JP2022049718A - アデノ随伴ウイルスを用いたｃｘ３ｃｌ１遺伝子の導入による網膜変性疾患の治療 - Google Patents
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Abstract
【課題】遺伝子治療による網膜変性疾患の予防又は治療方法、及び、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供する。【解決手段】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、特にＡＡＶ８ベクターを用いたＣＸ３ＣＬ１遺伝子の導入が錐体細胞保護作用を示し、ＣＸ３ＣＬ１遺伝子を搭載したＡＡＶベクター、特にＡＡＶ８ベクターが、網膜変性疾患の予防及び／又は治療剤として使用できる。【選択図】なし
Description
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）を用いたＣＸ３ＣＬ１遺伝子の導入による網膜変性疾患の予防又は治療方法、及び、ＣＸ３ＣＬ１遺伝子を搭載したＡＡＶベクターを有効成分として含む、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。
網膜は眼底に位置する組織であり、光の情報を電気信号に変え、脳に刺激を伝える役割を持つ。組織学的に幾つかの層に分けることができ、外側から網膜色素上皮層、内節・外節層、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層に分けられる。光刺激を電気信号に変換する役割を担う視細胞は核を外顆粒層に持ち、外節に光に反応するタンパク質オプシンを発現する。また、視細胞はそれぞれ暗所と明所で機能する杆体細胞と錐体細胞に分類できる。ヒトの網膜においては、杆体細胞は周辺部に位置し、錐体細胞は黄斑に密集している（中心窩に一番多い）ことが知られ、このため、杆体細胞は周辺視野を、錐体細胞は中心視野及び視力をつかさどることが知られている。
網膜色素変性症（Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ：ＲＰ）は、杆体細胞、錐体細胞、又は網膜色素上皮細胞における遺伝子変異が原因で視細胞及び網膜色素上皮細胞が変性する、数千人に一人の頻度で発症する病気である。多くの場合は杆体細胞に何らかの変異が認められ、まず杆体細胞の変性が発生し、患者は夜盲及び視野狭窄を経験する。更に病気が進行すると、二次的に錐体細胞の変性が起き、中心視力の低下及び最終的な失明に至る。現在、治療法は確立されておらず、患者の視覚機能を回復又は維持させる治療法が望まれている。
黄斑ジストロフィーは、錐体細胞が密集する黄斑が徐々に障害を受けることにより視力低下をきたす、遺伝性進行性疾患である。黄斑ジストロフィーは、スタルガルト黄斑ジストロフィー又は黄色斑眼底としても公知のスタルガルト病を含む。黄斑ジストロフィーは錐体細胞機能障害にともなう色覚異常、中心視力低下又は中心視野異常によって特徴付けられる。
錐体杆体ジストロフィー（Ｃｏｎｅ－ｒｏｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ＣＲＤ）及び杆体錐体ジストロフィー（Ｒｏｄ－ｃｏｎｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ＲＣＤ）は、錐体細胞及び杆体細胞の変性を引き起こし、多くの場合盲目をもたらす、遺伝性進行性疾患である。ＣＲＤは、錐体細胞の生存性低下又は細胞死と、続く杆体細胞の生存性低下又は細胞死によって特徴付けられる。対照的に、ＲＣＤは、杆体細胞の生存性低下又は細胞死と、続く錐体細胞の生存性低下又は細胞死によって特徴付けられる。
加齢性黄斑変性症（Ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＡＭＤ）は、黄斑変性症とも称され、高齢者に盲目を引き起こす病態である。加齢性黄斑変性症は、滲出性及び非滲出性のＡＭＤの両方を含む。非滲出性のＡＭＤは、ドライ型、萎縮性、又はドルーゼノイド（ｄｒｕｓｅｎｏｉｄ）（加齢性）黄斑変性症としても公知である。非滲出性のＡＭＤにおいて、ドルーゼンは、網膜色素上皮細胞に隣接するブルッフ膜に典型的に蓄積する。続いて、ドルーゼン及び障害された網膜色素上皮細胞が、黄斑における錐体細胞の機能に干渉すると、視力喪失が起こり得る。非滲出性のＡＭＤは、長年にわたり漸進的な視力喪失を生じる。非滲出性のＡＭＤは、滲出性のＡＭＤをもたらし得る。滲出性のＡＭＤは、ウェット型又は血管新生黄斑症としても知られ、急速に進行し、中心視力に重度の損傷を引き起こし得る。
マイクログリアは網膜内に存在するグリア細胞の一つである。近年、マイクログリアの網膜色素変性症における有害な作用が複数報告されており、新たな標的細胞として注目されている。正常な網膜ではマイクログリアは内網状層及び外網状層に局在するが、網膜色素変性症においては、外顆粒層に浸潤することが報告されている。浸潤したマイクログリアは活性化した形態をとっており、高い貪食機能を持っている。マイクログリアは一般的に、細胞死を起こした細胞の残骸を貪食し、除去することが知られているが、網膜色素変性症においては、マイクログリアが生きている視細胞も過剰に貪食してしまい、病態の進行を速めることが報告されている（非特許文献１）。また、活性化したマイクログリアはＴＮＦα等のサイトカインを放出し、それら自体が更なる視細胞の変性を誘導することも知られている。実際に、網膜色素変性症のモデルマウスであるｒｄ１０マウスにおいてマイクログリアの活性を抑制させると、病態進行を遅延できることが報告されている（Ｐｅｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１４年、第３４巻、８１３９～８１５０頁）。よって、マイクログリアを標的とする新規薬剤探索は網膜色素変性症の進行を抑制する新たな治療選択肢になる可能性がある。
ＣＸ３ＣＬ１（ＦＫＮ，フラクタルカイン）は、ＣＸ３Ｃサブファミリーに属する唯一の遺伝子であり、正常な神経において恒常的に発現しているケモカインである。マイクログリアではその唯一の受容体であるＣＸ３ＣＲ１が発現している。ＣＸ３ＣＬ１はＮ末端からシグナルペプチド、ケモカインドメイン、ムチン様ストークドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインに分けられる。ＣＸ３ＣＬ１は膜貫通タンパク質として発現されるが、細胞外切断酵素であるＡＤＡＭ－１０やＡＤＡＭ－１７、カテプシンＳなどにより細胞外領域の根元が切断され、可溶型タンパク質として存在することが知られている。また、ＣＸ３ＣＬ１／ＣＸ３ＣＲ１シグナル経路はマイクログリアを非活性化状態に保つ機能を持つことが知られている。
網膜色素変性症においては、リコンビナントＣＸ３ＣＬ１タンパク質を硝子体内投与することにより、マイクログリアの活性抑制及び病態の進行抑制を誘導することが報告されている（非特許文献１）。
パーキンソン病及びアルツハイマー病においては、可溶型ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸を搭載したＡＡＶ９ベクターが、神経細胞脱落を抑制することが報告されている（特許文献１、非特許文献２、３及び４）。また、可溶型ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸を搭載したＡＡＶ４ベクターを脳室内に投与した結果、可溶型ＣＸ３ＣＬ１の分泌が確認されたことが記載されている（非特許文献５）。
Ｚａｂｅｌら、Ｇｌｉａ、２０１６年、第６４巻、１４７９～１４９１頁
Ｎａｓｈら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、２０１５年、第２３巻、１７～２３頁
Ｎａｓｈら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ａｇｉｎｇ、２０１３年、第３４巻、１５４０～１５４８頁
Ｍｏｒｇａｎｔｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１２年、第３２巻、１４５９２～１４６０１頁
Ｆｉｎｎｅｒａｎら、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２０１５年、第２４巻、７５７頁
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いたＣＸ３ＣＬ１遺伝子の導入による網膜変性疾患の予防又は治療方法、及び、ＣＸ３ＣＬ１遺伝子を搭載したＡＡＶベクターを有効成分として含む、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供する。
本発明者らは、網膜変性疾患の遺伝子治療について鋭意検討した結果、ＡＡＶベクター、特にＡＡＶ８ベクターを用いたＣＸ３ＣＬ１遺伝子の導入が錐体細胞保護作用を示すこと、ＣＸ３ＣＬ１遺伝子を搭載したＡＡＶベクター、特にＡＡＶ８ベクターが、網膜変性疾患の予防又は治療剤として使用できることを知見して本発明を完成した。
本発明のある態様を以下に示す。
（１）ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物。
（２）前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（１）に記載の医薬組成物。
（３）前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（２）に記載の医薬組成物。
（４）前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（３）に記載の医薬組成物。
（５）前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターである、（１）乃至（４）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（６）前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、（１）乃至（５）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（７）前記ＡＡＶベクターが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含むＡＡＶ８ベクターである、（１）に記載の医薬組成物。
（８）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（１）乃至（７）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（９）進行期の網膜色素変性症の治療用である（８）に記載の医薬組成物。
（１０）網膜下に投与するための、（１）乃至（９）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（１１）硝子体内に投与するための、（１）乃至（９）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（１）ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物。
（２）前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（１）に記載の医薬組成物。
（３）前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（２）に記載の医薬組成物。
（４）前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（３）に記載の医薬組成物。
（５）前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターである、（１）乃至（４）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（６）前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、（１）乃至（５）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（７）前記ＡＡＶベクターが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含むＡＡＶ８ベクターである、（１）に記載の医薬組成物。
（８）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（１）乃至（７）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（９）進行期の網膜色素変性症の治療用である（８）に記載の医薬組成物。
（１０）網膜下に投与するための、（１）乃至（９）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（１１）硝子体内に投与するための、（１）乃至（９）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
本発明の別の態様を以下に示す。
（１２）ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの治療有効量を対象に投与することを含む、網膜変性疾患の予防又は治療方法。
（１３）前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（１２）に記載の方法。
（１４）前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（１３）に記載の方法。
（１５）前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（１４）に記載の方法。
（１６）前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターである、（１２）乃至（１５）のいずれか１つに記載の方法。
（１７）前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、（１２）乃至（１６）のいずれか１つに記載の方法。
（１８）前記ＡＡＶベクターが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含むＡＡＶ８ベクターである、（１２）に記載の方法。
（１９）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（１２）乃至（１８）のいずれか１つに記載の方法。
（２０）進行期の網膜色素変性症の治療のための（１９）に記載の方法。
（２１）投与がＡＡＶベクターの網膜下への投与である、（１２）乃至（２０）のいずれか１つに記載の方法。
（２２）投与がＡＡＶベクターの硝子体内への投与である、（１２）乃至（２０）のいずれか１つに記載の方法。
（１２）ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの治療有効量を対象に投与することを含む、網膜変性疾患の予防又は治療方法。
（１３）前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（１２）に記載の方法。
（１４）前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（１３）に記載の方法。
（１５）前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（１４）に記載の方法。
（１６）前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターである、（１２）乃至（１５）のいずれか１つに記載の方法。
（１７）前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、（１２）乃至（１６）のいずれか１つに記載の方法。
（１８）前記ＡＡＶベクターが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含むＡＡＶ８ベクターである、（１２）に記載の方法。
（１９）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（１２）乃至（１８）のいずれか１つに記載の方法。
（２０）進行期の網膜色素変性症の治療のための（１９）に記載の方法。
（２１）投与がＡＡＶベクターの網膜下への投与である、（１２）乃至（２０）のいずれか１つに記載の方法。
（２２）投与がＡＡＶベクターの硝子体内への投与である、（１２）乃至（２０）のいずれか１つに記載の方法。
本発明の別の態様を以下に示す。
（２３）網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物の製造のためのＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用。
（２４）前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（２３）に記載の使用。
（２５）前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（２４）に記載の使用。
（２６）前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（２５）に記載の使用。
（２７）前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターである、（２３）乃至（２６）のいずれか１つに記載の使用。
（２８）前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、（２３）乃至（２７）のいずれか１つに記載の使用。
（２９）前記ＡＡＶベクターが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含むＡＡＶ８ベクターである、（２３）に記載の使用。
（３０）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（２３）乃至（２９）のいずれか１つに記載の使用。
（３１）進行期の網膜色素変性症の治療用医薬組成物の製造のための（３０）に記載の使用。
（３２）医薬組成物が網膜下に投与するための医薬組成物である、（２３）乃至（３１）のいずれか１つに記載の使用。
（３３）医薬組成物が硝子体内に投与するための医薬組成物である、（２３）乃至（３１）のいずれか１つに記載の使用。
（２３）網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物の製造のためのＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用。
（２４）前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（２３）に記載の使用。
（２５）前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（２４）に記載の使用。
（２６）前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（２５）に記載の使用。
（２７）前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターである、（２３）乃至（２６）のいずれか１つに記載の使用。
（２８）前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、（２３）乃至（２７）のいずれか１つに記載の使用。
（２９）前記ＡＡＶベクターが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含むＡＡＶ８ベクターである、（２３）に記載の使用。
（３０）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（２３）乃至（２９）のいずれか１つに記載の使用。
（３１）進行期の網膜色素変性症の治療用医薬組成物の製造のための（３０）に記載の使用。
（３２）医薬組成物が網膜下に投与するための医薬組成物である、（２３）乃至（３１）のいずれか１つに記載の使用。
（３３）医薬組成物が硝子体内に投与するための医薬組成物である、（２３）乃至（３１）のいずれか１つに記載の使用。
本発明の別の態様を以下に示す。
（３４）網膜変性疾患の予防又は治療のためのＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用。
（３５）前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（３４）に記載の使用。
（３６）前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（３５）に記載の使用。
（３７）前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（３６）に記載の使用。
（３８）前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターである、（３４）乃至（３７）のいずれか１つに記載の使用。
（３９）前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、（３４）乃至（３８）のいずれか１つに記載の使用。
（４０）前記ＡＡＶベクターが配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含むＡＡＶ８ベクターである、（３４）に記載の使用。
（４１）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（３４）乃至（４０）のいずれか１つに記載の使用。
（４２）進行期の網膜色素変性症の治療のための（４１）に記載の使用。
（４３）予防又は治療がＡＡＶベクターを網膜下に投与することによる、（３４）乃至（４２）のいずれか１つに記載の使用。
（４４）予防又は治療がＡＡＶベクターを硝子体内に投与することによる、（３４）乃至（４２）のいずれか１つに記載の使用。
（３４）網膜変性疾患の予防又は治療のためのＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用。
（３５）前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（３４）に記載の使用。
（３６）前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（３５）に記載の使用。
（３７）前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（３６）に記載の使用。
（３８）前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターである、（３４）乃至（３７）のいずれか１つに記載の使用。
（３９）前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、（３４）乃至（３８）のいずれか１つに記載の使用。
（４０）前記ＡＡＶベクターが配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含むＡＡＶ８ベクターである、（３４）に記載の使用。
（４１）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（３４）乃至（４０）のいずれか１つに記載の使用。
（４２）進行期の網膜色素変性症の治療のための（４１）に記載の使用。
（４３）予防又は治療がＡＡＶベクターを網膜下に投与することによる、（３４）乃至（４２）のいずれか１つに記載の使用。
（４４）予防又は治療がＡＡＶベクターを硝子体内に投与することによる、（３４）乃至（４２）のいずれか１つに記載の使用。
本発明の別の態様を以下に示す。
（４５）ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）８ベクター。
（４６）前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（４５）に記載のＡＡＶ８ベクター。
（４７）前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（４６）に記載のＡＡＶ８ベクター。
（４８）前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（４７）に記載のＡＡＶ８ベクター。
（４９）前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、（４５）乃至（４８）のいずれか１つに記載のＡＡＶ８ベクター。
（５０）ＡＡＶ８ベクターが、自己相補型ＡＡＶ８ベクターである、（４５）乃至（４９）のいずれか１つに記載のＡＡＶ８ベクター。
（５１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含む、（４５）に記載のＡＡＶ８ベクター。
（５２）前記ＡＡＶ８ベクターが、自己相補型ＡＡＶ８ベクターである、（５１）に記載のＡＡＶ８ベクター。
（５３）（４５）乃至（５２）のいずれか１つに記載のＡＡＶ８ベクター、及び一以上の賦形剤を含有する医薬組成物。
（５４）網膜変性疾患の予防又は治療用である（５３）に記載の医薬組成物。
（５５）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（５４）に記載の医薬組成物。
（５６）進行期の網膜色素変性症の治療用である（５５）に記載の医薬組成物。
（５７）網膜下に投与するための、（５３）乃至（５６）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（５８）硝子体内に投与するための、（５３）乃至（５６）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（５９）（４５）乃至（５２）のいずれか１つに記載のＡＡＶ８ベクターを用いて、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子を視細胞及び／又は網膜色素上皮細胞に導入することを含む、網膜変性疾患の予防又は治療方法。
（６０）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（５９）に記載の方法。
（６１）進行期の網膜色素変性症の治療のための（６０）に記載の方法。
（４５）ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）８ベクター。
（４６）前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（４５）に記載のＡＡＶ８ベクター。
（４７）前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（４６）に記載のＡＡＶ８ベクター。
（４８）前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（４７）に記載のＡＡＶ８ベクター。
（４９）前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、（４５）乃至（４８）のいずれか１つに記載のＡＡＶ８ベクター。
（５０）ＡＡＶ８ベクターが、自己相補型ＡＡＶ８ベクターである、（４５）乃至（４９）のいずれか１つに記載のＡＡＶ８ベクター。
（５１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含む、（４５）に記載のＡＡＶ８ベクター。
（５２）前記ＡＡＶ８ベクターが、自己相補型ＡＡＶ８ベクターである、（５１）に記載のＡＡＶ８ベクター。
（５３）（４５）乃至（５２）のいずれか１つに記載のＡＡＶ８ベクター、及び一以上の賦形剤を含有する医薬組成物。
（５４）網膜変性疾患の予防又は治療用である（５３）に記載の医薬組成物。
（５５）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（５４）に記載の医薬組成物。
（５６）進行期の網膜色素変性症の治療用である（５５）に記載の医薬組成物。
（５７）網膜下に投与するための、（５３）乃至（５６）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（５８）硝子体内に投与するための、（５３）乃至（５６）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（５９）（４５）乃至（５２）のいずれか１つに記載のＡＡＶ８ベクターを用いて、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子を視細胞及び／又は網膜色素上皮細胞に導入することを含む、網膜変性疾患の予防又は治療方法。
（６０）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（５９）に記載の方法。
（６１）進行期の網膜色素変性症の治療のための（６０）に記載の方法。
ＣＸ３ＣＬ１遺伝子を搭載したＡＡＶベクターは、網膜変性疾患の予防及び／又は治療剤として使用できる。
以下、本発明について詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書中で使用される用語が具体的に定義されていない場合、当該用語は、当業者に一般的に受け入れられている意味で使用される。
本発明は、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（以下、「本発明のＡＡＶベクター」とも称する）、並びに、本発明のＡＡＶベクターを含む、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」とも称する）を提供する。
＜本発明のＡＡＶベクター＞
１．ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子
本発明のＡＡＶベクターは、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子を含む。ＣＸ３ＣＬ１は、正常な神経において恒常的に発現しているケモカインであり、Ｎ末端からシグナルペプチド、ケモカインドメイン、ムチン様ストークドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインから構成される。天然において、ＣＸ３ＣＬ１は膜貫通タンパク質として発現されるが、細胞外切断酵素で切断され、可溶型ＣＸ３ＣＬ１としても存在できる。
１．ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子
本発明のＡＡＶベクターは、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子を含む。ＣＸ３ＣＬ１は、正常な神経において恒常的に発現しているケモカインであり、Ｎ末端からシグナルペプチド、ケモカインドメイン、ムチン様ストークドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインから構成される。天然において、ＣＸ３ＣＬ１は膜貫通タンパク質として発現されるが、細胞外切断酵素で切断され、可溶型ＣＸ３ＣＬ１としても存在できる。
本発明において、ＣＸ３ＣＬ１には、天然に存在するＣＸ３ＣＬ１及びその機能を有する改変体が含まれる。ある態様では、ＣＸ３ＣＬ１は、哺乳動物由来のＣＸ３ＣＬ１であり、ある態様では、ヒトＣＸ３ＣＬ１である。本発明において、ヒトＣＸ３ＣＬ１には、天然に存在するヒトＣＸ３ＣＬ１及びその機能を有する改変体が含まれる。
本発明において、ＣＸ３ＣＬ１には、全長型（膜貫通型）ＣＸ３ＣＬ１及び可溶型ＣＸ３ＣＬ１が含まれる。ある態様では、ＣＸ３ＣＬ１は、可溶型ＣＸ３ＣＬ１である。本発明において、「可溶型ＣＸ３ＣＬ１」とは、ケモカインドメイン及びムチン様ストークドメインを含み、かつ、膜貫通ドメインと細胞内ドメインを含まないＣＸ３ＣＬ１ポリペプチドをいう。可溶型ＣＸ３ＣＬ１には、天然に存在する可溶型ＣＸ３ＣＬ１及びその機能を有する改変体が含まれる。ある態様では、ＣＸ３ＣＬ１は、ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である。本発明において、ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１には、天然に存在するヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１及びその機能を有する改変体が含まれる。
ある態様では、ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１は、アクセッション番号ＮＭ＿００２９９６．６のコーディング領域（配列番号１）を翻訳した配列（配列番号２）のアミノ酸番号１から３３８までのアミノ酸配列（配列番号４）からなるポリペプチドである。別の態様では、ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１～数個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～７個、さらに好ましくは１～５個、１～３個、又は１～２個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１の機能を有するポリペプチドである。別の態様では、ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１は、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１の機能を有するポリペプチドである。
ある態様では、ＣＸ３ＣＬ１は、マウスＣＸ３ＣＬ１であり、ある態様では、マウス可溶型ＣＸ３ＣＬ１である。ある態様では、マウス可溶型ＣＸ３ＣＬ１は、アクセッション番号ＮＭ＿００９１４２．３のコーディング領域（配列番号５）を翻訳した配列（配列番号６）のアミノ酸番号１から３３６までのアミノ酸配列（配列番号８）からなるポリペプチドである。
本明細書において、「同一性」とは、ＥＭＢＯＳＳ ＮＥＥＤＬＥ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９７０年、第４８巻、４４３～４５３頁）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下の通りである。
Ｇａｐ Ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１０
Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５
Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２
Ｇａｐ Ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１０
Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５
Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２
本発明において、ＣＸ３ＣＬ１又は可溶型ＣＸ３ＣＬ１の機能として、ＣＸ３ＣＲ１受容体に結合する能力が挙げられる。また、ＣＸ３ＣＬ１又は可溶型ＣＸ３ＣＬ１の機能として、マイクログリアの活性を抑制する能力が挙げられる。このようなＣＸ３ＣＬ１の機能は、公知の方法を用いて当業者に容易に評価され得る。
ある態様では、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子であり、ある態様では、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる核酸分子である。
ＣＸ３ＣＬ１をコードする「核酸分子」には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）並びにヌクレオチドアナログを使用して生成されるＤＮＡ又はＲＮＡのアナログが含まれる。当該核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、ある態様としては、一本鎖ＤＮＡである。
ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子は、公的に利用可能な配列情報に基づき、当該分野で公知の標準的なポリヌクレオチド合成法を使用して合成することができる。また、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子を一旦取得すれば、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８７、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ ８．１－８．５）等の当業者に公知の方法を使用して、所定の部位に変異を導入することによって、ＣＸ３ＣＬ１の機能を有する改変体を作製することも可能である。
２．ＡＡＶベクター
本発明では、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子を搭載するベクターとしてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用する。ＡＡＶは、ＡＡＶの宿主細胞への感染や複製に必要な機能をコードする遺伝子（Ｒｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子）及び末端逆位反復配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ：ＩＴＲ）を含む一本鎖ＤＮＡ分子からなるゲノム（ＡＡＶゲノム）を有するエンベロープを持たない正十二面体ウイルスである。ＡＡＶは、非病原性であり、非***期の細胞へも感染できることが知られている。ＡＡＶには１００を超える血清型が存在しており、血清型の違いによって宿主域やウイルスの持つ特徴が異なることが知られている。ＡＡＶベクターは、キャプシド、及びそれに封入された、１つ以上のＩＴＲが隣接した異種核酸分子配列を含むゲノム（ＡＡＶベクターゲノム）を含む。
本発明では、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子を搭載するベクターとしてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用する。ＡＡＶは、ＡＡＶの宿主細胞への感染や複製に必要な機能をコードする遺伝子（Ｒｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子）及び末端逆位反復配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ：ＩＴＲ）を含む一本鎖ＤＮＡ分子からなるゲノム（ＡＡＶゲノム）を有するエンベロープを持たない正十二面体ウイルスである。ＡＡＶは、非病原性であり、非***期の細胞へも感染できることが知られている。ＡＡＶには１００を超える血清型が存在しており、血清型の違いによって宿主域やウイルスの持つ特徴が異なることが知られている。ＡＡＶベクターは、キャプシド、及びそれに封入された、１つ以上のＩＴＲが隣接した異種核酸分子配列を含むゲノム（ＡＡＶベクターゲノム）を含む。
本発明で使用されるＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第７，０５６，５０２号及びＹａｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、２００２年、７６巻、２０４３～２０５３頁に記載されているＡＡＶベクターであり、具体的には、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ２／８ベクター（例えば、Ｎａｔｈｗａｎｉら、２０１１年、３６５巻、２３５７～２３６５頁）等である。ある態様では、本発明で使用されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８ベクターである（例えば、国際公開第２００３／０５２０５１号）。本発明で使用されるＡＡＶベクターに含まれるＩＴＲは、野生型の配列であってもよく、或いは、ＩＴＲの機能を有する改変体又は後述の自己相補型ベクターで使用される変異を含むＩＴＲ（変異ＩＴＲ）であってもよい。ある態様では、本発明で使用されるＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等に由来のＩＴＲ又はその変異ＩＴＲである。ある態様では、本発明で使用されるＩＴＲは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ又はその変異ＩＴＲである。
ある態様では、本発明で使用されるＡＡＶベクターは、自己相補型ＡＡＶ（Ｓｅｌｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ（ｓｃ））ＡＡＶ）ベクターである。ある態様では、本発明で使用されるＡＡＶベクターは、自己相補型ＡＡＶ８ベクターである。自己相補型ＡＡＶベクターは、自己相補性のＡＡＶベクターゲノムを有するＡＡＶベクターである（例えば、国際公開第２００１／０９２５５１号、国際公開第２００１／０１１０３４号）。通常のＡＡＶベクターでは、ベクターゲノムが一本鎖ＤＮＡであるために宿主細胞への感染後に一本鎖ゲノムから二本鎖ゲノムを形成ためには時間がかかる。一方、自己相補型ＡＡＶベクターでは、連結された異種核酸分子配列とその相補配列を有するベクターゲノム（自己相補性ベクターゲノム）を含み、宿主細胞内で速やかに二本鎖ゲノムを形成する。自己相補型ＡＡＶベクターのある態様において、変異ＩＴＲによって連結された異種核酸分子配列とその相補配列を含み、さらに両端に２つのＩＴＲを有する。変異ＩＴＲはＤシーケンス（パッケージングシグナル）が欠損し、Δｔｒｓ（末端切断領域（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）の変異）が含まれる構造を有する。当該構造はＲｅｐを介したニッキングを防ぎ、自己相補性ベクターゲノムのパッケージングを誘導することができる。
３．プロモーター
本発明のＡＡＶベクターは、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。「作動可能に連結された」とは、目的の核酸分子にコードされたタンパク質が宿主細胞において発現可能なように１以上のプロモーターが目的の核酸分子に連結されていることを意味する。本発明において使用されるプロモーターとしては、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来プロモーター、並びに当業者に公知の他のウイルス及び真核細胞プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。ある態様として、本発明において使用されるプロモーターは、ＣＭＶ由来プロモーターである。ある態様として、本発明において使用されるプロモーターは、組織特異的プロモーターである。組織特異的プロモーターの例としては、網膜色素上皮細胞特異的プロモーター、視細胞特異的プロモーター、杆体細胞特異的プロモーター、及び錐体細胞特異的プロモーターが挙げられる。より具体的な例としては、Ｎｒｌ、Ｃｒｘ、Ｒａｘ（Ｍａｔｓｕｄａ及びＣｅｐｋｏ、２００７年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０４巻、１０２７～１０３２頁）、オプシンプロモーター、光受容体間レチノイド結合タンパク質プロモーター（ＩＲＢＰ１５６）、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、神経ロイシンジッパー（ＮＲＬＬ）プロモーター（例えば、Ｓｅｍｐｌｅ－Ｒｏｗｌａｎｄら、Ｍｏｌ． Ｖｉｓ．、２０１０年、１６巻、９１６～９３４頁を参照）が挙げられる。別の態様としては、錐体アレスチンプロモーター、Ｃａｂｐ５プロモーター、Ｃｒａｌｂｐプロモーター、Ｎｄｒｇ４プロモーター、ベストロフィン１プロモーター、チキンベータアクチン（ＣＢＡプロモーター）、クラスタリンプロモーター、Ｈｅｓ１プロモーター、ビメンチンプロモーター、表面抗原分類（ＣＤ４４）プロモーター及びグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターが挙げられる。
本発明のＡＡＶベクターは、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。「作動可能に連結された」とは、目的の核酸分子にコードされたタンパク質が宿主細胞において発現可能なように１以上のプロモーターが目的の核酸分子に連結されていることを意味する。本発明において使用されるプロモーターとしては、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来プロモーター、並びに当業者に公知の他のウイルス及び真核細胞プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。ある態様として、本発明において使用されるプロモーターは、ＣＭＶ由来プロモーターである。ある態様として、本発明において使用されるプロモーターは、組織特異的プロモーターである。組織特異的プロモーターの例としては、網膜色素上皮細胞特異的プロモーター、視細胞特異的プロモーター、杆体細胞特異的プロモーター、及び錐体細胞特異的プロモーターが挙げられる。より具体的な例としては、Ｎｒｌ、Ｃｒｘ、Ｒａｘ（Ｍａｔｓｕｄａ及びＣｅｐｋｏ、２００７年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０４巻、１０２７～１０３２頁）、オプシンプロモーター、光受容体間レチノイド結合タンパク質プロモーター（ＩＲＢＰ１５６）、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、神経ロイシンジッパー（ＮＲＬＬ）プロモーター（例えば、Ｓｅｍｐｌｅ－Ｒｏｗｌａｎｄら、Ｍｏｌ． Ｖｉｓ．、２０１０年、１６巻、９１６～９３４頁を参照）が挙げられる。別の態様としては、錐体アレスチンプロモーター、Ｃａｂｐ５プロモーター、Ｃｒａｌｂｐプロモーター、Ｎｄｒｇ４プロモーター、ベストロフィン１プロモーター、チキンベータアクチン（ＣＢＡプロモーター）、クラスタリンプロモーター、Ｈｅｓ１プロモーター、ビメンチンプロモーター、表面抗原分類（ＣＤ４４）プロモーター及びグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターが挙げられる。
本発明のＡＡＶベクターは、プロモーターの他にも、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙ（Ａ））、コザック配列等（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９０年、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）の発現調節配列を含んでもよい。
ある態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含む、ＡＡＶ８ベクターである。ある態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含む、自己相補型ＡＡＶ８ベクターである。
＜本発明のＡＡＶベクターを製造する方法＞
本発明のＡＡＶベクターは、当該分野で公知の方法を使用して製造することができる。製造方法の一例としては、第一に、野生型ＡＡＶゲノムから、両端のＩＴＲを残して、Ｒｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子の代わりに、異種核酸分子（例えば、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子）配列を挿入したＡＡＶベクタープラスミドを作製する。また、ＡＡＶヘルパー機能を補完するＡＡＶのＲｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子を含むプラスミド、及び、ＡＡＶの複製を促進するヘルパーウイルス付属遺伝子（例えば、領域ＶＡ、Ｅ２Ａ、Ｅ４）を含むプラスミドを準備する。これらの３つのプラスミドをパッケージング細胞にコトランスフェクトすることで該細胞内に組換ＡＡＶ（即ち、ＡＡＶベクター）が産生される。その後、パッケージング細胞を培養して、ＡＡＶベクターを生成し、当該分野において公知の標準的技術を使用して、ＡＡＶベクターを精製する。使用されるパッケージング細胞の例としては、哺乳動物細胞、具体的には、Ａ５４９細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ１７細胞が挙げられる。精製方法としては、塩化セシウム密度勾配遠心分離法、ベンゾナーゼを用いたＤＮＡ及びＲＮＡの消化、ショ糖勾配遠心分離法、イオジキサノール（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）密度勾配遠心分離法、限外ろ過法、ダイアフィルトレーション法、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、ポリエチレングリコール沈殿法や硫酸アンモニウム沈殿法などを用いることができる。
本発明のＡＡＶベクターは、当該分野で公知の方法を使用して製造することができる。製造方法の一例としては、第一に、野生型ＡＡＶゲノムから、両端のＩＴＲを残して、Ｒｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子の代わりに、異種核酸分子（例えば、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子）配列を挿入したＡＡＶベクタープラスミドを作製する。また、ＡＡＶヘルパー機能を補完するＡＡＶのＲｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子を含むプラスミド、及び、ＡＡＶの複製を促進するヘルパーウイルス付属遺伝子（例えば、領域ＶＡ、Ｅ２Ａ、Ｅ４）を含むプラスミドを準備する。これらの３つのプラスミドをパッケージング細胞にコトランスフェクトすることで該細胞内に組換ＡＡＶ（即ち、ＡＡＶベクター）が産生される。その後、パッケージング細胞を培養して、ＡＡＶベクターを生成し、当該分野において公知の標準的技術を使用して、ＡＡＶベクターを精製する。使用されるパッケージング細胞の例としては、哺乳動物細胞、具体的には、Ａ５４９細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ１７細胞が挙げられる。精製方法としては、塩化セシウム密度勾配遠心分離法、ベンゾナーゼを用いたＤＮＡ及びＲＮＡの消化、ショ糖勾配遠心分離法、イオジキサノール（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）密度勾配遠心分離法、限外ろ過法、ダイアフィルトレーション法、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、ポリエチレングリコール沈殿法や硫酸アンモニウム沈殿法などを用いることができる。
本発明のＡＡＶベクターの製造方法として、別の態様では、ＡＡＶベクターゲノムは、バキュロウイルスとしてパッケージングされ、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９細胞に導入されてもよい。この際、Ｒｅｐ及びＣａｐ遺伝子も別のバキュロウイルスによって同様に昆虫細胞に導入される。バキュロウイルスは、ＡＡＶベクターの効率的な産生のために必要な遺伝子を含んでいてもよい。次に、２種のバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を培養してＡＡＶベクターを生成し、当該分野で公知の方法を使用してＡＡＶベクターを精製し、製剤化することができる（例えば、米国特許第５４３６１４６号、同第５７５３５００号、同第６０９３５７０号、及び同第６５４８２８６号、ＵＳ２００２／０１６８３４２）。
＜本発明の医薬組成物＞
本発明の医薬組成物は、本発明のＡＡＶベクターを含む、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物である。網膜変性疾患とは、網膜組織を構成する細胞に障害が発生することにより、視機能に異常をきたす疾患の総称であり、杆体細胞の変性を伴う網膜疾患及び錐体細胞の変性を伴う網膜疾患を含む。ある態様では、網膜変性疾患は、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである。ある態様では、網膜変性疾患は、網膜色素変性症である。ある態様では、本発明の医薬組成物は、進行期の網膜色素変性症の治療用医薬組成物である。本明細書において「進行期の網膜色素変性症」とは、杆体細胞機能の消失が認められる時期以降の網膜色素変性症、光干渉断層撮影において外顆粒層の菲薄化を認める網膜色素変性症、矯正視力がｌｏｇＭＡＲ視力において２０／８０から２０／４００であることを認める網膜色素変性症、又は夜盲を認める網膜色素変性症をいう。杆体細胞機能の消失は暗順応網膜電図における振幅の消失を認めることで判断できる。また、中心視野が２０度以下に狭まることからも判断できる。
本発明の医薬組成物は、本発明のＡＡＶベクターを含む、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物である。網膜変性疾患とは、網膜組織を構成する細胞に障害が発生することにより、視機能に異常をきたす疾患の総称であり、杆体細胞の変性を伴う網膜疾患及び錐体細胞の変性を伴う網膜疾患を含む。ある態様では、網膜変性疾患は、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである。ある態様では、網膜変性疾患は、網膜色素変性症である。ある態様では、本発明の医薬組成物は、進行期の網膜色素変性症の治療用医薬組成物である。本明細書において「進行期の網膜色素変性症」とは、杆体細胞機能の消失が認められる時期以降の網膜色素変性症、光干渉断層撮影において外顆粒層の菲薄化を認める網膜色素変性症、矯正視力がｌｏｇＭＡＲ視力において２０／８０から２０／４００であることを認める網膜色素変性症、又は夜盲を認める網膜色素変性症をいう。杆体細胞機能の消失は暗順応網膜電図における振幅の消失を認めることで判断できる。また、中心視野が２０度以下に狭まることからも判断できる。
本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、すなわち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。ある態様では、本発明の医薬組成物は、本発明のＡＡＶベクター、及び一以上の賦形剤を含有する。これらの医薬組成物の剤型としては、例えば、注射用医薬組成物、及びその他の非経口用医薬組成物が挙げられ、眼内投与、網膜下投与、硝子体内投与、脈絡膜上投与等により投与することができる。ある態様では、本発明の医薬組成物は、網膜下又は硝子体内に投与される。本発明のＡＡＶベクターの製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、又は添加剤等を使用することができる。本発明の医薬組成物は、さらに、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント又は免疫賦活薬等、少量の補助的物質を含有することができる。
＜本発明の予防又は治療方法＞
本発明はまた、本発明のＡＡＶベクターの治療有効量を対象に投与することを含む、網膜変性疾患の予防又は治療方法（以下、「本発明の予防又は治療方法」ともいう）を提供する。ある態様では、本発明の予防又は治療方法は、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーの予防又は治療方法である。ある態様では、本発明の予防又は治療方法は、網膜色素変性症の予防又は治療方法である。ある態様では、本発明の予防又は治療方法は、進行期の網膜色素変性症を治療する方法である。
本発明はまた、本発明のＡＡＶベクターの治療有効量を対象に投与することを含む、網膜変性疾患の予防又は治療方法（以下、「本発明の予防又は治療方法」ともいう）を提供する。ある態様では、本発明の予防又は治療方法は、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーの予防又は治療方法である。ある態様では、本発明の予防又は治療方法は、網膜色素変性症の予防又は治療方法である。ある態様では、本発明の予防又は治療方法は、進行期の網膜色素変性症を治療する方法である。
本発明の予防又は治療方法において、「対象」とは、その予防又は治療を必要とするヒト又はその他の動物であり、ある態様では、その予防又は治療を必要とするヒトである。対象への「投与」には、眼内投与、硝子体内投与、網膜下投与、脈絡膜上投与等が含まれる。投与方法としては、注射（例えば、硝子体内又は網膜下又は脈絡膜上注射）、遺伝子銃、ゲル、エレクトロポレーション、脂質に基づくトランスフェクション試薬の使用、薬物送達デバイスの埋め込み、又は他のいずれかの適したトランスフェクション方法が挙げられる。
ある態様において、本発明のＡＡＶベクターは、硝子体内に投与される。硝子体内投与において、本発明のＡＡＶベクターは、懸濁液又は溶液等の剤型で送達され得る。硝子体内投与に際しては、例えば、最初に、眼の表面に局所麻酔剤を適用し、その後局所消毒溶液を適用する。器具を使用するか、又は使用せずに眼を開いたまま維持し、直接観察下、細く短い（例えば、３０ゲージの）針によって、強膜を通して対象の眼の硝子体腔内にベクターを注射する。硝子体内投与は他の眼内投与方法に比べて、比較的侵襲性が低いことが特徴である。
ある態様において、本発明のＡＡＶベクターは、網膜下に投与される。網膜下に投与されたＡＡＶベクターは、一般的に、視細胞や網膜色素上皮細胞（Ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：ＲＰＥ）等の細胞に導入されることが知られている（Ａｌｌｏｃｃａら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、２００７年、８１巻、１１３７２～１１３８０頁）。網膜下投与において、本発明のＡＡＶベクターは、懸濁液や溶液等の剤型で、直接観察下、手術用顕微鏡を使用して網膜下注射される。網膜下投与のある態様としては、硝子体切開後、微細なカニューレを使用して、１つ以上の小さな網膜切開を通して網膜下の空間に注射することが挙げられる。
ある態様において、本発明のＡＡＶベクターは、脈絡膜上投与（ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）される。脈絡膜上投与において、ベクターは、懸濁液又は溶液の剤型で投与される。最初に、眼の表面に局所麻酔剤を適用し、その後、局所消毒溶液を適用する。脈絡膜上投与に際しては、器具を使用するか、又は使用せずに、眼を開いたまま維持し、直接観察下、細く短い（例えば、３０ゲージの）針によって、対象の眼の脈絡膜上にＡＡＶベクターを注射する。
ある態様において、本発明の予防又は治療方法は、本発明のＡＡＶベクターを用いて本発明の核酸分子を視細胞及び／又は網膜色素上皮細胞に導入することを含む。
本発明のＡＡＶベクターの治療有効量は、疾患の重症度、以前の処置、対象の一般的な健康状態、年齢、投与方法、他の疾患等を考慮して適宜最適化され得る。ある態様では、本発明のＡＡＶベクターの治療有効量は、約０．００１～３０ｍｇ／ｋｇ体重、ある態様では約０．０１～２５ｍｇ／ｋｇ体重、別の態様では約０．１～２０ｍｇ／ｋｇ体重、別の態様では約１～１０ｍｇ／ｋｇ、２～９ｍｇ／ｋｇ、３～８ｍｇ／ｋｇ、４～７ｍｇ／ｋｇ又は５～６ｍｇ／ｋｇ体重である。本発明のＡＡＶベクターの治療有効量は１眼あたりに投与するベクターゲノムの量（ｖｇ／ｅｙｅ）でも表すことができる。ｖｇは、ゲノムコピー（ＧＣ）とも表記できる。ある態様では、本発明のＡＡＶベクターの治療有効量は、約１×１０6～１×１０12ｖｇ／ｅｙｅであり、別の態様では、約１×１０7～４×１０10ｖｇ／ｅｙｅである。本発明のＡＡＶベクターの治療有効量の投与には、単回投与、複数回投与、漸減投与、漸増投与が含まれる。ある態様では、本発明のＡＡＶベクターは、１日に少なくとも１、２、３、又は４回投与することができる。予防又は治療のための投与期間は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４週間の期間に及び得る。
本発明のＡＡＶベクターは、それが有効性を示すと考えられる疾患の種々の治療剤又は予防剤と併用することができる。当該併用は、同時投与、或いは別個に連続して、若しくは所望の時間間隔をおいて投与してもよい。同時投与製剤は、配合剤であっても別個に製剤化されていてもよい。
本発明はまた、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物の製造のための本発明のＡＡＶベクターの使用を提供する。本発明はまた、網膜変性疾患の予防又は治療のための本発明のＡＡＶベクターの使用を提供する。
本発明についてさらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
実施例１ コンストラクトの作製：クローニング、プラスミド作製、ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１作製
マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１の核酸分子配列を搭載したＡＡＶベクタープラスミドを、ｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳプラスミド（Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬａｂｓ社、カタログ番号ＶＰＫ－４３０)にマウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１核酸分子配列（配列番号７）をＢａｍＨＩ（５’側）とＸｂａＩ（３’側）制限酵素を使用し挿入して、作製した。得られたプラスミドをｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１と称する。マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１遺伝子はＣＭＶ由来プロモーターの下流、かつ、ＳＶ４０ ｐｏｌｙ（Ａ）の上流に位置しており、開始コドンの前にコザック配列(ＧＣＣＡＣＣ)が存在する。また、マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１遺伝子の下流に終止コドンを配置し、マウス全長ＣＸ３ＣＬ１アミノ酸配列（配列番号６）の内のアミノ酸番号１から３３６までのアミノ酸配列（配列番号８）を有するマウス可溶型ＣＸ３ＣＬ１が発現されるようにデザインした。ＩＴＲを含むＩＴＲ間の長さは１９６９ｂ．ｐ.であり、ＡＡＶベクターにパッケージできるサイズである。ｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１のベクターマップを図１に示す。このプラスミドをＳｔｂｌ３大腸菌株（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号Ｃ７３７３０３）を用いて増幅した。この他、組換ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）作製に必要なプラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（ＡＡＶｐｒｏ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＡＡＶ２）、タカラバイオ社、カタログ番号６２３０）及びｐＲＣＡＡＶ８をＤＨ５α大腸菌株（タカラバイオ社、カタログ番号９０５７）を用いて増幅した。ｐＲＣＡＡＶ８は、ｐＲＣ５（ＡＡＶｐｒｏ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｐｌａｓｍｉｄ （ＡＡＶ５）、タカラバイオ社、カタログ番号６６６４）のＣａｐ配列部分をＡＡＶ８のＣａｐ配列（アクセッション番号ＮＣ＿００６２６１．１の２１２１ｂ．ｐ.－４３３７ｂ．ｐ.）に変換したプラスミドである。１平方センチメートルあたり２５００細胞の密度でＨＥＫ２９３Ｔ１７細胞株を播種し、４日後にｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１、ｐＨｅｌｐｅｒ、及びｐＲＣＡＡＶ８を一過性にトランスフェクションし、３日間及び６日間培養した細胞培養上清を回収した。培養上清中に含まれるｒＡＡＶ８をｍＰＥＳ ＭｉｎｉＫｒｏｓ Ｓａｍｐｌｅｒ ３００ｋＤａ(Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ社、カタログ番号 Ｓ－０２－Ｅ３００－０５－Ｎ)を用いてタンジェンシャルフロー・フィルトレーション（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて濃縮した。濃縮されたサンプルを０．２２μｍフィルターにかけ、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いたアフィニティーカラムＰＯＲＯＳ（登録商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＡＡＶ８ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号Ａ３０７９０）で精製した。精製したサンプルを塩化セシウムの濃度勾配を利用した超遠心にかけた。この超遠心では垂直ローター（ＶＴｉ５０（ベックマン・コールター社、カタログ番号３６２７５８））を使用した。超遠心したサンプルにおいて、２８０ｎｍ及び２６０ｎｍの吸光測定値が高いフラクションを回収した。回収したサンプルをりん酸緩衝生理食塩水を用いて３回透析したものを、作製されたマウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ遺伝子を搭載したＡＡＶ８ベクター（ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１と称する）のストックとした。ウイルスタイター測定はＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ ＡＡＶ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ(Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ番号 ＶＰＫ－１４５)を用いて実施した。
マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１の核酸分子配列を搭載したＡＡＶベクタープラスミドを、ｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳプラスミド（Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬａｂｓ社、カタログ番号ＶＰＫ－４３０)にマウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１核酸分子配列（配列番号７）をＢａｍＨＩ（５’側）とＸｂａＩ（３’側）制限酵素を使用し挿入して、作製した。得られたプラスミドをｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１と称する。マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１遺伝子はＣＭＶ由来プロモーターの下流、かつ、ＳＶ４０ ｐｏｌｙ（Ａ）の上流に位置しており、開始コドンの前にコザック配列(ＧＣＣＡＣＣ)が存在する。また、マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１遺伝子の下流に終止コドンを配置し、マウス全長ＣＸ３ＣＬ１アミノ酸配列（配列番号６）の内のアミノ酸番号１から３３６までのアミノ酸配列（配列番号８）を有するマウス可溶型ＣＸ３ＣＬ１が発現されるようにデザインした。ＩＴＲを含むＩＴＲ間の長さは１９６９ｂ．ｐ.であり、ＡＡＶベクターにパッケージできるサイズである。ｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１のベクターマップを図１に示す。このプラスミドをＳｔｂｌ３大腸菌株（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号Ｃ７３７３０３）を用いて増幅した。この他、組換ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）作製に必要なプラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（ＡＡＶｐｒｏ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＡＡＶ２）、タカラバイオ社、カタログ番号６２３０）及びｐＲＣＡＡＶ８をＤＨ５α大腸菌株（タカラバイオ社、カタログ番号９０５７）を用いて増幅した。ｐＲＣＡＡＶ８は、ｐＲＣ５（ＡＡＶｐｒｏ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｐｌａｓｍｉｄ （ＡＡＶ５）、タカラバイオ社、カタログ番号６６６４）のＣａｐ配列部分をＡＡＶ８のＣａｐ配列（アクセッション番号ＮＣ＿００６２６１．１の２１２１ｂ．ｐ.－４３３７ｂ．ｐ.）に変換したプラスミドである。１平方センチメートルあたり２５００細胞の密度でＨＥＫ２９３Ｔ１７細胞株を播種し、４日後にｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１、ｐＨｅｌｐｅｒ、及びｐＲＣＡＡＶ８を一過性にトランスフェクションし、３日間及び６日間培養した細胞培養上清を回収した。培養上清中に含まれるｒＡＡＶ８をｍＰＥＳ ＭｉｎｉＫｒｏｓ Ｓａｍｐｌｅｒ ３００ｋＤａ(Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ社、カタログ番号 Ｓ－０２－Ｅ３００－０５－Ｎ)を用いてタンジェンシャルフロー・フィルトレーション（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて濃縮した。濃縮されたサンプルを０．２２μｍフィルターにかけ、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いたアフィニティーカラムＰＯＲＯＳ（登録商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＡＡＶ８ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号Ａ３０７９０）で精製した。精製したサンプルを塩化セシウムの濃度勾配を利用した超遠心にかけた。この超遠心では垂直ローター（ＶＴｉ５０（ベックマン・コールター社、カタログ番号３６２７５８））を使用した。超遠心したサンプルにおいて、２８０ｎｍ及び２６０ｎｍの吸光測定値が高いフラクションを回収した。回収したサンプルをりん酸緩衝生理食塩水を用いて３回透析したものを、作製されたマウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ遺伝子を搭載したＡＡＶ８ベクター（ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１と称する）のストックとした。ウイルスタイター測定はＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ ＡＡＶ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ(Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ番号 ＶＰＫ－１４５)を用いて実施した。
実施例２ コンストラクトの作製：クローニング、プラスミド作製、ｒＡＡＶ８－ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１作製
ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１の核酸分子配列を搭載したＡＡＶベクタープラスミドを、ｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳプラスミド（Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬａｂｓ社、カタログ番号ＶＰＫ－４３０）にヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１核酸分子配列（配列番号３）をＢａｍＨＩ（５’側）とＸｂａＩ（３’側）制限酵素を使用し挿入して、作製した。得られたプラスミドをｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１と称する。ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１遺伝子はＣＭＶ由来プロモーターの下流、かつ、ＳＶ４０ ｐｏｌｙ（Ａ）の上流に位置しており、開始コドンの前にコザック配列(ＧＣＣＡＣＣ)が存在する。また、ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１遺伝子の下流に終止コドンを配置し、ヒト全長ＣＸ３ＣＬ１配列（配列番号２）の内のアミノ酸番号１から３３８までのアミノ酸配列（配列番号４）を有するヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が発現されるようにデザインした。ＩＴＲを含むＩＴＲ間の長さは１９７５ｂ．ｐ.であり、ＡＡＶベクターにパッケージできるサイズである。ｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１のベクターマップを図２に示す。このプラスミドをＳｔｂｌ３大腸菌株を用いて増幅した。この他、ｒＡＡＶ作製に必要なプラスミドｐＨｅｌｐｅｒ及びｐＲＣＡＡＶ８をＤＨ５α大腸菌株を用いて増幅した。１平方センチメートルあたり２５００細胞の密度でＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を播種し、４日後にｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１、ｐＨｅｌｐｅｒ、及びｐＲＣＡＡＶ８を一過性にトランスフェクションし、４日間培養した細胞の培養上清を回収した。培養上清中に含まれるｒＡＡＶ８をｍＰＥＳ ＭｉｎｉＫｒｏｓ Ｓａｍｐｌｅｒ ３００ｋＤａ(Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社、カタログ番号 Ｓ－０２－Ｅ３００－０５－Ｎ)を用いてＴａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎを用いて濃縮した。濃縮されたサンプルを０．２２μＭフィルターにかけ、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたアフィニティーカラムで精製した。精製したサンプルを塩化セシウムの濃度勾配を利用した超遠心にかけた。この超遠心では垂直ローター（ＶＴｉ５０）を使用した。超遠心したサンプルにおいて、２８０ｎｍ及び２６０ｎｍの吸光測定値が高いフラクションを回収した。回収したサンプルをりん酸緩衝生理食塩水を用いて３回透析したものを、作製されたヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１遺伝子を搭載したＡＡＶ８ベクター（ｒＡＡＶ８－ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１と称する）のストックとした。ウイルスタイター測定はＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ ＡＡＶ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ(Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ番号 ＶＰＫ－１４５)を用いて実施した。
ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１の核酸分子配列を搭載したＡＡＶベクタープラスミドを、ｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳプラスミド（Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬａｂｓ社、カタログ番号ＶＰＫ－４３０）にヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１核酸分子配列（配列番号３）をＢａｍＨＩ（５’側）とＸｂａＩ（３’側）制限酵素を使用し挿入して、作製した。得られたプラスミドをｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１と称する。ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１遺伝子はＣＭＶ由来プロモーターの下流、かつ、ＳＶ４０ ｐｏｌｙ（Ａ）の上流に位置しており、開始コドンの前にコザック配列(ＧＣＣＡＣＣ)が存在する。また、ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１遺伝子の下流に終止コドンを配置し、ヒト全長ＣＸ３ＣＬ１配列（配列番号２）の内のアミノ酸番号１から３３８までのアミノ酸配列（配列番号４）を有するヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が発現されるようにデザインした。ＩＴＲを含むＩＴＲ間の長さは１９７５ｂ．ｐ.であり、ＡＡＶベクターにパッケージできるサイズである。ｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１のベクターマップを図２に示す。このプラスミドをＳｔｂｌ３大腸菌株を用いて増幅した。この他、ｒＡＡＶ作製に必要なプラスミドｐＨｅｌｐｅｒ及びｐＲＣＡＡＶ８をＤＨ５α大腸菌株を用いて増幅した。１平方センチメートルあたり２５００細胞の密度でＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を播種し、４日後にｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１、ｐＨｅｌｐｅｒ、及びｐＲＣＡＡＶ８を一過性にトランスフェクションし、４日間培養した細胞の培養上清を回収した。培養上清中に含まれるｒＡＡＶ８をｍＰＥＳ ＭｉｎｉＫｒｏｓ Ｓａｍｐｌｅｒ ３００ｋＤａ(Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社、カタログ番号 Ｓ－０２－Ｅ３００－０５－Ｎ)を用いてＴａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎを用いて濃縮した。濃縮されたサンプルを０．２２μＭフィルターにかけ、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたアフィニティーカラムで精製した。精製したサンプルを塩化セシウムの濃度勾配を利用した超遠心にかけた。この超遠心では垂直ローター（ＶＴｉ５０）を使用した。超遠心したサンプルにおいて、２８０ｎｍ及び２６０ｎｍの吸光測定値が高いフラクションを回収した。回収したサンプルをりん酸緩衝生理食塩水を用いて３回透析したものを、作製されたヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１遺伝子を搭載したＡＡＶ８ベクター（ｒＡＡＶ８－ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１と称する）のストックとした。ウイルスタイター測定はＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ ＡＡＶ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ(Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ番号 ＶＰＫ－１４５)を用いて実施した。
実施例３ ウイルス感染プロトコル
生後１日齢にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１を投与するプロトコルはＸｉｏｎｇらの方法（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２０１５年、１２５巻、１４３３～１４４５頁）に従ったものである。実施例１で作製したｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１を網膜色素変性症のモデルマウスであるｒｄ１０マウスに投与した。生後１日齢のマウスを氷上麻酔させ、眼球を露出し、ガラスシリンジで網膜下に投与を行った。ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１を最終濃度が２．２×１０10ｖｇ／ｍＬ、２．２×１０11ｖｇ／ｍＬ又は２．２×１０12ｖｇ／ｍＬになるようにビヒクル（りん酸緩衝生理食塩水に０．２５％のＦａｓｔ Ｇｒｅｅｎ ＦＣＦ（ナカライテスク社、カタログ番号１５９３９－５４）及び０．００１％のプルロニック Ｆ―６８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加した溶液）で調製し、１眼あたり６．５×１０6ｖｇ／０．３μＬ、６．５×１０7ｖｇ／０．３μＬ又は６．５×１０8ｖｇ／０．３μＬで投与した。投与したマウスは体温を戻し覚醒させ、親マウスと共に飼育し、生後２８日齢～生後３５日齢で離乳後、生後５０日齢～生後５１日齢まで生存させた。
ｒｄ１０マウスでは網膜色素変性症患者同様、杆体細胞の細胞死（生後２０日齢～生後２８日齢）が発生した後に錐体細胞の細胞死が起こる（Ｇａｒｇｉｎｉら、Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．、２００７年、５００巻、２２２～２３８頁）。また、杆体細胞の保護は間接的に錐体細胞の保護に繋がることも知られている（Ｌｅｖｅｉｌｌａｒｄら、Ｃ． Ｒ． Ｂｉｏｌ．、２０１４年、３３７巻、２０７～２１３頁）。ｒｄ１０マウスにおける網膜保護効果を検証する場合は、杆体細胞変性前又はそれと同時に薬剤を投与する方法が一般的である（非特許文献１）が、その場合は薬剤の錐体細胞直接的な保護効果が検証できないため、杆体細胞非依存的に錐体細胞保護効果が期待できるかを、生後２８日齢～生後２９日齢のｒｄ１０マウスに薬剤を投与し検証した。その際の投与方法は次の通りである。ｒｄ１０マウスにミドリンＰ点眼液（参天製薬社）を点眼し、散瞳させ、ケタミン・キシラジン混合麻酔液を筋肉内注射し麻酔した。麻酔後にヒアレイン点眼液０．３％（参天製薬社）を点眼し、角膜を保護した。耳側の強膜に３０ゲージの針で穴をあけ、投与液を１μＬ充填したハミルトンシリンジの針を通し、硝子体を通り、鼻側の網膜に挿して網膜下投与した。ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１は、最終濃度が２×１０11ｖｇ／ｍＬ又は２×１０12ｖｇ／ｍＬになるように調製し、１眼あたり２×１０8ｖｇ／１μＬ又は２×１０9ｖｇ／１μＬで投与した。投与したマウスはアンチセダン（日本全薬工業社）を筋肉内注射し覚醒させ、最長生後５１日齢まで生存させた。
生後１日齢にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１を投与するプロトコルはＸｉｏｎｇらの方法（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２０１５年、１２５巻、１４３３～１４４５頁）に従ったものである。実施例１で作製したｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１を網膜色素変性症のモデルマウスであるｒｄ１０マウスに投与した。生後１日齢のマウスを氷上麻酔させ、眼球を露出し、ガラスシリンジで網膜下に投与を行った。ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１を最終濃度が２．２×１０10ｖｇ／ｍＬ、２．２×１０11ｖｇ／ｍＬ又は２．２×１０12ｖｇ／ｍＬになるようにビヒクル（りん酸緩衝生理食塩水に０．２５％のＦａｓｔ Ｇｒｅｅｎ ＦＣＦ（ナカライテスク社、カタログ番号１５９３９－５４）及び０．００１％のプルロニック Ｆ―６８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加した溶液）で調製し、１眼あたり６．５×１０6ｖｇ／０．３μＬ、６．５×１０7ｖｇ／０．３μＬ又は６．５×１０8ｖｇ／０．３μＬで投与した。投与したマウスは体温を戻し覚醒させ、親マウスと共に飼育し、生後２８日齢～生後３５日齢で離乳後、生後５０日齢～生後５１日齢まで生存させた。
ｒｄ１０マウスでは網膜色素変性症患者同様、杆体細胞の細胞死（生後２０日齢～生後２８日齢）が発生した後に錐体細胞の細胞死が起こる（Ｇａｒｇｉｎｉら、Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．、２００７年、５００巻、２２２～２３８頁）。また、杆体細胞の保護は間接的に錐体細胞の保護に繋がることも知られている（Ｌｅｖｅｉｌｌａｒｄら、Ｃ． Ｒ． Ｂｉｏｌ．、２０１４年、３３７巻、２０７～２１３頁）。ｒｄ１０マウスにおける網膜保護効果を検証する場合は、杆体細胞変性前又はそれと同時に薬剤を投与する方法が一般的である（非特許文献１）が、その場合は薬剤の錐体細胞直接的な保護効果が検証できないため、杆体細胞非依存的に錐体細胞保護効果が期待できるかを、生後２８日齢～生後２９日齢のｒｄ１０マウスに薬剤を投与し検証した。その際の投与方法は次の通りである。ｒｄ１０マウスにミドリンＰ点眼液（参天製薬社）を点眼し、散瞳させ、ケタミン・キシラジン混合麻酔液を筋肉内注射し麻酔した。麻酔後にヒアレイン点眼液０．３％（参天製薬社）を点眼し、角膜を保護した。耳側の強膜に３０ゲージの針で穴をあけ、投与液を１μＬ充填したハミルトンシリンジの針を通し、硝子体を通り、鼻側の網膜に挿して網膜下投与した。ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１は、最終濃度が２×１０11ｖｇ／ｍＬ又は２×１０12ｖｇ／ｍＬになるように調製し、１眼あたり２×１０8ｖｇ／１μＬ又は２×１０9ｖｇ／１μＬで投与した。投与したマウスはアンチセダン（日本全薬工業社）を筋肉内注射し覚醒させ、最長生後５１日齢まで生存させた。
実施例４ 網膜組織のＣｘ３ｃｌ１遺伝子発現評価
生後１日齢にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１又はビヒクルを網膜下に投与したｒｄ１０マウスを生後５１日齢でイソフルラン麻酔下で放血により安楽死させ、眼球を摘出した。角膜及び水晶体を除去し、網膜を他組織から単離するように採材し、網膜組織におけるＣｘ３ｃｌ１の遺伝子発現評価を実施した。網膜からＲＮＡを抽出し、逆転写でｃＤＮＡを作製後、Ｃｘ３ｃｌ１及びベータアクチン（ハウスキーピング遺伝子）に対するＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイを行った。Ｃｘ３ｃｌ１のＣｔ値をベータアクチンのＣｔ値で補正し、比較Ｃｔ法により対照ビヒクル群と各投与群の比較を行った。結果を図３に示す。６．５×１０6（６．５ｅ６）ｖｇ／ｅｙｅ投与群、６．５×１０7（６．５ｅ７）ｖｇ／ｅｙｅ投与群及び６．５×１０8（６．５ｅ８）ｖｇ／ｅｙｅ投与群において用量依存的なＣｘ３ｃｌ１ ｍＲＮＡの発現上昇が見られた。
生後１日齢にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１又はビヒクルを網膜下に投与したｒｄ１０マウスを生後５１日齢でイソフルラン麻酔下で放血により安楽死させ、眼球を摘出した。角膜及び水晶体を除去し、網膜を他組織から単離するように採材し、網膜組織におけるＣｘ３ｃｌ１の遺伝子発現評価を実施した。網膜からＲＮＡを抽出し、逆転写でｃＤＮＡを作製後、Ｃｘ３ｃｌ１及びベータアクチン（ハウスキーピング遺伝子）に対するＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイを行った。Ｃｘ３ｃｌ１のＣｔ値をベータアクチンのＣｔ値で補正し、比較Ｃｔ法により対照ビヒクル群と各投与群の比較を行った。結果を図３に示す。６．５×１０6（６．５ｅ６）ｖｇ／ｅｙｅ投与群、６．５×１０7（６．５ｅ７）ｖｇ／ｅｙｅ投与群及び６．５×１０8（６．５ｅ８）ｖｇ／ｅｙｅ投与群において用量依存的なＣｘ３ｃｌ１ ｍＲＮＡの発現上昇が見られた。
生後２８日齢～生後２９日齢にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１又はビヒクルを網膜下に投与したｒｄ１０マウスにおいては、投与７日後（Ｐｏｓｔ ｄ７）、１４日後（Ｐｏｓｔ ｄ１４）、及び２２日後（Ｐｏｓｔ ｄ２２）に上記に記載の通り網膜からｃＤＮＡを作製し、前記と同様にＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイでＣｘ３ｃｌ１遺伝子発現を評価した（図４）。２×１０8（２ｅ８）ｖｇ／ｅｙｅ投与群において、Ｃｘ３ｃｌ１ ｍＲＮＡの発現は投与７日後に対照ビヒクル群に比べ上昇しており、１４日後及び２２日後では更に上昇していた。なお、２×１０9（２ｅ９）ｖｇ／ｅｙｅ投与群は投与２２日後のみで評価しており、その時点において、２×１０8ｖｇ／ｅｙｅ投与群より高い発現傾向が見られた。
実施例５ 硝子体中及び血漿中のＣＸ３ＣＬ１タンパク質量評価
生後１日齢にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１又はビヒクルを網膜下に投与したｒｄ１０マウスを生後５０日齢まで生存させ、血漿及び硝子体を採材した。硝子体は、眼球から角膜及び水晶体を切除し、露出させた硝子体をりん酸緩衝生理食塩水に浸して採材した。血漿は、イソフルラン麻酔下で腹部大静脈から血液をヘパリン採血管に採取し、遠心して分離した上清から採取した。抗マウスＣＸ３ＣＬ１抗体を用いたＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号 ＭＣＸ３１０）により硝子体及び血漿中のＣＸ３ＣＬ１タンパク質量を評価した。結果をそれぞれ図５及び図６に示す。硝子体においては、６．５×１０6（６．５ｅ６）ｖｇ／ｅｙｅ投与群、６．５×１０7（６．５ｅ７）ｖｇ／ｅｙｅ投与群、６．５×１０8（６．５ｅ８）ｖｇ／ｅｙｅ投与群において用量依存的なＣＸ３ＣＬ１タンパク質の値の上昇が確認でき、特に６．５×１０7ｖｇ／ｅｙｅ投与群及び６．５×１０8ｖｇ／ｅｙｅ投与群において大幅な上昇が見られた。血漿においては対照ビヒクル群に比べ、６．５×１０7ｖｇ／ｅｙｅ投与群及び６．５×１０8ｖｇ／ｅｙｅ投与群において用量依存的な上昇が確認できた。これらは、網膜組織で発現したＣＸ３ＣＬ１タンパク質が一部全身血流に移行していることを示唆する。
生後１日齢にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１又はビヒクルを網膜下に投与したｒｄ１０マウスを生後５０日齢まで生存させ、血漿及び硝子体を採材した。硝子体は、眼球から角膜及び水晶体を切除し、露出させた硝子体をりん酸緩衝生理食塩水に浸して採材した。血漿は、イソフルラン麻酔下で腹部大静脈から血液をヘパリン採血管に採取し、遠心して分離した上清から採取した。抗マウスＣＸ３ＣＬ１抗体を用いたＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号 ＭＣＸ３１０）により硝子体及び血漿中のＣＸ３ＣＬ１タンパク質量を評価した。結果をそれぞれ図５及び図６に示す。硝子体においては、６．５×１０6（６．５ｅ６）ｖｇ／ｅｙｅ投与群、６．５×１０7（６．５ｅ７）ｖｇ／ｅｙｅ投与群、６．５×１０8（６．５ｅ８）ｖｇ／ｅｙｅ投与群において用量依存的なＣＸ３ＣＬ１タンパク質の値の上昇が確認でき、特に６．５×１０7ｖｇ／ｅｙｅ投与群及び６．５×１０8ｖｇ／ｅｙｅ投与群において大幅な上昇が見られた。血漿においては対照ビヒクル群に比べ、６．５×１０7ｖｇ／ｅｙｅ投与群及び６．５×１０8ｖｇ／ｅｙｅ投与群において用量依存的な上昇が確認できた。これらは、網膜組織で発現したＣＸ３ＣＬ１タンパク質が一部全身血流に移行していることを示唆する。
実施例６ 視覚運動反応試験
Ｘｉｏｎｇらの方法（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、２０１５年、１２５巻 １４３３～１４４５頁）に従って視覚運動反応試験を実施した。生後１日齢にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１又はビヒクルを網膜下に投与したｒｄ１０マウスを対象に生後４４日齢～生後４５日齢に視覚運動反応試験を実施した。本試験にはＣｅｒｅｂｒａｌＭｅｃｈａｎｉｃｓ社のＯｐｔｏＭｏｔｒｙ ＨＤを使用した。全てのマウスは評価のおよそ１週間前に覚醒下でプラットフォームに５分ほど置き、チャンバーに順化させた。評価当日、マウスを覚醒下でプラットフォームに乗せ、動物が探索行動をやめ、プラットフォームから落ちることなく、落ち着いたと実験者が判断したら検査を開始した。白黒の格子のコントラストを１００％、回転速度を１２度／秒に設定し、格子画面を回転させ、回転させた格子に対するマウスの視覚運動反応を観察した。盲目マウスは応答せず、目の見えるマウスは回転させた格子の動きを追跡するかのようにその頭部も回した。視覚運動反応は、マウスが認識できる格子の最小の厚さ、すなわち空間周波数の限界（ｓｐａｔｉａｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ；ｃｙｃｌｅｓ／ｄｅｇｒｅｅ（ｃ／ｄ）で表される）を指標に評価した。なお、実験者はそれぞれの個体の投与内容が分からないよう、ブラインドで試験を実施した。結果を図７に示す。６．５×１０6（６．５ｅ６）ｖｇ／ｅｙｅ投与群では対照ビヒクル群に比べ変化は見られなかったが、６．５×１０7（６．５ｅ７）ｖｇ／ｅｙｅ投与群及び６．５×１０8（６．５ｅ８）ｖｇ／ｅｙｅ投与群において視覚運動反応が保持される傾向が確認された。
Ｘｉｏｎｇらの方法（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、２０１５年、１２５巻 １４３３～１４４５頁）に従って視覚運動反応試験を実施した。生後１日齢にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１又はビヒクルを網膜下に投与したｒｄ１０マウスを対象に生後４４日齢～生後４５日齢に視覚運動反応試験を実施した。本試験にはＣｅｒｅｂｒａｌＭｅｃｈａｎｉｃｓ社のＯｐｔｏＭｏｔｒｙ ＨＤを使用した。全てのマウスは評価のおよそ１週間前に覚醒下でプラットフォームに５分ほど置き、チャンバーに順化させた。評価当日、マウスを覚醒下でプラットフォームに乗せ、動物が探索行動をやめ、プラットフォームから落ちることなく、落ち着いたと実験者が判断したら検査を開始した。白黒の格子のコントラストを１００％、回転速度を１２度／秒に設定し、格子画面を回転させ、回転させた格子に対するマウスの視覚運動反応を観察した。盲目マウスは応答せず、目の見えるマウスは回転させた格子の動きを追跡するかのようにその頭部も回した。視覚運動反応は、マウスが認識できる格子の最小の厚さ、すなわち空間周波数の限界（ｓｐａｔｉａｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ；ｃｙｃｌｅｓ／ｄｅｇｒｅｅ（ｃ／ｄ）で表される）を指標に評価した。なお、実験者はそれぞれの個体の投与内容が分からないよう、ブラインドで試験を実施した。結果を図７に示す。６．５×１０6（６．５ｅ６）ｖｇ／ｅｙｅ投与群では対照ビヒクル群に比べ変化は見られなかったが、６．５×１０7（６．５ｅ７）ｖｇ／ｅｙｅ投与群及び６．５×１０8（６．５ｅ８）ｖｇ／ｅｙｅ投与群において視覚運動反応が保持される傾向が確認された。
実施例７ 錐体細胞保護効果の評価
ｒｄ１０マウスにおいて、ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１による錐体細胞保護効果を検証するため、錐体細胞の外節を免疫組織化学法で染色し、陽性となった各外節１つを各錐体細胞１つとみなし、残存する錐体細胞数の評価を実施した。具体的には以下の通りである。生後１日齢に網膜下にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１を感染させたｒｄ１０マウスを生後５０日齢にイソフルラン麻酔下で放血により安楽死させ、眼球を採材し、４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。固定した眼球から角膜・水晶体・虹彩・強膜・脈絡膜・網膜色素上皮細胞を除き、網膜を単離した。単離した網膜を免疫組織染色用ブロッキング剤でブロッキング後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６４７がラベルされた抗赤色／緑色オプシン抗体（メルク社、カタログ番号ＡＢ５４０５）及びＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８がラベルされた抗青色オプシン抗体（メルク社、カタログ番号ＡＢ５４０７）で染色した。染色した網膜は４か所に切れ込みを入れ、視細胞側を上にするようにスライドに乗せ、フラットマウントを作製した。視神経乳頭部位から１．５ｍｍの位置をＫＥＹＥＮＣＥ ＢＺ－Ｘ７１０蛍光顕微鏡の４０倍レンズを用いて画像を取得した。撮影部位に存在する抗錐体オプシン抗体で陽性となった細胞(外節)数はＩｍａｇｅ Ｊ（ｖｅｒ １．４９）ソフトウェアを用いて定量化した。１画面（観察エリア）あたりの錐体オプシンの数を残存する錐体細胞の数の指標として評価した。結果を図８に示す。６．５×１０6（６．５ｅ６）ｖｇ／ｅｙｅ投与群では対照ビヒクル群に比べ変化は見られなかったが、６．５×１０7（６．５ｅ７）ｖｇ／ｅｙｅ投与群では有意な上昇を示した（Ｐ＜０．０１、ダネット多重比較検定）。また、６．５×１０8（６．５ｅ８）ｖｇ／ｅｙｅ投与群でも上昇傾向を示している。これらのデータはｒｄ１０マウスにおいて、ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１の網膜下投与によりマウス錐体細胞数が保持されることを示している。
ｒｄ１０マウスにおいて、ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１による錐体細胞保護効果を検証するため、錐体細胞の外節を免疫組織化学法で染色し、陽性となった各外節１つを各錐体細胞１つとみなし、残存する錐体細胞数の評価を実施した。具体的には以下の通りである。生後１日齢に網膜下にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１を感染させたｒｄ１０マウスを生後５０日齢にイソフルラン麻酔下で放血により安楽死させ、眼球を採材し、４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。固定した眼球から角膜・水晶体・虹彩・強膜・脈絡膜・網膜色素上皮細胞を除き、網膜を単離した。単離した網膜を免疫組織染色用ブロッキング剤でブロッキング後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６４７がラベルされた抗赤色／緑色オプシン抗体（メルク社、カタログ番号ＡＢ５４０５）及びＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８がラベルされた抗青色オプシン抗体（メルク社、カタログ番号ＡＢ５４０７）で染色した。染色した網膜は４か所に切れ込みを入れ、視細胞側を上にするようにスライドに乗せ、フラットマウントを作製した。視神経乳頭部位から１．５ｍｍの位置をＫＥＹＥＮＣＥ ＢＺ－Ｘ７１０蛍光顕微鏡の４０倍レンズを用いて画像を取得した。撮影部位に存在する抗錐体オプシン抗体で陽性となった細胞(外節)数はＩｍａｇｅ Ｊ（ｖｅｒ １．４９）ソフトウェアを用いて定量化した。１画面（観察エリア）あたりの錐体オプシンの数を残存する錐体細胞の数の指標として評価した。結果を図８に示す。６．５×１０6（６．５ｅ６）ｖｇ／ｅｙｅ投与群では対照ビヒクル群に比べ変化は見られなかったが、６．５×１０7（６．５ｅ７）ｖｇ／ｅｙｅ投与群では有意な上昇を示した（Ｐ＜０．０１、ダネット多重比較検定）。また、６．５×１０8（６．５ｅ８）ｖｇ／ｅｙｅ投与群でも上昇傾向を示している。これらのデータはｒｄ１０マウスにおいて、ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１の網膜下投与によりマウス錐体細胞数が保持されることを示している。
また、生後２８日齢に網膜下にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１を感染させたｒｄ１０マウスを投与後２２日（生後５０日齢）で網膜を採材し、前記と同様の方法で錐体オプシン数を評価した結果を図９に示す。２×１０8（２ｅ８）ｖｇ／ｅｙｅ投与群及び２×１０9（２ｅ９）ｖｇ／ｅｙｅ投与群では対照ビヒクル群に比べ有意な上昇を示した（それぞれＰ＜０．０１、Ｐ＜０．０５、ダネット多重比較検定）。これらのデータは、病態がある程度進行し、杆体細胞死が起こった後にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１を網膜下投与してもｒｄ１０マウスの錐体細胞数が保持されることを示している。
本発明のＣＸ３ＣＬ１遺伝子を搭載したＡＡＶベクターは、網膜変性疾患、例えば、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、杆体錐体ジストロフィー等の予防及び／又は治療剤として期待される。
Claims (11)
- ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物。
- 前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、請求項２に記載の医薬組成物。
- 前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項３に記載の医薬組成物。
- 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターである、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記ＡＡＶベクターが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含むＡＡＶ８ベクターである、請求項１に記載の医薬組成物。
- 網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 進行期の網膜色素変性症の治療用である、請求項８に記載の医薬組成物。
- 網膜下に投与するための、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 硝子体内に投与するための、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
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