JP2024054164A - グリピカン－３特異的変形アプタマー及びその用途 - Google Patents

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Abstract

【課題】グリピカン－３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＧＰＣ３）特異的変形アプタマー及びグリピカン－３を検出する方法を提供する。【解決手段】本発明のグリピカン－３特異的変形アプタマーは、グリピカン－３に特異的に結合して肝癌細胞内に細胞内在化し、アプタマーに結合している抗癌剤を通じて抗癌活性を示すため、正常の肝細胞には影響なしにＧＰＣ３が発現した肝癌細胞のみに選択的抗癌効果を有する。【選択図】図１７ａ

Description

本発明は、グリピカン－３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＧＰＣ３）特異的変形アプタマー及びそれを用いた肝癌の予防または治療に関する。
肝癌は、肝臓で一次的に発生した原発性の悪性腫瘍を総称する。そのうち、肝細胞に起源した「肝細胞癌」の比率が約７７％、胆管癌が１６％、それ以外の癌腫は稀で、肝癌は大部分肝細胞癌（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ， ＨＣＣ）と見ることができる。肝細胞癌の主要原因は、慢性Ｂ型肝炎、慢性Ｃ型肝炎、肝硬変、アルコール肝疾患などである。
肝癌は、大部分手術や組織検査なしに治療するため、組織サンプルを得るのが容易でなく、慢性肝炎や肝硬変の同伴など考慮すべき臨床データが他の癌腫に比べて多く臨床研究が容易ではないため、肝癌に関する研究は他の癌腫に比べて相対的に不十分であった。
また、肝癌は、同伴疾患である慢性肝炎と肝硬変症を伴い、早期に周囲の血管を侵犯して急激に進行する腫瘍の生物学的特性により治療難易度が非常に高い。
肝細胞癌の治療は、肝切除あるいは肝移植手術、局所治療、肝動脈化学塞栓術及びその他の頚動脈治療、放射線治療、全身治療などが施行される。全身治療は、リンパ節、肺などの肝臓外転移があって局所治療が不可能な患者を対象とし、複合抗癌療法が主に使われた。しかし、化学療法の客観的反応率は１０％未満であることが伝えられ、生存期間を延長させるという証拠はなかった。
それ以後、肝細胞癌が高度の血管性腫瘍という点が明らかになり、ネクサバール（成分名：ソラフェニブ）、レンビマ（成分名：レンバチニブ）のようにＶＥＧＦＲ（血管内皮細胞増殖因子受容体）を主要ターゲットとする分子標的治療剤が開発された。これは、進行・転移性肝癌での治療代案となった。
しかし、初期には症状がほとんどないため、大部分が、癌が進行して症状が現れた後に治療が開始される肝癌の特性上、肝癌後期（Ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ＨＣＣ）で効果的な治療方法が必要な実情であり、併せて、既存の治療剤に対する補助または新たな機序による治療方法が求められる。
一方、グリピカン－３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＧＰＣ３）は、細胞***と成長を調節するＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌ－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）－固定ＨＳＰＧ（ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）であり、グリピカンファミリーに属する。ＧＰＣ３は、Ｎ末端サブユニット及びＣ末端サブユニットで構成され、Ｗｎｔ信号経路、ＩＧＦ、ＦＧＦ媒介及びＴＧＦ－β２信号伝達に関与することが知られている。ＧＰＣ３は、ＨＣＣ特異的マーカーであり、これを標的とする抗癌剤が多数研究されている。
現在、多数の製薬会社でＧＰＣ３に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ＡＤＳ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）及びＣＡＲ－Ｔｃｅｌｌ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ）などが開発中であり、現在、前臨床または臨床段階にある。
Ｊ Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ ２０１３ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ； ５６（１１）： １００１－１０１１
しかし、現在までＧＰＣ３を用いた効果的なＨＣＣ標的抗癌剤は開発されずにいる。
本発明者らは、新たな肝癌治療剤を開発するために多方面に努力した結果、目的とする肝癌細胞に特異的に薬物を伝達して抗癌効果を示す肝癌治療剤を開発することにより、本発明を完成した。
本発明の一つの目的は、グリピカン－３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＧＰＣ３）に特異的に結合する核酸アプタマー及び前記核酸アプタマーと結合した抗癌剤を含む、変形アプタマーを提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記変形アプタマーを有効成分として含む、肝癌予防または治療用薬学組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記核酸アプタマーを提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記核酸アプタマーを有効成分として含む、グリピカン－３検出用組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、肝癌の診断または予後に必要な程度を提供するために、検査対象体由来の生物学的試料からグリピカン－３の含量を検出する段階；前記含量検出結果を対照群試料のグリピカン－３の含量検出結果と比較する段階；及び前記対照群の試料と比較し、前記対象体由来試料の含量水準に変化がある場合、前記対象体を肝癌の診断または予後と関連付ける段階を含む、グリピカン－３を検出する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、グリピカン－３検出用組成物を含む、肝癌診断用キットを提供することにある。
本発明のグリピカン－３特異的変形アプタマーは、グリピカン－３に特異的に結合して肝癌細胞に細胞内在化し、アプタマーに結合している抗癌剤を通じて抗癌活性を示すため、正常の肝細胞には影響なしにＧＰＣ３が発現された肝癌細胞のみに選択的抗癌効果を有する。
ＧＰＣ３特異的アプタマーライブラリのタンパク質結合親和力を示した図である。ＮＴ＃はヌクレオチドの数（長さ）を意味する。濃度別タンパク質において最も低い濃度２つは除いた。 ＧＰＣ３特異的アプタマーライブラリ中、２４２８－１２－１０（４０ｍｅｒ）及びこの配列を一部切断した１２－１２（３５ｍｅｒ）のタンパク質結合親和力を示した図である。 ゲムシタビンが結合した１２－１０変形アプタマーの模式図である。２次元予測プログラム上、化学的置換の有無は表記されず、一般の塩基で表した。 ゲムシタビンが結合した１２－１０変形アプタマーのタンパク質結合親和力を示した図である。 ゲムシタビンが結合した１２－１０変形アプタマーの抗癌効果を示した図である。 ＧＰＣ３特異的アプタマーライブラリ中、２４２８－１２－１０（１２－１０）を多様な長さに切断して作製したアプタマーライブラリに対する細胞結合を示した図である。 ＧＰＣ３特異的アプタマーライブラリ中、２４２８－１２－１０（１２－１０）を多様な長さに切断して作製したアプタマーライブラリに対する細胞内在化を示した図である。 ゲムシタビンが結合した１２－１２変形アプタマーの模式図である。２次元予測プログラム上、化学的置換の有無は表記されず、一般の塩基で表した。 ゲムシタビンが結合した１２－１２変形アプタマーに対する細胞結合を示した図である。１２－１２は１２－１２アプタマー、ＳＣはスクランブルされた１２－１２アプタマーである。 ゲムシタビン３つが結合した変形アプタマー（１２－１２ Ｇ（３））に対する細胞内在化を示した図である。１２－１２は１２－１２アプタマー、ＳＣはスクランブルされた１２－１２アプタマーである。 ゲムシタビン３つが結合した変形アプタマー（１２－１２ Ｇ（３））に対する経時による細胞内在化を示した図である。１２－１２は１２－１２アプタマー、ＳＣはスクランブルされた１２－１２アプタマーである。 ゲムシタビン３つが結合した変形アプタマー（１２－１２ Ｇ（３））の濃度別（１０ｎＭ～１μＭ）よる抗癌効果を示した図である。１２－１２は１２－１２アプタマー、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅはゲムシタビン単独である。 ゲムシタビン３つが結合した変形アプタマー（１２－１２ Ｇ（３））の濃度別（３１．７５ｎＭ～２μＭ）による抗癌効果を示した図である。１２－１２は１２－１２アプタマー、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅはゲムシタビン単独である。 アプタマー配列内の塩基の置換位置及び対象（Ｎａｐ－ｄＵ、Ｃ３リンカー、２－Ｆ、２－０－Ｍｅ）によるタンパク質結合親和力及び細胞結合を示した図である。 タンパク質結合親和力及び細胞結合を考慮して化学的に最適化したアプタマー候補を選別した図である。 化学最適化したアプタマーライブラリの細胞結合を示した図である。 化学最適化したアプタマーライブラリ（ｃｏｍｂｉ １～５）の細胞内在化を示した図である。 化学最適化したアプタマーライブラリ（ｃｏｍｂｉ ６～１０）の細胞内在化を示した図である。 ゲムシタビンが結合した化学最適化したアプタマーライブラリに対するタンパク質結合親和力を示した図である。 ゲムシタビンが結合した化学最適化したアプタマーライブラリに対する細胞結合を示した図である。 化学最適化したアプタマーライブラリ（ｃｏｍｂｉ １～３）に対する細胞内在化を示した図である。Ｃｏｎｔｒｏｌは無処理、１２１２は１２－１２アプタマー、ＳＣはスクランブルされた１２－１２アプタマーである。 ゲムシタビンが３つまたは５つ結合した化学最適化したアプタマーライブラリ（ｃｏｍｂｉ ４）に対する細胞内在化を示した図である。Ｃｏｎｔｒｏｌは無処理、１２１２は１２－１２アプタマー、ＳＣはスクランブルされた１２－１２アプタマーである。 ゲムシタビンが３つまたは５つ結合した化学最適化したアプタマーライブラリ（ｃｏｍｂｉ ５）に対する細胞内在化を示した図である。Ｃｏｎｔｒｏｌは無処理、１２１２は１２－１２アプタマー、ＳＣはスクランブルされた１２－１２アプタマーである。 ゲムシタビンが３つまたは５つ結合した化学最適化したアプタマーライブラリ（ｃｏｍｂｉ ４～５）に対する抗癌効果を示した図である。 ゲムシタビンが３つ結合した化学最適化したアプタマー（Ｃｏｍｂｉ １１ Ｇ（３））に対する抗癌効果を示した図である。 ゲムシタビンが３つまたは５つ結合した化学最適化したアプタマーライブラリ（ｃｏｍｂｉ ４～５）のＨｅｐ３Ｂに対する細胞周期を分析した図である。 ゲムシタビンが３つまたは５つ結合した化学最適化したアプタマーライブラリ（ｃｏｍｂｉ ４～５）のＨｅｐＧ２に対する細胞周期を分析した図である。 ゲムシタビンが３つまたは５つ結合した化学最適化したアプタマーライブラリ（ｃｏｍｂｉ ４～５）のＡ４３１に対する細胞周期を分析した図である。 化学最適化したアプタマーライブラリ（１２－１２，ｃｏｍｂｉ ５ Ｇ（３））に対するマウス血清安定性を示した図である。
本発明を具体的に説明すると次の通りである。一方、本発明で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用され得る。即ち、本発明で開示された多様な要素の全ての組合わせが本発明の範囲に属する。また、下記記述された具体的な記述により本発明の範囲は制限されない。
前記目的を達成するための本発明の一の様態は、グリピカン－３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＧＰＣ３）に特異的に結合する核酸アプタマー及び前記核酸アプタマーと結合した抗癌剤を含む、変形アプタマーを提供することにある。
本発明において、用語「グリピカン－３」は、細胞***と成長を調節するＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌ－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）－固定ＨＳＰＧ（ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）であり、Ｎ末端サブユニット及びＣ末端サブユニットで構成され、Ｗｎｔ信号経路、１ＧＦ、ＦＧＦ媒介及びＴＧＦ－β２信号伝達に関与することが知られている。
本発明において、用語「アプタマー」、または「核酸アプタマー」は「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ」であり、特定の化合物からタンパク質まで多様な種類の標的リガンドに高い特異度と親和度で結合できる特性を有する長さの短い（２０～８０個の塩基）単一鎖核酸分子を意味する。アプタマーはＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を通じて生体外（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ）で製造できる。前記「核酸アプタマー」は「アプタマー」に含まれ、前記「アプタマー」、または「核酸アプタマー」は混用され得る。
アプタマーは、標的タンパク質に対してナノモル（ｎＭ）～フェムトモル（ｆＭ）水準の高い結合力と選択性を有するという点で抗体と類似の特性を有するオリゴ核酸分子とみなされる。一方、抗体と比較すると、アプタマーは次のような様々な長所を有している。（１）化学的合成が容易でかつ比較的小さく単純な分子であるため、様々な必要な変形が容易に可能であり、（２）ＳＥＬＥＸ過程を通じて選択性と親和度を極大化することができ、（３）化学的合成により作られるため、純度が高く、（４）機器分析を通じて作られた物質を同定することができ、（５）動物に注入して抗体を生成し難い毒素などに対するアプタマーの開発が可能であり、（６）熱に安定して室温で長期間の保存も可能であり、（７）生体内免疫反応（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）をほぼ引き起こさず、（８）一旦特定物質に特異的に結合するアプタマーを分離すれば、自動化したオリゴマー合成方法で低費用と一貫性で再生産が可能で経済的である。
アプタマーの選別過程には、一般に、１０14～１０15個程度の互いに異なる配列、即ち、多様性を有するライブラリから一本鎖核酸プール（ｐｏｏｌ）を確保する過程が必要である。このための方法として様々な方法が用いられているが、一般に、非対称ＰＣＲを用いて一方の鎖のみを増幅させる方法、二本鎖核酸の一本鎖の終端部にビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）を付けた後、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）で取り囲んだビード（ｂｅａｄ）を用いて一本鎖のみを選択的に分離する方法が最も多く用いられている。
その後、確保したライブラリを標的分子に結合させて結合力の高いアプタマーを選び出す選択過程を行う。標的分子がタンパク質である場合には、通常、タンパク質に標識されたビオチンをストレプトアビジンビードを用いてプルダウン（Ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ）する。標的タンパク質と変形核酸ライブラリの結合を誘導した後、バッファで洗い落として標的タンパク質に結合していない変形核酸ライブラリを除去する。
プレート（Ｐｌａｔｅ）の場合も同様に、核酸ライブラリと標的タンパク質の結合を誘導した後、バッファで洗い落として標的タンパク質に結合しない核酸を除去する。このような方法を用いてリガンドに対して親和度を有するアプタマーを得ることができる。通常、５－１５回の選別－増幅過程を繰り返すと、高い親和度を有するアプタマーを得ることができる。選別過程が終了すると、増幅した核酸をクローニングした後、個々のクローンから配列分析を通じてその配列を確認し、アプタマーを合成して標的分子との親和度及び結合力を測定する。
本発明において、用語「標的分子」とは、本発明のアプタマーで検出できる物質を意味する。具体的には、前記標的分子は、分離された試料内に存在するもので、捕獲アプタマーが結合できるタンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）、薬物、染料、成長因子及び規制物質（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）からなる群から選択される一つ以上のものであってもよいが、これに制限されない。本発明の目的上、前記標的分子は、グリピカン－３、そのリガンドまたはその受容体であってもよい。
本発明の目的上、前記グリピカン－３に特異的に結合する核酸アプタマーは、配列番号１の変異体、即ち、配列番号１からなる塩基配列の変異体塩基からなるものであってもよいが、これに制限されない。
本発明において、前記配列番号１は配列番号１の塩基配列前後への無意味な配列の追加または自然に発生し得る突然変異、あるいはその潜在性突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を除くものではなく、配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチドと互いに同一または対応する活性を有する場合であれば、本発明の配列番号１に該当することは当業者に自明である。具体的な例としては、本発明の配列番号１は、前記配列番号１の塩基配列またはこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性または同一性を有する塩基配列で構成されるポリヌクレオチドであってもよい。また、このような相同性または同一性を有し、前記アプタマーに対応する効能を示す塩基配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドも本出願の配列番号１の範囲内に含まれることは自明である。
即ち、本発明において「特定配列番号で記載された塩基配列からなるポリヌクレオチド」と記載されていても、当該配列番号の塩基配列からなるポリヌクレオチドと同一あるいは対応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドも本発明で用いられることは自明である。例えば、「配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド」は、これと同一あるいは対応する活性を有する場合であれば、「配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド」に属することは自明である。
前記配列番号１の変異体は、前記配列番号１をなすヌクレオチドのいずれか一つ以上が化学的または物理的に変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）された形態を含んでもよい。例えば、前記変異体は、配列番号１の塩基配列において一つ以上のヌクレオチドの切断；配列番号１の塩基配列において一つ以上のヌクレオチド内の塩基構造のピリミジン基の５番目の炭素位置でナフチル基への置換；一つ以上のヌクレオチドが糖と塩基を有さないリンカーへの置換；一つ以上のヌクレオチド内の糖の構造の２番目の炭素位置でＯＨ基が－Ｍｅｔｈｏｘｙ（メトキシ）－Ｆ（ｆｌｕｏｒｉｎｅ、フッ素）またはＭｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ（メトキシエチル）のいずれか一つ以上への置換；一つ以上のヌクレオチド内の塩基構造のピリミジン基の５番目の炭素位置でベンジル基への置換；からなる群から選択されるいずれか一つ以上の置換による変形を含むものであってもよい。
前記ナフチル基は、下記化学式１で表されるものであってもよい。
［化学式１］
前記リンカーは、下記化学式２で表されるものであってもよい。
［化学式２］
前記ベンジル基は、下記化学式３で表されるものであってもよい。
［化学式３］
具体的には、前記一つ以上のヌクレオチド内の塩基構造のピリミジン基の５番目の炭素位置でナフチル基への置換は、前記ピリミジン基の５番目の炭素位置で５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－ジオキシウリジン（５－（Ｎ－ｎａｐｈｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｅ）－２’－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）への置換であってもよいが、これに制限されない。
具体的には、前記「配列番号１の変異体」は、変異位置及び個数に限定されないため、配列番号６、配列番号６の変異体、及び配列番号１０～１９からなる群から選択されるいずれか一つであってもよいが、これに限定されない。また、前記グリピカン－３特異的核酸アプタマーは、配列番号１の変異体からなるものであってもよいため、配列番号６、配列番号６の変異体、及び配列番号１０～１９からなる群から選択されるいずれか一つであってもよいが、これに限定されない。
また、前記グリピカン－３特異的アプタマーまたは変形アプタマーは、血清内の安定性の増進のために、５’末端、３’末端、または両末端がいずれも変形されて血清内の安定性が増強されたものであってもよい。前記変形は、５’末端、３’末端、または両末端にＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ｉｄＴ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、２’－メトキシヌクレオシド、２’－アミノヌクレオシド、２’Ｆ－ヌクレオシド、アミンリンカー、チオールリンカー、及びコレステロールなどからなる群から選択された１種以上が結合して変形したものであってもよい。具体的には、前記アプタマーの３’末端にｉｄＴを結合させたものであってもよいが、これに制限されない。
本発明の目的上、前記グリピカン－３特異的アプタマーは、グリピカン－３に特異的に結合して細胞内在化を誘導できる。
本発明において、用語、「変形アプタマー」とは、前述した核酸アプタマー及び抗癌剤を含むアプタマーを意味する。本発明の目的上、変形アプタマーは配列番号１の変異体からなる核酸アプタマー；配列番号６からなる核酸アプタマー；配列番号６の変異体からなる核酸アプタマー；または配列番号１０～配列番号１９のいずれか一つからなる核酸アプタマー及び抗癌剤を含む変形アプタマーであってもよいが、これに限定されない。具体的には、前記変形アプタマーは、配列番号２～配列番号５、配列番号７～配列番号９、及び配列番号２０～配列番号２５からなる群から選択されるいずれか１つ以上を含むものであってもよいが、これらに限定されない。
本発明において、用語「抗癌剤」は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫）、中皮腫、膵臓癌（例えば、膵管癌、膵臓内分泌腫瘍）、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、胃癌（例えば、乳頭腺癌、粘液性腺癌、腺扁平上皮癌）、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌（例えば、結腸癌、直腸癌、肛門癌、家族性大腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、消化管間質腫瘍）、乳癌（例えば、浸潤性乳管癌、非浸潤性乳管癌、炎症性乳癌）、卵巣癌（例えば、上皮性卵巣癌腫、精巣外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍）、精巣腫瘍、前立腺癌（例えば、ホルモン依存性前立腺癌、ホルモン非依存性前立腺癌）、肝癌（例えば、肝細胞癌、原発性肝癌、肝外胆管癌）、甲状腺癌（例えば、甲状腺髄質癌腫）、腎臓癌（例えば、腎細胞癌腫）、腎盂と尿管の移行上皮癌腫、子宮癌（例えば、子宮頸癌、子宮体癌、子宮肉腫）、脳腫瘍（例えば、髓母細胞腫、神経膠腫、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫、下垂体腺腫）、網膜芽細胞腫、皮膚癌（例えば、基底細胞癌、悪性黒色腫）、肉腫（例えば、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、軟部組織肉腫）、悪性骨腫瘍、膀胱癌、血液癌（例えば、多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫、ホジキン病、慢性骨髄増殖疾患）、原発性不明癌など、末梢神経障害を副作用として引き起こす癌の予防剤及び治療剤を含む。前記抗癌剤の例としては、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）（ゲムシタビン注）、シタラビン（Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）（パラプラチン）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）（プラチノール、プラチノール－ＡＱ）、クリゾチニブ（Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）（ザーコリ）、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（シトキサン、ネオサル）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）（タキソテレール）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）（アドリアマイシン）、エルロチニブ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）（タルセバ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）（ベプシド）、フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，５－ＦＵ）、イマチニブメシレート（Ｉｍａｔｉｎｉｂ ｍｅｓｙｌａｔｅ）（グリベック）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）（カンプトサール）、リポソーム－カプセル化ドキソルビシン（ドキシル）、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）（ポレックス、メキセート、アメトプテリン）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（タキソール、アブラキサン）、ソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）（ネクサバール）、スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）（スーテント）、トポテカン（Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）（ハイカムチン）、トラベクテジン（Ｔｒａｂｅｃｔｅｄｉｎ）（ヨンデリス）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）（オンコビン、ビンカサルＰＦＳ）、及びビンブラスチン（Ｖｉｎｂｒａｓｔｉｎｅ）（ベルバン）などがあるが、これに限定されず、公知の抗癌剤であれば制限なく使用することができる。具体的には、前記抗癌剤は、ゲムシタビン、シタラビン、カルボプラチン、シスプラチン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドキソルビシン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、イマチニブメシレート、イリノテカン、リポソーム－カプセル化ドキソルビシン、メトトレキサート、パクリタキセル、ソラフェニブ、スニチニブ、トポテカン、トラベクテジン、ビンクリスチン、及びビンブラスチンからなる群から選択されるいずれか一つ以上であってもよく、より具体的にはゲムシタビンであってもよいが、これに限定されない。
前記抗癌剤は、前記核酸アプタマーに１個以上結合するものであってもよく、具体的には、２個以上結合するものであってもよく、より具体的には３個以上結合するものであってもよいが、これに制限されない。
前記抗癌剤は、前記核酸アプタマーの５’末端、３’末端または両末端のいずれか一つ以上の末端に共有結合、イオン結合、金属結合、ファンデルワールス結合及び水素結合のいずれか一つ以上の化学結合を通じて結合したり、前記アプタマーの塩基配列内の一つ以上の塩基が置換されて結合したものであってもよいが、これに制限されない。
本発明の目的上、前記変形アプタマーは、核酸アプタマーの塩基配列内の一つ以上の塩基が抗癌剤に置換されて結合したものであってもよく、例えば、核酸アプタマーの塩基配列内の一つ以上のシトシンまたはグアニンが抗癌剤に置換されて結合したものであってもよい。
具体的には、前記抗癌剤は、前述した前記核酸アプタマーの末端またはアプタマー内の置換される塩基一つの位置に２個以上が連続して結合したものであってもよく、２個以上連続して結合時に、抗癌剤間は共有結合、イオン結合、金属結合、ファンデルワールス結合及び水素結合のいずれか一つ以上の化学結合を通じて結合されてもよいが、これに制限されない。
また、前記抗癌剤は、前記核酸アプタマーの塩基配列内の独立して存在する１個以上の塩基が置換されて結合したものであってもよく、２個以上の塩基が置換されて結合したものであってもよい。
前記独立して存在する２個以上の塩基が置換された場合には、抗癌剤が連続または不連続で置換されてもよく、抗癌剤が不連続に置換された場合には、前記抗癌剤間の化学結合はなされないこともあるが、これに制限されない。
前述したように核酸アプタマーの塩基配列内の一つ以上の塩基が抗癌剤で置換された変形アプタマーは、核酸アプタマーと同様にグリピカン－３に特異的に結合可能であり、核酸アプタマーの末端に抗癌剤が結合した変形アプタマーに比べて生体内で抗癌剤が安定して存在し、グリピカン－３を発現する肝癌細胞に内在化後にアプタマーが分解されて抗癌剤が放出されることにより癌細胞特異的抗癌効果を示すようになるため、抗癌剤の無作為的なアポトーシス及びこれによる副作用を防止し、癌細胞選択的なアポトーシスがなされる。
本発明において、前記グリピカン－３特異的アプタマーは、配列番号２～配列番号２５からなる群から選択されるいずれか一つの塩基配列を含むものであってもよいが、これに制限されない。具体的には、前記グリピカン－３特異的核酸アプタマーは、配列番号６及び配列番号１０～配列番号１９からなる群から選択されるいずれか１つの塩基配列を含むものであってもよいが、これに限定されない。
本発明において、前記変形アプタマーは、前記核酸アプタマーを含むものであってもよく、配列番号２～配列番号５、配列番号７～配列番号９、及び配列番号２０～配列番号２５からなる群から選択されるいずれか一つの塩基配列を含むものであってもよいが、これに限定されない。
本発明のもう一つの様態は、本発明の変形アプタマーの製造方法を提供することである。
ここで用いられる用語は前述した通りである。
本発明による変形アプタマーは、当業界において公知となった方法で製造することができ、例えば、一般的なオリゴヌクレオチド合成方法、核酸アプタマーと抗癌剤とを反応させる方法などにより製造できるが、これに制限されない。
前記オリゴヌクレオチド合成方法は、具体的には、核酸アプタマーの合成時に抗癌剤を塩基の代わりに添加してアプタマー配列内の抗癌剤を含む変形アプタマーを製造するものであってもよいが、これに制限されない。
前記核酸アプタマーと抗癌剤を反応させる方法は、具体的には、グリピカン－３に特異的に結合するアプタマー塩基配列を有する核酸アプタマーを準備するアプタマー準備段階；及び前記核酸アプタマーと抗癌剤を反応させて変形アプタマーを形成する変形アプタマー形成段階を含んでなるものであってもよい。前記変形アプタマーの形成段階は、例えば、核酸アプタマーにアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）で溶解させた抗癌剤と活性剤（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を添加して数分間反応させるものであってもよいが、これに制限されない。
本発明のもう一つの様態は、本発明の変形アプタマーを有効成分として含む、肝癌予防または治療用薬学組成物を提供することである。
ここで用いられる用語は前述した通りである。
本発明の薬学組成物は、肝癌の「予防」（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）及び／または「治療」（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の用途を有する。予防的用途において、本発明の薬学組成物は、本発明に記載の疾患、障害、または状態を有するか、または発病の危険性があると疑われる個体に投与される。すなわち、肝癌の発病の危険性がある個体に投与することができる。治療用途において、本発明の薬学組成物は、本発明に記載の障害を既に発症している患者のような個体に本発明に記載の疾患、障害、または状態の症状を治療するか、または少なくとも部分的に停止させるために十分な量で投与される。そのような使用に有効な量は、疾患、障害または状態の重症度及び経過、以前の治療、個体の健康状態と薬物に対する反応性、ならびに医師または獣医の判断にかかっているものである。
本発明の薬学組成物の製造に通常用いる適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。この時、前記組成物に含まれる有効成分の含量は特にこれに制限されないが、組成物の全重量に対して０．０００１重量％～１０重量％であり、望ましくは０．００１重量％～１重量％を含んでもよい。
前記薬学組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有することができ、経口または非経口の様々な剤形であってもよい。製剤化する場合には、普通用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も用いられる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤としては、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウィテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。
本発明の組成物は、個体に薬学的に有効な量で投与できる。
本発明において用語、「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／リスクの比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量の水準は個体の種類及び重症度、年齢、性別、疾病の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に用いられる薬物を含む要素及びその他医学分野においてよく知られている要素により決定されてもよい。本発明の組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次的または同時に投与されてもよい。そして単一または多重投与されてもよい。前記要素をいずれも考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者により容易に決定され得る。本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物の形態、投与経路及び期間によって異なり、投与は１日に１回投与することもでき、数回に分けて投与することができる。前記組成物は、肝癌の予防または治療を目的とする個体であれば、特に限定されず、いずれのものにも適用可能である。投与の方式は、当業界の通常の方法であれば、制限なく含む。例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射により投与され得る。
本発明の薬学組成物が、肝癌が発病して進行したり、発病し得る可能性が高い個体に投与され、肝癌の発生を防止したり発生の程度を緩和することができる。
本発明の薬学組成物において、有効成分であるグリピカン－３特異的変形アプタマーは、薬学組成物内に１００ｎＭ～５００ｎＭの濃度で含まれてもよい。前記濃度範囲より低い濃度では肝癌細胞に対するグリピカン３選択的抗癌効果が示されるのに十分ではないことがあり、前記濃度範囲より高い濃度では表皮癌細胞に対して細胞毒性を示すことがある。
本発明のもう一つの様態は、グリピカン－３特異的アプタマーを含む組成物を個体に投与する段階を含む、肝癌の予防または治療方法を提供することである。
ここで用いられる用語は前述した通りである。
本発明において「個体」とは、肝臓癌が発病しているか、発病し得るヒトを除く全ての動物を意味し、本発明の薬学組成物を肝癌の疑わしい個体に投与することにより、個体を効率的に治療することができる。
本発明において用語、「投与」とは、任意の適切な方法で肝癌の疑わしい個体に本発明の薬学組成物を導入することを意味し、投与経路は目的の組織に到達できる限り、経口または非経口の多様な経路を通じて投与されてもよい。
本発明の薬学組成物は薬学的に有効な量で投与でき、前記薬学的に有効な量は前述した通りである。
本発明の薬学組成物は、肝癌を予防または治療を目的とする個体であれば特に限定されず、いずれのものにも適用可能である。例えば、サル、犬、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、牛、羊、豚、ヤギのような非ヒト動物、鳥類及び魚類などいずれのものにも用いることができ、前記薬学組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内及び鼻腔内に投与され得、局部的治療のために、必要であれば病変内への投与を含む適した方法により投与され得る。本発明の前記薬学組成物の好ましい投与量は、個体の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者により適宜選択され得る。例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射により投与され得るが、これに制限されるものではない。
本発明の薬学組成物の適した総１日使用量は、正しい医学的判断の範囲内で処置医により決定されてもよく、一般に、０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇの量、望ましくは０．０５～２００ｍｇ／ｋｇ、より望ましくは０．１～１００ｍｇ／ｋｇの量を一日１回～数回に分けて投与できる。
本発明のもう一つの様態は、配列番号２～配列番号２５からなる群から選択されるいずれか一つの塩基配列を含む、グリピカン－３に特異的に結合する核酸アプタマーを提供することである。
ここで用いられる用語は前述した通りである。
本発明のもう一つの様態は、本発明の核酸アプタマーを有効成分として含む、グリピカン－３検出用組成物を提供することである。
本発明のグリピカン－３検出用組成物は、前述した核酸アプタマー以外にも核酸アプタマーの安定した保管及び保存のための当業界に公知となった担体及び／又は保存剤、安定剤などを含んでもよい。
また、前記核酸アプタマーには検出可能な標識が付着されてもよい。アプタマーに検出可能な標識を付着させることにより、標的分子とアプタマーの結合有無及び結合程度を容易に観察及び測定することが可能である。前記検出可能な標識は、当業界に知られた検出方法により検出され得るモイエティであってもよく、特に限定されない。前記検出可能な標識は、例えば、発色酵素（ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）等）、蛍光物質（ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓ））、クロモフォア（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）及び放射性同位元素（124Ｉ，125Ｉ，111Ｉｎ，99ｍＴｃ，32Ｐ，35Ｓ等）で構成された群から選択される少なくともいずれか一つであってもよいが、これに制限されず、具体的には、前記アプタマーの５’末端にＣｙ５を結合させたものであって
もよい。
前記検出用組成物は、器官、組織、細胞をはじめとして、標的分子、標的分子を含む標的物質を検出することができ、具体的には、癌細胞または腫瘍と連関して発現される標的物質を検出でき、より具体的には、肝癌と連関して発現されるグリピカン－３を含む標的物質を検出できるが、これに制限されない。
即ち、前記検出用組成物は、グリピカン－３イメージング用のものであってもよいが、これに制限されない。
また、前記検出用組成物は細胞内の蛍光を測定して細胞を検出でき、この時、前記細胞はグリピカン－３を発現する細胞であってもよく、より具体的にグリピカン－３を発現する癌細胞であってもよい。前記癌細胞は、例えば、肝癌細胞であってもよいが、これに制限されない。
即ち、前記検出用組成物は、グリピカン－３をイメージングして肝癌を診断するものであってもよいが、これに制限されない。
本発明のもう一つの様態は肝癌の診断または予後に必要な程度を提供するために、検査対象体由来の生物学的試料からグリピカン－３の含量を検出する段階；前記含量検出結果を対照群試料のグリピカン－３の含量検出結果と比較する段階；及び前記対照群試料と比較して、前記対象体由来試料の含量水準に変化がある場合、前記対象体を肝癌の診断または予後と関連付ける段階を含む、グリピカン－３を検出する方法を提供することである。
ここで用いられる用語は前述した通りである。
前記試料は個体から分離された細胞、血液、体液または組織を含むものであってもよく、グリピカン－３を含むものであってもよいが、これに制限されない。
前記グリピカン－３検出に必要な情報を提供する方法は、本発明のアプタマーを含む検出用組成物を試料と接触させ、前記アプタマー及び試料内グリピカン－３の複合体形成を確認することによりグリピカン－３を検出し、グリピカン－３の検出に必要な情報を提供することであってもよいが、これに制限されない。
前記アプタマー及びグリピカン－３の複合体の形成は、当業界に公知となった方法、例えば、比色法（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）、電気化学法（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ）、蛍光法（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）、発光法（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）、粒子計数法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）、吸光法（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）、分光法（ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）、ラマン分光法（Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）、表面プラズモン共鳴法（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ）、干渉計法（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）、肉眼測定法（ｖｉｓｕａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）、閃光計測法（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）、または酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ａｐｔａｍｅｒ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）により確認することができるが、これに制限されない。
本発明のもう一つの様態は、グリピカン－３検出用組成物を含む、肝癌診断用キットを提供することである。
ここで用いられる用語は前述した通りである。
以下、本発明を実施例により、より詳細に説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるものではなく、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者にとって明白なものである。
実施例１．ＧＰＣ３特異的アプタマーの選別
１－１．タンパク質結合親和力（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）の分析
ＧＰＣ３に特異的であると予想されるアプタマーライブラリ７つ［２４２８－１２－０９、２４２８－１２－１０、２４２８－１２－１１、２４２４－３０－０１、２４２４－３０－０５、２４２４－３０－０６、２４２４－３０－０７、計４０ ｍｅｒ］の中でＧＰＣ３に最も特異的に結合するアプタマーを選別するために、ＲＩ（Ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ Ｉｍｐｏｒｔｅｒ）標識を通じたタンパク質結合アッセイ（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）を行った。具体的には、各候補アプタマー配列のオリゴヌクレオチド３'部分にＲＩ標識及び非標識のオリゴヌクレオチド部分を除去するために、プレートにα－３２Ｐ ０．２５μｌ、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＤＮＡ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｅｘｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅまたはｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ） ０．２５μｌ、１０Ｘ ＮＥＢ 緩衝液１μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）、ＣｏＣｌ2 １μｌ、鋳型（アプタマー配列）７．５μｌ（計１０μｌ）を入れてホイル（Ｆｏｉｌ）でプレートを封止した後、３７℃で３０分間インキュベーションした（酵素インキュベーション）。再度７０℃で１０分間インキュベーションした後（酵素インキュベーション）、インキュベーションした各試料を３０μｌの蒸溜水で希釈した。マイクロスピン（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）Ｇ－５０カラムの下部を除去し、チューブ（ｔｕｂｅ）を被せた。８００ｒｃｆで１分間回転させた後、チューブを除去した。レジン（ｒｅｓｉｎ）に試料を入れて常温で、８００ｒｃｆで２分間回転させた。
ＲＩ標識及び非標識のオリゴヌクレオチド部分が除去されたアプタマーを１００μ１の１Ｘ ＳＢ１８Ｔ0,05で２０，０００ｃｐｍまで希釈した。９５℃で５分間、続いて、３７℃で１５分間アプタマーを加熱及び冷却させた。タンパク質（ＧＰＣ３）１００ｎＭを４．６４倍に段階希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）して計８ポイントで各ウェルに３０μｌずつ添加した。加熱及び冷却が終わったアプタマーに２００μｌの１Ｘ ＳＢ１８Ｔ0.05を添加した後、これを各ウェルに３０μｌずつ入れて計６０μｌになるようにした。アプタマー２μｌを対照群（ｉｎｐｕｔ ｃｏｎｔｒｏｌ）としてナイロンフィルタに落とした。３７℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーションの間、１Ｘ ＳＢ１８Ｔ0.05 ３０μｌをフィルタプレートに予め入れた。インキュベーション後にゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）レジンを５．５μｌ入れ、１４００ｒｐｍで１分間反応させた。ゾルバックス－タンパク質－アプタマー（Ｚｏｒｂａｘ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ａｐｔａｍｅｒ）をフィルタプレートに入れて吸引（ｓｕｃｔｉｏｎ）した後、１Ｘ ＳＢ１８Ｔ0.05 ２００μｌで洗浄した。ナイロンフィルタを露出させ、フィルタプレートをホスフォイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）で１７時間一晩中スクリーニングした。スクリーンを分析し、各タンパク質濃度による結合程度を導き出した（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｂｏｕｎｄ値）。
その結果、図１のようにタンパク質濃度が高いほど多くのアプタマーが結合したことが示され、候補中、２４２８－１２－１０が最大結合能力（ｍａｘｉｍｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ，Ｂｍａｘ）０．７９、解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｋｄ）１．５０で最も優れた結合力を示した。
最も優れた結合力を示した２４２８－１２－１０（以下、１２－１０と命名、４０ｍｅｒ、配列番号１）アプタマー及びこの配列を一部切断した１２－１２（３５ｍｅｒ）アプタマーに対する結合親和力を前記方法で確認した。具体的には、ＧＰＣ３にシアニン５（Ｃｙ５）ＮＨＳエステル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を結合させてＧＰＣ３－Ｃｙ５を製造した。Ｃｙ５の合成は、一般的なオリゴヌクレオチド合成と同様の方法で合成した。合成された最終粉末に最小量の水（約５０μｌ）を添加して再懸濁し、その後、ＧＰＣ３－Ｃｙ５ １００ｎＭを４．６４の段階に段階希釈し、各タンパク質濃度による結合程度を導き出した。
その結果、図２のようにタンパク質の濃度が高いほど多くのアプタマーが結合したことが示され、１２－１０と１２－１２のＫｄ値が同様に示されたことを確認した。
１－２．ＧＰＣ３特異的アプタマー及び変形アプタマーのタンパク質結合親和力の分析
１２－１０（４０ｍｅｒ）アプタマーに抗癌剤が結合した変形アプタマーを製造した。変形アプタマーはオリゴヌクレオチド合成方法を用いて製造し、オリゴヌクレオチド合成時にアプタマー配列内の塩基２つが抗癌剤［ゲムシタビン、ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ（２’，２’－ｄｉｆｌｕｏｒｏ ２’ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）］で置換されるようにして変形アプタマーを形成させた。この時、ゲムシタビンが置換される位置は、ゲムシタビンが置換されてもアプタマーの構造形成に影響がない位置を予測して塩基配列ＣまたはＧの中から選定した後、３’末端、ループ（Ｌｏｏｐ）、５’末端（ｅｎｄ）または塩基対（Ｐａｉｒ）の部分にゲムシタビンが２つずつそれぞれ置換されて結合した１２－１０ Ｇ（２）アプタマー（配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５）（図３）を製造した（図３）。前記アプタマー配列は下記表１の通りであった。
前記配列においてｎで示される塩基は、ジオキシウリジンのピリミジン基の５番目の炭素位置にベンジル基が導入された塩基（ＢｚｄＵ）であり、前記化学式３で表される。Ｓで表される塩基はゲムシタビンが置換された塩基である。
その後、製造された１２－１０ Ｇ（２）変形アプタマー（配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５）及び対照群として１２－１０に対して実施例１－１の方法によりタンパク質結合親和力を分析した。
その結果、図４のようにゲムシタビンの位置に応じて結合親和力が変わることを確認することができた。この結果により塩基対の部分と５’末端はゲムシタビンで置換される場合、タンパク質との結合力に影響を与える位置であることを確認した。
１－３．ＧＰＣ３特異的アプタマー及び変形アプタマーの抗癌効能の分析
１２－１０ Ｇ（２）変形アプタマー１００μＭ（配列番号２、配列番号３）及び対照群として無処理群（１２－１０）、ゲムシタビンの数を合せるために２倍の濃度である２００ｎＭのゲムシタビンを単独処理したゲムシタビン処理群が肝細胞に選択的抗癌効能を示すかを確認するために、細胞毒性を分析した。具体的には、Ｈｕｈ－７細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を９６ウェルプレートに１ｘ１０4／ｍｌでシーディングし、１０％ ＦＢＳ （Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）と１％の抗生剤（ペニシリン／ストレプトマイシン）が含まれたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）培地を用いて５％ ＣＯ2、３７℃の条件下に培養した。翌日、アプタマーストック（１００μＭ）を５Ｘ ＳＢ１８緩衝液と混合して８０μＭに製造した後、９５℃で５分加熱し、常温で１５分間以上冷却した。培養した細胞から培地を除去し、無血清培地１００μｌを添加した後、３７℃で１時間５％ ＣＯ2の条件で培養した。無血清培地を除去した後、１Ｘ ＰＢＳ １００μｌで洗浄した。ＫＲＰＨ緩衝液１００μｌを添加し、３７℃で１時間５％ ＣＯ2の条件で培養した。アプタマーを所望の濃度の２倍になるようにＫＲＰＨ緩衝液で希釈した後、１Ｘになるように９６ウェルプレートに添加して３７℃で４時間５％ ＣＯ2の条件で培養した。アプタマー処理後にＫＲＰＨ緩衝液を除去して後、培養培地１００μｌを入れて３７℃で３日間５％ ＣＯ2の条件で培養した。６日後にＣＣＫ－８（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８）キット溶液１０μｌずつを各ウェルに入れた後、３７℃で３時間５％ ＣＯ2の条件で培養した。マイクロプレートリーダで４５０ｎＭでアポトーシスの水準を測定した。
その結果、図５のように３’末端とループ部分に結合した複合体のアポトーシス効能はほぼ同様に示され、ゲムシタビンによる抗癌効能が十分に示されることを確認することができた。
実施例２．長さ最適化したＧＰＣ３特異的アプタマーの選別
２－１．細胞結合（ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）の分析
１２－１０アプタマー及び１２－１０アプタマーを多様な長さに切断して製作したアプタマーライブラリ５つ［１２－１０（４０ｍｅｒ）、１２－１２（３５ｍｅｒ）、１２－１１（２９ｍｅｒ）、１２－１３（２４ｍｅｒ）、１２－１４（２３ｍｅｒ）、１２－１５（１８ｍｅｒ）］に対して細胞結合力を分析した。各アプタマー配列は、実施例１－１の方法により５’末端にＣｙ５を標識した。１００ｍｍ2の培養皿にＨｕｈ－７細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）２ｘ１０6／ｍｌをシーディングし、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）と１％の抗生剤（ペニシリン／ストレプトマイシン）が含まれたＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて５％ ＣＯ2、３７℃の条件下で培養した。アプタマーストック５μＭと５Ｘ ＳＢ１８緩衝液を混合してアプタマー４μＭを作った後、９５℃で５分間加熱し、常温で１５分間以上冷却した。アプタマー４μＭをＫＲＰＨ緩衝液（ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ，ＫＨ2ＰＯ4 ５ｍＭ，ＭｇＳＯ4 １ｍＭ，ＣａＣｌ2 １ｍＭ，ＮａＣｌ １３６ｍＭ，ＫＣｌ ４．７ｍＭ，ｐＨ ７．４）で、２５ｎＭに希釈した。培養した細胞の培養液を除去し、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）４ｍｌを入れて洗浄後にＰＢＳ４ｍｌを除去した。再度冷たいＰＢＳまたは温かいＰＢＳ ４ｍｌを入れてスクレーパー（ｓｃｒａｐｅｒ）で細胞を掻き取り、それぞれチューブに集めた後、ピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）した。試料の数だけＦＡＣｓ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）チューブに分けて添加した後、４℃で２０００ｒｐｍ、４分間遠心分離した。上清を除去した後、ＫＲＰＨ緩衝液１５ｍｌに２５ｎＭアプタマー及び対照群（３１－０８（４０ｍｅｒ）アプタマー）をそれぞれ５００μｌずつ入れてピペッティングした。ホイルでチューブの外側を包んで光を遮断した後、４℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、４℃で２０００ｒｐｍ、４分間遠心分離し、上清を除去した。冷たい１ｘ ＰＢＳ ２ｍｌを入れて洗浄し、４℃で２０００ｒｐｍ、４分間遠心分離し、上清を除去する過程を３回繰り返した。３回目で上清除去後、１～２ｍｌのＦＡＣｓ緩衝液（１％ ＢＳＡ，１Ｘ ＰＢＳ）に入れてＦＡＣｓチューブに移して氷上に置いた。６５０－６７０ｎｍでＣｙ５を測定した。
その結果、図６のように１２－１２（３５ｍｅｒ）の細胞結合力が最も優れていることを確認した。
２－２．細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）の分析
１２－１０アプタマーを多様な長さに切断して製作したアプタマー５つ［１２－１２（３５ ｍｅｒ），１２－１１（２９ ｍｅｒ），１２－１３（２４ ｍｅｒ）， １２－１４（２３ ｍｅｒ）及び１２－１５（１８ ｍｅｒ）］に対して細胞内在化を分析した。具体的には、６ウェルプレートを準備し、丸いカバーガラス（ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ）を６ウェルプレート内に置いた。実施例１－３の方法によりＨｕｈ－７細胞を６ウェルプレートに培養した。アプタマーストック５μＭと５Ｘ ＳＢ１８緩衝液を混合してアプタマー４μＭを作った後、９５℃で５分間加熱し、常温で１５分間以上冷却した。翌日、培養した細胞から培地を除去した後、無血清培地を入れて３７℃で１時間５％ ＣＯ2の条件で培養した。無血清培地を除去し、１Ｘ ＰＢＳ２ｍｌを入れて洗浄した。ＫＲＰＨ緩衝液を入れて３７℃で１時間５％ ＣＯ2の条件で培養した。４μＭのアプタマーを２５ｎＭになるように希釈した後、３７℃で１時間または４時間５％ ＣＯ2の条件で培養した。１Ｘ ＰＢＳ２ｍｌで３回繰り返して洗浄した。洗浄は、攪拌機（ｓｈａｋｅｒ）で光を遮断した状態で、常温で１０分間行った。その後、４℃で１０分間４％のパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を処理して固定した。１Ｘ ＰＢＳ２ｍｌを用いて３回繰り返して洗浄した。透過化（Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）溶液（０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ ｉｎ １Ｘ ＰＢＳ）を入れて常温で１５分間インキュベーションした後、１Ｘ ＰＢＳ２ｍｌで３回繰り返して洗浄した。ブロッキング（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）溶液（３％ ＢＳＡ，１Ｘ ＰＢＳ）を入れて３７℃で２０分間５％ ＣＯ2の条件でインキュベーションした。１Ｘ ＰＢＳ２ｍｌで１回洗浄した。１５０ｎＭのリソトラッカー（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ）を含むブロッキング（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）溶液を処理した後、３７℃で１時間５％ ＣＯ2の条件でインキュベーションした。１Ｘ ＰＢＳ２ｍｌで３回繰り返して洗浄し、ＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）染色した。カバーガラスを慎重に取り外してマニキュア処理した。
その結果、図７のように１２－１２（３５ｍｅｒ）の細胞内在化が最も優れていることを確認した。
２－３．ＧＰＣ３特異的アプタマー及び変形アプタマーの細胞結合及び細胞内在化の分析
ＧＰＣ３に対する結合親和力、細胞結合及び細胞内在化が優れていることが確認された１２－１２（３５ｍｅｒ）アプタマーに実施例１－２の方法により抗癌剤を結合させ、ゲムシタビンが３、５、７個ずつそれぞれ置換されて結合した１２－１２ Ｇ（３）、１２－１２ Ｇ（５）、１２－１２ Ｇ（７）アプタマー（配列番号７、配列番号８、配列番号９）を製造した（図８）。各ライブラリの３’末端にはｉｄＴが付着されて合成された。
その後、１２－１２ Ｇ（３）、１２－１２ Ｇ（５）、１２－１２ Ｇ（７）アプタマー及び対照群として無処理群（３’末端にｉｄＴが付着された１２－１２、配列番号６）、１２－１２－Ｃｙ５、スクランブルされた１２－１２（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ３５ｍｅｒ）に対して実施例２－１の方法により細胞結合を分析した。前記アプタマー配列は下記表２の通りであった。
前記配列おいてｎで表される塩基は、ジオキシウリジンのピリミジン基の５番目の炭素位置にベンジル基が導入された塩基（ＢｚｄＵ）であり、前記化学式３で表される。Ｓで表される塩基はゲムシタビンが置換された塩基である。
その結果、図９のようにゲムシタビン３つが結合した変形アプタマーが最も優れた細胞結合を示すことを確認した。
また、ゲムシタビン３つが結合した変形アプタマー１２－１２ Ｇ（３）及び対照群として１２－１２アプタマー、スクランブルされた１２－１２（ＳＣ）に対して実施例２－２の方法により細胞内在化を分析した。
その結果、図１０のようにゲムシタビン３つが結合した変形アプタマー１２－１２ Ｇ（３）の細胞内在化が優れていることを確認し、図１１のように内在化開始後、１、２、４時間後、確認した結果でもゲムシタビン３つが結合した変形アプタマー１２－１２ Ｇ（３）の細胞内在化が優れていることを確認した。
本実施例の結果においてゲムシタビンの数が増加するほど細胞結合力が低くなることを確認した。
２－４．ＧＰＣ３特異的アプタマー及び変形アプタマーの抗癌効能の分析
タンパク質結合親和力、細胞結合及び細胞内在化が優れていることが確認された変形アプタマー１２－１２ Ｇ（３）及び対照群として無処理群、１２－１２単独、ゲムシタビン単独が肝癌細胞及び表皮癌細胞に対してＧＰＣ３選択的抗癌効能を示すかを確認するために、細胞毒性を分析した。具体的には、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ及びＡ４３１細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を９６ウェルプレートに１ｘ１０4／ｍｌでシーディングし、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）と１％の抗生剤（ペニシリン／ストレプトマイシン）が含まれたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）培地を用いて５％ ＣＯ2、３７℃の条件下に培養した。翌日、アプタマーストック（１００μＭ）を５Ｘ ＳＢ１８緩衝液と混合して８０μＭで製造した後、９５℃で５分間加熱し、常温で１５分間以上冷却した。培養した細胞から培地を除去し、無血清培地１００μｌを添加した後、３７℃で１時間５％ ＣＯ2の条件で培養した。無血清培地を除去した後、１Ｘ ＰＢＳ １００μｌで洗浄した。ＫＲＰＨ緩衝液１００μｌを添加し、３７℃で１時間５％ ＣＯ2の条件で培養した。アプタマーを所望の濃度の２倍になるようにＫＲＰＨ緩衝液で希釈した後、１Ｘになるように９６ウェルプレートに添加し、３７℃で４時間５％ ＣＯ2の条件で培養した。アプタマー処理後にＫＲＰＨ緩衝液を除去して後、培養培地１００μｌを入れて３７℃で６日間５％ ＣＯ2の条件で培養した。６日後にＣＣＫ－８キット溶液１０μ１ずつを各ウェルに入れた後、３７℃で３時間５％ ＣＯ2の条件で培養した。マイクロプレートリーダで、４５０ｎＭでアポトーシスの水準を測定した。
その結果、図１２のように１０ｎＭ～１μＭ濃度のゲムシタビン３つが結合した変形アプタマー１２－１２ Ｇ（３）は、１０Ｍ～１μＭ濃度の１２－１２または３０ｎＭ～３μＭ濃度のゲムシタビンに比べてＨｅｐＧ２アポトーシス効果に優れており、表皮癌細胞であるＡ４３１に対してはアポトーシスを示さなかった。
また、図１３のように３１．７５Ｍ～２μＭ濃度のゲムシタビン３つが結合した変形アプタマー１２－１２ Ｇ（３）は、同一の濃度の１２－１２またはゲムシタビンに比べてＨｅｐＧ２アポトーシス効果に優れており、表皮癌細胞であるＡ４３１に対してはアポトーシスを示さなかった。
実施例３．化学最適化したＧＰＣ３特異的アプタマーの選別
３－１．塩基が置換されたアプタマーライブラリの製作
ＧＰＣ３に対する結合親和力、細胞結合及び細胞内在化に優れることが確認された１２－１２（３５ｍｅｒ）アプタマーを化学的に最適化するために、アプタマー配列内に置換を導入した。具体的には、アプタマー配列内にＮａｐ－ｄＵを導入したライブラリ１２個、Ｃ３リンカーを導入したライブラリ１１個、２－Ｆを配列中の塩基Ｇにのみ導入したライブラリ７つ、２－Ｆを配列中の塩基Ｃにのみ導入したライブラリ７つ、２－Ｆを配列中の塩基Ａにのみ導入したライブラリ８つ、２－０－Ｍｅを配列中の塩基Ｇにのみ導入したライブラリ７つ、２－０－Ｍｅを配列中の塩基Ｃにのみ導入したライブラリ７つ、２－０－Ｍｅを配列中の塩基Ａにのみ導入したライブラリ８つを製作した。各ライブラリの５’末端にはＣｙ５、３’末端にはｉｄＴが付着されて合成された。
３－２．塩基が置換されたアプタマーライブラリに対するタンパク質結合親和力の分析
実施例３－１のアプタマーライブラリのタンパク質結合親和力を分析するためにＮａｐ－ｄＵ、２－Ｆ、２－０－Ｍｅを導入したライブラリに対してｑＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）結合アッセイ、Ｃ３リンカーを導入したライブラリに対してＭＳＴ（Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）アッセイを行った。具体的には、ｑＰＣＲを用いたタンパク質結合アッセイは、ｑＰＣＲマスターミックス［最終濃度基準：１Ｘ ＫＯＤ緩衝液、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２μＭ ５’、３’プライマー、５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１Ｘ ＳＹＢＲグリーン、０，０２５Ｕ／μｌ ＫＯＤポリメラーゼ、Ｄ．Ｗ．（ＫＡＰＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，Ｓｉｇｍａ， Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）］を用いて行った。アプタマー（２０ｎＭ）５μｌと１Ｘ ＳＢ１８Ｔ0.05 ９５μｌを混合して濃度が１０ｆｍｏｌｅ（１０10コピー）であるアプタマーを準備し、９５℃で５分間、７０℃で５分間、４８℃で５分間、その後、３７℃で放置して加熱及び冷却した。ＧＰＣ３ １００ｎＭを４．６４倍で段階希釈した、計８ポイントを各ウェルに３０μｌずつ添加した。加熱及び冷却されたアプタマーに１Ｘ ＳＢ１８Ｔ0.05 ２００μｌを添加した後、これを各ウェルに３０μｌずつ入れ、ウェル当たり含まれたＧＰＣ３及びアプタマーが計６０μｌになるようにした。３７℃で３０分間インキュベーションしてＧＰＣ３及びアプタマー間の結合が起こるように反応させた。インキュベーション後、１０ｍｇ／ｍｌのＴＡＬＯＮビード（ｂｅａｄ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を５．５μｌずつ各ウェルに入れ、１４００ｒｐｍで５分間反応させた。フィルタプレートに反応させたＴＡＬＯＮビードＧＰＣ３－アプタマー混合物を入れて吸込ませた。その後、１Ｘ ＳＢ１８Ｔ0.05 ２００μｌで洗浄後に ＳＢ１８Ｔ0.05緩衝液を除去した。フィルタプレートに残った緩衝液を除去するために、フィルタプレートの下にディープウェルプレート（ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）を嵌めた後、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。新たなディープウェルプレートに８ｍＭ ＨＣｌ ２０μｌを添加し、遠心分離したフィルタプレートを嵌めた。フィルタプレートに２０ｍＭ ＮａＣｌ ８０μｌを添加した後、１０００ｒｐｍで５分間反応させ、その後、１０００ｒｐｍで２分間遠心分離してアプタマーを溶離（ｅｌｕｔｉｏｎ）させた。溶離されたアプタマーを１０10コピーになるように濃度を合せた後、１０10コピーから１０8コピーまで１０倍ずつ３．２ｍＭＮａＣｌを利用して希釈させ、各濃度のアプタマー（１０10コピー、１０9コピー、１０8コピー）をｑＰＣＲプレートのウェルの２行目にそれぞれ１０μｌ添加した。各タンパク質と結合させない純粋アプタマー（ｓｔａｎｄａｒｄ）１０10コピー、１０9コピー、１０8コピーをｑＰＣＲプレートのウェルの最初の行にそれぞれ１０μｌ添加した。その後、ｑＰＣＲ混合物を全てのウェルに１０μｌずつ添加し、ウェル内の総体積が２０μｌになるようにした後にｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲの条件は９６℃で４５秒間、５５℃で１０秒間、７０℃で１時間１回、その後、９６℃で１５秒間、７０℃で１分間４０回繰り返した。その後、実施例１－１の方法によりＢｍａｘ及びＫｄ値を算出した。
ＭＳＴを行うために、５μＭアプタマー２４μｌと５Ｘ ＳＢ１８緩衝液６μｌを混合して４μＭアプタマー３０μｌを製造した後、９５℃で５分間、その後、常温で１０分間加熱及び冷却した。アプタマーの５’末端にＣｙ５を標識し、１Ｘ ＳＢ１８Ｔ0.05緩衝液を用いて標識されたアプタマーを４ｎＭ、ＧＰＣ３を２００ｎＭの濃度にそれぞれ希釈した。２００ｎＭ ＧＰＣ３ １０μｌを新たなＰＣＲチューブに２０μｌずつ配分し、１Ｘ ＳＢ１８Ｔ0.05緩衝液を用いて１／２段階希釈した。希釈されたＧＰＣ３に４ｎＭアプタマーを１０μｌずつ添加し、計２０μ１になるようにした。２０μｌのＧＰＣ３－アプタマー混合物をＭＳＴ毛細管（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）に投与し、毛細管スキャン（Ｓｔａｒｔ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｓｃａｎ）を用いて適正な蛍光値を決定した後、ＭＳＴを測定し、Ｋｄ及びＫｄコンフィデンス（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ）値を導き出した。
その結果、図１４のように、１２－１２（３５ｍｅｒ）アプタマーライブラリのタンパク質結合親和力が確認された。
３－３．化学最適化したアプタマーライブラリの選別
実施例３－２の結果と実施例３－１のアプタマーライブラリに対して実施例２－１の方法によりＨｅｐＧ２細胞結合を分析した結果を総合し、タンパク質結合親和力及び細胞結合を考慮してアプタマー配列内の塩基の置換位置及び対象（Ｎａｐ－ｄＵ、Ｃ３リンカー、２－Ｆ、２－０－Ｍｅ）を導き出し、優れたタンパク質結合親和力及び細胞結合を示すことができるものと予想されるアプタマーライブラリ１０個（ｃｏｍｂｉ １～１０、配列番号１０～１９）を選別した（図１５）。
選別されたアプタマー中、ｃｏｍｂｉ １～５に対して実施例２－１の方法により細胞結合分析及び実施例２－２の方法により細胞内在化分析を行った。
その結果、図１６のようにＨｅｐＧ２でｃｏｍｂｉ ５の細胞結合が１２－１２と最も類似したことを確認し、図１７ａのようにＨｅｐ３Ｂ細胞でｃｏｍｂｉ ５の細胞内在化が最も多く行われたことを確認した。ｃｏｍｂｉ ４でも優れた細胞内在化が確認された。また、図１７ｂのようにＣｏｍｂｉ ６～１０番で細胞内在化を確認した。また、Ｃｏｍｂｉ ６～１０番でＧＰＣ３が多く発現された肝癌特異的細胞（ＨｅｐＧ２，Ｈｅｐ３Ｂ）の選択的な細胞内在化が生じることを確認し、ＧＰＣ３の発現が低いＡ４３１細胞には細胞内在化が示されなかった。そのうち、Ｃｏｍｂｉ ８とＣｏｍｂｉ ９において細胞内在化が最も多く生じたことを確認した。
実施例４．化学最適化したＧＰＣ３特異的変形アプタマーの選別
４－１．タンパク質結合親和力、細胞結合、細胞内在化及び抗癌効能の分析
優れたタンパク質結合親和力及び細胞内在化が確認されたアプタマーライブラリｃｏｍｂｉ ４、５及び８に実施例１－２の方法により抗癌剤を結合させて変形アプタマーを製造した。具体的には、ｃｏｍｂｉ ４、５及び８にゲムシタビンを３つまたは５つ結合させて変形アプタマーを製造した。また、アプタマー配列内の塩基の一部がメトキシエチル（Ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ、ＭＯＥ）で置換されたアプタマーライブラリ（配列番号２０）にゲムシタビンを３つ結合させて変形アプタマーを製造した。前記アプタマー配列は、下記表３の通りであった。
前記配列においてMeで表された塩基は２番目の炭素位置に－Ｍｅ（メトキシ）基が導入された塩基（２－０－Ｍｅ，２－０－Ｍｅｔｈｏｘｙ－ＤＮＡ）である。Fで表された塩基は２番目の炭素位置に－Ｆ（フッ素）基が導入された塩基（２－Ｆ，２－Ｆｌｕｏｒｉｎｅ－ＤＮＡ）である。moeで表される－１８－塩基は２番目の炭素位置に－ｍｏｅ（メトキシエチル）基が導入された塩基（２－ｍｏｅ，２－Ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ－ＤＮＡ）である。Ｙで表された塩基はピリミジン基の５番目の炭素位置に５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－ジオキシウリジン（５－（Ｎ－ｎａｐｈｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｅ）－２’－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）が導入された塩基（Ｎａｐ－ｄＵ）であり、前記化学式１で表される。Ｗで表される塩基は３番目の炭素位置にリンカー（Ｃ３ ｌｉｎｋｅｒ）が導入された塩基（Ｃ３ ｌｉｎｋｅｒ－ＤＮＡ）であり、前記化学式２で表される。ｎで表される塩基はジオキシウリジンのピリミジン基の５番目の炭素位置にベンジル基が導入された塩基（ＢｚｄＵ）であり、前記化学式３で表される。Ｓで表される塩基はゲムシタビンが置換された塩基である。
製造された変形アプタマーに対し実施例３－２の方法によりＭＳＴを用いたタンパク質結合分析、実施例２－１の方法により細胞結合分析及び実施例２－２の方法によりＨｅｐＧ２、Ａ４３１で細胞内在化の分析を行った。
その結果、図１８のようにｃｏｍｂｉ ４及び５にゲムシタビンを３つ結合させた場合、Ｋｄは１２－１２アプタマーと類似の水準であったが、ゲムシタビンを５つ結合させた場合には、結合力が低いことが示された。
また、図１９のようにｃｏｍｂｉ ４及び５にゲムシタビンを３つ結合させた場合が（ｃｏｍｂｉ ４ Ｇｅｍ（３）、Ｃｏｍｂｉ ５ Ｇｅｍ（３））５つ結合させた場合（Ｃｏｍｂｉ ４ Ｇｅｍ（５），Ｃｏｍｂｉ＿５ Ｇｅｍ（５））より細胞結合力に優れており、ｃｏｍｂｉ ４とｃｏｍｂｉ ５との間の細胞結合力を比較してみると、ゲムシタビンが結合していない時の細胞結合力と同様に、ｃｏｍｂｉ ５において細胞結合力に優れた。図２０～図２２でもゲムシタビンを３つ結合させたｃｏｍｂｉ ４及び５（Ｃｏｍｂｉ＿４ Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ（３），Ｃｏｍｂｉ＿５ Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ（３））で優れた細胞内在化が確認された。
ゲムシタビンを３つまたは５つ結合させたｃｏｍｂｉ ４及び５ゲムシタビンが３つ結合したｃｏｍｂｉ １１が肝癌細胞及び表皮癌細胞に対してＧＰＣ３選択的アポトーシス効能を示すかを確認するために、実施例１－３の方法によりアポトーシス効能を分析した。
その結果、図２３のようにゲムシタビンを３つまたは５つ結合させたｃｏｍｂｉ ４及び５（Ｃｏｍｂｉ ４＿Ｇ（３），Ｃｏｍｂｉ ５＿Ｇ（３），Ｃｏｍｂｉ ４＿Ｇ（５），Ｃｏｍｂｉ ５＿Ｇ（５））は、表皮癌細胞であるＡ４３１に対しては５００ｎＭの濃度までアポトーシス効果を示さなかったが、ＧＰＣ３が発現された肝癌細胞に対しては１００ｎＭの濃度からアポトーシスを示した。アプタマーに結合したゲムシタビンの数が増えるほどアポトーシス効果にも強くなることを確認した。
また、図２４のようにゲムシタビンが３つ結合したｃｏｍｂｉ １１は肝癌細胞に対して２００ｎＭの濃度からアポトーシスを示すことを確認した。
４－２．細胞周期の分析
ゲムシタビンを３つまたは５つ結合させたｃｏｍｂｉ ４及び５が肝癌細胞の細胞周期に及ぼす影響を確認するために細胞周期を分析した。具体的には、６ウェルプレートにＨｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、Ａ４３１細胞１ｘ１０6／ｗｅｌｌをシーディングし、１０％ ＦＢＳと１％の抗生剤（ペニシリン／ストレプトマイシン）が含まれたＤＭＥＭ培地を用いて５％ ＣＯ2、３７℃の条件下に培養した。翌日、変形アプタマーストック１００μＭと５Ｘ ＳＢ１８緩衝液を混合してアプタマー８０μＭを作った後、９５℃で５分間加熱し、常温で１５分間以上冷却した。培養した細胞の培養液を除去し、無血清培地で交換した後、３７℃で１時間５％ ＣＯ2の条件で培養した。無血清培地を除去し、１Ｘ ＰＢＳ２ｍｌを入れて洗浄後にＫＲＰＨ緩衝液２ｍｌを入れて３７℃で１時間５％ ＣＯ2の条件で培養した。アプタマーを入れた後に再度３７℃で４時間５％ ＣＯ2の条件で培養した。ＫＲＰＨ緩衝液を除去し、１Ｘ ＰＢＳ ２ｍｌを入れて洗浄してＰＢＳを除去した。再度１Ｘ ＰＢＳ２ｍｌを入れてスクレーパーで細胞を掻き取ってＦＡＣｓチューブに集めた後、４℃で２０００ｒｐｍ、４分間遠心分離した。１／５００で希釈したＲＮＡａｓｅ ＡとＰＢＳで５０μｇ／ｍｌに希釈したヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）をＦＡＣｓチューブに５００ｕｌ添加してピペッティングした。光を遮断した条件で常温に３０分間インキュベーションした後、細胞周期を測定した。
その結果、図２５～２７のようにゲムシタビンを３つまたは５つ結合させたｃｏｍｂｉ ４及び５（ｃｏｍｂｉ ４＿Ｇ（３），Ｃｏｍｂｉ ５＿Ｇ（３），Ｃｏｍｂｉ ４＿Ｇ（５），Ｃｏｍｂｉ ５＿Ｇ（５））は、肝癌細胞に対しては細胞周期の進行をＧ１／Ｓ段階で抑制したが、表皮癌細胞に対しては細胞周期抑制を示さなかった。これを通じてゲムシタビンの数の増加による細胞周期抑制効果の増加を確認し、ＧＰＣ３が発現されない他の癌細胞では比較群であるゲムシタビン単独処理と比較した時、細胞周期抑制効果を奏しないことから、ＧＰＣ３が発現された細胞に対する選択性が示されることを確認した。
４－３．血清安定性の分析
１２－１２、ｃｏｍｂｉ ５アプタマー及びゲムシタビンを３つまたは５つ結合させたｃｏｍｂｉ ４、５変形アプタマーがヒト血清内で安定するかを確認するために血清安定性を分析した。具体的には、１００％のヒト血清に１０ｕＭの変形アプタマー１０μｌを入れて３７℃で０、１、３、６、１２、２４時間インキュベーションした。インキュベーション後、１０μＭの対照群アプタマー５μｌを入れ、蒸溜水で２５０μｌになるように体積を合せた。フェノール：クロロフォーム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を同じ体積で２５０ｕｌ添加して攪拌した。各試料を１６０００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を新チューブに移して完全に乾燥させた。５ｘサンプル緩衝液と蒸溜水で希釈後、９５℃で５分間沸かした後、冷した。尿素ＰＡＧＥ（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で、２２０Ｖで２５分間サンプル分離した後、ＳＹＢＲゴールドに染色してＧｅｌ ＤｏｃTM ＥＺシステムで確認した。
その結果、図２８のようにヒト血清において１２－１２アプタマーは６時間の半減期を維持したが、化学的最適化したＣｏｍｂｉ ５ Ｇ（３）の場合、半減期が約６４時間で安定性が増加したことを確認した。これは、最適化前の１２－１２より約１０倍以上改善された結果を示した。
本実施例の結果によりＧＰＣ３の有無による選択的な抗癌効果とゲムシタビンの数依存的なアポトーシス効果を確認した。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

Claims (14)

  1. グリピカン－３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＧＰＣ３）に特異的に結合する核酸アプタマー及び抗癌剤を含む変形アプタマー。
  2. 前記核酸アプタマーは、配列番号１の変異体からなる、請求項１に記載の変形アプタマー。
  3. 前記変異体は、配列番号１の塩基配列において一つ以上のヌクレオチドの切断；配列番号１の塩基配列において一つ以上のヌクレオチド内の塩基構造のピリミジン基の５番目の炭素位置でナフチル基への置換；一つ以上のヌクレオチドが糖と塩基を有さないリンカーへの置換；一つ以上のヌクレオチド内の塩基構造の２番目の炭素位置で－ＯＨ基が－Ｍｅｔｈｏｘｙ（メトキシ）、－Ｆ（フッ素）またはＭｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ（メトキシエチル）のいずれか１つ以上への置換；一つ以上のヌクレオチド内の糖構造のジオキシウリジンのピリミジン基の５番目の炭素位置でベンジル基への置換；からなる群から選択されるいずれか１つ以上の変形を含む、請求項２に記載の変形アプタマー。
  4. 前記変異体は、配列番号２～配列番号２５からなるいずれか一つの塩基配列を含む、請求項２に記載の変形アプタマー。
  5. 前記抗癌剤は、前記核酸アプタマーに一つ以上結合する、請求項１に記載の変形アプタマー。
  6. 前記抗癌剤は、前記核酸アプタマーの塩基配列内のいずれか１つ以上の塩基が置換されて結合したものである、請求項５に記載の変形アプタマー。
  7. 前記塩基は、シトシンまたはグアニンである、請求項６に記載の変形アプタマー。
  8. 前記抗癌剤は、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビン（Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、クリゾチニブ（Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エルロチニブ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ、５－ＦＵ）、イマチニブメシレート（Ｉｍａｔｉｎｉｂ ｍｅｓｙｌａｔｅ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、リポソーム－カプセル化ドキソルビシン、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、トポテカン（Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、トラベクテジン（Ｔｒａｂｅｃｔｅｄｉｎ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、及びビンブラスチン（Ｖｉｎｂｒａｓｔｉｎｅ）からなる群から選択されるいずれか一つ以上である、請求項５に記載の変形アプタマー。
  9. 前記抗癌剤は、ゲムシタビンである、請求項８に記載の変形アプタマー。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の変形アプタマーを有効成分として含む、肝癌予防または治療用薬学組成物。
  11. 配列番号２～配列番号２５からなる群から選択されるいずれか一つの塩基配列を含む、グリピカン－３に特異的に結合する核酸アプタマー。
  12. 請求項１１に記載の核酸アプタマーを有効成分として含む、グリピカン－３検出用組成物。
  13. 肝癌の診断または予後に必要な程度を提供するために、
    請求項１２に記載の検出用組成物を用いて検査対象由来の生物学的試料からグリピカン－３の含量を検出する段階；
    前記含量検出結果を対照群試料のグリピカン－３の含有量検出結果と比較する段階；及び
    前記対照群試料と比較し、前記対象体由来試料の含量水準に変化がある場合、前記対象体を肝癌の診断または予後に関連付ける段階を含む、
    グリピカン－３を検出する方法。
  14. 請求項１２に記載の検出用組成物を含む、肝癌診断用キット。
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