CMV-MLC260-FLAG-Rel1human(AAV6-huRXFP1)を以下のように生成した。最適化ドブネズミRXFP1 cDNAと最適化ホモ・サピエンスRXFP1 cDNAの両方[NM_201417.1及びNM_021634.3、米国立生物工学情報センター(NCBI)]を合成し、N末端FLAGタグを含むpCDNA3.1プラスミドにクローニングした。広範なin vitro検査の後、導入遺伝子カセットを短い260bpミオシン軽鎖プロモーター(MLC260)と接合した心臓筋細胞特異的サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサーの下流においてAAV移入プラスミドにサブクローニングし、全構築物を2つのITRにより挟んだ。組換えベクターを、2つのプラスミドのトランスフェクションプロトコル(Grimmら、2003、Mol. Ther. 7: 839~850)を使用して、AAV末端逆位配列組換えゲノムのAAV6カプシドへのパッケージングによって生成した。高力価ベクターをセルスタック(Corning)においてポリエチレンイミントランスフェクションを用いて作製した。48時間後、ベクターを回収し、イオジキサノール勾配における密度濾過によって精製した(Jungmannら、2017、Hum. Gene. Ther. Methods 28: 235~246)。同じ方法を使用して、対照ベクターAAV6-CMV-MLC260-FLAG-LucFirefly(AAV6-LUC)を生成した。全てのウイルスベクターのウイルス力価を、SYBRグリーンリアルタイムPCRアッセイ(Bio-Rad)を使用して同時に定量し、1ミリリットル当たりのウイルスゲノム(vg/mL)として表した。
新生仔ラット心室心臓筋細胞(NRVM)の初代培養を1~2日齢Wistarラット(Charles River)から調製した。新生仔ラットを断頭によって安楽死させ、心臓を剥離し、1×冷ADS溶液に入れた。心房及び他の血管を除去し、心臓を新たな1×冷ADS溶液に移した。ADS溶液を除去し、心室を、3mLの冷ADSを用いて洗浄した後に細断した。組織断片を、コラゲナーゼ及びパンクレアチンを含有する30mLの消化溶液を含むT75ボトルにおいて37℃で5分間消化した。組織断片をボトルの一方の側に沈殿させ、溶液を除去及び廃棄した。新しい消化溶液を添加し、組織断片を37℃で20分間消化した。20分後、組織断片を最大出力で5回ピペッティングし、溶液を、40μmセルストレーナーを介して50mLファルコンに回収及び濾過した。10mLのFCSを、セルストレーナーを介して添加し、溶液を1000rpmで5分間、室温にて遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、7mLのFCSを添加した。細胞溶液をさらなる処理まで37℃のインキュベーターに入れた。全ての組織片を完全に消化するために組織断片を少なくとも5回消化した。消化後、全ての細胞懸濁液を組み合わせ、1000rpmで5分間、室温にて遠心分離した。上清を除去し、細胞を12mLの冷1×ADSに再懸濁した。線維芽細胞及び心臓筋細胞を、パーコール密度勾配を使用して分離した。高純度の心筋細胞を取得するために、二層パーコール密度勾配を実施した。勾配は63%赤色パーコール溶液及び40.5%透明パーコール溶液からなった。4mLの赤色パーコール溶液を各15mLファルコンに添加した。次いで、3mLの透明パーコール溶液を、基礎技法を使用して添加した。1×冷ADSを含有する2mLの細胞溶液を勾配上に45度の角度で層状に重ねた。ファルコンを2400rpmで30分間、37℃にて0の減速度で遠心分離した。線維芽細胞を含む上側の間質細胞バンドを吸引によって除去した。下側の心筋細胞バンドは保ち、冷1×ADSを用いて2回洗浄した後に、10%v/vウシ胎児血清、100U/mLペニシリン、100μg/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、及び1mM塩化カルシウムを補充した温かい199培地に再懸濁した。細胞をノイバウエルチャンバーにおいて手動で計数し、それに応じてプレーティングした(表4)。NRVCMを37℃及び5%CO2湿潤雰囲気において培養した。48時間後、ウシ胎児血清を0.5%に減少させ、細胞を2~5日間培養した。細胞をプレーティングした2日後、培地を除去し、細胞を、温PBSを用いて1回洗浄した後に、0.5%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%L-グルタミン、1mM CaCl2を補充したM199飢餓培地を添加した。その後、細胞を回収するまで培地を2日ごとに交換した。細胞は最大7日間使用した後に廃棄した。
最初の培地交換後、6ウェルプレートに播種したNRVMに種々の量のRXFP1ウイルス(5,000~50,000vg/細胞のウイルスMOIの範囲)を、10,000vg/細胞のMOIを有するLuc対照ウイルスと共に形質導入した。ウイルスを細胞に48時間形質導入させた後に培地を交換した。5日後、形質導入されたNRVMを回収し、RXFP1 mRNA発現を、表1のプライマーを使用したqPCRによって定量した。RXFP1 mRNA発現の有意な増加を用量依存的に検出することができた(図4A)。最適なMOIをさらに確認するために、cAMP測定を、Promega製のcAMP Glo(商標)アッセイキットを使用して実施した。製造業者のマニュアルに従った。第1のNRVMを表4に従って96ウェルに播種した。細胞に5,000~50,000vg/細胞のMOIの範囲である種々のMOIのRXFP1ウイルス及び10,000vg/細胞の固定したMOIのLuc対照ウイルスを形質導入した。ウイルスを細胞に48時間形質導入させた後に培地を交換した。5日後、形質導入されたNRVMを、100nMの組換えRLNを用いて30分間処理した。形質導入されたNRVMを刺激するために、培地を除去し、誘導緩衝液(500μM IBMX及び100μM Ro 20-1724を補充した1×PBS)に溶解した20μLのRLNを細胞に添加してcAMP産生を刺激した。30分後、20μLの溶解緩衝液を全てのウェルに添加した。細胞を室温で15分間溶解した。40μLの検出緩衝液(プロテインキナーゼAを補充した反応緩衝液)を全てのウェルに添加し、プレートを1分間振盪することによって混合し、室温で20分間インキュベートした。80μLのKinase Glo(登録商標)試薬を全てのウェルに添加し、プレートを1分間振盪することによって混合し、室温で10分間インキュベートした。発光を、発光測定装置を用いて測定した。少なくとも10,000vg/細胞のRXFP1を受けた試料においてcAMP産生の有意な増加が観察されたが、50,000vg/細胞のMOIの場合にはcAMP産生の減少が検出された(図2B)。したがって、RXFP1 mRNA発現とRLN刺激後の細胞内cAMP産生の有意な増加の両方を有する最小のウイルスMOIは10,000vg/細胞であった。
6ウェルプレートに播種したNRVMに10,000vg/細胞のウイルスMOIを有するRXFP1ウイルス及びLuc対照ウイルスを形質導入した。ウイルスを細胞に48時間形質導入させた後に培地を交換した。5日後、形質導入されたNRVMを回収し、RXFP1 mRNA発現を、表1に列挙したプライマーを使用したqPCRによって定量した。RXFP1 mRNA発現の有意な増加をRXFP1ウイルス処理細胞において、Luc対照処理細胞及び心房(新生仔ラット心房心筋細胞、NRAM)からの天然のRXFP1発現を有する未処理細胞と比較して検出することができた(図4C)。
cAMP測定を、Promega製のcAMP Glo(商標)アッセイキットを使用して実施した。製造業者のマニュアルに従った。第1のNRVCMを表4に従って96ウェルプレートに播種した。細胞に10,000vg/細胞のウイルスMOIを有するRXFP1ウイルス及びLuc対照ウイルスを形質導入した。ウイルスを細胞に48時間形質導入させた後に培地を交換した。5日後、形質導入されたNRVMを、1pM~10nMの範囲の種々の量の組換えRLNを用いて30分間処理した。形質導入されたNRVMを刺激するために、培地を除去し、誘導緩衝液(500μM IBMX及び100μM Ro 20-1724を補充した1×PBS)中20μLのRLNを細胞に添加してcAMP産生を刺激した。30分後、20μLの溶解緩衝液を全てのウェルに添加した。細胞を室温で15分間溶解した。40μLの検出緩衝液(プロテインキナーゼAを補充した反応緩衝液)を全てのウェルに添加し、プレートを1分間振盪することによって混合し、室温で20分間インキュベートした。80μLのKinase Glo(登録商標)試薬を全てのウェルに添加し、プレートを1分間振盪することによって混合し、室温で10分間インキュベートした。発光を、発光測定装置を用いて測定した。結果は、cAMP産生の実質的な増加がRXFP1ウイルス及び組換えRLN処理細胞において、Luc対照ウイルス及び組換えRLNを用いて処理した細胞と比較して観察されたことを確認した(図4D)。RXFP1受容体のピーク刺激は10nMの組換えRLN濃度において観察された。興味深いことに、より高い組換えRLN濃度を用いたとしてもcAMP蓄積のさらなる増加は見出されなかった。
6ウェルプレートに播種したNRVMに10,000vg/細胞のウイルスMOIのRXFP1ウイルス及びLuc対照ウイルスを形質導入した。ウイルスを細胞に48時間形質導入させた後に培地を交換した。5日後、形質導入されたNRVMを、100nM組換えRLNを用いて5時間刺激した後に1%SDS緩衝液(プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤カクテル2及び3を補充した、1%SDS、1mM EDTA、1mM EGTA)を使用する免疫ブロッティングのために回収した。タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び免疫ブロッティングによって以前に記載されたように解析した(Towbinら、1979、Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 4350~4354)。膜を、表3に列挙した抗体を用いてプローブした。Alexa Flour 680に接合したマウス二次抗体(Invitrogen)及びDylight(商標)800に接合したウサギ二次抗体(Cell Signaling)を使用し、Odyssey赤外線イメージャー(LI-COR)検出システムを利用して免疫ブロットからシグナルを検出した。画像を、Odysseyイメージングソフトウェアを使用して処理した。P-PLB(S16)の有意な増加がRXFP1ウイルスを形質導入し、組換えRLNを用いて処理したNRVM群において観察された(図4E~F)。in vivo実験と一致して、in vitro実験からの分子的証拠は、陽性変力性が増加したcAMP産生及び増加したセリン16におけるホスホランバンリン酸化の結果であることを示唆する。
ヒト及びラットRXFP1遺伝子療法の比較
ウイルス作製
全てのin vitro実験のためにAAV6血清型ベクターを活用した。AAV6-CMV-MLC260-Rel1Rattus(AAV6-naRXFP1と称す)を以下のように生成した。最適化ドブネズミRel1 cDNA[NM_201417.1、米国立生物工学情報センター(NCBI)]を合成し、pCDNA3.1プラスミドにクローニングした。広範なin vitro検査の後、導入遺伝子カセットを短い260bpミオシン軽鎖プロモーター(MLC260)と接合した心臓筋細胞特異的サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサーの下流においてAAV移入プラスミドにサブクローニングし、全構築物を2つのITRにより挟んだ。組換えベクターを、2つのプラスミドのトランスフェクションプロトコル(Grimmら、2003、Mol. Ther. 7: 839~850)を使用して、AAV末端逆位配列組換えゲノムのAAV6カプシドへのパッケージングによって生成した。高力価ベクターをセルスタック(Corning)においてポリエチレンイミントランスフェクションを用いて作製した。48時間後、ベクターを回収し、イオジキサノール勾配における密度濾過によって精製した(Jungmannら、2017、Hum. Gene. Ther. Methods 28: 235~246)。全てのウイルスベクターのウイルス力価を、SYBRグリーンリアルタイムPCRアッセイ(Bio-Rad)を使用して同時に定量し、1ミリリットル当たりのウイルスゲノム(vg/mL)として表した。
6ウェルプレートに播種したNRVMに10,000vg/細胞のウイルスMOIのヒト及びラットRXFP1ウイルス並びにLuc対照ウイルスを含有するウイルスを形質導入した。ウイルスを細胞に48時間形質導入させた後に培地を交換した。5日後、形質導入されたNRVMを、100nM組換えRLNを用いて5時間刺激した後に1%SDS緩衝液(プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤カクテル2及び3を補充した、1%SDS、1mM EDTA、1mM EGTA)を使用する免疫ブロッティングのために回収した。タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び免疫ブロッティングによって以前に記載されたように解析した(Towbinら、1979、Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 4350~4354)。膜を、表3に列挙した抗体を用いて一晩プローブした。Alexa Flour 680に接合したマウス二次抗体(Invitrogen)及びDylight(商標)800に接合したウサギ二次抗体(Cell Signaling)を使用し、Odyssey赤外線イメージャー(LI-COR)検出システムを利用して免疫ブロットからシグナルを検出した。画像を、Odysseyイメージングソフトウェアを使用して処理した。P-PLB(S16)の有意な増加がヒト又はラットRXFP1ウイルスを形質導入し、且つ組換えRLNを用いて処理したNRVM群において観察されたが(図5A及びB)、ヒトRXFP1ウイルスとラットRXFP1ウイルスとの間に有意差は存在しなかった。
ML290(ヒトRXFP1化学的アゴニスト)によるRXFP1の活性化
in vitroにおけるML290によるRXFP1活性化
6ウェルプレートに播種したNRVMに10,000vg/細胞のウイルスMOIのヒトRXFP1、ラットRXFP1、及びLuc対照ウイルスを含有するウイルスを形質導入した。ウイルスを細胞に48時間形質導入させた後に培地を交換した。5日後、形質導入されたNRVMを、1μMのML290を用いて30分間刺激した後に1%SDS緩衝液(プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤カクテル2及び3を補充した、1%SDS、1mM EDTA、1mM EGTA)を使用する免疫ブロッティングのために回収した。タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び免疫ブロッティングによって以前に記載されたように解析した(Towbinら、1979、Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 4350~4354)。膜を、表3に列挙した抗体を用いて一晩プローブした。Alexa Flour 680に接合したマウス二次抗体(Invitrogen)及びDylight(商標)800に接合したウサギ二次抗体(Cell Signaling)を使用し、Odyssey赤外線イメージャー(LI-COR)検出システムを利用して免疫ブロットからシグナルを検出した。画像を、Odysseyイメージングソフトウェアを使用して処理した。P-PLB(S16)の有意な増加がヒトRXFP1ウイルスを形質導入し、1μM ML290を用いて処理したNRVM群において検出された(図6A及びB)。P-PLB(S16)の著しい増加はラットRXFP1ウイルスを形質導入し、1μM ML290を用いて処理したNRVM群においても観察された。ヒトRXFP1ウイルス及び1μM ML290を用いた処理と、ヒトRXFP1ウイルス及び100nM組換えRLNを用いた処理との間にP-PLB(S16)の差は観察されなかった。
RLN投与を伴うhuRXFP1遺伝子療法の変力効果は心不全を救済する
ウイルス作製
全てのin vivo実験のためにAAV9血清型ベクターを活用した。組換えアデノ随伴ウイルスベクターAAV9-CMV-MLC260-FLAG-Rel1Rattus(AAV9-RXFP1と称す)及びAAV9-CMV-MLC260-FLAG-Rel1human(AAV9-huRXFP1と称す)を以下のように生成した。最適化ドブネズミRel1 cDNAと最適化ホモ・サピエンスRel1 cDNAの両方[NM_201417.1及びNM_021634.3、米国立生物工学情報センター(NCBI)]を合成し、N末端FLAGタグを含むpCDNA3.1プラスミドにクローニングした。広範なin vitro検査の後、導入遺伝子カセットを短い260bpミオシン軽鎖プロモーター(MLC260)と接合した心臓筋細胞特異的サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサーの下流においてAAV移入プラスミドにサブクローニングし、全構築物を2つのITRにより挟んだ。組換えベクターを、2つのプラスミドのトランスフェクションプロトコル(Grimmら、2003、Mol. Ther. 7: 839~850)を使用して、AAV末端逆位配列組換えゲノムのAAV9カプシドへのパッケージングによって生成した。高力価ベクターをセルスタック(Corning)においてポリエチレンイミントランスフェクションを用いて作製した。48時間後、ベクターを回収し、イオジキサノール勾配における密度濾過によって精製した(Jungmannら、2017、Hum. Gene. Ther. Methods 28: 235~246)。同じ方法を使用して、対照ベクター AAV9-CMV-MLC260-FLAG-LucFirefly(AAV9-LUCと称す)を生成した。全てのウイルスベクターのウイルス力価を、SYBRグリーンリアルタイムPCRアッセイ(Bio-Rad)を使用して同時に定量し、1ミリリットル当たりのウイルスゲノム(vg/mL)として表した。
心不全モデルを以前に記載された横行大動脈縮窄術操作(TAC)によって生成した(Rockmanら、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 8277~8281)。8週齢C57BL/6マウスを取り寄せ、操作前に体重を測定した。TAC操作を、横行大動脈の直径をおよそ0.46mmに効果的に小さくする26ゲージ鈍針を使用して0日目に実施した(Rockmanら、1994、Proc. Natl. Acad. Sci. 91(7): 2694~2698)。心機能測定を横行大動脈縮窄術(TAC)操作前(-2日目)、ウイルス注入前(7日目)、ポンプ植込前(28日目)、及び2か月の追跡時点(55日目)に実施した(図7A)。7日目に、動物をルシフェラーゼ対照ウイルス又はRXFP1ウイルスの全身注射に対して無作為化した。浸透圧ポンプを、食塩水ポンプ又は組換えリラキシンポンプのいずれかを得るように動物を無作為化して28日目に植え込んだ。追跡評価を55日目に実施し、3日後に動物を屠殺した。加えて、17匹のマウスは、シャム操作され、続いて食塩水ポンプ又は組換えリラキシンポンプいずれかの植込が行われた対照動物として役立った。
心エコー検査を、VisualSonicsのVevo 2100を使用して実施した。マウスの胸を剃毛し、マウスを腹臥位に保持した。温超音波カップリングゲル(37℃)を剃毛した胸部に載せ、MS400トランスデューサーを当てて、2D Bモード傍胸骨長及び短軸像並びに1D Mモード短軸像を取得した。駆出率(EF)を、MモードにおいてLV追跡機能を使用して、6回の連続した心拍から算出した。
RNA発現
RNAを、TRIzol(登録商標)試薬(Ambion)を使用して、急速凍結組織(10mg)又は細胞溶解物(2×106個の細胞)から製造業者のプロトコルに従って抽出した。1μgの総RNAを、iScript cDNA合成キット(Bio-Rad)を使用してcDNAに逆転写した。iQ SYBR Green Supermixを製造業者のプロトコルに従って使用した。反応1つ当たり15μLの最終容量は、7.5μLのiQ SYBR Green Supermix、1μLの順及び逆方向プライマーミックス(それぞれ300nMの最終濃度)、並びに6.5μLの調製した希釈cDNA(反応1つ当たり3.25ngの最終濃度)からなった。定量的リアルタイムPCRをBio-Rad CFX96リアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad)において二連で実施した。2-ΔΔCT法を使用して、試料間の相対遺伝子発現レベルを定量した。PCR産物の特異性をゲル電気泳動によって確認した。上の表1に列挙したプライマーをmRNA発現定量のために使用し、アニーリング温度の調整のみ行って表5の汎用RT-PCRプログラムを全てのプライマーに関して使用した。
高度に発現した場合のhuRXFP1の保護効果
トランスジェニック動物生成
FLAG huRXFP1を、制限部位と隣り合う全長α-MHCプロモーターを含有するプレースホルダープラスミド(place holder plasmid)にクローニングした。正確なクローンを同定した後、プラスミドを増殖し、目的の遺伝子及びプロモーターを含む構築物を、制限消化を使用してプラスミドから切除した。正確なDNA断片を同定及び精製した後に、これを核注入のためにUniversity of Heidelbergの動物施設に預けた。トランスジェニック(TG)動物生成プロトコルはDavisら(Davisら、2012、Circ. Res. 111(6): 761~777)に概ね基づいていた。
心不全モデルを以前に記載された横行大動脈縮窄術操作(TAC)によって生成した(Rockmanら、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 8277~8281)。8週齢C57BL/6マウスを取り寄せ、操作前に体重を測定した。TAC操作を、横行大動脈の直径をおよそ0.44mmに効果的に小さくする27ゲージ鈍針を使用して0日目に実施した(Rockmanら、1994、Proc. Natl. Acad. Sci. 91(7): 2694~2698)。心機能測定を横行大動脈縮窄術(TAC)操作前(-2日目)、操作の7日後(7日目)、操作の28日後(28日目)、及び操作の42日後(42日目)に実施した(図8A)。動物を最後の評価の2日後に屠殺した。加えて、20匹のマウスはシャム操作された対照動物として役立った。
心エコー検査を、VisualSonicsのVevo 2100を使用して実施した。マウスの胸を剃毛し、マウスを腹臥位に保持した。温超音波カップリングゲル(37℃)を剃毛した胸部に載せ、MS400トランスデューサーを当てて、2D Bモード傍胸骨長及び短軸像並びに1D Mモード短軸像を取得した。駆出率(EF)を、MモードにおいてLV追跡機能を使用して、6回の連続した心拍から算出した。
全てのRNAを、上の表1に列挙したプライマーを使用して解析した。RTPCRを使用した死後mRNA発現解析は、全てのhuRXFP1トランスジェニック動物の心室内のhuRXFP1 mRNA発現の有意な増加を明らかにした(図8C)。WT TAC群と比較して、ANP及びBNP mRNA発現の有意な減少がTAC操作huRXFPIトランスジェニック動物において観察された(図8C及びD)。
RXFP1の陽性変力効果は新生仔ラット心室心筋細胞における細胞内カルシウムハンドリングを改善する
新生仔ラット心室心筋細胞(NRVCM)の単離
新生仔ラット心室心臓筋細胞(NRVCM)の初代培養を1~2日齢Wistarラット(Charles River)から調製した。新生仔ラットを断頭によって安楽死させ、心臓を取り出し、1×冷ADS溶液に入れた。心房及び他の血管を除去し、心臓を新たな1×冷ADS溶液に移した。ADS溶液を除去し、心室を、3mLの冷ADSを用いて洗浄した後に細断した。組織断片を、コラゲナーゼ及びパンクレアチンを含有する30mLの消化溶液を含むT75ボトルにおいて37℃で5分間消化した。組織断片をボトルの一方の側に沈殿させ、溶液を除去及び廃棄した。新しい消化溶液を添加し、組織断片を37℃で20分間消化した。20分後、組織断片を最大出力で5回ピペッティングし、溶液を、40μmセルストレーナーを介して50mLファルコンに回収及び濾過した。10mLのFCSを、セルストレーナーを介して添加し、溶液を1000rpmで5分間、室温にて遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、7mLのFCSを添加した。細胞溶液をさらなる処理まで37℃のインキュベーターに入れた。全ての組織片を完全に消化するために組織断片を少なくとも5回消化した。消化後、全ての細胞懸濁液を組み合わせ、1000rpmで5分間、室温にて遠心分離した。上清を除去し、細胞を12mLの冷1×ADSに再懸濁した。線維芽細胞及び心臓筋細胞を、パーコール密度勾配を使用して分離した。高純度の心筋細胞を取得するために、二層パーコール密度勾配を実施した。勾配は63%赤色パーコール溶液及び40.5%透明パーコール溶液からなった。4mLの赤色パーコール溶液を各15mLファルコンに添加した。次いで、3mLの透明パーコール溶液を、基礎技法を使用して添加した。1×冷ADSを含有する2mLの細胞溶液を勾配上に45度の角度で層状に重ねた。ファルコンを2400rpmで30分間、37℃にて0の減速度で遠心分離した。線維芽細胞を含む上側の間質細胞バンドを吸引によって除去した。下側の心筋細胞バンドは保ち、冷1×ADSを用いて2回洗浄した後に、10%v/vウシ胎児血清、100U/mLペニシリン、100μg/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、及び1mM塩化カルシウムを補充した温かい199培地に再懸濁した。細胞をノイバウエルチャンバーにおいて手動で計数し、それに応じてプレーティングし
た(表6)。NRVCMを37℃及び5%CO2湿潤雰囲気において培養した。48時間後、ウシ胎児血清を0.5%に減少させ、細胞を2~5日間培養した。細胞をプレーティングした2日後、培地を除去し、細胞を、温PBSを用いて1回洗浄した後に、0.5%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%L-グルタミン、1mM CaCl2を補充したM199飢餓培地を添加した。その後、細胞を回収するまで培地を2日ごとに交換した。細胞は最大7日間使用した後に廃棄した。
ガラスボトムディッシュに播種したNRVCMに10,000vg/細胞のウイルスMOIを有するRXFP1ウイルス及びLuc対照ウイルスを形質導入した。ウイルスを細胞に48時間形質導入させた後に培地を交換した。
細胞内Ca2+トランジェントを、利用可能な装置に適合させる修正を加えたYuら(Yuら、2013、J. Biol. Chem. 288(31): 22481~22492)に従って測定した。NRVCMにRXFP1又はLUC AAVベクターを5日間形質導入した。培地を2日ごとに交換した。実験の当日、トランスフェクトされたNRVCMに1μM Fura 2 AMをM199培地中37℃で15分間、遮光下で負荷した。負荷後、細胞を、温かいM199培地を用いて37℃で15分間、遮光下で洗浄し、倒立型蛍光顕微鏡(IX70 Olympus)の台上の電極系に接続した。細胞を、1Hzのバイポーラを用いて電気刺激した。モノクロメータを使用して、Fura 2 AM負荷細胞を380nMで励起した。バイスペクトル放射(340nM/380nM)の交互測定を、蛍光顕微鏡を用いて5分間実施し、放射比を、ソフトウェアTILL visionを用いて算出した。データをMartin Bush博士によって記述されたオンラインプログラムにエクスポートした。以下のパラメータを解析した:a)トランジェントの振幅(Δ[340nM/380nM])及びb)拡張期Ca2+([340nM/380nM])。
RXFP1の陽性変力効果は成体心筋細胞における細胞内カルシウムハンドリングを改善する
成体マウス心筋細胞の単離
成体マウス心細胞をHardingら(Hardingら、1990、Cardioscience. 1: 49~54)から修正したプロトコルに従って単離した。マウス心臓をランゲンドルフ技法において消化緩衝液を用いて灌流し、したがって単一心細胞の解離を可能にした。成体雄マウス(30~35g)を頸椎脱臼によって迅速に安楽死させた。腹部及び胸部の切開部分を、70%エタノールを用いて滅菌し、剪刀による横方向の切断によって開口した。腹部大静脈を露出し、ヘパリンをI.V.投与した。次いで心臓を露出し、大部分の大動脈と共に切り取り、10mLの室温の灌流緩衝液を含む6cmペトリ皿に迅速に入れた。大動脈をランゲンドルフ装置のカニューレにはめ込み、二重結びした外科用縫合糸を用いて固定した。灌流を約3.5mL/分の点滴速度にて直ちに開始した。心臓がカニューレに対して正確に配置されているかどうかを判断するために、冠動脈の充満を確かめ、評価した。残留血清微量元素及び遊離Ca2+を除去するために、心臓を、灌流緩衝液を用いて1分間洗浄した。その後、心臓をリベラーゼ(コラゲナーゼの混合物)及びトリプシン溶液の混合物を含有する消化緩衝液を用いて10分間灌流した。心臓が弛緩し、先の細い鉗子によって容易に貫通可能となった場合、灌流を停止した。心臓をカニューレから迅速に外し、心房を、外科剪刀を使用して切り取った。心臓を1mm片に細断し、1%BSA及び50μM CaCl2を含有する2.5mLの停止溶液1を溶液に添加して消化プロセスを停止した。心臓を、切れ目のある1mLピペットチップを使用して3分間ピペッティングした。溶液を50mLファルコンに濾過し、室温で15分間放置して沈殿させた。ペレットが形成した後、1.5mLの上清以外の全てを取り出し、0.5%BSA及び38μM CaCl2を含有する5mLの停止溶液2を細胞に添加した。カルシウム処理を、4分で62μM CaCl2から始めて、8分で114μM CaCl2、12分で191μM CaCl2、16分で498μM CaCl2、20分で960μM CaCl2として、溶液内のカルシウム濃度を調整することによって4分ごとに実施した。最後の調整後、細胞をインキュベーター中で12分間放置して沈殿させ、細胞を4つのラミニンコーティングしたカルシウムトランジェントガラスボトムディ
ッシュにプレーティングした。細胞を1時間接着させた。
細胞内Ca2+トランジェントを、利用可能な装置に適合させる修正を加えたYuら(Yuら、2013、J. Biol. Chem. 288(31): 22481~22492)に従って測定した。実験の当日、成体心筋細胞に1μM Fura 2 AMをBDM不含培地中37℃で20分間、遮光下で負荷した。負荷後、細胞を、温かいBDM不含培地を用いて37℃で20分間洗浄した。次に皿を遮光し、ハイスループット倒立型蛍光顕微鏡(Cytocypher)の台上の電極系に接続した。細胞を、1Hzのバイポーラを用いて電気刺激した。モノクロメータを使用して、Fura 2 AM負荷細胞を380nmで励起した。バイスペクトル放射(340nM/380nM)の交互測定を、ベースラインに関して、並びにNaCl、100nM RLN、及び10nM ISOを用いた1、5、及び10分の刺激後に蛍光顕微鏡を用いて実施した。トランジェントを、cytocypher製のトランジェント算出ソフトウェアを使用して算出した。以下のパラメータを解析した:a)ピーク高さ、b)逸脱速度(departure velocity)、及びc)回帰速度(return velocity)。全てのパラメータ解析における増加傾向が1分のRLN処理後の単離されたTG成体心筋細胞において観察された(図10A~C)。
ヒト試料におけるRXFP1発現解析
分子解析
RNA発現
RNAを、TRIzol(登録商標)試薬(Ambion)を使用して、急速凍結組織(10mg)から製造業者のプロトコルに従って抽出した。1μgの総RNAを、iScript cDNA合成キット(Bio-Rad)を使用してcDNAに逆転写した。iQ SYBR Green Supermixを製造業者のプロトコルに従って使用した。反応1つ当たり15μLの最終容量は、7.5μLのiQ SYBR Green Supermix、1μLの順及び逆方向プライマーミックス(それぞれ300nMの最終濃度)、並びに6.5μLの調製した希釈cDNA(反応1つ当たり3.25ngの最終濃度)からなった。定量的リアルタイムPCRをBio-Rad CFX96リアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad)において2連で実施した。2-ΔΔCT法を使用して、試料間の相対遺伝子発現レベルを定量した。PCR産物の特異性をゲル電気泳動によって確認した。表7に列挙するプライマーをmRNA発現定量のために使用し、アニーリング温度の調整のみ行って表8の汎用RT-PCRプログラムを全てのプライマーに関して使用した。
RLN投与後のhuRXFP1 TG動物の血行動態変化
トランスジェニック動物生成
FLAG huRXFP1を、制限部位に挟まれた全長α-MHCプロモーターを含有するプレースホルダープラスミドにクローニングした。正確なクローンを同定した後、プラスミドを増殖し、目的の遺伝子を含む構築物及びプロモーターを、制限消化を使用してプラスミドから切除した。正確なDNA断片を同定及び精製した後に、これを核注入のためにUniversity of Heidelbergの動物施設に預けた。トランスジェニック(TG)動物生成プロトコルはDavisら(Davisら(2012)、Circ. Res. 111(6): 761~777)に基づいていた。
圧容積ループ(PVループ)測定をAbraham及びMao(Abraham及びMao(2015)、J. Vis. Exp. (103): e52942)から修正して実施した。動物を体重に応じてメデトミジン、ミダゾラム、及びフェンタニルのカクテルを用いて15分腹腔内麻酔した後に測定を行った。正向反射が喪失した後、マウスを、外科用テープを用いて手術台に固定した。測定前、カテーテルチップを温食塩水中で30分間平衡化した。頸部及び胸部を、エタノールを用いて清浄し、被毛を除去した。切開を下顎骨から胸骨まで右頸動脈上に対して行った。周囲組織を剥離して右頸動脈を露出し、頸動脈に隣接して走る迷走神経を切断した。滅菌6.0絹製縫合糸を頸動脈の遠位端(胸部から離れた)付近に置き、結んで固定した。追加の縫合糸を頸動脈の第1の縫合糸の下に置いた。第2の縫合糸を緩く結び、頸動脈を第2の縫合糸の近位でクランプした。確実に頸動脈を近位と遠位の両方でクランプした後、第1の縫合糸の近位の頸動脈に対し小さく切開を行った。カテーテルチップを切開部を介して血管に挿入し、カテーテルを、第2の縫合糸を使用して固定した。カテーテルを、PVループの追跡に従って頸動脈を介して左心室内まで穏やかに進め、正確な留置を確実にした。算出可能なループを取得するために種々のフィルター設定を適用した。PVループ記録を開始し、10分間安定化させた。10分の定常状態後、100μLの10μg RLNを腹腔内(I.P.)投与した。PVループを実験全体にわたって被験物質の投与の10分後まで連続的に記録した。
Claims (15)
- 対象における心不全の治療及び/又は予防における使用のための、リラキシンファミリーペプチド受容体(RXFP)ポリペプチドをコードする発現可能な核酸配列を含むポリヌクレオチド。
- 前記心不全が慢性心不全である、請求項1に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
- 配列番号1、3、又は5の配列を含む、請求項1又は2に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
- 前記RXFPポリペプチドが、ヒトRXFP1のアミノ酸1~766に対応するアミノ酸を少なくとも含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
- 前記RXFPが、RXFP1、好ましくはヒトRXFP1であり、より好ましくは配列番号2若しくは/及び4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも70%同一の配列を含み、好ましくは配列番号2及び/又は4のアミノ酸配列を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
- 配列番号3の配列を含み、好ましくはそれからなる、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
- ベクター、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、より一層好ましくはAAV1、AAV2、AAV5、AAV6、又はAAV9ベクター、最も好ましくはAAV9ベクターに含まれる、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
- 前記使用が、前記ポリヌクレオチドの前記対象への静脈内及び/又は心臓内投与を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
- 前記使用がRXFPアゴニストの投与をさらに含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
- 前記RXFPアゴニストがリラキシン又はその誘導体、好ましくはリラキシンである、請求項9に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
- 心不全の治療及び/又は予防における使用のための請求項1から10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 心不全の治療及び/又は予防における使用のための、請求項1から10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項1から10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから発現したRXFPポリペプチド、及び/又は請求項11に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 対象における心不全の治療における使用のためのRXFPアゴニストであって、前記治療が、請求項1から10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項11に記載のベクター、及び/又は請求項12に記載の宿主細胞の前記対象への投与を含む、RXFPアゴニスト。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項11に記載のベクター、及び/又は請求項12に記載の宿主細胞、並びにRXFPアゴニストを含む医薬調製物を含むキット。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド及び/又は請求項11に記載のベクターを含むデバイス。
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