JP2022061987A - 癌細胞に結合するdnaアプタマー - Google Patents
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Abstract
Description
(1)以下の(i)又は(ii)の塩基配列を含む、癌細胞に結合するDNAアプタマー:
(i)(a)N1N2N3N4N5AGGGGTGTTTGTGCCGTGAGN26TGTN30N31N32N33N34(配列番号35)に示される塩基配列
(配列中、N1~N5は独立にG、T、A若しくはCであり、N26は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N30はN5と、N31はN4と、N32はN3と、N33はN2と、N34はN1と塩基対を形成する)、又は
(b)(i)(a)に示される塩基配列のN26以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び/又は置換された塩基配列;及び
(ii)(a)N1N2N3N4N5N6GATCACN13N14CTAGGGGN22CCN25N26N27N28N29N30N31(配列番号28)に示される塩基配列
(配列中、N1~N6、N14、N25は独立にG、T、A若しくはCであり、N13及びN22は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N26はN4と、N29はN3と、N30はN2と、N31はN1と塩基対を形成し、N27及びN28は独立にG、T、A、C若しくは存在しない)、又は
(b)(ii)(a)に示される塩基配列のN13及びN22以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び/又は置換された塩基配列。
(2)(i)(a)又は(ii)(a)の塩基配列がさらに1~5個のGC対を末端に含む、(1)に記載のDNAアプタマー。
(3)前記塩基対がGC対である、(1)又は(2)に記載のDNAアプタマー。
(4)(i)(b)の付加、欠失、及び/又は置換が、配列番号35の1位~5位又は30位~34位においてなされる、(1)~(3)のいずれかに記載のDNAアプタマー。
(5)(ii)(b)の付加、欠失、及び/又は置換が、配列番号28の1位~6位、14位又は25位~31位においてなされる、(1)~(3)のいずれかに記載のDNAアプタマー。
(6)(i)(a)の塩基配列が、配列番号36、37、又は40に示される配列である、(1)又は(2)に記載のDNAアプタマー。
(7)(ii)(a)の塩基配列が、配列番号29に示される配列である、(1)又は(2)に記載のDNAアプタマー。
(8)3'末端にミニヘアピン構造をさらに含み、
前記ミニヘアピン構造が、
5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の(A)~(C)の核酸領域:
(A)2~5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
(B)GNA又はGNNA(ここで、各nは独立にG、T、A若しくはCのいずれかである)の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
(C)第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域からなり、
かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、
(1)~(7)のいずれかに記載のDNAアプタマー。
(9)以下の(I)~(IV)のいずれかの塩基配列を含む、乳癌細胞に結合するDNAアプタマー:
(I)(a)N1N2N3N4N5N6CAGCCTGGGN16TN18TCTTTN24AGTCN29AN31TTCAN36TCGN40N41N42N43N44N45(配列番号43)に示される塩基配列
(配列中、N1~N6、N18、N24、N31、及びN36は独立に、G、T、A若しくはCであり、N16は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N29は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl、G、T、A若しくはCであり、N40はN6と、N41はN5と、N42はN4と、N43はN3と、N44はN2と、N45はN1と塩基対を形成する)、又は
(b)(I)(a)に示される塩基配列のN16以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び/又は置換された塩基配列;及び
(II)(a)N1N2N3N4CN6N7TCGAACTGN16N17ATGAGN23GTN26N27N28N29N30N31(配列番号2)に示される塩基配列
(配列中、N1~N4、N7、N16、N23、N26及びN31独立に、G、T、A若しくはCであり、N6は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl、G、T、A若しくはCであり、N17は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N27はN3と、N28はN2と塩基対を形成し、N29及びN30はG、T、A、C若しくは存在しない)、又は
(b)(II)(a)に示される塩基配列のN17以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び/又は置換された塩基配列;
(III)(a)N1N2N3CCGGCTN10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20N21N22N23N24N25TCCTGGN32N33TAAGGTTTCTAAN46N47N48N49N50N51(配列番号18)に示される塩基配列
(配列中、N1~N3、N13~N17、N19~N22、N33、N46~N48、及びN50は独立に、G、T、A若しくはCであり、N10~N12及びN23~N25はG、T、A、C若しくは存在せず、N18は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl、G、T、A若しくはC、又は存在せず、N32は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N49はN3と、N51はN1と塩基対を形成し、N10~N15の三つ以上がN20~N25の三つ以上と塩基対を形成する)、又は
(b)(III)(a)に示される塩基配列のN32以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び/又は置換された塩基配列;
(IV)(a)N1N2N3TCTTAAGTTTAN15AN17N18TN20N21N22N23TN25N26N27N28N29N30N31N32TN34GGGCGTTTTAAN46N47N48N49(配列番号50)に示される塩基配列
(配列中、N1~N3、N15、N17、N20~N23、N25~N29、N31~N32、N34及びN46は独立に、G、T、A若しくはCであり、N18及びN30は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N47はN3と、N48はN2と、N49はN1と塩基対を形成する)、又は
(b)(IV)(a)に示される塩基配列のN18及びN30以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び/又は置換された塩基配列。
(10)(I)(a)、(II)(a)、(III)(a)、又は(IV)(a)の塩基配列がさらに1~5個のGC対を末端に含む、(9)に記載のDNAアプタマー。
(11)前記塩基対がGC対である、(9)又は(10)に記載のDNAアプタマー。
(12)(I)(b)の付加、欠失、及び/又は置換が、配列番号43の1位~6位、18位、24位、29位、31位、36位、又は40位~45位においてなされる、(9)~(11)のいずれかに記載のDNAアプタマー。
(13)(II)(b)の付加、欠失、及び/又は置換が、配列番号2の1位~4位、6~7位、16位、23位、又は26位~31位においてなされる、(9)~(11)のいずれかに記載のDNAアプタマー。
(14)(III)(b)の付加、欠失、及び/又は置換が、配列番号18の1位~3位、10位~25位、33位、又は46位~51位においてなされる、(9)~(11)のいずれかに記載のDNAアプタマー。
(15)(IV)(b)の付加、欠失、及び/又は置換が、配列番号50の1位~3位、15位、17位、20位~23位、25位~29位、31位~32位、34位、又は46位~49位においてなされる、(9)~(11)のいずれかに記載のDNAアプタマー。
(16)(I)(a)の塩基配列が、配列番号44又は46に示される配列である、(9)又は(10)に記載のDNAアプタマー。
(17)(II)(a)の塩基配列が、配列番号3~5、8~9、及び14~16のいずれかに示される配列である、(9)又は(10)に記載のDNAアプタマー。
(18)(III)(a)の塩基配列が、配列番号20、21、及び26のいずれかに示される配列である、(9)又は(10)に記載のDNAアプタマー。
(19)(IV)(a)の塩基配列が、配列番号51に示される配列である、(9)又は(10)に記載のDNAアプタマー。
(20)3'末端にミニヘアピン構造をさらに含み、
前記ミニヘアピン構造が、
5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の(A)~(C)の核酸領域:
(A)2~5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
(B)GNA又はGNNA(ここで、各Nは、独立に、G、T、A若しくはCのいずれかである)の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
(C)第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域からなり、
かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、
(9)~(19)のいずれかに記載のDNAアプタマー。
(21)(1)~(20)のいずれかに記載のDNAアプタマーを含む癌検出剤。
(22)(1)~(20)のいずれかに記載のDNAアプタマーを含む癌細胞検出用キット。
(23)(1)~(20)のいずれかに記載のDNAアプタマーを含む医薬組成物。
(24)(1)~(8)のいずれかに記載の(i)(a)又は(b)の塩基配列を含むDNAアプタマーからなる抗癌剤。
(25)(1)~(20)のいずれかに記載のDNAアプタマーと薬剤とを含む、薬剤を癌細胞に送達するための医薬組成物。
(26)癌細胞を検出する方法であって、
被験体から得られた細胞を含むサンプルを、(1)~(8)のいずれかに記載のDNAアプタマーと接触させる工程、
前記サンプルと前記DNAアプタマーの結合に基づいて癌細胞を検出する工程、
を含む、前記方法。
(27)乳癌細胞を検出する方法であって、
被験体から得られた細胞を含むサンプルを、(9)~(20)のいずれかに記載のDNAアプタマーと接触させる工程、
前記サンプルと前記DNAアプタマーの結合に基づいて乳癌細胞を検出する工程、
を含む、前記方法。
(28)被験体から得られた癌細胞を分類する方法であって、
被験体から得られた癌細胞を、(1)~(20)のいずれかに記載のDNAアプタマーと接触させる工程、
前記癌細胞と前記DNAアプタマーの結合の有無又は強度を測定する工程、
前記結合の有無又は強度に基づいて癌細胞を分類する工程、
を含む、前記方法。
(29)被験体から得られた乳癌細胞を分類する方法であって、
被験体から得られた乳癌細胞を、(9)~(20)のいずれかに記載のDNAアプタマーと接触させる工程、
前記乳癌細胞と前記DNAアプタマーの結合の有無又は強度を測定する工程、
前記結合の有無又は強度に基づいて乳癌細胞を分類する工程、
を含む、前記方法。
(30)接触工程が、被験体から得られた乳癌細胞を、(9)~(20)のいずれかに記載の(I)~(IV)の四つの群の少なくとも二つの群から選択される二種以上のDNAアプタマーと接触させる工程である、(29)に記載の方法。
本明細書で使用する一般的な用語の定義について以下で説明する。
一態様において、本発明は、以下の(i)(a)~(b)又は(ii)(a)~(b)の塩基配列を含む、癌細胞に結合するDNAアプタマーに関する。
一態様において、本発明は、以下の(I)(a)~(b)、(II)(a)~(b)、(III)(a)~(b)、又は(IV)(a)~(b)の塩基配列を含む、乳癌細胞に結合するDNAアプタマーに関する。
一態様において、本発明は、上記2又は3に記載のDNAアプタマー(本明細書では単に、これらを合わせて「本発明のDNAアプタマー」とも記載する)を含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、本発明のアプタマーが有する癌細胞への結合能を失わない範囲において、他の薬剤を一以上含有することもできる。例えば、抗癌剤を所定量含有していてもよい。
一態様において、本発明は、上記「2.癌細胞に結合するDNAアプタマー」の(i)(a)又は(i)(b)に記載の塩基配列を含むDNAアプタマーからなる抗癌剤に関する。このDNAアプタマーの由来となった05-MB231アプタマーは癌細胞に結合するだけでなく、癌細胞の増殖を抑制することができることが示されていることから、抗癌剤として用いることができる。また、一実施形態において、本発明は、上記DNAアプタマーからなる抗癌剤を有効成分として含む医薬組成物に関する。医薬組成物の構成については上記の通りであるからここでは記載を省略する。
一態様において、本発明は上記医薬組成物又は抗癌剤を被験体に投与することを含む、癌の治療及び/又は予防方法に関する。
一態様において、本発明は、本発明のDNAアプタマーを含む癌検出剤に関する。本発明の癌検出剤は、DNAアプタマーの癌細胞への結合能を利用して、in vivo又はin vitroにおいて癌又は癌細胞を検出するための組成物である。例えば、DNAアプタマーをあらかじめ蛍光試薬等で標識し、これを投与することによって、生体内で癌細胞の有無を決定し、また存在する場合にはその局在を調べることができる。本発明のDNAアプタマーは、イメージング及び組織染色等において有用である。
一態様において、本発明は、癌細胞を検出する方法に関する。本方法は、被験体から得られたサンプルを、本発明のDNAアプタマーと接触させる工程、及びサンプルとDNAアプタマーの結合に基づいて癌細胞を検出する工程を含む。本方法によって、被験体における癌罹患の有無の診断を補助することが可能となり得る。
一態様において、本発明は、被験体から得られた癌細胞を分類する方法に関する。本方法は、被験体から得られた癌細胞を、本発明のDNAアプタマーと接触させる工程、前記癌細胞と前記DNAアプタマーの結合の有無又は強度を測定する工程、前記結合の有無又は強度に基づいて癌細胞を分類する工程を含む。癌細胞とDNAアプタマーの結合の有無又は強度を測定する工程については、上記癌細胞の検出方法において記載したのと同様であるからここでは記載を省略する。
細胞株:
実施例に用いた細胞株の入手先とその培養培地は、以下の通りである:
ヒト乳癌由来細胞株MCF7(理研バイオリソースセンター(BRC)、RCB1904、MEM)、T-47D(ATCC、HTB-133TM、RPMI1640培地)、MDA-MB-231(ATCC、HTB-26TM、L15培地、CO2不要、CO2環境下ではDMEM培地)、MDA-MB-453(BRC、RCB1192、L15培地、CO2不要、CO2環境下ではDMEM培地)、ヒト乳腺線維症由来細胞株MCF 10A(ATCC、CRL-10317TM、MEGM培地)、大腸癌由来細胞株HCT-116(BRC、RCB2979、DMEM培地)、肺癌由来細胞株A549(BRC、RCB0098、F12K培地)、胃癌由来細胞株 MKN45(BRC、RCB1001、RPMI1640培地)、卵巣癌由来細胞株NIH: OVCAR-3(BRC、RCB2135、RPMI1640培地)、前立腺癌由来細胞株PC-3(ATCC、CRL-1435、RPMI1640培地)、膵臓癌由来細胞株MIAPaca2(東北大学加齢医学研究所、TKG0227、RPMI1640培地)、Panc1(東北大学加齢医学研究所、TKG0606、RPMI1640培地)、肝癌由来細胞株PLC/PRT/5(JCRB、JCRB0406、RPMI1640培地)、子宮頸癌由来細胞株HeLa(BRC、BRC0007、MEM培地)、骨髄性白血病由来細胞株KG-1(BRC、RCB1166、RPMI1640培地)、急性リンパ性白血病由来細胞株CCRF-CEM(東北大学加齢医学研究所、I-4924、RPMI1640培地)、ヒト臍帯血内皮細胞株Huvec(Lonza、CC-2519、MEG培地)。特に明記しない限り、全ての実施例において、上記の細胞株を用いた。
(Cell-SELEX)
まずWO2013/073602に記載の方法に準じてDNAライブラリーの調製を行った。DNAライブラリーは、両末端のプライマー配列(25塩基)と中間部の45塩基のランダム配列からなる計95塩基の配列を含む核酸で構成される。45塩基のランダム配列中の二か所には、人工塩基Dsを組み込んでおり、その組み入れ位置は、ランダム配列の5'末端の3塩基を構成する配列(タグ配列)から判定できる。これらタグ配列を持つ24種のサブライブラリーを化学合成し、混合することで、DNAライブラリー(N42Ds3nmix-P003)を調製した(表1)。
Ion PGM sequencing(Thermo Fisher Scientific)により、ソートした細胞から得られたDNAの塩基配列の特定を行った。MCF7 Cell-SELEXでは、総リード(read)数246,903配列から両末端のプライマー配列を正しく保持している配列を抽出したところ、解析対象は80,592配列であった。抽出した配列を基に、1塩基違いの配列を派生配列とみなす条件でクラスタリングし、配列の濃縮程度を確認したところ、10配列が濃縮候補として挙がった。それらの候補配列をそれぞれ化学合成して、個々に結合能スクリーニングを実施し、2配列(14A-MCF7(配列番号4)及び08B-MCF7(配列番号17))に絞った。
実施例2で得られた配列を含むDNAアプタマーについて、WO2013/073602の実施例3に記載の方法に準じてセカンドセレクション(Doped selection)を実施し、それぞれのDNAアプタマーの二次構造の推定を行った。セカンドセレクションでは、オリジナルの1stセレクションで得られたオリジナル配列のそれぞれの塩基組成を55%、その他ヌクレオチドをそれぞれ15%含む割合で調製されたライブラリー(Doped-14A、Doped-08B、Doped-03-T47D short、Doped-05-MB231、Doped-07-MB231、Doped-23-MB231)を使って、再びセレクションを行った。
実施例3で得られた14A-MCF7(53DsDs)(配列番号4)を元に、17位のDsをAに置換した14A-MCF7(53ADs)(配列番号5)、28位のDsをAに置換した14A-MCF7(53DsA)(配列番号6)、17位と28位のDsをAに置換した14A-MCF7(53AA)(配列番号7)、3'末端側のバルジ部分のAGをTTに置換し、ステム部分のミスマッチ部分の一部を塩基対を形成するように置換した14A-MCF7(Opt53DsDs)(配列番号3)を設計し、それぞれの塩基配列を有するDNAアプタマーを化学合成した(それぞれの塩基配列と、Doped selectionから予測される二次構造を図7に示す)。
08B-MCF7アプタマーでも改変を行った。具体的には、08B-MCF7(51DsDs)(配列番号20)を元に、18位のDsをAに置換した08B-MCF7(51ADs)(配列番号21)、32位のDsをAに置換した08B-MCF7(51DsA)(配列番号22)、18位及び32位のDsをAに置換した08B-MCF7(51AA)(配列番号23)、08B-MCF7(51DsDs)にミニヘアピンを付加した08B-MCF7mh(配列番号24)、08B-MCF7mhの内部のステムループをミニヘアピンに置換した08B-MCF7mh2(配列番号25)を設計し、それぞれの塩基配列を有するDNAアプタマーを化学合成した(それぞれの塩基配列とDoped selectionから予測される二次構造を図11に示す)。
03-T47Dアプタマーでも改変を行った。具体的には、03-T47D(配列番号27)の末端にGC対を付加した03-T47D(DsDs)(配列番号29)を元に、24位のDsをAに置換した03-T47D(DsA)(配列番号30)、15位のDsをAに置換した03-T47D(ADs)(配列番号31)、15位及び24位のDsをAに置換した03-T47D(AA)(配列番号32)、03-T47D(DsDs)の末端にミニヘアピンを付加した03-T47Dmh(配列番号33)を設計し、それぞれの塩基配列を有するDNAアプタマーを化学合成した(それぞれの塩基配列とDoped selectionから予測される二次構造を図13に示す)。
05-MB231アプタマーでも改変を行った。具体的には、05-MB231(配列番号34)の末端のステムの一部をGC対に置換した05-MB231(DsDs)(配列番号36)を元に、44位のDsをAに置換した05-MB231(DsA)(配列番号37)、33位のDsをAに置換した05-MB231(ADs)(配列番号38)、33位及び44位のDsをAに置換した05-MB231(AA)(配列番号39)、05-MB231(DsDs)の末端の配列の一部を除去し、ステムの一部をGC対に置換した05-MB231GC(配列番号40)、及び05-MB231GCにミニヘアピンを付加した05-MB231GCmh(配列番号41)を設計し、それぞれの塩基配列を有するDNAアプタマーを化学合成した(それぞれの塩基配列とDoped selectionから予測される二次構造を図15に示す)。
07-MB231アプタマーでも改変を行った。具体的には、07-MB231(配列番号42)の末端のステムの一部をGC対に置換した07-MB231(DsDs)(配列番号44)を元に、28位のDsをAに置換した07-MB231(DsA)(配列番号46)、15位のDsをAに置換した07-MB231(ADs)(配列番号47)、15位及び28位のDsをAに置換した07-MB231(AA)(配列番号48)、07-MB231の末端にミニヘアピンを付加した07-MB231mh(配列番号45)を設計し、それぞれの塩基配列を有するDNAアプタマーを化学合成した(それぞれの塩基配列とDoped selectionから予測される二次構造を図17に示す)。
23-MB231でも改変を行った。具体的には、23-MB231b(配列番号51)を元に、末端にミニへピンを付加した23-MB231bmh(配列番号52)を設計し、それぞれの塩基配列を有するDNAアプタマーを化学合成した(それぞれの塩基配列とDoped selectionから予測される二次構造を図19に示す)。
最適化、安定化を行ったDNAアプタマーを用いて、標的細胞株に対する親和性を比較検討した。方法は、DNAアプタマーにAlexa488標識を行い、細胞結合によって生じる蛍光強度の変化をフローサイトメーターで解析した。
14A-MCF7アプタマーに由来するアプタマー及び08B-MCF7アプタマーに由来するアプタマーのTm値をUV-2450(島津製作所)で測定した(3回平均)。
細胞結合能が特に強い4種のDNAアプタマー(14A-MCF7mh、08B-MCF7mh、05-MB231GCmh、及び07-MB231mh)の細胞結合性について、競合実験を行い、結合標的の同一性を検討した。すなわち、DNAアプタマーにAlexa488標識を行い、細胞結合によって生じるKd値濃度付近の蛍光強度の変化が、他のDNAアプタマーの存在下で変化するかどうかをフローサイトメーターで解析した。
取得したDNAアプタマーの結合特異性を確認するために、これらのAlexa488標識体と種々の培養癌細胞株をインキュベーションし、結合の有無を実施例1と同様にフローサイトメーターで蛍光強度のシフトにて解析した。陽性対照として、AS1411を、陰性対照としてAS1411の変異体Cont26を用いて、その蛍光強度のシフトより判断した。Cont26よりも弱い蛍光強度が認められたものを-、Cont26よりも強い蛍光強度が認められたものを+、AS1141よりも強い蛍光強度が認められたものを++と評価した。
各DNAアプタマーの結合局在を確認するために、250 nMのAlexa488標識を施したDNAアプタマーをOPTI-MEM(GibcoBRL)中で4℃又は37℃で30分インキュベーションを行った。細胞は、各DNAアプタマーの由来となる細胞を用いた。上記培地には後期エンドソーム及びリソソームを染色するLysoTracker Red DND-99(Molecular Probes)を75 nM添加しておき、細胞内オルガネラマーカーとして局在の指標に用いた。インキュベーションを行った細胞は、4%パラホルムアルデヒドで固定し、DAPI染色を施して封入しサンプルとした。これらのサンプルについて、ECLIPSE Ti (ニコン)で蛍光顕微鏡観察を、FV10iあるいはFV1200(共にオリンパス)共焦点顕微鏡観察を実施した。
種々の培養癌細胞株を用いて、取得した各DNAアプタマーの細胞増殖抑制効果を検証した。接着性の種々の癌細胞(MCF7 / MEM培地、T47D /RPMI培地、MDA-MB-231 / DMEM培地、MDA-MB-453 / DMEM培地、MIAPaca2 / RPMI培地、PC-3 / RPMI培地、HCT-116 / DMEM培地、A549/ DMEM培地)は、薬剤添加前日に1×103 から2.5×103cells/wellとなるように、96穴プレートに播種した。骨髄性白血病由来細胞株KG-1(RPMI培地)は、薬剤添加約2時間前に4×104 cells/mLで90 μL/wellとなるように播種した。非癌細胞(MCF10A及びHUVEC)は、4×103cells/wellとなるように播種した。
Claims (24)
- 以下の(i)又は(ii)のヌクレオチド配列を含む、癌細胞に結合するDNAアプタマー:
(i)(a)N1N2N3N4N5AGGGGTGTTTGTGCCGTGAGN26TGTN30N31N32N33N34(配列番号35)に示されるヌクレオチド配列
(配列中、N26は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N30はN5と、N31はN4と、N32はN3と、N33はN2と、N34はN1と塩基対を形成し、該ヌクレオチド配列はその末端において1~5個のGC塩基対からなる)、又は
(b)(i)(a)に示されるヌクレオチド配列のN26以外の位置において、1~6個のヌクレオチドが付加、欠失、及び/又は置換されたヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列の該1~6個のヌクレオチドが配列番号35の1位~5位又は30位~34位において付加、欠失、及び/又は置換された、ヌクレオチド配列;及び
(ii)(a)N1N2N3N4N5N6GATCACN13N14CTAGGGGN22CCN25N26N27N28N29N30N31(配列番号28)に示されるヌクレオチド配列
(配列中、N14、N25は独立にG、T、A若しくはCであり、N13及びN22は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N26はN4と、N29はN3と、N30はN2と、N31はN1と塩基対を形成し、該ヌクレオチド配列はその末端において1~5個のGC塩基対からなる)、又は
(b)(ii)(a)に示されるヌクレオチド配列のN13及びN22以外の位置において、1~6個のヌクレオチドが付加、欠失、及び/又は置換されたヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列の該1~6個のヌクレオチドが配列番号28の1位~6位、14位又は25位~31位において付加、欠失、及び/又は置換された、ヌクレオチド配列。 - (i)(a)のヌクレオチド配列のN30がAであり、N31がG又はCであり、N32がCであり、N33がGであり、及び/又はN34がTであり、又は(ii)(a)のヌクレオチド配列のN3がCであり、N4がGであり、及び/又はN14がAである、請求項1に記載のDNAアプタマー。
- 前記塩基対がGC対である、請求項1又は2に記載のDNAアプタマー。
- (i)(a)のヌクレオチド配列が、配列番号36、37、又は40に示される配列である、請求項1又は2に記載のDNAアプタマー。
- (ii)(a)のヌクレオチド配列が、配列番号29に示される配列である、請求項1又は2に記載のDNAアプタマー。
- 3'末端にミニヘアピン構造をさらに含み、
前記ミニヘアピン構造が、
5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の(A)~(C)の核酸領域:
(A)2~5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
(B)GNA又はGNNA(ここで、各Nは独立にG、T、A若しくはCのいずれかである)のヌクレオチド配列からなる第2核酸領域、及び
(C)第1核酸領域に相補的なヌクレオチド配列からなる第3核酸領域からなり、
かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が塩基対合によるステム部分を形成し、第2核酸領域がループ部分を形成する、
請求項1~5のいずれか一項に記載のDNAアプタマー。 - 以下の(I)~(IV)のいずれかのヌクレオチド配列を含む、乳癌細胞に結合するDNAアプタマー:
(I)(a)N1N2N3N4N5N6CAGCCTGGGN16TN18TCTTTN24AGTCN29AN31TTCAN36TCGN40N41N42N43N44N45(配列番号43)に示されるヌクレオチド配列
(配列中、N18、N24、N31、及びN36は独立に、G、T、A若しくはCであり、N16は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N29は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl、G、T、A若しくはCであり、N40はN6と、N41はN5と、N42はN4と、N43はN3と、N44はN2と、N45はN1と塩基対を形成し、該ヌクレオチド配列はその末端において1~5個のGC塩基対からなる)、又は
(b)(I)(a)に示されるヌクレオチド配列のN16以外の位置において、1~6個のヌクレオチドが付加、欠失、及び/又は置換されたヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列の該1~6個のヌクレオチドが配列番号43の1位~6位、18位、24位、29位、31位、36位又は40位~45位において付加、欠失、及び/又は置換された、ヌクレオチド配列;
(II)(a)N1N2N3N4CN6N7TCGAACTGN16N17ATGAGN23GTN26N27N28N29N30N31(配列番号2)に示されるヌクレオチド配列
(配列中、N1~N4、N7、N16、N23、N26及びN31独立に、G、T、A若しくはCであり、N6は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl、G、T、A若しくはCであり、N17は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N27はN3と、N28はN2と塩基対を形成し、N29及びN30はG、T、A、C若しくは存在せず、N23はN7と、N31はN1と塩基対を形成し、該ヌクレオチド配列はその末端において1~5個のGC塩基対からなる)、又は
(b)(II)(a)に示されるヌクレオチド配列のN17以外の位置において、1~6個のヌクレオチドが付加、欠失、及び/又は置換されたヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列の該1~6個のヌクレオチドが配列番号2の1位~4位、6位~7位、16位、23位又は26位~31位において付加、欠失、及び/又は置換された、ヌクレオチド配列;
(III)(a)N1N2N3CCGGCTN10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20N21N22N23N24N25TCCTGGN32N33TAAGGTTTCTAAN46N47N48N49N50N51(配列番号18)に示されるヌクレオチド配列
(配列中、N13~N17、N19~N22、N33、N46~N48は独立に、G、T、A若しくはCであり、N10~N12及びN23~N25はG、T、A、C若しくは存在せず、N18は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl、G、T、A若しくはC、又は存在せず、N32は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N49はN3と、N51はN1と塩基対を形成し、N10~N15の三つ以上がN20~N25の三つ以上と塩基対を形成し、N50はN2と塩基対を形成し、N10~N15はN20~N25と完全塩基対を形成し、N10~N25は全体としてミニヘアピン構造を形成し、該ヌクレオチド配列はその末端において1~5個のGC塩基対からなる)、又は
(b)(III)(a)に示されるヌクレオチド配列のN32以外の位置において、1~6個のヌクレオチドが付加、欠失、及び/又は置換されたヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列の該1~6個のヌクレオチドが配列番号18の1位~3位、10位~25位、33位又は46位~51位において付加、欠失、及び/又は置換された、ヌクレオチド配列;及び
(IV)(a)N1N2N3TCTTAAGTTTAN15AN17N18TN20N21N22N23TN25N26N27N28N29N30N31N32TN34GGGCGTTTTAAN46N47N48N49(配列番号50)に示されるヌクレオチド配列
(配列中、N1~N3、N15、N17、N20~N23、N25~N29、N31~N32、N34及びN46は独立に、G、T、A若しくはCであり、N18及びN30は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N47はN3と、N48はN2と、N49はN1と塩基対を形成し、該ヌクレオチド配列はその末端において1~5個のGC塩基対からなる)、又は
(b)(IV)(a)に示されるヌクレオチド配列のN18及びN30以外の位置において、1~6個のヌクレオチドが付加、欠失、及び/又は置換されたヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列の該1~6個のヌクレオチドが配列番号50の1位~3位、15位、17位、20位~23位、25位~29位、31位~32位、34位又は46位~49位において付加、欠失、及び/又は置換された、ヌクレオチド配列。 - (i)(a)のヌクレオチド配列のN3がTであり、N18がCであり、N24がTであり、N31がGであり、及び/又はN36がAであり、(ii)(a)のヌクレオチド配列のN7がGであり、N16がTであり、及び/又はN23がCであり、(iii)(a)のヌクレオチド配列のN33がCであり、N46がAであり、N47がGであり、及び/又はN48がGであり、又は(iv)(a)のヌクレオチド配列のN1がCであり、N2がCであり、N15がTであり、及び/又はN34がAである、請求項7に記載のDNAアプタマー。
- 前記塩基対がGC対である、請求項7又は8に記載のDNAアプタマー。
- (I)(a)のヌクレオチド配列が、配列番号44又は46に示される配列である、請求項7又は8に記載のDNAアプタマー。
- (II)(a)のヌクレオチド配列が、配列番号3~5、8~9、及び14~16のいずれかに示される配列である、請求項7又は8に記載のDNAアプタマー。
- (III)(a)のヌクレオチド配列が、配列番号20、21、及び26のいずれかに示される配列である、請求項7又は8に記載のDNAアプタマー。
- (IV)(a)のヌクレオチド配列が、配列番号51に示される配列である、請求項7又は8に記載のDNAアプタマー。
- 3'末端にミニヘアピン構造をさらに含み、
前記ミニヘアピン構造が、
5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の(A)~(C)の核酸領域:
(A)2~5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
(B)GNA又はGNNA(ここで、各Nは、独立に、G、T、A若しくはCのいずれかである)のヌクレオチド配列からなる第2核酸領域、及び
(C)第1核酸領域に相補的なヌクレオチド配列からなる第3核酸領域からなり、
かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が塩基対合によるステム部分を形成し、第2核酸領域がループ部分を形成する、
請求項7~13のいずれか一項に記載のDNAアプタマー。 - 請求項1~14のいずれか一項に記載のDNAアプタマーを含む癌検出剤
- 請求項1~14のいずれか一項に記載のDNAアプタマーを含む癌細胞検出用キット。
- 請求項1~14のいずれか一項に記載のDNAアプタマーを含む医薬組成物。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の(i)(a)又は(b)のヌクレオチド配列を含むDNAアプタマーからなる抗癌剤。
- 請求項1~14のいずれか一項に記載のDNAアプタマーと薬剤とを含む、薬剤を癌細胞に送達するための医薬組成物。
- 癌細胞を検出する方法であって、
被験体から得られた細胞を含むサンプルを、請求項1~6のいずれか一項に記載のDNAアプタマーと接触させる工程、
前記サンプルと前記DNAアプタマーの結合に基づいて癌細胞を検出する工程、
を含む、前記方法。 - 乳癌細胞を検出する方法であって、
被験体から得られた細胞を含むサンプルを、請求項7~14のいずれか一項に記載のDNAアプタマーと接触させる工程、
前記サンプルと前記DNAアプタマーの結合に基づいて乳癌細胞を検出する工程、
を含む、前記方法。 - 被験体から得られた癌細胞を分類する方法であって、
被験体から得られた癌細胞を、請求項1~14のいずれか一項に記載のDNAアプタマーと接触させる工程、
前記癌細胞と前記DNAアプタマーの結合の有無又は強度を測定する工程、
前記結合の有無又は強度に基づいて癌細胞を分類する工程、
を含む、前記方法。 - 被験体から得られた乳癌細胞を分類する方法であって、
被験体から得られた乳癌細胞を、請求項7~14のいずれか一項に記載のDNAアプタマーと接触させる工程、
前記乳癌細胞と前記DNAアプタマーの結合の有無又は強度を測定する工程、
前記結合の有無又は強度に基づいて乳癌細胞を分類する工程、
を含む、前記方法。 - 接触工程が、被験体から得られた乳癌細胞を、請求項7~14のいずれか一項に記載の(I)~(IV)の四つの群の少なくとも二つの群から選択される二種以上のDNAアプタマーと接触させる工程である、請求項23に記載の方法。
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