JP2022065761A

JP2022065761A - 化粧品組成物

Info

Publication number: JP2022065761A
Application number: JP2020174449A
Authority: JP
Inventors: 有華金平; Yuka Kanehira
Original assignee: Sunstar Inc
Current assignee: Sunstar Inc
Priority date: 2020-10-16
Filing date: 2020-10-16
Publication date: 2022-04-28

Abstract

【課題】肌に潤いを与え、また肌のバリア機能を増強若しくは回復させる新規な化粧品組成物の提供。【解決手段】（Ａ）亜硫酸金属塩、ピロ亜硫酸金属塩、及び亜硫酸水素金属塩からなる群より選択される少なくとも１種の金属塩、並びに（Ｂ）プロテオグリカンを含有する組成物。好ましくは、前記プロテオグリカンが分子量５００万以上のプロテオグリカンである。【選択図】なし

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り（その１）送付日２０２０年９月１１日送付先通信販売の利用顧客（その２）送付日２０２０年９月２４日、２０２０年１０月１１日送付先通信販売の利用顧客（その３）送付日２０２０年９月１５日送付先女性誌・美容誌・主婦誌の出版社（その４）送付日２０２０年１０月７日送付先雑誌出版社（その５）送付日２０２０年１０月１０日送付先通信販売の利用顧客（その６）送付日２０２０年１０月１１日送付先通信販売の利用顧客

本開示は、化粧品組成物等に関し、詳細にはプロテオグリカンを含有する化粧品組成物に関する。なお、本明細書に記載される全ての文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。

化粧品は、皮膚に適用することにより、様々な効果を肌に与えることが期待される。例えば、肌に潤いを与え、また肌のバリア機能を増強若しくは回復させることが期待される。このため、このような種々の機能を好ましく奏する化粧品組成物が求められている。このような機能を有する化粧品組成物として、例えばプロテオグリカンを含有する組成物が提案されている。

国際公開第２０１１／００７８８５号国際公開第２０１４／０１７５７０号国際公開第２０１２／０９９２２４号国際公開第２０１２／０９９２１６号特開２０１７－０６６０９７号公報

本発明者らは、プロテオグリカンを含有する組成物（特に化粧品組成物）の検討を進め、プロテオグリカンを含有する組成物はある程度以上（例えば２５℃以上）程度の温度で長期間保存すると、組成物の色が徐々に黄色に変色する（つまり、黄変する）ことを見いだした。組成物を特に化粧品組成物として用いるときなどは、保存により徐々に変色することは消費者から忌避されるため、このような黄変を抑制することが重要である。

そこで、本発明者らは、プロテオグリカン含有組成物の保存により生じる黄変（経時的黄変）を抑制する方法を見いだすべく、さらに検討を進めた。

本発明者らは、プロテオグリカン含有組成物に、さらに特定の金属塩を含有させることにより、経時的黄変を抑制できる可能性を見いだし、さらに改良を重ねた。

本開示は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
（Ａ）亜硫酸金属塩、ピロ亜硫酸金属塩、及び亜硫酸水素金属塩からなる群より選択される少なくとも１種の金属塩、並びに
（Ｂ）プロテオグリカン
を含有する組成物。
項２．
（Ａ）の金属塩が、アルカリ金属塩である、項１に記載の組成物。
項３．ｌ
（Ａ）の金属塩が、亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カリウム、ピロ亜硫酸カリウム、及び亜硫酸水素カリウムからなる群より選択される少なくとも１種の金属塩である、項１に記載の組成物。
項４．
（Ｂ）が、分子量５００万以上のプロテオグリカンである、項１～３のいずれかに記載の組成物。
項５．
さらにアミノ酸を含有する、項１～４のいずれかに記載の組成物。
項６．
化粧品組成物である、項１～４のいずれかに記載の組成物。

経時的黄変が抑制された、プロテオグリカン含有組成物が提供される。

凍結サケ鼻軟骨ブロックの写真である。プラスチック容器の中央に配置された塊が凍結サケ鼻軟骨ブロックである。高分子量プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物（凍結乾燥物：サンプル１）の、ウロン酸量クロマトグラム及び２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラムを示す。市販プロテオグリカンの、ウロン酸量クロマトグラム及び２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラムを示す。ピロ亜硫酸ナトリウム及びプロテオグリカンを含有する組成物を１ヶ月保存した時の写真を示す。なお、左から順に、－５℃、室温（２５℃）、４０℃、５５℃での保存後の写真である。プロテオグリカンを含有する組成物（亜硫酸塩含有せず）を１ヶ月保存した時の写真を示す。なお、左から順に、－５℃、室温（２５℃）、４０℃、５５℃での保存後の写真である。亜硫酸ナトリウム及びプロテオグリカンを含有する組成物を１ヶ月保存した時の写真を示す。なお、左から順に、－５℃、室温（２５℃）、４０℃、５５℃での保存後の写真である。ピロ亜硫酸カリウム及びプロテオグリカンを含有する組成物を１ヶ月保存した時の写真を示す。なお、左から順に、－５℃、室温（２５℃）、４０℃、５５℃での保存後の写真である。亜硫酸水素ナトリウム及びプロテオグリカンを含有する組成物を１ヶ月保存した時の写真を示す。なお、左から順に、－５℃、室温（２５℃）、４０℃、５５℃での保存後の写真である。チオ硫酸ナトリウム及びプロテオグリカンを含有する組成物を１ヶ月保存した時の写真を示す。なお、左から順に、－５℃、室温（２５℃）、４０℃、５５℃での保存後の写真である。

以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。本開示は、プロテオグリカン含有組成物等を好ましく包含するが、これらに限定されるわけではなく、本開示は本明細書に開示され当業者が認識できる全てを包含する。

本開示に包含される組成物は、（Ａ）特定の金属塩、及び（Ｂ）プロテオグリカンを含有する。以下、本開示に包含される当該組成物を「本開示の組成物」ということがある。

（Ａ）の金属塩は、亜硫酸金属塩、ピロ亜硫酸金属塩、及び亜硫酸水素金属塩である。当該金属塩は、アルカリ金属塩であることが好ましく、リチウム塩、ナトリウム塩、及びカリウム塩がより好ましい。特にナトリウム塩及びカリウム塩が好ましく、具体的には亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カリウム、ピロ亜硫酸カリウム、及び亜硫酸水素カリウムが好ましい。（Ａ）の金属塩は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。当該特定の金属塩をプロテオグリカンと組み合わせて組成物に含有させることにより、当該組成物の黄変を抑制することができる。

プロテオグリカンは、グリコサミノグリカン（ムコ多糖）及びタンパク質が結合した構造を有する化合物である。グリコサミノグリカンは、２糖の繰り返し構造を有する酸性糖であり、具体的にはコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸等が例示できる。これら酸性糖成分が有する２糖の繰り返し構造において、当該２糖のうち通常１つはアミノ糖、もう１つはウロン酸である。従って、プロテオグリカンの検出には、ウロン酸検出法の常法の１つであるカルバゾール硫酸法を用いることができる。

また、タンパク質に、櫛の歯状にグリコサミノグリカンが結合した化合物はプロテオグリカンモノマーとも呼ばれる（プロテオグリカンモノマーにおける当該タンパク質はコアタンパク質と呼ばれる。）。特に生体内では、このプロテオグリカンモノマーがリンクタンパク質を介してヒアルロン酸と結合した会合体を形成していると考えられており、当該会合体はプロテオグリカン集合体（proteoglycanaggregate）とも呼ばれる。本明細書における用語「プロテオグリカン」は、特に断らない限り、プロテオグリカンモノマー及びプロテオグリカン集合体を包含する意味で用いられる。なお、ヒアルロン酸もグリコサミノグリカンの一種である。

本開示の組成物に（Ｂ）成分として用いられるプロテオグリカンは、比較的高分子量のプロテオグリカンであることが好ましい。また、本開示の組成物に含まれるプロテオグリカンは、下述するように特定の方法により魚類軟骨から調製される水抽出物に含有される形で得られうる。当該特定の方法により得られるプロテオグリカンは比較的高分子量のプロテオグリカンであり、好ましい。従って、本開示の組成物の好ましい一形態は、当該魚類軟骨水抽出物を含有する組成物（特に化粧品組成物）ということができる。

本開示の組成物に含まれる高分子量プロテオグリカンは、具体的には分子量１８０万以上のプロテオグリカンであり、好ましくは分子量２５０万以上、３００万以上、４００万以上、５００万以上、６００万以上、７００万以上、８００万以上、９００万以上、１０００万以上、１１００万以上、１２００万以上、１３００万以上、１４００万以上、１５００万以上、１６００万以上、１７００万以上、１８００万以上、１９００万以上、又は２０００万以上のプロテオグリカンである。分子量が大きいものほど好ましく、特に分子量５００万以上が好ましい。魚類軟骨水抽出物を、下記条件のゲル濾過クロマトグラフィーにより処理し、得られる各フラクションに含まれるウロン酸量（プロテオグリカン量を反映する）をカルバゾール硫酸法で定量し、当該ウロン酸量に基づくクロマトグラムを作成することにより、上記の分子量以上のプロテオグリカンの存在を確認することができる。このようなウロン酸量に基づくクロマトグラムを以下「ウロン酸量クロマトグラム」ということがある。また、各フラクションの２８０ｎｍでの吸光度を測定することで、含まれるタンパク質量を相対値化し（すなわち、含まれるタンパク質量を反映する値とし）、当該吸光度に基づくクロマトグラムを描くこともできる。このようなクロマトグラムを以下「２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラム」ということがある。

〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕
カラム： SepharoseCL-2B 充填カラム（Sepharose CL-2Bを担体としてφ1cm×50cmのカラムに充填したもの。Sepharose CL-2Bのデキストランの分画範囲は100～20,000kDaであり、GE Healthcare社等から入手できる。Sepharose CL-2Bは、２％架橋アガロース、粒子径６０～２００μｍ（レーザー回折散乱法による）、CAS登録番号65099-79-8である。）
バッファー： 0.1Mリン酸緩衝液（pＨ 7.1, 0.2M NaCl含有）
アプライサンプル量：魚類軟骨水抽出物4mg（乾燥質量換算）（１ｍＬバッファーに溶解させて使用）
流速： 0.15ｍＬ/min
分画フラクション量： 1ｍＬ/tube
分子量検量線：次の各種デキストラン分子量マーカーについて上記と同様の条件でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、糖検出のための周知の方法であるフェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度（デキストラン量を反映する）を測定し、各マーカーが溶出されたフラクションを求め、当該条件のゲル濾過クロマトグラフィーの各フラクションに含まれる成分の分子量を反映する検量線を作成する。“各マーカーが溶出されたフラクション”とは、各マーカーが最も多く溶出されたフラクションをいう。換言すれば、各デキストラン分子量マーカーをゲル濾過した際の、デキストラン量を反映するクロマトグラムにおけるピークトップに相当するフラクションである。

＜デキストラン分子量マーカー＞
Dextran from Leuconostoc mesenteroides（mol wt 5,000,000－40,000,000）（SIGMA）・・・カラムのvoid volume測定用、20000kDa
Dextran Standard 1,400,000（SIGMA）・・・1400kDa
Dextran Standard 670,000（SIGMA）・・・670kDa
Dextran Standard 410,000（SIGMA）・・・410kDa
Dextran Standard 270,000（SIGMA）・・・270kDa

但し、Dextran from Leuconostoc mesenteroidesについては、これに含まれる低分子のデキストランを除去する前処理を行った後、マーカーとして用いる。当該前処理は、上述の〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕によりDextran from Leuconostoc mesenteroidesそのものを溶出させ、分子量20,000kDa以上の分子を回収し、凍結乾燥させることで行う。具体的には、フェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度を測定して作成した、デキストラン量を反映するクロマトグラムにおいて、最初に出現したピークに相当するフラクションを回収し、これを凍結乾燥する（これにより、分子量20,000kDa以上の分子を回収、凍結乾燥できると考えられる）。この凍結乾燥物を実際にマーカー（カラムのvoidvolume測定用）として用いる。

デキストラン量を反映するクロマトグラムを得るための吸光度測定は、Hodge, J. E. and Hofreiter, B. T., Method in Carbohydrate Chemistry, 1, 338 (1962)に記載の方法（フェノール・硫酸法）に従う。具体的には、次のようにして行う。
〔１〕105×15mmの試験管に試料水溶液を500μＬ加える。
〔２〕フェノール試薬（5 v/v%フェノール水溶液）を500μＬ加え、撹拌する。
〔３〕濃硫酸を２．５ｍＬ加え、すぐに１０秒間激しく撹拌する。
〔４〕室温に２０分以上放置する。
〔５〕分光光度計で４９０ｎｍの吸収を測定する。

なお、カルバゾール硫酸法とは、ウロン酸（グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、イズロン酸等）の発色色素であるカルバゾール溶液を測定検体に添加し、分光光度計を用いて吸光度を測定し、当該吸光度を基にウロン酸量を算出する周知の方法である。濃度を規定したグルクロン酸標準溶液を用いて検量線を作成し、検体中のグルクロン酸含量を求める。より具体的には、次のようにして行う。ホウ酸ナトリウム・１０水和物０．９５ｇを濃硫酸１００ｍＬに溶解した試薬２．５ｍＬを試験管にとり、氷冷する。これに被検体０．５ｍＬ（２～２０μｇのウロン酸を含むようにするのが好ましい）を静かに重層する。室温以上にならないように水冷しながらよく攪拌する。ガラス球で蓋をした後に、沸騰湯浴中で１０分間加熱し、室温まで水冷する。これに、カルバゾール１２５ｍｇを無水メチルアルコール１００ｍＬに溶解した試薬を０．１ｍＬ加えて混合し、更に１５分間沸騰湯浴中で加熱する。その後、室温まで水冷し５３０ｎｍにおける吸光度を測定する。ブランクは蒸留水０．５ｍＬを用いる。同時に、グルクロン酸を用いて検量線を作成する。（下述する実施例のカルバゾール硫酸法も、ここに記載した方法で行った。）

特に限定はされないが、乾燥質量換算で、魚類軟骨水抽出物に含まれるウロン酸量（カルバゾール硫酸法により定量）全量のうち、１０質量％以上は、分子量１８０万以上のプロテオグリカンに由来するのが好ましい。換言すれば、魚類軟骨水抽出物は、乾燥質量換算で、分子量１８０万以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、抽出物に含まれるウロン酸全量の１０質量％以上であることが好ましい。より好ましくは、１５質量％以上、２０質量％以上、２５質量％以上、３０質量％以上、３５質量％以上、４０質量％以上、４５質量％以上、５０質量％以上、又は５５質量％以上である。当該割合は大きい程好ましい。

また、魚類軟骨水抽出物は、乾燥質量換算で、分子量２５０万以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、抽出物に含まれるウロン酸全量の１０質量％以上であることが好ましい。より好ましくは、１５質量％以上、２０質量％以上、２５質量％以上、３０質量％以上、３５質量％以上、４０質量％以上、４５質量％以上、５０質量％以上、５５質量％以上、又は６０質量％以上である。当該割合は大きい程好ましい。

また、特に限定はされないが、魚類軟骨水抽出物は、乾燥質量換算で、分子量５００万以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、抽出物に含まれるウロン酸全量の７質量％以上であることが好ましい。より好ましくは、１０質量％以上、１３質量％以上、１６質量％以上、２０質量％以上、２４質量％以上、２７質量％以上、３０質量％以上、３４質量％以上、又は３７質量％以上である。当該割合は大きいほど好ましい。

なお、特定の分子量（仮にＸとする）以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、抽出物に含まれるウロン酸全量のどの程度の割合を占めるのかは、上述したウロン酸量クロマトグラムのピーク面積から求めることができる。具体的には、当該ウロン酸量クロマトグラムのピーク面積全体に対して、分子量Ｘ以上のウロン酸が占める面積割合を求めればよい。より具体的には、縦軸がウロン酸量、横軸がフラクションＮｏ．であるウロン酸量クロマトグラムにおいて、分子量Ｘのプロテオグリカンを含むフラクションを通るように垂線を引き、その垂線で分断されたピーク部分のうち、分子量のより大きいプロテオグリカンを含むピーク部分の面積が、ピーク全体の面積のどの程度の割合を占めるかを求めればよい。

なお、魚類軟骨水抽出物に含まれるウロン酸は、プロテオグリカンに含まれるものの他、プロテオグリカンから分断された糖鎖に含まれるもの等も想定される。

また、魚類軟骨水抽出物に含まれるウロン酸量（カルバゾール硫酸法により測定）は、乾燥質量換算で、当該抽出物の好ましくは５質量％以上、より好ましくは７．５質量％以上、さらに好ましくは１０質量％以上、よりさらに好ましくは１２．５質量％以上、なお好ましくは１５質量％以上、特に好ましくは１７．５質量％以上である。なお、本明細書（特に図表）において、ウロン酸量を示す際にグルクロン酸の略記であるＧｌｃＡを用いて「ＧｌｃＡ（μｇ）」などと表す場合がある。なお、魚類軟骨水抽出物に含まれるプロテオグリカン中のグリコサミノグリカンは、ほぼコンドロイチン硫酸と考えられる。そして、おおよそのコンドロイチン硫酸量は、ウロン酸量に係数２．５９３を乗ずることで求められることが知られている。よって、本発明の魚類軟骨水抽出物に含まれるおおよそのプロテオグリカン量は、ウロン酸量に係数２．５９３を乗ずることで算出できる。

魚類軟骨水抽出物は、魚類軟骨（魚類の軟骨）から抽出される。魚類としては、サケ科サケ属の魚が好ましく、具体的にはマス（カラフトマス、サクラマス、サツキマス等）、サケ（シロザケ、ベニザケ、ギンザケ、マスノスケ、スチールヘッド等）、等が例示される。また、サメ、タラ等も用いることができる。特にサケ又はマスが好ましい。また、軟骨としては、特に制限されないが、頭部軟骨、中でも鼻軟骨が好ましい。また、通常、魚類（特にサケやマス）が食品製品等へ加工される際に頭部は廃棄されることから、頭部軟骨の入手コストは安く、大量に安定供給され得るという利点もある。魚類軟骨水抽出物としては、サケ鼻軟骨水抽出物が最も好ましい。

抽出は、水を用いて行われる。魚類軟骨は、生体から採取した軟骨をそのまま抽出に供してもよく、微細化（より具体的には、小片化又は粉末化）してから抽出に供してもよい。また、下述するように、抽出前に例えばエタノールなどの有機溶媒を用いて魚類軟骨に脱脂処理を施しても良い。このようにして、水によりプロテオグリカン（高分子量プロテオグリカンを含む）を抽出することができる。また、あるいは、水抽出を行う際、水を加熱しつつ行なうことにより、もしくは熱水や沸騰水を用いることにより、効率的により効果が高い魚類軟骨水抽出物を得ることができる。

上記の通り、生体から採取した魚類軟骨をそのまま抽出に供することができる。抽出に供するまで、凍結して保存しておくことが好ましい。凍結方法は特に制限されず、公知の凍結方法を用いることができる。例えば、フリーザーを用いて、魚類軟骨を－２０～－８０℃程度で２４～７２時間程度保存する方法が例示できる。また、魚類軟骨は、脱脂（すなわち脂肪除去）処理されているものを用いることもできる。脱脂処理されたものを用いることで、脂質の混入が少ない精製度の高い魚類軟骨水抽出物を得ることができる点で好ましい。脱脂処理方法としては、下述する「脱脂処理された魚類軟骨」を得る方法が例示できる。

小片化魚類軟骨は、魚類軟骨を小片化したものである。小片化は、公知の方法により行うことができる。例えば、公知のブレンダーやミル等の機器を用いて、魚類軟骨（好ましくは凍結魚類軟骨）を小片化することができる。小片化操作は、できるだけ低温で行うことが好ましい。例えば、小片化された魚類軟骨が凍結状態を保持可能な温度であることが好ましい。具体的には０℃以下が例示できる。

また、小片化魚類軟骨は、抽出効率の観点からは、凍結された小片化魚類軟骨（凍結小片化魚類軟骨）であることが好ましい。凍結小片化魚類軟骨は、（ｉ）魚類軟骨を凍結した後小片化することで、又は（ｉｉ）魚類軟骨を小片化した後凍結することで、得ることができるが、（ｉ）により得られるものが特に好ましい。凍結方法は特に制限されず、公知の凍結方法を用いることができる。例えば、フリーザーを用いて、魚類軟骨を－２０～－８０℃程度で２４～７２時間程度保存する方法が例示できる。

小片化魚類軟骨又は凍結小片化魚類軟骨は、１小片あたり０．００１～０．５ｇ程度が好ましく、０．００５～０．３ｇ程度がより好ましく、０．０１～０．１ｇ程度がさらに好ましい。小片化操作は、このような小片が得られるように行われるのが好ましい（使用機器条件を検討することにより、このような小片が得られる機器使用条件は簡単に決定できる）。

粉末化魚類軟骨は、魚類軟骨を粉末化したもの（魚類軟骨粉末）である。粉末化は、公知の方法により行うことができる。例えば、公知のブレンダーやミル等の機器を用いて、魚類軟骨（好ましくは凍結魚類軟骨）を粉末化することができる。粉末化操作は、できるだけ低温（例えば０℃以下）で行うことが好ましい。

また、粉末化魚類軟骨は、抽出効率の観点からは、凍結された粉末化魚類軟骨（凍結粉末化魚類軟骨）であることが好ましい。凍結粉末化魚類軟骨は、（ｉ’）魚類軟骨を凍結した後粉末化することで、又は（ｉｉ’）魚類軟骨を粉末化した後凍結することで、得ることができるが、（ｉ’）により得られるものが特に好ましい。凍結方法は特に制限されず、公知の凍結方法を用いることができる。例えば、フリーザーを用いて、魚類軟骨を－２０～－８０℃程度で２４～７２時間程度保存する方法が例示できる。

なお、「粉末」は「小片」に比べて、小さいものを指すが、明確に区別することを意図する訳ではない。魚類軟骨を微細化したもののうち、比較的大きめの欠片のものを「小片」、比較的小さめの欠片のものを「粉末」と称している。従って、特に制限される訳ではないが、粉末としては、粒径約１０～１０００μｍ程度、好ましくは５０～５００μｍ程度、より好ましくは１００～２００μｍ程度（レーザー回折散乱法により測定）の粒径を有する粒子を含む粉末が望ましい。これらの粒径を有する粒子は、粉末中多く（例えば５０質量％以上、好ましくは７０質量％以上）含まれることが好ましい。

用いられる小片化魚類軟骨又は粉末化魚類軟骨は、脱脂（すなわち脂肪除去）されているものも使用できる。つまり、小片化脱脂魚類軟骨又は粉末化脱脂魚類軟骨も使用できる。脱脂処理されたものを用いることで、脂質の混入が少ない精製度の高い魚類軟骨水抽出物を得ることができるからである。小片化脱脂魚類軟骨又は粉末化脱脂魚類軟骨は、（α）脱脂処理された魚類軟骨を小片化又は粉末化することにより、あるいは（β）魚類軟骨を小片化又は粉末化した後に脱脂処理することにより、得ることができる。

脱脂方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、上記（α）において魚類軟骨を脱脂処理する方法としては、例えば、魚類軟骨を１～２４時間程度流水（例えば水道蛇口からの流水）にさらす方法が例示される。また、魚類軟骨の入手は公知の方法で行うことができ、例えば魚類組織（好ましくは魚類頭部）を水に１～２４時間程度漬けて膨潤させ、軟骨（好ましくは鼻軟骨）以外の組織を除去する方法や、あるいは、凍結サケ頭部を解凍後、直ちに鼻軟骨を取り出し、さらに流水に１～２４時間程度さらして洗浄及び脱脂する方法が例示される。肉片等が残存する場合は、ピンセット等により残存する肉片等を取り除くことが好ましい。なお、この段階では魚類軟骨は小片化又は粉末化されていないため、流水にさらす等しても、ほとんどプロテオグリカンは抽出されないと考えられる。また、下記の（β）の場合と同様に、有機溶媒により脂質を抽出除去する方法も用いることができる。

また、例えば、（β）において、小片化魚類軟骨又は粉末化魚類軟骨を脱脂処理する方法としては、例えば、有機溶媒により脂質を抽出除去する方法が例示される。有機溶媒としては、エタノール、ヘキサン、アセトン等が例示される。より具体的には、上記（β）の方法として、特開２００９－１７３７０２号公報に記載される方法を好ましく用いることができる。つまり、例えば、以下の工程Ａ～Ｅを含む方法により、粉末化脱脂魚類軟骨を得、これを本発明に用いることができる（より詳細な条件も特開２００９－１７３７０２号公報に記載されている）。
Ａ．凍結した水棲動物組織（魚類組織）を破砕し、これに水を加え、温度０～２０℃、ｐＨ４．８～７で処理する工程
Ｂ．Ａの固液混合物を遠心分離し、最上部の脂質層と中間層の水層を取り除き、沈殿物を回収する工程
Ｃ．沈殿物を乾燥し、微粉末化する工程
Ｄ．得られた乾燥微粉末に、溶媒としてヘキサン、アセトン又はエタノールを加え、残存脂質を抽出除去する工程
Ｅ．溶媒を除去する工程

なお、凍結処理及び脱脂処理が両方なされた小片化魚類軟骨又は粉末化魚類軟骨（凍結小片化脱脂魚類軟骨又は凍結粉末化脱脂魚類軟骨）を用いるのが、さらに好ましい。これらは、例えば、脱脂処理された魚類軟骨を凍結し、これを小片化又は粉末化することにより得ることができる。

これらの脱脂方法は、小片化魚類軟骨又は粉末化魚類軟骨だけでなく、生体から採取した軟骨そのものにも適用できる。

魚類軟骨（小片化魚類軟骨及び粉末化魚類軟骨を含む。なお、以下小片化魚類軟骨及び粉末化魚類軟骨まとめて「微細化魚類軟骨」ということがある。）は水抽出に供される。水抽出に用いる水（以下「抽出水」という場合がある）としては、例えば、ミリＱ水、蒸留水、脱イオン水、精製水、水道水等が例示される。また、抽出水のｐＨは、通常５．５～８．０程度、好ましくはｐＨ６．０～７．５程度、より好ましくはｐＨ６．５～７．５程度である。酸やアルカリ、塩基類などｐＨを大きく変動される物質を溶解させるのは好ましくない。なお、有機酸や無機酸等の酸化合物や水酸化ナトリウム等のアルカリ化合物を抽出水に添加すると、高分子量プロテオグリカン（特に分子量が１０００万を超える高分子量プロテオグリカン）が減少若しくは消失するため、酸化合物やアルカリ化合物は添加しないことが好ましい。なお、限定的な解釈を望むものではないが、これは、酸化合物やアルカリ化合物の影響により、抽出処理中にプロテオグリカン集合体が崩壊することが原因ではないかと推測される。

水抽出は、例えば、魚類軟骨を水に適当時間（例えば３０分以上、好ましくは３０分～２４時間程度、より好ましくは１～１２時間程度、さらに好ましくは２～６時間程度、よりさらに好ましくは３～４時間程度）浸漬させることで行うことができる。水の量は、特に制限されないが、例えば抽出に供される小片化魚類軟骨又は粉末化魚類軟骨が全て水に浸かる程度の量が例示される。水抽出の際、静置してもよいし、撹拌してもよい。撹拌することが好ましい。また、抽出時の水の温度は、特に制限はされないが、好ましくは５０℃以上、より好ましくは７０℃以上である。そのため、抽出時に加温してもよいし、抽出前に予め温めておいてもよい。加熱温度（すなわち用いる水の温度）は、具体的には、好ましくは５０～１００℃程度、より好ましくは７０～１００℃程度、さらに好ましくは８０～１００℃程度、よりさらに好ましくは９０～１００℃程度が例示される。また、加圧下で加熱してもよい。また、加熱を行う場合は、高分子量プロテオグリカンが熱により分解されるおそれがあるため、加熱された抽出水を抽出処理中に置換してもよい。抽出水を置換する場合の各抽出水における抽出時間間隔は、例えば１５分～４時間毎、好ましくは３０分～２時間又は1時間程度が例示される。好ましい一態様としては、魚類軟骨に、これらを全量浸漬できる量の水（好ましくは加熱された水）を加え、３～４時間加熱しつつ静置若しくは撹拌する、という方法が挙げられる。また、他の好ましい一態様としては、“魚類軟骨に、これらを全量浸漬できる量の水（好ましくは加熱された水）を加え、１時間加熱しつつ静置し、この水を回収する”という工程を４回繰り返す方法が挙げられる（この場合、合計４時間の水抽出を行うことになる）。

水抽出後は、液体部分を回収することで、魚類軟骨水抽出物を得ることができる。液体部分の回収は、例えば遠心分離（例えば５０００ｒｐｍ、２０分、４℃での遠心分離が例示できる）処理や連続遠心分離処理などを行い、上清を回収することで行い得る。当該液体（上清）をそのまま本発明の魚類軟骨水抽出物として用いてもよいし、公知の方法により更に精製（例えば脱脂）してもよい。あるいは、減圧蒸留法等により、濃縮してもよい。またあるいは、凍結乾燥法やスプレードライ法等により、乾燥や粉末化してもよい。

例えば上記のようにして得られる、高分子量プロテオグリカン（あるいは高分子量プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物）を、本開示の組成物に好ましく用いることができる。

本開示の組成物には、（Ａ）特定の金属塩及び（Ｂ）プロテオグリカン（好ましくは高分子量プロテオグリカン又は高分子量プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物）の他に、化粧品分野で用いられる公知の成分を含有することができる。

このような成分としては、ブチレングリコール（特に１，３－ブチレングリコール）が好ましい。本開示の組成物に、高分子量プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物並びにブチレングリコールが含まれる場合、後述する肌荒れ改善効果（特に界面活性剤による肌荒れ改善効果）が特に好ましく奏され得る。この場合において、当該魚類軟骨水抽出物とブチレングリコールとの質量比は、例えば当該魚類軟骨水抽出物（乾燥質量換算）１質量部に対して、ブチレングリコール１００質量部以下程度が好ましく、５～１００質量部程度がより好ましい。当該範囲（５～１００質量部）の上限または下限は、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、
７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９質量部であってもよい。例えば、当該範囲は１０～９０質量部であってもよい。

また、本開示の組成物には、化粧品分野で用いられるアミノ酸が含まれていてもよい。特に制限はされないが、アミノ酸としては例えばＬアミノ酸、Ｄアミノ酸のいずれも用いることができる。より具体的には、例えばイソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、ヒスチジン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、プロリン、グリシン、アラニン、アルギニン等が挙げられる。またヒドロキシ基が導入される等の修飾が施されていてもよい。より具体的には、Ｄ－アラニン、Ｌ－ヒドロキシプロリン等が好ましく例示される。

なお、限定的な解釈を望むものではないが、上記の通り、プロテオグリカンの構成成分として糖が存在するところ、糖とアミノ酸を含有する組成物では、一定以上の温度が加わることでメイラード反応が起こり変色（黄変）が生じる可能性があるところ、本開示の組成物はアミノ酸を含有したとしても経時的黄変は抑制され得る。

また、これらの他にも、本開示の組成物には、例えば、化粧品用として許容される界面活性剤、湿潤剤、高分子剤、粉体、エステル類、アルコール類、動植物油脂、薬効剤、保存剤、着色剤、香料や、その他化粧品用として許容される成分、材料等が含まれていてもよい。

また、本開示の組成物は、上記（Ａ）、（Ｂ）成分、及び必要に応じてその他の成分を適宜配合して、常法（例えば混合）に従って製造され得る。また、本開示の組成物の形態も特に限定はされず、例えば、育毛剤、ヘアトニック、乳液、化粧水、クリーム、美容液、フェイスパック、フェイスマスク、日焼け止め等を挙げることができる。

本開示の組成物は、肌に潤いを与え、また肌のバリア機能を増強若しくは回復させ得ることから、特に肌荒れ改善用として好ましく用いることができる。

本開示の組成物における、高分子量プロテオグリカン、あるいは高分子量プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物の配合量は、上記効果が発揮される限り特に制限はされず、例えば、０．０００５～１００質量％、より好ましくは０．００５～９０質量％、さらに好ましくは０．０５～８０質量％が挙げられる。

なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。

また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。

以下、例を示して本開示の実施形態をより具体的に説明するが、本開示の実施形態は下記の例に限定されるものではない。

プロテオグリカンの調製
以下の手順により、サケ鼻軟骨からプロテオグリカン含有水抽出物を得た。サケ鼻軟骨としては、凍結サケ頭部を解凍後、直ちに鼻軟骨を取り出し、さらに流水に６時間さらして洗浄及び脱脂した後、さらにピンセットで肉片等を取り除き、手で水洗いして得られたサケ鼻軟骨を用いた。

サケ鼻軟骨をフリーザーに保存して凍結させ、これを「凍結サケ鼻軟骨ブロック」として用いた。当該凍結サケ鼻軟骨ブロックの写真を図１に示す。なお、用いたサケ頭部の大きさにもよるが、凍結サケ鼻軟骨ブロック１個は、およそ、大きさ 2.5×1.5 ～ 4.5×2 cm、重さ 1.71 ～ 6.91 gの塊（7個あたりの平均の重さは3.701g）であった。

凍結サケ鼻軟骨ブロックを100℃で加熱することによりプロテオグリカンを抽出した。
具体的には、次のようにして抽出を行った。凍結サケ鼻軟骨ブロック合計約1000gに対し2500mLの蒸留水を加え、100℃で3時間加熱し、それらを遠心分離機により8,000rpm、30分、4℃で遠心分離し、不溶物（残渣）を取り除き上清を回収した。回収上清を、濾紙を用いて吸引濾過し、得られた濾液を凍結乾燥し、プロテオグリカン含有凍結乾燥物を得た。当該凍結乾燥物を、カッターミルで破砕し、粉末状にして、以下の分析に供した。当該粉末は、約６５ｇ得られた。なお、当該粉末状のプロテオグリカン含有凍結乾燥物を、「サンプル１」とする。

分子量の検討
サンプル１を、下記条件のゲル濾過クロマトグラフィーにより各フラクションに分離した。そして、各フラクションに含まれるウロン酸量をカルバゾール硫酸法により定量した。また、各フラクションの２８０ｎｍでの吸光度を測定し、当該吸光度を、含まれるタンパク質量を反映する値とした。そして、これらの結果を基にして、ウロン酸量クロマトグラム及び２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラムを描いた。ウロン酸量クロマトグラム及び２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラムを重ねて描いた図を図２に示す。なお、サンプル１全量（約６５ｇ）中、ウロン酸量は約１２ｇであった。

また、図２には、ウロン酸量クロマトグラムにおいて各デキストラン分子量マーカーが溶出されたフラクションの位置も、併せて示す。なお、ゲル濾過クロマトグラフィーの分画フラクション量は下記の通り 1ｍＬ/tubeとしたため、図２の横軸「Elution Volume(mL)」は、フラクションＮｏ．も反映する。

〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕
カラム： SepharoseCL-2B 充填カラム（Sepharose CL-2Bを担体としてφ1cm×50cmのカラムに充填したもの。Sepharose CL-2Bのデキストランの分画範囲は100～20,000kDaであり、GE Healthcare社等から入手できる。Sepharose CL-2Bは、２％架橋アガロース、粒子径６０～２００μｍ（レーザー回折散乱法による）、CAS登録番号65099-79-8である。）
バッファー： 0.1Mリン酸緩衝液（pＨ 7.1, 0.2M NaCl含有）
アプライサンプル量：ウロン酸として1mg/ml
流速： 0.15ｍＬ/min
分画フラクション量： 1ｍＬ/tube
分子量検量線：分子量マーカーとして、次の各種デキストランについて上記と同様の条件（但しサンプルアプライ量は１ｍｇ／１ｍＬバッファー）でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、フェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度（デキストラン量を反映する）を測定し、検量線を作成した。

但し、Dextran from Leuconostoc mesenteroidesについては、当該マーカーに含まれる低分子のデキストランを除去する前処理を行った後、用いた。当該前処理は、上述の〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕（アプライ量はマーカー用の量）によりDextran from Leuconostoc mesenteroidesそのものを溶出させ、分子量２０００万以上の分子を回収し、凍結乾燥させることで行った。具体的には、フェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度を測定して作成した、デキストラン量を反映するクロマトグラムにおいて、最初に出現したピークに相当するフラクションを回収し、これを凍結乾燥した（これにより、分子量20,000kDa以上の分子を回収、凍結乾燥できると考えられる）。この凍結乾燥物を実際にマーカー（カラムのvoid volume測定用）として用いた。

デキストラン量を反映するクロマトグラムを得るための吸光度測定は、Hodge, J. E. and Hofreiter, B. T., Method in Carbohydrate Chemistry, 1, 338 (1962)に記載の方法（フェノール・硫酸法）に従った。具体的には、次のようにして行った。
〔１〕105×15mmの試験管に試料水溶液を500μＬ加える。
〔２〕フェノール試薬（5 v/v%フェノール水溶液）を500μＬ加え、撹拌する。
〔３〕濃硫酸を２．５ｍＬ加え、すぐに１０秒間激しく撹拌する。
〔４〕室温に２０分以上放置する。
〔５〕分光光度計で４９０ｎｍの吸収を測定する。

得られた検量線は（y = －4.3446Ln(x)＋56.68 ；Ｒ^２＝０．９８２３）であり、Ｒ^２値から考えて、分子量とフラクションNo.（即ち溶出液量）はよく相関していることがわかった。

図２に示されるように、サンプル１には、少なくとも分子量１８０万以上、特に分子量５００万以上の高分子量のプロテオグリカンが含まれることがわかった。

また、「プロテオグリカン」として市販されている製品を対照として、同様に検討を行った。ウロン酸量クロマトグラム及び２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラムを重ねて描いた図を図３に示す。また、図３には、ウロン酸量クロマトグラムにおいて各デキストラン分子量マーカーが溶出されたフラクションの位置も、併せて示す。当該検討において作成した検量線は（y = －3.943Ln(x)＋59.069 ；Ｒ^２＝０．９９７８）であり、Ｒ^２値から考えて、分子量とフラクションNo.（即ち溶出液量）はよく相関していた。図３に示されるように、市販のプロテオグリカンには、分子量１８０万以上のプロテオグリカンはほとんど含まれず、特に分子量５００万以上のプロテオグリカンは全く含まれないことがわかった。なお、当該市販のプロテオグリカンを、以下「サンプル２」とする。

さらに、サンプル１及びサンプル２における分子量１８０万以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、サンプル全体のウロン酸量に占める割合について、図２及び図３に示されるウロン酸クロマトグラムを基に算出した。具体的には、図２及び図３に示されるウロン酸クロマトグラムにおいて、ピーク面積全体に対して、分子量１８０万以上のウロン酸が占める面積割合を算出した。より具体的には、分子量１８０万に相当する溶出液量点に垂線を引き、該クロマトグラムを分割した際の２部分の面積比を求めた。また、同様にして、サンプル１及びサンプル２における分子量５００万以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、サンプル全体のウロン酸量に占める割合についても算出した。結果を表１に示す。

乾燥質量換算で、サンプル１を１質量部に対して、水を９質量部加えて溶解させ、さらに当該溶解液３１．５質量部に対して水３８．５質量部及び１，３－ブチレングリコール３０質量部を加えて混合した。以下、当該混合液をプロテオグリカン溶液として用いた。

プロテオグリカン含有組成物の調製及び検討
表２及び表３に記載される組成に従って各成分を混合して、組成物を調製した。なお、表２に記載される処方の各成分量は質量％である。また、当該組成物は、特に化粧品組成物として用い得る。

調製した実施例１～４及び比較例１～２の各組成物を、－５℃、室温（２５℃）、４０℃、又は５５℃で、１ヶ月保管した。結果を図４ａ～４ｆに示す。なお、これらの図では、４つの瓶に充填された各組成物の写真が示されるところ、左から順に、－５℃で１ヶ月保存した組成物、室温（２５℃）で１ヶ月保存した組成物、４０℃で１ヶ月保存した組成物、及び５５℃で１ヶ月保存した組成物が、それぞれ示されている。

これらの図から、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸カリウム、又は亜硫酸水素ナトリウムを含有する組成物は経時的黄変が抑制される一方、金属塩が含有されない組成物及びチオ硫酸ナトリウムを含有する組成物は、経時的黄変は抑制されないことが確認できた。また、これら黄変した組成物の状態から、プロテオグリカン含有組成物の経時的黄変は、保存温度が高いほど進行が早く、特に４０℃以上での保存で黄色が濃くなってしまうこともわかった。

なお、これらの金属塩以外にも、プロテオグリカン含有組成物の黄変を抑制できる成分として、酸化防止剤やキレート剤が有用では無いかと予測して探索を行ったが、エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ－２Ｎａ）、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、フィチン酸、エチドロン酸を用いた検討では、黄変を抑制することはできなかった。

以下の表に処方例を示す。なお、当該表の各成分の値は質量％を示す。

Claims

（Ａ）亜硫酸金属塩、ピロ亜硫酸金属塩、及び亜硫酸水素金属塩からなる群より選択される少なくとも１種の金属塩、並びに
（Ｂ）プロテオグリカン
を含有する組成物。
（Ａ）の金属塩が、アルカリ金属塩である、請求項１に記載の組成物。
（Ａ）の金属塩が、亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カリウム、ピロ亜硫酸カリウム、及び亜硫酸水素カリウムからなる群より選択される少なくとも１種の金属塩である、請求項１に記載の組成物。
（Ｂ）が、分子量５００万以上のプロテオグリカンである、請求項１～３のいずれかに記載の組成物。
さらにアミノ酸を含有する、請求項１～４のいずれかに記載の組成物。
化粧品組成物である、請求項１～４のいずれかに記載の組成物。