JP2022110110A - 糸状真菌宿主細胞によって発現された組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、特許文献1の優先権を主張し、当該出願の全ての内容が参照により本願に援用される。
選択マーカー遺伝子発現カセット及びシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットを含む少なくとも1つの組込み型発現ベクターを構築する、ステップS1と、
組込み型発現ベクターによる糸状真菌宿主細胞の形質転換後、選別してシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットの1つ以上のコピーを含有する組換え糸状真菌宿主細胞を得る、ステップS2とを含む。
少なくとも1つのランダム組込み発現ベクターを構築し、凍結融解法によりアグロバクテリウム・ツメファシェンスAGL-1形質転換受容性細胞に導入することにより、上記ランダム組込み発現ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシェンスAGL-1細胞を得て、当該細胞の感染液を製造してpyr4遺伝子が欠失されたトリコデルマ・リーセイと共培養し、選別してシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットの1つ以上のコピーを含有するトリコデルマ・リーセイ株、すなわち目的宿主細胞を得る。
(1)トリコデルマ・リーセイのCBH1、CBH2、EG1、EG2の4つの遺伝子座部位をターゲットとするシュウ酸デカルボキシラーゼ発現ベクターをそれぞれ構築する。
(2)pyr4及びmus53遺伝子が欠失されたトリコデルマ・リーセイ株において、部位特異性組込みノックインの方式によりCBH1、CBH2、EG1及びEG2部位ゲノムにステップ(1)の各部位に対応する発現ベクターにおける発現カセットを組み込む。これらの部位に部位特異的に組み込まれた後、細胞外分泌総タンパクにおける夾雑タンパク質の含有量が極めて少なく、ほぼ全てが目的タンパク質であるため、当該方法により生産されたシュウ酸デカルボキシラーゼ発酵液の後続の処理はより簡単で且つ経済的である。mus53遺伝子がノックアウトされると部位特異的組込みの確率は大幅に向上するため、後続の部位特異性組込み株の選別は容易になる。
(3)pyr4及びmus53遺伝子修復ベクターを用いて、ステップ(2)で得た菌株に対しmus53及びpyr4遺伝子の修復を行う。修復が成功した菌株はすなわち目的宿主細胞である。pyr4遺伝子が修復されると、発酵中に培地にさらにウラシル又はウリジンを加える必要がなく、宿主細胞は固有する代謝平衡を保持できるため、発酵コストが上がらない。また、mus53遺伝子が修復されると、宿主細胞は固有する安定性を保持し、mus53遺伝子の欠失がもたらすゲノムが不安定になる要因を解消することができる。
本発明は、真菌に由来するシュウ酸デカルボキシラーゼが効果的な組換え発現を実現できないという技術的課題を解決し、糸状真菌宿主細胞によって組換え発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼに対し、各種の翻訳後加工を行うことができ、効果的に分泌発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼは天然宿主細胞において製造されたシュウ酸デカルボキシラーゼに類似する酵素学的性質を有する。当該宿主細胞の培養は簡単であり、シュウ酸デカルボキシラーゼの分泌量が多く酵素活性が高い。本発明による2種の培地の配合はそれぞれ2種の組換え糸状真菌宿主細胞に適用され、収量を効果的に向上させることができる。シュウ酸デカルボキシラーゼの生産において、発現カセットの構築、ベクター構築、宿主細胞の構築及び培地配合の最終的な調整により、収率及び製品の酵素活性はいずれも大幅に向上し、シュウ酸デカルボキシラーゼの人力生産は大規模な産業化を実現できず、酵素学的特性が不安定であり、生産コストが高いという従来技術における課題を効果的に解決できる。
Adaptation Index)が0.51から0.99に、G+Cの含有量が53.09%から69.23%に変化し、最適化された配列は配列番号17に示すとおりである。最適化されたチャジュタケのOXDC遺伝子における成熟ペプチドのDNAコード配列をTRA2と新たに命名した。
トリコデルマ・リーセイRut-C30(ATCC寄託番号:56765)をPDA培地に接種し、28℃の恒温で胞子が成熟するまで7日培養した。無菌水で胞子を溶出させて、適量の胞子懸濁液を調製し、液体培地20mlに接種し、28℃で170rpmの条件において36~48時間培養した。吸引濾過により菌糸体を収集し、脱イオン水で2回洗浄し、液体窒素冷凍において菌糸体を微粉に粉砕し、上海Sangon Biotech社製のEzup型カラム型真菌ゲノムDNA抽出キットを使用してゲノムDNAを分離した。
pCAMBIA1300プラスミドをテンプレートとして、次の表1に示すプライマーpMDT05-F1及びpMDT05-R1を使用してPCR増幅を行い、1%アガロースゲル電気泳動によりPCR産物を分離し、ゲルから約6.8kbの断片を切り出し、omega社提供のゲル抽出キットを用いて回収し、回収した断片を精製して制限酵素XhoI及びXbaIを用いて1時間消化し、消化完了後、omega社提供のPCR産物回収キットを用いて精製・回収を行った。
公開文献に記載されたトリコデルマ・リーセイpyr4遺伝子(オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子)の情報(非特許文献3)を参照し、BLASTNプログラムを利用してトリコデルマ・リーセイのゲノムデータベースでpyr4遺伝子の位置における遺伝子座配列情報を検索した(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)。上述したように抽出されたトリコデルマ・リーセイのゲノムDNAをテンプレートとして、表2に示すプライマーpyr4-3F/pyr4-3R及びpyr4-5F/pyr4-5Rを使用してそれぞれ増幅することにより約1.3kbのpyr4遺伝子の上流ホモロジーアーム断片及び約1.3kbのpyr4遺伝子の下流ホモロジーアーム断片を得た。pyr4遺伝子の上流ホモロジーアーム断片及びpyr4遺伝子の下流ホモロジーアーム断片をモル比1:1の比率で混合してテンプレートとし、pyr4-3F及びpyr4-5Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとし、SOE-PCR増幅することにより約2.6kbのpyr4遺伝子ノックアウトカセットを得た。
凍結融解法(非特許文献4)により上記ノックアウトベクターpMDT05-pyr4KOをアグロバクテリウム・ツメファシェンスAGL-1形質転換受容性細胞に導入し、28℃で3~4時間活性化させた後、適量の菌液を採取してkan(50μg/mL)及びGent(50μg/mL)を含有するLBプレート培地に塗布し、28℃で48~72時間倒置培養した後、モノクローナルをピッキングしてkan(50μg/mL)及びGent(50μg/mL)を含有するLB液体培地に接種し、振盪培養機を用いて28℃で220rpmにおいて24時間培養し、少量の菌液を採取してコロニーのPCR検証を行うことにより陽性形質転換体を選別した。
実施例2で製造されたプラスミドベクターpMDT05をテンプレートとして、表3に示すプライマーF1及びR1をフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してPCR増幅することにより約6.6kbのベクター骨格断片を得て、ゲルを用いて当該断片を回収後、制限酵素DpnIで3時間消化し、目的断片を回収しておく。
トリコデルマ・リーセイのゲノムDNAをテンプレートとして、表3に示すプライマーPcbh1-F及びPcbh1-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してCBH1遺伝子のプロモーター及びCBH1遺伝子のシグナルペプチドコード配列Pcbh1-sigをPCR増幅し、トリコデルマ・リーセイのゲノムDNAをテンプレートとして、表3に示すプライマーTcbh1-F及びTcbh1-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してCBH1遺伝子のターミネーター配列Tcbh1をPCR増幅した。Pcbh1-sig断片及びTcbh1断片をモル比1:1で混合してテンプレートとし、プライマーPcbh1-F及びTcbh1-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してPCR増幅することにより、約3.3kbの融合断片Pcbh1-sig-Tcbh1を得て、目的断片を回収しEcoRI及びPstIで当該断片を消化し、ゲル回収しておく。プラスミドpUC19に対して同様に制限酵素EcoRI及びPstIで3時間消化し、ベクター骨格断片をゲル回収し、消化・回収後のPcbh1-sig-Tcbh1断片とT4 DNAリガーゼでライゲーションさせて、大腸菌TOP10形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをpUC19-Pcbh1-sig-Tcbh1と命名した。
制限酵素EcoRI及びXbaIで、上述したように製造されたベクターpMGUを3時間消化し、ベクター骨格断片をゲル回収しておく。上述したように製造されたベクターpUC19-Pcbh1-sig-TRA2-Tcbh1をテンプレートとして、表3に示すプライマーF2及びR2をフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してPcbh1-sig-TRA2-Tcbh1断片をPCR増幅し、当該目的断片をゲル回収しておく。制限酵素EcoRI及びXbaIでpMGUを消化して回収したベクター骨格及びPcbh1-sig-TRA2-Tcbh1断片を、ClonExpress(登録商標)IIによるワンステップ法クローニングキットを用いて組み立て、大腸菌TOP10形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをpMGU-cbh1-TRA2と命名し、図3はトリコデルマ・リーセイのランダム組込み誘導型発現ベクターpMGU-cbh1-TRA2の構築を示す。
実施例2で製造されたベクターpMDT05をテンプレートとして、表3に示すプライマーF1及びR1を使用してPCR増幅することにより6.6kbのベクター骨格を得て、当該断片をゲル回収して制限酵素DpnIで3時間消化し、目的断片を回収しておく。
上述したように製造されたベクターpDGUを制限酵素XbaIで3時間消化切断し、次に制限酵素EcoRIを加えて5分消化切断して不完全消化を行い、サイズが大きなベクター骨格断片をゲル回収しておく。プラスミドpUC19-Ppdc-sig-TRA2-Tpdcをテンプレートとして、表3に示すプライマーF3及びR3をフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用して、Ppdc-sig-TRA2-Tpdc断片をPCR増幅し、目的断片をゲル回収しておく。ClonExpress(登録商標)IIによるワンステップ法クローニングキットを用いて、上記pDGUを消化・回収後のベクター骨格断片及びPpdc-sig-TRA2-Tpdc断片を組み立て、大腸菌TOP10形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをpDGU-pdc-TRA2と命名し、これは即ちトリコデルマ・リーセイのランダム組込み構成型発現ベクターpDGU-pdc-TRA2であり、図4はその構築を示す図である。
TRA2-F:ATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATC
TRA2-R:TTAGGCAGGGCCGACGACAATAGG
6g/L、ふすま粉 2g/L、Mandels微量元素(1000×) 1ml、MnCl2 5mMであり、pHは4.5である。
93℃、120秒;
95℃、60秒;
94℃、30秒;60℃、60秒;72℃、180秒;10サイクル;
94℃、30秒;25℃、120秒;150秒以内に、72℃に均一昇温;72℃、180秒;
94℃、20秒;58℃、60秒;72℃、120秒;25サイクル;
最後に72℃、300秒。
94℃、120秒;
94℃、20秒;68℃(-1℃/サイクル)、60秒;72℃、180秒;15サイクル;
94℃、20秒;53℃、60秒;72℃、180秒;15サイクル;
最後に72℃、300秒。
pyr4-F1:5’-TCAGATCTAGTGTTTGATGCTCACGCTCGGAT-3’;
pyr4-R1:5’-TTTCTAGATGAACAGTAAGGTGTCAGCA-3’。
公開文献に記載のトリコデルマ・リーセイmus53遺伝子(タンパク質Id:58509)の情報(非特許文献7)を参照して、トリコデルマ・リーセイゲノムデータベースにおけるmus53遺伝子の位置の遺伝子座配列情報を検索した(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)。
実施例4に記載の方法及びステップを利用して、アグロバクテリウム仲介による形質転換の方法によりmus53遺伝子ノックアウトベクターpMDT05-mus53KOでトリコデルマ・リーセイRut-C30(pyr4-)株を形質転換することにより、294の形質転換体を得て、各形質転換体を固体MM培地(セファロスポリン300μg/mL及びハイグロマイシン200μg/mL)プレート及び固体MM培地(セファロスポリン300μg/mL)プレートにそれぞれスポットして二次選別を行い、28℃で3日培養して、ハイグロマイシン耐性を有しない44の形質転換体を得て、このうちの31の形質転換体を選択してPDAプレートに移し、28℃で7日培養した。
キーワード検索により、トリコデルマ・リーセイゲノムデータベース(http://genome. jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)からCBH1(Cel7A)遺伝子座に対応するDNA配列情報を取得した。
キーワード検索によりトリコデルマ・リーセイゲノムデータベース(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)からCBH2(Cel6A)遺伝子座に対応するDNA配列情報を取得した。
キーワード検索によりトリコデルマ・リーセイゲノムデータベース(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)からEG1(Cel7B)遺伝子座に対応するDNA配列情報を取得した。
キーワード検索によりトリコデルマ・リーセイゲノムデータベース(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)からEG2(Cel5B)遺伝子座に対応するDNA配列情報を取得した。
実施例4に記載の方法及びステップを利用して、アグロバクテリウム仲介による形質転換の方法により、CBH1部位に対する部位特異的組込み発現ベクターpMDT05-CBH1-TRA2(KI)でトリコデルマ・リーセイRut-C30(pyr4-、mus53-)株を形質転換し、36の形質転換体をピッキングして固体MM培地(セファロスポリン300μg/mL)プレートにスポットして二次選別を行い、28℃で3日培養し、このうちから20をピッキングして成長状態が良好な形質転換体菌糸をPDAプレートにスポットし、28℃で7日分生子の培養を行った。
菌株LYH-D1(pyr4-、mus53-)を元に、上述したCBH1部位に対する部位特異的組込みノックインの方法及びステップを利用して、アグロバクテリウム仲介による形質転換の方法によりCBH2部位に対する部位特異的組込み発現ベクターpMDT05-CBH2-TRA2(KI)でトリコデルマ・リーセイLYH-D1(pyr4-、mus53-)株を形質転換することにより、2コピーの部位特異的組込み株LYH-D2(pyr4-、mus53-)を得た。
菌株LYH-D2(pyr4-、mus53-)を元に、上述したCBH1部位に対する部位特異的組込みノックインの方法及びステップを利用して、アグロバクテリウム仲介による形質転換の方法によりEG1部位に対する部位特異的組込み発現ベクターpMDT05-EG1-TRA2(KI)でトリコデルマ・リーセイLYH-D2(pyr4-、mus53-)株を形質転換することにより、3コピーの部位特異的組込み株LYH-D3(pyr4-、mus53-)を得た。
菌株LYH-D3(pyr4-、mus53-)を元に、上述したCBH1部位に対する部位特異的組込みノックインの方法及びステップを利用して、アグロバクテリウム仲介による形質転換の方法によりEG2部位に対する部位特異的組込み発現ベクターpMDT05-EG2-TRA2(KI)でトリコデルマ・リーセイLYH-D3(pyr4-、mus53-)株を形質転換することにより、4コピーの部位特異的組込み株LYH-D4(pyr4-、mus53-)を得た。
MUS-YZ-F2:GTGCTGGGAGACGATGTGATG
mus3-YZ-F:CAGCAGCGACGCGATTCCTTC
MUS-YZ-R2:CTGCTTCAGAATGATGCGGATG
組換えトリコデルマ・リーセイ菌LYH-D4の菌糸を複数のPDA固体斜面培地に接種し、28℃で7日培養し、分生子が成長して緑色になると、無菌水で洗い流して胞子懸濁液を収集し、胞子濃度を1.0×108個/ml前後に調整し、1%の接種量でMM液体培地500mLに接種し、28℃で24~36時間暗所振盪(170rpm)して培養し、これを7L発酵タンクによる発酵のシード培養液とした。
トリコデルマ・リーセイの発酵プロセスは以下の2つ段階に分かれる。第1段階の菌糸体成長段階(0~72時間):7L発酵タンク(上海保興生物設備工程有限公司提供)に基礎発酵培地(グルコース 20g/L、コーンスティープリカー 7g/L、KH2PO4 4g/L、尿素 1g/L、硫酸アンモニウム 2g/L、MgSO4・7H2O
0.5g/L、CaCl2 1g/L、MnCl2 1mM、Mandels微量元素(1000×) 1ml/L、pH=4.0)4.5Lを加え、10%の比率で調製されたトリコデルマ・リーセイのシード培養液に接種し、28℃で約72時間通気攪拌しながら培養し、溶存酸素量を30%以上に保持し、攪拌回転数は溶存酸素量に基づき調整し、一般に250~500rpmに制御し、pHは3.5~4.0前後に保持した。菌糸体成長段階において、トリコデルマ・リーセイ菌体が成長するにつれて、一般に24~28時間経過後にグルコースがほぼ完全に消費され、このとき、12ml/時間のスピードで250g/Lのラクトース溶液を補足した。約72時間培養後に菌体の乾燥重量は15~18g/Lに達する。第2段階の誘導発現段階(72~168時間):発酵開始後72時間に、蠕動運動ポンプを用いて250g/Lのラクトース溶液を流加し、作業環境濃度を常に2g/l以下、溶存酸素量を常に20%より大きくし、28℃で接種後約168時間まで通気攪拌培養し、pHは4.0前後に保持した。24時間経過するごとに発酵液上清をサンプリングしてシュウ酸デカルボキシラーゼ活性を検出し、約160時間発酵後における発酵液上清の活性は271756U/Lに達する(図13参照)。136時間及び160時間発酵液上清を採取して10倍希釈してSDS-PAGE検出を行うと、分子量が約60KDaの目的タンパク質バンドは明確に確認された(図14参照)。160時間発酵液試料を200倍及び500倍希釈してウエスタンブロッティング検出分析を行った(図15参照)。
Claims (23)
- 糸状真菌宿主細胞によって組換え発現された組換えシュウ酸デカルボキシラーゼであって、当該組換えシュウ酸デカルボキシラーゼにおけるグリコシル化修飾の形式及び程度はオリジナルの宿主細胞によって発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼとは異なり、当該組換えシュウ酸デカルボキシラーゼは糸状真菌宿主細胞に固有するグリコシル化修飾の形式及び程度を有する
ことを特徴とする組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ。 - 前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼは、pH値1.5~7.0においてその酵素活性が全て又は一部保持され、且つ、pH値1.5~2.5において至適pHおけるその酵素活性が10%以上保持され、pH値2.5~4.5において至適pHにおけるその酵素活性が50%以上保持され、pH値4.5~7.0において至適pHにおけるその酵素活性が25%以上保持される
請求項1に記載の組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ。 - 前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼの至適pH値は2.5~3.5である
請求項1に記載の組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ。 - 前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は真核生物に由来し、前記真核生物は、チャジュタケ(Agrocybe aegirit)、ヤナギマツタケ(Agrocybe Cylindracea)、エノキタケ(Flammulina velutipes)、カワラタケ(Coriolus versicolor)、褐色腐朽菌(Postia placenta)、アスペルギルス・リュウキュウエンシス(Aspergillus luchuensis)、ツクリタケ(Agaricus bisporus)、又はキシメジ(Tricholoma Lobayensc Heim)等真菌である
請求項1に記載の組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ。 - 前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列は配列番号1又は配列番号5における20~470位のアミノ酸配列、又は配列番号2における25~472位のアミノ酸配列、又は配列番号3における20~455位のアミノ酸配列、又は配列番号4における21~447位のアミノ酸配列、又は配列番号6における21~455位のアミノ酸配列、又は配列番号7における25~440位のアミノ酸配列、配列番号8における24~472位のアミノ酸配列と少なくとも60%の相同性を有し、好ましくは少なくとも65%の相同性、少なくとも70%の相同性、少なくとも75%の相同性、少なくとも80%の相同性、少なくとも85%の相同性、少なくとも90%の相同性、又は少なくとも95%の相同性を有する
請求項1ないし4のいずれかに記載の組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ。 - 前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列は、配列番号1又は配列番号5の20~470位のアミノ酸配列、又は配列番号2における25~472位のアミノ酸配列、又は配列番号3における20~455位のアミノ酸配列、又は配列番号4における21~447位のアミノ酸配列、又は配列番号6における21~455位のアミノ酸配列、又は配列番号7における25~440位のアミノ酸配列、配列番号8における24~472位のアミノ酸配列からなる
請求項1ないし5のいずれかに記載の組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ。 - 染色体DNAは、請求項1ないし6のいずれかに記載のシュウ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子配列を含む
ことを特徴とする組換え糸状真菌宿主細胞。 - 前記糸状真菌は、アスペルギルス属(Aspergillus)、コリオラス属(Coriolus)、ムコール属(Mucor)、フレビア属(Phlebia)、アクレモニウム属(Acremonium)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、フザリウム属(Fusarium)、フミコーラ属(Humicola)、ミセリオフトラ属(Myceliophthora)、アウレオバシジウム属(Aureobasidium)、トラメテス属(Trametes)、プレロータス属(Pleurotus)、ニューロスポラ属(Neurospora)、ペニシリウム属(Penicillium)、ペシロマイセス属(Paecilomyces)、ファネロカエテ属(Phanerochaete)、ブジェルカンデラ属(Bjerkandera)、セリポリオプシス属(Ceriporiopsis)、チエラビア属(Thielavia)、クリソスポリウム属(Chrysosporium)、スキゾフィルム(Schizophyllum)、コプリヌス属(Coprinus)、マグナポルテ属(Magnaporthe)、ネオカリマスティクス属(Neocallimastix)、トリポクラディウム属(Tolypocladium)、タラロマイセス属(Talaromyces)、サーモアスカス属(Thermoascus)、又はトリコデルマ属(Trichoderma)等真菌である
請求項7に記載の組換え糸状真菌宿主細胞。 - 前記糸状真菌は、アスペルギルス属のクロコウジカビ(A.niger)、アスペルギルス・ニデュランス(A.nidulans)、ニホンコウジカビ(A.oryzae)、又はアワモリコウジカビ(A.awamori)の菌株である
請求項7に記載の組換え糸状真菌宿主細胞。 - 前記糸状真菌は、トリコデルマ属のトリコデルマ・ハルチアナム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギイ(T.koningii)、トリコデルマ・リーセイ(T.reesei)、トリコデルマ・ロンギブラキアタム(T.longibrachiatum)、又はトリコデルマ・ビリデ(T.viride)の菌株である
請求項7に記載の組換え糸状真菌宿主細胞。 - 前記糸状真菌は、トリコデルマ・リーセイである
請求項7に記載の組換え糸状真菌宿主細胞。 - 前記シュウ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列で少なくとも10%の塩基は、糸状真菌宿主細胞のコドンの選好度に基づきコドンの最適化が行われている
請求項7ないし11のいずれかに記載の組換え糸状真菌宿主細胞。 - 前記ヌクレオチド配列は、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15及び配列番号16の塩基配列から選ばれるか、又は配列番号9~16のいずれかと少なくとも50%の相同性を有し、好ましくは少なくとも60%の相同性、少なくとも70%の相同性、少なくとも80%の相同性又は少なくとも90%の相同性を有する配列から選ばれる
請求項12に記載の組換え糸状真菌宿主細胞。 - 前記組換え糸状真菌宿主細胞はそのゲノムに組み込まれたシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットの1つ以上のコピーを含み、前記シュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットはプロモーター、シグナルペプチドコード配列、シュウ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びターミネーターを含み、
選択マーカー遺伝子発現カセット及びシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットを含む少なくとも1つの組込み型発現ベクターを構築する、ステップS1と、
組込み型発現ベクターによる糸状真菌宿主細胞の形質転換後、選別してシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットの1つ以上のコピーを含む組換え糸状真菌宿主細胞を得る、ステップS2とを含む
請求項7ないし12のいずれかに記載の組換え糸状真菌宿主細胞の構築方法。 - ステップS2に記載の糸状真菌宿主細胞は人工的に構築された栄養要求性細胞であり、前記組込み型発現ベクターは前記糸状真菌宿主細胞ゲノムに組み込まれると当該タイプの栄養要求性を修復できる
請求項14に記載の方法。 - 糸状真菌宿主細胞の形質転換後、前記組込み型発現ベクターは非相同組換えにより糸状真菌宿主細胞ゲノムにランダムに組み込まれる
請求項14に記載の方法。 - 前記組込み型発現ベクターは糸状真菌宿主細胞ゲノムにおける特異性遺伝子座の所定の長さのヌクレオチド配列と相同の5’末端ホモロジーアーム及び3’末端ホモロジーアームを含み、これによって糸状真菌宿主細胞の形質転換後に前記組込み型発現ベクターは相同組換えの方式によりゲノムの特定部位に組み込まれ、好ましくは細胞外タンパク質をコードする遺伝子に組み込まれ、より好ましくは細胞外プロテアーゼ類又は細胞外グリコシドヒドロラーゼ類をコードする遺伝子に組み込まれ、最も好ましくはCBH1、CBH2、EG1、又はEG2遺伝子に組み込まれる
請求項14に記載の方法。 - 請求項16に記載の方法により製造された宿主細胞の培養に適用され、組成は、グルコース 3~8g/L、微結晶セルロース 10~25g/L、コーンスティープリカー 5~15g/L、(NH4)2SO4 0.5~5g/L、MgSO4・7H2O 1.56g/L、CaCl2 0.5g/L、KH2PO4 2~8g/L、尿素 0~1g/L、ふすま粉 0.2~2g/L、Mandels微量元素(1000×) 1ml、MnCl2 0.5~5mMであり、pHは3.0~4.5である
ことを特徴とする培地。 - 請求項17に記載の方法により製造された宿主細胞の培養に適用され、組成は、グルコース 3~6g/L、ラクトース 30~40g/L、コーンスティープリカー 7~10g/L、(NH4)2SO4 0.5~1g/L、MgSO4・7H2O 1.56g/L、CaCl2 0.5g/L、KH2PO4 2~4g/L、尿素 0~1g/L、ふすま粉 10~20g/L、Mandels微量元素(1000×) 1ml、MnCl2 0.5~5mMであり、pHは3.5~4.0である
ことを特徴とする培地。 - プロモーター、シグナルペプチドコード配列、シュウ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びターミネーターを含むシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットを構築し、発現ベクターにより糸状真菌宿主細胞に導入して、宿主細胞ゲノムに1つ以上のシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットを組み込み、宿主細胞を培養してシュウ酸デカルボキシラーゼを発現させ、最後に宿主細胞培養基質から発現産物を分離して精製する
ことを特徴とする組換えシュウ酸デカルボキシラーゼの生産方法。 - 薬物及び食品の製造における、請求項1ないし6のいずれかに記載の組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ、又は請求項7ないし13のいずれかに記載の組換え糸状真菌宿主細胞の培養後に分泌発現された
ことを特徴とするシュウ酸デカルボキシラーゼの適用。 - 前記薬物は泌尿器系結石を予防及び/又は治療する薬物である
請求項21に記載の適用。 - 尿中シュウ酸過剰に関連する疾患の予防又は治療に用いられる薬物組成物であって、請求項20に記載の方法により製造されたシュウ酸デカルボキシラーゼを含む
ことを特徴とする薬物組成物。
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