JP2022506156A - 原核宿主細胞における２鎖タンパク質の産生方法 - Google Patents

原核宿主細胞における２鎖タンパク質の産生方法 Download PDF

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Abstract

抗体、半抗体、抗体断片、または１アーム抗体などの２つの鎖を含むポリペプチドを産生するための方法および宿主細胞が、本明細書で提供される。本方法および宿主細胞は、染色体外ポリヌクレオチド（複数可）からのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドの発現、およびプロモータとシャペロンタンパク質をコードする翻訳単位との非天然の組合せ（複数可）を使用した宿主細胞染色体からの１つ以上のシャペロンタンパク質（例えば、ペプチジル－プロリルイソメラーゼおよび／またはタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ）の発現を使用して、２鎖ポリペプチドの産生を可能にする。【選択図】図５

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月５日に出願された米国特許仮出願第６２／７５５，９１５号に対する優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルによる配列表の提出
以下のＡＳＣＩＩテキストファイルによる提出の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：１４６３９２０４４０４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：：２０１９年１０月２８日、サイズ：６ＫＢ）。
本開示は、抗体（例えば、二重特異性抗体、半抗体、１アーム抗体、抗体断片など）などの組換えポリペプチドを産生する方法、および前記方法に使用を見出すことができる原核宿主細胞に関する。
原核宿主細胞における組換えタンパク質産生は、１９７８年の大腸菌におけるヒトインスリンの産生以来、多くの重要な治療薬剤の源となっている。分子生物学ツールおよび知識が発達するにつれて、組換え治療薬の複雑性もまた増している。これらの組換えタンパク質の産生は、産物が、適切な翻訳、折り畳み、組立て、ジスルフィド結合、およびペリプラズムへの輸送などの特性を呈することを必要とする。多くの組換えタンパク質、特に、ジスルフィド結合を有するもの（例えば、抗体および抗体断片を含むが、これらに限定されない、２鎖タンパク質）の発現により、原核宿主細胞において封入体が形成されるということが知られている（Ｓｐａｄｉｕｔら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３２：５４、２０１４）。したがって、産業規模で、原核宿主細胞において適切に折り畳まれ、組み立てられた２鎖タンパク質の組換え体産生のための発現系およびプロセスが必要とされている。
モノクローナル抗体は、最も速く成長しているタイプの組換え治療薬剤のうちの１つに相当し、多数のモノクローナル抗体が、種々の疾患の治療のために既に承認されているか、または審査中である（Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、９：７６７、２０１０）。従来のモノクローナル抗体は、単一の標的抗原に結合する。多くの疾患では、２つ以上の標的抗原に結合する抗体、すなわち、多重特異性抗体を採用することが有利であり得る。このような抗体を、複数の治療標的に対するコンビナトリアルアプローチにおいて採用することができる（例えば、Ｂｏｓｔｒｏｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２３：１６１０、２００９、およびＷｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５：１２９０、２００７を参照されたい）。例えば、がん細胞の表面上で発現したエピトープ、およびＴ細胞上で発現したエピトープに同時に結合して、腫瘍細胞のＴ細胞媒介性殺滅を誘導する、二重特異性抗体を産生することができる（Ｓｈａｌａｂｙら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、７４：１８５、１９９５）。抗体断片および１アーム抗体などの他のモノクローナル抗体フォーマットも使用されている（例えば、Ｍｅｒｃｈａｎｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１０：Ｅ２９８７～Ｅ２９９６、２０１３を参照されたい）。
診療所における抗体の使用は、産業的に必要な量の２鎖タンパク質を産生する能力を必要とする。原核宿主細胞における組換えタンパク質産生を改善するベクター成分が記載されており（例えば、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１９：３８５、２００６、およびＳｉｍｍｏｎｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２６３：１３３、２００２を参照）、特に、シャペロンタンパク質（複数可）の発現が、抗体価を増加させるために使用されている。しかしながら、これらのシャペロンタンパク質（複数可）は、典型的には、宿主細胞内のプラスミドから発現される。これは、発現されるすべての新しい組換えタンパク質について、組換え産物およびシャペロン（複数可）の両方をコードするユニークな発現プラスミドを構築し、それらの発現を（例えば、様々なプロモータおよび／または翻訳開始領域を試験することによって）調整するために、かなりの時間および費用を費やさなければならないことを意味する。これはまた、コード配列（複数可）およびシャペロンタンパク質（複数可）のための関連する調節エレメントを収容するために、より大きなプラスミドサイズの使用を必要とする。プラスミド発現はまた、典型的には、（プラスミドは１細胞あたり少なくとも１０～１５コピーで存在し得るので、）シャペロンタンパク質（複数可）のより高い発現レベルをもたらし、いくつかの場合、プラスミド発現は、組換え産物力価からシャペロンタンパク質を除去するために追加の精製工程を必要とする。
特許出願、特許公報、およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号を含む、本明細書において引用されるすべての参考文献は、個々の参考文献がそれぞれ参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
実験規模で組換え２鎖タンパク質を効率的に産生するための最適な方法が、依然として求められている。特に、シャペロンタンパク質をコードする翻訳単位（複数可）の原核宿主細胞染色体への組込み、および／または天然シャペロンタンパク質の発現を駆動するための非天然プロモータの組込みは、様々な組換えタンパク質産物を発現し、産生に必要なプラスミド操作およびタンパク質精製プロトコルを単純化するために使用することができる、単一の宿主細胞を可能にする。
これらおよび他の要求を満たすために、原核宿主細胞およびそれを使用して２鎖ポリペプチドを産生する方法が本明細書で提供される。有利なことには、これらの宿主細胞および方法は、例えば、シャペロン発現プラスミドを最適化するための事前の時間およびコスト、またはシャペロンタンパク質を除去するための下流での精製工程を必要とせずに、２鎖ポリペプチドのより効率的な産生を可能にする。
一態様では、宿主細胞染色体を含む原核宿主細胞中で、２つの鎖を含むポリペプチドを産生する方法が本明細書で提供され、該方法は、（ａ）宿主細胞を、該ポリペプチドの該２つの鎖の発現に適した条件下の培養培地中で、該ポリペプチドの該２つの鎖を発現するように培養し、それによって、発現すると、該２つの鎖は折り畳まれ、組み立てられて、該宿主細胞中で生物学的に活性なポリペプチドを形成することであって、該宿主細胞が、（１）該ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド、（２）該ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、該第１および第２のポリヌクレオチドは、１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドの一部である）、および（３）ペプチジル－プロリルイソメラーゼおよびタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼからなる群から選択されるシャペロンタンパク質をコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、該第３の翻訳単位は該宿主細胞染色体の一部であり、該第３の翻訳単位が、該宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ該第３の翻訳単位の転写を駆動するプロモータと作動可能な組合せにあり、該第３の翻訳単位と該プロモータとの組合せが、該宿主細胞染色体に対して非天然である、第３のポリヌクレオチドを含む、形成すること、ならびに（ｂ）該宿主細胞から該生物学的に活性なポリペプチドを回収することを含む。
いくつかの実施形態では、プロモータは、誘導性プロモータである。いくつかの実施形態では、誘導性プロモータは、培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、第３の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータである。いくつかの実施形態では、誘導性プロモータは、培養培地中にイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）が存在する場合に、第３の翻訳単位の転写を駆動するＩＰＴＧ誘導性プロモータである。いくつかの実施形態では、プロモータは、構成的プロモータである。いくつかの実施形態では、構成的プロモータは、ＣＰ２５プロモータである。いくつかの実施形態では、第３の翻訳単位は、宿主細胞染色体に対して天然である。いくつかの実施形態では、第３の翻訳単位は、宿主細胞染色体に対して非天然である。いくつかの実施形態では、シャペロンタンパク質は、ペプチジル－プロリルイソメラーゼである。いくつかの実施形態では、ペプチジル－プロリルイソメラーゼは、ＦｋｐＡタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＦｋｐＡは、大腸菌ＦｋｐＡである。いくつかの実施形態では、シャペロンタンパク質は、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、ＤｓｂＣタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、大腸菌ＤｓｂＣである。いくつかの実施形態では、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、ＤｓｂＡタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、大腸菌ＤｓｂＡである。
別の態様では、宿主細胞染色体を含む原核宿主細胞中で、２つの鎖を含むポリペプチドを産生する方法が本明細書で提供され、該方法は、（ａ）宿主細胞を、該ポリペプチドの該２つの鎖の発現に適した条件下の培養培地中で、該ポリペプチドの該２つの鎖を発現するように培養し、それによって、発現すると、該２つの鎖は折り畳まれ、組み立てられて、該宿主細胞中で生物学的に活性なポリペプチドを形成することであって、該宿主細胞が、（１）該ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド、（２）該ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、該第１および第２のポリヌクレオチドは、１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドの一部である）、（３）タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、該第３の翻訳単位は該宿主細胞染色体の一部であり、該第３の翻訳単位が、該宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ該第３の翻訳単位の転写を駆動する第１のプロモータと作動可能な組合せにあり、該第３の翻訳単位と該第１のプロモータとの組合せが、該宿主細胞染色体に対して非天然である、第３のポリヌクレオチド、および（４）ペプチジル－プロリルイソメラーゼをコードする第４の翻訳単位を含む第４のポリヌクレオチドであって、該第４の翻訳単位は該宿主細胞染色体の一部であり、該第４の翻訳単位が、該宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ該第４の翻訳単位の転写を駆動する第２のプロモータと作動可能な組合せにあり、該第４の翻訳単位と該第２のプロモータとの組合せが、該宿主細胞染色体に対して非天然である、第４のポリヌクレオチドを含む、形成すること、ならびに（ｂ）該宿主細胞から該生物学的に活性なポリペプチドを回収することを含む。
いくつかの実施形態では、第１および第２のプロモータは両方とも、誘導性プロモータである。いくつかの実施形態では、第１および第２のプロモータは両方とも、培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、それぞれ第３および第４の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータである。いくつかの実施形態では、第１および第２のプロモータの一方は、誘導性プロモータであり、第１および第２のプロモータの他方は、構成的プロモータである。いくつかの実施形態では、第１のプロモータは、培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、第３の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータであり、第２のプロモータは、ＣＰ２５プロモータである。いくつかの実施形態では、第２のプロモータは、誘導性プロモータであり、第１のプロモータは、構成的プロモータである。いくつかの実施形態では、第３の翻訳単位および第４の翻訳単位の一方または両方は、宿主細胞染色体に対して天然である。いくつかの実施形態では、第３の翻訳単位および第４の翻訳単位は両方とも、宿主細胞染色体に対して天然である。いくつかの実施形態では、第３の翻訳単位および第４の翻訳単位の一方または両方は、宿主細胞染色体に対して非天然である。いくつかの実施形態では、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、ＤｓｂＣタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、大腸菌ＤｓｂＣである。いくつかの実施形態では、ペプチジル－プロリルイソメラーゼは、ＦｋｐＡタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＦｋｐＡは、大腸菌ＦｋｐＡである。いくつかの実施形態では、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、大腸菌ＤｓｂＣであり、第１のプロモータは、培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、第３の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータであり、ペプチジル－プロリルイソメラーゼは、大腸菌ＦｋｐＡであり、第２のプロモータは、ＣＰ２５プロモータである。いくつかの実施形態では、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、大腸菌ＤｓｂＣであり、第１のプロモータは、培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、第３の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータであり、ペプチジル－プロリルイソメラーゼは、大腸菌ＦｋｐＡであり、第２のプロモータは、培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、第４の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、（５）第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第５の翻訳単位を含む第５のポリヌクレオチドであって、該第５の翻訳単位は該宿主細胞染色体の一部であり、該第５の翻訳単位が、該宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ該第５の翻訳単位の転写を駆動する第３のプロモータと作動可能な組合せにあり、該第５の翻訳単位と該第３のプロモータとの組合せが、該宿主細胞染色体に対して非天然である、第５のポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、ＤｓｂＡタンパク質である。いくつかの実施形態では、第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、大腸菌ＤｓｂＡである。いくつかの実施形態では、第３のプロモータは、誘導性プロモータである。いくつかの実施形態では、第３のプロモータは、培養培地中にイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）が存在する場合に、第５の翻訳単位の転写を駆動するＩＰＴＧ誘導性プロモータである。いくつかの実施形態では、第５の翻訳単位は、宿主細胞染色体に対して天然である。いくつかの実施形態では、第５の翻訳単位は、宿主細胞染色体に対して非天然である。いくつかの実施形態では、第１のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、大腸菌ＤｓｂＣであり、第１のプロモータは、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）が培養培地中に存在する場合に、第３の翻訳単位の転写を駆動するＩＰＴＧ誘導性プロモータであり、ペプチジル－プロリルイソメラーゼは、大腸菌ＦｋｐＡであり、第２のプロモータは、ＣＰ２５プロモータであり、第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、大腸菌ＤｓｂＡであり、第３のプロモータは、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）が培養培地中に存在する場合に、第５の翻訳単位の転写を駆動するＩＰＴＧ誘導性プロモータである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、（６）ポリペプチドの第３の鎖をコードする第６の翻訳単位を含む第６のポリヌクレオチドであって、該第６のポリヌクレオチドが、１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドの一部である、第６のポリヌクレオチドをさらに含み、それによって、発現すると、３つの鎖は折り畳まれ、組み立てられて、該宿主細胞中で生物学的に活性なポリペプチドを形成する。いくつかの実施形態では、第１の翻訳単位は免疫グロブリン重鎖をコードし、第２の翻訳単位は免疫グロブリン軽鎖をコードし、第６の翻訳単位は免疫グロブリンＦｃ断片をコードし、該３つの鎖は折り畳まれ、組み立てられて、生物学的に活性な一価抗体を形成する。いくつかの実施形態では、一価抗体は、抗原に特異的に結合することができる。
上記実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは両方とも、単一の染色体外発現ベクターの一部である。いくつかの実施形態では、染色体外発現ベクターは、選択剤に対する耐性を促進する選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、宿主細胞は、選択可能マーカーの発現に適した条件下で培養され、培養培地は、選択剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、染色体外発現ベクターは、原核宿主細胞中で染色体外発現ベクターを複製するのに適した複製起点をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの２つの鎖は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに連結される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ヘテロ二量体のモノマーである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第１の鎖および第２の鎖が免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む、半抗体である。いくつかの実施形態では、半抗体は、抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、分泌タンパク質である。いくつかの実施形態では、分泌タンパク質は、宿主細胞のペリプラズムから回収される。いくつかの実施形態では、原核宿主細胞は、グラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、グラム陰性細菌は、大腸菌である。いくつかの実施形態では、大腸菌は、内因性プロテアーゼ活性を欠く株のものである。いくつかの実施形態では、大腸菌は、ｄｅｇｐＳ２１０Ａ変異を有する株である。いくつかの実施形態では、大腸菌は、増強されたＬａｃＩ産生または活性を有する株のものである。いくつかの実施形態では、大腸菌は、ｌａｃＩＱ変異を有する株である。いくつかの実施形態では、大腸菌は、ΔｆｈｕＡ ΔｐｈｏＡ ｉｌｖＧ２０９６（ＩｌｖＧ＋、Ｖａｌｒ）Δｐｒｃ ｓｐｒ４３Ｈ１ ΔｍａｎＡ ｌａｃＩＱ ΔｏｍｐＴ ΔｍｅｎＥ７４２ ｄｅｇＰＳ２１０Ａ株のものである。
別の態様では、第１の抗原に結合することができる第１の半抗体および第２の抗原に結合することができる第２の半抗体を含む二重特異性抗体を産生する方法が本明細書で提供され、該方法は、上記実施形態のいずれか１つの方法に従って第１の半抗体を産生することであって、第１の翻訳単位が該第１の半抗体の重鎖をコードし、第２の翻訳単位が該第１の半抗体の軽鎖をコードし、該第１の半抗体が少なくとも１つのノブ形成変異を含む、第１の半抗体を産生すること、および上記実施形態のいずれか１つの方法に従って第２の半抗体を産生することであって、第１の翻訳単位が該第２の半抗体の重鎖をコードし、第２の翻訳単位が該第２の半抗体の軽鎖をコードし、該第２の半抗体が少なくとも１つのホール形成変異を含む、第２の半抗体を産生すること、ならびに、還元条件下で、該第１の半抗体を該第２の半抗体と組み合わせて、二重特異性抗体を生成することを含む。
いくつかの実施形態では、第１の抗原および第２の抗原は、異なる抗原である。いくつかの実施形態では、方法は、還元条件を達成するために、還元剤を添加する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、還元剤は、グルタチオンである。
別の態様では、宿主細胞染色体を含む宿主細胞（例えば、原核宿主細胞）が本明細書で提供され、該原核宿主細胞は、（１）ペプチジル－プロリルイソメラーゼをコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチドであって、該第１の翻訳単位は該宿主細胞染色体の一部であり、該第１の翻訳単位が、該宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ該第１の翻訳単位の転写を駆動する第１のプロモータと作動可能な組合せにあり、該第１の翻訳単位と該第１のプロモータとの組合せが、該宿主細胞染色体に対して非天然である、第１のポリヌクレオチド、および（２）タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチドであって、該第２の翻訳単位は該宿主細胞染色体の一部であり、該第２の翻訳単位が、該宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ該第２の翻訳単位の転写を駆動する第２のプロモータと作動可能な組合せにあり、該第２の翻訳単位と該第２のプロモータとの組合せが、該宿主細胞染色体に対して非天然である、第２のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、第１の翻訳単位および第２の翻訳単位の一方または両方は、原核宿主細胞染色体に対して天然である。いくつかの実施形態では、第１の翻訳単位および第２の翻訳単位は両方とも、原核宿主細胞染色体に対して天然である。いくつかの実施形態では、第１の翻訳単位および第２の翻訳単位の一方または両方は、原核宿主細胞染色体に対して非天然である。いくつかの実施形態では、第１のプロモータは、第１の誘導性プロモータである。いくつかの実施形態では、第１の誘導性プロモータは、Ｐｈｏプロモータである。いくつかの実施形態では、第１の誘導性プロモータは、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモータである。いくつかの実施形態では、第１のプロモータは、第１の構成的プロモータである。いくつかの実施形態では、第１の構成的プロモータは、ＣＰ２５プロモータである。いくつかの実施形態では、第２のプロモータは、第２の誘導性プロモータである。いくつかの実施形態では、第２の誘導性プロモータは、Ｐｈｏプロモータである。いくつかの実施形態では、第２の誘導性プロモータは、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモータである。いくつかの実施形態では、第２のプロモータは、第２の構成的プロモータである。いくつかの実施形態では、第２の構成的プロモータは、ＣＰ２５プロモータである。いくつかの実施形態では、ペプチジル－プロリルイソメラーゼは、ＦｋｐＡタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＦｋｐＡは、大腸菌ＦｋｐＡである。いくつかの実施形態では、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、ＤｓｂＣタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、大腸菌ＤｓｂＣである。いくつかの実施形態では、ペプチジル－プロリルイソメラーゼは、ＦｋｐＡタンパク質であり、第１のプロモータは、ＣＰ２５プロモータであり、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、ＤｓｂＣタンパク質であり、第２のプロモータは、Ｐｈｏプロモータである。いくつかの実施形態では、ペプチジル－プロリルイソメラーゼは、ＦｋｐＡタンパク質であり、第１のプロモータは、Ｐｈｏプロモータであり、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、ＤｓｂＣタンパク質であり、第２のプロモータは、Ｐｈｏプロモータである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、（３）第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、該第３の翻訳単位は該宿主細胞染色体の一部であり、該第３の翻訳単位が、該宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ該第３の翻訳単位の転写を駆動する第３のプロモータと作動可能な組合せにあり、該第３の翻訳単位と該第３のプロモータとの組合せが、該宿主細胞染色体に対して非天然である、第３のポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、ＤｓｂＡタンパク質である。いくつかの実施形態では、第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、大腸菌ＤｓｂＡである。いくつかの実施形態では、第３のプロモータは、第３の誘導性プロモータである。いくつかの実施形態では、第３の誘導性プロモータは、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモータである。いくつかの実施形態では、ペプチジル－プロリルイソメラーゼは、ＦｋｐＡタンパク質であり、第１のプロモータは、ＣＰ２５プロモータであり、第１のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、ＤｓｂＣタンパク質であり、第２のプロモータは、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモータであり、第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、ＤｓｂＡタンパク質であり、第３のプロモータは、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモータである。いくつかの実施形態では、原核宿主細胞は、グラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、グラム陰性細菌は、大腸菌である。いくつかの実施形態では、大腸菌は、内因性プロテアーゼ活性を欠く株のものである。いくつかの実施形態では、大腸菌は、ｄｅｇｐＳ２１０Ａ変異を有する株である。いくつかの実施形態では、大腸菌は、増強されたＬａｃＩ産生または活性を有する株のものである。いくつかの実施形態では、大腸菌は、ｌａｃＩＱ変異を有する株である。いくつかの実施形態では、大腸菌は、ΔｆｈｕＡ ΔｐｈｏＡ ｉｌｖＧ２０９６（ＩｌｖＧ＋、Ｖａｌｒ）Δｐｒｃ ｓｐｒ４３Ｈ１ ΔｍａｎＡ ｌａｃＩＱ ΔｏｍｐＴ ΔｍｅｎＥ７４２ ｄｅｇＰＳ２１０Ａ株のものである。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、（ａ）２鎖ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の染色体外翻訳単位を含む第１の染色体外ポリヌクレオチド、および（ｂ）該２鎖ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の染色体外翻訳単位を含む第２の染色体外ポリヌクレオチドを含む染色体外発現ベクターをさらに含み、それによって、発現すると、該２つの鎖は折り畳まれ、組み立てられて、該宿主細胞中で生物学的に活性な２鎖ポリペプチドを形成する。いくつかの実施形態では、染色体外発現ベクターは、原核宿主細胞中で染色体外発現ベクターを複製するのに適した複製起点をさらに含む。いくつかの実施形態では、染色体外発現ベクターは、選択剤に対する耐性を促進する選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、２鎖ポリペプチドの２つの鎖は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに連結される。いくつかの実施形態では、２鎖ポリペプチドは、ヘテロ二量体のモノマーである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第１の鎖および第２の鎖が免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む、半抗体である。いくつかの実施形態では、半抗体は、抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、２鎖ポリペプチドは、分泌タンパク質である。いくつかの実施形態では、分泌タンパク質は、宿主細胞のペリプラズムから回収される。いくつかの実施形態では、染色体外発現ベクターは、２鎖ポリペプチドの第３の鎖をコードする第３の染色体外翻訳単位を含む第３の染色体外ポリヌクレオチドをさらに含み、それによって、発現すると、３つの鎖は折り畳まれ、組み立てられて、宿主細胞中で生物学的に活性なポリペプチドを形成する。いくつかの実施形態では、第１の染色体外翻訳単位は免疫グロブリン重鎖をコードし、第２の染色体外翻訳単位は免疫グロブリン軽鎖をコードし、第３の染色体外翻訳単位は免疫グロブリンＦｃ断片をコードし、該３つの鎖は折り畳まれ、組み立てられ、生物学的に活性な一価抗体を形成する。いくつかの実施形態では、一価抗体は、抗原に特異的に結合することができる。
本明細書において説明される種々の実施形態の特性のうちの１つ、いくつか、またはすべてが、組み合わされて、本開示の他の実施形態を形成し得るということを理解されたい。本開示のこれらの態様および他の態様は、当業者には明らかとなるであろう。本開示のこれらの実施形態および他の実施形態は、以下の詳細な説明によってさらに説明される。
シャペロンタンパク質の染色体過剰発現を有する宿主細胞における２鎖タンパク質産物の発現のための発現ベクター（ＣＳ３９２、右）と比較して、同じシャペロンタンパク質および２鎖タンパク質産物（この場合、抗体断片重鎖および軽鎖、それぞれ「ＨＣ」および「ＬＣ」）を過剰発現するために使用される発現ベクター（ＭＤ１５６、左）のプラスミドマップを示す。ベクターサイズは、塩基対ｂｐで提供されている。
ＦｋｐＡのプラスミドベースの発現を有する株と比較して、示されたプロモータ－ｆｋｐＡペアリングを有する株の力価（黒色）およびＦｋｐＡ発現レベル（灰色）を示す。
振盪フラスコ中、示された株におけるＤｓｂＡ（図３Ａ）、ＤｓｂＣ（図３Ｂ）、またはＦｋｐＡ（図３Ｃ）の相対シャペロン発現レベル（天然の発現レベルに対しての倍数）を示す。Ｓｈ．Ｆｌ．は振盪フラスコ培養を表し、＋は陽性対照（プラスミドシャペロン発現）を表し、－は陰性対照（シャペロン発現なし）を表し、Ｓｈ．Ｆｌ．（－）は天然の発現レベルを指す。
は、１０Ｌ発酵槽からの示された株におけるＤｓｂＡ（図４Ａ）、ＤｓｂＣ（図４Ｂ）、またはＦｋｐＡ（図４Ｃ）の相対シャペロン発現レベル（天然の発現レベルに対しての倍数）を示す。＋は陽性対照（プラスミドシャペロン発現）を表し、－は陰性対照（シャペロン発現なし）を表し、Ａｍｂｒ（－）は天然の発現レベルを指す。
は、示された染色体操作されたプラスミドおよび天然シャペロン遺伝子座のペアを有する株によって産生されるｘＩＬ１３力価（ｇ／Ｌ）を示す。６７Ａ６／ＭＤ１５７は、染色体操作を行わず、示されたプロモータの下で、示されたシャペロンを発現するＭＤ１５７プラスミドを有する株を指す（ＭＤ１５７プラスミドの図については、図１を参照されたい）。
ｘＩＬ１３を産生する、示された株／プラスミドの組合せの培養物の経時的な光学密度（ＯＤ、図６Ａ）およびオスモル濃度（図６Ｂ）を示す。
示された株によって経時的に産生されるｘＩＬ１３力価（ｇ／Ｌ、図７Ａ）、ＤｓｂＣ濃度（図７Ｂ）、およびＦｋｐＡ濃度（図７Ｃ）を示す。
ＡＦ２を産生する、示された株／プラスミドの組合せの培養物の経時的な光学密度（ＯＤ、図８Ａ）およびオスモル濃度（図８Ｂ）を示す。
示された株によって産生されたＡＦ２力価（ｇ／Ｌ）を経時的に示す。
ＭｅｔＭＡｂを産生する、示された株／プラスミドの組合せの培養物の経時的な光学密度（ＯＤ、図１０Ａ）およびオスモル濃度（図１０Ｂ）を示す。
示された株によって産生されたＭｅｔＭＡｂ力価（ｇ／Ｌ）を経時的に示す。
抗ＶＥＧＦ抗体断片を産生する、示された株／プラスミドの組合せの培養物の経時的な光学密度（ＯＤ、図１２Ａ）およびオスモル濃度（図１２Ｂ）を示す。
示された株によって産生された抗ＶＥＧＦ抗体断片力価（ｇ／Ｌ）を経時的に示す。
本開示は、組換え２鎖タンパク質産物の大規模生産に適した非天然プロモータ：シャペロンタンパク質の組合せ（複数可）が組み込まれた宿主細胞（例えば、原核宿主細胞）、ならびにそれに関連する方法を提供する。本明細書で提供される例は、宿主細胞染色体からシャペロンタンパク質を発現する原核宿主細胞が、プラスミドベースのシャペロン発現に匹敵する力価を生じることを実証している。これらの結果は、半抗体、１アーム抗体、および抗体断片などの複数の抗体フォーマットにわたって一貫しており、追加のプロセス開発をほとんどまたは全く必要としなかった。重要なことに、本明細書で提示されるデータは、プラスミドではなく宿主細胞染色体からのシャペロン発現が、シャペロン発現レベルをより低くする（産物からシャペロンタンパク質を除去するためのさらなる下流での精製の必要性を潜在的になくす）が、同等またはより高い産物力価をもたらすことを示す。これらの結果は、プラスミドからシャペロンタンパク質（複数可）を発現する宿主細胞を使用するのと比較して、本開示の宿主細胞および／または方法を使用し、シャペロン発現プラスミドを最適化するための事前の時間およびコスト、またはシャペロンタンパク質を除去するための下流での精製工程を必要とせずに、少なくとも同程度に効率的に工業規模で産物を生産することができることを実証している。
一態様では、宿主細胞染色体を含む原核宿主細胞中で、２つの鎖を含むポリペプチドを産生する方法が本明細書で提供され、該方法は、該宿主細胞を、該ポリペプチドの該２つの鎖の発現に適した条件下の培養培地中で、該ポリペプチドの該２つの鎖を発現するように培養し、それによって、発現すると、該２つの鎖は折り畳まれ、組み立てられて、該宿主細胞中で生物学的に活性なポリペプチドを形成すること、および（ｂ）該宿主細胞から該生物学的に活性なポリペプチドを回収することを含み、該宿主細胞は、（１）該ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド、（２）該ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、該第１および第２のポリヌクレオチドは、１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドの一部である）、ならびに（３）ペプチジル－プロリルイソメラーゼおよびタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼからなる群から選択されるシャペロンタンパク質をコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、該第３の翻訳単位は該宿主細胞染色体の一部であり、該第３の翻訳単位が、該宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ該第３の翻訳単位の転写を駆動するプロモータと作動可能な組合せにあり、該第３の翻訳単位と該プロモータとの組合せが、該宿主細胞染色体に対して非天然である、第３のポリヌクレオチドを含む。
別の態様では、宿主細胞染色体を含む原核宿主細胞中で、２つの鎖を含むポリペプチドを産生する方法が本明細書で提供され、該方法は、該宿主細胞を、該ポリペプチドの該２つの鎖の発現に適した条件下の培養培地中で、該ポリペプチドの該２つの鎖を発現するように培養し、それによって、発現すると、該２つの鎖は折り畳まれ、組み立てられて、該宿主細胞中で生物学的に活性なポリペプチドを形成すること、および（ｂ）該宿主細胞から該生物学的に活性なポリペプチドを回収することを含み、該宿主細胞は、（１）該ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド、（２）該ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、該第１および第２のポリヌクレオチドは、１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドの一部である）、（３）タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、該第３の翻訳単位は該宿主細胞染色体の一部であり、該第３の翻訳単位が、該宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ該第３の翻訳単位の転写を駆動する第１のプロモータと作動可能な組合せにあり、該第３の翻訳単位と該第１のプロモータとの組合せが、該宿主細胞染色体に対して非天然である、第３のポリヌクレオチド、および（４）ペプチジル－プロリルイソメラーゼをコードする第４の翻訳単位を含む第４のポリヌクレオチドであって、該第４の翻訳単位は該宿主細胞染色体の一部であり、該第４の翻訳単位が、該宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ該第４の翻訳単位の転写を駆動する第２のプロモータと作動可能な組合せにあり、該第４の翻訳単位と該第２のプロモータとの組合せが、該宿主細胞染色体に対して非天然である、第４のポリヌクレオチドを含む。
別の態様では、宿主細胞染色体を含む原核宿主細胞が本明細書で提供され、該原核宿主細胞は、（１）ペプチジル－プロリルイソメラーゼをコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチドであって、該第１の翻訳単位は該宿主細胞染色体の一部であり、該第１の翻訳単位が、該宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ該第１の翻訳単位の転写を駆動する第１のプロモータと作動可能な組合せにあり、該第１の翻訳単位と該第１のプロモータとの組合せが、該宿主細胞染色体に対して非天然である、第１のポリヌクレオチド、および（２）タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチドであって、該第２の翻訳単位は該宿主細胞染色体の一部であり、該第２の翻訳単位が、該宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ該第２の翻訳単位の転写を駆動する第２のプロモータと作動可能な組合せにあり、該第２の翻訳単位と該第２のプロモータとの組合せが、該宿主細胞染色体に対して非天然である、第２のポリヌクレオチドを含む。
Ｉ．定義
本開示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物または生物系に限定されず、言うまでもなく、変わり得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことも理解されたい。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別途内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの分子」への言及は、場合によっては、２つ以上のかかる分子の組合せなどを含む。
本明細書で使用される「約」という用語は、当業者であれば容易に理解する、それぞれの値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」の値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。値に関して本明細書で使用される「約」という用語は、最大でその値の９０％～１１０％を包含する（例えば、約１．０～約３．０の第１および第２のＴＩＲの相対的翻訳強度は、０．９～３．３の間の範囲にある相対的翻訳強度を指す）。
本明細書に記載の本開示の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む」、態様および実施形態「からなる」、および態様および実施形態「から本質的になる」を含むことを理解されたい。
本明細書で使用される「２つの鎖を含むポリペプチド」（「２鎖タンパク質」および「２鎖ポリペプチド」という用語も本明細書で互換的に使用され得る）という用語は、２つ以上の別個のポリペプチド鎖を含有する任意のポリペプチドを指すように意図される。いくつかの実施形態では、２鎖タンパク質は、ジスルフィド結合を含むが、これに限定されない、１つ以上の分子間連結を介して共に連結する２つ以上のポリペプチドの高分子複合体を含み得る。いくつかの実施形態では、２鎖タンパク質は、ポリペプチドリンカーによって連結された２つの別個のポリペプチド鎖（例えば、抗体重鎖および抗体軽鎖）に属するアミノ酸配列を有する、単一のポリペプチドを含み得る。この場合、２鎖タンパク質は、物理的には単一の鎖を表すが、単一の鎖の２つ以上の部分は、それらが２つの別個のタンパク質鎖であるかのように機能的に挙動し得る。例えば、一本鎖抗体は、機能的重鎖および機能的軽鎖を含んでもよく、これらの機能的重鎖および機能的軽鎖は、ポリペプチドリンカーによって接合されるが、それにもかかわらず、分子間連結（例えば、１つ以上のジスルフィド結合）によってのみ会合している別個のポリペプチドであるかのように折り畳まれ、組み立てられる。
１つ以上の遺伝要素（例えば、プロモータ、翻訳単位、またはそれらの組合せ）に関して、本明細書で使用される「天然」および「非天然」という用語は、自然界で発生する宿主細胞染色体中の遺伝要素のゲノム状況を指すことを意図している。例えば、翻訳単位は、翻訳単位が宿主細胞のゲノム中に天然に存在する場合、宿主細胞または宿主細胞染色体に関して「天然」であり、翻訳単位が宿主細胞のゲノム中に天然に存在しない場合、「非天然」である。プロモータは、プロモータが宿主細胞のゲノム中に天然に存在する場合、宿主細胞または宿主細胞染色体に関して「天然」であり、プロモータが宿主細胞のゲノム中に天然に存在しない場合、「非天然」である。プロモータと翻訳単位との作動可能な組合せは、プロモータが翻訳単位と同じ作動可能な連結で、宿主細胞のゲノム中に天然に存在しない場合、またはその逆の場合、「非天然」である。例えば、プロモータ：翻訳単位の組合せは、プロモータおよび翻訳単位の一方または両方が、宿主細胞ゲノム中に天然に存在しない場合、プロモータが、（たとえ、同じプロモータ配列が、宿主細胞ゲノム中のどこか他の場所に天然に存在する場合であっても）天然に存在する宿主細胞ゲノムにおいて作動可能に組み合わされていない翻訳単位と、作動可能に連結して宿主細胞ゲノムに存在する場合、または翻訳単位が、（たとえ、同じ翻訳単位が、宿主細胞ゲノム中のどこか他の場所に天然に存在する場合であっても）天然に存在する宿主細胞ゲノムにおいて作動可能に組み合わされていないプロモータと、作動可能に連結して宿主細胞ゲノムに存在する場合に、宿主細胞または宿主細胞染色体に関して「非天然」である。
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すように意図される。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは環状二本鎖ＤＮＡループを指し、これに追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る。ベクターの別の種類は、ファージベクターである。ベクターの別の種類は、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得る。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製することができる（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことができる。このようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単純に「組換えベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法において利用される発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、互換的に使用され得る。
「シストロン」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチド鎖および隣接する制御領域をコードするヌクレオチド配列を含む翻訳単位と広義で等しい遺伝要素を指すように意図される。「シストロン」は、例えば、１つ以上のオープンリーディングフレーム、翻訳開始領域（本明細書で以下において定義されるＴＩＲ）、シグナル配列、および終結領域を含み得る。
「多シストロン性」発現ベクターは、１つの単一プロモータの調節制御下にある複数のシストロンを含有してそれらを発現する単一のベクターを指す。多シストロン性ベクターの一般的な例は、１つのプロモータの制御下にある２つの異なるポリペプチドを含有してそれらを発現する「２シストロン性」ベクターである。２シストロン性または多シストロン性ベクターの発現の際、複数の遺伝子は、まず単一の転写単位として転写され、その後、別個に翻訳される。
「転写単位」は、単一のＲＮＡ転写産物として転写されるポリヌクレオチドを指す。「翻訳単位」は、ポリペプチドをコードし、翻訳時にポリペプチドを産生するポリヌクレオチドを指す。上記のように、多シストロン性ポリヌクレオチドは、複数の翻訳単位を有する単一の転写単位を含有し得る。
本開示に従う「別個のシストロン」発現ベクターは、少なくとも２つの別個のプロモータ－シストロン対を含む単一のベクターを指し、各シストロンは、それ自体のプロモータの制御下にある。別個のシストロン発現ベクターの発現の際、異なる遺伝子の転写プロセスおよび翻訳プロセスの両方は、別個の独立したものである。
本明細書で使用される「シャペロンタンパク質」は、２鎖タンパク質を含むが、これに限定されない、他の高分子の折畳みまたは組立てに役立つ任意のタンパク質を指す。一般に、シャペロンタンパク質は、多くの異なる機構によって、タンパク質の折畳みまたは組立てを促進するように作用し得る。例えば、シャペロンタンパク質は、タンパク質の折畳みおよび／または組立ての促進、鎖内ジスルフィド結合の形成の触媒、（例えば、凝集またはミスフォールドしたタンパク質または多タンパク質複合体の）タンパク質アンフォールディングおよび／または分解の促進、凝集の防止、タンパク質分解の支援などを行ってもよい。
「分泌シグナル配列」または「シグナル配列」は、新たに合成された目的のタンパク質を、細胞膜、通常は原核生物の内膜または内膜および外膜の両方を介して導くために使用することができる、短いシグナルペプチドをコードする核酸配列を指す。このように、免疫グロブリン軽鎖または重鎖ポリペプチドなどの目的のタンパク質は、原核宿主細胞のペリプラズム中または培養培地中に分泌される。分泌シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドは、宿主細胞に対して内因性であってもよく、またはそれらは外因性であってもよく、発現されるポリペプチドに対して天然のシグナルペプチドを含む。分泌シグナル配列は、典型的には、発現されるポリペプチドのアミノ末端に存在し、典型的には、生合成とポリペプチドの細胞質からの分泌との間で酵素的に除去される。したがって、シグナルペプチドは、通常、成熟タンパク質産物中には存在しない。
「作動可能に連結した」は、２つ以上の構成要素の並立を指し、そのように記述される構成要素は、それらがその意図される様式で機能することを可能にする関係にある。例えば、プロモータは、連結した配列の転写を制御または調節するためにシスにおいて作用する場合、コード配列または翻訳単位に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結される」ＤＮＡ配列は、必ずしも連続していなくてよいが、２つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合、または分泌リーダーの場合には、連続し、かつリーディングフレーム内にある。しかしながら、作動可能に連結したプロモータは、概して、コード配列または翻訳単位の上流に位置するが、必ずしもそれと連続していない。作動可能に連結されたエンハンサーは、プロモータから相当な距離を置いて、コード配列／翻訳単位の上流、その中、またはその下流に位置し得る。連結は、当技術分野で既知の組換え方法によって、例えば、ＰＣＲ法を使用して、アニーリングによって、または都合のよい制限酵素部位でのライゲーションによって、達成される。都合のよい制限酵素部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプタまたはリンカーが、慣行に従って使用される。
本明細書で使用される「調節エレメント」は、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリペプチドへの転写および翻訳に不可欠な、シスに存在するヌクレオチド配列を指す。転写調節エレメントは、通常、発現される遺伝子配列のプロモータ５’、転写開始および終結部位、ならびにポリアデニル化シグナル配列を含む。「転写開始部位」という用語は、一次転写産物、すなわち、ｍＲＮＡ前駆体に組み込まれる第１の核酸に対応する構築物中の核酸を指し、転写開始部位はプロモータ配列と重複し得る。
「プロモータ」は、それが作動可能に連結している遺伝子または配列の転写を制御するポリヌクレオチド配列を指す。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始のためのシグナルを含む。使用されるプロモータは、選択された配列の発現が企図される宿主細胞の細胞型において機能的である。多様な異なるソースに由来する構成的、誘導性、および抑制性プロモータを含む多数のプロモータが、当技術分野で周知であり（かつＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースにおいて特定され）、クローン化されたポリヌクレオチドとして、またはクローン化されたポリヌクレオチド内で（例えば、ＡＴＣＣなどの受託機関および他の商業的または個人的ソースから）利用可能である。誘導性プロモータについては、プロモータの活性が、シグナル、例えば、ＩＰＴＧの存在またはリン酸塩枯渇に応答して増加または減少する。
「宿主細胞」（または「組換え宿主細胞」）という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝的に改変されているか、または組換えプラスミドもしくはベクターなどの外因性もしくは非天然ポリヌクレオチドの導入よって遺伝的に改変されることができる細胞を指すように意図される。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫も指すように意図されることを理解されたい。変異または環境的影響のいずれかに起因して、後続の世代においてある特定の修飾が起こる場合があるため、かかる子孫は、実際には、親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。
「薬学的製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象に許容できないほどに有毒な追加の成分を含有しない調製物を指す。このような製剤は、無菌である。「薬学的に許容される」賦形剤（ビヒクル、添加剤）は、対象哺乳動物に適度に投与されて、用いられる有効用量の活性成分を提供することができるものである。
治療の目的のための「対象」または「個体」は、哺乳類に分類される任意の動物を指し、ヒト、家畜および農場動物、および動物園、スポーツ、またはペット動物、例えば犬、馬、猫、牛などを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を包含する。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から特定および分離され、かつ／または回収された抗体である。その自然環境の混入成分は、抗体の試験的、診断的、または治療的使用を妨害するであろう物質であり、それらとしては、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、抗体は、（１）例えば、ローリー法によって決定される、９５重量％超になるまで、いくつかの実施形態では、９９重量％超になるまで、（２）例えば、スピニングカップシークエネーターを使用して、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに充分な程度まで、または（３）例えば、クマシーブルーまたはシルバー染色を使用して、還元または非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均質性が得られるまで精製される。単離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイチュ抗体を含む。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製されることになる。
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖が１つのジスルフィド共有結合によって重鎖に連結される一方で、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重および軽鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後、いくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。
「定常ドメイン」という用語は、抗原結合部位を含有する可変ドメインである、免疫グロブリンの他の部分と比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン（集合的に、ＣＨ）、ならびに軽鎖のＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインを含有する。
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは、‘‘ＶＨ’’と称され得る。軽鎖の可変ドメインは、‘‘ＶＬ’’と称され得る。これらのドメインは、一般に、抗体の最も可変性の高い部分であり、抗原結合部位を含有する。
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分が、配列において抗体間で大きく異なり、かつ各特定の抗体の、その特定の抗原に対する結合および特異性において使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布してはいない。可変性は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方における超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、ベータシート構造を接続する、かついくつかの場合では、ベータシート構造の一部を形成する、ループを形成する３つのＨＶＲによって接続されたベータシート立体配置を主に採用する４つのＦＲ領域を含む。各鎖内のＨＶＲは、ＦＲ領域によって近接して互いに保持され、他方の鎖からのＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ、１９９１を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞毒性への関与などの様々なエフェクター機能を呈する。
任意の哺乳動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（「κ」）およびラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明らかに異なるタイプのうちの一方に割り当てられ得る。
本明細書で使用されるＩｇＧ「アイソタイプ」または「サブクラス」という用語は、それらの定常領域の化学的および抗原的特徴によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのうちのいずれかを意味する。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は、異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンの主な５つのクラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分かれ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、γ、ε、γ、およびμと呼ばれる。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成が周知であり、例えば、Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．、２０００）に一般的に記載されている。抗体は、抗体と１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有または非共有会合によって形成される、より大きい融合分子の一部であり得る。
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、および「全抗体」という用語は、以下で定義される抗体断片ではない、実質的にインタクトな形態の抗体を指すために、本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、具体的には、Ｆｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
本明細書における目的のための「裸抗体」は、細胞傷害性部分または放射標識にコンジュゲートされていない抗体である。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体断片は、抗原結合断片である。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
抗体のパパイン消化により、各々単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と、容易に結晶化するその能力を反映して命名された残りの「Ｆｃ」断片と呼ばれる、２つの同一の抗原結合断片が産生される。ペプシン処理は、Ｆ（ａｂ’）２断片をもたらし、これは、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。一実施形態では、二本鎖Ｆｖ種は、密接に非共有会合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖が二本鎖Ｆｖ種における構造に類似の「二量体」構造で会合し得るように、可動性ペプチドリンカーによって共有結合し得る。各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するのは、この立体配置においてである。集合的に、６つのＨＶＲが、抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、全結合部位よりも低い親和性ではあるが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＨＶＲを３つしか含まないＦｖの半分）でさえも、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖定常ドメインおよび第１の重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が、遊離チオール基を持つＦａｂ’に対する本明細書での呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして産生されたものであった。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖに関するレビューについては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４）、２６９～３１５頁を参照されたい。
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、これらの断片は（ＶＨ－ＶＬ）、同じポリペプチド鎖に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインは、別の鎖の相補的なドメインとペアリングさせられ、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９、１２９～１３４（２００３）、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４～６４４８（１９９３）において、より完全に記載されている。トリアボディおよびテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９～１３４（２００３）に記載されている。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、例えば、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な変異、例えば、天然に存在する変異を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。ある特定の実施形態では、このようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、該標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られたものである。例えば、この選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンから特有のクローンを選択することであり得る。選択された標的結合配列が、例えば、標的への親和性を改善し、標的結合配列をヒト化し、細胞培養物におけるその産生を改善し、インビボでのその免疫原性を低減し、多重特異性抗体を作製するなどのために、さらに改変されてもよく、改変された標的結合配列を含む抗体もまた、本開示のモノクローナル抗体でもあることを理解されたい。通常、異なる決定基（エピトープ）に対して指向する様々な抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、通常は他の免疫グロブリンによる混入がないという点で有利である。
「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、原核宿主細胞における発現を含む様々な技法、ハイブリドーマ法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５～９７（１９７５）、Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１４（３）：２５３～２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ５６３～６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４～６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１～５９７（１９９２）、Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９～３１０（２００４）、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３～１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１（３４）：１２４６７～１２４７２（２００４）、およびＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２８４（１～２）：１１９～１３２（２００４）を参照）、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部またはすべてを有する動物において、ヒトまたはヒト様抗体を産生するための技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３、ＷＯ１９９６／３４０９６、ＷＯ１９９６／３３７３５、ＷＯ１９９１／１０７４１、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ３６２：２５５～２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、および同第５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９～７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６～８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ３６８：８１２～８１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５～８５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）、ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５～９３（１９９５）を参照）によって作製され得る。
本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ抗体」、ならびにそれらが所望の生物学的活性を呈する限り、そのような抗体の断片を含む（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１、６８５１～６８５５（１９８４）を参照されたい）。キメラ抗体としては、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体が挙げられ、該抗体の抗原結合領域は、例えば、マカクザルを目的の抗原で免疫化することによって産生された抗体由来である。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性、および／または能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲ由来の残基によって置き換えられるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの修飾により、抗体の性能をさらに洗練させることができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には、２つの可変ドメインのうちの実質的にすべてを含み、超可変ループのうちのすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲのうちのすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体はまた、場合によっては、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２～５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３～３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３～５９６（１９９２）を参照されたい。また、例えば、ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５～１１５（１９９８）、Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ２３：１０３５～１０３８（１９９５）、ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８～４３３（１９９４）、ならびに米国特許第６，９８２，３２１号および同第７，０８７，４０９号も参照されたい。
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生され、かつ／または本明細書に開示されるヒト抗体を作製するための技法のうちのいずれかを使用して作製された抗体のアミノ酸配列に対応する、アミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外する。ヒト抗体は、ファージ・ディスプレイ・ライブラリを含む当技術分野で公知の様々な技法を使用して産生され得る。ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）。Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：（１）８６～９５（１９９１）に記載されている方法もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。ｖａｎ Ｄｉｊｋおよびｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５：３６８～７４（２００１）もまた、参照されたい。ヒト抗体は、抗原投与に応答してそのような抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、免疫化されたキセノマウス（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関して、米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号を参照）に抗原を投与することによって調製することができる。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により産生されるヒト抗体については、例えば、Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：３５５７～３５６２（２００６）を参照されたい。
「種依存性抗体」は、第２の哺乳動物種由来の抗原のホモログに対する結合親和性よりも、第１の哺乳類種由来の抗原に対して、より強い結合親和性を有する抗体である。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原に「特異的に」結合する（例えば、約１×１０－７Ｍ以下、好ましくは約１×１０－８Ｍ以下、好ましくは約１×１０－９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）が、ヒト抗原に対する結合親和性よりも少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い、第２の非ヒト哺乳動物種由来の抗原のホモログに対する結合親和性を有する。種依存性抗体は、上で定義される様々な種類の抗体のうちのいずれかであり得るが、好ましくは、ヒト化抗体またはヒト抗体である。
「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列が超可変性であり、かつ／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に、３つがＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。天然抗体では、Ｈ３およびＬ３が、６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示し、特にＨ３が抗体に優れた特異性を与える上で特有の役割を果たすと考えられている。例えば、Ｘｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：３７～４５（２０００）、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ２４８：１～２５（Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．、２００３）を参照されたい。実際に、重鎖のみからなる、天然に存在するラクダ抗体は、軽鎖の非存在下で機能的であり、安定している。例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ３６３：４４６～４４８（１９９３）、Ｓｈｅｒｉｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３～７３６（１９９６）を参照されたい。
いくつかのＨＶＲ説明が本明細書で使用され、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づくものであり、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））。代わりに、Ｃｈｏｔｈｉａは、構造的ループの位置を指す（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７（１９８７））。ＡｂＭ ＨＶＲは、ＫａｂａｔのＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａの構造的ループとの間の折衷物を表し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらＨＶＲの各々に由来する残基が、以下に示される。
Figure 2022506156000002
ＨＶＲは、以下の「伸長ＨＶＲ」を含み得る：ＶＬにおいて、２４～３６または２４～３４（Ｌ１）、４６～５６または５０～５６（Ｌ２）、および８９～９７または８９～９６（Ｌ３）、ならびにＶＨにおいて、２６～３５（Ｈ１）、５０～６５または４９～６５（Ｈ２）、および９３～１０２、９４～１０２、または９５～１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々について、Ｋａｂａｔら（上記参照）に従って付番される。
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
「Ｋａｂａｔにおけるような可変ドメイン残基付番」または「Ｋａｂａｔにおけるようなアミノ酸位置付番」という用語、およびそれらの変形は、Ｋａｂａｔら（上記参照）における抗体の編集物の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される付番システムを指す。この付番システムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮、またはそれへの挿入に対応する、より少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔ付番は、所与の抗体に対して、「標準の」Ｋａｂａｔによって付番された配列を有する抗体の配列の相同領域での整列によって決定され得る。
Ｋａｂａｔ付番システムは一般に、可変ドメイン（およそ軽鎖の残基１～１０７および重鎖の残基１～１１３）中の残基に言及するときに使用される（例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵ付番システム」または「ＥＵインデックス」は、一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域における残基について言及するときに使用される（例えば、Ｋａｂａｔら（上記参照）で報告されるＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基付番を指す。
「直鎖状抗体」という表現は、Ｚａｐａｔａら（１９９５Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ、８（１０）：１０５７～１０６２）に記載されている抗体を指す。簡潔には、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
ＩＩ．宿主細胞
プロモータと翻訳単位との組合せが宿主細胞または宿主細胞染色体に対して非天然であるように、少なくとも１つのシャペロンタンパク質（例えば、ペプチジル－プロリルイソメラーゼまたはタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ）をコードする翻訳単位であって、該翻訳単位の転写を駆動するプロモータ（宿主細胞染色体の一部でもある）と作動可能な組合せにあるか、または連結されている、翻訳単位を含む、宿主細胞染色体を有する宿主細胞（例えば、原核宿主細胞）が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞染色体は、（１）ペプチジル－プロリルイソメラーゼをコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド、（２）タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチドを含み、該第１および第２の翻訳単位が該宿主細胞染色体の一部であり、該第１および第２の翻訳単位それぞれの転写を駆動する第１および第２の（それぞれの）プロモータ（また、該宿主細胞染色体の一部である）と作動可能な組合せにあるか、または連結されている。いくつかの実施形態では、第１の翻訳単位と第１のプロモータとの組合せおよび／または第２の翻訳単位と第２のプロモータとの組合せは、宿主細胞染色体に対して非天然である。例えば、プロモータの一方もしくは両方は、宿主細胞染色体に対して非天然であり得るか、翻訳単位の一方もしくは両方は、宿主細胞染色体に対して非天然であり得るか、または翻訳単位の一方もしくは両方は、宿主細胞染色体に対して天然であるが、宿主細胞染色体に対して非天然である組合せでプロモータと作動可能に組み合わされ得る。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本開示の２鎖ポリペプチドの２つ以上の鎖をコードする１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、（１）本開示の２鎖ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド、（２）本開示の２鎖ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチド、および（３）シャペロンタンパク質（例えば、ペプチジル－プロリルイソメラーゼまたはタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ）をコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、該第３の翻訳単位の転写を駆動するプロモータと作動可能な組合せにある、第３のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第３の翻訳単位とプロモータとの組合せは、宿主細胞染色体に対して非天然である。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチド（すなわち、それぞれ第１および第２の翻訳単位をコードする）は、１つ以上の染色体外ポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）の一部であり、第３のポリヌクレオチド（および関連するプロモータ）は、宿主細胞染色体の一部である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、（１）本開示の２鎖ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド、（２）本開示の２鎖ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチド、（３）タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、該第３の翻訳単位の転写を駆動するプロモータと作動可能な組合せにある、第３のポリヌクレオチド、および（４）ペプチジル－プロリルイソメラーゼをコードする第４の翻訳単位を含む第４のポリヌクレオチドであって、該第４の翻訳単位の転写を駆動するプロモータと作動可能な組合せにある、第４のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第３の翻訳単位とその関連するプロモータとの組合せおよび／または第４の翻訳単位とその関連するプロモータとの組合せは、宿主細胞染色体に対して非天然である。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチド（すなわち、それぞれ第１および第２の翻訳単位をコードする）は、１つ以上の染色体外ポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）の一部であり、第３および第４のポリヌクレオチド（および関連するプロモータ）は、宿主細胞染色体の一部である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、（１）本開示の２鎖ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド、（２）本開示の２鎖ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチド、（３）タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、該第３の翻訳単位の転写を駆動する第１のプロモータと作動可能な組合せにある、第３のポリヌクレオチド、および（４）タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第４の翻訳単位を含む第４のポリヌクレオチドであって、該第４の翻訳単位の転写を駆動する第２のプロモータと作動可能な組合せにある、第４のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第３の翻訳単位と第１のプロモータとの組合せおよび／または第４の翻訳単位と第２のプロモータとの組合せは、宿主細胞染色体に対して非天然である。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチド（すなわち、それぞれ第１および第２の翻訳単位をコードする）は、１つ以上の染色体外ポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）の一部であり、第３および第４のポリヌクレオチド（および関連するプロモータ）は、宿主細胞染色体の一部である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、（１）本開示の２鎖ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド、（２）本開示の２鎖ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチド、（３）タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、該第３の翻訳単位の転写を駆動する第１のプロモータと作動可能な組合せにある、第３のポリヌクレオチド、（４）ペプチジル－プロリルイソメラーゼをコードする第４の翻訳単位を含む第４のポリヌクレオチドであって、該第４の翻訳単位の転写を駆動する第２のプロモータと作動可能に組合せにある、第４のポリヌクレオチド、および（５）タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第５の翻訳単位を含む第５のポリヌクレオチドであって、該第５の翻訳単位の転写を駆動する第３のプロモータと作動可能な組合せにある、第５のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第３の翻訳単位と第１のプロモータとの組合せ、第４の翻訳単位と第２のプロモータとの組合せ、および／または第５の翻訳単位と第３のプロモータとの組合せは、宿主細胞染色体に対して非天然である。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチド（すなわち、それぞれ第１および第２の翻訳単位をコードする）は、１つ以上の染色体外ポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）の一部であり、第３、第４、および第５のポリヌクレオチド（および関連するプロモータ）は、宿主細胞染色体の一部である。
いくつかの実施形態では、シャペロンタンパク質（例えば、ペプチジル－プロリルイソメラーゼまたはタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ）をコードする、本開示のポリヌクレオチドまたは翻訳単位は、宿主細胞染色体に対して天然である。例えば、シャペロンタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドまたは翻訳単位は、天然のシャペロンタンパク質遺伝子または遺伝子座であり得る。いくつかの実施形態では、プロモータは、天然シャペロンタンパク質遺伝子または遺伝子座と作動可能な組合せになるように宿主細胞ゲノムに（例えば、１つ以上の天然の調節配列または遺伝要素への挿入またはその置換によって）挿入され、宿主細胞染色体に対して非天然であるプロモータ：翻訳単位の組合せを生成する。
他の実施形態では、シャペロンタンパク質（例えば、ペプチジル－プロリルイソメラーゼまたはタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ）をコードする、本開示のポリヌクレオチドまたは翻訳単位は、宿主細胞（例えば、染色体的に組み込まれた宿主細胞）に対して非天然である。
いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞染色体は、本開示のシャペロンタンパク質をコードする１つ以上の天然の翻訳単位と、本開示のシャペロンタンパク質をコードする１つ以上の非天然の翻訳単位とを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞染色体は、本開示のシャペロンタンパク質をコードする複数の非天然の翻訳単位を含み得る。さらに、本開示の宿主細胞の多くは、複数のシャペロンタンパク質（例えば、大腸菌のＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、およびＤｓｂＣ）をコードする宿主細胞染色体を含むことが公知である。いくつかの実施形態では、本開示のシャペロンタンパク質をコードする１つ以上の天然の翻訳単位は、宿主細胞または宿主細胞染色体に対して非天然である組合せで、本開示のプロモータと作動可能に組み合わされる。
本開示のポリヌクレオチドまたは翻訳単位を宿主細胞（例えば、原核宿主細胞）に導入する方法は、当技術分野で公知である。例示的な方法である、対立遺伝子交換は、以下により詳細に記載されている。有利なことには、対立遺伝子交換方法は、宿主細胞ゲノム上に「傷」を残さない。他の方法としては、Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．およびＷａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：６６４０～６６４５に記載されている方法が挙げられるが、これに限定されない。
上記実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、宿主細胞は、本開示の２鎖ポリペプチドの第３の鎖をコードする翻訳単位をさらに含む。いくつかの実施形態では、翻訳単位は、２鎖ポリペプチドの第１および／または第２の鎖をコードする染色体外ポリヌクレオチドの一部である。例えば、いくつかの実施形態では、２鎖ポリペプチドは、生物学的に活性な一価抗体（例えば、抗原に特異的に結合することができる一価抗体）を形成するように組立てられる、例えば、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、および免疫グロブリンＦｃ断片を含む１アーム抗体である。
シャペロンタンパク質
本開示のある特定の態様は、シャペロンタンパク質に関する。シャペロンタンパク質は、２鎖タンパク質を含むが、これに限定されない、他の高分子の折畳みまたは組立てに役立つ任意のタンパク質を指し得る。シャペロンタンパク質の例としては、ペプチジル－プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、および熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、およびＨｓｐ１００タンパク質など）を挙げることができるが、これらに限定されない。シャペロンタンパク質はまた、タンパク質を膜を通して輸送すること、例えば、原形質膜または小胞体膜を通したポリペプチド鎖の転座に役立ち得る。
いくつかの実施形態では、シャペロンタンパク質は、ペプチジル－プロリルイソメラーゼであり得る。ペプチジル－プロリルイソメラーゼ（「プロリルイソメラーゼ」、「ロタマーゼ」、および「ＰＰｉａｓｅ」という用語が、本明細書で互換的に使用され得る）は、プロリンまたはプロリル－イミノペプチド結合のシスおよびトランス異性体の相互変換を触媒する任意の酵素を指し得る。この反応のＥＣ番号は、ＥＣ５．２．１．８である。このＥＣ番号によって表される反応を触媒することが知られるまたは予測される任意のタンパク質は、本開示のペプチジル－プロリルイソメラーゼであり得る。ペプチジル－プロリルイソメラーゼ活性はまた、ＧＯ：０００３７５５というＧＯタームＩＤによって表され得る。このＧＯタームＩＤによって表される分子機能を保有することが知られるまたは予測される任意のタンパク質は、本開示のペプチジル－プロリルイソメラーゼであり得る。
ペプチジル－プロリルイソメラーゼ活性は、タンパク質の折畳みおよび組立てを促進することが当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ペプチジル－プロリルイソメラーゼは、適切に折り畳まれた構造がシスプロリル結合を含むタンパク質について、トランスプロリル結合をシスプロリル結合に変換することで、タンパク質の折畳みおよび組立てに役立ち得る。いくつかのペプチジル－プロリルイソメラーゼはまた、シスプロリル結合を欠くタンパク質の折畳みおよび組立てを向上させることも公知である（Ｂｏｔｈｍａｎｎ ＨおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ ２０００ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００）。いくつかの実施形態では、ペプチジル－プロリルイソメラーゼは、シスプロリル結合を欠くタンパク質のタンパク質の折畳みおよび組立てに役立ち得る。したがって、ペプチジル－プロリルイソメラーゼ活性は、本明細書に記載の方法に有用であるシャペロンタンパク質を特定するための機能的特徴として機能し得るが、ペプチジル－プロリルイソメラーゼの有用性は、その触媒活性自体に必ずしも限定されない。
いくつかの実施形態では、ペプチジル－プロリルイソメラーゼは、ＦｋｐＡタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＦｋｐＡタンパク質は、大腸菌ＦｋｐＡである。大腸菌ＦｋｐＡは、大腸菌種に属する細菌の任意の株または単離株におけるｆｋｐＡ遺伝子によってコードされる任意のポリペプチドを指し得る。いくつかの実施形態では、大腸菌ＦｋｐＡは、ＥｃｏＧｅｎｅ受託番号ＥＧ１２９００によって表されるｆｋｐＡ遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、大腸菌ＦｋｐＡは、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿４１７８０６によって表される配列を有するタンパク質を指す。
他のＦｋｐＡタンパク質が、当技術分野で公知である。ＦｋｐＡタンパク質の例としては、限定されないが、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉペプチジル－プロリルイソメラーゼ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０００８３８２５２）、Ｃ．ｙｏｕｎｇａｅペプチジル－プロリルイソメラーゼ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿００６６８７３６６）、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａペプチジル－プロリルイソメラーゼ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿００４１２５９４３）、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａペプチジル－プロリルイソメラーゼ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＷＰ＿０００８３８２３３）、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅペプチジル－プロリルイソメラーゼ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０１９７０４６４２）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＰＲ３ｐ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０１３６３７）、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｆｋｐｂ１ａ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０３２０４５）、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｆｋｐｂ２（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０３２０４６）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ ＦＫＢＰ２（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００１１２８６８０）、およびＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４７１５（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿６５０１０１）が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、本開示のＦｋｐＡタンパク質は、大腸菌ＦｋｐＡに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、シャペロンタンパク質は、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼであり得る。タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ（「タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ」および「チオール－ジスルフィドイソメラーゼ」という用語が、本明細書で互換的に使用され得る）は、タンパク質におけるジスルフィド結合の再構成を触媒する任意の酵素を指し得る。例えば、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、システインの酸化を触媒して、タンパク質におけるジスルフィド結合を形成し得る。タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼはまた、タンパク質における不対合ジスルフィド結合の異性化を触媒し得る。この反応のＥＣ番号は、ＥＣ５．３．４．１である。このＥＣ番号によって表される反応を触媒することが知られるまたは予測される任意のタンパク質は、本開示のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼであり得る。タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ活性はまた、ＧＯ：００１５０３５というＧＯタームＩＤによって表され得る。このＧＯタームＩＤによって表される分子機能を保有することが知られるまたは予測される任意のタンパク質は、本開示のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼであり得る。
タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ活性は、タンパク質の折畳みおよび組立てを促進することが当技術分野で公知である。例えば、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ活性は、タンパク質の折畳みおよび組立て中に適切な分子内および分子間ジスルフィド結合の形成を促進する。特に、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ活性は、原核細胞のペリプラズムにおいて発現されるジスルフィド結合を有するタンパク質にとって重要である。
いくつかの実施形態では、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、ＤｓｂＡタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＡタンパク質は、大腸菌ＤｓｂＡである。大腸菌ＤｓｂＡは、大腸菌種に属する細菌の任意の株または単離株におけるｄｓｂＡ遺伝子によってコードされる任意のポリペプチドを指し得る。いくつかの実施形態では、大腸菌ＤｓｂＡは、ＥｃｏＧｅｎｅ受託番号ＥＧ１１２９７によって表されるｄｓｂＡ遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、大腸菌ＤｓｂＡは、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿４１８２９７によって表される配列を有するタンパク質を指す。
他のＤｓｂＡタンパク質が、当技術分野で公知である。ＤｓｂＡタンパク質の例としては、限定されないが、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉチオール－ジスルフィドイソメラーゼ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０００７２５３３５）、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅチオール－ジスルフィドイソメラーゼ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０００７２５３４８）、Ｃ．ｙｏｕｎｇａｅチオール－ジスルフィドイソメラーゼ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿００６６８６１０８）、およびＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａチオール－ジスルフィドイソメラーゼ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０２３２４０５８４）が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、本開示のＤｓｂＡタンパク質は、大腸菌ＤｓｂＡに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、ＤｓｂＣタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＤｓｂＣタンパク質は、大腸菌ＤｓｂＣである。大腸菌ＤｓｂＣは、大腸菌種に属する細菌の任意の株または単離株におけるｄｓｂＣ遺伝子によってコードされる任意のポリペプチドを指し得る。いくつかの実施形態では、大腸菌ＤｓｂＣは、ＥｃｏＧｅｎｅ受託番号ＥＧ１１０７０によって表されるｄｓｂＣ遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、大腸菌ＤｓｂＣは、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿４１７３６９によって表される配列を有するタンパク質を指す。
他のＤｓｂＣタンパク質が、当技術分野で公知である。ＤｓｂＣタンパク質の例としては、限定されないが、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０００７１５２０６）、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０００７１５２０９）、Ｅ．ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０００７１５２２５）、Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉチオール：ジスルフィド交換タンパク質ＤｓｂＣ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０２０８４５１６１）、およびＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａタンパク質ジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＣ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０２３１８３５１５）が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、本開示のＤｓｂＣタンパク質は、大腸菌ＤｓｂＣに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、最適な整列のためにギャップを第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入し得、比較目的で非相同配列を無視し得る）。一実施形態では、比較目的で整列させた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも５０％、典型的には少なくとも７５％、さらにより典型的には少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にある、アミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、それら分子は、その位置にて同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と等しい）。
２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数、および該２つの配列の最適な整列のために導入されることを必要とする各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列として機能し、これと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブシーケンス座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することができ、または代替的なパラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。同一性について２つの配列を比較する場合、配列が連続している必要はないが、いずれのギャップも、全体的な同一性パーセントを減少させ得るペナルティを持ち得る。ｂｌａｓｔｎについては、デフォルトのパラメータは、ギャップ隙間ペナルティが５、ギャップ延長ペナルティが２である。ｂｌａｓｔｐについては、デフォルトのパラメータは、ギャップ隙間ペナルティが１１、ギャップ延長ペナルティが１である。
「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用される場合、２０～６００、通常は約５０～約２００、さらに通常は約１００～約１５０からなる群から選択される連続する位置の数のうちのいずれか１つのセグメントへの言及を含み、この中で、配列が、２つの配列を最適に整列させた後で、同じ数の連続する位置の参照配列と比較する。比較のための配列整列方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適な整列は、公知のアルゴリズムを使用して（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ、２：４８２，１９８１のローカル相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、４８：４４３、１９７０の相同性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８５：２４４４、１９８８の類似性方法の調査によって、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））における、アルゴリズムＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡのコンピュータ化された実装によって、または手動の整列および目視検査によって実施することができる。
配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの好ましい例は、ＦＡＳＴＡアルゴリズム（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８５：２４４４、１９８８、ならびにＰｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、２６６：２２７～２５８、１９９６）である。同一性パーセントを算出するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＡ整列において使用される好ましいパラメータを最適化する。ＢＬ５０マトリックス１５：－５、ｋタプル＝２、ジョイニングペナルティ＝４０、最適化＝２８、ギャップペナルティ－１２、ギャップ長さペナルティ＝－２、および幅＝１６。
配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである（それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２５：３３８９～３４０２、１９７７およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２１５：４０３～４１０、１９９０）。本明細書に記載のパラメータを用い、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を使用して、本開示の核酸およびタンパク質についての配列同一性パーセントを決定する。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトを介して一般に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列における同じ長さのワードと整列するときに、何らかの正値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たす、問い合わせ配列における長さの短いワードＷを特定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を特定することを伴う。Ｔは、近傍のワードスコア閾値と称される。これらの最初の近傍のワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すために検索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、累積整列スコアが増加することができる限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチする残基の対に対するリワードスコア；常に０超）およびＮ（ミスマッチの残基に対するペナルティスコア；常に０未満）を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコア化マトリックスを使用して累積スコアを算出する。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積整列スコアが、その最大の実績値から量Ｘだけ減少する場合、累積スコアが、１つ以上の負のスコアの残基整列の蓄積に起因してゼロ以下になる場合、またはいずれかの配列の終端に達する場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較をデフォルトで使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長３、および期待値（Ｅ）１０、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９：１０９１５，１９８９）整列（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較をデフォルトで使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を実施する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０：５８７３～５７８７、１９９３を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の１つの測定は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こり得る確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸とを比較した際の最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、参照配列に類似していると見なされる。
有用なアルゴリズムの別の例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関係および配列同一性パーセントを示すために、進歩的な対整列を使用して、関係する配列の群から複数の配列整列を創出する。これはまた、整列を創出するために使用されるクラスター関係を示す系図または樹状図をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、公開されている方法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１～１５３、１９８９）に類似した方法を用いる進歩的整列方法の単純化を使用する（ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ、３５：３５１～３６０、１９８７）。プログラムは、最大で３００配列を整列させることができ、各々のヌクレオチドまたはアミノ酸の最大長は５，０００である。複数整列の手順は、２つの最も類似した配列の対整列から開始し、２つの整列した配列のクラスタを生成する。次いで、このクラスタを、次に最も関係のある配列または整列した配列のクラスタに整列させる。配列の２つのクラスタを、２つの個々の配列の対整列の単純な延長によって整列させる。最後の整列は、一連の進歩的な対整列によって達成される。プログラムは、特定の配列およびそのアミノ酸またはヌクレオチド座標を配列比較の領域に対して示すこと、ならびにプログラムパラメータを示すことによって実行される。ＰＩＬＥＵＰを使用して、参照配列を他の試験配列と比較して、以下のパラメータを使用して配列同一性パーセントの関係を決定する：デフォルトのギャップ重み（３．００）、デフォルトのギャップ長重み（０．１０）、および重み付き端部ギャップ。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ、例えば、バージョン７．０（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、１２：３８７～３９５、１９８４）から得ることができる。
複数のＤＮＡおよびアミノ酸配列整列に好適なアルゴリズムの別の好ましい例は、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ、２２：４６７３～４６８０、１９９４）。ＣＬＵＳＴＡＬＷは、配列群間の複数の対比較を実行し、相同性に基づき、それらを整理して複数整列にする。ギャップ隙間ペナルティおよびギャップ延長ペナルティは、それぞれ、１０および０．０５であった。アミノ酸整列については、ＢＬＯＳＵＭアルゴリズムをタンパク質重み付けマトリックスとして使用することができる（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９：１０９１５～１０９１９，１９９２）。
プロモータ
発現ベクターおよびクローニングベクターは、一般に、宿主生物によって認識され、かつ抗体をコードする核酸に作動可能に連結されるプロモータを含有する。原核宿主との使用に好適なプロモータとしては、ｐｈｏＡプロモータ、β－ラクタマーゼおよびラクトースプロモータ系、アルカリホスファターゼプロモータ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系、ならびにｔａｃプロモータなどのハイブリッドプロモータが挙げられる。しかしながら、他の公知の細菌性プロモータも好適である。細菌系で使用するためのプロモータは、抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結されるＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有することになる。上述のように、プロモータは、宿主細胞または宿主細胞染色体に対して非天然であるプロモータ：翻訳単位の組合せを生成するために、翻訳単位（例えば、本開示のシャペロンタンパク質をコードするものなどの天然の翻訳単位）と作動可能な組合せで、宿主細胞染色体に挿入することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のプロモータは、誘導性プロモータである。誘導性プロモータの活性は、シグナルに応答して増加または減少する。例えば、誘導性プロモータは、ＩＰＴＧなどのシグナルの存在に応答して、転写を促進し得る。誘導性プロモータは、リン酸塩などのシグナルの不在に応答して、転写を促進し得る。これらのシナリオのいずれにおいても、転写の量は、シグナルの量またはその欠如に比例する場合も、しない場合もある。原核宿主細胞に好適な誘導性プロモータの多数の例が、当技術分野で公知である。これらには、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏ、ｒｅｃＡ、ｔｅｔＡ、ｎａｒ、ファージＰＬ、ｃｓｐＡ、Ｔ７、およびＰＢＡＤプロモータが含まれ得るが、これらに限定されない（より詳細な説明については、Ｔｅｒｐｅ Ｋ．、２００６ Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２：２１１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、誘導性プロモータの複数のコピーを使用して、例えば、ＤｓｂＣおよびＦｋｐＡなどのシャペロンタンパク質をコードする別個の翻訳単位の発現を協調的に駆動する。
いくつかの実施形態では、誘導性プロモータは、ＩＰＴＧ誘導性プロモータである。ＩＰＴＧ誘導性プロモータは、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、またはｌａｃオペロンからの転写を促進することができる任意の他のラクトース誘導体（例えば、アロラクトース）に応答する様式で、転写を促進する任意のポリヌクレオチド配列を指し得る。ＩＰＴＧ誘導性プロモータの多くの例が当技術分野で公知であり、これらの例としては、ｔａｃ（例えば、ｔａｃＩ、ｔａｃＩＩなど）プロモータ、ｌａｃプロモータ、およびこれらの誘導体（例えば、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃｌａｃなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、誘導性プロモータは、培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、翻訳単位の転写を駆動するｐｈｏプロモータである。ｐｈｏプロモータは、細胞外リン酸塩（例えば、無機リン酸塩）に応答する様式で、転写を促進する任意のポリヌクレオチド配列を指し得る。例えば、大腸菌におけるリン酸塩（Ｐｈｏ）レギュロンは、細胞外リン酸塩を感知し、リン酸塩レベルに応答してＰｈｏプロモータを介して多数の下流遺伝子の発現を調節するタンパク質成分を含む（より詳細な説明については、Ｈｓｉｅｈ ＹＪおよびＷａｎｎｅｒ ＢＬ ２０１０ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３（２）：１９８を参照されたい）。細菌を培養培地中で増殖させる場合、このＰｈｏレギュロンの発現は、リン酸塩（例えば、無機リン酸塩、Ｐｉ）が培地中で得られるときに抑制され、リン酸塩が枯渇したときに誘導されることが公知である。本明細書に記載の方法において使用されるｐｈｏプロモータの１つの非限定的な例は、大腸菌ｐｈｏＡプロモータである。このプロモータは広く知られており、原核宿主細胞における組換えタンパク質発現を、細胞培養培地中のリン酸塩濃度に依存する様式で調節するために、当技術分野で使用される（より詳細な説明については、Ｌｕｂｋｅ Ｃら、１９９５ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１０）：９２３を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本開示のプロモータは、構成的プロモータである。構成的プロモータの活性は、宿主細胞が増殖する条件（例えば、栄養条件、細胞密度など）の変動にかかわらず、一定レベルの遺伝子発現を保持すると考えられている。例えば、構成的プロモータの活性は、１つ以上の転写因子の活性または発現ではなく、ＲＮＡポリメラーゼの利用可能性に依存し得る。いくつかの実施形態では、プロモータは、合成プロモータまたは天然に存在しないプロモータである。ある範囲の原核宿主細胞に適した例示的な構成的プロモータは、例えば、Ｊｅｎｓｅｎ ＰＲ、Ｈａｍｍｅｒ Ｋ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９８、６４：８２～８７に記載されている。いくつかの実施形態では、構成的プロモータは、ＣＰ２５プロモータである。
本明細書に記載されているように、本開示の宿主細胞染色体は、本開示のシャペロンタンパク質をコードする翻訳単位と作動可能に連結されたまたは組み合わされたプロモータの複数の非天然の組合せを含むことができる。異なる種類のプロモータが、任意の数または組合せで宿主細胞染色体に挿入され得る。例えば、いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞染色体は、誘導性プロモータ（例えば、本開示のシャペロンタンパク質をコードする翻訳単位と作動可能に組み合わされる）および構成的プロモータ（例えば、本開示のシャペロンタンパク質をコードする異なる翻訳単位と作動可能に組み合わされる）を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞染色体は、本開示のシャペロンタンパク質をコードする翻訳単位と作動可能に組み合わされた本開示の誘導性プロモータ、および本開示のシャペロンタンパク質をコードする異なる翻訳単位と作動可能に連結された本開示の構成的プロモータを含み、該プロモータ：翻訳単位の両方の組合せは、宿主細胞または宿主細胞染色体に対して非天然である。
いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞染色体は、本開示のシャペロンタンパク質をコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＰｈｏプロモータ、および本開示のシャペロンタンパク質をコードする異なる翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＣＰ２５プロモータを含む。いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞染色体は、本開示のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＰｈｏプロモータ、および本開示のペプチジル－プロリルイソメラーゼをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＣＰ２５プロモータを含む。いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞染色体は、ＤｓｂＣをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＰｈｏプロモータ、およびＦｋｐＡをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＣＰ２５プロモータを含む。いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞染色体は、大腸菌ＤｓｂＣをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＰｈｏプロモータ、および大腸菌ＦｋｐＡをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＣＰ２５プロモータを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は大腸菌であり、ＤｓｂＣおよびＦｋｐＡをコードする翻訳単位は天然である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本開示の２鎖ポリペプチドの２つ以上のポリペプチド鎖をコードする２つ以上の翻訳単位を含む１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞染色体は、本開示のシャペロンタンパク質をコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＰｈｏプロモータ、および本開示のシャペロンタンパク質をコードする異なる翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＰｈｏプロモータを含む。いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞染色体は、本開示のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＰｈｏプロモータ、および本開示のペプチジル－プロリルイソメラーゼをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＰｈｏプロモータを含む。いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞染色体は、ＤｓｂＣをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＰｈｏプロモータ、およびＦｋｐＡをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＰｈｏプロモータを含む。いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞染色体は、大腸菌ＤｓｂＣをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＰｈｏプロモータ、および大腸菌ＦｋｐＡをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＰｈｏプロモータを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は大腸菌であり、ＤｓｂＣおよびＦｋｐＡをコードする翻訳単位は天然である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本開示の２鎖ポリペプチドの２つ以上のポリペプチド鎖をコードする２つ以上の翻訳単位を含む１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞染色体は、本開示のシャペロンタンパク質をコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のｔａｃプロモータ、本開示のシャペロンタンパク質をコードする第２の翻訳単位と作動可能に連結された本開示のｔａｃプロモータ、および本開示のシャペロンタンパク質をコードする第３の翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＣＰ２５プロモータを含む。いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞染色体は、本開示のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のｔａｃプロモータ、本開示のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第２の翻訳単位と作動可能に連結された本開示のｔａｃプロモータ、および本開示のペプチジル－プロリルイソメラーゼをコードする第３の翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＣＰ２５プロモータを含む。いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞染色体は、ＤｓｂＣをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のｔａｃプロモータ、ＤｓｂＡをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のｔａｃプロモータ、およびＦｋｐＡをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＣＰ２５プロモータを含む。いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞染色体は、大腸菌ＤｓｂＣをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のｔａｃプロモータ、大腸菌ＤｓｂＡをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のｔａｃプロモータ、および大腸菌ＦｋｐＡをコードする翻訳単位と作動可能に連結された本開示のＣＰ２５プロモータを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は大腸菌であり、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＡ、およびＦｋｐＡをコードする翻訳単位は天然である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本開示の２鎖ポリペプチドの２つ以上のポリペプチド鎖をコードする２つ以上の翻訳単位を含む１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドをさらに含む。
染色体外ポリヌクレオチドおよび発現ベクター
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、（１）本開示の２鎖ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド、および（２）該２鎖ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドの一部である。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、同じ染色体外ポリヌクレオチドの一部である。いくつかの実施形態では、染色体外ポリヌクレオチド（複数可）は、２鎖ポリペプチドの第３の鎖をコードする第３の翻訳単位をさらに含む。いくつかの実施形態では、染色体外ポリヌクレオチド（複数可）は、１つ以上の発現ベクターまたはプラスミドを含む。
いくつかの実施形態では、２鎖ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位および２鎖ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位は、単一の染色体外ポリヌクレオチド（例えば、プラスミドまたは他の発現ベクター）の一部である。いくつかの実施形態では、２鎖ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位および２鎖ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位は、別個の染色体外ポリヌクレオチド（例えば、プラスミドまたは他の発現ベクター）から発現される。
いくつかの実施形態では、染色体外ポリヌクレオチド（複数可）は、選択可能マーカー（例えば、選択可能マーカータンパク質をコードする翻訳単位）をさらに含む。選択可能マーカーは、細胞が、選択、すなわち、選択可能マーカーを欠く細胞（複数可）の存在量と比較して、選択可能マーカーを保有する細胞（複数可）の存在量を選択的に増加させるために使用される任意の条件に曝露されるとき、宿主細胞の生存を促進するタンパク質をコードする任意のポリヌクレオチドを指し得る。典型的な選択マーカーは、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンへの耐性を与えるか、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するか、または（ｃ）複合培地から得ることができない必須の栄養素を供給する（例えば、Ｂａｃｉｌｌｉに対するＤ－アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）、タンパク質をコードする。多数の選択可能マーカー、および単一の抗生物質を有する対応する選択剤が、当技術分野で公知である。例えば、限定しないが、多くの選択可能マーカーおよび対応する抗生物質が、Ｊａｎｇ ＣＷおよびＭａｇｎｕｓｏｎ Ｔ ２０１３ ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（２）：ｅ５７０７５において記載され、引用されている。いくつかの実施形態では、選択可能マーカーは、宿主細胞のゲノム内に存在する遺伝子欠失を補う遺伝子（例えば、プラスミドから発現される遺伝子）を指し得る。これらの例では、細胞を選択するとき（すなわち、宿主ゲノムから欠失した遺伝子の活性を必要とする条件下での増殖）、プラスミドによって供給される遺伝子のコピーが、宿主ゲノムの欠損を補い、それによって外因性相補遺伝子を保有する細胞（複数可）を選択する。このような遺伝子としては、細胞培地において欠乏している特定の栄養素を生成するために必要とされる栄養要求性マーカーまたは遺伝子を挙げることができ、これらの例は、本明細書でさらに記載されている。いくつかの例示的な選択可能マーカーおよび抗生物質を、本明細書でさらに記載する。
いくつかの実施形態では、選択可能マーカーは、選択剤に対する耐性を促進し、培養培地は、宿主細胞にポリヌクレオチドを保持させるための選択剤を含む。いくつかの実施形態では、選択剤は、抗生物質である。選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を停止する薬物を利用する。異種遺伝子での形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を産生して、したがって、選択レジメンで生き残る。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸、およびハイグロマイシンを使用する。
別の選択スキームは、遺伝子産物が特定の培養培地における増殖に不可欠である遺伝子を除去する、染色体欠失を有する原核宿主細胞を使用する。これらの例では、宿主細胞の染色体欠失を補う異種遺伝子による形質転換に成功した細胞は、特定の培養培地における増殖時に生存することになる。このスキームにおいて有用な遺伝子の例としては、栄養要求性マーカー遺伝子、または宿主細胞を特定の培養培地において増殖させるときに必須の栄養素を産生するために必要とされる他の遺伝子を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、染色体外ポリヌクレオチド（複数可）は、原核宿主細胞中で染色体外発現ベクターを複製するのに適した複製起点をさらに含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、宿主染色体ＤＮＡから独立してベクターの複製を可能にするものであり、これらとしては、複製起点または自己複製配列が挙げられる。このような配列は、多様な原核宿主細胞について周知である。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に好適である。
原核宿主細胞において使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有し得る。原核細胞において、終結因子は、Ｒｈｏ依存性またはＲｈｏ非依存性終結因子を含んでもよい。原核宿主細胞において有用な終結因子の一例としては、λｔ０終結因子が挙げられるが、これに限定されない（ＳｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋおよびＧｒｏｓｓｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３１８５、１９８７）。
本開示の抗体は、直接的にだけではなく、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え的に産生され得、この異種ポリペプチドは、好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端にて特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識およびプロセシング（例えば、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。天然抗体シグナル配列を認識もプロセシングもしない原核宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核シグナル配列によって置換される。
組換えポリペプチド
本開示のある特定の態様は、２鎖ポリペプチドを産生する方法に関する。有利なことには、本明細書に記載の方法は、多くの様々な種類のタンパク質、特に、上記のような２鎖タンパク質などのジスルフィド結合を有するものの発現、折畳み、および組立てを促進するのに有用であり得る。特定の２鎖タンパク質を以下に記載するが、本明細書に記載の方法は、これらの特定の実施形態に限定されない。本明細書で使用される場合、２鎖タンパク質は、２つを超える別個のポリペプチド鎖を含有するタンパク質を含み得る。本明細書に記載の多くの実施形態は、２つのポリペプチド鎖を含む２鎖タンパク質に関するが、２つを超えるポリペプチド鎖（例えば、３つ以上のポリペプチド）を有する２鎖タンパク質が企図され、本明細書に記載の方法によって産生されてもよい。上記のように、そうでなければ、２つの別個のポリペプチド鎖（例えば、一本鎖抗体、一本鎖可変断片など）である場合に会合する、単一のポリペプチド鎖からなる２鎖タンパク質もまた企図され、本明細書に記載の方法によって産生され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の２鎖ポリペプチドの２つの鎖は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに連結される。ジスルフィド結合は、２つのチオール基を連結している任意の共有結合を指し得る。ポリペプチドにおけるジスルフィド結合は、典型的には、システイン残基のチオール基の間で形成する。ポリペプチドジスルフィド結合は、本開示の２鎖タンパク質などの多くのポリペプチドの折畳みおよび組立てに重要であることが、当技術分野で公知である。ポリペプチドジスルフィド結合は、単一のポリペプチド鎖におけるシステイン残基間のジスルフィド結合（すなわち、分子内または鎖内ジスルフィド結合）を含み得る。ポリペプチドジスルフィド結合はまた、別個のポリペプチド鎖上で見出されるシステイン残基間のジスルフィド結合（すなわち、分子間または鎖間ジスルフィド結合）を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、２鎖ポリペプチドの２つの鎖は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに連結される。
ジスルフィド結合は、抗体および抗体断片の折畳みおよび組立てに重要であることが、当技術分野で公知である。異なる抗体同位体、および同位体内の異なるサブクラスは、異なるパターンのジスルフィド結合を保有することが知られている。例えば、ＩｇＧ抗体は、特定のＩｇＧサブクラスに応じて、鎖内ジスルフィド結合を１２個、各軽鎖とその対応する重鎖との間の鎖間ジスルフィド結合を１個、重鎖間の鎖間ジスルフィド結合を２～１１個含有し得る（より詳細な説明については、Ｌｉｕ ＨおよびＭａｙ Ｋ ２０１２ ＭＡｂｓ．４（１）：１７を参照されたい）。ＩｇＭ（例えば、Ｗｉｅｒｓｍａ ＥＪおよびＳｈｕｌｍａｎ ＭＪ １９９５ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（１０）：５２６５を参照）、ＩｇＥ（例えば、Ｈｅｌｍ ＢＡら １９９１ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１（６）：１５４３を参照）、ＩｇＡ（例えば、Ｃｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕ ＫＲら ２００２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９（９）：５０７２を参照）、およびＩｇＤ（例えば、Ｓｈｉｎ ＳＵら １９９２ Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３（２）：６５を参照）はまた、折畳みおよび組立て中にジスルフィド結合を形成することが公知である。
いくつかの実施形態では、本開示の２鎖ポリペプチドは、宿主細胞に対して異種である。本明細書で使用される場合、宿主細胞に関連して使用される場合の異種ポリペプチドは、宿主細胞（すなわち、宿主細胞が自然から単離される場合）において内因的に発現されない任意のポリペプチドを指し得る。異種ポリペプチドはまた、宿主細胞によって内因的に発現され得るが、宿主細胞が自然から単離される場合とは異なる調節の下で発現されるポリペプチドを指し得る。異なる調節の例としては、異なる発現の量、異なる刺激に応答した発現、または誘導性プロモータなどの異種プロモータの使用によるなど、任意の他の改変された発現の量を挙げることができるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示の２鎖ポリペプチドは、ヘテロ二量体のモノマーである。本明細書で使用される場合、ヘテロ二量体は、作動可能に連結している、２つの別個のポリペプチドまたはポリペプチド複合体を含有する任意のポリペプチド複合体を指し得る。ヘテロ二量体の非限定的な例は、２つの別個の抗体モノマーで構成される二重特異性または二価抗体（すなわち、作動可能に連結している軽鎖－重鎖対）である。この例では、第１の抗原を認識する第１の重鎖－軽鎖対の折畳みおよび組立ては、第１の抗体モノマーを生成する。第２の抗原を認識する第２の重鎖－軽鎖対の折畳みおよび組立ては、第２の抗体モノマーを生成する。これらのモノマーは、当技術分野で公知である任意の手段（二重特異性抗体に関して以下でより詳細に記載されている）によって組み立てられて、ヘテロ二量体を形成し得る。ヘテロ二量体抗体形成の例示に関するさらなる詳細については、Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢＢら １９９６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（７）：６１７を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本開示の２鎖ポリペプチドは、第１の鎖および第２の鎖が免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖に相当する一価抗体である。本明細書で使用される場合、一価抗体は、共に作動可能に連結して重鎖－軽鎖対を形成する抗体重鎖および抗体軽鎖から作製される任意のポリペプチド複合体を指してもよく、これにおいて、重鎖－軽鎖対は、第２の重鎖－軽鎖対に対して作動可能に連結されない。「半抗体（ｈＡｂ）」という用語が、本明細書では互換的に使用され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の一価抗体は、抗原に特異的に結合することができる。本明細書で使用される場合、「結合する」、「特異的に結合する」、または「～に特異的である」という用語は、標的と（すなわち、生体分子を含む不均一な分子集団の存在下での標的の存在を決定する抗体と）の間の結合などの測定可能かつ再現可能な相互作用を指す。例えば、標的（エピトープであり得る）に結合するか、またはそれに特異的に結合する抗体は、この標的に、他の標的に結合するよりも高い親和性で、結合力で、より容易に、かつ／またはより長期間結合する抗体である。一実施形態では、抗体が無関係の標的に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される、抗体の標的への結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、標的に特異的に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗体は、異なる種由来のタンパク質間で保存されるタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。別の実施形態では、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、それを必要としない。
いくつかの実施形態では、本開示の２鎖ポリペプチドは、分泌タンパク質である。本明細書で使用される場合、分泌タンパク質は、宿主細胞によって宿主細胞ペリプラズムまたは細胞外環境に分泌される任意のタンパク質を指し得る。分泌タンパク質は、宿主細胞によって内因的に分泌されるタンパク質であってもよく、または分泌タンパク質は、宿主細胞によって内因的に分泌はされないが、その分泌を促進するような方法で修飾されるタンパク質であってもよい。例えば、典型的にはポリペプチドのＮ末端で見出されるシグナル配列の存在により、ポリペプチドが分泌のための分泌経路に導かれ得る。多数のシグナル配列が当技術分野で公知であり、分泌タンパク質の分泌を促進するため、または宿主細胞によって自然に分泌されないタンパク質の分泌を可能にするために有用であり得る。例えば、Ｐｉｃｋｅｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４２：２６９～２７５（１９８３）、ＳｉｍｍｏｎｓおよびＹａｎｓｕｒａ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：６２９～６３４（１９９６）、ならびにＨｕｍｐｈｒｅｙｓ ＤＰら ２０００ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２０（２）：２５２を参照されたい。シグナル配列の１つの非限定的な例は、熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列である。
いくつかの実施形態では、本開示の分泌タンパク質は、宿主細胞のペリプラズムから回収される。ペリプラズムは、グラム陰性細菌細胞の内膜または細胞膜と外膜との間の空間を指すことが、当技術分野で公知である。理論に拘束されることを望むものではないが、ペリプラズムは、ジスルフィド結合の形成に適した酸化環境であると考えられる。したがって、ジスルフィド結合を、その適切に折り畳まれ、組み立てられた構造の一部として有するポリペプチド（例えば、本開示の２鎖タンパク質）をペリプラズムに局在させることが有利であり得る（より詳細な説明については、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ Ｍら ２００６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１９（８）：３８５を参照されたい）。
ペリプラズムタンパク質を回収するための多数の方法が、当技術分野で公知である。ペリプラズムタンパク質の大規模な精製の１つの非限定的な例は、欧州特許ＥＰ１３５６０５２ Ｂ１において記載されている（例えば、実施例４を参照されたい）。ペリプラズムタンパク質は、スフェロプラスト調製物から、ペリプラズム画分を抽出することによって回収され得る（例えば、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ Ｍら２００６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１９（８）：３８５を参照されたい）。ペリプラズム抽出物が生成されると、ペリプラズムタンパク質は、当技術分野で公知の任意の標準的なタンパク質精製技法、例えば、アフィニティ精製、クロマトグラフィなどによって精製され得る。
宿主細胞
本開示のある特定の態様は、原核宿主細胞に関する。本明細書のベクターにＤＮＡをクローニングまたは発現させるために適した原核生物としては、真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、エンテロバクター科、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、大腸菌、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢａｃｉｌｌｉ、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日に公表のＤＤ２６６，７１０において開示されたＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４１Ｐ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが挙げられる。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉＢ、Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などの他の株も好適である。これらの例は、限定するものではなく、例証するものである。
いくつかの実施形態では、原核宿主細胞は、グラム陰性細菌である。グラム陰性細菌は、グラム染色によって検出されるペプチドグリカン層を取り囲む外膜を含む任意の細菌を指す。多くのグラム陰性細菌宿主細胞が、当技術分野で公知である。例えば、グラム陰性細菌は、これらに限定されないが、アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、ガンマプロテオバクテリア、ゼータプロテオバクテリア、イプシロンプロテオバクテリア、デルタプロテオバクテリア、およびアキドバクテリアなどのプロテオバクテリア、シアノバクテリア、ならびにスピロヘータを含むことが公知である。周知のグラム陰性細菌には、エシェリヒア属、サルモネラ属、シゲラ属、シュードモナス属、ヘリオバクター属、レジオネラ属、ナイセリア属、およびクレブシエラ属などの属の種が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、本開示のグラム陰性細菌は、大腸菌である。本明細書で使用される場合、大腸菌は、大腸菌種に属する細菌の任意の株または単離株を指し得る。大腸菌は、自然発生株、または変異もしくは本明細書に記載のプラスミドによる形質転換などによって遺伝的に修飾された株を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本開示の大腸菌は、内因性プロテアーゼ活性を欠く株のものである。理論に拘束されることを望むものではないが、いくつかの内因性プロテアーゼは、組換えによって発現された基質に対する活性を有するため、内因性プロテアーゼ活性を欠く株は、本開示のペリプラズムタンパク質などの組換えタンパク質の産生の向上を可能にし得ると考えられる（１つのこのような例については、Ｂａｎｅｙｘ ＦおよびＧｅｏｒｇｉｕ Ｇ １９９０ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２（１）：４９１を参照されたい）。内因性プロテアーゼ活性を欠く株は、内因性プロテアーゼをコードする遺伝子が、変異、欠失、そうでなければ不活性化している株を含んでもよい。このような遺伝子の例としては、ｄｅｇＰ、ｐｒｃ、およびｏｍｐＴを挙げることができるが、これらに限定されない。多種多様な原核宿主細胞（例えば、内因性プロテアーゼ活性を欠く株を操作するため）に変異を導入する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓｎｙｄｅｒ Ｌら２０１３ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ 第４版ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。ある特定の実施形態では、本開示の大腸菌は、ｄｅｇｐＳ２１０Ａ変異を有する株のものである。
いくつかの実施形態では、本開示の大腸菌は、増強されたＬａｃＩ産生または活性を有する株のものである。例示的なＬａｃＩタンパク質の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ受託番号Ｐ０３０２３によって表される。ある特定の実施形態では、大腸菌は、ｌａｃＩＱ変異（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ－Ｈｉｌｌ，Ｂ．ら（１９６８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５９：１２５９～１２６４を参照）を有する株である。この変異は、ｌａｃオペロンのＬａｃＩリプレッサーの過剰産生をもたらすことが知られている。
ある特定の実施形態では、本開示の大腸菌は、ΔｆｈｕＡ ΔｐｈｏＡ ｉｌｖＧ２０９６（ＩｌｖＧ＋、Ｖａｌｒ）Δｐｒｃ ｓｐｒ４３Ｈ１ ΔｍａｎＡ ｌａｃＩＱ ΔｏｍｐＴ ΔｍｅｎＥ７４２ ｄｅｇＰＳ２１０Ａ株のものである。
抗体および抗体断片
本明細書に記載の２鎖タンパク質は、当技術分野で公知である任意の好適な技法によって調製され得る。２鎖タンパク質の１つの例示的なクラスは、抗体である。以下に記載されているように、抗体は、抗体を生成するために当技術分野で利用可能な技法を使用して調製され、その例示的な方法は、以下のセクションにおいてより詳細に記載されている。当業者は、以下に記載の方法の多くが、抗体以外の２鎖タンパク質に適用され得ることを認識するであろう。
抗体は、目的の抗原（例えば、かつ非限定的に、ＰＤ－Ｌ１（ヒトＰＤ－Ｌ１など）、ＨＥＲ２、またはＣＤ３（ヒトＣＤ３など）、ＩＬ１３、ＩＬ４、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＡ、およびＶＥＧＦ）に対して指向する。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、障害に罹患している哺乳動物への抗体の投与により、その哺乳動物に治療的利益がもたらされ得る。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、インターロイキン－１３（本明細書においてＩＬ－１３またはＩＬ１３と称される）に対して指向する。例えば、抗体は、ＩＬ１３に対する一価抗体もしくは「半抗体」、ＩＬ１３に対する２つの一価の重鎖－軽鎖対を含む完全抗体（例えば、２つの同一の一価の重鎖－軽鎖対、ＩＬ１３の同一のエピトープを認識する異なるＨＶＲまたはＣＤＲをそれぞれ含む、２つの一価の重鎖－軽鎖対、またはＩＬ１３の非重複または部分的に重複するエピトープを認識する異なるＨＶＲまたはＣＤＲをそれぞれ含む、２つの一価重鎖－軽鎖対）、またはＩＬ１３に対する重鎖－軽鎖対および異なる抗原に対する重鎖－軽鎖対を含む二重特異性抗体であり得る。
ＩＬ１３ポリペプチドの例は、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＩＬ１３ポリペプチドは、ヒトＩＬ１３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＩＬ１３ポリペプチドは、ＩＬ１３の前駆体形態である。ＩＬ１３ポリペプチドの前駆体形態の非限定的な例は、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ３５２２５．２によって表されるようなヒトＩＬ１３前駆体である。いくつかの実施形態では、ＩＬ１３ポリペプチドは、配列：
ＭＡＬＬＬＴＴＶＩＡ ＬＴＣＬＧＧＦＡＳＰ ＧＰＶＰＰＳＴＡＬＲＥＬＩＥＥＬ ＶＮＩＴＱＮＱＫＡＰ ＬＣＮＧＳＭＶＷＳＩ ＮＬＴＡＧＭＹＣＡＡ ＬＥＳＬＩＮＶＳＧＣ ＳＡＩＥＫＴＱＲＭＬ ＳＧＦＣＰＨＫＶＳＡ ＧＱＦＳＳＬＨＶＲＤ ＴＫＩＥＶＡＱＦＶＫ ＤＬＬＬＨＬＫＫＬＦ ＲＥＧＲＦＮ（配列番号１）を含む。
他の実施形態では、ＩＬ１３は、ＩＬ１３の成熟形態（例えば、シグナル配列を欠く）である。いくつかの実施形態では、ＩＬ１３ポリペプチドは、配列：
ＳＰＧＰＶＰＰＳＴＡＬＲ ＥＬＩＥＥＬＶＮＩＴ ＱＮＱＫＡＰＬＣＮＧ ＳＭＶＷＳＩＮＬＴＡ ＧＭＹＣＡＡＬＥＳＬ ＩＮＶＳＧＣＳＡＩＥ ＫＴＱＲＭＬＳＧＦＣ ＰＨＫＶＳＡＧＱＦＳ ＳＬＨＶＲＤＴＫＩＥ ＶＡＱＦＶＫＤＬＬＬ ＨＬＫＫＬＦＲＥＧＲ ＦＮ（配列番号２）を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む抗ＩＬ１３抗体が、本明細書で提供され、
（ａ）
（ａ）該重鎖可変ドメインは、ＡＹＳＶＮ（配列番号５）、ＭＩＷＧＤＧＫＩＶＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号６）、およびＤＧＹＹＰＹＡＭＤＮ（配列番号７）に対して、それぞれ、少なくとも８５％の配列同一性を有する、ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２、およびＨＶＲ－Ｈ３配列を含み、かつ／または、
（ｂ）
（ｂ）該軽鎖可変ドメインは、ＲＡＳＫＳＶＤＳＹＧＮＳＦＭＨ（配列番号８）、ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号９）、およびＱＱＮＮＥＤＰＲＴ（配列番号１０）に対して、それぞれ、少なくとも８５％の配列同一性を有する、ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２、およびＨＶＲ－Ｌ３配列を含む。
特定の態様では、配列同一性は、参照配列と比較して、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。
いくつかの実施形態では、抗ＩＬ１３抗体は、配列番号３の重鎖可変ドメイン配列および／または配列番号４の軽鎖可変ドメイン配列を含む。なおさらなる実施形態では、重鎖配列および／または軽鎖配列を含む、単離された抗ＩＬ１３抗体が提供され、
（ａ）（ａ）該重鎖可変ドメイン配列は、以下の参照重鎖配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し：
（ｂ）ＥＶＴＬＲＥＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＡＹＳＶＮＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＭＩＷＧＤＧＫＩＶＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＧＤＧＹＹＰＹＡＭＤＮＷＧＱＧＳＬＶＴＶＳＳ（配列番号３）
（ｃ）（ｂ）該軽鎖可変ドメイン配列は、以下の参照軽鎖配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する：
（ｄ）ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＳＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＫＳＶＤＳＹＧＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＬＡＳＮＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＮＮＥＤＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号４）。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、インターロイキン－３３（本明細書においてＩＬ－３３またはＩＬ３３と称される）に対して指向する。例えば、抗体は、ＩＬ３３に対する一価抗体もしくは「半抗体」、ＩＬ３３に対する２つの一価の重鎖－軽鎖対を含む完全抗体（例えば、２つの同一の一価の重鎖－軽鎖対、ＩＬ３３の同一のエピトープを認識する異なるＨＶＲまたはＣＤＲをそれぞれ含む、２つの一価重鎖－軽鎖対、またはＩＬ３３の非重複または部分的に重複するエピトープを認識する異なるＨＶＲまたはＣＤＲをそれぞれ含む、２つの一価重鎖－軽鎖対）、またはＩＬ３３に対する重鎖－軽鎖対および異なる抗原に対する重鎖－軽鎖対を含む二重特異性抗体であり得る。
ＩＬ３３の様々なアイソフォームが、公知である。例えば、ヒトＩＬ３３アイソフォームとしては、例えば、限定されないが、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＡＯＺ２６４９５、ＡＤＲ７７８２８、ＡＡＨ４７０８５、ＮＰ＿２５４２７４、ＮＰ＿００１１８６５６９、ＮＰ＿００１３００９７７、ＮＰ＿００１３４０７３１、ＮＰ＿００１３００９７５、ＮＰ＿００１３００９７６、およびＸＰ＿０６８７０７７４によって表されるものが挙げられる。
一態様では、多重特異性抗体が提供され、該抗体は、第１の一価または半抗体および第２の一価または半抗体を含み、該第１の半抗体は、ＩＬ－３３に結合する第１のＶＨ／ＶＬユニットを含み、該第２の半抗体は、ＩＬ－１３に結合する第２のＶＨ／ＶＬユニットを含む。
例示的な抗ＩＬ３３抗体（抗ＩＬ３３／抗ＩＬ１３二重特異性抗体を含む）のＨＶＲおよび可変ドメイン配列は、例えば、ＷＯ２０１６０７７３８１に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体のＣＨ３および／またはＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ２Ａサブタイプ、ＩｇＧ２Ｂサブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ、またはＩｇＧ４サブタイプ）に由来する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体のＣＨ３および／またはＣＨ２ドメインは、１つ以上のノブ形成変異またはホール形成変異（例えば、下記の表２に記載されている変異など）を含み得る。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体のＣＨ３および／またはＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ４サブタイプに由来する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体のＩｇＧ４ ＣＨ３および／またはＣＨ２ドメインは、限定されないが、Ｓ２２８Ｐ変異（ＥＵ付番）を含む１つ以上の追加の変異を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、以下により詳細に考察されるように、抗体断片である。本明細書で使用される場合、抗体断片は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、および抗体断片から形成した多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１アーム抗体である。いくつかの実施形態では、１アーム抗体は、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、および免疫グロブリンＦｃ断片を含み、該３つの鎖は折り畳まれ、組み立てられて、生物学的に活性な一価抗体を形成する。例示的かつ非限定的な１アーム抗体オナルツズマブ（例えば、ＭｅｔＭＡｂ）の説明については、例えば、Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ｍ．ら（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１０：Ｅ ２９８７～Ｅ２９９６を参照されたい。
抗体特性
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、１μＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
一実施形態では、Ｋｄは、以下のアッセイにより説明されるように、目的の抗体のＦａｂバージョンおよびその抗原を用いて行われる放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、非標識抗原の滴定系の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原によりＦａｂを平衡化し、次いで、結合した抗原を抗Ｆａｂ抗体でコーティングしたプレートで捕捉することによって測定する（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９３：８６５～８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍＬの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで２～５時間、室温（およそ２３℃）でブロッキングする。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）中、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を、目的のＦａｂの段階希釈液と混合する。次いで、目的のＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションをより長い期間（例えば、約６５時間）続けて、平衡に達することを保証してもよい。その後、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために混合物を捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、プレートを、ＰＢＳ中の０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ－２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートを１０分間、ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）上で計数する。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイでの使用のために選択する。
別の実施形態によると、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、２５℃で、約１０の応答ユニット（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示に従って、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を、ｐＨ４．８の１０ｍＭの酢酸ナトリウムによって、５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈した後、５μｌ／分の流速でインジェクトし、カップリングされたタンパク質のおよそ１０応答ユニット（ＲＵ）を達成する。抗原のインジェクション後、１Ｍのエタノールアミンをインジェクトして、未反応基をブロックする。キネティクス測定のために、Ｆａｂ（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）の２倍段階希釈物（０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳ中）を、２５℃で、およそ２５μＬ／分の流速でインジェクトする。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して、会合および解離センサグラムを同時にフィッティングすることによって、計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９３：８６５～８８１（１９９９）を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる会合速度が、１０６Ｍ－１ｓ－１を超える場合、会合速度は、ストップトフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを有する８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定されるように、増加する抗原濃度の存在下、２５℃で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０ｎＭ抗－抗原抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）の増加または減少を測定する蛍光消光技法を使用して決定することができる。
（ｉ）抗原調製
場合によっては、他の分子にコンジュゲートされる可溶性抗原またはその断片は、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。受容体などの膜貫通分子に対しては、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）が、免疫原として使用され得る。代替的に、膜貫通分子を発現する細胞が、免疫原として使用され得る。このような細胞は、自然源（例えば、がん細胞株）由来であり得るか、または膜貫通分子を発現するように組換え技法によって形質転換された細胞であり得る。抗体の調製に有用な他の抗原およびその形態は、当業者には明らかであろう。
（ｉｉ）ある特定の抗体に基づく方法
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって、動物中で産生される。二官能性剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は、異なるアルキル基である）を使用して、関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤にコンジュゲートさせることが有用であり得る。
動物は、例えば、タンパク質またはコンジュゲート（ウサギまたはマウスの場合、それぞれ１００μｇまたは５μｇ）を、フロイントの完全アジュバント３容量と組み合わせ、溶液を複数の部位で皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫化される。１ヶ月後、動物を、複数の部位での皮下注射によって、フロイントの完全アジュバント中の元々の量の１／５～１／１０のペプチドまたはコンジュゲートで追加免疫する。７～１４日後、動物から採血し、血清を抗体価についてアッセイする。力価がプラトー状態になるまで、動物を追加免疫する。好ましくは、動物を、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なるタンパク質にコンジュゲートしたものおよび／または異なる架橋試薬によりコンジュゲートしたもので追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク質融合物として組換え細胞培養で作製することもできる。ミョウバンなどの凝集剤も免疫応答を増強するために、好適に使用される。
本開示のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載され、例えば、Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１４（３）：２５３～２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）にさらに記載されているハイブリドーマ法、ヒト－ヒトハイブリドーマについては、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ５６３～６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）、およびＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ２６（４）：２６５～２６８（２００６）を用いて作製することができる。追加の方法としては、ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒト天然ＩｇＭ抗体の産生について、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号に記載の方法が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、ＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０（３）：９２７～９３７（２００５）、ならびにＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２７（３）：１８５～９１（２００５）に記載されている。所望のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマから単離されると、それらをコードするポリヌクレオチドを、原核発現ベクターへとサブクローニングすることができ、本明細書に記載の方法のいずれかによって、原核宿主細胞中で発現させることで抗体を産生することができる。
（ｉｉｉ）ライブラリ由来抗体
本開示の抗体を、コンビナトリアルライブラリを所望の活性（複数可）を有する抗体についてスクリーニングすることによって、単離することができる。例えば、実施例３に記載の方法などのファージ・ディスプレイ・ライブラリを作製し、かつ所望の結合特性を有する抗体についてかかるライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当技術分野で公知である。追加の方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７８：１～３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００１）でレビューされ、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２～５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４～６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１～５９７（１９９２）、ＭａｒｋｓおよびＢｒａｄｂｕｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８：１６１～１７５（Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３）、Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３３８（２）：２９９～３１０（２００４）、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３４０（５）：１０７３～１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１（３４）：１２４６７～１２４７２（２００４）、ならびにＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８４（１～２）：１１９～１３２（２００４）でさらに説明されている。
ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングされ、ファージライブラリ中でランダムに再結合され、次いで、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３～４５５（１９９４）に記載されているように抗原結合ファージのスクリーニングを行うことができる。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、またはＦａｂ断片としてのいずれかで、抗体断片を提示する。免疫化源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブレパートリは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ Ｊ、１２：７２５～７３４（１９９３）によって記載されているように、免疫化を行わずに、広範囲の非自己抗原および自己抗原にも対する抗体の単一供給源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブライブラリは、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１～３８８（１９９２）に記載されているように、高度に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞から再構成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダムな配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリについて記載する特許公報としては、例えば：米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、および同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書ではヒト抗体またはヒト抗体断片とみなされる。
（ｉｖ）キメラ、ヒト化、およびヒト抗体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１～６８５５（１９８４）に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類由来の可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが、親抗体のそれから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
ある特定の実施形態では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減させる一方で、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持するようにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体由来であり、かつＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列由来である、１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、場合によっては、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復、または改善するように、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９～１６３３（２００８）でレビューされ、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３～３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９～１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、および同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：２５～３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフトの記載）、Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９～４９８（１９９１）（「リサーフェシング」の記載）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：４３～６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」の記載）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：６１～６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８３：２５２～２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングの「ガイド付き選択」アプローチの記載）にさらに記載されている。
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域としては、限定されないが、「ベストフィット」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２２９６（１９９３）を参照）、軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）、およびＰｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３（１９９３）を参照）、ヒト成熟（体細胞性変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞フレームワーク領域（例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．、１３：１６１９～１６３３（２００８）を参照）、ならびにＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：１０６７８～１０６８４（１９９７）およびＲｏｓｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：２２６１１～２２６１８（１９９６）を参照）が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を使用して産生され得る。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋおよびｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８～７４（２００１）およびＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０～４５９（２００８）に記載されている。ヒト抗体は、例えば、かつ非限定的に、本明細書に記載の方法のいずれかによって、原核宿主細胞中で原核発現ベクターから発現させることによって作製することができる。
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージ・ディスプレイ・ライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することができる。次いで、かかる可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせられ得る。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技法を、以下に記載する。
（ｖ）抗体断片
抗体断片は、酵素消化などの従来の手段または組換え技法によって生成され得る。ある特定の状況下では、全抗体ではなく抗体断片を使用する利点がある。より小さいサイズの断片により、迅速なクリアランスが可能になり、固形腫瘍へのアクセスの改善がもたらされ得る。ある特定の抗体断片のレビューについては、Ｈｕｄｓｏｎら（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９～１３４を参照されたい。
抗体断片を産生するために、様々な技法が開発されている。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解を介して得られていた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ２４：１０７～１１７（１９９２）、およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌中で発現され、大腸菌から分泌され得るため、これらの断片の容易な大量生産が可能である。抗体断片を、上記の抗体ファージライブラリから単離することができる。代替的に、Ｆａｂ’－ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収され、化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６３～１６７（１９９２））。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ’）２断片を、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加した、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片については、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片を産生するための他の技法は、当業者に明らかであろう。ある特定の実施形態では、抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号、および同第５，５８７，４５８号を参照されたい。ＦｖおよびｓｃＦｖは、定常領域を欠くインタクトな結合部位を有する唯一の種であり、それゆえに、それらは、インビボでの使用中の非特異的結合の低減に好適であり得る。ｓｃＦｖ融合タンパク質を構築して、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでのエフェクタータンパク質の融合をもたらすことができる。上記のＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編を参照されたい。抗体断片はまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているように、「直鎖状抗体」であり得る。このような直鎖状抗体は、単一特異性または二重特異性であり得る。
（ｖｉ）多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有し、これらのエピトープは、通常、異なる抗原由来である。このような分子は、通常、２つの異なるエピトープ（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）のみに結合するが、三重特異性抗体などのさらなる特異性を有する抗体は、本明細書で使用される場合、この表現に包含される。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製され得る。
二重特異性抗体の作製方法は、当技術分野で公知である。全長二重特異性抗体の従来の産生は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づき、これらの２つの鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７～５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな分類のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり、これらのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティクロマトグラフィ工程によって行われる、この正しい分子の精製は、いくらか煩わしく、産物収率は低い。同様の手順は、ＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０：３６５５～３６５９（１９９１）に記載されている。
二重特異性抗体を作製するための当技術分野で公知の１つのアプローチは、「ノブ・イントゥー・ホール」または「突起イントゥーキャビティ」アプローチである（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）。このアプローチでは、２つの免疫グロブリンポリペプチド（例えば、重鎖ポリペプチド）がそれぞれ、界面を含む。一方の免疫グロブリンポリペプチドの界面が、他方の免疫グロブリンポリペプチドの対応する界面と相互作用し、それによって、２つの免疫グロブリンポリペプチドの会合を可能にする。これらの界面を、一方の免疫グロブリンポリペプチドの界面に位置する「ノブ」または「突起」（これらの用語は、本明細書で互換的に使用され得る）が、他方の免疫グロブリンポリペプチドの界面に位置する「ホール」または「キャビティ」（これらの用語は、本明細書で互換的に使用され得る）に対応するように操作することができる。いくつかの実施形態では、ホールは、ノブと同一または同様のサイズのものであり、２つの界面が相互作用するときに、一方の界面のノブが他方の界面の対応するホール内に位置付け可能であるように好適に位置付けられる。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、ヘテロ多量体を安定させ、かつ他の種、例えば、ホモ多量体よりもヘテロ多量体の形成に適していると考えられる。いくつかの実施形態では、このアプローチを使用して、２つの異なる免疫グロブリンポリペプチドのヘテロ多量体化を促進し、異なるエピトープに対する結合特異性を有する２つの免疫グロブリンポリペプチドを含む二重特異性抗体を作製することができる。
いくつかの実施形態では、ノブは、小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖で置き換えることによって構築され得る。いくつかの実施形態では、ホールは、大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖で置き換えることによって構築され得る。ノブまたはホールは、元々の界面に存在し得るか、または合成的に導入され得る。例えば、ノブまたはホールは、界面をコードする核酸配列を改変し、少なくとも１つの「元々の」アミノ酸残基を少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基で置き換えることによって合成的に導入され得る。核酸配列を改変するための方法としては、当技術分野で周知の標準的な分子生物学的技法が挙げられ得る。様々なアミノ酸残基の側鎖体積を、以下の表に示す。いくつかの実施形態では、元々の残基は、小さい側鎖体積（例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、またはバリン）を有し、ノブを形成するための移入残基は、天然に存在するアミノ酸であり、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを含み得る。いくつかの実施形態では、元々の残基は、大きい側鎖体積（例えば、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン）を有し、ホールを形成するための移入残基は、天然に存在するアミノ酸であり、アラニン、セリン、トレオニン、およびバリンを含み得る。
Figure 2022506156000003
ａアミノ酸の分子量は、水の分子量を差し引いたものである。Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ、第４３版、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、１９６１からの値。
ｂＡ．Ａ．Ｚａｍｙａｔｎｉｎ、Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：１０７～１２３、１９７２からの値。
ｃＣ．Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：１～１４、１９７５からの値。アクセス可能な表面積は、この参考文献の図６～図２０に定義されている。
いくつかの実施形態では、ノブまたはホールを形成するための元々の残基は、ヘテロ多量体の三次元構造に基づき、特定される。当技術分野で公知の三次元構造を得るための技法としては、Ｘ線結晶学およびＮＭＲが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、界面は、免疫グロブリン定常ドメインのＣＨ３ドメインである。これらの実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３／ＣＨ３界面は、４つの逆平行β鎖上に位置する各ドメイン上の１６残基が関与する。理論に拘束されることを望むものではないが、変異した残基は、好ましくは、ノブがパートナーＣＨ３ドメイン中の補償ホールではなく、周囲の溶媒によって収容され得るリスクを最小限に抑えるように、２つの中央の逆平行β鎖上に位置する。いくつかの実施形態では、２つの免疫グロブリンポリペプチド中の対応するノブおよびホールを形成する変異は、以下の表に提供される１つ以上の対に対応する。
Figure 2022506156000004
変異は、元々の残基、続いて、Ｋａｂａｔ付番システムを使用した位置、次いで、移入残基によって表されている（すべての残基は一文字のアミノ酸コードで示されている）。複数の変異は、コロンで区切られている。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリンポリペプチドは、上の表２に列記される１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、表２の左側の列に列記される１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む第１の免疫グロブリンポリペプチドと、表２の右側の列に列記される１つ以上の対応するアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む第２の免疫グロブリンポリペプチドとを含む。ノブおよびホール形成対の非限定的な例として、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むＣＨ３ドメインを含む第１の免疫グロブリンポリペプチドと、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異を含むＣＨ３ドメインを含む第２の免疫グロブリンポリペプチドとを含む。
各半抗体は、米国特許第７，６４２，２２８号に記載されているように、重鎖に操作されたノブ（突起）またはホール（キャビティ）のいずれかを有することができる。簡潔には、ＣＨ３ノブ変異体を最初に生成することができる。次いで、パートナーＣＨ３ドメイン上のノブに近接している残基３６６、３６８、および４０７をランダム化することによって、ＣＨ３ホール変異体のライブラリを作製することができる。ある特定の実施形態では、ノブ変異はＴ３６６Ｗを含み、ホール変異は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４骨格中にＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む。他の免疫グロブリンアイソタイプにおける同等の変異は、当業者によって作製され得る。さらに、当業者は、二重特異性抗体に使用される２つの半抗体が同じアイソタイプであることが好ましいことを容易に理解するであろう。
多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を産生するための例示的かつ非限定的な技法が、セクションＩＩＩで提供される。
２つを超えるの結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Ｔｕｆｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
いくつかの実施形態では、２鎖タンパク質は、多重特異性抗体または二重特異性抗体の一部である。多重特異性抗体または二重特異性抗体は、本開示の２つ以上の一価抗体を含有する。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の第１の抗原結合ドメインは、１つ以上の重鎖定常ドメインを含み、該１つ以上の重鎖定常ドメインは、第１のＣＨ１（ＣＨ１１）ドメイン、第１のＣＨ２（ＣＨ２１）ドメイン、第１のＣＨ３（ＣＨ３１）ドメインから選択され、二重特異性抗体の第２の抗原結合ドメインは、１つ以上の重鎖定常ドメインを含み、該１つ以上の重鎖定常ドメインは、第２のＣＨ１（ＣＨ１２）ドメイン、第２のＣＨ２（ＣＨ２２）ドメイン、および第２のＣＨ３（ＣＨ３２）ドメインから選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインの１つ以上の重鎖定常ドメインのうちの少なくとも１つは、第２の抗原結合ドメインの別の重鎖定常ドメインと対形成される。いくつかの実施形態では、ＣＨ３１およびＣＨ３２ドメインはそれぞれ、突起またはキャビティを含み、ＣＨ３１ドメインにおける突起またはキャビティは、ＣＨ３２ドメインにおけるキャビティまたは突起にそれぞれ位置決め可能である。いくつかの実施形態では、ＣＨ３１およびＣＨ３２ドメインは、前記突起とキャビティとの間の界面で会合する。ＣＨ３１およびＣＨ３２ドメインにおけるアミノ酸置換の例示的なセットを、本明細書の表２に示す。いくつかの実施形態では、ＣＨ２１およびＣＨ２２ドメインはそれぞれ、突起またはキャビティを含み、ＣＨ２１ドメインにおける突起またはキャビティは、ＣＨ２２ドメインにおけるキャビティまたは突起にそれぞれ位置決め可能である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２１およびＣＨ２２ドメインは、前記突起とキャビティとの間の界面で会合する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧのＣＨ３１および／またはＣＨ３２ドメインは、米国特許第８，２１６，８０５号の図５に示されているアミノ酸付番による３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９８、３９９、４０５、４０７、および４０９からなる群から選択される残基で、１つ以上のアミノ酸置換を含有する。いくつかの実施形態では、突起は、アルギニン（Ｒ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基、チロシン（Ｙ）残基、およびトリプトファン（Ｗ）残基からなる群から選択される、１つ以上の導入された残基を含む。いくつかの実施形態では、キャビティは、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、およびバリン（Ｖ）残基からなる群から選択される、１つ以上の導入された残基を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ３および／またはＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ２Ａサブタイプ、ＩｇＧ２Ｂサブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ、またはＩｇＧ４サブタイプ）に由来する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｙを含み、もう一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｙ４０７Ｔを含む。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、もう一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｙ４０７Ａを含む。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｆ４０５Ａを含み、もう一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３９４Ｗを含む。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６ＹおよびＦ４０５Ａを含み、もう一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３９４ＷおよびＹ４０７Ｔを含む。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６ＷおよびＦ４０５Ｗを含み、もう一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３９４ＳおよびＹ４０７Ａを含む。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｆ４０５ＷおよびＹ４０７Ａを含み、もう一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６ＷおよびＴ３９４Ｓを含む。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｆ４０５Ｗを含み、もう一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３９４Ｓを含む。変異は、元々の残基、続いて、Ｋａｂａｔ付番システムを使用した位置、次いで、移入残基によって表されている。米国特許第８，２１６，８０５号の図５における付番も参照されたい。
（ｖｉｉ）単一ドメイン抗体
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部を含む、単一のポリペプチド鎖である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．、例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照されたい）。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてまたは一部からなる。
（ｖｉｉｉ）抗体バリアント
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善させることが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および／または挿入、および／または置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組合せにより、最終構築物に到達することができるが、但し、最終構築物が所望の特徴を有することを条件とする。主題の抗体のアミノ酸配列が作製されるときに、アミノ酸改変がその配列に導入されてもよい。
（ｉｘ）置換、挿入、および欠失バリアント
ある特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換による変異導入のための目的の部位には、ＨＶＲおよびＦＲが含まれる。保存的置換は、「保存的置換」という見出しの下で表１に示される。より実質的な変化は、表１において、「例示的な置換」という見出しの下に提供され、またアミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載されている通りである。目的の抗体中にアミノ酸置換を導入することができ、その産物を、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングする。
Figure 2022506156000005
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従ってグループ化され得る。
ａ．疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
ｂ．中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
ｃ．酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
ｄ．塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
ｅ．鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
ｆ．芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うことになる。
一種の置換バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、さらなる研究のために選択される、得られたバリアント（複数可）は、親抗体と比較して、ある特定の生物学的特性（例えば、増加した親和性、低減した免疫原性）における修飾（例えば、改善）を有し、かつ／または実質的に保持された親抗体のある特定の生物学的特性を有することになる。例示的な置換バリアントは、親和性成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載のファージディスプレイに基づく親和性成熟技法などを使用して、簡便に作成されてもよい。簡潔には、１つ以上のＨＶＲ残基が変異を受け、バリアント抗体がファージにディスプレイされ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
改変（例えば、置換）をＨＶＲに行い、例えば、抗体親和性を改善することができる。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異が起こるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９～１９６（２００８）を参照）、および／またはＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）において行われてもよく、得られたバリアントＶＨまたはＶＬが、結合親和性について試験される。二次ライブラリからの構築と再選択による親和性成熟化は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ１７８：１～３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性変異導入）のいずれかによって、成熟のために選択される可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリが作製される。次いで、このライブラリをスクリーニングして、所望の親和性を有する抗体バリアントを同定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４～６個の残基）をランダム化する、ＨＶＲ指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異導入またはモデリングを使用して、具体的に同定され得る。特に、ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３が、標的にされることが多い。
ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、このような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書で提供される保存的置換）が、ＨＶＲ中になされてもよい。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲ外であってもよい。上に提供されるバリアントＶＨおよびＶＬ配列のある特定の実施形態では、各ＨＶＲは、改変されていないか、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
変異導入の標的となり得る抗体の残基または領域を同定するための有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１～１０８５に記載されているように「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれる。この方法では、一残基または一群の標的残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられて、抗体の抗原との相互作用が影響を受けたかどうかが判定される。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入されてもよい。あるいは、またはさらに、抗体と抗原との間の接点を同定するための抗原－抗体複合体の結晶構造。このような接触残基および隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、または除去されてもよい。バリアントは、所望の特性を有するかどうかを判定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列挿入としては、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに１個または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入型バリアントとしては、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）またはポリペプチドへの抗体のＮ末端またはＣ末端の融合が挙げられる。
（ｘ）Ｆｃ領域バリアント
ある特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによって、Ｆｃ領域バリアントが生成され得る。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
ある特定の実施形態では、本開示は、すべてではないが、いくつかのエフェクター機能を有することにより、インビボでの抗体の半減期は重要ではあるが、特定のエフェクター機能（補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途に望ましい候補となる抗体変異体を企図する。インビトロおよび／またはインビボの細胞毒性アッセイを行い、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／消失を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行い、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（ゆえに、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを保証することができる。ＡＤＣＣの媒介のための主要な細胞であるＮＫ細胞は、Ｆｃ（ＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、Ｆ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ、およびＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現については、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７～４９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめてある。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：７０５９～７０６３（１９８６）を参照）、およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１４９９～１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１～１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法が用いられ得る（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、およびＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照されたい）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：６５２～６５６（１９９８）に開示されているように、動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、抗体がＣ１ｑに結合することができないために、ＣＤＣ活性を欠くことを確認してもよい。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２における、Ｃ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ１０１：１０４５～１０５２（２００３）、ならびにＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．およびＭ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ１０３：２７３８～２７４３（２００４）を参照されたい）、ＦｃＲｎ結合およびインビボクリアランス／半減期の判定はまた、当技術分野で公知の方法を使用して行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９～１７６９（２００６）を参照されたい）。
低減したエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９のうちの１つ以上の置換を有する抗体が挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体としては、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７、および３２７位のうちの２つ以上で置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５および２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ＦｃＲへの結合が改善または減少した特定の抗体バリアントが記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２、およびＳｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１～６６０４（２００１）を参照されたい。）
ある特定の実施形態では、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、および／または３３４位（残基のＥＵ付番）での置換を有するＦｃ領域を含む。例示的な実施形態では、抗体は、そのＦｃ領域に以下のアミノ酸置換：Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａを含む。
いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、およびＩｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４：４１７８～４１８４（２０００）に記載されているように、変化した（すなわち、改善されたかまたは減少したかのいずれか）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をもたらす改変が、Ｆｃ領域において行われる。
半減期が増加し、母体のＩｇＧの胎児への移行に関与する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域の、ＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃバリアントは、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上で置換（例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号））を伴うバリアントを含む。Ｆｃ領域バリアントの他の例に関して、ＤｕｎｃａｎおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ３２２：７３８～４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、およびＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
（ｘｉ）抗体誘導体
本開示の抗体は、当技術分野で公知であり、かつ容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含むように、さらに修飾され得る。ある特定の実施形態では、抗体の誘導体化に好適な部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量を有していてもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に結合したポリマーの数は異なってもよく、２つ以上のポリマーが結合している場合、それらは、同じ分子であっても、異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下で、ある治療に使用されるかどうかなどを含む検討事項に基づき決定することができるが、これらに限定されるものではない。
ＩＩＩ．産生方法
本開示の原核宿主細胞において、２つの鎖（例えば、２鎖ポリペプチド）を含むポリペプチドを産生する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、方法は、本開示の宿主細胞を、ポリペプチドの２つの鎖の発現に適した条件下の培養培地中で、該ポリペプチドの該２つの鎖を発現するように培養し、それによって、発現すると、該２つの鎖は折り畳まれ、組み立てられて、該宿主細胞中で生物学的に活性なポリペプチドを形成すること、および該宿主細胞から該生物学的に活性なポリペプチドを回収することを含む。
本開示の宿主細胞（例えば、セクションＩＩに記載されているように）のいずれも、本開示の方法において使用を見出すことができる。例えば、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本開示の１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドおよび本開示の１つ以上の翻訳単位（例えば、プロモータに作動可能に連結され、非天然の組合せで宿主細胞染色体上に存在する）を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド（染色体外ポリヌクレオチドの一部）、ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチド（染色体外ポリヌクレオチドの一部）、およびシャペロンタンパク質（例えば、本開示のペプチジル－プロリルイソメラーゼまたはタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ）をコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、非天然の組合せで本開示のプロモータと作動可能な組合せにある、第３のポリヌクレオチド（宿主細胞染色体の一部）を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド（染色体外ポリヌクレオチドの一部）、ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチド（染色体外ポリヌクレオチドの一部）、本開示のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチド（宿主細胞染色体の一部）であって、非天然の組合せで本開示のプロモータと作動可能な組合せにある、第３のポリヌクレオチド、および本開示のペプチジル－プロリルイソメラーゼをコードする第４の翻訳単位を含む第４のポリヌクレオチド（宿主細胞染色体の一部）であって、非天然の組合せで本開示のプロモータと作動可能な組合せにある、第４のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド（染色体外ポリヌクレオチドの一部）、ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチド（染色体外ポリヌクレオチドの一部）、本開示のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、非天然の組合せで本開示のプロモータと作動可能な組合せにある、第３のポリヌクレオチド（宿主細胞染色体の一部）、本開示のペプチジル－プロリルイソメラーゼをコードする第４の翻訳単位を含む第４のポリヌクレオチドであって、非天然の組合せで本開示のプロモータと作動可能に組合せにある、第４のポリヌクレオチド（宿主細胞染色体の一部）、および本開示の第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第５の翻訳単位であって、非天然の組合せで本開示のプロモータと作動可能な組合せにある、第５の翻訳単位を含む。上記実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、宿主細胞は、２鎖タンパク質の第３の鎖をコードする翻訳単位（染色体外ポリヌクレオチドの一部）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ポリペプチドの２つの鎖を発現するように培養され、発現すると、該２つの鎖は折り畳まれ、組み立てられて、宿主細胞中で生物学的に活性なポリペプチドを形成する。本明細書で使用される場合、２つの鎖の折畳みおよび組立ては、適切な３次元の２鎖タンパク質立体構造、２鎖タンパク質組立て、またはその両方の最終的な適合を促進する、任意またはすべての工程を指し得る。折畳みおよび組立ては、各鎖をその適切な立体構造および折畳みに、折り畳むことおよび組み立てることを指してもよく、または２つのタンパク質鎖の分子間連結によって創出される複合体の折畳みおよび組立てを指してもよい。同様に、各鎖は、折り畳まれ、組み立てられて生物学的に活性なポリペプチドを形成してもよく、または２つのタンパク質鎖の分子間連結によって創出される複合体は、概して、折り畳まれ、組み立てられて生物学的に活性なポリペプチドを形成し得る。
生物学的に活性なポリペプチドは、ポリペプチドに起因する機能を実行することができる任意のポリペプチドを指し得る。生物学的に活性なポリペプチドの機能としては、適切な折畳みまたは組立て、別の高分子との結合または他の相互作用、および酵素活性が挙げられるが、これらに限定されない。例示を目的として、生物学的に活性な抗体は、抗体に起因する少なくとも１つの機能を実行することができる抗体を指してもよく、該機能としては、本明細書でより詳述するように、エピトープへの結合または抗体Ｆｃ領域の特性の保有が挙げられるが、これらに限定されない。
抗体は、組換え方法を使用して産生され得る。抗抗原抗体の組換え体産生について、抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）配列決定され得る。多くのベクターが利用可能である。ベクターの成分には、一般に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモータ、および転写終結配列のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない（例えば、上に記載の通り）。
多重特異性（例えば、二重特異性）抗体の産生
本開示のある特定の態様は、二重特異性抗体（例えば、第１の抗原に結合することができる第１の半抗体および第２の抗原に結合することができる第２の半抗体を含み、該第１および第２の抗原は、場合によっては、異なる）を産生する方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の第１の半抗体を産生することであって、該第１の半抗体が、本開示の翻訳単位（例えば、１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドの一部）によってコードされる重鎖および軽鎖を含む、第１の半抗体を産生することと、本明細書に記載の第２の半抗体を産生することであって、該第２の半抗体が、本開示の翻訳単位（例えば、１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドの一部）によってコードされる重鎖および軽鎖を含む、第２の半抗体を産生することとを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の半抗体の一方は、本開示の少なくとも１つのノブ形成変異を含み、第１および第２の半抗体の他方は、本開示の少なくとも１つのホール形成変異を含む。いくつかの実施形態では、方法は、還元条件下で、第１の半抗体を第２の半抗体と組み合わせて、二重特異性抗体を生成することをさらに含む。半抗体産生および二重特異性抗体組立てのための例示的な方法が、下記に提供される。
１つ以上の対応するノブまたはホール形成変異を有する、修飾された免疫グロブリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当技術分野で公知の標準的な組換え技法および細胞系を使用して、発現および精製することができる。例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、同第５，８０７，７０６号、同第５，８２１，３３３号、同第７，６４２，２２８号、同第７，６９５，９３６号、同第８，２１６，８０５号、米国特許出願公開第２０１３／００８９５５３号、およびＳｐｉｅｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３１：７５３～７５８、２０１３を参照されたい。修飾された免疫グロブリンポリペプチドは、大腸菌などの原核宿主細胞を使用して産生されてもよい。対応するノブおよびホールを持つ免疫グロブリンポリペプチドは、共培養下で、宿主細胞中で発現され、ヘテロ多量体として一緒に精製され得るか、または単一培養下で発現され、別個に精製され、インビトロで組立てられ得る。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞の２つの株（一方はノブを有する免疫グロブリンポリペプチドを発現し、他方はホールを有する免疫グロブリンポリペプチドを発現する）は、当技術分野で公知の標準的な細菌培養技法を使用して共培養される。いくつかの実施形態では、２つの株は、例えば、培養下で等しい発現レベルを達成するように、特定の比率で混合され得る。いくつかの実施形態では、２つの株は、５０：５０、６０：４０、または７０：３０の比率で混合され得る。ポリペプチドが発現した後、細胞が一緒に溶解され得、タンパク質が抽出され得る。ホモ多量体種対ヘテロ多量体種の存在量の測定を可能にする、当技術分野で公知の標準的な技法としては、サイズ排除クロマトグラフィが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、各修飾された免疫グロブリンポリペプチドは、標準的な組換え技法を使用して、別個に発現され、回収され、インビトロで一緒に組立てられ得る。以下により詳細に記載されているように、組立ては、例えば、各修飾された免疫グロブリンポリペプチドを精製し、それらを等しい質量で混合および一緒にインキュベートし、ジスルフィドを還元し（例えば、ジチオスレイトールで処理することによって）、濃縮し、ポリペプチドを再酸化することによって達成され得る。形成された二重特異性抗体は、陽イオン交換クロマトグラフィを含む標準的な技法を使用して精製することができ、サイズ排除クロマトグラフィを含む標準的な技法を使用して測定することができる。これらの方法のより詳細な説明については、Ｓｐｅｉｓｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３１：７５３～８、２０１３を参照されたい。
ノブまたはホール変異のいずれかを含有する半抗体は、細菌宿主細胞（例えば、大腸菌）において、重鎖および軽鎖構築物を発現させることによって、別々の培養物中で生成される。各半抗体を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって、別個に精製することができる。ノブおよびホール半抗体からの清澄化された細胞抽出物を、ＨｉＴｒａｐ ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ ＳＵＲＥ（商標）カラムによって精製することができる。異なる特異性を有するプロテインＡ精製半抗体は、還元剤の存在下で、インビトロの酸化還元反応において、二重特異性抗体を形成するように組み立てられ得る。
任意の適切な方法を使用して、所望の還元条件を調製することができる。例えば、所望の還元条件は、還元化剤／還元剤を反応物（本発明の組立て混合物など）に添加することによって調製することができる。好適な還元化剤には、これらに限定されないが、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、チオグリコール酸、アスコルビン酸、チオール酢酸、グルタチオン（ＧＳＨ）、β－メルカプトエチルアミン、システイン／シスチン、ＧＳＨ／グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、システアミン／シスタミン、グリシルシステイン、およびβ－メルカプトエタノール、好ましくはＧＳＨが含まれる。ある特定の特定の実施形態では、還元化剤は、ＧＳＨ、β－メルカプトエチルアミン、システイン／シスチン、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ、システアミン／シスタミン、グリシルシステイン、およびβ－メルカプトエタノール、好ましくはＧＳＨを含むが、これらに限定されない、弱い還元化剤である。ある特定の好ましい実施形態では、還元化剤はＧＳＨである。ある特定の実施形態では、還元化剤は、ＤＴＴではない。反応において所望の還元条件を達成するために、適切な濃度および適切な実験条件下で適切な還元化剤を選択することは、当業者の能力の範囲内である。例えば、２０ｏＣで１０ｇ／Ｌの二重特異性抗体タンパク質濃度を有する溶液中の１０ｍＭのＬ－還元型グルタチオンは、約－４００ｍＶの開始酸化還元電位をもたらす。例えば、組立て混合物に添加されたグルタチオンは、ノブ－イントゥー－ホール二重特異性組立てに有利な弱還元条件を創出する。ＢＭＥＡ（β－メルカプトエチルアミン）などの同様のクラスの他の還元化剤も、同様の効果を有し得る。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／０５５９５８を参照されたい。反応の還元条件は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して、推定および測定することができる。例えば、レサズリン指示薬（還元条件で青色から無色への変色）を用いて、測定することができる。より正確な測定のために、酸化還元電位計（ＢＲＯＡＤＬＥＹ ＪＡＭＥＳ（登録商標）製のＯＲＰ電極など）を使用することができる。
ある特定の特定の実施形態では、還元条件は弱還元条件である。本明細書で使用される「弱還元化剤」または「弱還元条件」という用語は、２５°Ｃで負の酸化電位を有する還元剤によって調製される還元剤または還元条件を指す。還元化剤の酸化電位は、ｐＨが７～９の間であり、温度が１５°Ｃ～３９°Ｃの間である場合、好ましくは－５０～－６００ｍＶの間、－１００～－６００ｍＶの間、－２００～－６００ｍＶの間、－１００～－５００ｍＶの間、－１５０～－３００ｍＶの間、より好ましくは約－３００～－５００ｍＶの間、最も好ましくは約－４００ｍＶである。当業者は、所望の還元条件を調製するために、適切な還元化剤を選択することができるであろう。当業者は、強力な還元化剤、すなわち、同じ濃度、ｐＨ、および温度で上述の還元化剤よりも負の酸化電位を有するものが、より低い濃度で使用され得ることを認識するであろう。好ましい実施形態では、タンパク質は、上記の条件下でインキュベートした場合、還元化剤の存在下で、ジスルフィド結合を形成することができる。弱還元化剤の例としては、これらに限定されないが、グルタチオン、β－メルカプトエチルアミン、シスチン／システイン、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ、システアミン／シスタミン、グリシルシステイン、およびβ－メルカプトエタノールが挙げられる。ある特定の実施形態では、ＧＳＨ：抗体の２００Ｘのモル比の酸化電位と同様の酸化電位を、他の還元化剤を使用して効率的な組立てが期待され得る弱還元条件の基準点として、使用することができる。
グルタチオン濃度は、組立て混合物中に存在する半抗体の量に対して、モル濃度、またはモル比もしくはモル過剰で表すことができる。組立て混合物中のタンパク質濃度に対する還元化剤対照の標的モル比の使用、これは、可変なタンパク質濃度の結果としての過剰な還元または過少な還元を防止する。ある特定の他の実施形態では、還元化剤は、半抗体の総量に対して、２～６００Ｘ、２～２００Ｘ、２～３００Ｘ、２～４００Ｘ、２～５００Ｘ、２～２０Ｘ、２～８Ｘ、２０～５０Ｘ、５０～６００Ｘ、５０～２００Ｘ、または１００～３００Ｘのモル過剰、好ましくは５０～４００Ｘ、より好ましくは１００～３００Ｘ、最も好ましくは２００Ｘのモル過剰で、組立て混合物に添加される。ある特定の実施形態では、組立て混合物は、ｐＨ７～９の間、好ましくはｐＨ８．５を有する。
ある特定の実施形態では、第１の半抗体および第２の半抗体の培養物を組み合わせ、続いて組み合わせた培養物中で溶解することができる。放出された第１の半抗体と第２の半抗体との組合せは、還元条件で二重特異性抗体を形成することができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１１／１３３８８６を参照されたい。
異なるアプローチによると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体－抗原結合部位）が、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。この融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。これらの融合のうちの少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが典型的である。免疫グロブリン重鎖融合物と、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物に共トランスフェクトされる。構築にあたり、使用される３つのポリペプチド鎖の不均等な比率が最適収率をもたらす実施形態では、これは、３つのポリペプチド断片の相互割合を調整する上で、優れた柔軟性を提供する。しかしながら、少なくとも２つのポリペプチド鎖を等比率で発現させることが高収率をもたらす場合、または比率が特に重要でない場合、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチの一実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームに第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームに（第２の結合特異性を提供する）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖－軽鎖対からなる。この非対称構造は、望まない免疫グロブリン鎖の組合せから、所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。二重特異性分子の半分のみで、免疫グロブリン軽鎖が存在することにより、容易な分離方法がもたらされるためである。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
ＷＯ９６／２７０１１に記載の別のアプローチによると、抗体分子対の間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合が最大になるように操作され得る。１つの界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面由来の１つ以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる。大きい側鎖（複数可）と同一または同様のサイズの補償「キャビティ」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって、第２の抗体分子の界面上に作製される。これにより、ホモ二量体などの他の望まない最終産物と比べて、ヘテロ二量体の収率を増加させるための機構が提供される。
二重特異性抗体には、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方がアビジンにカップリングし、他方がビオチンにカップリングし得る。このような抗体は、例えば、望まない細胞を免疫系細胞の標的とするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、ＨＩＶ感染の治療のために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、およびＥＰ０３０８９）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体を、任意の簡便な架橋方法を用いて、作製してもよい。好適な架橋剤が当技術分野で周知であり、いくつかの架橋技法とともに、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技法もまた、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク質分解的に切断されて、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する手順について記載している。これらの断片は、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、近接するジチオールを安定させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。次いで、生成したＦａｂ’断片を、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’－ＴＮＢ誘導体の一方が、メルカプトエチルアミンによる還元によってＦａｂ’－チオールに再変換され、等モル量の他方のＦａｂ’－ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
近年の進歩により、化学的にカップリングして二重特異性抗体を形成することができるＦａｂ’－ＳＨ断片を、大腸菌から直接回収することが容易になった。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７～２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生について記載している。各Ｆａｂ’断片は、大腸菌から別個に分泌され、インビトロでの指向性化学的カップリングに供されて、二重特異性抗体を形成した。
二重特異性抗体断片を、直接、組換え細胞培養物から作製および単離するための様々な技法も記載されている。例えば、ロイシンジッパを使用して、二重特異性抗体が産生された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（５）：１５４７～１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシン・ジッパ・ペプチドを、遺伝子融合によって、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させた。抗体ホモ二量体を、ヒンジ領域で還元して単量体を形成させ、次いで、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成させた。この方法はまた、抗体ホモ二量体の産生にも利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４～６４４８（１９９３）により記載されている「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替的機構を提供している。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーによって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、ある断片のＶＨおよびＶＬドメインは、別の断片の相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対合させられ、それによって、２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって、二重特異性抗体断片を作製するための、別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
二重特異性抗体断片を作製するための別の技法は、「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」またはＢｉＴＥ（登録商標）アプローチである（例えば、ＷＯ２００４／１０６３８１、ＷＯ２００５／０６１５４７、ＷＯ２００７／０４２２６１、およびＷＯ２００８／１１９５６７を参照されたい）。このアプローチは、単一のポリペプチド上に配列された２つの抗体可変ドメインを利用する。例えば、単一のポリペプチド鎖は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを各々有する２つの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含み、これらのドメインは、２つのドメイン間の分子内会合を可能にする十分な長さのポリペプチドリンカーによって分離されている。この単一のポリペプチドは、２つのｓｃＦｖ断片間のポリペプチドスペーサー配列をさらに含む。各ｓｃＦｖは、異なるエピトープを認識し、２つの異なる細胞種の細胞が、各ｓｃＦｖがその同族のエピトープと係合するときに近接近するかまたは繋留されるように、これらのエピトープは、異なる細胞種に対して特異的であり得る。このアプローチの１つの特定の実施形態は、免疫細胞によって発現される細胞表面抗原を認識するｓｃＦｖ、例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３ポリペプチドを含み、これは、悪性または腫瘍細胞などの標的細胞によって発現される細胞表面抗原を認識する別のｓｃＦｖに連結される。
これは単一ポリペプチドであるため、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、当技術分野で公知の任意の原核細胞発現系を使用して発現され得る。しかしながら、特定の精製技法（例えば、ＥＰ１６９１８３３を参照）が、単量体二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを、単量体の意図される活性以外の生物学的活性を有し得る他の多量体種から分離するために、必要であり得る。１つの例示的な精製スキームでは、分泌されたポリペプチドを含有する溶液はまず、金属アフィニティクロマトグラフィに供され、ポリペプチドは、イミダゾール濃度の勾配を用いて溶出される。この溶出物は、陰イオン交換クロマトグラフィを使用してさらに精製され、ポリペプチドは、塩化ナトリウム濃度の勾配を使用して溶出される。最後に、この溶出液をサイズ排除クロマトグラフィに供して、モノマーを多量体種から分離する。
宿主細胞の選択および形質転換
全長抗体または半抗体、抗体融合タンパク質、１アーム抗体、および抗体断片などの２鎖タンパク質を、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、例えば、治療用抗体が、単独で腫瘍細胞の破壊において効果を示す細胞傷害性薬剤（例えば、毒素）にコンジュゲートされる場合に、細菌において産生することができる。全長抗体は、より優れた循環血中の半減期を有する。大腸菌での産生が、より迅速であり、より費用効率が高い。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、発現および分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）およびシグナル配列を説明している、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号（Ｃａｒｔｅｒら）、米国特許第５，７８９，１９９号（Ｊｏｌｙら）、米国特許第５，８４０，５２３号（Ｓｉｍｍｏｎｓら）を参照されたい。また、大腸菌における抗体断片の発現を記載する、Ｃｈａｒｌｔｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．、２００３）、２４５～２５４頁も参照されたい。発現後、抗体は、可溶性画分中の大腸菌細胞ペーストから単離することができ、例えば、アイソタイプに応じてプロテインＡまたはＧカラムにより精製され得る。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で発現された抗体を精製するためのプロセスと同様に行われ得る。
宿主細胞は、２鎖タンパク質産生のために、本開示の発現またはクローニングベクターによって形質転換され、プロモータの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードしている遺伝子の増幅に適切なものとなるように修飾された従来の栄養素培地において培養される。
宿主細胞の培養
本開示の宿主細胞は、多様な培地中で培養され得る。本明細書で使用される「培養培地」は、本開示の細菌の増殖を支援する任意の組成物または培養液を指す。好適な培養培地は、液体または固体であり、任意の栄養素、塩、緩衝液、元素、ならびに細胞の増殖および生存を支援する他の化合物を含有し得る。培養培地の一般的な栄養素は、窒素、炭素、アミノ酸、炭水化物、微量元素、ビタミン、およびミネラル源を含み得る。これらの栄養素は、個々の成分として（定義された培養培地中のように）または複合エキスの構成成分（例えば、酵母エキス）として添加されてもよい。培養培地は、急速な増殖を支援するために栄養素に富んでいてもよく、あるいはより遅い増殖を支援するために栄養素が最低限であってもよい。培養培地はまた、混入生物の増殖を阻害するかまたは混入生物を殺滅するために使用される任意の薬剤（例えば、抗生物質）を含有してもよい。培養培地はまた、誘導性プロモータまたは酵素の活性を制御するために使用される任意の化合物を含有してもよい（一例として、ＩＰＴＧを含めることにより、ｌａｃオペロンまたは機能的に類似するプロモータによって制御される、任意のポリヌクレオチドの発現を誘導してもよい）。好適な培養培地の多数の例が、当技術分野で周知であり、Ｍ９培地、Ｌｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）、ＮＺＹ培養液、ＳＯＢ培地、およびＹＴ培養液が挙げられるが、これらに限定されない。
これらの培地のいずれも、必要に応じて、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質、抗真菌薬、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、グルコース、および／または適切なエネルギー源を補充され得る。原核細胞培養培地中で見出される典型的な成分は、酵母エキス、塩（例えば、ＮａＣｌ）、トリプトン、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）、グリセロールなどを含む。任意の他の必要な補充物もまた、当業者に公知の適切な濃度で含まれ得る。温度およびｐＨなどの培養条件は、発現のために選択される原核宿主細胞で既に使用されたものであり、当業者には明らかとなるであろう。
生物学的に活性なポリペプチドの精製
本開示のある特定の態様は、宿主細胞から生物学的に活性なポリペプチドを回収することに関する。典型的には、本開示の生物学的に活性なポリペプチドを回収すること（「精製すること」または「精製」という用語が、本明細書で互換的に使用され得る）は、ポリペプチドを宿主細胞（または、ポリペプチドが培地中に排出される場合には、細胞培養培地）から単離すること、ならびにポリペプチドを、他の関連する高分子、例えば、細胞残屑および他のポリペプチドから精製することを伴う。様々な宿主細胞コンパートメントから様々なタンパク質を精製するための多数の技法が、当技術分野で公知である（例えば、Ｅｖａｎｓ，Ｊｒ．，ＴＣおよびＸｕ ＭＱ（編）Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第７０５巻、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。例示的な技法が以下に記載されているが、これらは、当業者の理解を補助するための例示目的のために含まれるものであり、決して限定を意味するものではない。
組換え技法を使用する場合、分泌タンパク質などの２鎖タンパク質は、細胞内で産生されるか、ペリプラズム空間で産生されるか、または培地中に直接分泌され得る。分泌タンパク質が細胞内で産生される場合、第１の工程として、宿主細胞または溶解断片である粒子状残屑が、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。
いくつかの実施形態では、分泌タンパク質は、宿主細胞のペリプラズムから回収される。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６３～１６７（１９９２）は、大腸菌のペリプラズム空間に分泌される分泌タンパク質を単離するための手順を記載している。簡潔には、細胞ペーストが、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分間にわたって解凍される。細胞残屑が、遠心分離によって除去され得る。分泌タンパク質が培地中に排出される場合、一般に、このような発現系から上清を、まず、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮する。タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が前述の工程のいずれかに含まれてもよく、外来性混入物の増殖を防止するために、抗生物質が含まれてもよい。
細胞から調製された分泌タンパク質組成物を、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティクロマトグラフィを使用して精製することができるが、アフィニティクロマトグラフィが典型的に好ましい精製工程のうちの１つである。抗体に関して、アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１～１３（１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティリガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御された細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスにより、アガロースで達成され得るよりも速い流速および短いプロセシング時間が可能になる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技法、例えば、イオン交換カラム上での分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィ、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィ、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのクロマトグラフィ、クロマト分画、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿も回収される抗体に応じて利用可能である。当業者は、抗体回収に有用なこれらの技法の多くが、分泌タンパク質などの他の２鎖タンパク質を回収するために、容易に応用できることを認識するであろう。
本開示は、以下の例を参照することによって、より完全に理解されることになるだろう。しかしながら、これらは、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載の例および実施形態は、例証のみを目的とするものであり、それを考慮に入れた様々な修飾または変更が当業者に提案されるであろうが、それらは、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることを理解されたい。
実施例１：シャペロンＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、およびＦｋｐＡの発現を制御する、染色体に組み込まれたプロモータを有する大腸菌株の操作
プラスミドからのシャペロンＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、およびＦｋｐＡの過剰発現は、細菌培養における抗体ベースの産物産生を改善することができる。しかしながら、プラスミドからのこれらのシャペロンの発現には、いくつかの欠点がある。例えば、このようなアプローチは、新しい産物ごとに発現プラスミドの開発および調整を必要とする。大きなプラスミドサイズはまた、場合によっては、より低い産物力価をもたらし得る。さらに、プラスミドは、典型的には、１細胞あたり１０～１５コピーで存在し、産物からシャペロンタンパク質（例えば、ＦｋｐＡ）を除去するために下流の精製工程（複数可）を必要とし得る高レベルの過剰発現をもたらす。場合によっては、１つ以上のシャペロンのより低い発現レベルで、同じ産物力価を達成することができた。
ここで、大腸菌ゲノム内のｄｓｂＡ、ｄｓｂＣ、およびｆｋｐＡの天然プロモータを、非天然の組合せのプロモータｐｈｏＡ、ｔａｃ、およびＣＰ２５と交換して、シャペロンを染色体過剰発現する操作された株を作製した。これらの株を、２つの半抗体（本明細書で「ｘＩＬ１３」およびＡＦ２と称される、抗ＩＬ１３半抗体）、１アーム抗体（ＭｅｔＭＡｂ）、および抗体Ｆａｂ断片（抗ＶＥＧＦ抗体断片）の産生における使用について調べた。
方法
ベクター構築
シャペロンおよびｘＩＬ１３（ＭＤ１５７）またはＡＦ２（ＭＤ３４１）のいずれかを発現するベクターを、ＷＯ２０１６０７３７９１（例えば、段落２７８および２７９、２８１～２８４、２８５～２８８を参照）に記載されているように構築した。
株の操作
ｐｈｏＡ（Ｗａｎｎｅｒ Ｂ．Ｌ．（１９９０）Ｃｏｌｌｏｑｉｕｍ Ｍｏｓｂａｃｈ，Ｍｏｌ．Ｂａｓｉｓ Ｂａｃｔ．Ｍｅｔａｂ．４１頁を参照）、ｔａｃ（ｄｅ Ｂｏｅｒ Ｈ．Ａ．ら（１９８３）ＰＮＡＳ８０、２１～５頁を参照）、およびＣＰ２５（Ｊｅｎｓｅｎ Ｐ．Ｒ．およびＨａｍｍｅｒ Ｋ．（１９９８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４、８２～８７頁を参照）プロモータを、大腸菌ゲノムに組み込み、ｄｓｂＡ、ｄｓｂＣ、およびｆｋｐＡの天然プロモータを置き換えた。これらのプロモータ修飾は、対立遺伝子交換（例えば、Ｂａｓｓ，Ｓ．ら（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１１５４～１１６１およびＩｎｎｅｓ，Ｄ．ら（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４７：１８８７～１８９６を参照）を介して行った。
簡潔には、大腸菌ゲノム中の所望の挿入領域に一致する５００塩基対の相同配列が両側に隣接し、目的のプロモータを含むように、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）を用いて、ｐＳ１０８０ベースの自殺ベクターを構築した。確認のために配列決定した後、バクテリオファージＭ１３およびＰ１を使用して、４８Ｃ８株にプラスミド配列を感染させ、導入した配列を目的の株に形質導入した（例えば、Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｎ．およびＭｉｙａｚａｋｉ，Ｋ．（２０１４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１５：２７７３～２７９３を参照されたい）。供給源プラスミドから得られたプロモータは、シャペロンの上流の遺伝子間領域を置き換えた。これにより、大腸菌ゲノム内のｄｓｂＡ、ｄｓｂＣ、およびｆｋｐＡの天然プロモータが、ｐＳ１０８０自殺ベクター由来のｐｈｏＡ、ｔａｃ、および／またはＣＰ２５プロモータで置換された。ｌａｃＩ遺伝子に対する修飾も、ｔａｃプロモータからの発現をさらに増強するために行った。得られた株のバイアルロットを製造し、－８０°Ｃで保存した。
振盪フラスコ培養および発酵槽プロセス
操作された株（表Ｂを参照）を、標準的な振盪フラスコ培養（Ｓｈ．Ｆｌ．）および１０リットルの発酵槽（１０Ｌ）で培養した。ＷＯ２０１６０７３７９１（例えば、段落２８９～２９２を参照）に記載されているように、１０リットルの発酵を行った。それらの天然プロモータから発現されるシャペロンのみを含有する、株６７Ａ６および６４Ｂ４を陰性対照として使用した（すなわち、Ｓｈ．Ｆｌ．（－）およびＡｍｂｒ（－））。陽性対照として、これらの株を、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、およびＦｋｐＡを発現するプラスミドで形質転換した（表Ａを参照）（すなわち、Ｓｈ．Ｆｌ．（＋）、Ａｍｂｒ（＋）、および１０Ｌ（＋））。
電気泳動、ウェスタンブロット、およびＨＰＬＣ分析
ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、およびＦｋｐＡの相対濃度をウェスタンブロットによって測定した。ｘＩＬ１３、ＡＦ２、ＭｅｔＭＡｂ、および抗ＶＥＧＦ抗体断片濃度を逆相ＨＰＬＣによって測定した。電気泳動、ウェスタンブロット、およびＨＰＬＣ分析方法は、ＷＯ２０１６０７３７９１（例えば、段落２９３～２９９を参照）に記載されているように行った。
結果
抗体ベースの産物ｘＩＬ１３、ＡＦ２、ＭｅｔＭＡｂ、および抗ＶＥＧＦ抗体断片を、大腸菌中で過剰発現させるためのベクターを構築した。ｘＩＬ１３を発現するベクターの代表的なプラスミドマップを図１に示す。各ベクターは、以下の表Ａに詳述されるように、ｘＩＬ１３、ＡＦ２、ＭｅｔＭＡｂ、または抗ＶＥＧＦ抗体断片をコードする遺伝子と、（１）シャペロン遺伝子なし（例えば、図１、右）、または（２）ｄｓｂＡ、ｄｓｂＣ、およびｆｋｐＡの組合せ（例えば、図１、左）のいずれかとを含む。これらのベクターを含有する株は、操作された株におけるタンパク質発現を評価する場合、陽性対照として使用することができる。
Figure 2022506156000006
－は、示されたシャペロン遺伝子が存在しないことを示す。
さらに、大腸菌ゲノム中のこれらのシャペロンの天然プロモータをｔａｃ、ｐｈｏＡ、およびＣＰ２５プロモータと交換することによって、ペリプラズムシャペロンＤｓｂＣ、ＤｓｂＡ、およびＦｋｐＡのうちの１つ以上の過剰発現のための１７株を構築した。株のｌａｃＩバックグラウンドはまた、ｌａｃＩを欠失させる（ΔｌａｃＩおよびΔｌａｃＩ：：ｋａｎ）、ｌａｃＩの野生型コピーを挿入する（ｌａｃＩ＋またはｌａｃＩＷＴ）、または親株の元々のｌａｃＩＱ変異を無傷のまま残すことによって、ｔａｃプロモータからの発現をさらに増強するように操作された。ｌａｃＩ遺伝子産物は、ｔａｃプロモータからの発現を抑制するので、ｌａｃＩの欠失は、ｔａｃプロモータからのより高い発現をもたらす。ｌａｃＩＱ変異は、ｌａｃＩの転写レベルの増加をもたらし、ｔａｃプロモータのより強い抑制をもたらす（Ｃａｌｏｓ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ２７４、７６２～７６５頁を参照されたい）。さらに、ｔａｃプロモータを、ＩＰＴＧで誘導することができる。表Ｂは操作された株を列挙しており、ｌａｃＩ遺伝子修飾に加えて、操作されたプロモータ修飾を示している。
Figure 2022506156000007
－ダッシュは、天然プロモータ配列に対する修飾がないことを示す。
ａ親株（６７Ａ６）の遺伝子型は、ｌａｃＩｑ変異を有する。
実施例２：染色体に組み込まれたプロモータの制御下でのＦｋｐＡの過剰発現
ＦｋｐＡの過剰発現を、ＦｋｐＡを発現するプラスミドを有する株と比較して、天然ＦｋｐＡを過剰発現する組み込まれたプロモータを有する、実施例１に記載されているように操作された株の間で比較した。
ＦｋｐＡが染色体過剰発現される能力を評価するために、ＦｋｐＡの天然プロモータを実施例１の方法に従って、ｔａｃ、ｐｈｏＡ、またはＣＰ２５プロモータと交換した。ｌａｃＩプロモータに対する修飾もまた、ｔａｃプロモータの強度をさらに増強するために行った。株を１０リットルの発酵槽で増殖させ、ウェスタンブロットによって、ＦｋｐＡ産生について評価した。
ＣＰ２５プロモータによって駆動される染色体発現は、最も高いレベルのＦｋｐＡ発現を示し、ｐｈｏＡプロモータによって駆動される発現がそれに続いた（図２）。予想通り、ｔａｃプロモータは、最も低いレベルのＦｋｐＡ発現を示し、ΔｌａｃＩバックグラウンドではｌａｃＩＷＴバックグラウンドよりも高いＦｋｐＡ発現を示した。
したがって、プラスミド発現ｆｋｐＡ遺伝子座の使用による単一レベルの高発現と比較して、染色体工学によって様々な範囲のＦｋｐＡ発現がもたらされた。これらの結果は、ＦｋｐＡの発現が染色体過剰発現によって、制御および増強され得ることを実証している。
実施例３：振盪フラスコ培養におけるｔａｃ、ｐｈｏＡ、およびＣＰ２５プロモータの制御下でのシャペロンの染色体発現
ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、およびＦｋｐＡのプロモータ修飾を有する株におけるシャペロン発現を評価するために、培養物を振盪フラスコ中で増殖させ、これらのシャペロンの発現を、ウェスタンブロットを使用して測定した。
様々な範囲の発現レベルが、観察された（図３Ａ～図３Ｃ）。ＤｓｂＡについては、ＣＰ２５プロモータからの発現が最も強く、陽性対照で見られた発現のレベル（Ｓｈ．Ｆｌ．（＋）および１０Ｌ（＋）、プラスミドからのＤｓｂＡ発現）を超えた（図３Ａ）。次に高いＤｓｂＡレベルは、ｐｈｏＡ、次いでｔａｃによって産生され、ｔａｃプロモータのＩＰＴＧ誘導は、予想通り、ＤｓｂＡの発現レベルを上昇させた。ｔａｃプロモータ単独からの発現は、おそらくこの株の抑制性ｌａｃＩＱバックグラウンドのために、陰性対照（Ｓｈ．Ｆｌ．（－）、外因性シャペロン発現なし）よりも低かった。同様に、ＤｓｂＣ発現は、ｔａｃプロモータと比較して、ｐｈｏＡプロモータでより高く、ｔａｃプロモータのＩＰＴＧ誘導は、ＤｓｂＣ発現の増加をもたらした（図３Ｂ）。ｔａｃプロモータ単独からのＤｓｂＣ発現も、陰性対照より低かった（Ｓｈ．Ｆｌ．（－））。
興味深いことに、ＦｋｐＡ発現は、ＤｓｂＡおよびＤｓｂＣ発現結果と比較した場合に、操作された株の間でわずかに異なっていた（図３Ｃ）。ｐｈｏＡプロモータは、ＦｋｐＡの最も高い発現を駆動し、ＣＰ２５プロモータからの発現がそれに続いた。ＤｓｂＡおよびＤｓｂＣと同様に、ｔａｃプロモータは、最も低いレベルの発現を駆動した。一般に、ＦｋｐＡの発現レベルは、天然レベル（Ｓｈ．Ｆｌ．（－））と比較して非常に高く、天然のＦｋｐＡプロモータは、天然のＤｓｂＡおよびＤｓｂＣプロモータと比較して、より弱いプロモータであることを示している。
まとめると、これらの結果は、３つのシャペロンＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、およびＦｋｐＡの発現がすべて、染色体過剰発現を介し、同様に制御および増強され得ることを実証している。
実施例４：ａｍｂｒ２５０発酵槽培養におけるｔａｃ、ｐｈｏＡ、およびＣＰ２５プロモータの制御下でのシャペロンの染色体発現
シャペロンの染色体過剰発現が振盪フラスコ培養からより大きな発酵槽培養に転換され得るかどうかを試験するために、操作された株を実施例１の方法に従って、ａｍｂｒ２５０高細胞密度発酵槽で増殖させ、シャペロン発現をウェスタンブロットによって測定した。
振盪フラスコ培養と同様に、様々な範囲の発現レベルが観察された（図４Ａ～図４Ｃ）。ＤｓｂＡおよびＤｓｂＣについては、異なるｌａｃＩバックグラウンドを有するｔａｃプロモータのみを試験した。ＤｓｂＡおよびＤｓｂＣの両方に対して、ｌａｃＩＱバックグラウンドを有するｔａｃプロモータは、最も低いレベルの発現をもたらしたが、ｌａｃＩＷＴバックグラウンドを有するＩＰＴＧ誘導性ｔａｃプロモータは、振盪フラスコ培養で見られるように、最も高い発現を有した（図４Ａおよび図４Ｂ）。振盪フラスコにおけるＦｋｐＡ発現とは異なり、ｐｈｏＡおよびｔａｃプロモータと比較した場合、ＣＰ２５プロモータは、ａｍｂＲ２５０バイオリアクターにおいて、最も高いＦｋｐＡ発現を有していた（図４Ｃ）。
まとめると、これらのデータは、染色体発現されたシャペロンの発現パターンが、振盪フラスコから１０Ｌの高細胞密度発酵槽プロセスに首尾よくスケールアップされ得ることを示している。
実施例５：操作された株におけるｘＩＬ１３半抗体の発現
半抗体ｘＩＬ１３の産生について、宿主株（表Ｂを参照）におけるシャペロン過剰発現の効果を試験した。
宿主株を、ｘＩＬ１３を発現するプラスミドＣＳ３９２で形質転換した。染色体過剰発現シャペロンを含有しない宿主株６７Ａ６を、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、およびＦｋｐＡと共にｘＩＬ１３を発現するプラスミドＭＤ１５７で、形質転換した（図１）。６７Ａ６／ＭＤ１５７を、陽性対照として使用した。すべての株を実施例１に記載のように、１０Ｌの発酵槽で増殖させ、ｘＩＬ１３産生を逆相ＨＰＬＣ力価アッセイによって評価した。
上位３つのｘＩＬ１３産生株（６９Ｅ１、６９Ｆ８、および６９Ｆ４）は、陽性対照と比較して、同等以上の力価のｘＩＬ１３を産生し、ｘＩＬ１３はプラスミドから発現された（図５）。６９Ｅ１株からの最も高い発現は、ｐｈｏＡおよびＣＰ２５プロモータによって駆動されるＤｓｂＣおよびＦｋｐＡをそれぞれ含有していた。これらの結果はまた、ｘＩＬ１３力価が、ＤｓｂＡの発現によって有意には影響されないことを示した。
したがって、３つの操作された６９Ｅ１、６９Ｆ８、および６９Ｆ４株のような染色体操作を、プラスミド上でシャペロンをｘＩＬ１３と共発現させる代替として使用することができ、同等のｘＩＬ１３力価が得られる。
実施例６：操作された６９Ｅ１、６９Ｆ４、および６９Ｆ８株におけるシャペロンおよびｘＩＬ１３半抗体の発現
抗体ベースの産物産生における６９Ｅ１、６９Ｆ４および６９Ｆ８株の使用をさらに調査するために、これらの株を、７２時間にわたって、ｘＩＬ１３およびシャペロンの発現についてより入念に評価した。実施例５に記載されている３つの操作された株を、実施例１および５に記載されているように、プラスミドＣＳ３９２で形質転換して、ｘＩＬ１３を発現させた。実施例１に記載されているように、６７Ａ６株を陽性対照として、プラスミドＭＤ１５７で形質転換して、ｘＩＬ１３およびシャペロンを発現させた。すべての株を、実施例１に記載されているように、１０Ｌの発酵槽で増殖させ、ｘＩＬ１３濃度を逆相ＨＰＬＣ力価アッセイによって評価した。
発酵中、光学密度（図６Ａ）およびオスモル濃度（図６Ｂ）を測定した。実験株とプラスミド対照株との間に、有意差は見られなかった。
３つすべての実験株について、ｘＩＬ１３発現は陽性対照と類似しているか、またはそれよりわずかに高く、６９Ｅ１および６９Ｆ８株は、７２時間で最も高い発現レベルを有していた（図７Ａ）。操作された株の発酵槽におけるＤｓｂＣレベルは、大部分の発酵槽について、対照プロセスと比較して、低かった（図７Ｂ）。これは、プラスミドベースのプロセスは、シャペロンが染色体から発現されるプロセスよりも、はるかに高いコピー数を有するからと予想された。６９Ｅ１株の発酵槽と６９Ｆ８株の発酵槽との間のＤｓｂＣレベルは類似しており、両方とも発現のためにｐｈｏＡプロモータを使用しているからと予想された。興味深いことに、それらのレベルは発酵の終わりに向かって、プラスミド発現レベルと類似していた。ＤｓｂＣは、６９Ｅ１および６９Ｆ８株においてｐｈｏＡプロモータから発現された。そのため、リン酸塩の存在に起因してプロモータが発酵の１８時間後まで誘導されず、発酵の最初の部分ではレベルが低かった。リン酸塩は約１８時間で完全に消費され、その後、プロモータは完全に誘導され、より多くのＤｓｂＣ発現がもたらされる。６９Ｆ４は漏出性ｔａｃプロモータを使用し、培地中のリン酸塩レベルとは無関係であるので、６９Ｆ４の発酵槽におけるＤｓｂＣレベルは、最初、６９Ｅ１および６９Ｆ８株の発酵槽と比較して高かった。これらの結果はまた、ｐｈｏＡプロモータは、振盪フラスコ培養で得られた発現結果と同様に、ｔａｃプロモータと比較して、より強いプロモータであることを示している。
６９Ｅ１および６９Ｆ４株は、ＣＰ２５プロモータ下でＦｋｐＡを発現する一方、６９Ｆ８は、ｐｈｏＡプロモータ下でＦｋｐＡを発現する。強力な構成的ＣＰ２５プロモータは、（ＦｋｐＡが、ｐｈｏＡプロモータ下にある）プラスミドレベルに匹敵する高いレベルのＦｋｐＡをもたらした（図７Ｃ）。６９Ｆ８株は、プラスミドベースのプロセスと比較して、より低いレベルでＦｋｐＡを蓄積したが、これは、ＦｋｐＡ発現を駆動するために、両方の場合でｐｈｏＡプロモータを使用するにもかかわらず、コピー数の差（プラスミドでは約１５、染色体では１）に起因しているという可能性がある。しかしながら、第Ｉ相プラスミドベースのプロセスと６９Ｆ８株プロセスとの間の力価（図７Ａ）は類似しており、追加のＦｋｐＡは必要でない可能性があることを示唆している。最終プール中のＦｋｐＡレベルを低減させるために精製開発に課される負担のため、高力価を達成する能力を有しながらの低減したＦｋｐＡレベルは、ｘＩＬ１３プロセスのための６９Ｆ８株の利点と考えられ得る。
これらのデータは、ｘＩＬ１３の発現は、プラスミド対照と比較して、高いレベルのＤｓｂＣおよびＦｋｐＡを必ずしも必要としないことを示唆する。株は、一般に、低いレベルのシャペロンを発現したにもかかわらず、３つすべての株から同等以上の力価のｘＩＬ１３を産生することができた（とはいえ、この特徴は、ＦｋｐＡを除去するためのさらなる精製の必要性を排除するという点で有利である）。
実施例７：操作された６９Ｅ１、６９Ｆ４、および６９Ｆ８株におけるＡＦ２半抗体の発現
半抗体ＡＦ２を産生する、６９Ｅ１、６９Ｆ４、および６９Ｆ８株の能力を評価した。６９Ｅ１、６９Ｆ４、および６９Ｆ８株をプラスミドＥＲＤ０４６で形質転換してＡＦ２を発現させ、６７Ａ６株を陽性対照として、実施例１に記載されているように、プラスミドＭＤ３４１で形質転換してＡＦ２およびシャペロンを発現させた。株を、実施例１に記載されているように、１０Ｌの発酵槽で増殖させ、ＡＦ２濃度を７２時間にわたって様々な時点で評価した。
発酵中、光学密度（図８Ａ）およびオスモル濃度（図８Ｂ）を測定した。実験株とプラスミド対照株との間に、有意差は見られなかった。ＡＦ２の発現は６９Ｅ１株で最も高く、プラスミド対照で見られる力価を上回った（図９）。６９Ｆ４および６９Ｆ８株は、対照と比較して、わずかに低いが同程度の力価のＡＦ２を有していた。
これらのデータは、ＡＦ２を産生する場合、３つすべての株、特に６９Ｅ１株を、プラスミド上でシャペロンを発現させる代わりに使用できることを実証している。
実施例８：操作された６９Ｅ１、６９Ｆ４、および６９Ｆ８株におけるＭｅｔＭＡｂ１アーム抗体の発現
１アーム抗体ＭｅｔＭＡｂを産生する、６９Ｅ１、６９Ｆ４、および６９Ｆ８株の能力を評価した。これらの３つの株を、プラスミドｐ１８６で形質転換してＭｅｔＭＡｂを発現させ、株６４Ｂ４を陽性対照として、実施例１に記載されているように、プラスミドｐＯＡ５Ｄ５．３６３０で形質転換して、ＭｅｔＭＡｂおよびシャペロンを発現させた。株を、実施例１に記載されているように、１０Ｌの発酵槽で増殖させ、ＭｅｔＭＡｂ濃度を７２時間にわたって様々な時点で評価した。
発酵中、光学密度（図１０Ａ）およびオスモル濃度（図１０Ｂ）を測定した。実験株とプラスミド対照株との間に、有意差は見られなかった。
対照プロセスでは、ＤｓｂＡおよびＤｓｂＣをプラスミドから発現させ、ＦｋｐＡを使用しなかった。３つすべての株を使用した発酵槽は、対照プロセスと比較した場合、同等以上の力価を有した（図１１）。６９Ｅ１株を使用した発酵槽は、対照プロセスと比較して、力価が約２倍に増加した。驚くべきことに、６９Ｆ４株を使用した発酵槽は、６９Ｅ１株と同様の力価を蓄積しなかった。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、６９Ｅ１株のｐｈｏＡプロモータ（より強力なプロモータ）と比較して、６９Ｆ４株のｔａｃプロモータ下で発現されるＤｓｂＣの準最適レベルに起因する可能性がある。６９Ｅ８株を使用した発酵槽は、対照プロセスと同様の力価を有した。理論に拘束されることを望むものではないが、これはＦｋｐＡの準最適レベルに起因する可能性がある。
実施例９：操作された６９Ｅ１株における抗ＶＥＧＦ抗体断片の発現
抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ断片を産生する６９Ｅ１株の能力を評価した。６９Ｅ１株および対照株６７Ａ６を、実施例１に記載されているように、プラスミドＨＳＫ１１７で形質転換して、抗ＶＥＧＦ抗体断片を発現させた。株を、実施例１に記載されているように、１０Ｌの発酵槽で増殖させ、抗ＶＥＧＦ抗体断片濃度を７２時間にわたって様々な時点で評価した。
発酵中、光学密度（図１２Ａ）およびオスモル濃度（図１２Ｂ）を測定した。６９Ｅ１株は、７２時間で対照よりもわずかに高い光学密度を示した（図１２Ａ）。６９Ｅ１株における抗ＶＥＧＦ抗体断片の発現もまた、試験したすべての時点でプラスミド対照の発現を超えた（図１３）。
これらのデータは、染色体シャペロン過剰発現を有する株を、プラスミドベースのシャペロン過剰発現を使用する株と比較して、より高い力価の抗ＶＥＧＦ抗体断片を産生するために使用できることを実証している。
まとめると、実施例５～９の結果は、シャペロンの染色体過剰発現が、プラスミドベースのシャペロン発現に匹敵する力価を生じる可能性を有することを実証している。二重特異性半抗体ｘＩＬ１３およびＡＦ２、１アーム抗体ＭｅｔＭＡｂ、および抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ断片を含むいくつかの分子フォーマットを試験した。３つの操作された６９Ｅ１、６８Ｆ８、および６９Ｆ４株を使用した発酵は、追加のプロセス開発がほとんどまたは全くない対照プロセスと比較して、同等またはより高い力価を有した。さらに、１つの場合（６９Ｆ８宿主でのＡＦ２の場合）、対照を超える事例では、追加の開発を行わなかったので、ここで観察されたレベルを超える力価をさらに駆動するために、分子ごとにさらなるプロセス開発努力を行うことができる可能性がある。高い力価を達成することに加えて、これらの株は、追加のプラスミドクローニング作業を必要とせず、シャペロン発現を評価するための迅速かつ容易な方法を提供する。いくつかの場合（例えば、ｘＩＬ１３プロセスにおける６９Ｆ８株）では、より低いレベルのＦｋｐＡで同様の力価が得られた。これはＦｋｐＡのクリアランスのために追加のカラム精製が必要ないので、下流の精製にとって望ましい。

Claims (112)

  1. 宿主細胞染色体を含む原核宿主細胞中で、２つの鎖を含むポリペプチドを産生する方法であって、
    （ａ）宿主細胞を、前記ポリペプチドの前記２つの鎖の発現に適した条件下の培養培地中で、前記ポリペプチドの前記２つの鎖を発現するように培養し、それによって、発現すると、前記２つの鎖は折り畳まれ、組み立てられて、前記宿主細胞中で生物学的に活性なポリペプチドを形成することであって、
    前記宿主細胞が、
    （１）前記ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド、
    （２）前記ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、前記第１および第２のポリヌクレオチドは、１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドの一部である）、および
    （３）ペプチジル－プロリルイソメラーゼおよびタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼからなる群から選択されるシャペロンタンパク質をコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、前記第３の翻訳単位が前記宿主細胞染色体の一部であり、前記第３の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ前記第３の翻訳単位の転写を駆動するプロモータと作動可能な組合せにあり、前記第３の翻訳単位と前記プロモータとの組合せが、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、第３のポリヌクレオチド
    を含む、形成すること、ならびに
    （ｂ）前記宿主細胞から前記生物学的に活性なポリペプチドを回収すること
    を含む、方法。
  2. 前記プロモータが、誘導性プロモータである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記誘導性プロモータが、前記培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、前記第３の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記誘導性プロモータが、前記培養培地中にイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）が存在する場合に、前記第３の翻訳単位の転写を駆動するＩＰＴＧ誘導性プロモータである、請求項２に記載の方法。
  5. 前記プロモータが、構成的プロモータである、請求項１に記載の方法。
  6. 前記構成的プロモータが、ＣＰ２５プロモータである、請求項５に記載の方法。
  7. 前記第３の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に対して天然である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記第３の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記シャペロンタンパク質が、ペプチジル－プロリルイソメラーゼである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記ペプチジル－プロリルイソメラーゼが、ＦｋｐＡタンパク質である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ＦｋｐＡが、大腸菌ＦｋｐＡである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記シャペロンタンパク質が、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＣタンパク質である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、大腸菌ＤｓｂＣである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＡタンパク質である、請求項１２に記載の方法。
  16. 前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、大腸菌ＤｓｂＡである、請求項１５に記載の方法。
  17. 宿主細胞染色体を含む原核宿主細胞中で、２つの鎖を含むポリペプチドを産生する方法であって、
    （ａ）宿主細胞を、前記ポリペプチドの前記２つの鎖の発現に適した条件下の培養培地中で、前記ポリペプチドの前記２つの鎖を発現するように培養し、それによって、発現すると、前記２つの鎖は折り畳まれ、組み立てられて、前記宿主細胞中で生物学的に活性なポリペプチドを形成することであって、
    前記宿主細胞が、
    （１）前記ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド、
    （２）前記ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチド（ここで、前記第１および第２のポリヌクレオチドは、１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドの一部である）、
    （３）タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、前記第３の翻訳単位は前記宿主細胞染色体の一部であり、前記第３の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ前記第３の翻訳単位の転写を駆動する第１のプロモータと作動可能な組合せにあり、前記第３の翻訳単位と前記第１のプロモータとの組合せが、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、第３のポリヌクレオチド、および
    （４）ペプチジル－プロリルイソメラーゼをコードする第４の翻訳単位を含む第４のポリヌクレオチドであって、前記第４の翻訳単位は前記宿主細胞染色体の一部であり、前記第４の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ前記第４の翻訳単位の転写を駆動する第２のプロモータと作動可能な組合せにあり、前記第４の翻訳単位と前記第２のプロモータとの組合せが、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、第４のポリヌクレオチドを含む、
    形成すること、ならびに
    （ｂ）前記宿主細胞から前記生物学的に活性なポリペプチドを回収すること
    を含む、方法。
  18. 前記第１および第２のプロモータが両方とも、誘導性プロモータである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記第１および第２のプロモータが両方とも、前記培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、それぞれ前記第３および第４の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記第１および第２のプロモータの一方が誘導性プロモータであり、前記第１および第２のプロモータの他方が構成的プロモータである、請求項１７に記載の方法。
  21. 前記第１のプロモータが誘導性プロモータであり、前記第２のプロモータが構成的プロモータである、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記第１のプロモータが、前記培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、前記第３の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータであり、前記第２のプロモータがＣＰ２５プロモータである、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記第２のプロモータが誘導性プロモータであり、前記第１のプロモータが構成的プロモータである、請求項２０に記載の方法。
  24. 前記第３の翻訳単位および前記第４の翻訳単位の一方または両方が、前記宿主細胞染色体に対して天然である、請求項１７から２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記第３の翻訳単位および前記第４の翻訳単位が両方とも、前記宿主細胞染色体に対して天然である、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記第３の翻訳単位および前記第４の翻訳単位の一方または両方が、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、請求項１７から２３のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＣタンパク質である、請求項１７から２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、大腸菌ＤｓｂＣである、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ペプチジル－プロリルイソメラーゼが、ＦｋｐＡタンパク質である、請求項１７から２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記ＦｋｐＡが、大腸菌ＦｋｐＡである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、大腸菌ＤｓｂＣであり、前記第１のプロモータが、前記培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、前記第３の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータであり、前記ペプチジル－プロリルイソメラーゼが、大腸菌ＦｋｐＡであり、前記第２のプロモータが、ＣＰ２５プロモータである、請求項１７に記載の方法。
  32. 前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、大腸菌ＤｓｂＣであり、前記第１のプロモータが、前記培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、前記第３の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータであり、前記ペプチジル－プロリルイソメラーゼが、大腸菌ＦｋｐＡであり、前記第２のプロモータが、前記培養培地中のリン酸塩が枯渇したときに、前記第４の翻訳単位の転写を駆動するＰｈｏプロモータである、請求項１７に記載の方法。
  33. 前記宿主細胞が、（５）第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第５の翻訳単位を含む第５のポリヌクレオチドであって、前記第５の翻訳単位は前記宿主細胞染色体の一部であり、前記第５の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ前記第５の翻訳単位の転写を駆動する第３のプロモータと作動可能な組合せにあり、前記第５の翻訳単位と前記第３のプロモータとの組合せが、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、第５のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  34. 前記第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＡタンパク質である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、大腸菌ＤｓｂＡである、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記第３のプロモータが、誘導性プロモータである、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記第３のプロモータが、前記培養培地中にイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）が存在する場合に、前記第５の翻訳単位の転写を駆動するＩＰＴＧ誘導性プロモータである、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記第５の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に対して天然である、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記第５の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記第１のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、大腸菌ＤｓｂＣであり、前記第１のプロモータが、前記培養培地中にイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）が存在する場合に、前記第３の翻訳単位の転写を駆動するＩＰＴＧ誘導性プロモータであり、前記ペプチジル－プロリルイソメラーゼが、大腸菌ＦｋｐＡであり、前記第２のプロモータが、ＣＰ２５プロモータであり、前記第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、大腸菌ＤｓｂＡであり、前記第３のプロモータが、前記培養培地中にイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）が存在する場合に、前記第５の翻訳単位の転写を駆動するＩＰＴＧ誘導性プロモータである、請求項３３に記載の方法。
  41. 前記宿主細胞が、（６）前記ポリペプチドの第３の鎖をコードする第６の翻訳単位を含む第６のポリヌクレオチドチドであって、前記第６のポリヌクレオチドが、前記１つ以上の染色体外ポリヌクレオチドの一部である、第６のポリヌクレオチドをさらに含み、それによって、発現すると、前記３つの鎖が折り畳まれ、組み立てられて、前記宿主細胞中で生物学的に活性なポリペプチドを形成する、請求項１７から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記第１の翻訳単位が、免疫グロブリン重鎖をコードし、前記第２の翻訳単位が、免疫グロブリン軽鎖をコードし、前記第６の翻訳単位が、免疫グロブリンＦｃ断片をコードし、前記３つの鎖が折り畳まれ、組み立てられて生物学的に活性な一価抗体を形成する、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記一価抗体が、抗原に特異的に結合することができる、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記第１および第２のポリヌクレオチドが両方とも、単一の染色体外発現ベクターの一部である、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記染色体外発現ベクターが、選択剤に対する耐性を促進する選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記宿主細胞が、前記選択可能マーカーの発現に適した条件下で培養され、前記培養培地が、前記選択剤をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記染色体外発現ベクターが、前記原核宿主細胞中で前記染色体外発現ベクターを複製するのに適した複製起点をさらに含む、請求項４４または請求項４５に記載の方法。
  47. 前記ポリペプチドの前記２つの鎖が、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに連結される、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記ポリペプチドが、ヘテロ二量体のモノマーである、請求項１から４１および４３から４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記ポリペプチドが半抗体であり、前記第１の鎖および前記第２の鎖が、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項１から４１および４３から４７のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記半抗体が、抗原に特異的に結合することができる、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記ポリペプチドが、分泌タンパク質である、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記分泌タンパク質が、前記宿主細胞の前記ペリプラズムから回収される、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記原核宿主細胞が、グラム陰性細菌である、請求項１から５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記グラム陰性細菌が、大腸菌である、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記大腸菌が、内因性プロテアーゼ活性を欠く株のものである、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記大腸菌が、ｄｅｇｐＳ２１０Ａ変異を有する株である、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記大腸菌が、増強されたＬａｃＩ産生または活性を有する株のものである、請求項５４から５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記大腸菌が、ｌａｃＩＱ変異を有する株である、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記大腸菌が、ΔｆｈｕＡ ΔｐｈｏＡ ｉｌｖＧ２０９６（ＩｌｖＧ＋、Ｖａｌｒ）Δｐｒｃ ｓｐｒ４３Ｈ１ ΔｍａｎＡ ｌａｃＩＱ ΔｏｍｐＴ ΔｍｅｎＥ７４２ ｄｅｇＰＳ２１０Ａ株のものである、請求項５４に記載の方法。
  60. 第１の抗原に結合することができる第１の半抗体と、第２の抗原に結合することができる第２の半抗体とを含む、二重特異性抗体の産生方法であって、
    前記第１の翻訳単位が、前記第１の半抗体の重鎖をコードし、前記第２の翻訳単位が、前記第１の半抗体の軽鎖をコードし、前記第１の半抗体が、少なくとも１つのノブ形成変異を含む、請求項１から４０および４４から５９のいずれか一項に記載の方法に従って前記第１の半抗体を産生することと、
    前記第１の翻訳単位が、前記第２の半抗体の重鎖をコードし、前記第２の翻訳単位が、前記第２の半抗体の軽鎖をコードし、前記第２の半抗体が、少なくとも１つのホール形成変異を含む、請求項１から４０および４４から５９のいずれか一項に記載の方法に従って前記第２の半抗体を産生することと、
    還元条件で、前記第１の半抗体を前記第２の半抗体と組み合わせて、前記二重特異性抗体を産生することとを含む、方法。
  61. 前記第１の抗原および前記第２の抗原が、異なる抗原である、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記還元条件を達成するために還元剤を添加する工程をさらに含む、請求項６０または請求項６１に記載の方法。
  63. 前記還元剤が、グルタチオンである、請求項６２に記載の方法。
  64. 宿主細胞染色体を含む原核宿主細胞であって、
    （１）ペプチジル－プロリルイソメラーゼをコードする第１の翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチドであって、前記第１の翻訳単位は前記宿主細胞染色体の一部であり、前記第１の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ前記第１の翻訳単位の転写を駆動する第１のプロモータと作動可能な組合せにあり、前記第１の翻訳単位と前記第１のプロモータとの組合せが、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、第１のポリヌクレオチド、および
    （２）タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第２の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチドであって、前記第２の翻訳単位は前記宿主細胞染色体の一部であり、前記第２の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ前記第２の翻訳単位の転写を駆動する第２のプロモータと作動可能な組合せにあり、前記第２の翻訳単位と前記第２のプロモータとの組合せが、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、第２のポリヌクレオチドを含む、原核宿主細胞。
  65. 前記第１の翻訳単位および前記第２の翻訳単位の一方または両方が、前記宿主細胞染色体に対して天然である、請求項６４に記載の原核宿主細胞。
  66. 前記第１の翻訳単位および前記第２の翻訳単位の両方が、前記宿主細胞染色体に対して天然である、請求項６５に記載の原核宿主細胞。
  67. 前記第１の翻訳単位および前記第２の翻訳単位の一方または両方が、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、請求項６４に記載の原核宿主細胞。
  68. 前記第１のプロモータが、第１の誘導性プロモータである、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
  69. 前記第１の誘導性プロモータが、Ｐｈｏプロモータである、請求項６８に記載の原核宿主細胞。
  70. 前記第１の誘導性プロモータが、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモータである、請求項６８に記載の原核宿主細胞。
  71. 前記第１のプロモータが、第１の構成的プロモータである、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
  72. 前記第１の構成的プロモータが、ＣＰ２５プロモータである、請求項７１に記載の原核宿主細胞。
  73. 前記第２のプロモータが、第２の誘導性プロモータである、請求項６４から７２のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
  74. 前記第２の誘導性プロモータが、Ｐｈｏプロモータである、請求項７３に記載の原核宿主細胞。
  75. 前記第２の誘導性プロモータが、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモータである、請求項７３に記載の原核宿主細胞。
  76. 前記第２のプロモータが、第２の構成的プロモータである、請求項６４から７２のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
  77. 前記第２の構成的プロモータが、ＣＰ２５プロモータである、請求項７６に記載の原核宿主細胞。
  78. 前記ペプチジル－プロリルイソメラーゼが、ＦｋｐＡタンパク質である、請求項６４から７７のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
  79. 前記ＦｋｐＡが、大腸菌ＦｋｐＡである、請求項７８に記載の原核宿主細胞。
  80. 前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＣタンパク質である、請求項６４から７９のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
  81. 前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、大腸菌ＤｓｂＣである、請求項８０に記載の原核宿主細胞。
  82. 前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＡタンパク質である、請求項６４から７９のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
  83. 前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、大腸菌ＤｓｂＡである、請求項８２に記載の原核宿主細胞。
  84. 前記ペプチジル－プロリルイソメラーゼが、ＦｋｐＡタンパク質であり、前記第１のプロモータが、ＣＰ２５プロモータであり、前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＣタンパク質であり、前記第２のプロモータが、Ｐｈｏプロモータである、請求項６４に記載の原核宿主細胞。
  85. 前記ペプチジル－プロリルイソメラーゼが、ＦｋｐＡタンパク質であり、前記第１のプロモータが、Ｐｈｏプロモータであり、前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＣタンパク質であり、前記第２のプロモータが、Ｐｈｏプロモータである、請求項６４に記載の原核宿主細胞。
  86. 請求項６４から８３のいずれか一項に記載の原核宿主細胞であって、
    （３）第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼをコードする第３の翻訳単位を含む第３のポリヌクレオチドであって、前記第３の翻訳単位は前記宿主細胞染色体の一部であり、前記第３の翻訳単位が、前記宿主細胞染色体に組み込まれ、かつ前記第３の翻訳単位の転写を駆動する第３のプロモータと作動可能な組合せにあり、前記第３の翻訳単位と前記第３のプロモータとの組合せが、前記宿主細胞染色体に対して非天然である、第３のポリヌクレオチドをさらに含む、原核宿主細胞。
  87. 前記第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＡタンパク質である、請求項８６に記載の原核宿主細胞。
  88. 前記第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、大腸菌ＤｓｂＡである、請求項８７に記載の原核宿主細胞。
  89. 前記第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＣタンパク質である、請求項８６に記載の原核宿主細胞。
  90. 前記第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、大腸菌ＤｓｂＣである、請求項８９に記載の原核宿主細胞。
  91. 前記第３のプロモータが、第３の誘導性プロモータである、請求項８６から９０のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
  92. 前記第３の誘導性プロモータが、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモータである、請求項９１に記載の原核宿主細胞。
  93. 前記ペプチジル－プロリルイソメラーゼが、ＦｋｐＡタンパク質であり、前記第１のプロモータが、ＣＰ２５プロモータであり、前記第１のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＣタンパク質であり、前記第２のプロモータが、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモータであり、前記第２のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＡタンパク質であり、前記第３のプロモータが、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモータである、請求項８６に記載の原核宿主細胞。
  94. 前記原核宿主細胞が、グラム陰性細菌である、請求項６４から９３のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
  95. 前記グラム陰性細菌が、大腸菌である、請求項９４に記載の原核宿主細胞。
  96. 前記大腸菌が、内因性プロテアーゼ活性を欠く株のものである、請求項９５に記載の原核宿主細胞。
  97. 前記大腸菌が、ｄｅｇｐＳ２１０Ａ変異を有する株である、請求項９６に記載の原核宿主細胞。
  98. 前記大腸菌が、増強されたＬａｃＩ産生または活性を有する株のものである、請求項９５から９７のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
  99. 前記大腸菌が、ｌａｃＩＱ変異を有する株である、請求項９８に記載の原核宿主細胞。
  100. 前記大腸菌が、ΔｆｈｕＡ ΔｐｈｏＡ ｉｌｖＧ２０９６（ＩｌｖＧ＋、Ｖａｌｒ）Δｐｒｃ ｓｐｒ４３Ｈ１ ΔｍａｎＡ ｌａｃＩＱ ΔｏｍｐＴ ΔｍｅｎＥ７４２ ｄｅｇＰＳ２１０Ａ株のものである、請求項９５に記載の原核宿主細胞。
  101. （ａ）２鎖ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の染色体外翻訳単位を含む第１の染色体外ポリヌクレオチド、および（ｂ）前記２鎖ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の染色体外翻訳単位を含む第２の染色体外ポリヌクレオチドを含む染色体外発現ベクターを含む染色体外発現ベクターであって、それによって、発現すると、前記２つの鎖が折り畳まれ、組み立てられて、前記宿主細胞において生物学的に活性な２鎖ポリペプチドを形成する、染色体外発現ベクターをさらに含む、請求項６４から１００のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
  102. 前記染色体外発現ベクターが、前記原核宿主細胞中で前記染色体外発現ベクターを複製するのに適した複製起点をさらに含む、請求項１０１に記載の原核宿主細胞。
  103. 前記染色体外発現ベクターが、選択剤に対する耐性を促進する選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１０１または請求項１０２に記載の原核宿主細胞。
  104. 前記２鎖ポリペプチドの前記２つの鎖が、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに連結される、請求項１０１から１０３のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
  105. 前記２鎖ポリペプチドが、ヘテロ二量体のモノマーである、請求項１０１から１０４のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
  106. 前記ポリペプチドが半抗体であり、前記第１の鎖および前記第２の鎖が免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項１０１から１０４のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
  107. 前記半抗体が、抗原に特異的に結合することができる、請求項１０６に記載の原核宿主細胞。
  108. 前記２鎖ポリペプチドが、分泌タンパク質である、請求項１０１から１０４のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
  109. 前記分泌タンパク質が、前記宿主細胞の前記ペリプラズムから回収される、請求項１０８に記載の原核宿主細胞。
  110. 前記染色体外発現ベクターが、２鎖ポリペプチドの第３の鎖をコードする第３の染色体外翻訳単位を含む第３の染色体外ポリヌクレオチドをさらに含み、それによって、発現すると、前記３つの鎖が折り畳まれ、組み立てられて、前記宿主細胞中で生物学的に活性なポリペプチドを形成する、請求項１０１から１０４のいずれか一項に記載の原核宿主細胞。
  111. 前記第１の染色体外翻訳単位が免疫グロブリン重鎖をコードし、前記第２の染色体外翻訳単位が免疫グロブリン軽鎖をコードし、前記第３の染色体外翻訳単位が免疫グロブリンＦｃ断片をコードし、前記３つの鎖が折り畳まれ、組み立てられて、生物学的に活性な一価抗体を形成する、請求項１１０に記載の原核宿主細胞。
  112. 前記一価抗体が、抗原に特異的に結合することができる、請求項１１１に記載の原核宿主細胞。
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