JP2022061984A - Gdf15融合タンパク質及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
パク質、リンカー、及びGDF15タンパク質を含む融合タンパク質、融合タンパク質を
コードする核酸及び発現ベクター、その組換え細胞、並びに融合タンパク質を含む医薬組
成物に関する。かかる融合タンパク質を作製する方法、及びかかる融合タンパク質を使用
して代謝性疾患を治療するための方法も提供される。
て血漿中を循環する分泌タンパク質である。GDF15の血漿中濃度は多くの個人で15
0~1150pg/mlの範囲である(Tsai et al.,J Cachexia
Sarcopenia Muscle.2012,3:239~243)。GDF15
の血漿中濃度は、怪我、心血管系疾患、及びある種のがんの条件下で上昇する。この上昇
は、細胞保護的な機構であると考えられている。GDF15の高い血漿中濃度は、がんに
おける食欲不振及び悪液質による体重減少、また腎不全及び心不全における体重減少と関
連している。臨床試験では、GDF15レベルは、肥満の非糖尿病対象者におけるインス
リン抵抗性の独立予測因子とされていた(Kempf et al.,Eur.J.En
do.2012,167:671~678)。双子における研究により、双子のペアにお
けるGDF15のレベルの差がそのペアのBMIの差に相関していることが示され、GD
F15がエネルギーホメオスタシスの長期的な調節因子として機能していることを示唆し
ている(Tsai et al.,PLoS One.2015,10(7):e013
3362)。
研究されてきたが、心筋肥大及び虚血性傷害におけるGDF15の保護的な役割について
も記載されている(Collinson,Curr.Opin.Cardiol.201
4,29:366~371;Kempf et al.,Nat.Med.2011,1
7:581~589;Xu et al.,Circ Res.2006,98:342
~50)。GDF15は、1型及び2型糖尿病のマウスモデルにおいて腎尿細管及び腸へ
の傷害からの保護において重要な役割を担っていることが示されている。(Mazago
va et al.,Am.J.Physiol.Renal Physiol.201
3;305:F1249-F1264)。GDF15は、加齢に伴う感覚及び運動ニュー
ロンの喪失に対する保護作用を有することが示されており、末梢神経傷害後の回復を改善
する(Strelau et al.,J.Neurosci.2009,29:136
40~13648;Mensching et al.,Cell Tissue Re
s.2012,350:225~238)。実際、GDF15トランスジェニックマウス
は、その同腹のコントロールよりも長い寿命を有することが示されており、この分子が長
期生存因子として機能することを示唆し得るものである(Wang et al.,Ag
ing.2014,6:690~700)。
びインスリン感受性の改善が示されている。GDF15を過剰発現しているトランスジェ
ニックマウスの独立した2系統で体重及び体脂肪量の減少、並びに改善された耐糖能が認
められている(Johnen et al.,Nat.Med.2007,13:133
3~1340;Macia et al.,PLoS One.2012,7:e348
68;Chrysovergis et al.,Int.J.Obesity.201
4,38:1555~1564)。GDF15マウスにおいて全身のエネルギー消費量及
び酸化的代謝量の増加が報告されている(Chrysovergis et al.,2
014、同上)。これらは、褐色脂肪組織における熱発生遺伝子の発現の増加、及び白色
脂肪組織における脂肪分解遺伝子の増加を伴う。GDF15遺伝子を欠損したマウスでは
、体重及び体脂肪量が増加した(Tsai et al.,PLoS One.2013
,8(2):e55174)。GDF15のFc融合タンパク質は、肥満カニクイザルモ
デルにおいて週1回、6週にわたって投与した場合に体重を減少させ、耐糖能及びインス
リン感受性を改善することが示されている(国際公開第2013/113008号)。
して媒介されると考えられている。GDF15は、体重依存性及び非依存性の機構によっ
て血糖コントロールを改善している可能性がある。
治療法として有用であると考えられる。
F15を用いた組成物が当該技術分野で求められている。
若しくは予防に使用できることを示す特徴を示すGDF15の融合タンパク質を提供する
ことにより、このような要請に応えるものである。このような特徴としては、例えば、本
発明の実施形態による融合タンパク質を投与した対象の体重減少、耐糖能の向上、及びイ
ンスリン感受性の改善が挙げられる。
(c)GDF15タンパク質を含み、N末端からC末端に(a)-(b)-(c)の順序
で配列された融合タンパク質に関する。
の機能的変異体である。特定の実施形態では、GDF15タンパク質は、成熟GDF15
タンパク質又はその機能的変異体を含む。より詳細な実施形態では、GDF15タンパク
質は、配列番号6~11と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の
特定の実施形態では、GDF15タンパク質は、配列番号11のアミノ酸配列、例えば配
列番号6~11からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
はその機能的変異体である。特定の実施形態では、半減期延長タンパク質は、配列番号1
と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態では、半
減期延長タンパク質は、配列番号1~3からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
軟性リンカーは、配列(GGGGS)n(ただし、nは2~20、好ましくは4~10で
ある)を含む。本発明の別の一実施形態では、融合タンパク質のリンカーは構造化リンカ
ーである。特定の実施形態では、構造化リンカーは、配列(AP)n又は(EAAAK)
n(ただし、nは2~20、好ましくは4~10である)を含む。
0、48、55~60、又は64~75と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ
酸配列を含む。本発明の詳細な実施形態では、融合タンパク質は、配列番号5、25~3
0、40、55~60、及び70からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明
のより詳細な実施形態では、融合タンパク質は、配列番号60のアミノ酸配列を含む。
分子に関する。
を含む発現ベクターに関する。
を含む組換え宿主細胞に関する。
る方法は、(1)融合タンパク質が生成する条件下で、融合タンパク質をコードする核酸
分子を含む宿主細胞を培養することと、(2)宿主細胞により産生された融合タンパク質
を回収することと、を含む。
る担体とを含む医薬組成物に関する。
と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
法であって、治療又は予防を要する対象に、治療上又は予防上の有効量の本発明の医薬組
成物を投与することを含む、方法に関する。特定の実施形態では、医薬組成物は、対象に
皮下又は静脈内投与される。
インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全
、又は慢性関節リウマチからなる群から選択される代謝性疾患を治療する方法は、対象に
、配列番号5、25~30、40、55~60、及び70からなる群から選択されるアミ
ノ酸配列を含む融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、治療有効量の医薬
組成物を投与することを含む。詳細な一実施形態では、かかる方法は、対象に、配列番号
60のアミノ酸配列を含む融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む治療有効
量の医薬組成物を投与することを含む。
態及び付属の特許請求の範囲を含む以下の開示より明らかとなろう。
形態」は、添付の図面と併せて読むことでより良好に理解されるであろう。本発明は、図
面に示される実施形態そのものに限定されない点は理解されるべきである。
記載する。これら参照文献のそれぞれをその全容において参照により本明細書に援用する
ものである。本明細書に含まれる文書、操作、材料、装置、物品などの考察は、本発明の
コンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又はす
べてが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成すること
を容認するものではない。
本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。そうで
ない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するもの
である。本明細書に引用するすべての特許、公開された特許出願及び公開公報は、参照に
よって恰もその全体が本明細書に記載されているものと同様にして援用するものである。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「a」、「an」及び「the」
は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意しなければならな
い。
パク質を含み、N末端からC末端に(a)-(b)-(c)の順序で配列された融合タン
パク質に関する。
に基づく融合タンパク質は、GDF15タンパク質の半減期を増大させるため、本発明の
融合タンパク質は、代謝性疾患、障害又は状態を治療及び予防するための治療薬としての
適性を示す代謝効果を示すことが見出された。このような効果としては、これらに限定さ
れるものではないが、融合タンパク質を投与した動物の体重の減少、耐糖能の向上、イン
スリン感受性の改善が挙げられる。
タンパク質に由来する、互いに共有結合された2つ以上の部分を有するタンパク質を指す
。
ができる。本明細書で使用するところの「GDF15タンパク質」なる用語は、天然に存
在する野生型増殖分化因子15タンパク質、又はその機能的変異体を指す。GDF15タ
ンパク質は、ヒト、又はマウス、ウサギ、ラット、ブタ、イヌ、若しくは霊長類などの他
の適当な哺乳動物のような任意の哺乳動物に由来するものとすることができる。特定の実
施形態では、GDF15タンパク質は、ヒトGDF15タンパク質又はその機能的変異体
である。好ましい実施形態では、GDF15タンパク質は、成熟GDF15タンパク質又
はその機能的変異体である。
様切断部位での細胞内切断後に完全長タンパク質から放出されるGDF15のプレプロタ
ンパク質の部分を指す。成熟GDF15タンパク質は、ジスルフィド結合により連結され
たホモ二量体として分泌される。本発明の一実施形態では、成熟GDF15タンパク質(
GDF15(197~308)(配列番号6)と略記される)は、完全長ヒトGDF15
タンパク質のアミノ酸197~308を含む。
当の配列同一性を有し、親タンパク質の生物学的活性の少なくとも1つを保持している親
タンパク質の変異体を指す。親タンパク質の機能的変異体は、本開示を考慮することで当
該技術分野では周知の手段により調製することができる。機能的変異体は、親タンパク質
のアミノ酸配列に対する1つ以上の改変を含むことができる。かかる改変は、例えば、ポ
リペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を変化させ、最適pHを変化させることな
どによってポリペプチドの物理化学特性を変化させることができる。かかる改変は、親タ
ンパク質の生物学的活性のすべてを喪失又は消失させないものであれば、親タンパク質の
生物学的活性を変化させることもできる。
的活性に大きく影響しない親タンパク質に対する置換、好ましくは保存的アミノ酸置換を
含む。保存的置換としては、これらに限定されるものではないが、塩基性アミノ酸(アル
ギニン、リシン及びヒスチジン)、酸性アミノ酸(グルタミン酸及びアスパラギン酸)、
極性アミノ酸(グルタミン及びアスパラギン)、疎水性アミノ酸(ロイシン、イソロイシ
ン及びバリン)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン)、
及び小さいアミノ酸(グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン)の群内
でのアミノ酸置換が挙げられる。非標準又は非天然アミノ酸(例えば、4-ヒドロキシプ
ロリン、6-N-メチルリシン、2-アミノイソ酪酸、イソバリン、α-メチルセリン)
を使用して親タンパク質中の標準アミノ酸残基を置換することもできる。
る1つ以上のアミノ酸の欠失及び/又は挿入を含む。例えば、成熟GDF15タンパク質
の機能的変異体は、成熟GDF15タンパク質に対する1、2、3、4、5、6、7、8
、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、2
2、23、24、25、26、27、28、29、30個、又はそれ以上のアミノ酸の欠
失及び/又は挿入、好ましくは、成熟GDF15タンパク質のN末端の1~30個のアミ
ノ酸の欠失を含むことができる。
に対する置換、好ましくは保存的アミノ酸置換、並びに欠失及び/又は挿入、好ましくは
アミノ酸の小さな欠失及び/又は挿入を含む。
列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有するGDF15タンパク質、例えばGDF
15(197~308)(配列番号6);又はN末端が短縮された成熟GDF15のアミ
ノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列、例えば、GDF15(200~308
)(配列番号7)、GDF15(201~308)(配列番号8)、GDF15(202
~308)(配列番号9)、GDF15(203~308)(配列番号10)、又はGD
F15(211~308)(配列番号11)を含む。GDF15タンパク質は、食物摂取
、血糖値、インスリン抵抗性、及び体重などに対するその効果など、GDF15タンパク
質の生物学的活性の少なくとも1つを維持する限り、配列番号6、7、8、9、10又は
11に対する置換、挿入、及び欠失の少なくとも1つを有することができる。
は11のアミノ酸配列を含むがこれらに限定されない、配列番号11のアミノ酸配列を含
むGDF15タンパク質を含む。
することができる。本明細書で使用するところの「半減期延長タンパク質」なる用語は、
半減期延長タンパク質が融合されたタンパク質の半減期を延長することが知られている任
意のタンパク質又はそのフラグメントであってよい。かかる半減期延長タンパク質の例と
しては、これらに限定されるものではないが、ヒト血清アルブミン(HSA)、イムノグ
ロブリン(Ig)の定常フラグメントドメイン(Fc)、又はトランスフェリン(Tf)
が挙げられる。本発明の実施形態では、半減期延長タンパク質は、HSA又はその機能的
変異体を含む。本発明の特定の実施形態では、半減期延長タンパク質は、配列番号1と少
なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。本発明の好ましい実施形態では、半減期
延長タンパク質は、HSAの34位のシステイン残基がセリン又はアラニンに置換された
HSA又はその機能的変異体を含む。
されるアミノ酸配列を有する半減期延長タンパク質を含む。
できる。本明細書で使用するところの「リンカー」なる用語は、ペプチドリンカーを含む
連結部分を指す。リンカーは、適正なフォールディングを確実とし、立体障害を最小化し
、融合タンパク質内のそれぞれの機能的要素の構造に大きく干渉しないことが好ましい。
本発明の特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、2~120個のアミノ酸を含む。例
えば、ペプチドリンカーは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13
、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、4
0、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53
、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、
67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、8
0、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93
、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、1
05、106、107、108、109、110、111、112、113、114、1
15、116、117、118、119、又は120個のアミノ酸を含む。
明の特定の実施形態では、リンカーは、GS-(GGGGS)n又はAS-(GGGGS
)n-GTを含むがこれらに限定されない、配列(GGGGS)n(ただし、nは2~2
0、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15で
ある)を含む柔軟性リンカーとすることができる。
形態では、リンカーは、AS-(AP)n-GT又はAS-(EAAAK)n-GTを含
むがこれらに限定されない、配列(AP)n又は(EAAAK)n(ただし、nは2~2
0、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15で
ある)を含む構造化リンカーとすることができる。本発明の他の実施形態では、リンカー
は、配列(GGGGA)n、(PGGGS)n、(AGGGS)n又はGGS-(EGK
SSGSGSESKST)n-GGS(nは2~20である)を含む。
0、48、55~56、59~60又は64~75と少なくとも90%の配列同一性を有
するアミノ酸配列を含む。本発明の特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号5
、25~30、36~37、40、48、55~56、59~60及び64~75からな
る群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明のより特定の実施形態では、融合タンパ
ク質は、配列番号5、25~30、40、55~56、55~56、59~60、及び7
0からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明の更なるより特定の実施形態で
は、融合タンパク質は、配列番号92、配列番号60、又は配列番号26のアミノ酸配列
を含む。融合タンパク質は、タンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端に、ポリヒス
チジンタグ、抗原性エピトープ、又は結合ドメインなどの、精製を容易にするタグなどの
小さい延長部分を有してもよい。
取量に対する効果、経口耐糖能試験、血糖値の測定、インスリン抵抗性の分析、体重変化
、薬物動態分析、毒物動態分析、完全長の融合タンパク質のレベル及び安定性のイムノア
ッセイ及び質量分析、並びにヒト血漿中でのエクスビボ安定性分析を含むGDF15の生
物学的活性について特性評価又は評価を行うことができる。
施形態では、単離核酸分子は、配列番号5、25~30、36~37、40、48、55
~56、59~60又は64~75と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配
列を含む融合タンパク質をコードする。特定の実施形態では、単離核酸分子は、配列番号
5、25~31、36~37、40、48、55~56、59~60及び64~75から
なる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。より特定の実施
形態では、単離核酸分子は、配列番号5、25~30、40、55~56、59~60、
及び70からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。更
により特定の実施形態では、単離核酸分子は、配列番号76~91ヌクレオチド配列を含
む。
ー内に存在させることができる。発現ベクターとしては、これらに限定されるものではな
いが、組換えタンパク質を発現させるためのベクター、及びウイルスベクターなどの、対
象の体内に核酸を送達させて対象の組織で発現させるためのベクターなどが挙げられる。
本発明との使用に適したウイルスベクターの例としては、これらに限定されるものではな
いが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター
などが挙げられる。ベクターは、非ウイルスベクターであってもよい。非ウイルスベクタ
ーの例としては、これらに限定されるものではないが、プラスミド、細菌人工染色体、酵
母人工染色体、バクテリオファージなどが挙げられる。ベクターは、例えば、プロモータ
ー、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、又は複
製起点などの発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメントを含むことが
できる。
来腎細胞(HEK)又はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの所望の宿主細
胞からの組換えによる発現を向上させるため、本開示を考慮して当該技術分野では周知の
技術を用いてコドン最適化することができる。
宿主細胞としては、これらに限定されるものではないが、組換えタンパク質を発現させる
ための宿主細胞、及び対象の体内に核酸を送達させて対象の組織で発現させるための宿主
細胞などが挙げられる。本発明との使用に適した宿主細胞の例としては、これらに限定さ
れるものではないが、HEK又はCHO細胞が挙げられる。
的な態様では、かかる方法は、(1)融合タンパク質が生成する条件下で、融合タンパク
質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養することと、(2)宿主細胞により産生さ
れた融合タンパク質を回収することと、を含む。融合タンパク質は、更に当該技術分野で
は周知の方法を用いて精製することができる。
れるものではないが、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、限外
濾過、及び透析を含む1以上の標準的な精製方法の組み合わせを用いて宿主細胞から精製
される。好ましくは、融合タンパク質は、プロテアーゼを含まないように精製される。
提供する。
とを含む組成物を更に提供する。本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む組
成物は、融合タンパク質を発現させるために核酸分子を細胞内に導入するための送達媒介
物を含むことができる。核酸送達媒介物の例としては、リポソーム、天然ポリマー及び合
成ポリマーを含む生体適合性ポリマー、リポ蛋白質、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類
、人工ウイルスエンベロープ、金属粒子、及び細菌、バキュロウイルス、アデノウイルス
及びレトロウイルスウイルスなどのウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミ
ド、真菌ベクター、並びに各種の真核宿主での発現について記載されている当該技術分野
で通常用いられている他の組換え用媒介物が挙げられる。
又は当業者には周知の他の材料を含むことができる。薬学的に許容される担体の例として
は、これらに限定されるものではないが、水、生理食塩水、緩衝剤、糖類などの等張化剤
、多価アルコール、湿潤剤又は乳化剤などの補助物質、防腐剤、及びこれらの組み合わせ
の1以上のものが挙げられる。かかる材料は無毒性でなければならず、かつ使用される用
量及び濃度で有効成分の効果を妨げてはならない。担体又は他の材料の厳密な性質は、投
与経路、例えば、筋肉内、皮下、経口、静脈内、皮膚、粘膜内(例えば、腸内)、鼻腔内
又は腹腔内経路などに応じて決まり得る。例えば、液体医薬組成物は一般に、水、石油、
動物又は植物油、鉱油又は合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロース若
しくは他の糖液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレン
グリコールなどのグリコール類が含まれてもよい。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形
態として、又は溶液として保管することができ、一般に皮下注射針を穿刺可能なストッパ
ーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルのような、無菌アクセスポートを有する容器に
入れられる。
むことができる。
燥融合タンパク質を有する第1の容器と、対象への投与に先立って乾燥融合タンパク質と
混合される水溶液を有する第2の容器とを含むか、又は本発明の液体医薬組成物が入った
単一の容器を含むことができる。かかるキットは、本発明の医薬組成物の単一用量投与単
位又は複数用量投与単位を含むことができる。かかるキットは、1以上の予め充填された
注射器(例えば、液体注射器及びリオシリンジ(lyosyringe))を含んでもよい。キット
はその使用説明書を含んでもよい。かかる使用説明書は、キット内で与えられる材料の使
用及び性質について記載したものでよく、治療される正確な代謝性疾患に適合したものと
することができる。
病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチなどの代謝性疾患、障
害又は状態を治療又は予防するための本明細書に記載される医薬組成物の使用にも関する
。本発明の実施形態によれば、治療を要する対象の代謝性疾患、障害、又は状態を治療又
は防止する方法は、対象に治療上又は予防上の有効量の本発明の医薬組成物を投与するこ
とを含む。本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物又は融合タンパク質をコードする核
酸を含む医薬組成物を含む、本明細書に記載される医薬組成物のいずれのものも、本発明
の方法で使用することができる。
される、又は治療された任意の動物、詳細には哺乳動物、最も詳細にはヒトを意味する。
本明細書で使用するところの「哺乳動物」なる用語は、あらゆる哺乳動物を包含する。哺
乳動物の例としては、これらに限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、
ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル又は類人猿などの非ヒト霊長類
(NHP)、より詳細にはヒトが挙げられる。
の方法にしたがって治療することができる代謝性疾患、障害又は状態の例としては、これ
らに限定されるものではないが、2型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満
、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチが
挙げられる。
、対象に組成物を投与して対象で所望の治療的又は臨床的転帰を得ることを指す。一実施
形態では、「治療する」、「治療される」、及び「治療」なる用語は、本発明の医薬組成
物を投与することにより、2型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質
異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチなどの代
謝性疾患の進行又は進展を低減、緩和又は遅延させることを指す。
る治療活性化合物の量を意味する。本発明の実施形態によれば、「治療有効量」は、臨床
上の結果を含む、有用な、又は所望の結果を生じるのに充分な量である。治療有効量は、
1回又はそれよりも多い投与で投与することができる。疾患状態に関連して、有効量とは
、疾患の進展を改善、安定化、又は遅延させるうえで充分な量である。本発明の特定の実
施形態によれば、治療有効量とは、2型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥
満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチ
などの代謝性疾患、障害、又は状態を治療又は予防するために必要とされる融合タンパク
質の量である。
膚、粘膜内(例えば、腸内)、鼻腔内又は腹腔内の投与経路などの、本開示を考慮するこ
とで当業者には周知の任意の方法によって対象に投与することができる。特定の実施形態
では、本発明の医薬組成物は、静脈内注射又は皮下注射によって対象に投与される。
のパラメータは、いずれの特定の形でも限定されない。かかるパラメータの最適値は、治
療する対象、治療される特定の代謝性疾患、疾患の重症度、投与経路などの様々な要因に
よって決まり得るものであり、当業者であれば、所望の治療的又は臨床的転帰が得られる
ようにかかるパラメータの最適値を決定することができる。例えば、医薬組成物は、1日
1回、又は1日複数回、例えば2回、3回、4回といった具合で投与することができる。
一般的な用量は、上記に述べたもののような因子に応じて、約0.1μg/kg~約10
0mg/kg以下、又はそれ以上の融合タンパク質の範囲とすることができる。
実施形態1は、(a)半減期延長タンパク質、(b)リンカー、及び(c)GDF15
タンパク質を含み、N末端からC末端に(a)-(b)-(c)の順序で配列された融合
タンパク質に関する。
異体である、実施形態1に記載の融合タンパク質である。
アミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態1に記
載の融合タンパク質である。
態1に記載の融合タンパク質である。
アミノ酸配列を含む、実施形態4に記載の融合タンパク質である。
的変異体を含む、実施形態1~5のいずれかに記載の融合タンパク質である。
するアミノ酸配列を含む、実施形態6に記載の融合タンパク質である。
ミノ酸配列を含む、実施形態7に記載の融合タンパク質である。
融合タンパク質である。
、例えばGS-(GGGGS)x8又はAS-(GGGGS)x8-GTを含む、実施形
態9に記載の融合タンパク質である。
の融合タンパク質である。
~20である)、例えばAS-(AP)n-GT又はAS-(EAAAK)n-GTを含
む、実施形態11に記載の融合タンパク質である。
64~75と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質
である。
び64~75からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態13に記載の融合
タンパク質である。
ら選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態14に記載の融合タンパク質である。
る単離核酸分子である。
。
する核酸分子を含む宿主細胞を培養することと、(2)宿主細胞により産生された融合タ
ンパク質を回収することと、を含む、実施形態1~15のいずれか1つに記載の融合タン
パク質を作製する方法である。
ことを含む、実施形態20に記載の方法である。
質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
る治療有効量の核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
要する対象に、有効量の実施形態22及び23のいずれかに記載の医薬組成物を投与する
ことを含む、方法である。
満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチ
からなる群から選択される、実施形態25に記載の方法である。
6に記載の方法である。
値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性
関節リウマチからなる群から選択される代謝性疾患を治療する方法であって、対象に、配
列番号5、25~30、40、55~60、及び70からなる群から選択されるアミノ酸
配列を含む融合タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む、治療有効量の医薬組成物
を皮下又は静脈内投与することを含む、方法である。
値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性
関節リウマチからなる群から選択される代謝性疾患を治療する方法であって、対象に、配
列番号60のアミノ酸配列を含む融合タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む、治
療有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法である。
のいずれか1つに記載の方法である。
、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、又は慢性関節リウマチからなる群から
選択される代謝性疾患の治療又は予防に使用するための実施形態1~15のいずれか1つ
に記載の融合タンパク質である。
例は本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は付属の請求項によって定められる点
を理解されたい。
他のTFGβファミリーのメンバーと同様、GDF15は、小胞体内で二量体を形成し
、フーリン様に切断されて分泌型の成熟GDF15(アミノ酸197~308)を生じる
プレプロタンパク質として合成される。分泌型の成熟GDF15ホモ二量体は約25kD
aであり、各単量体は最大で4つの分子内ジスルフィド結合を形成することができ、1つ
の分子間ジスルフィド結合によってホモ二量体の構成要素同士が連結されている。
構造は、成熟GDF15のC末端が二量体の界面に埋め込まれているのに対して、N末端
は露出していることを示している。この露出した末端は、GDF15のN末端に対する半
減期延長タンパク質などの融合タンパク質の連結を可能とする。
ーンも示している。TFGβ1がC1~C3及びC2~C7のペアリング(すなわち、そ
の1番目と3番目のシステイン残基間のペアリングと、その2番目と7番目のシステイン
残基間のペアリング)を有しているのに対して、GDF15はC1~C2及びC3~C7
のペアリングを有している(図1A及び図1Bを参照)。この固有のジスルフィドペアリ
ングは、タンパク質のN末端に、他のジスルフィド結合を含むシステインノットから離れ
て位置するC1~C2ペアリングによって形成されたループを生じる。この構造により、
GDF15のN末端が二量体の形成又は全体のタンパク質のフォールディングにとって重
要ではない可能性があり、GDF15及びそのN末端融合タンパク質は、C1及びC2、
C1~C2ループ内の残基、又は更にはC2のC末端側の残基を欠失させるN末端欠失に
よっても影響を受けない可能性が予測される。
HSA分子とGDF15分子との間の異なるリンカーについて評価した。配列(GGG
GS)nを含む可撓性リンカーと、配列(AP)n又は(EAAAK)nを含む構造化リ
ンカー(ただし、nは2~20である)の両方を評価した。
取の効果に対するそれらの影響、それらのマウスでの薬物動態(PK)値、及びヒト血液
中でのそれらのエクスビボ安定性について比較した。試験したリンカー変異体の結果を表
1に示す。(EAAAK)8リンカーを含む、配列番号31を含む分子は、HPLCによ
り凝集を示した。表1の残りの7種類のリンカー変異体は、凝集を示さなかった。
漿試料中でのエクスビボ安定性実験により、リンカーの安定性を評価した。2つの検出の
形態を用いてこれらの実験からの結果を分析した。抗GDF15捕捉抗体と抗HSA検出
抗体のペアを用いたイムノアッセイを用いて、リンカーの両側の両分子の存在を測定する
ことにより、リンカーがどの程度、完全であるかを評価した。分子全体の完全性の大まか
な状態を、HSA及びGDF15からの異なる代理ペプチド配列を用いて液体クロマトグ
ラフィー/質量分析(LC-MS)により分析した。イムノアッセイは、すべてのリンカ
ー変異体について安定したPKプロファイルを示し、いずれのリンカー変異体についても
血漿中の試料濃度のスパイクの消失は48時間にわたって認められなかった。LC-MS
の結果はイムノアッセイと一致し、HSA及びGDF15分子の異なる部分からの代理ペ
プチドが完全であることを示した。代理ペプチドを用いてLC-MSにより分析したリン
カー変異体のPKプロファイルは、異なるリンカー変異体で同様の傾向を示し、いずれの
リンカー変異体も7日目において検出可能なレベルを示した。表1のすべての変異体は、
配列番号31を除き、所望の生物物理特性及びPK値を示した。
性について評価した。表2は、食物摂取量の減少における融合タンパク質の効果に対する
リンカー変異体の影響を示す。効果に対するリンカーの明らかな影響が認められた。柔軟
な(GGGGS)nリンカーでは、リンカーの長さを2個~4個~8個に増やすことで融
合タンパク質の効果が大幅に増大した。より固い(AP)nリンカーでは、この傾向はそ
れほど顕著ではなく、融合タンパク質内のGDF15分子の自由度がその効果に重要な役
割を果たしていることを示唆している。
半減期延長タンパク質としてのヒト血清アルブミンを、GDF15のN末端にリンカー
によって融合させた組換えタンパク質を設計した。この設計によれば、GDF15の二量
体化のための界面が不安定化しないため、天然の分子間鎖ジスルフィド結合が形成され、
融合されたHSAタンパク質がそれぞれのGDF15アームから伸びたGDF15ホモ二
量体が得られる。このアプローチによれば、HSA-GDF15ホモ二量体を作製するう
えで1個の遺伝子しか必要としない。
のシステイン(Cys、C)残基を含んでおり、Cys-34残基が分子中で唯一の遊離
システインである。この遊離Cys-34は、複数の活性酸素種(ROS)及び活性窒素
種(RNS)を捕捉することにより、フリーラジカルスカベンジャーとして機能すること
が示されている。そこでこの遊離Cysを変異させて酸化による不均一性が生じるリスク
を最小とした。
C34S)又はHSA(C34A)変異を有するGDF15融合分子を分析した。これら
の分子はいずれも、(i)イオン交換クロマトグラフィー、(ii)疎水性相互作用クロ
マトグラフィー、及び(iii)サイズ排除クロマトグラフィー、の3段階の精製方法を
用いて精製した。これらの分子が最初に作製された時点では、HPLC分析はどちらの分
子も純粋であり、凝集がないことを示した(表3)。
番号48を含む)は、HPLCにより凝集を示したのに対して、HSA(C34A)変異
を有するタンパク質(配列番号40)は、4週後でも凝集がないままであった。
本発明者らはGDF15のアミノ酸位置198のアルギニン残基(R198)がHSA
-GDF15融合分子内でプロテアーゼ分解を受けやすいことを観察した。このような分
解によって不均一な集団が生じ、治療組成物としては望ましくない。このような切断は、
プロテアーゼ阻害剤カクテルによって防止することができる。各精製方法をプロテアーゼ
の除去について調べた。表4に、HPLCにより測定される、HSA-GDF15融合タ
ンパク質の精製について試験した2種類のHSAアフィニティーカラムを示す。精製の時
点で、いずれの方法によって精製されたHSA-GDF15融合タンパク質も純度100
%であり、完全であった。低濃度(2~5mg/ml)では、いずれの方法により精製さ
れたタンパク質も4週間の試験期間全体にわたって完全に保たれた。しかしながら、高濃
度(40~50mg/ml)では、抗体に基づいたHSA樹脂(CaptureSele
ct社)のみがプロテアーゼを含まないタンパク質を生じ、これは4週間の試験期間全体
にわたって完全に保たれた。HSA-リガンドに基づいた樹脂(Albupure社)に
より得られたタンパク質は、初期には完全であったが、高濃度で保存した場合、時間とと
もに分解した。プロテアーゼ阻害剤カクテル(PI)及びEDTAの添加により、Alb
upure社の樹脂を用いて精製された高濃度のHSA-GDF15融合タンパク質の分
解は完全に停止した。したがって、精製法は、安定した治療組成物を生成するうえで重要
な役割を担っている。これに相当する分解は、インビボでもエクスビボでも観察されず、
治療組成物がいったんプロテアーゼを含まないものとして調製されると、融合タンパク質
の分解はインビボでは問題とならないことを示している。したがって、CaptureS
elect社の樹脂を用いた方法のように、製造時に潜在的なプロテアーゼを効果的に除
去することができる精製法は、均質で完全かつ安定したGDF15治療薬を効果的に製造
するうえで不可欠である。
図1A及び図1Bに示されるGDF15結晶構造によれば、欠失変異体に関与するGD
F15のN末端は、二量体形成及び全体のタンパク質フォールディングにとって重要では
ないことが予測される。この結晶構造によれば、このようなN末端欠失はいずれの潜在的
な受容体相互作用にも影響しないことも予測される。GDF15のN末端の様々な欠失を
含むHSA-GDF15融合タンパク質をインビボ活性について試験した。
異体を設計した。R198残基の直後には残基N199~G200の潜在的脱アミノ化部
位があるが、基質の脱アミノ化は治療組成物ではやはり好ましくない。GDF15のN末
端欠失は、タンパク分解切断部位及び脱アミノ化部位の両方を除去することができる。H
SAとともに融合タンパク質に組み込んだ、得られたGDF15欠失変異体には、GDF
15(201~308、配列番号8)、GDF15(202~308、配列番号9)、及
びGDF15(211~308、配列番号11)が含まれた。マウスでのインビボ実験に
より、GDF15のN末端欠失変異体は食物摂取量を低減させるうえで依然活性を有して
いることが示された(図17)。実験の結果より、これらのGDF15のN末端欠失変異
体は、適正に発現され、適切な二量体を形成し、インビボデアクティブであることが確認
された。
表5は、GDF15のインビボ活性を消失させ、GDF15の機能的エピトープを同定
するために作製したGDF15の12種類の突然変異体を示している。これらの突然変異
体には、5種類の1重突然変異体、2種類の2重突然変異体、及び5種類の3重突然変異
体が含まれる。これらの突然変異を含むHSA-GDF15融合タンパク質をそれらの生
物物理特性及び活性について特性評価を行った(表5)。12種類の突然変異体のうち、
1つは発現がみられず、4つは時間とともに凝集体を形成し、これらの変異がタンパク質
フォールディング及び生物物理特性を妨げることを示した。残りの7種類の突然変異体の
うち、4つはGDF15の1重突然変異を有するものであり、これらの変異体を、マウス
で野生型と比較した食物摂取量の低下について試験した。3つの1重突然変異体(I89
R、I89W及びW32A)はインビボ活性を失ったが、残りの変異体(Q60W)は野
生型と同様の活性を示した。これらの結果は、I89R、I89W及びW32A変異が、
GDF15の受容体/共受容体との相互作用を妨げることを示し、GDF15の機能性エ
ピトープが残基I89及びW32の周辺にあることを示唆するものであった。突然変異の
番号付けは、融合タンパク質中に存在する成熟GDF15に基づいている。例えば、「1
」は成熟GDF15(配列番号6)の1番目のアミノ酸を指し、「89」は成熟GDF1
5タンパク質の89番目のアミノ酸を指す。
発現
20mlよりも多く発現させるため、Expi293(商標)発現培地中で増殖させた
HEK Expi293(商標)細胞を用いて発現を行った。細胞を8%CO2下で12
5RPMで振盪しながら37℃で増殖させた。Expi293(商標)発現キットを使用
して細胞を1ml当たり2.5×106個でトランスフェクトした。トランスフェクトし
た細胞1Lにつき、1mgの全DNAを25mlのOpti-MEMに希釈し、2.6m
lのExpi293(商標)試薬を25mlのOpti-MEMに希釈し、室温で5分間
インキュベートした。希釈したDNAと希釈したExpi293試薬を加え合わせ、室温
で20分間インキュベートした。次に、このDNA複合体を細胞に加えた。細胞を振盪イ
ンキュベーターに一晩入れた。トランスフェクションの翌日、5mlのキットのEnha
ncer1を50mlのキットのEnhancer2に希釈し、2つのEnhancer
の全量を細胞に加えた。トランスフェクトした細胞をインキュベーター内に再び4日間戻
してから収穫した。細胞を6000gで30分間遠心分離して濃縮した後、精製工程に先
立って0.2μmのフィルターで濾過した。
クションに先立ち、HSA-GDF15のコーディング領域を含むプラスミドDNA20
0μgの1つのアリコートをAcl Iによる制限酵素消化によって直鎖化した。この制
限エンドヌクレアーゼによる消化によって、アンピシリン耐性遺伝子を確実に除去する。
2つの15μgの直鎖化DNAアリコートを、BTX ECM 830Electro
Cellマニピュレータ(Harvard Apparatus社、マサチューセッツ州
ホリストン)を使用して2つの1×107細胞(トランスフェクションプールA及びBと
した)にトランスフェクトした。細胞を、電極ギャップ4mmのキュベット中、15ミリ
秒のパルス長及び5秒のパルス間隔で250Vで3回電気穿孔した。トランスフェクトし
た細胞を振盪フラスク内のMACH-1+L-グルタミンに移し、1日間インキュベート
した。トランスフェクションプールA及びトランスフェクションプールBを遠心し、MA
CH-1+MSX中に再懸濁し、振盪フラスコに移して6日間インキュベートした。トラ
ンスフェクションプールA及びトランスフェクションプールBからのトランスフェクトし
たHSA融合タンパク質産生細胞をプールし、電気穿孔から8日目にメチルセルロースに
播種した。
CaptureSelect樹脂及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いた2段階精
製を用いた。一過性にトランスフェクトしたExpi293(商標)細胞からの細胞上清
を、樹脂1ml当たりタンパク質10mgの適当な容量で、予め平衡化した(PBS、p
H7.2)HSA CaptureSelectカラム(ThermoFisher S
cientific社より販売されるCaptureSelectヒトアルブミンアフィ
ニティーマトリクス)にロードした。ローディング後、未結合タンパク質をカラム容量(
CV)の10倍量のPBS(pH7.2)でカラムを洗浄することによって除去した。カ
ラムに結合したHSA-GDF15を10CVの20mM Tris(pH7.0)中の
2M MgCl2で溶出した。ピーク画分をプールし、濾過(0.2μ)し、4℃のPB
S(pH7.2)に対して透析した。透析後、タンパク質を再び濾過し(0.2μ)、適
当な体積にまで濃縮した後、26/60Superdex 200カラム(GE Hea
lthcare社)にロードした。高い純度でサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
から溶出したタンパク質画分(SDS-PAGEにより測定したもの)をプールした。タ
ンパク質の濃度は、BioTek Synergy HTTM分光光度計で280nmの
吸光度で測定した。精製したタンパク質の質を、SDS-PAGE、及び分析用サイズ排
除HPLC(SE-HPLC、Dionex HPLC system社)によって評価
した。内毒素レベルをLALアッセイ(Pyrotell(登録商標)-T、Assoc
iates of Cape Cod社)を用いて測定した。
合タンパク質を、HSAに選択的に結合するように固定化した合成トリアジンリガンドを
用いたAlbuPure樹脂(ProMetic BioSciences社)を用いて
室温で精製した。発現用上清をAlbuPure樹脂に流した。次いで、樹脂を最初に4
CVのPBS(pH7.2)で、次に4CVの50mM Tris(pH8.0)、15
0mM NaClバッファで洗浄した。カラムに結合したHSA-GDF15を100m
Mのオクタン酸Naを含む4CVのPBSバッファ(pH7.2)で溶出した。タンパク
質を含む画分を、カットオフ値が分子量30,000kDaのスピンコンセントレータ(
Amicon社)を使用して10mLの体積にまで濃縮してから、PBSバッファ(pH
7.2)で平衡化した26/60Superdex S200pgカラム(GE)に流し
た。HSA-GDF15二量体を含むSEC画分をSDS-PAGEにより同定し、分析
用にプールした。SDS-PAGE及びSE-HPLCによりタンパク質の純度を評価し
た。
な融合タンパク質の特性評価を行っている。この融合タンパク質は、グリシン及びセリン
残基からなるアミノ酸42個のリンカーGS-(GGGGS)8を介した、HSAの成熟
ヒトGDF15との融合体のホモ二量体として存在する完全な組換えタンパク質である。
この融合タンパク質の予測される分子量は、162,696Daであり、HSAの34位
の1個の天然遊離システインがセリンに変異している。この特定のHSA-GDF15融
合タンパク質を、簡潔にするために、以下の実施例では単に「FP1」と呼ぶものとする
。AS-(GGGGS)x8-GTリンカーを含むFP1の6xHisタグ付加変異体(
6xHis-FP1、配列番号26)を、以下の実施例の一部で比較のために使用した。
この実験の目的は、C57B1/6マウスの食物摂取の阻害に対するFP1の用量応答
性の効果を実証することであった。
その後、マウスを食物摂取量に基づいて1群8匹ずつの6群に事前の24時間にグループ
分けした。午後4:00~5:00の間に、動物の体重を測定し、溶媒又はFP1を含む
組成物を皮下注射により投与した。各ケージについて、食物摂取量の変化をBioDAQ
システムにより、注射後48時間にわたって継続的に記録した。この実験では、6xHi
s-FP1を比較に用いた。
果は、C57Bl/6マウスへのFP1の皮下投与が、試験したすべての用量及び時点に
おいて食物摂取を溶媒処理した動物に対して有意に阻害したことを示した。6xHis-
FP1は、8nmol/kgの用量で食物摂取を低減させた。
*PBSに対してp≦0.05;**PBSに対してp≦0.01;***PBSに対
してp≦0.001;****PBSに対してp≦0.0001
一元配置分散分析:テューキーの多重比較検定;n=8/群
1の効果
この実験の目的は、スプラーグ・ドーリーラットの食物摂取の阻害に対するFP1の用
量応答性の効果を実証することであった。
せた。その後、ラットを食物摂取量に基づいて1群8匹ずつの6群に事前の24時間にグ
ループ分けした。午後4:00~5:00の間に、動物の体重を測定し、溶媒又は融合タ
ンパク質を含む組成物を皮下注射により投与した。各ケージについて、食物摂取量の変化
をBioDAQシステムにより、注射後48時間にわたって継続的に記録した。この実験
では、6xHis-FP1を比較に用いた。
ol/kg及び10nmol/kgの用量で食物摂取を阻害した。阻害率は、投与24及
び48時間後で、試験した最高用量(10nmol/kg)でのみ有意差に達した。FP
1は、用量8nmol/kgで食物摂取を低下させ、その効果は24及び48時間で有意
であった。
体重に対するFP1の効果
この実験の目的は、DIOC57Bl/6マウスに処理を行った2週間全体を通じて食
物摂取量、体重、及びグルコースホメオスタシスに対するFP1の効果を評価することで
あった。
(q3d)に2mL/kgを皮下投与した。溶媒処理群及びロシグリタゾン処理群に同様
のレジメンでPBSを投与した。コントロールのロシグリタゾンは、0.015%で食餌
中で自由に与えた。マウス及び食餌重量を毎日記録した。血糖値測定器(One Tou
ch(登録商標)Ultra(登録商標)、Lifescan、カリフォルニア州ミルピ
タス)を用いて血糖値を測定した。体脂肪量及び除脂肪量を、Bruker Mini-
Spec LF110を使用し、時間領域NMR(TD-NMR)により覚醒状態のマウ
スで定量した。経口グルコース負荷試験(OGTT)において、マウスを4時間絶食させ
た。2g/kgのグルコースを10mL/kgで強制経口投与した0、30、60、90
、及び120分後に尾を切って血糖値を測定した。グルコース投与の0、30、及び90
分後にインスリンを測定した。
を濡れた氷の入った96穴プレートに入れた後、-80℃で保存した。肝臓を摘出し、肝
臓切片の合計質量に対する脂肪含量を、製造者の指示にしたがってBruker Min
iSpec mq60でTD-NMRを用いて評価した。
g/dL)とインスリン値(mU/L)との積を405の因数で割ることによって計算し
た。
することにより、体重(表8)及び食物摂取量(表9)が低下した。低下量は、下記に述
べる特定の時点でのみ統計的に有意な値に達した。
)の用量で体重を減少させた(表8及び図4)。食物摂取量の有意な低下は、1nmol
/kgの用量で実験の1及び2日目に、10nmol/kgの用量で1、8、及び9日目
に認められた(表9)。
時点0以降のすべての時点において溶媒処理動物と比較して血糖値を有意に低下させた(
表10)。これを、曲線下全面積(AUC)及びΔAUCとして更に定量したところ、試
験した3つの用量すべてで溶媒と比較して有意に低かった(表10及び図5A及び図5B
)。
図6)。FP1は、実験の13日目に1nmol/kg及び10nmol/kgの用量で
血糖値を統計的に有意に低下させた。
gの用量で対応する溶媒群よりも有意に高く、同じ時点で1及び10nmol/kgの用
量で低かった(表12)。全AUCにより測定されるOGTTの間のインスリン変動は、
0.1nmol/kgのFP1の用量では溶媒群よりも高く(表12)、1及び10nm
ol/kgの用量ではより低かった。いずれの場合も、最低用量においてのみ統計的有意
差に達した。90分の時点で1及び10nmol/kgのFP1で処理したマウスはより
低いインスリン値を示したが、この効果は統計的有意差を示さなかった。インスリン感受
性の指標として用いたHOMA-IRは、実験の14日目に測定した。この時点で、FP
1は、10nmol/kgでHOMA-IRを低下させ、インスリン感受性を改善した(
表13及び図7)。
脂肪率(%)の測定可能な変化を生じなかった(表14)。10nmol/kgの用量で
は、絶対除脂肪量に有意な減少が認められた。この減少は、除脂肪率(%)として表した
場合には認められなかった。実験の15日目に最終的な剖検を行って肝重量を測定した(
表15)。FP1は、10nmol/kgの用量で絶対肝重量及び体重の割合(%)とし
ての肝重量を減少させた。1nmol/kgの用量で減少が認められたが、これはどちら
のパラメータでも統計的に有意な値には達しなかった。肝脂肪を生検でNMRにより測定
した(表16)。FP1融合タンパク質は、1及び10nmol/kgの用量で、肝生検
重量の割合(%)として表される肝脂肪含有率を減少させた。この低下はより高い用量で
有意であった。
この実験の目的は、肥満で高血糖症のレプチン欠損ob/obマウスにおける8日間の
処理にわたって体重及び血糖値に対するFP1の効果を評価することにあった。
d)に2mL/kgを皮下投与した。マウス及び食餌重量を毎日記録した。血糖値測定器
を使用して血糖値を毎日測定した。実験の終了時にマウスを安楽死させ、最終血液試料を
採取した。
して、2日目~8日目までに有意に体重を減少させた(開始体重の割合(%)として表さ
れる)。FP1は、10nmol/kgの用量で、ob/obマウスにおいて溶媒処理マ
ウスに対して1日目~8日目までに体重を減少させた(開始体重の割合(%)として表さ
れる)(表17及び図8)。
2日目、並びに4日目~8日目までに溶媒処理マウスに対して摂食血糖値を減少させた。
1nmol/kgで血糖値の低下が認められたが、この効果は統計的に有意な値に達しな
かった(表18及び図9)。
マウスにおける薬物動態
FP1を、雌性C57Bl/6マウスに、PBS(pH7)中、2mg/kgの用量で
静脈内及び皮下投与した。両方の投与経路後に、血液試料を採取し、血清を処理して、薬
剤濃度を7日間にわたって測定した。FP1の濃度をイムノアッセイ法により測定した。
血清中の薬剤濃度/時間プロファイルを表19及び20にまとめて示し、図10に示す。
れ、1.67及び1.57日のFP1の最終半減期が示された(表21)。FP1は、皮
下投与後に約71%の平均バイオアベイラビリティーを示した。
FP1を、雌性スプラーグ・ドーリーラットに、PBS(pH7)中、2mg/kgの
用量で静脈内及び皮下投与した。両方の投与経路後に、血液試料を採取し、血清を処理し
て、薬剤濃度を7日間にわたって測定した。FP1の濃度をイムノアッセイ法により測定
した。血清中の薬剤濃度/時間プロファイルを表22及び23にまとめて示し、図11に
示す。
それぞれ、1.34及び1.51日のFP1の最終半減期が示された(表24)。FP1
は、皮下投与後に約23%の平均バイオアベイラビリティーを示した。
FP1を、ナイーブな雄性カニクイザル(Macaca fascicularis)
に、PBS(pH7)中、1mg/kgの用量で静脈内及び皮下投与した。両方の投与経
路後に、血液試料を採取し、血清を処理し、イムノアッセイバイオアナリシスを用いて、
薬剤濃度を21日間にわたって測定した。血清中の薬剤濃度/時間プロファイルを表25
及び26にまとめて示し、図12に示す。
5及び9.2日のFP1の最終半減期が示され、皮下投与後の平均バイオアベイラビリテ
ィーは約88%であった(表27)。
に存在する完全な二量体の濃度を定量した(表28及び29、並びに図13及び14)。
この方法により測定された濃度は、イムノアッセイ(IA)により測定された濃度と同様
であり、FP1が完全な二量体として循環しており、カニクイザルでは検出可能な代謝不
安定性はないことを示している。
ン消化LC-MS/MS分析によって測定した(表30及び31)。FP1内のHSA領
域のN末端近く、GDF15のN末端近く、及びGDF15のC末端近くにそれぞれ位置
するトリプシン消化ペプチド、すなわち、ALV(ALVLIAFAQYLQQSPFE
DHVK)、ASL(ASLEDLGWADWVLSPR)、及びTDT(TDTGVS
LQTYDDLLAK)を選択した。これらのペプチドをFP1の代理ペプチドとして観
察した。代理ペプチドのすべての濃度は互いと、また、イムノアッセイにより測定された
濃度と同程度であり、FP1内のGDF15配列が完全に保たれ、インビボで完全なHS
A配列に連結されていることが示された。
この研究の目的は、ヒト血漿中のFP1のエクスビボ安定性を分析することにあった。
新鮮な非凍結ヒト血漿を、遠心分離により2名の被験者(男性1人、女性1人)のヘパリ
ン添加血から調製した。FP1を、静かに混合しながらこの基質中で、0、4、24及び
48時間、37℃でインキュベートした。FP1の濃度を、イムノアッセイ法により測定
した。開始濃度(0時間)からの平均の差(%)は、-4.1~-12.9の範囲であり
、経時的な増加はみられず、FP1がエクスビボのヒト血漿中で48時間まで安定である
ことが示された(表32及び図15)。
全な二量体の濃度を定量した。この方法で測定された濃度は経時的(0、4、24、及び
48時間)に安定であり、FP1が、エクスビボのヒト血漿中で最大48時間、完全な二
量体に保たれることが示された(表33及び図16)。
動物及び臨床試料中の抗薬剤抗体(ADA)を検出するために免疫応答(IR)アッセ
イが開発される。IRアッセイは、ADAの状態を薬物動態/毒物動態(PK/TK)の
結果と比較するためのADA陽性試料を同定するものであり、FP1への曝露及び薬物動
態の評価を可能とするものである。臨床IRアッセイは、血清試料をスクリーニングし、
ADA陽性試料の特異性を確認し、確認された陽性試料のADA力価を測定するために使
用される。中和抗体(NAb)アッセイの開発が、プログラムの第1相でADA陽性被験
者からの確認された陽性試料に使用するために行われる。更に、プログラムの第2相で用
いるために、内因性GDF15に対するADA交差反応性の決定が行われる。ファースト
・イン・ヒューマン(FIH)試験に先立って免疫原性リスクの評価が行われ、更なる免
疫応答特性評価が認められる場合には実施することができる。
GDF15の内因性の標的受容体は同定されていないため、FP1ではインビトロの結
合データ及び機能性のデータがない。しかしながら、ラット、マウス、及びカニクイザル
における単回及び複数回用量の薬物及び効果試験によって、これらの種におけるFP1の
活性が実証され、食物摂取量を低下させ、体重を減少させ、経口耐糖能を調節する効果が
示されている。ラット及びサルは、効果試験の結果に基づき、これらの種における受容体
に対するFP1の内因性効果(ヒトに対する)が完全に特性評価がなされていないという
理解のもと、それぞれ齧歯類及び非齧歯類毒物試験用の種とされるであろう。
)及び110(コドン最適化2)のヌクレオチド配列によりコードされる)を有する、実
施例5で述べた本発明の別の例示的な融合タンパク質の特性評価を行う。この融合タンパ
ク質は、グリシン及びセリン残基からなるアミノ酸42個のリンカーGS-(GGGGS
)8を介した、HSA(C34S)の成熟ヒトGDF15の欠失変異体(201~308
、配列番号8)との融合体のホモ二量体として存在する完全な組換えタンパク質である。
HSAの34位の1個の天然の遊離システインがセリンに変異している。この特定のHS
A-GDF15融合タンパク質を、簡潔にするために、以下の実施例では「FP2」と呼
ぶものとする。
FP2を、1回の投与後に雄性C57Bl/6マウスの食物摂取量を低下させる性質に
ついて評価した。Taconic Biosciences社(ニューヨーク州ハドソン
)より入手した雄性C57Bl/6Nマウス(10~12週齢)を実験で使用した。マウ
スは、12時間の明暗サイクル(午前6時/午後6時)を行った調温室内で1匹ずつ収容
し、水及び食餌を自由に取らせた。雄性C57Bl/6マウスはBioDAQケージ内で
最低72時間、環境順応させた。その後、マウスを食物摂取量に基づいて1群8匹ずつの
6群に最後の24時間にグループ分けした。午後4:00~5:00の間に、動物の体重
を測定し、溶媒又は化合物を皮下注射により投与した。各ケージについて、食物摂取量の
変化をBioDAQシステムにより、化合物の投与後48時間にわたって継続的に記録し
た。この実験では、6xHis-FP1を比較に用いた。
物摂取量を低減させる有意な効果を示した(表34)。マウスですべての時点及びすべて
の用量レベルにおいてPBSに対して食物摂取量の変化率(%)の低下がみられた(表3
5)。
それぞれ、*PBSに対してp≦0.05
**PBSに対してp≦0.01
***PBSに対してp≦0.001
****PBSに対してp≦0.0001
使用した統計分析法は、ANOVA及びダネットの多重比較検定である。
6xHis-FP1の8nmol/kg(n=6)投与群を除き、n=8/群とした。
低下率として表す。
それぞれ、*PBSに対してp≦0.05
**PBSに対してp≦0.01
***PBSに対してp≦0.001
****PBSに対してp≦0.0001
使用した統計分析法は、ANOVA及びダネットの多重比較検定である。
6xHis-FP1の8nmol/kg投与群(n=6)を除き、n=8/群とした。
FP2を、1回の投与後に雄性スプラーグ・ドーリーラットの食物摂取量及び体重増加
を低下させる能力について評価した。動物は、体重200~225gのものをCharl
es River Labs社(マサチューセッツ州ウィルミントン)より入手し、配送
の1週間以内に使用した。動物は、12時間の明暗サイクルを行った調温室内で、Alp
haドライ床材及び濃縮用プラスチックチューブの入ったケージに1匹ずつ収容した。動
物は自由に水を摂取させ、実験用齧歯類の餌である、Irradiated Certi
fied PicoLab(登録商標)Rodent Diet 20、5K75*(A
SAP社(ペンシルベニア州クエーカータウン)を介してPurina Mills社(
ミズーリ州セントルイス)より供給されるもの)を与えた。投与に先立って各ラットにつ
いて動物の体重を測定し、記録した。
摂取量に基づいて1群8匹ずつの6群に最後の24時間にグループ分けした。午後4:0
0~5:00の間に、動物の体重を測定し、溶媒又は化合物を皮下注射により投与した。
各ケージについて、食物摂取量の変化を、BioDAQシステムにより、化合物の投与後
48時間にわたって継続的に記録した。この実験では、6XHis-FP1を比較に用い
た。
l/kgの用量では、食物摂取量に有意差は認められなかった。1nmol/kgでは、
食物摂取量を低下させる有意な効果が12時間で認められたが、24又は48時間では認
められなかった。3及び10nmol/kgの用量レベルでは、食物摂取量の有意な低下
がすべての時点で認められた(表36、図19)。すべての時点及びすべての用量レベル
においてPBSに対して食物摂取量の変化率(%)の低下がみられた(表37)。
それぞれ、*PBSに対してp≦0.05
**PBSに対してp≦0.01
****PBSに対してp≦0.001
使用した統計分析法は、ANOVA及びダネットの多重比較検定である。
n=8/群
低下率として表す。
データは、平均値±SEMとして表す。
それぞれ、*PBSに対してp≦0.05
**PBSに対してp≦0.01
***PBSに対してp≦0.001
使用した統計分析法は、ANOVA及びダネットの多重比較検定である。
n=8/群
びグルコースホメオスタシスに対するFP2の効果
FP2を、8日間にわたって雄性DIO C57Bl/6マウスに反復投与し、食物摂
取量及び体重を低下させ、グルコースホメオスタシスを改善する能力について評価した。
Taconic Biosciences社(ニューヨーク州ハドソン)より入手した雄
性DIO C57Bl/6マウス(21週齢、高脂肪食を15週間与えたもの)を実験で
使用した。マウスは、12時間の明暗サイクル(午前6時/午後6時)を行った調温室内
で1匹ずつ収容し、水を自由摂取させ、研究用食事D12492(Research D
iets社、ニュージャージー州ニューブランズウィック)を与えた。マウスを1週間以
上マウス飼育室で環境順応させてから実験に供した。実験の評価項目は、食物摂取量、体
重、体組成、及び血糖評価項目(OGTT、血糖値)の測定値とした。投与の1日前に動
物の体重を測定し、体重(BW)別にグループ分けした。皮下注射によりマウスに投与し
た。FP2を投与した動物には、この化合物を0日目、3日目、及び6日目、9日目、及
び12日目に投与した。溶媒群及びロシグリタゾン群には、滅菌PBSをこれらの日に同
様に投与した。ロシグリタゾンは、0.015重量/重量%で食餌中で自由に与えた。体
重及び食物摂取量を、15日間にわたり毎日記録した。血糖値を0、7、及び13日目に
測定した。経口グルコース負荷試験(OGTT)を14日目に実施した。OGTTの間、
インスリン値を選択された時点に測定した。15日目にマウスをCO2で安楽死させ、曝
露用の最終血液試料を心臓穿刺により採取した。各投与群3匹のマウスで合計15匹のマ
ウスで別々のPKアームを行った。
薬力学(PD)(有効性)アームの大半の動物が、恐らくは免疫原性のために、薬物動
態(PK)試料を得た最後の実験日には検出不能な薬剤濃度を有していた。したがって、
PDアームからの個々のPKの代わりに、PKアームからの平均PKプロファイルを使用
して、対応する用量レベルでPDアームのベースラインからの体重変化率(%)について
曝露-反応(それぞれ、3、6及び9日目)を実施した。この方法では、PKアームが薬
剤曝露に関してPDアームと同様の挙動を示すと仮定している。
値)を用いて曝露量を反応データと相関させた(対数値を薬剤濃度に変換した)。Hil
l Slopeは1に設定した。EC50値に対してEC10を当てはめたモデルは、E
max推定値が異なった(Emax=それぞれ、-4.26%、-8.18%及び-9.
85%)にもかかわらず、3、6及び9日目で2倍以内であった。9日目に、一部の動物
が、潜在的なADAの形成のために薬剤曝露の消失をやはり示したため、9日目のデータ
に基づいたE-Rパラメータは解釈に注意を要する。
P2の曝露の効果を、食餌誘発性肥満雄性C57Bl/6マウスで評価した。0.3nm
ol/kg処理群の1.7~3.3nMのFP2、1.0nmol/kg処理群の7.1
~14nM、3.0nmol/kg処理群の20.8~41.6nM、及び10nmol
/kg処理群の28.5~112.9のFP2のトラフ曝露値を、実験のPKアームで9
日目まで維持した(n=2又は3、表49)。9日目以降、q3d投与を継続したにもか
かわらず、循環値の減少が大半の動物で認められた(表49)。この加速したクリアラン
スと一致して、実験のPDアームの動物の大半が15日目に検出不能なFP2の循環値を
有していた(表50)。
て、食物摂取量(表38)、体重(表39、40及び図20)、及び摂食血糖値を低下さ
せた。食物摂取量の有意な低下が、0.3nmol/kgでは2日目、5日目、及び8日
目で、1.0nmol/kgでは1日目~7日目を通じて、3.0nmol/kgでは1
日目、2日目、4日目~6日目、及び8日目に、10.0nmol/kgでは1日目、3
日目~6日目、8日目、及び9日目でみられた。体重変化率(%)は、0.3nmol/
kgでは5日目~13日目で、1.0nmol/kg及び10.0nmol/kgでは3
日目~13日目で、3.0nmol/kgでは4日目から13日目で有意であった。体重
の変化(g)は、0.3nmol/kgでは8日目から、1.0nmol/kgでは6日
目から、3.0nmol/kgでは7日目から、10.0nmol/kgでは5日目から
有意であった。摂食血糖値の減少は、3.0nmol/kgの用量レベルの動物では7日
目で有意であり、3.0及び10.0nmol/kgの用量レベルの動物では13日目で
有意であった。
理群と比較して14日目に耐糖能の改善がみられた(表41、図21A及び12B)。血
糖値は、0.3nmol/kg群では30分で、1.0nmol/kg群では60分及び
120分で、3.0nmol/kg群では120分で、10.0nmol/kg群では3
0、90、及び120分で有意に低かった。全曲線下面積は、すべての用量群で有意であ
った。グルコースチャレンジにおけるインスリン値は、0.3及び10.0nmol/k
g群で30分で有意に低かった(表42、図22A及び22B)。更に、溶媒処理動物と
比較して、14日間の10.0nmol/kgのFP2によるq3d処理後のDIOマウ
スで絶食HOMA-IR計算値に有意な低下がみられ、インスリン感受性の改善を示した
(表44及び図24)。
8)。1.0nmol/kg及び10.0nmol/kgのFP2で処理したDIOマウ
スが13日目に体脂肪量の有意な低下を示したのに対して、いずれの処理群でも除脂肪量
の変化はみられなかった。13日目に、10.0nmol/kg処理群は、溶媒処理群と
比較して除脂肪率(%)の有意な増加及び体脂肪率(%)の有意な低下を示した。-1日
目~13日目の変化は除脂肪量について0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、
及び10.0nmol/kg処理群で有意であり、除脂肪率(%)について1.0、3.
0、及び10.0nmol/kg処理群で有意であった。-1日目~13日目の変化は、
溶媒と比較してすべての処理群で体脂肪量及び除脂肪率(%)について有意であった。
F15の血清レベルに有意差はみられなかった(表46)。
すべてにおいて、集団レベルでベースラインからのより大きな体重変化率(%)を伴うこ
とを示している。
の減少、耐糖能及びインスリン感受性の改善につながった。q3dの1.0、3.0、及
び10.0nmol/kgで複数の日数にわたって食物摂取量の有意な減少が得られた。
実験開始の3日~5日後から体重が有意に減少した。13日目の摂食血糖値は3.0及び
10.0nmol/kgのFP2のq3d投与後に有意に減少した。絶食HOMA-IR
の有意な減少により示されるインスリン感受性は、10.0nmol/kgのFP2のq
3d投与の14日後に得られた。13日目に、10.0nmol/kgのFP2でq3d
処理されたDIOマウスにおいて、除脂肪率(%)の有意な増大及び体脂肪率(%)の有
意な減少が認められた。
時間当たり、群当たりの平均±SEMを表す。
*溶媒に対してp<0.05
使用した統計分析法は、二元配置ANOVA RM、テューキーの多重比較検定である
。
。
*溶媒に対してp<0.05
使用した統計分析法は、血糖値については、二元配置ANOVA RM、テューキーの
多重比較検定、
AUCについては、一元配置ANOVA、テューキーの多重比較検定である。
。
*溶媒に対してp<0.05
使用した統計分析法は、インスリン値については、二元配置ANOVA RM、テュー
キーの多重比較検定、
AUCについては、一元配置ANOVA、テューキーの多重比較検定である。
マウスにおける薬物動態
FP2を雌性C57Bl/6マウスに皮下投与した場合の薬物動態特性を評価した。F
P2を雌性C57Bl/6マウス(Sage Laboratories社、ミズーリ州
セントルイス)にPBS(pH7.3~7.5)中、2.0mg/kgの用量レベルで、
皮下(各時点につきn=5の試料)及び静脈内(各時点につきn=5の試料)投与した。
最後の時点の試料の採取は、最終瀉血により行った。血液試料を採取し、血清を処理し、
薬物濃度を168時間まで測定した。FP2の濃度は、イムノアッセイ法により測定した
。血漿中の薬物濃度プロファイルを表51及び52にまとめて示し、図25に示す。
最終半減期は、それぞれ約1.51日及び約1.76日であり、皮下投与後の平均バイオ
アベイラビリティーは約61%であることが示された。
FP2をスプラーグ・ドーリーラット(Sage Laboratories社、ミズ
ーリ州セントルイス)にPBS(pH7.3~7.5)中、2.0mg/kgの用量レベ
ルで、皮下(各時点につきn=5の試料)及び静脈内(各時点につきn=5の試料)投与
した。最後の時点の試料の採取は、最終瀉血により行った。血液試料を採取し、血清を処
理し、薬物濃度を168時間まで測定した。FP2の濃度は、イムノアッセイ法により測
定した。血漿中の薬物濃度プロファイルを表54及び55にまとめて示し、図26に示す
。これらのデータから計算した薬物動態パラメータを表56にまとめて示す。
与後の最終半減期は、それぞれ約1.46日及び約1.37日であり、皮下投与後の平均
バイオアベイラビリティーは約28%であることが示された。
FP2を、3匹の雄のカニクイザルにそれぞれPBS(pH7.0~7.6)中、1m
g/kgで皮下に、1mg/kgで静脈内に投与した。血液試料を採取し、血漿を処理し
、薬物濃度を21日目まで測定した。
)及び皮下(SC)(1.0mg/kg)投与した後に特性評価した。SC投与後の血漿
中の薬物濃度-時間プロファイルを、イムノアッセイ及びLCMS分析について表57及
び58にそれぞれ示し、IV投与後の血漿中の薬物濃度-時間プロファイルをイムノアッ
セイ及びLCMS分析について表59及び60にそれぞれ示す。イムノアッセイのデータ
を図27にグラフで示し、LCMSのデータを図28に示す。
1/2)は、IV及びSC投与後にそれぞれ約7.05日及び約8.51日であった。I
V及びSC投与後の平均PKパラメータを表61に示す。イムノアッセイ生体分析の結果
を用いると、平均の非コンパートメントモデルで推定したFP2の最終半減期(t1/2
)は、IV及びSC投与後にそれぞれ約7.05日及び約8.51日であった。FP2の
平均バイオアベイラビリティー(F%)は、SC投与後のカニクイザルでAUC0~最終
に基づいて約98.5%と推定され、AUC0~無限に基づいて約109.2%と推定さ
れた。
FP2のエクスビボ安定性を、新鮮なヘパリン添加血漿中、37℃で48時間まで調べ
た。新鮮な非凍結ヒト血漿を、遠心分離により2名の被験者(男性1人、女性1人)のヘ
パリン添加血から調製した。FP2を、静かに混合しながらこの基質中で、0、4、24
及び48時間、37℃でインキュベートした。FP2の濃度を、イムノアッセイ法により
測定した。独立した免疫親和性捕捉の後にLCMSを行って、アッセイ条件下でこの基質
中に存在する完全な二量体の濃度を定量した。
経時的な減少はみられず、FP2がエクスビボのヒト血漿中で48時間まで安定であるこ
とが示された(図29及び表62)。LCMS法では、濃度は経時的に安定しており、J
NJ-64739090がエクスビボのヒト血漿中で48時間まで完全な二量体に保たれ
ることが示された(図30及び表63)。
ナイーブなカニクイザルへの1回投与後の食物摂取量及び体重に対するFP1及びFP
2の影響を評価した。
の用量レベルで皮下投与した。溶媒処理群も含めた。動物は盲検で処理した。実験は、2
週間のベースライン食物摂取量測定及びデータ収集、化合物の1回投与後の4週間のデー
タ収集の合計6週間で行った。血漿薬剤曝露量を投与の1、7、14、21、及び28日
目に測定した。
重を減少させた(図32~33)。一日食物摂取量の有意な低下が、10nmol/kg
の用量レベルで4、5、6、及び8~12日目にみられた(図32)。一日食物摂取量の
週平均値は、10nmol/kgの用量レベルで投与後2週目の間、有意に低下した。3
nmol/kgの用量レベルでは、投与後2週目の投与の前に平均の週食物摂取量から有
意な低下率(%)を示し、10nmol/kgの用量レベルでは、投与後1及び2週目の
投与の前に平均の週食物摂取量から有意な低下率(%)を示した。0日目からの体重変化
率(%)の有意な低下が、3nmol/kgの用量レベルで28日目に、10nmol/
kgの用量レベルでは14、21、及び28日目にみられた(図33)。
の用量レベルで皮下投与した。溶媒処理群も含めた。動物は盲検で処理した。実験は、5
週間のベースライン食物摂取量測定及びデータ収集、1週間の処理、及び5週間の休薬期
データ収集の合計11週間で行った。血漿薬剤曝露量を投与の1、7、14、21、28
、35、及び42日目に測定した。
重を減少させた(図34~35)。一日食物摂取量の有意な低下が、3nmol/kgの
用量レベルで3、5~8、10及び12日目に、10nmol/kgの用量レベルで3~
38日目、及び40日目にみられた(図34)。一日食物摂取量の週平均値は、3nmo
l/kgの用量レベルで投与後1週目に有意に低下し、10nmol/kgの用量レベル
で1~6週目に有意に低下した。3nmol/kgの用量レベルでは、投与後2週目に、
週平均の一日食物摂取量に投与の前の週から有意な低下率(%)がみられ、10nmol
/kgの用量レベルでは、投与後1及び6週目に、週平均の一日食物摂取量に投与の前の
週から有意な低下率(%)がみられた。0日目からの体重変化率(%)の有意な低下が、
1nmol/kgの用量レベルでは21~42日目に、3nmol/kgの用量レベルで
は14~42日目に、10nmol/kgの用量レベルでは7~42日目にみられた(図
34)。
HSA-GDF15:GDF15ヘテロ二量体の生物活性を調べた。
トを設計した。第1のコンストラクトは、グリシン/セリンリンカーを介して成熟GDF
15のN末端(AA203~308)に融合されたHSAを含むものとした(配列番号9
3)。第2のコンストラクトは、グリシン/セリンリンカーを介して成熟GDF15のN
末端(AA197~308)に融合された6×ヒスチジンタグ化HSA及びHRV3Cプ
ロテアーゼ切断部位を含むものとした(配列番号94)。これらのプラスミドを、製造者
のプロトコールにしたがってExpi293(商標)発現系(Thermo Fishe
r Scientific社)を使用して1:1の比で同時トランスフェクトした。ペプ
チドは、モノマー同士がジスルフィド結合によって連結されたヘテロ二量体及びホモ二量
体の両方の形を含むHSA-GDF15タンパク質として分泌された。
スフェクションの5日後に回収し、遠心して清澄化し、滅菌濾過(0.2μmPES膜、
Corning社)した。清澄化した上清を20mMリン酸ナトリウム、500mM N
aCl、pH7.4で平衡化したHistrap HPカラム(GE Healthca
re社)にロードした。ローディング後、未結合タンパク質を平衡化バッファでカラムを
洗浄することによって除去した。カラムに結合した、ヘテロ二量体及びホモ二量体の両方
の形を含むHSA-GDF15タンパク質を20mMリン酸ナトリウム、150mMイミ
ダゾール、pH7.4で溶出した。溶離液の各画分をプールし、6×ヒスチジンタグ化H
RV3C酵素(Janssen社)の存在下、4℃で一晩インキュベートしてHSA-G
DF15:GDF15ヘテロ二量体を生成させた。インキュベーション後、タンパク質溶
液を平衡化バッファ中に透析してイミダゾールを除去した後、HisTrap HPカラ
ムに再度かけた。HSA-GDF15:GDF15ヘテロ二量体は20mMリン酸ナトリ
ウム、50mMイミダゾール、pH7.4中による洗浄工程で溶出したが、ヒスチジンタ
グ化タンパク質は保持された。ヘテロ二量体は、1×DPBS、pH7.2中で平衡化し
たHiLoad26/60 Superdex 200 pgカラム(GE Healt
hcare社)を使用してサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により更に精製した
。HSA-GDF15:GDF15ヘテロ二量体を高い純度(SDS-PAGEにより測
定)で含むSECからの溶離液の画分をプールし、濾過した。タンパク質濃度を、Bio
Tek SynergyHTTM分光光度計により吸光度280nmで測定した。精製し
たタンパク質の品質を、SDS-PAGE、及び分析用サイズ排除HPLC(Ultim
ate3000 HPLCシステム)によって評価した。内毒素レベルをLALアッセイ
(Pyrotell(登録商標)-T、Associates of Cape Cod
社)を用いて測定した。精製したタンパク質を4℃で保管した。
を、アッセイの24時間前に96ウェルプレート内の増殖培地(10%FBS)に播種し
た。24時間後、培地を1%HIウマ血清を添加した200μlのDMEM培地で置き換
えて、37℃のインキュベーター内で3時間インキュベーターすることで細胞を飢餓状態
とした。次いで、1%HIウマ血清添加培地を200μlのAB1で置き換え、37℃の
インキュベーター内で更に2時間インキュベートした。アッセイを行うため、AB1をす
べてのウェルから吸引し、AB2中100μlの異なる濃度の試験化合物を加え、プレー
トを37℃のインキュベーター内で15分インキュベートした。15分後、試験溶液を除
去し、30μlの溶解バッファ(検出キット中で与えられるもの)を加え、プレートを室
温でプレートシェーカー上で30分振盪した。検出を行うため、16μlの溶解した試料
を384ウェルアッセイプレートに移し、4μlのHTRF pAKT検出用抗体を加え
た。プレートを室温で一晩インキュベートした後、HTRFシグナルをEnvision
(Perkin Elmer社)で読み取った。
を使用して計算した。データを、データ点当たり3つの重複を与える3つの別々の実験か
らの平均±標準誤差(SE)として表す。HSA-GDF15:GDF15ヘテロ二量体
の分子を質量分析により確認した。ヘテロ二量体の曲線の左方向へのシフトは、HSA-
GDF15:GDF15ヘテロ二量体が、更なるアルブミンを有する関連するホモ二量体
分子と比較して、pAKTを誘導するうえでより強力であることを示唆した。
HSAとGDF15とを連結する異なるリンカーの熱安定性を調べた。フラグメント化
及び凝集する性質を評価するため、異なるリンカーを有するHSA-GDF15融合タン
パク質を10mg/mlに希釈した。EDTA及びメチオニンを加えた後、試料を40℃
以下で14日間インキュベートした。次いで試料を1mg/mlの濃度に希釈し、サイズ
排除高速液体クロマトグラフィー(SE-HPLC)で評価した。完全なタンパク質並び
に凝集体及びフラグメントの割合(%)をこれらのタンパク質について定量した。表64
は、APの繰り返しからなるリンカーを有するHSA-GDF15タンパク質が熱ストレ
ス下でフラグメント化に対して最も安定的であることを示している。
ため、GFRAL-FC融合タンパク質をプレートにコートし、抗GDF15又は抗HS
Aによる検出を行うイムノアッセイを、GDF15(Janssen社)及びHSA(K
erafast,Inc.社、マサチューセッツ州ボストン)に対するモノクローナル抗
体を使用して行った。このアッセイにより、表66に示されるこれらのリンカーはいずれ
も受容体に同様の結合性を有することが示された。
、発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更及び改変を行い得る点
は明らかであろう。
本発明は次の実施態様を含む。
[1]
a.半減期延長タンパク質と、
b.リンカーと、
c.GDF15タンパク質と、を含み、
N末端からC末端に(a)-(b)-(c)の順序で配列された、融合タンパク質。
[2]
前記GDF15タンパク質が、成熟GDF15タンパク質又はその機能的変異体である、上記[1]に記載の融合タンパク質。
[3]
前記GDF15タンパク質が、配列番号6、7、8、9、10又は11と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記[1]に記載の融合タンパク質。
[4]
前記GDF15タンパク質が、配列番号6、7、8、9、10及び11からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記[3]に記載の融合タンパク質。
[5]
前記半減期延長タンパク質が、ヒト血清アルブミン(HSA)又はその機能的変異体である、上記[1]~[4]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[6]
前記半減期延長タンパク質が、配列番号1と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記[5]に記載の融合タンパク質。
[7]
前記半減期延長タンパク質が、配列番号1、2及び3からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記[6]に記載の融合タンパク質。
[8]
前記リンカーが、柔軟性リンカーである、上記[1]~[7]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[9]
前記リンカーが、配列(GGGGS)n(ただし、nは2~20である)を含む、上記[8]に記載の融合タンパク質。
[10]
前記リンカーが、構造化リンカーである、上記[1]~[7]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[11]
前記リンカーが、配列(AP)n又は(EAAAK)n(ただし、nは2~20である)を含む、上記[10]に記載の融合タンパク質。
[12]
前記リンカーが、(GGGGA)n、(PGGGS)n、(AGGGS)n、又はGGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS(ただし、nは2~20である)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記[1]~[7]のいずれかに記載の融合タンパク質。
[13]
配列番号5、25~30、36~37、40、48、55~56、59~60、64~75、92、113、115、117、119、121、123、125、又は127と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質。
[14]
配列番号5、25~30、40、55~56、59~60、70、92、113、115、117、119、121、123、125、及び127からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記[13]に記載の融合タンパク質。
[15]
上記[1]~[14]のいずれかに記載の融合タンパク質をコードしたヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
[16]
配列番号76~91、95、109、110、114、116、118、120、122、124、126、及び128と少なくとも90%の配列同一性を有する、上記[15]に記載の単離核酸分子。
[17]
配列番号76~91、95、109、110、114、116、118、120、122、124、126、及び128からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、上記[16]に記載の単離核酸分子。
[18]
上記[1]~[14]のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクター。
[19]
配列番号76~91、95、109、110、114、116、118、120、122、124、126、及び128からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、上記[18]に記載のベクター。
[20]
上記[1]~[14]のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞。
[21]
上記[1]~[14]のいずれかに記載の融合タンパク質を作製する方法であって、
(1)融合タンパク質が生成する条件下で融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養することと、
(2)前記宿主細胞により産生された前記融合タンパク質を回収することと、を含む、方法。
[22]
上記[1]~[14]のいずれかに記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[23]
上記[1]~[14]のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[24]
代謝性疾患を治療又は予防する方法であって、該疾患の治療又は予防を要する対象に、有効量の上記[22]又は[23]に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
[25]
疾患の治療を要する対象において、2型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、及び慢性関節リウマチからなる群から選択される代謝性疾患からなる群から選択される疾患を治療する方法であって、前記対象に、配列番号60のアミノ酸配列を含む融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。
[26]
疾患の治療を要する対象において、2型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、及び慢性関節リウマチからなる群から選択される代謝性疾患からなる群から選択される疾患を治療する方法であって、前記対象に、配列番号92のアミノ酸配列を含む融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。
[27]
2本のポリペプチド鎖を含む二量体であって、各鎖が、N末端からC末端にかけてHSA領域、リンカー、及びGDF15領域を含み、前記HSA領域が、配列番号1、2、又は3と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記GDF15領域が、配列番号6、7、8、9、10、又は11と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、二量体。
[28]
前記HSA領域が、配列番号1、2、及び3からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記[27]に記載の二量体。
[29]
前記GDF15領域が、配列番号6、7、8、9、10及び11からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記[27]に記載の二量体。
[30]
前記2本のポリペプチド鎖が、ジスルフィド結合によって連結されている、上記[27]に記載の二量体。
[31]
前記HSA領域と前記GDF15領域とがポリペプチドリンカーによって連結されている、上記[27]に記載の二量体。
[32]
前記HSA領域と前記GDF15領域とが柔軟性リンカーによって連結されている、上記[31]に記載の二量体。
[33]
前記ポリペプチドリンカーが、配列(GGGGS)n(ただし、nは2~20である)を含む、上記[32]に記載の二量体。
[34]
前記HSA領域と前記GDF15領域とが構造化リンカーによって連結されている、上記[31]に記載の二量体。
[35]
前記ポリペプチドリンカーが、配列(AP)n又は(EAAAK)n(ただし、nは2~20である)を含む、上記[34]に記載の二量体。
[36]
前記リンカーが、(GGGGA)n、(PGGGS)n、(AGGGS)n、又はGGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS(ただし、nは2~20である)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記[31]に記載の二量体。
[37]
(i)N末端の第1のHSA領域、リンカー、及びC末端の第1のGDF15領域を含む第1のポリペプチド鎖と、(ii)第2のGDF15領域を含む第2のポリペプチド鎖と、を含む二量体であって、前記HSA領域が、配列番号1、2、又は3と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第1のGDF15領域が、配列番号6、7、8、9、10、又は11と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第2のGDF15領域が、配列番号6、7、8、9、10、又は11と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、二量体。
[38]
前記HSA領域が、配列番号1、2、及び3からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記[37]に記載の二量体。
[39]
前記GDF15領域が、配列番号6、7、8、9、10及び11からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記[37]に記載の二量体。
[40]
前記リンカーが、(GGGGS)n、(AP)n、(EAAAK)n、(GGGGA)n、(PGGGS)n、(AGGGS)n及びGGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS(ただし、nは2~20である)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記[37]に記載の二量体。
[41]
前記2本のポリペプチド鎖が、ジスルフィド結合によって連結されている、上記[37]に記載の二量体。
[42]
配列番号7、8、9、10、及び11からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
[43]
配列番号96~108からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
[44]
配列番号96~108からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクター。
[45]
配列番号96~108からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む宿主細胞。
[A1]
a.配列番号2のアミノ酸配列と、
b.アミノ酸配列(GGGGS)n(ただし、nは7又は8である)(配列番号42又は43)を含む35~48アミノ酸の長さを有するリンカーと、
c.配列番号8のアミノ酸配列からなる短縮されたGDF15と、を含み、
N末端からC末端に(a)-(b)-(c)の順序で配列され、
前記配列番号2のアミノ酸配列のC末端が、前記リンカーを介して、前記短縮されたGDF15のN末端に融合した、融合タンパク質。
[A2]
前記リンカーが、配列(GGGGS)n(ただし、nは8である)(配列番号43)を含む、上記[A1]に記載の融合タンパク質。
[A3]
前記リンカーが、配列番号12のアミノ酸配列からなるものである、上記[A1]に記載の融合タンパク質。
[A4]
配列番号92のアミノ酸配列を含む融合タンパク質。
[A5]
上記[A1]に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
[A6]
配列番号97~99からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、上記[A5]に記載の単離核酸分子。
[A7]
上記[A1]に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクター。
[A8]
配列番号97~99からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、上記[A7]に記載のベクター。
[A9]
上記[A1]に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞。
[A10]
上記[A1]に記載の融合タンパク質を作製する方法であって、
(1)融合タンパク質が生成する条件下で融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養することと、
(2)前記宿主細胞により産生された前記融合タンパク質を回収することと、を含む、方法。
[A11]
上記[A1]に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[A12]
上記[A4]に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[A13]
代謝性疾患を治療又は予防するための、上記[A11又は12]に記載の医薬組成物。
[A14]
2型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、及び慢性関節リウマチからなる群から選択される代謝性疾患からなる群から選択される疾患を治療するための医薬組成物であって、配列番号60のアミノ酸配列を含む融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[A15]
2型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、及び慢性関節リウマチからなる群から選択される代謝性疾患からなる群から選択される疾患を治療するための医薬組成物であって、配列番号92のアミノ酸配列を含む融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[A16]
上記[A4]に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
[A17]
上記[A4]に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクター。
[A18]
上記[A4]に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞。
[A19]
上記[A4]に記載の融合タンパク質を作製する方法であって、
(1)融合タンパク質が生成する条件下で融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養することと、
(2)前記宿主細胞により産生された前記融合タンパク質を回収することと、を含む、方法。
[A20]
配列番号95のヌクレオチド配列を含む、上記[A16]に記載の単離核酸分子。
[A21]
配列番号110のヌクレオチド配列を含む、上記[A16]に記載の単離核酸分子。
Claims (45)
- a.半減期延長タンパク質と、
b.リンカーと、
c.GDF15タンパク質と、を含み、
N末端からC末端に(a)-(b)-(c)の順序で配列された、融合タンパク質。 - 前記GDF15タンパク質が、成熟GDF15タンパク質又はその機能的変異体である
、請求項1に記載の融合タンパク質。 - 前記GDF15タンパク質が、配列番号6、7、8、9、10又は11と少なくとも9
0%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。 - 前記GDF15タンパク質が、配列番号6、7、8、9、10及び11からなる群から
選択されるアミノ酸配列を含む、請求項3に記載の融合タンパク質。 - 前記半減期延長タンパク質が、ヒト血清アルブミン(HSA)又はその機能的変異体で
ある、請求項1~4のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記半減期延長タンパク質が、配列番号1と少なくとも90%の同一性を有するアミノ
酸配列を含む、請求項5に記載の融合タンパク質。 - 前記半減期延長タンパク質が、配列番号1、2及び3からなる群から選択されるアミノ
酸配列を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。 - 前記リンカーが、柔軟性リンカーである、請求項1~7のいずれか1項に記載の融合タ
ンパク質。 - 前記リンカーが、配列(GGGGS)n(ただし、nは2~20である)を含む、請求
項8に記載の融合タンパク質。 - 前記リンカーが、構造化リンカーである、請求項1~7のいずれか1項に記載の融合タ
ンパク質。 - 前記リンカーが、配列(AP)n又は(EAAAK)n(ただし、nは2~20である
)を含む、請求項10に記載の融合タンパク質。 - 前記リンカーが、(GGGGA)n、(PGGGS)n、(AGGGS)n、又はGG
S-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS(ただし、nは2~20である)から
なる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の融合タ
ンパク質。 - 配列番号5、25~30、36~37、40、48、55~56、59~60、64~
75、92、113、115、117、119、121、123、125、又は127と
少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質。 - 配列番号5、25~30、40、55~56、59~60、70、92、113、11
5、117、119、121、123、125、及び127からなる群から選択されるア
ミノ酸配列を含む、請求項13に記載の融合タンパク質。 - 請求項1~14のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードしたヌクレオチド配列
を含む単離核酸分子。 - 配列番号76~91、95、109、110、114、116、118、120、12
2、124、126、及び128と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項15
に記載の単離核酸分子。 - 配列番号76~91、95、109、110、114、116、118、120、12
2、124、126、及び128からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請
求項16に記載の単離核酸分子。 - 請求項1~14のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベ
クター。 - 配列番号76~91、95、109、110、114、116、118、120、12
2、124、126、及び128からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請
求項18に記載のベクター。 - 請求項1~14のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿
主細胞。 - 請求項1~14のいずれか1項に記載の融合タンパク質を作製する方法であって、
(1)融合タンパク質が生成する条件下で融合タンパク質をコードする核酸分子を含む
宿主細胞を培養することと、
(2)前記宿主細胞により産生された前記融合タンパク質を回収することと、を含む、
方法。 - 請求項1~14のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。 - 請求項1~14のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子と、薬学
的に許容される担体とを含む、医薬組成物。 - 代謝性疾患を治療又は予防する方法であって、該疾患の治療又は予防を要する対象に、
有効量の請求項22又は23に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。 - 疾患の治療を要する対象において、2型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、
肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、及び慢性関節リウマ
チからなる群から選択される代謝性疾患からなる群から選択される疾患を治療する方法で
あって、前記対象に、配列番号60のアミノ酸配列を含む融合タンパク質と、薬学的に許
容される担体とを含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。 - 疾患の治療を要する対象において、2型糖尿病、血糖値の上昇、インスリン値の上昇、
肥満、脂質異常症、糖尿病性腎症、心筋虚血性障害、鬱血性心不全、及び慢性関節リウマ
チからなる群から選択される代謝性疾患からなる群から選択される疾患を治療する方法で
あって、前記対象に、配列番号92のアミノ酸配列を含む融合タンパク質と、薬学的に許
容される担体とを含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。 - 2本のポリペプチド鎖を含む二量体であって、各鎖が、N末端からC末端にかけて
HSA領域、リンカー、及びGDF15領域を含み、前記HSA領域が、配列番号1、2
、又は3と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記GDF15領域
が、配列番号6、7、8、9、10、又は11と少なくとも90%の同一性を有するアミ
ノ酸配列を含む、二量体。 - 前記HSA領域が、配列番号1、2、及び3からなる群から選択されるアミノ酸配列を
含む、請求項27に記載の二量体。 - 前記GDF15領域が、配列番号6、7、8、9、10及び11からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の二量体。 - 前記2本のポリペプチド鎖が、ジスルフィド結合によって連結されている、請求項
27に記載の二量体。 - 前記HSA領域と前記GDF15領域とがポリペプチドリンカーによって連結されてい
る、請求項27に記載の二量体。 - 前記HSA領域と前記GDF15領域とが柔軟性リンカーによって連結されている、請
求項31に記載の二量体。 - 前記ポリペプチドリンカーが、配列(GGGGS)n(ただし、nは2~20である)
を含む、請求項32に記載の二量体。 - 前記HSA領域と前記GDF15領域とが構造化リンカーによって連結されている、請
求項31に記載の二量体。 - 前記ポリペプチドリンカーが、配列(AP)n又は(EAAAK)n(ただし、nは2
~20である)を含む、請求項34に記載の二量体。 - 前記リンカーが、(GGGGA)n、(PGGGS)n、(AGGGS)n、又はGG
S-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS(ただし、nは2~20である)から
なる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項31に記載の二量体。 - (i)N末端の第1のHSA領域、リンカー、及びC末端の第1のGDF15領域を含
む第1のポリペプチド鎖と、(ii)第2のGDF15領域を含む第2のポリペプチド鎖
と、を含む二量体であって、前記HSA領域が、配列番号1、2、又は3と少なくとも9
0%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第1のGDF15領域が、配列番号6、
7、8、9、10、又は11と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記第2のGDF15領域が、配列番号6、7、8、9、10、又は11と少なくとも9
0%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、二量体。 - 前記HSA領域が、配列番号1、2、及び3からなる群から選択されるアミノ酸配列を
含む、請求項37に記載の二量体。 - 前記GDF15領域が、配列番号6、7、8、9、10及び11からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を含む、請求項37に記載の二量体。 - 前記リンカーが、(GGGGS)n、(AP)n、(EAAAK)n、(GGGGA)
n、(PGGGS)n、(AGGGS)n及びGGS-(EGKSSGSGSESKST
)n-GGS(ただし、nは2~20である)からなる群から選択されるアミノ酸配列を
含む、請求項37に記載の二量体。 - 前記2本のポリペプチド鎖が、ジスルフィド結合によって連結されている、請求項
37に記載の二量体。 - 配列番号7、8、9、10、及び11からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポ
リペプチド。 - 配列番号96~108からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子
。 - 配列番号96~108からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含
むベクター。 - 配列番号96~108からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含
む宿主細胞。
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