JP2022058778A5

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Publication number: JP2022058778A5
Application number: JP2022010933A
Authority: JP
Filing date: 2022-01-27
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2037-10-19

Description

本開示は、試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５補体タンパク質（Ｃ５）を定量化する方法を提供するものであって、該方法が、
ａ．ストレプトアビジン被覆粒子に対して、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体を結合させることであって、前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、ストレプトアビジン被覆粒子を含むカラムを備えるＧｙｒｏｓＢｉｏａｆｆｙ２００ＣＤに毛細管作用によって付着して、該ＣＤがＧｙｒｏｌａｂｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、カラム中のストレプトアビジン被覆粒子へと動かされることと、
ｂ．試料中の遊離（非結合）Ｃ５を捕捉することであって、該試料が毛細管作用によってＣＤに付着して、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、試料が、カラム中のストレプトアビジン被覆粒子に結合した前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体へと動かされることと、
ｃ．捕捉された遊離Ｃ５を検出することであって、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５検出抗体が、毛細管作用によってＣＤに付着して、該抗Ｃ５検出抗体が、捕捉抗体によって結合されるエピトープとは異なるエピトープにおいてＣ５に結合し、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、該検出抗体が、前記カラム中のストレプトアビジン被覆粒子に結合された捕捉抗体に結合された遊離Ｃ５へと動かされることと、
ｄ．レーザー誘導蛍光検出を使用して、捕捉された遊離Ｃ５を定量化することと、を含む。

項１試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５補体タンパク質（Ｃ５）を定量化する方法であって、該方法が、ａ．ストレプトアビジン被覆されたメソスケールディスカバリー（ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標））（ＭＳＤ（登録商標））９６ウェルアッセイプレートに対して、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体を結合させることと、ｂ．試料を該プレートに添加することによって、試料中の遊離（非結合）Ｃ５を捕捉することと、ｃ．ｓｕｌｆｏ－ｔａｇ標識した抗Ｃ５検出抗体をプレートに添加することにより捕捉された遊離Ｃ５を検出することと、ｄ．電気化学発光を使用して、捕捉された遊離Ｃ５を定量化することと、を含むものであって、試料が約１：２で希釈され、試料が氷上に保持され、工程ｂ～ｃは約１５～３０分であり、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体は、約５μｇ／ｍＬの濃度で添加される、方法。

項２試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５補体タンパク質（Ｃ５）を定量化する方法であって、該方法が、ａ．ストレプトアビジン被覆粒子に対して、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体を結合させることであって、前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、前記ストレプトアビジン被覆粒子を含むカラムを備えるＧｙｒｏｓＢｉｏａｆｆｙ２００ＣＤに毛細管作用によって付着して、該ＣＤがＧｙｒｏｌａｂｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、前記カラム中のストレプトアビジン被覆粒子へと動かされることと、ｂ．前記試料中の前記遊離（非結合）Ｃ５を捕捉することであって、前記試料が毛細管作用によって前記ＣＤに付着して、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、前記試料が、前記カラム中の前記ストレプトアビジン被覆粒子に結合した前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体へと動かされることと、ｃ．捕捉された遊離Ｃ５を検出することであって、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５検出抗体が、毛細管作用によって前記ＣＤに付着して、該抗Ｃ５検出抗体が、捕捉抗体によって結合されるエピトープとは異なるエピトープにおいてＣ５に結合し、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、検出抗体が、前記カラム中の前記ストレプトアビジン被覆粒子に結合された捕捉抗体に結合された前記遊離Ｃ５へと動かされることと、ｄ．レーザー誘導蛍光検出を使用して、捕捉された遊離Ｃ５を定量化することと、を含む方法。

特定の態様では例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５補体タンパク質（Ｃ５）を定量化する方法であって、前記方法が、
ａ．ストレプトアビジン被覆されたメソスケールディスカバリー（ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（（登録商標）））（ＭＳＤ（登録商標））９６ウェルアッセイプレートに対して、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体を結合させることと、
ｂ．前記試料を前記プレートに添加することによって、前記試料中の前記遊離（非結合）Ｃ５を捕捉することと、
ｃ．ｓｕｌｆｏ－ｔａｇ標識した抗Ｃ５検出抗体を前記プレートに添加することにより前記捕捉された遊離Ｃ５を検出することと、
ｄ．電気化学発光を使用して、捕捉された遊離Ｃ５を定量化することと、を含むものであって、
前記試料が約１：２で希釈され、前記試料が氷上に保持され、工程ｂ～ｃは約１５～３０分であり、前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体は、約５μｇ／ｍＬの濃度で添加される、方法。
（項目２）
試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５補体タンパク質（Ｃ５）を定量化する方法であって、前記方法が、
ａ．ストレプトアビジン被覆粒子に対して、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体を結合させることであって、前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、ストレプトアビジン被覆粒子を含むカラムを備えるＧｙｒｏｓＢｉｏａｆｆｙ２００ＣＤに毛細管作用によって添加されて、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、前記カラム中の前記ストレプトアビジン被覆粒子へと動かされることと、
ｂ．前記試料中の前記遊離（非結合）Ｃ５を捕捉することであって、前記試料が毛細管作用によって前記ＣＤに添加されて、前記ＣＤが前記ＧｙｒｏｌａｂｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、前記試料が、前記カラム中の前記ストレプトアビジン被覆粒子に結合した前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体へと動かされることと、
ｃ．捕捉された遊離Ｃ５を検出することであって、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５検出抗体が、毛細管作用によって前記ＣＤに添加されて、前記抗Ｃ５検出抗体が、前記捕捉抗体によって結合されるエピトープとは異なるエピトープにおいてＣ５に結合し、
前記ＣＤが前記ＧｙｒｏｌａｂｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、前記検出抗体が、前記カラム中の前記ストレプトアビジン被覆粒子に結合された前記捕捉抗体に結合された前記遊離Ｃ５へと動かされることと、
ｄ．レーザー誘導蛍光検出を使用して、前記捕捉された遊離Ｃ５を定量化することと、を含む方法。
（項目３）
工程ｄから得たデータを、項目１記載の方法を使用してＣ５枯渇試料に添加した既知の量のＣ５から作成した標準曲線と比較することによって、遊離Ｃ５抗体の濃度または量を計算することをさらに含む、項目１記載の方法。
（項目４）
工程ｄから得たデータを、項目２記載の方法を使用してＣ５枯渇試料に添加した既知の量のＣ５から作成した標準曲線と比較することによって、遊離Ｃ５抗体の濃度または量を計算することをさらに含む、項目２記載の方法。
（項目５）
ＧｙｒｏｓＥｖａｌｕａｔｏｒソフトウェアを用いて遊離Ｃ５抗体の濃度を計算することをさらに含む、項目３記載の方法。
（項目６）
前記試料がヒト患者から得られる、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記試料が血清試料または血漿試料である、項目６記載の方法。
（項目８）
患者が抗Ｃ５抗体で治療されている、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記患者がエクリズマブで治療されている、項目８記載の方法。
（項目１０）
前記患者がＡＬＸＮ１２１０で治療されている、項目８記載の方法。
（項目１１）
前記ビオチン化捕捉抗体がエクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０である、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
検出抗Ｃ５抗体がＮ１９－８（マウス抗ヒトＣ５抗体）である、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
試料の希釈に、ＲｅｘｘｉｐＡ緩衝液が使用され、前記検出抗体の希釈に、ＲｅｘｘｉｐＦ緩衝液が使用される、項目２記載の方法。
（項目１４）
前記Ｇｙｒｏｓ機器を、Ｂｉｏａｆｆｙｗａｓｈ１およびｐＨ１１緩衝液を用いて別個に二回プライミングすることをさらに含む、項目２記載の方法。
（項目１５）
前記試料が患者からのヒト血清試料であり、抗Ｃ５抗体を用いた前記患者の治療前および治療後の血清試料の前記遊離Ｃ５が定量化され、前記治療前および治療後の試料の両方が同じ希釈で希釈される、項目２記載の方法。
（項目１６）
前記治療前および治療後の試料の両方が１：２０～１：３０の希釈で希釈される、項目１５記載の方法。
本発明のこれらおよびその他の態様に従って、多数のその他の態様が提供される。本発明のその他の特徴および態様は、以下の発明を実施するための形態および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになる。

円形のＢｉｏａｆｆｙコンパクトディスク（ＣＤ）を使用する。ＰＣＲプレートは、試料および試薬のために使用しうる。多くの利用可能なＰＣＲプレートを使用してよい。プレートは箔で封止され、蒸発を防止する。捕捉試薬（ビオチン化抗Ｃ５抗体など）は、毛細管作用によってＣＤに入る。疎水性部が液体の流れを停止させる。このＣＤは、ＧｙｒｏｌａｂｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂＸＰなどのアッセイ専用の機器の内部で遠心力を受ける。この遠心力により、試薬が、ＣＤ内部のカラムの中へと動かされる。捕捉試薬は、カラム内のストレプトアビジン被覆粒子に結合する。その後試料が、毛細管作用によってＣＤに入り、活性化されたカラムに試料が付着する。その後検出試薬（例えば、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５抗体、捕捉試薬として使用される抗Ｃ５抗体とは異なるエピトープに結合するもの）が、毛細管作用によってカラムに入り、カラムに付着する。その後、カラムをレーザーでスキャンする（９０秒以内に１１２カラム）。ＲｅｘｘｉｐＡは、標準試料、ＱＣ、試料に用いられ得、またＲｅｘｘｉｐＦは、検出Ａｂに用いられ得る。次いで、レーザー誘導蛍光を使用して、試料（例えば、Ｃ５）の濃度または量を測定する。

本開示は、試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５補体タンパク質（Ｃ５）を定量化する方法を提供するものであって、該方法が、
ａ．ストレプトアビジン被覆粒子に対して、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体を結合させることであって、前記ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、ストレプトアビジン被覆粒子を含むカラムを備えるＧｙｒｏｓＢｉｏａｆｆｙ２００ＣＤに毛細管作用によって付着して、該ＣＤがＧｙｒｏｌａｂｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、カラム中のストレプトアビジン被覆粒子へと動かされることと、
ｂ．試料中の遊離（非結合）Ｃ５を捕捉することであって、試料が毛細管作用によってＣＤに付着して、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、該試料が、カラム中のストレプトアビジン被覆粒子上に結合したビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体へと動かされることと、
ｃ．捕捉された遊離Ｃ５を検出することであって、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５検出抗体が、毛細管作用によってＣＤに付着して、該抗Ｃ５検出抗体が、捕捉抗体によって結合されるエピトープとは異なるエピトープにおいてＣ５に結合し、前記ＣＤがＧｙｒｏｌａｂｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、該検出抗体が、カラム中のストレプトアビジン被覆粒子上に結合された捕捉抗体に結合された遊離Ｃ５へと動かされることと、
ｄ．レーザー誘導蛍光検出を使用して、捕捉された遊離Ｃ５を定量化することと、を含む。

他の態様では、試料からの遊離（非結合）ヒトＣ５補体タンパク質（Ｃ５）を定量化する方法を提供するものであって、該方法が、ａ．ストレプトアビジン被覆されたメソスケールディスカバリー（ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標））（ＭＳＤ（登録商標））（メリーランド州ロックビルのＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ社、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｅｓｏｓｃａｌｅ．ｃｏｍ／ｅｎ）９６ウェルアッセイプレートに対して、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体を結合させることと、ｂ．試料を該プレートに添加することによって、試料中の遊離（非結合）Ｃ５を捕捉することと、ｃ．ｓｕｌｆｏ－ｔａｇ標識した抗Ｃ５（特定の実施形態では、ルテニル化（ｒｕｔｈｅｎｙｌｅｄ）されたｓｕｌｆｏ－ｔａｇ標識した抗Ｃ５）検出抗体をプレートに添加することにより捕捉された遊離Ｃ５を検出することと、ｄ．電気化学発光を使用して、捕捉された遊離Ｃ５を定量化することと、を含むものであって、試料が約１：２で希釈され、試料が氷上に保持され、工程ｂ～ｃは約１５～３０分であり、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体は、約５μｇ／ｍＬの濃度で添加される。

Claims

抗Ｃ５抗体での治療前および治療後のヒト患者から得た試料中で、非結合のヒトＣ５補体タンパク質（Ｃ５）を定量化する方法であって、前記方法が、
ａ．ストレプトアビジン被覆粒子に対して、ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体を結合させることであって、該ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、該ストレプトアビジン被覆粒子を含むカラムを備えるＧｙｒｏｓＢｉｏａｆｆｙ２００コンパクトディスク（ＣＤ）に毛細管作用によって付着して、該ＣＤがＧｙｒｏｌａｂｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、該ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体が、該カラム中の該ストレプトアビジン被覆粒子へと動かされることと、
ｂ．該試料中の非結合Ｃ５を捕捉することであって、該試料が毛細管作用によって該ＣＤに付着して、該ＣＤがＧｙｒｏｌａｂｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、該試料が、該カラム中の該ストレプトアビジン被覆粒子に結合した該ビオチン化抗Ｃ５捕捉抗体へと動かされることと、
ｃ．捕捉されたＣ５を検出することであって、アレクサフルオール（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）標識抗Ｃ５検出抗体が、毛細管作用によって該ＣＤに付着し、該抗Ｃ５検出抗体が、該捕捉抗体によって結合されるエピトープとは異なるエピトープにおいてＣ５に結合し、該ＣＤがＧｙｒｏｌａｂｘＰｌｏｒｅまたはＧｙｒｏｌａｂＸＰ機器内で遠心力を受けることによって、該検出抗体が、該カラム中の該ストレプトアビジン被覆粒子に結合された該捕捉抗体に結合されたＣ５へと動かされることと、
ｄ．レーザー誘導蛍光検出を使用して、捕捉されたＣ５を定量化することと、
を含み、該治療前の試料が少なくとも１：２０で希釈され、該治療後の試料が約１：２で希釈される、方法。
工程ｄから得たデータを、Ｃ５枯渇試料に添加した既知の量のＣ５から作成した標準曲線と比較することによって、Ｃ５抗体の濃度または量を計算することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
試料の希釈に、ＲｅｘｘｉｐＡ緩衝液が使用され、前記検出抗体の希釈に、ＲｅｘｘｉｐＦ緩衝液が使用される、請求項１に記載の方法。
前記機器を、０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０および０．０２％のアジ化ナトリウムと共にＰＢＳを含む洗浄緩衝液ならびにｐＨ１１緩衝液を用いて別個に二回プライミングすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記ＧｙｒｏｓＢｉｏａｆｆｙ２００ＣＤが、前記抗Ｃ５抗体について０．０１５μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬのダイナミックレンジを持つ、請求項１に記載の方法。
前記治療後の試料が約１：３０希釈で希釈される、請求項５に記載の方法。
前記試料が、ヒト患者から得た血清試料または血漿試料である、請求項１に記載の方法。
前記患者が抗Ｃ５抗体での治療を受けている、請求項１に記載の方法。
前記患者が、
（ａ）配列番号９、１０、１１の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３ドメインと、配列番号１２、１３および１４の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン；または
（ｂ）配列番号２８、２９、１１の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３ドメインと、配列番号１２、１３および１４の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン
を含む抗体での治療を受けている、請求項８に記載の方法。
前記抗Ｃ５検出抗体が、Ｎ１９－８（マウス抗ヒトＣ５抗体）である、請求項１に記載の方法。