JP2022044827A - 免疫媒介性がん治療のための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

【課題】免疫媒介性がん治療のための組成物及び方法の提供。【解決手段】本明細書で開示されるのは、被験体における固形腫瘍への免疫応答を強化するための方法および組成物である。一部の実施形態では、方法は、（ａ）低酸素活性化生体還元剤（ＨＡＢＡ）を被験体に投与すること、（ｂ）（ｉ）低酸素誘導剤を被験体に投与すること、または（ｉｉ）固形腫瘍を供給している１つまたは複数の血管に塞栓形成することによって、低酸素を誘導すること、および（ｃ）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ｂ）と同時にまたはステップ（ｂ）に続いて、免疫チェックポイント阻害剤を、免疫チェックポイント阻害剤の不在下での免疫応答に比べて、固形腫瘍への免疫応答を強化するのに有効な量で投与することを含む。開示される方法における使用のためのキットもまた提供される。【選択図】なし

Description

相互参照
本ＰＣＴ出願は、２０１５年１０月２１日に出願した米国仮特許出願第６２／２４４，４５７号に対する優先権を主張する。この出願は、すべての目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される。

発明の背景
一部の患者が、腫瘍特異性細胞傷害性Ｔ細胞の検出に基づき、がんに対して免疫を呈することが示されてきたが、これらのＴ細胞は、何らかの治療的利益または予防的利益があったとしても、多くをもたらすことなく腫瘍から遮蔽されているようであった。この不整合を、腫瘍はさまざまな機序を進化させて免疫攻撃を回避するという理論で説明する人もいる。正常な免疫反応が起きるためには、ＡＰＣは腫瘍由来の抗原を取り込み、抗原を保有する腫瘍細胞に対する細胞傷害性を発現すべくＴ細胞をプライムする処理後に、それらの抗原をＴ細胞に提示する。ＡＰＣとＴ細胞との間の相互作用は、腫瘍関連抗原を認識し、ＭＨＣ分子と複合体を形成するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むさまざまなリガンド－受容体の相互作用、および共活性化剤ＣＤ２８によって調節される。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞の陰性調節因子として機能し、ＣＤ４０は、ＡＰＣのための陽性調節因子として機能する。ＰＤ－１は、細胞傷害性Ｔ細胞の別の陰性調節因子であり、免疫チェックポイントとして役立つ。腫瘍細胞は、ＰＤ－Ｌ１と呼ばれるＰＤ－１リガンドを発現することができ、これはＰＤ－１を活性化し、そのためＴ細胞の抗腫瘍活性を抑制する。腫瘍はまた、調節性Ｔ細胞をリクルートすることがあり、これは、細胞傷害性Ｔ細胞活性を抑制して腫瘍を免疫攻撃から防ぐことができる。がんを処置するために免疫シグナリング応答を操作するよう努力がなされてきたが、奏効率および無増悪生存率への効果は、多くの改善の余地を残している。さらに、免疫抑制を弱める化合物への過度な依存は、免疫系のバランスを、自己免疫障害のほうに傾けるおそれがあった。例えば、ニボルマブおよびペンブロリズマブの観察される有害作用には、さまざまな免疫関連の、肝炎、肺炎、下垂体炎、大腸炎などが挙げられ、このことは、全身免疫のさらなる強化が潜在的リスクを保有しうることを示している。

上記を考慮して、がんの処置のための、詳細には被験体における免疫応答を利用するがんの処置のための、改善された組成物および戦略への必要性がある。本開示は、この必要性に対処し、同様に他の利点も提供する。本明細書で開示の実施形態のうちの一部では、腫瘍中の壊死の誘導（免疫系の、腫瘍抗原への曝露を増やす）を免疫チェックポイント阻害剤の投与と組み合わせることによって固形腫瘍に対する免疫応答を強化する方法が提供される。

一態様では、本開示は、被験体における固形腫瘍への免疫応答を強化する方法であって、（ａ）低酸素活性化生体還元剤（ＨＡＢＡ）を該被験体に投与すること、（ｂ）（ｉ）低酸素誘導剤を該被験体に投与すること、または（ｉｉ）該固形腫瘍を供給している１つまたは複数の血管に塞栓形成することによって、低酸素を誘導すること、および（ｃ）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ｂ）と同時にまたはステップ（ｂ）に続いて、免疫チェックポイント阻害剤を、該免疫チェックポイント阻害剤の不在下での免疫応答に比べて、固形腫瘍への免疫応答を強化するのに有効な量で投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、前記低酸素活性化生体還元剤が、チラパザミンである。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）が、血管破壊剤である低酸素誘導剤を投与することを含む。一部の実施形態では、前記血管破壊剤が、ＤＭＸＡＡ、スチルベンまたはスチルベン誘導体である。一部の実施形態では、前記スチルベン誘導体が、コンブレタスタチン、コンブレタスタチン誘導体、ｃｉｓ－３，４’，５－トリメトキシ－３’－アミノスチルベン（スチルベン５ｃ）、ｃｉｓ－３，４’，５－トリメトキシ－３’－ヒドロキシスチルベン（スチルベン６ｃ）、およびスチルベン５ｃのプロドラッグであるモルホリノ－カルバメート誘導体からなる群から選択される。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）が、抗血管新生剤である低酸素誘導剤を投与することを含む。一部の実施形態では、前記低酸素活性化剤および前記低酸素誘導剤が、前記固形腫瘍のうちの少なくとも７５％の壊死を誘導するのに有効な量で投与される。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）が、塞栓剤を投与することによって前記１つまたは複数の血管に塞栓形成することを含む。一部の実施形態では、前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４の阻害剤である。一部の実施形態では、前記免疫チェックポイント阻害剤が、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、前記モノクローナル抗体が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、ＭＥＤＩ４７３６およびイピリムマブからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記固形腫瘍が、肝細胞癌、胆管癌、肝臓の転移性結腸直腸がん、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、頭頚部がん、卵巣がんおよび膵がんからなる群から選択される腫瘍である。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）が、動脈塞栓術を含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の後に実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）が、低酸素誘導剤を投与することを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）が、前記免疫チェックポイント阻害剤を、ステップ（ｂ）の後に、２回またはそれよりも多い回数で投与することを含む。一部の実施形態では、前記免疫チェックポイント調節剤を投与することが、前記固形腫瘍を、処置前の大きさの５０％未満である大きさに少なくとも６か月間維持するのに有効である。一部の実施形態では、前記ＨＡＢＡの投与、低酸素の誘導と、前記免疫チェックポイント阻害剤の投与との組合せが、前記被験体における増殖障害を処置するのに相乗効果を呈する。

一態様では、本開示は、被験体における固形腫瘍への免疫応答の強化に使用するためのキットを提供する。一部の実施形態では、このキットは、（ａ）低酸素活性化生体還元剤（ＨＡＢＡ）、（ｂ）低酸素誘導剤または塞栓剤、および（ｃ）免疫チェックポイント阻害剤を含む。一部の実施形態では、前記ＨＡＢＡが、チラパザミンである。一部の実施形態では、パート（ｂ）が、血管破壊剤である低酸素誘導剤である。一部の実施形態では、前記血管破壊剤が、ＤＭＸＡＡ、スチルベンまたはスチルベン誘導体である。一部の実施形態では、前記スチルベン誘導体が、コンブレタスタチン、コンブレタスタチン誘導体、ｃｉｓ－３，４’，５－トリメトキシ－３’－アミノスチルベン（スチルベン５ｃ）、ｃｉｓ－３，４’，５－トリメトキシ－３’－ヒドロキシスチルベン（スチルベン６ｃ）、およびスチルベン５ｃのプロドラッグであるモルホリノ－カルバメート誘導体からなる群から選択される。一部の実施形態では、パート（ｂ）が、抗血管新生剤である低酸素誘導剤である。一部の実施形態では、前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４の阻害剤である。一部の実施形態では、前記免疫チェックポイント阻害剤が、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、前記モノクローナル抗体が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、ＭＥＤＩ４７３６およびイピリムマブからなる群から選択される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
被験体における固形腫瘍への免疫応答を強化する方法であって、
（ａ）低酸素活性化生体還元剤（ＨＡＢＡ）を該被験体に投与すること、
（ｂ）（ｉ）低酸素誘導剤を該被験体に投与すること、または（ｉｉ）該固形腫瘍を供給している１つまたは複数の血管に塞栓形成することによって、低酸素を誘導すること、および
（ｃ）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ｂ）と同時にまたはステップ（ｂ）に続いて、免疫チェックポイント阻害剤を、該免疫チェックポイント阻害剤の不在下での免疫応答に比べて、固形腫瘍への免疫応答を強化するのに有効な量で投与すること
を含む方法。
（項目２）
前記低酸素活性化生体還元剤が、チラパザミンである、項目１に記載の方法。
（項目３）
ステップ（ｂ）が、血管破壊剤である低酸素誘導剤を投与することを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記血管破壊剤が、ＤＭＸＡＡ、スチルベンまたはスチルベン誘導体である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記スチルベン誘導体が、コンブレタスタチン、コンブレタスタチン誘導体、ｃｉｓ－３，４’，５－トリメトキシ－３’－アミノスチルベン（スチルベン５ｃ）、ｃｉｓ－３，４’，５－トリメトキシ－３’－ヒドロキシスチルベン（スチルベン６ｃ）、およびスチルベン５ｃのプロドラッグであるモルホリノ－カルバメート誘導体からなる群から選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
ステップ（ｂ）が、抗血管新生剤である低酸素誘導剤を投与することを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記低酸素活性化剤および前記低酸素誘導剤が、前記固形腫瘍のうちの少なくとも７５％の壊死を誘導するのに有効な量で投与される、項目１に記載の方法。
（項目８）
ステップ（ｂ）が、塞栓剤を投与することによって前記１つまたは複数の血管に塞栓形成することを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４の阻害剤である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記免疫チェックポイント阻害剤が、モノクローナル抗体である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記モノクローナル抗体が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、ＭＥＤＩ４７３６およびイピリムマブからなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記固形腫瘍が、肝細胞癌、胆管癌、肝臓の転移性結腸直腸がん、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、頭頚部がん、卵巣がんおよび膵がんからなる群から選択される腫瘍である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
ステップ（ｂ）が、動脈塞栓術を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の後に実施される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
ステップ（ｂ）が、低酸素誘導剤を投与することを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
ステップ（ｃ）が、前記免疫チェックポイント阻害剤を、ステップ（ｂ）の後に、２回またはそれよりも多い回数で投与することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記免疫チェックポイント調節剤を投与することが、前記固形腫瘍を、処置前の大きさの５０％未満である大きさに少なくとも６か月間維持するのに有効である、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記ＨＡＢＡの投与、低酸素の誘導と、前記免疫チェックポイント阻害剤の投与との組合せが、前記被験体における増殖障害を処置するのに相乗効果を呈する、項目１に記載の方法。
（項目１９）
被験体における固形腫瘍への免疫応答の強化に使用するためのキットであって、
（ａ）低酸素活性化生体還元剤（ＨＡＢＡ）、
（ｂ）低酸素誘導剤または塞栓剤、および
（ｃ）免疫チェックポイント阻害剤
を含むキット。
（項目２０）
前記ＨＡＢＡが、チラパザミンである、項目１９に記載のキット。
（項目２１）
パート（ｂ）が、血管破壊剤である低酸素誘導剤である、項目１９に記載のキット。
（項目２２）
前記血管破壊剤が、ＤＭＸＡＡ、スチルベンまたはスチルベン誘導体である、項目２１に記載のキット。
（項目２３）
前記スチルベン誘導体が、コンブレタスタチン、コンブレタスタチン誘導体、ｃｉｓ－３，４’，５－トリメトキシ－３’－アミノスチルベン（スチルベン５ｃ）、ｃｉｓ－３，４’，５－トリメトキシ－３’－ヒドロキシスチルベン（スチルベン６ｃ）、およびスチルベン５ｃのプロドラッグであるモルホリノ－カルバメート誘導体からなる群から選択される、項目２２に記載のキット。
（項目２４）
パート（ｂ）が、抗血管新生剤である低酸素誘導剤である、項目１９に記載のキット。（項目２５）
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４の阻害剤である、項目１９に記載のキット。
（項目２６）
前記免疫チェックポイント阻害剤が、モノクローナル抗体である、項目２５に記載のキット。
（項目２７）
前記モノクローナル抗体が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、ＭＥＤＩ４７３６およびイピリムマブからなる群から選択される、項目２６に記載のキット。

参照による組込み
本明細書で挙げるすべての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの刊行物、特許または特許出願が、あたかも具体的にかつ個別に参照により組み込まれていると示されたかのように、同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に示される。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原則が活用される、例示的な実施形態を示す以下の詳細な記載および添付の図面を参照することによって得られる。

図１は、腫瘍細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および調節性Ｔ細胞の間の、相互作用および調節を例示する例のダイアグラムを示す。ダイアグラムは、ブロッキングチェックポイントＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ４が、腫瘍内でいかに免疫抑制効果をモジュレートできるかを図示している。

図２は、ＨＢｘトランスジェニックマウスモデルにおける、左肝動脈結紮（ＨＡＬ）と、食塩水、ドキソルビシンまたはチラパザミンとの組合せの比較についての例の結果を例示している。腫瘍を保持しているＨＢｘトランスジェニックマウスを、ノーマルセーライン、チラパザミン（尾静脈からの３ｍｇ／ｋｇのＩＶ注射）またはドキソルビシン（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置し、続いて左肝動脈結紮を４０分行った。マウスの体重、ビリルビンおよびＡＬＴを、処置後のさまざまな日に測定した。肝細胞癌（ＨＣＣ）腫瘍の組織学的分析のために、７日目にマウスを屠殺した。

図３は、チラパザミンと肝動脈結紮とによるＨＣＣ処置後の、腫瘍壊死を誘導する効果および炎症反応を誘発させる効果を例示する、組織の画像を示す。腫瘍を保持しているＨＢｘトランスジェニックマウスを、チラパザミン（尾静脈からの３ｍｇ／ｋｇのＩＶ注射）で処置し、続いて左肝動脈結紮を４０分行った。ＨＣＣ腫瘍の組織学的分析のために、７日目にマウスを屠殺した。示しているのは、ほぼ完全な（９９％）腫瘍壊死を有する複数の組織切片から組み立てた、腫瘍全体の合成写真である。さらに留意すべきは、壊死性腫瘍の縁が、高い程度の炎症性細胞浸潤を有することである（すべては拡大された倍率の挿入画像である）。

図４は、完全奏効（ＣＲ）を達成した２名の患者の、コントラスト強化ＭＲＩスキャンの代表的な写真を示す。これらの患者は、それぞれ５ｍｇ／ｍ^２および１０ｍｇ／ｍ^２のチラパザミンを受け、その後に動脈塞栓術を受けた。追跡ＭＲＩスキャンを、塞栓形成手技後第６週に行った。矢印で強調している暗い領域は腫瘍であり、これはコントラスト強化の証拠を有さず、完全な腫瘍壊死またはＣＲであると評価される。

図５は、チラパザミンおよび血管破壊剤による、腫瘍壊死を誘導する効果、および炎症反応を誘発する効果を例示する、組織の画像を示す。ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに皮下注射して、腫瘍異種移植片を形成させた。腫瘍が直径１０ｍｍの大きさに成長したら、マウスを、チラパザミン（３０ｍｇ／ｋｇのＩＰ）プラス（Ａ）コンブレタスタチンＡ４（１０ｍｇ／ｋｇのＩＶ）または（Ｂ）ＤＭＸＡＡ（２０ｍｇ／ｋｇのＩＶ）で処置した（Chaplin DJ、２００６年）。マウスは、初回処置３週後に屠殺し、腫瘍をＨ＆Ｅ染色のために離断した。示しているのは、組織像の代表的な写真である。腫瘍壊死の領域および近傍の炎症性浸潤を示している。

図６は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの皮下３ＬＬ同系肺がんモデルの処置における、抗ｍＰＤ－１、チラパザミン（ＴＰＺ）、コンブレタスタチンＡ４ホスフェート、５，６－ジメチルキサンテノン（Dimethylxantheonone）－４－酢酸（ＤＭＸＡＡ）、およびそれらのさまざまな組合せの投与の、病理学および免疫組織化学を評価する研究の実験設計を記載する表を示す。

図７は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの皮下３ＬＬ同系肺がんモデルの処置における、抗ｍＰＤ－１、チラパザミン（ＴＰＺ）、コンブレタスタチンＡ４ホスフェート、５，６－ジメチルキサンテノン－４－酢酸（ＤＭＸＡＡ）、およびそれらのさまざまな組合せの投与に続く、ホルマリン固定パラフィン包埋組織のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色に基づく腫瘍壊死の百分率の結果を示す。アステリスク（＊）は、マン－ホイットニー検定によって決定する、ビヒクル群と比べた統計的有意性（Ｐ＜０．０５）を表す。

図８は、図７に描示した、Ｈ＆Ｅ染色した３ＬＬ腫瘍組織切片中の腫瘍壊死の百分率を示す表である。

発明の詳細な説明
用語「約」または「およそ」は、当業者により決定された特定の値について許容できる誤差範囲内であることを意味し、これは、いかにその値が測定されたかまたは決定されたか、すなわち測定系の限界に、部分的に依存する。例えば「約」は、当技術分野における実践当たり１以内または１超の標準偏差を意味することができる。あるいは「約」は、所与の値の、２０％まで、１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味することができる。あるいは、特に生物系または生物学的プロセスに関して、用語は、値の、１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。特定の値が本出願および特許請求の範囲において記載されるところでは、別段指定されない限り、用語「約」は特定の値についての許容される誤差範囲内を意味すると推定されるべきである。

用語「被験体」、「個人」および「患者」は、本明細書では、置き替え可能に使用されて、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物には、ネズミ、サル、ヒト、農場動物、スポーツ用動物およびペットが挙げられるがこれらに限定されない。組織、細胞、およびｉｎ ｖｉｖｏで得られるまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されるそれらの生物学的実体の後代もまた包含される。

用語「治療剤」、「治療可能な薬剤」または「処置剤」は、置き替え可能に使用され、被験体への投与の際にいくらかの有益な効果を付与する分子または化合物を指す。有益な効果には、診断決定の実施可能性；疾患、症状、障害または病態の改善；疾患、症状、障害または状態の、発症の低減または防止；および疾患、症状、障害または病態への全般的な対抗が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「処置」または「処置すること」または「緩和すること」または「改善すること」は、置き替え可能に使用される。これらの用語は、治療的利益および／または予防的利益が挙げられるがこれらに限定されない有益な結果または所望の結果を獲得するためのアプローチを指す。治療的利益は、処置中の１つまたは複数の疾患、状態または症状における任意の治療上関連する改善または効果を意味する。予防的利益では、特定の疾患、状態または症状がまだ顕在していないことがあっても、組成物は、該疾患、状態もしくは症状を発現する危険性のある被験体へ、または疾患の生理的症状のうちの１つまたは複数を報告している被験体に投与されうる。典型的には、予防的利益には、処置中の１種または複数の疾患、状態または症状の発生率を下げることおよび／または悪化を減らすことが挙げられる（例えば、処置された集団と未処置の集団との間の、または被験体の処置された状態と未処置の状態との間のような）。

用語「共投与」、「と組み合わせて投与される」およびそれらの文法的等価物は、双方の薬剤および／またはそれらの代謝物が動物中に同時に存在するような、動物への２種またはそれよりも多い薬剤の投与を包含する。共投与には、別々の組成物の同時投与、別々の組成物の異なる時間での投与（例えば、別々の組成物の逐次的投与）、またはその中に双方の薬剤が存在している組成物の投与が挙げられる。

用語「有効量」または「治療有効量」は、有益な結果または所望の結果の効果を上げるのに十分である薬剤の量を指す。治療有効量は、処置されている被験体および疾患状態、被験体の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与方法などのうちの１つまたは複数に依存して多様であってもよく、これは、当業者によって容易に決定されうる。活性剤の有効量は、単回用量で、または複数回用量で投与されうる。成分は、本明細書では、少なくとも１つの有効量、または特定の目標もしくは目的と関連する量などの少なくとも１つの有効な量、例えば本明細書に記載の任意の量を有するものとして記載されうる。

「相乗作用の」または「相乗作用する」効果は、組合せ組成物の１つもしくは複数の効果が、各成分単独の１つもしくは複数の効果よりも大きいか、またはそれらが各成分単独の１つまたは複数の効果の和よりも大きいものでありうる。相乗作用的効果は、約１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、１００％、１１０％、１２０％、１５０％、２００％、２５０％、３５０％または５００％であってよく、または約１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、１００％、１１０％、１２０％、１５０％、２００％、２５０％、３５０％または５００％よりも大きくてよく、あるいは成分のうちの１つ単独での被験体における効果よりもさらに大きく、または個別に投与されたときの成分のそれぞれの相加効果よりもさらに大きくてよい。効果は、本明細書に記載の測定可能な効果のうちの任意のものでありうる。

一態様では、本開示は、被験体における固形腫瘍への免疫応答を強化する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、（ａ）低酸素活性化生体還元剤（ＨＡＢＡ）を被験体に投与すること、ステップ（ａ）の後に、（ｉ）低酸素誘導剤を被験体に投与すること、または（ｉｉ）固形腫瘍を供給している１つまたは複数の血管の塞栓形成によって、低酸素を誘導すること（ここで、ＨＡＢＡおよび低酸素は、固形腫瘍の壊死の誘導において有効である）、および（ｃ）ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ｂ）と同時にまたはステップ（ｂ）に続いて、免疫チェックポイント阻害剤を、免疫チェックポイント阻害剤の不在下での免疫応答に比べて、固形腫瘍への免疫応答を強化するのに有効な量で投与すること、を含む。

一般に、低酸素活性化生体還元剤（ＨＡＢＡ）は化合物であって、酸素の存在下で不活性なプロドラッグであり、低酸素（ｌｏｗ ｏｘｙｇｅｎ）環境［例えば低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）］下で、プロドラッグ形態と比較して増加した活性を有する活性形態に変換される化合物である。一部の実施形態では、低酸素環境下で増加した活性は、投与が本明細書に記載の方法に従って実施されるとき（例えば、低酸素の局所領域が、本明細書に記載の方法によって、腫瘍中、または腫瘍を含有する領域中で発生するとき）のほうが、同量の低酸素活性化生体還元剤が固形腫瘍にまたは固形腫瘍を含有する領域（ただし、低酸素の領域は本明細書に記載の方法によっては発生しない）に投与されるときよりも、固形腫瘍内の腫瘍細胞死のレベルが高いことによって証明される。一部の実施形態では、活性の増加は、少なくとも約１０倍またはそれよりも大きく、その増加はきわめて大きいことがあり、例えば約２０～２００倍、または約５０～２００倍、または１００～２００倍、またはそれよりも大きいことがある。ＨＡＢＡの例には、チラパザミン、バノキサントロン（ＡＱ４Ｎ）、ポルフィロマイシン、アパジコン（ＥＯ９）、１，２－ビス（メチルスルホニル）－１－（２－クロロエチル）－２－［［１－（４－ニトロフェニル）エトキシ］カルボニル］ヒドラジン（ＫＳ１１９）、ジニトロベンズアミドマスタード誘導体（例えばＰＲ１０４）および４－［３－（２－ニトロ－１－イミダゾリル）－プロピルアミノ］－７－クロロキノリンヒドロクロリド（ＮＬＣＱ－１、ＮＳＣ７０９２５７）が挙げられるがこれらに限定されない。さらなる例には、ニトロイミダゾール、ミソニダゾール、エタニダゾールおよびニモラゾール、ＴＧ－３０２、ＳＮ３００００、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、ポルフィロマイシン、ＲＨ１およびＥＯ９（アパジコン）が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＨＡＢＡは、チラパザミンである。一部の実施形態では、チラパザミンは、構造

を有する。

一部の実施形態では、低酸素領域は、酸素のレベルが約１０％未満、好ましくは約５％未満である領域である。一部の実施形態では、低酸素領域中の酸素のレベルは、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％である。一部の実施形態では、約１０％またはそれよりも低い、好ましくは約５％またはそれよりも低い酸素レベルが、チラパザミン等の低酸素活性化生体還元剤を、プロドラッグ形態よりも少なくとも１０倍活性であるレベルまで活性化させるのに十分である。当業者であれば、生物系における酸素レベルの測定値に精通しており、酸素の測定値が「ｍｍＨｇ」（ここで、例えば、１０％のＯ_２は約７６ｍｍＨｇに等しく、１％のＯ_２は約７．６ｍｍＨｇに等しい）で表されうることもまた認識する。

ＨＡＢＡは、低酸素を誘導することによって活性化することができ、これは、有利には、ＨＡＢＡの投与後に実施される。さまざまな戦略のうちの任意のものが、その内部で生体還元剤が活性化される、局所的な低酸素領域を誘導するために利用されうる。一部の実施形態では、これは、標的とする領域を供給する１つまたは複数の血管（one or more
blood vessels that supply the targeted region）の機械的塞栓形成によって
、例えば塞栓剤の投与、または血管を機械的に閉塞するために介入放射線医により置かれるカテーテルを通じたデバイスによって、達成される。一部の実施形態では、低酸素は、動脈塞栓術によって誘導される。一部の実施形態では、血管破壊剤（ＶＤＡ）および／または抗血管新生剤（ＡＡＡ）等の１種または複数の低酸素誘導剤が、その内部で先に投与された、または共投与されたＨＡＢＡが活性化される局所的な低酸素領域を生じさせるために、局所的にまたは全身的に投与される。

一部の実施形態では、血管破壊剤（ＶＤＡ）は、ＤＭＸＡＡ、スチルベンまたはスチルベン誘導体である。スチルベン誘導体の例には、コンブレタスタチン、コンブレタスタチン誘導体、ｃｉｓ－３，４’，５－トリメトキシ－３’－アミノスチルベン（スチルベン５ｃ）、ｃｉｓ－３，４’，５－トリメトキシ－３’－ヒドロキシスチルベン（スチルベン６ｃ）、およびスチルベン５ｃのプロドラッグであるモルホリノ－カルバメート誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。さらなるＶＤＡには、（５Ｓ）－５－（アセチルアミノ）－９，１０，１１－トリメトキシ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ジベンゾ［ａ，ｃ］シクロヘプテン－３－イルジヒドロゲンホスフェート（ＺＤ６１２６）、（Ｎ－［２－［４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－３－ピリジニル］－４－メトキシベンゼンスルホンアミド）（Ｅ７０１０またはＡＢＴ－７５１）が挙げられるがこれらに限定されない。これらの化合物は、全身的に投与された場合でさえ、腫瘍中で選択的に、深い低酸素を誘導する。ＶＤＡの投与は、化学的な塞栓形成のタイプと考えられてもよく、これは、標準的な塞栓形成における血管の直接的な閉塞とは対照的に、腫瘍を含有する領域において選択的に塞栓形成の同じゴールを達成するために化学的薬剤を使用するものである。ＶＤＡと、チラパザミン等の低酸素活性化生体還元剤との組合せは、驚くことに、悪性固形腫瘍の処置においていずれかの薬剤単独の活性に基づいて予想されるよりも有効である。それらの活性は、相乗作用的である。例えば、チラパザミンの後に投薬されるＶＤＡは、チラパザミンの活性化を可能にし、続く腫瘍細胞の殺滅を、いずれかの薬剤単独による腫瘍細胞殺滅のレベルと比べて少なくとも１０倍またはそれよりも大きく増加させる。この戦略はまた、以下に記載される塞栓形成と組み合わされて腫瘍低酸素の誘導およびチラパザミン活性化においてさらにより有効となりうる。

一部の実施形態では、低酸素誘導剤は、抗血管新生剤（ＡＡＡ）である。ＡＡＡの非限定的な例には、ベバシズマブ、イトラコナゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＴＮＰ－４７０、ＣＭ１０１、ＩＦＮα、ＩＬ－１２、血小板因子－４、スラミン、ＳＵ５４１６、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、アンジオスタチン、エンドスタチン、２－メトキシエストラジオール、テコガラン、テトラチオモリブデート、サリドマイド、トロンボスポンジン、プロラクチン、α_ｖβ_３阻害剤、リノマイド、タスキニモド、ラニビズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブおよびエベロリムスが挙げられる。さらなるＡＡＡには、アフリベルセプト、ＩＭＣ－１Ｃ１１、バタラニブ（ＰＴＫ－８７）、Ｎ－（２，３－ジヒドロ－３，３－ジメチル－１Ｈ－インドール－６－イル）－２－［（４－ピリジニルメチル）アミノ］－３－ピリジンカルボキサミド（ＡＭＧ７０６）、３－（４－ブロモ－２，６－ジフルオロ－ベンジルオキシ）－５－［３－（４－ピロリジン－１－イル－ブチル）－ウレイド］－イソチアゾール－４－カルボン酸アミド（ＣＰ－５４７，６３２）、Ｎ－（４－（３－アミノ－１Ｈ－インダゾール－４－イル）フェニル）－Ｎ’－（２－フルオロ－５－メチルフェニル）尿素（ＡＢＴ－８６９）およびセジラニブ（ＡＸＤ－２１７１）が挙げられるがこれらに限定されない。ベバシズマブ等のモノクローナル抗体は、７日を超える半減期を有し、血管新生因子ＶＥＧＦの中和によって作用する。ＶＥＧＦの欠乏は、腫瘍中の新しい血管形成を最終的に妨げ、腫瘍内の酸素の消費に起因して、腫瘍低酸素をもたらす。ソラフェニブおよびスニチニブ等の小分子化合物は、２４時間未満の半減期を有し、ＶＥＧＦ受容体のキナーゼ活性を直接阻害することによって作用する。

一部の実施形態では、ＶＤＡとＡＡＡとの組合せが、腫瘍の低酸素を誘導するのに使用される。一部の実施形態では、ＶＤＡは、腫瘍の血流の即時の抑制を誘導して低酸素およびＨＡＢＡの活性化を誘導する。腫瘍の低酸素の誘導を伴う一部の実施形態では、ＡＡＡは、腫瘍による補整的低酸素応答、例えばＶＥＧＦの産生、または骨髄から内皮前駆細胞を移動させて損傷した腫瘍血管系を修復する他の血管新生因子を阻害するために使用される。ＶＤＡと、ベバシズマブ等のＡＡＡとの組合せは、ＶＥＧＦの補整効果を妨げ、腫瘍血管における修復プロセスを阻害して腫瘍が低酸素状態のままにするうえでのＶＤＡの効果を強化するのを助ける。

一部の実施形態では、これらの方法のさまざまな組合せもまた企図され（例えば塞栓形成プラス１種または複数の低酸素誘導剤）、その全体的効果（活性化される生体還元剤の局所提供、および生体還元剤への全身的曝露により通常起きる副作用なしの、標的部位内のまたは標的部位での腫瘍細胞の有効な殺滅）が目標とされる。この強化はまた、腫瘍細胞殺滅の適切で有効なレベルを維持しながら低用量の薬剤を使用し、それにより毒性をさらに減少させることを可能にする。一部の実施形態では、本明細書に記載の組合せ腫瘍治療の成分には、１種または複数の抗血管新生剤（ＡＡＡ）、および１種または複数の血管破壊剤（ＶＤＡ）、および低酸素活性化生体還元剤（ＨＡＢＡ）が挙げられる。ＡＡＡとＶＤＡとの組合せは、一緒に投与されたとき、腫瘍細胞において、延長された低酸素を誘導し、それら自体で腫瘍を死滅させることにいくらかの有効性を示す。しかしながら、それらの活性は、それらが本明細書に記載のように低酸素活性化生体還元剤（ＨＡＢＡ）との組合せで投与されるとき、相乗作用の様式で有意に強化される。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＨＡＢＡを共投与することによってＡＡＡおよび／またはＶＤＡの抗がん活性を強化する方法である。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＡＡＡおよび／またはＶＤＡを共投与することによってＨＡＢＡの抗がん活性を強化する方法である。一部の実施形態では、有効性は、免疫チェックポイント阻害剤の投与によってさらに強化される。

塞栓形成手技の一例では、塞栓形成は、腫瘍において、または同定可能な動脈の分枝、例えば肝細胞癌を供給する肝動脈により供給されている腫瘍を含有する領域において、使用される局所治療を含み、これは、腫瘍を含有している領域を供給する動脈の分枝の閉塞を誘導して腫瘍細胞が適切な血流を得られず死滅するように、材料（例えばリピオドール、ゲルフォーム、血餅、特定のビーズなど）を注射することによる。その領域およびその周りの正常な器官または組織の血液供給体を解剖すると、その周りの器官／組織が、塞栓形成後の血液供給の不足に起因して有意な損傷を経験することがあるかどうかが決定される。例えば、正常な肝臓は、二重の血管、肝動脈および門脈によって供給されており、そのため、正常な肝臓への有意な損傷という結果なしで肝動脈またはその分枝の閉塞が可能である。この手技は、介入放射線医によって一般に実施され、介入放射線医は、Ｘ線透視装置のガイダンス下、鼠径部の大腿動脈からカテーテルを置いて、カテーテルの先端を、腫瘍を供給している肝動脈の分枝へと進める。腫瘍を供給している動脈の分枝が造影剤の注入によって同定されると、リピオドールまたはゲルフォーム等の塞栓剤が注射されて分枝を閉塞する。

リピオドールに加えて、他の塞栓剤には、ゲルフォーム、血餅、ナノ粒子、または血管閉塞の目的を達成できる臨床的に証明された任意の機械的作用物質（mechanical agent
）が挙げられるがこれらに限定されない。塞栓剤および低酸素活性化生体還元剤（ＨＡＢＡ）の投与は、任意の好適な方法で実行されうる。例えばＨＡＢＡが、塞栓剤の投与の前に（例えば約１～１２０分前に）投与され得、続く塞栓剤の投与が、領域中でＨＡＢＡを「捕捉」する。あるいは、２種の薬剤が一緒に投与されてもよい（例えば混合物中に２種の薬剤を含む調製物を使用して）。一部の実施形態では、投与されるＨＡＢＡの投与量は、この方法で処置される患者について、（例えばチパラジンの）約１ｍｇ～約２００ｍｇ、好ましくは約５ｍｇ～約８０ｍｇの範囲にあり、投与される塞栓剤の用量は、例えばリピオドールの約５～４０ｍｌ、好ましくは約２０～３０ｍｌの範囲にある。塞栓形成範囲における低酸素領域または状態の創製を確実にするために、十分な塞栓剤が、Ｘ線透視装置検査下、意図される血管の分枝の完全な閉塞を達成するために投与される。塞栓剤の投与は、通常、動脈内注射によって実施される。あるいは、塞栓形成は、閉塞を誘導するための特定のビーズ等の他の手段によって実施されうる。

一部の実施形態では、ＨＡＢＡと、低酸素の誘導との組合せが、固形腫瘍の壊死を誘導する。一部の実施形態では、組合せは、１つまたは複数の腫瘍の、少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９５％またはそれよりも多い壊死を誘導する。誘導される壊死の程度は、処置に続く所定時間後に到達する程度でありうる。例えば、少なくとも５０％の腫瘍壊死は、処置後１、２、３、４週以内もしくはそれよりも多い週以内に、または処置後１、２、３、４、５か月以内もしくはそれよりも多い月以内に達成されうる。一部の実施形態では、処置により誘導される腫瘍壊死の程度は、開始時の腫瘍の大きさと比べ、処置後に観察される壊死の最大レベルである。

一部の実施形態では、腫瘍の壊死は、腫瘍が発現する１種または複数の抗原に対する、被験体における免疫応答を誘導する。例えば、腫瘍抗原には、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＢＣＲ－ａｂｌ、ｐ５３、未成熟ラミニン受容体、ＴＡＧ－７２、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＢＩＮＧ－４、カルシウム活性化クロリドチャネル２、サイクリン－Ｂ１、９Ｄ７、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、メソテリン、ＳＡＰ－１、サバイビン、ＢＡＧＥ、ＣＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＳＡＧＥ、ＸＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ－２、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、Ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、Ｐ．ポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ｂ－カテニン、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ＭＡＲＴ－２またはＴＧＲｂＲＩＩが挙げられるがこれらに限定されない。

ＨＡＢＡの投与、低酸素の誘導、および免疫チェックポイント阻害剤の投与は、逐次的であってもよく同時であってもよい。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤が、ＨＡＢＡおよび／または低酸素の誘導に続いて投与されてもよい。例としては、免疫チェックポイント阻害剤が、ＨＡＢＡの投与もしくは低酸素の誘導のいずれか、またはその両方の前に、単独で投与されてもよい。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤が投与され、続いてＨＡＢＡが投与され、後で低酸素を誘導してもよい。免疫チェックポイント阻害剤が、ＨＡＢＡの投与後および／または低酸素の誘導後に、単独で投与されてもよい。あるいは、免疫チェックポイント阻害剤が、ＨＡＢＡおよび／または低酸素の誘導との組合せで投与されてもよい。

一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、低酸素を誘導する前に、それと同時にまたはそれに続いて投与される。低酸素を誘導する前に投与されるとき、免疫チェックポイント阻害剤は、低酸素を誘導する約５分～約２４時間前またはそれよりも前に投与されてもよい。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、低酸素を誘導する約５、１０、１５、２０、２５、３０、４５または６０分前に投与される。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、低酸素を誘導する約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１８、２４時間前に投与される。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、低酸素を誘導する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２１、２８日前またはそれよりも前に投与される。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、低酸素を誘導する前に、１回投与される。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、低酸素を誘導する前に、複数回投与される（例えば２、３、４、５、１０、１５、２５回またはそれよりも多い回数）。同時に投与されるとき、２種の薬剤は、組合せ組成物として（例えば単一の液体懸濁液で）、または、ほぼ同じ時間に投与される別々の組成物として、同一もしくは異なる投与経路を通じて、投与されうる。低酸素の誘導に続いて投与されるとき、免疫チェックポイント阻害剤は、低酸素を誘導した約５～２４時間後またはそれよりも後に投与されうる。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、低酸素を誘導した約５、１０、１５、２０、２５、３０、４５または６０分後に投与される。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、低酸素を誘導した約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１８、２４時間後に投与される。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、低酸素を誘導した１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２１、２８日後またはそれよりも後に投与される。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、低酸素を誘導した後に、１回投与される。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、低酸素を誘導した後に、複数回投与される（例えば２、３、４、５、１０、１５、２５回またはそれよりも多い回数）。

免疫チェックポイント阻害剤の投与は、目標治療成果などの指定されたエンドポイントが得られるまで、設定した投薬スケジュールに従ってもよい。投薬スケジュールの例には、１日当たり１回もしくは複数回（例えば１、２、３回もしくはそれよりも多い回数）；１、２、３、４、５、６、７日もしくはそれよりも多い日ごとに１回もしくは複数回；１、２、３、４週もしくはそれよりも多い週ごとに１回もしくは複数回；１、２、３、４、５、６か月もしくはそれよりも多い月ごとに１回もしくは複数回；またはこれらの組合せ（例えば漸減される投薬スケジュールにおいて）で免疫チェックポイント阻害剤を投与することが挙げられる。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、低酸素を誘導した後に数週間にわたり複数回、例えば低酸素を誘導した後に１、２、３、４、５、６、８、１２、１６、２０、２４週または５２週にわたり１日当たり１、２、３、４回またはそれよりも多い回数で投与される。

一般に、免疫チェックポイント阻害剤は、１種または複数の免疫チェックポイントタンパク質を、完全にまたは部分的に、減少させる、阻害する、干渉するまたはモジュレートする薬剤である。免疫チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞の活性化または機能を調節する。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞が挙げられるがこれらに限定されないＴ細胞の活性または機能を増加させる。一部の実施形態では、ヘルパーＴ細胞には、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞およびＴｈ１７細胞が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗原に対する免疫応答を増加させるために、調節性Ｔ細胞の活性を低下させる一方で、細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞の活性を増加させる。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍抗原に応答してＴ細胞の増殖を増加させる。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ２２、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮｂ、ＩＦＮｇ、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＭＩＦ、ＴＧＦｂ、ＴＮＦａ、ＶＥＧＦまたはオンコスタチンＭが挙げられるがこれらに限定されない、腫瘍抗原に応答してＴ細胞によるサイトカインの分泌を増加させる。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、パーフォリン、グランザイムおよびグラウリシンが挙げられるがこれらに限定されない細胞毒の放出によって、細胞傷害性Ｔ細胞の活性、または腫瘍細胞の殺滅を増加させる。免疫チェックポイントタンパク質の標的の例には、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られる）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１としても知られる）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ、ＣＤ２７２としても知られる）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５２としても知られる）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、プログラム死－１（ＰＤ－１）、プログラム死－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、Ｔ細胞活性化のＶ－ドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、ＩＬ－１０またはＴＧＦ－ベータが挙げられるがこれらに限定されない。

図１は、腫瘍細胞と細胞傷害性Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）と調節性Ｔ細胞との間の相互作用、ならびにさまざまな抗体を使用する免疫チェックポイントの調節を例示する例のダイアグラムを提供している。例えば、図１で図示しているのは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１を含む免疫チェックポイント受容体を対象とする抗体である。抗ＰＤ－１抗体および抗-ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用をブロ
ックすることによって細胞傷害性Ｔ細胞の活性を強化し得る。抗－ＰＤ－Ｌ１または抗ＰＤ－１の、腫瘍細胞への投与は、免疫回避を妨げ、免疫介在性抗腫瘍活性を増加させ得る。抗ＣＴＬＡ４抗体は、これもまた描示されており、ＣＴＬＡ４関与の免疫抑制効果をブロックして潜在的にＴ細胞の増殖を強化することによって、活性な細胞傷害性Ｔ細胞の免疫媒介性細胞傷害性を強化し得る。こうした抗体は、調節性Ｔ細胞の活性を低下させ得る。

さまざまな免疫チェックポイント阻害剤のうちの任意のものが、有利には利用されうる。阻害剤は、小分子、阻害性ポリペプチド（例えば天然のもしくはトランケートされたリガンドまたは受容体にあるもの）、アプタマーまたは抗体とすることができる。一部の実施形態では、阻害剤は、抗体、または免疫チェックポイントタンパク質に結合するその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、抗体は、２つの重鎖配列および２つの軽鎖配列を含む全長抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤアイソタイプである。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧサブタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプのものである。一部の実施形態では、抗体は、重鎖、軽鎖、または少なくとも１つの重鎖および少なくとも１つの軽鎖である。一部の実施形態では、抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦａｂ’_２、Ｆｖ、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（ｄｄＦｖ）、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃａｍｅｌ Ｉｇ、Ｖ－ＮＡＲ、ＶＨＨ、三重特異性（Ｆａｂ_３）、二重特異性（Ｆａｂ_２）、ダイアボディ（（Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ）_２または（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ）_２）、トリボディ（三価）、テトラボディ（四価）、ミニボディ（（ｓｃＦｖ－ＣＨ_３）_２）、二重特異性単鎖Ｆｖ（Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ）、ＩｇＧデルタＣ_Ｈ２、ｓｃＦＶ－Ｆｃまたは（ｓｃＦＶ）_２－Ｆｃ、断片または単鎖抗体である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、ＭＥＤＩ４７３６、ランブロリズマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ－９３６５５９、ＢＭＳ－９３６５５８／ＭＤＸ－１１０６、ＣＴ－０１１、ピジリズマブ、ガリキシマブ、ＡＭＰ－５１４、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＫ－３４７５、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＩＭＰ３２１、ＢＭＳ－９８６０１６、ＩＰＨ２１０１、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＡＵＮＰ１２、トレメリムマブおよびイピリムマブから選択される。

一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ヒトまたは非ヒト動物（例えばマウスもしくはラット）に由来するモノクローナル抗体であり、ここで、モノクローナル抗体は、特異的に免疫チェックポイントタンパク質に結合することが可能である。モノクローナル抗体を調製するためのさまざまな方法論が利用可能である。一般に、モノクローナル抗体は、任意の、真核生物クローン、原核生物クローンまたはファージクローンを含む単一のクローンから得られ、またはそれに由来する。一部の実施形態では、非ヒト抗体の源（例えばキメラ抗体またはヒト化抗体中の）に由来しない部分に加えて非ヒト抗体由来の１つまたは複数の重鎖および／または軽鎖を含む抗体は、（ａ）結合するために競合することが可能である、（ｂ）機能的特性を保持する、（ｃ）同一のエピトープに結合する、および／または（ｄ）対応する親の非ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。

一部の態様では、ヒト抗体由来の１つまたは複数の重鎖および／または軽鎖を含むモノクローナル抗体が提供される。ヒト抗体は、完全なヒトアミノ酸配列、例えばヒト重鎖およびヒト軽鎖の可変部ならびにヒト定常部を有する抗体を含む。非ヒト抗体である抗体は、非ヒトアミノ酸残基を、ヒト抗体中に存在するアミノ酸残基で置き換えることによって完全にヒト抗体にすることができる。したがって、ヒト抗体は、１つまたは複数のヒトまたは非ヒトアミノ酸残基が、任意の他のヒト抗体中に存在する１つまたは複数のアミノ酸で置き換えられている抗体を含む。

一部の実施形態では、非ヒト動物から得られた抗体は、ヒト化されうる。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）中に、非ヒト、例えばマウス、ラット、ヤギ、ウサギのアミノ酸残基を有し、これは、アクセプター免疫グロブリン分子中の所望の抗原、およびＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）中の１つまたは複数のヒトアミノ酸残基に特異的に結合し、それらは、ＣＤＲに隣接するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒト抗体からの適切なＣＤＲセグメントを、ヒト抗体足場中へ挿入することによって創られ、ここで、ヒト化抗体は、免疫チェックポイント阻害剤に特異的に結合することが可能である。一部の実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体は、第２のヒト抗体からの１つまたは複数の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲドメインを置き換えるのに使用される、第１の非ヒト抗体からの１つまたは複数の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲドメインを含む。一部の実施形態では、第１の抗体は、非ヒト動物から得られ、免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合することが可能である。第１の抗体からのＣＤＲドメインは、第２のヒト抗体中のＣＤＲドメインを置き換え、ここで、第２のヒト抗体は、免疫チェックポイントタンパク質に対する結合特異性を欠いている。このプロセスは、第１の抗体からのＣＤＲドメインの付加に起因して免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合することが可能であるヒト化モノクローナル抗体を生成させ、残っている抗体ドメインがヒト抗体に由来するために免疫系によって異物（foreign）であると認識されない。一部の実施形態では、第１の抗体からの１つまたは複数の重
鎖および／または軽鎖ＣＤＲドメインを含むヒト化抗体は、（ａ）結合するために競うことが可能である、（ｂ）機能的特性を保持する、（ｃ）同一のエピトープと結合する、および／または（ｄ）対応する第１の抗体と類似した結合親和性を有する。

低酸素活性化生体還元剤、低酸素誘導剤、および免疫チェックポイント阻害剤は、任意の好適な投与経路によって被験体に投与するための医薬組成物として製剤化されうる。投与経路の例には、非経口（皮下、静脈内、動脈内、骨内、大脳内、脳室内、髄腔内（intrathecal）、髄内、関節内、筋肉内または腹腔内の注射を含む）、直腸、局所的、経皮的
または経口（例えば、カプセル剤、懸濁剤、または錠剤で）が挙げられるがこれらに限定されない。医薬組成物は、一般に、医薬的投与またはｉｎ ｖｉｖｏの接触もしくは送達と適合性のある、１種または複数の活性剤、および１種または複数の薬学的に許容される賦形剤（溶媒（水性もしくは非水性）、溶液（水性もしくは非水性）、エマルション（例えば水中油型もしくは油中水型）、懸濁液、シロップ、エリキシル、ディスパーションおよび懸濁液媒体、コーティング剤、等張剤および吸収促進剤または遅延剤が挙げられるがこれらに限定されない）を含む。水性または非水性の、溶媒、溶液および懸濁液は、懸濁剤および増粘剤を含んでもよい。こうした薬学的に許容される担体としては、錠剤（コーティングされているまたはコーティングされていない）、カプセル（硬または軟）、マイクロビーズ、粉末、顆粒および結晶が挙げられる。補助的活性化合物（例えば保存剤、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤）もまた、組成物中に組み込まれうる。

共溶媒の非限定的な例は、ヒドロキシル基または他の極性基、例えばアルコール、例えばイソプロピルアルコール；グリコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリコールエーテル；グリセロール；ポリオキシエチレンアルコールおよびポリオキシエチレン脂肪酸エステルを含む。共溶媒の非限定的な例は、ヒドロキシル基または他の極性基、例えばアルコール、例えばイソプロピルアルコール；グリコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリコールエーテル；グリセロール；ポリオキシエチレンアルコールおよびポリオキシエチレン脂肪酸エステルを含む。

補助的化合物（例えば、保存剤、抗酸化剤；抗菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤等の殺生物剤およびバイオスタットを含む抗微生物剤）もまた、組成物中に組み込まれうる。したがって、医薬組成物は、保存剤、抗酸化剤および抗微生物剤を含んでもよい。保存剤は、微生物の成長を阻害し、または成分の安定性を増加させ、それによって医薬製剤の貯蔵寿命を延長させるために使用されうる。好適な保存剤は、当技術分野で公知であり、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、塩化ベンザルコニウムまたは安息香酸またはベンゾエート、例えば安息香酸ナトリウムが挙げられる。抗酸化剤には、例えば、アスコルビン酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、トコフェロール、および類似のビタミンまたはプロビタミンが挙げられる。抗微生物剤または抗微生物化合物は、直接的にまたは間接的に、病原性もしくは非病原性の微生物有機体による汚染、または病原性もしくは非病原性の微生物有機体の成長、感染性、複製、増殖、再生を阻害する、減少させる、遅延させる、止める、除去する、停止する、抑制するもしくは防止する。抗微生物剤のクラスには、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤および駆虫薬が挙げられる。抗微生物剤には、微生物有機体を死滅させるもしくは破壊する（殺－（- cidal））、または微生物有機体による汚染もしくは微生物有機体の成長、感染性、複製、増殖、再生を阻害する（静－（-static））薬剤および化合
物が挙げられる。

一部の実施形態では、処置ステップのうちの１つまたは複数が、繰り返されうる。例えば、ＨＡＢＡを投与するステップ、低酸素を誘導するステップ、および免疫チェックポイント阻害剤を投与するステップが、処置のコースにわたり、１つのコースで１回または複数回、一緒に繰り返されうる。一部の実施形態では、１つのステップが、他のステップの不在下で繰り返される。例えば、ＨＡＢＡを投与し、低酸素を誘導した後に、免疫チェックポイント阻害剤が、処置のコースにわたる投薬スケジュールに従って、２回またはそれよりも多い回数投与されてもよい。一部の実施形態では、ＨＡＢＡを投与し、低酸素を誘導した後に、免疫チェックポイント阻害剤が、処置のコースにわたる投薬スケジュールに従って、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０回またはそれよりも多い回数投与される。一部の実施形態では、ＨＡＢＡを投与し、低酸素を誘導する前に、免疫チェックポイント阻害剤が、処置のコースにわたる投薬スケジュールに従って、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０回またはそれよりも多い回数投与される。一部の実施形態では、ＨＡＢＡを投与し、低酸素を誘導した後に、免疫チェックポイント阻害剤が、処置のコースにわたる投薬スケジュールに従って、１時間ごと、１日ごと、１週ごと、または１か月ごとに投与される。

一部の実施形態では、本開示の、方法、組成物およびキットは、被験体の増殖障害、特に１つまたは複数の固形腫瘍を含むものの処置において有用である。増殖障害の例には、棘細胞腫、腺房細胞癌、聴神経腫、末端黒子型黒色腫、先端汗腺腫、急性好酸球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、成熟した急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、アダマンチノーマ、腺癌、アデノイド嚢胞癌、アデノーマ、腺様歯原性腫瘍、副腎皮質癌、成人Ｔ細胞白血病、侵攻性ＮＫ細胞白血病、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、胞状軟部肉腫、エナメル上皮線維腫、肛門がん、未分化大細胞型リンパ腫、未分化甲状腺がん、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管筋脂肪腫、血管肉腫、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫様横紋筋肉腫様腫瘍、基底細胞癌、基底様癌、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、ベッリーニ腺管癌、胆道がん、膀胱がん、芽細胞腫、骨がん、骨腫瘍、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳がん、ブレンナー腫瘍、気管支腫瘍、細気管支肺胞癌、ブラウン腫瘍、バーキットリンパ腫、原発部位不明のがん、カルチノイド腫瘍、癌腫、上皮内癌、陰茎の癌、原発部位不明の癌腫、癌肉腫、キャッスルマン病、中枢神経系胚芽腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸がん、胆管癌、軟骨腫、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、脈絡叢乳頭腫、慢性リンパ性白血病、慢性単球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、慢性好中球性白血病、明細胞腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、デゴス病、***性皮膚線維肉腫、皮様嚢腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、胎児性癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜がん、子宮内膜子宮がん、子宮内膜性腫瘍、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫、上衣芽腫、上衣腫、類上皮肉腫、赤白血病、食道がん、感覚神経芽腫、ユーイングファミリー腫瘍、ユーイングファミリー肉腫（Ｅｗｉｎｇ Ｆａｍｉｌｙ Ｓａｒｃｏｍａ）、ユーイング肉腫（Ｅｗｉｎｇ’ｓ Ｓａｒｃｏｍａ）、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、***外ページェット病、卵管がん、胎児内胎児、線維腫、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、濾胞性甲状腺がん、胆嚢がん、胆嚢がん、神経節膠腫、神経節細胞腫、胃がん、胃リンパ腫、胃腸がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、消化管間質腫瘍、胚細胞腫瘍、胚細胞腫、妊娠性絨毛癌、妊娠性絨毛性腫瘍、骨巨細胞腫瘍、多形神経膠芽腫、グリオーマ、大脳神経膠腫症、グロームス腫瘍、グルカゴノーマ、性腺芽腫、顆粒膜細胞腫瘍、有毛細胞白血病、有毛細胞白血病、頭頚部がん、頭頚部がん、心臓がん、血管芽腫、血管外皮細胞腫、血管肉腫、血液系腫瘍、肝細胞癌、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、遺伝性乳がん－卵巣がん症候群、ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部グリオーマ、炎症性乳がん、眼球内黒色腫、膵島細胞癌、膵島細胞腫瘍、若年性骨髄単球性白血病、カポジ肉腫、カポジ肉腫、腎がん、クラツキン腫瘍、クルーケンベルグ腫瘍、喉頭がん、喉頭がん、悪性黒子黒色腫、白血病、白血病、***口腔がん、脂肪肉腫、肺がん、黄体腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ上皮腫、リンパ性白血病、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、悪性線維性組織球腫、骨の悪性線維性組織球腫、悪性グリオーマ、悪性中皮腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、悪性ラブドイド腫瘍、悪性トリトン腫瘍、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、マスト細胞白血病、縦隔胚細胞腫瘍、縦隔腫瘍、甲状腺髄様がん、髄芽腫、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頚部がん（Metastatic
Squamous Neck Cancer with Occult Primary）、転移性尿路上皮癌、転移性結腸
直腸がん、ミュラー管混合腫瘍、単球性白血病、口腔がん（Ｍｏｕｔｈ Ｃａｎｃｅｒ）、粘液性腫瘍、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫、菌状息肉症、菌状息肉症、骨髄異形成疾患、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄肉腫、骨髄増殖性疾患、粘液腫、鼻腔がん、鼻咽頭がん、鼻咽頭癌、新生物、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、神経腫、結節性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚がん、非小細胞肺がん、眼性腫瘍（Ocular oncology）、乏突起星細胞腫（Oligoastrocytoma）、乏突起神経膠腫、オンコサイトーマ、視神経鞘髄膜腫、口腔がん（Ｏｒａｌ Ｃａｎｃｅｒ）、口腔がん（Ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口咽頭がん、骨肉腫、骨肉腫、卵巣がん、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、***ページェット病、パンコースト腫瘍、膵がん、膵がん、乳頭状甲状腺がん、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、血管周囲類上皮細胞腫瘍、咽頭がん、褐色細胞腫、中分化の松果体実質腫瘍、松果体芽腫、下垂体細胞腫、下垂体腺種、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍、胸膜肺芽腫、多胚腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、原発性肝細胞がん、原発性肝がん、原発性腹膜がん、原始神経外胚葉性腫瘍、前立腺がん、腹膜偽性粘液腫、直腸がん、腎細胞癌、クロロソーム１５上にＮＵＴ遺伝子を含む気道癌、網膜芽細胞腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、リヒタートランスフォーメーション、仙尾部奇形腫、唾液腺がん、肉腫、神経鞘腫症、脂腺癌、続発性新生物、セミノーマ、漿液性腫瘍、セルトリ－ライディッヒ細胞腫、性索間質性腫瘍、セザリー症候群、印環細胞癌、皮膚がん、小型青細胞腫瘍（Small blue round cell tumor）、小細胞癌、小細胞肺がん、小細胞リンパ腫、小腸がん、軟部組織
肉腫、ソマトスタチン産生腫瘍、煤煙性疣、脊髄腫瘍、脊椎腫瘍（Spinal tumor）、脾
臓周辺帯リンパ腫、扁平上皮癌、胃がん、表在拡大型黒色腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、表面上皮間質腫瘍、滑膜肉腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞大型顆粒リンパ球白血病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞性リンパ腫、Ｔ細胞性前リンパ性白血病、奇形腫、末期リンパ性がん（Terminal lymphatic cancer）、精巣がん、莢膜細胞腫、咽喉がん
、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、移行上皮癌、尿膜管がん、尿道がん、泌尿生殖器新生物、子宮肉腫、ぶどう膜黒色腫、膣がん、ベルネル・モリソン症候群、疣状癌、視経路グリオーマ、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ウォーシン腫瘍、ウィルムス腫瘍、またはこれらの任意の組合せが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、固形腫瘍が処置される。固形腫瘍の例には、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、頭頚部がん、卵巣がんおよび膵がんが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＨＡＢＡの投与と低酸素の誘導と免疫チェックポイント阻害剤の投与との組合せは、被験体における増殖障害の処置において相乗効果を呈する。

がんの処置における有効性は、特に、任意の好適な測定基準によって測定されうる。一部の実施形態では、治療有効性は、がん等の増殖障害の処置の効果に基づいて測定される。一般に、増殖障害（例えばがん、良性であっても悪性であっても）の処置に関して、本発明の方法および組成物の治療有効性は、方法および組成物が、腫瘍細胞増殖の阻害、腫瘍血管化の阻害、腫瘍細胞の根絶、および／またはヒトが増殖障害のために処置されるような少なくとも１つの腫瘍の大きさの縮小を、促進する程度によって測定されうる。治療有効性の決定において考慮されるいくつかのパラメータが、本明細書で考察される。特定の状況についてのパラメータの適当な組合せが、臨床医によって確立されうる。がんの処置における本発明の方法の進捗（例えば腫瘍の大きさの縮小、またはがんの細胞の根絶）は、任意の好適な方法、例えばクリニックで現在使用されている、腫瘍の大きさおよびがんの進行を追跡する方法を使用して確かめられうる。一部の実施形態では、がんの処置を評価するのに使用される主要な有効性パラメータは、好ましくは、腫瘍の大きさの縮小である。腫瘍の大きさは、任意の好適な技術、例えば寸法の測定、または入手可能なコンピュータソフトウエア、例えば、腫瘍の体積の正確な概算を可能にする、ウェイクフォレスト大学で開発されたＦｒｅｅＦｌｉｇｈｔソフトウェアを使用する腫瘍の体積の概算を使用して決定されうる。腫瘍の大きさは、例えば、ＣＴ、超音波、ＳＰＥＣＴ、スパイラルＣＴ、ＭＲＩ、写真などを使用する腫瘍の可視化によって決定されうる。腫瘍が治療期間完了後に外科的に切除される実施形態では、腫瘍組織の存在および腫瘍の大きさは、切除される組織のグロス分析によって、および／または切除された組織の病理分析によって決定されうる。

望ましくは、腫瘍の成長は、処置の結果として安定する（すなわち、１つまたは複数の腫瘍が、大きさにおいて、１％、５％、１０％、１５％または２０％超で増加せず、および／または転移しない）。一部の実施形態では、腫瘍は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週またはそれよりも多い週の間、安定する。一部の実施形態では、腫瘍は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月またはそれよりも多い月の間、安定する。一部の実施形態では、腫瘍は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年またはそれよりも多い年の間、安定する。好ましくは、腫瘍の大きさは、少なくとも約５％（例えば少なくとも約１０％、１５％、２０％または２５％）縮小する。より好ましくは、腫瘍の大きさは、少なくとも約３０％（例えば少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％）縮小する。さらにより好ましくは、腫瘍の大きさは、少なくとも約７０％（例えば少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％）縮小する。最も好ましくは、腫瘍は、完全に除去される、または検出レベル未満に縮小する。一部の実施形態では、被験体は、処置に続く少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週またはそれよりも多い週の間、腫瘍なしのままである（例えば寛解にある）。一部の実施形態では、被験体は、処置に続く少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月またはそれよりも多い月の間、腫瘍なしのままである。一部の実施形態では、被験体は、処置後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年またはそれよりも多い年の間、腫瘍なしのままである。

腫瘍が治療期間の完了に続いて外科的切除に供されるとき、腫瘍の大きさの縮小における本発明の方法の有効性は、壊死している（すなわち死んだ）切除された組織の百分率の測定によって決定されうる。一部の実施形態では、処置は、切除された組織の壊死の百分率が約２０％超（例えば少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％）、より好ましくは約９０％またはそれよりも多い（例えば約９０％、９５％または１００％）である場合に、治療上有効である。最も好ましくは、切除された組織の壊死の百分率は、約１００％であり、すなわち腫瘍組織は存在しない、または検出可能でない。

多くの二次的パラメータが、本発明の方法の有効性を決定するのに利用されうる。二次的パラメータの例には、新しい腫瘍の検出、腫瘍抗原または腫瘍マーカー（例えばＣＥＡ、ＰＳＡまたはＣＡ－１２５）の検出、生検、外科的ダウンステージング（すなわち、切除不能から切除可能への、腫瘍の外科的ステージの変換）、ＰＥＴスキャン、生存率、疾患無増悪生存率、疾患進行への時間、臨床的有用性応答評価等の生活の質の評価などが挙げられるがこれらに限定されず、これらのすべては、ヒトにおけるがんの全体的進行（または退行）を指し示すことができる。生検は、組織内の、がん性細胞の根絶を検出するのにとりわけ有用である。放射免疫検出法（ＲＡＩＤ）は、腫瘍によって生成された、および／または腫瘍に関連する、マーカー（抗原）（「腫瘍マーカー」または「腫瘍関連抗原」）の血清レベルを使用して腫瘍の位置を突き止め、ステージ分類するのに使用され、処置前の診断的断定、処置後の再発の診断的指標、および処置後の治療有効性の指標として有用でありうる。治療有効性の指標として評価されうる腫瘍マーカーまたは腫瘍関連抗原の例には、癌胎児性抗原（carcinembryonic antigen）（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＣＡ－１２５、ＣＡ１９－９、ガングリオシド分子（例えばＧＭ２、ＧＤ２およびＧＤ３）、ＭＡＲＴ－１、熱ショックタンパク質（例えばｇｐ９６）、シアリルＴｎ（ＳＴｎ）、チロシナーゼ、ＭＵＣ－１、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ｃ－ｅｒｂ－Ｂ２、ＫＳＡ、ＰＳＭＡ、ｐ５３、ＲＡＳ、ＥＧＦ－Ｒ、ＶＥＧＦ、ＭＡＧＥおよびｇｐ１００が挙げられるがこれらに限定されない。他の腫瘍関連抗原が、当技術分野で公知である。内視鏡検出システムと組み合わされたＲＡＩＤ技術もまた、小さい腫瘍を、その周りの組織から効率的に識別する（例えば米国特許第４９３２４１２号を参照されたい）。

一部の実施形態では、ヒト患者におけるがんの処置は、以下の結果のうちの１つまたは複数によって証明される：（ａ）腫瘍の完全な消失（すなわち完全奏効）、（ｂ）治療期間の完了後少なくとも４週間の間、腫瘍の大きさが、処置前の腫瘍の大きさと比べて約２５％～約５０％縮小、（ｃ）治療期間の完了後少なくとも４週間の間、腫瘍の大きさが、治療期間前の腫瘍の大きさと比べて少なくとも約５０％縮小、および（ｄ）治療期間の完了後約４～１２週に、特異的な腫瘍関連抗原レベルが、治療期間前の腫瘍関連抗原レベルと比べて少なくとも２％低下（例えば約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％低下）。腫瘍関連抗原レベルの少なくとも２％低下が好ましいが、腫瘍関連抗原レベルの任意の減少が、患者におけるがんの処置の証拠である。例えば、切除不能な、局所的に進行した膵がんに関して、処置は、治療期間の完了後第４～１２週でのＣＡ１９－９腫瘍関連抗原レベルの、治療期間前のＣＡ１９－９レベルと比べての少なくとも１０％低下によって証明されうる。同様に、局所的に進行した直腸がんに関して、処置は、治療期間の完了後第４～１２週でのＣＥＡ腫瘍関連抗原レベルの、治療期間前のＣＥＡレベルと比べての少なくとも１０％低下によって証明されうる。

生活の質の評価、例えば臨床的利益応答基準（Clinical Benefit Response Criteria）に関して、本発明による処置の治療的利益は、痛み強度、鎮痛剤消費および／または
カルノフスキーパフォーマンススケールスコアの点で証明されうる。カルノフスキーパフォーマンススケールは、患者を、彼らの機能的欠陥に従って分類することを可能にする。カルノフスキーパフォーマンススケールは、０～１００でスコア付けされる。一般に、より低いカルノフスキースコアは、生存のための予後不良を予測する。そのため、ヒト患者におけるがんの処置は、代替的にまたは付加的に、（ａ）患者によって報告される痛み強度が、例えば処置の完了後１２週間のうちの任意の連続する４週間の期間中に、処置前に患者により報告された痛み強度と比べて少なくとも５０％低下（例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％低下）、（ｂ）患者により報告される鎮痛剤消費が、例えば処置の完了後１２週間のうちの任意の連続する４週間の期間中に、処置前に患者により報告された鎮痛剤消費と比べて少なくとも５０％減少（例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％減少）、および／または（ｃ）患者により報告されるカルノフスキーパフォーマンススケールスコアが、例えば治療期間の完了後１２週間のうちの任意の連続する４週間の期間中に、治療期間前に患者により報告されたカルノフスキーパフォーマンススケールスコアと比べて少なくとも２０ポイント増加（例えば少なくとも３０ポイント、５０ポイント、７０ポイントもしくは９０ポイント増加）によって証明される。

ヒト患者における増殖障害（例えばがん、良性であっても悪性であっても）の処置は、望ましくは、前述の結果のうちの１つまたは複数（任意の組合せで）によって証明されるが、参照される試験および／または他の試験の、代替的なまたは付加的な結果が、処置の有効性を証明することができる。

一部の実施形態では、腫瘍の大きさは、好ましくは、被験体における有意な有害事象なしで縮小される。有害事象は、米国国立がん研究所（ＮＣＩ）のがん治療評価プログラム（ＣＴＥＰ）によって分類され、または「グレード付け」され、グレード０は最小の有害な副作用を表し、グレード４は最も重篤な有害事象を表す。ＮＣＩの毒性スケール（１９９９年４月に刊行）および一般毒性基準マニュアル（Common Toxicity Criteria Manual）（１９９９年８月に更新）が、ＮＣＩを通じて、例えばＮＣＩインターネットウェブサイトwww.ctep.info.nih.govを通じて、またはＮＣＩがん治療診断部門が後援している
、治験薬の臨床試験における参加者用の、治験責任医師のハンドブック（１９９８年３月に更新）中で入手可能である。望ましくは、本明細書に記載の方法は、ＣＴＥＰ／ＮＣＩによるグレード付けで、最小の有害事象、例えばグレード０、グレード１またはグレード２の有害事象に関連する。しかしながら、腫瘍の大きさの縮小は、好ましくはあるが、腫瘍細胞の根絶（例えば壊死で）にもかかわらず腫瘍の実際の大きさが縮まないことがあるが故に、求められてはいない。がん性細胞の根絶が、治療効果を明確に理解するのに十分である。同様に、腫瘍の大きさにおける任意の縮小も、治療効果を明確に理解するのに十分である。

ヒトにおけるさまざまながんの、検出、モニタリングおよびレーティングは、Cancer Facts and Figures 2001、American Cancer Society、New York、N.Y.、および国
際特許出願ＷＯ０１／２４６８４にさらに記載されている。したがって、臨床医は、標準的な試験を使用して、がんの処置における本発明の方法のさまざまな実施形態の有効性を決定することができる。しかしながら、腫瘍の大きさおよび広がりに加えて、臨床医はまた、処置の有効性の評価において、生活の質および患者の生存も考慮することがある。

一部の実施形態では、ＨＡＢＡの投与、低酸素の誘導、および免疫チェックポイント阻害剤の投与は、いずれかの薬剤単独による処置、双方の薬剤を同時に送達する処置、および／または双方の薬剤の逆の順による処置によって、改善された治療有効性を提供する。改善された有効性は、本明細書に記載のものが挙げられるがこれらに限定されない任意の好適な方法を使用して測定されうる。一部の実施形態では、改善された治療有効性とは、適切な尺度（例えば腫瘍の大きさの縮小、腫瘍の大きさが安定な期間、転移事象のない期間、無疾患生存の期間）を使用して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、１０００％、１００００％またはそれよりも多い改善である。改善された有効性はまた、適切な尺度（例えば腫瘍の大きさの縮小、腫瘍の大きさが安定な期間、転移事象のない期間、無疾患生存の期間）を使用して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍またはそれより多い倍数などの倍数改善（fold improvement）として表されうる。

一態様では、本開示は、本明細書に記載の任意の使用によるなど、被験体における固形腫瘍への免疫応答を強化するためのキットを提供する。キットは、本明細書に記載の１種または複数の組成物を、任意の組合せで含むことができる。一部の実施形態では、キットは、（ａ）低酸素活性化生体還元剤（ＨＡＢＡ）、（ｂ）低酸素誘導剤または塞栓剤、および（ｃ）免疫チェックポイント阻害剤を含む。ＨＡＢＡ、低酸素誘導剤、塞栓剤および免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例は、例えば本開示のさまざまな方法に関して、上に提供されている。一部の実施形態では、キットは、臨床医、保健医療提供者または患者による使用のための指示、例えば印刷物または包装物をさらに含む。キット中の医薬組成物および他の材料は、任意の好適な容器中に含有されてもよく、即座に使用可能な形態であってもよく、またはキット中の他の試薬、もしくは使用者により供給される試薬との組合せ（例えば濃縮組成物の希釈、または凍結乾燥組成物の再形成）を要件としてもよい。

以下の実施例は、本発明のさまざまな実施形態を例示する目的で付与され、いかなる方法であれ本発明を限定することを意味しない。本実施例は、本明細書に記載の方法と共に、好ましい実施形態を現在代表するものであり、例示であり、本発明の範囲の限定であるとは意図されない。特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の精神内に包含される、そこにおける変更および他の使用は、当業者ならば想起される。

（実施例１）
肝細胞癌モデルにおけるチラパザミンと肝動脈結紮との組合せ。

材料および方法：すべてのＨＢｘトランスジェニックマウスを、特定の病原体のない施設で育て、追跡した。続いて、個々のマウスの尾を、３週齢での離乳において、遺伝子型判定プロセスのために収集した。肝細胞癌（ＨＣＣ）は、１７～１８月齢で、雄のＨＢｘトランスジェニックマウスのうちの＞９５％で自然に発生した。直径０．５～２ｃｍの腫瘍を有するトランスジェニックマウスを本研究で使用した。

チラパザミンと肝動脈結紮での、腫瘍を保持するＨＢｘマウスの処置：ＨＢｘトランスジェニックマウスを４０分間、左肝動脈結紮に供し、その後、絹結紮をほどいた。薬物の効果についての研究の間、０．９％の食塩水、ドキソルビシン（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＴＰＺ（３ｍｇ／ｋｇ）を、肝動脈結紮の前に７分間、各マウスの尾静脈に注射した。注射の完了後、正中線開腹を，肝臓の左葉および肝臓門を露出させるために実施して、一時的な結紮のために，左肝動脈または総肝動脈を解剖した。すべてのマウスを、実験の間、４００ｍｇ／ｋｇのａｖｅｒｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）の腹腔内注射で麻酔した。一連の血清試料を、第1週以内に、ＡＲＫＲＡ
Ｙ Ｓｐｏｔｃｈｅｍ ＥＺ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＳＰ－４４３０（Ａｒｋｒａｙ，Ｉｎｃ．、京都、日本）を使用することによって、ＡＬＴおよび総ビリルビンを評価するために収集した。１日または７日後に、肝臓組織を、ＨＥ染色のために収集した。

腫瘍壊死の組織像および形態計測分析：各マウスについて、全腫瘍および隣接した非腫瘍状領域を含有する肝臓組織を、１０％のホルムアルデヒド中に一晩固定し、パラフィン中に包埋した。全腫瘍を横断する肝臓組織切片（厚さ３μｍ）を、組織学的分析のために、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色に供した。各腫瘍における壊死の百分率を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（バージョン１．４６ｒ、National Institutes of Health、Bethesda、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用することによって、全腫瘍をカバーする５つの横断片において、壊死の面積を総腫瘍面積で割って定量した。詳細な結果を、以下でさらに考察する。

（実施例２）
肺がんモデルにおけるチラパザミンとコンブレタスタチンＡ４とＤＭＸＡＡとの組合せ。

材料および方法：ヒト肺がんＮＣＩ－Ｈ４６０細胞をＡＴＣＣから購入し、本研究で使用した。細胞を、マウスに植え付ける前に、５継代以内で継代培養した。動物の順化期間の後、無血清媒体／マトリゲル（５０：５０のｖ／ｖ）２００μＬ中およそ１．５×１０^６個のＮＣＩ－Ｈ４６０細胞を、各マウスへ、３～４％のイソフルランでの麻酔下、皮下注射した。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、雄、約４～５週齢、体重１８～２０ｇをＳｈａｎｇｈａｉ ＳＬＡＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、中国から購入し、動物施設に、処置群ごとにマウス３～５匹／ケージで収容した。マウスは、食物（放射線照射されたもの、Ｓｈａｎｇｈａｉ ＳＬＡＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、中国）および水（Ｍｏｌ Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ Ｗａｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍにより濾過した自治体の水道水）を自由に摂取させた。

各群からのマウスを、最初の投薬後１８日目に、ＣＯ_２窒息、続いて頚椎脱臼で安楽死させ、腫瘍を収集し、秤量し、その写真を撮影した。ホルマリン固定した腫瘍を、組織病理学作業のために使用した。ホルマリン固定後、腫瘍をパラフィン包埋してＦＦＰＥブロックを得た。１匹のマウスからの各腫瘍塊について１つのブロックを作製した。ＦＦＰＥブロックを、厚さ約４μｍで切開し、Ｈ＆Ｅ染色、組織病理学検査、および腫瘍壊死の定量のために処理した。詳細な結果を、以下でさらに考察する。

（実施例３）
ｉｎ ｖｉｖｏでの、腫瘍壊死の誘導、および腫瘍の、がんワクチンへの変換。

腫瘍不均質性およびゲノム不安定性の問題を解決するための、理想的ながんワクチンは、各患者の自己腫瘍である。しかしながら、腫瘍自体は、典型的にはきわめて免疫原性というわけではなく、抗腫瘍免疫の程度は、一般に、免疫チェックポイント阻害剤単独の存在下でさえ十分でない。免疫応答は、Ｔ細胞への腫瘍関連抗原の提示をもたらし腫瘍特異性Ｔ細胞の集団を増加させる強力な炎症反応と関連する腫瘍壊死を誘導することによって強化されうる。腫瘍壊死の誘導の１つのアプローチは、例えば、正常な肝臓への有意な損傷なしに、腫瘍を供給している肝動脈の塞栓形成を可能にする、門脈と肝動脈とからの二重の血液供給を伴う器官である肝臓内のがんにおいて適用可能である。腫瘍壊死を誘導する戦略は、チラパザミンと低酸素活性化剤と動脈塞栓術（ＴＡＥ）とを組み合わせて、腫瘍壊死を誘導するようにチラパザミンを活性化させる腫瘍低酸素を生み出すことである。組合せの有効性は、ＨＢｘトランスジェニックマウスモデルで確認した。

本研究で使用する動物モデルは、肝細胞の、腫瘍への変換を誘導することが可能であると示された、Ｂ型肝炎ウイルスのがん遺伝子であるＨＢｘを発現しているトランスジェニックマウスである。ＨＢｘトランスジェニックマウスは、およそ１８か月で肝細胞癌を自然に発生する。腫瘍病変は、ベースラインの腫瘍壊死を有さず、チラパザミンと肝動脈結紮（ＨＡＬ）との組合せにより誘導された腫瘍壊死の程度の調査のために使用することは、理想的である。ＨＢｘトランスジェニックマウスモデルにおいて、一時的なＨＡＬと組み合わせるチラパザミンの有効用量は、最初の滴定検査で３ｍｇ／ｋｇであると最初に確立された。次に、ＨＡＬとの組合せにおけるチラパザミンの有効性を調べ、ＴＡＣＥで通常使用される化学療法剤、ドキソルビシンと比較した。小群を最初に試験して、一時的な左ＨＡＬとともに蝕知可能なＨＣＣを有するＨＢｘトランスジェニックマウスを処置するのに、食塩水（ｎ＝１）、ドキソルビチン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１）および、チラパザミン（３ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１）の効果とを比較した。マウスを、チラパザミンと一過性左ＨＡＬとによる処置の１日後に屠殺した。ＡＬＴレベルは、チラパザミンで処置したマウスにおいて、ドキソルビシンで処置したマウスにおけるよりもはるかに大きく上昇した。処置後１日目での組織病理学検査は、チラパザミンが、ＨＡＬの領域内でＨＣＣにおいて９９％超の壊死を誘導し、対照的にドキソルビシンで処置したＨＣＣではわずか約５％の壊死を誘導したことを示した。この結果は、ＨＡＬと組み合わせたときに、チラパザミンがドキソルビシンよりもはるかに、腫瘍壊死を誘導するのに効果的であることを示ししていた。

同じ研究を、処置後７日目の組織病理学的変化を調べるために行った。各群で使用したマウスの数は、食塩水（ｎ＝２）、ドキソルビシン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝２）およびチラパザミン（３ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝３）であった。腫瘍血流を、ｏｘｙＦｌｏセンサーでモニタリングし、チラパザミンまたはドキソルビシンのいずれかで処置したＨＣＣでは、血流がＨＡＬで３０％下がったことを示し、これは腫瘍低酸素を誘導するのに十分であった。

マウス体重の分析は統計的に有意な変化を示さなかったが、ドキソルビシンで処置したマウスにおける平均体重はわずかに少ないようであった（図２Ａ）。血清中の総ビリルビンのレベルは、７日間を通じて３つの群の間ですべてが正常範囲内であった（図２Ｂ）。血清ＡＬＴレベルは、チラパザミンと一時的な左ＨＡＬとで処置した群で１日目にピークに達した（図２Ｃ）。その後、ＡＬＴレベルは低下し、３日目ごろに正常に戻った。ドキソルビシンと一時的なＨＡＬもまた、１日目にＡＬＴ上昇を誘導したが、チラパザミンと左ＨＡＬよりも低く、双方の群におけるＡＬＴは、２日目に正常のレベルに戻った。７日目の解剖の間、チラパザミンと一時的なＨＡＬとで処置したＨＣＣで腫瘍壊死が起きたことがその薄い色によって明らかであったが、食塩水またはドキソルビシンで処置したマウスからのＨＣＣでは明らかでなかった（図２Ｄ）。Ｈ＆Ｅ染色による組織病理学的分析により、左ＨＡＬの領域のＨＣＣが、チラパザミンと左ＨＡＬとの組合せ処置後に９０～９９％の壊死を有したことを確認した。左ＨＡＬと組み合わせた、食塩水またはドキソルビシンで処置したＨＣＣにおいて、病理学的変化は、ほとんどまたは全く検出されなかった（図２Ｅ）。これらのマウスが複数のＨＣＣを頻繁に有したので、内部対照として役立った、右葉に存在する腫瘍小結節があった。腫瘍壊死は、いずれの動物でも右葉のいずれでも起きなかった。肝臓の左葉の腫瘍のない部分では壊死の証拠は見られず、これは、チラパザミンと左ＨＡＬとの組合せが、７日目までに、同じ葉の正常な肝臓においていかなる有意な損傷も生じなかったことを示している。ＡＬＴの上昇により示唆されるように１日目に一時的な損傷がありえたにもかかわらず、それは、７日目に完全に回復した。

研究結果は、腫瘍壊死の誘導において、チラパザミンとＴＡＥとの組合せが、ＴＡＥ単独、またはドキソルビシンとＴＡＥとの組合せよりも良好であることを示している。ドキソルビシンは、中間ステージのＨＣＣの処置のための、ＴＡＣＥ（動脈化学塞栓術）の化学療法成分として現在使用されている。上に記載のデータは、ＨＣＣに対して免疫を引き起こすべく最大の腫瘍壊死を達成するためには、チラパザミンをＴＡＥとの組合せで使用するのが、ＴＡＣＥをドキソルビシンとの組合せで使用するよりもはるかに良好であることを示している。

次いで、同一のモデルを、処置後の腫瘍壊死の程度を調べるために、および、このアプローチによって誘導される腫瘍壊死が、抗原提示細胞として役立つマクロファージ／樹状細胞によって壊死性残屑の食作用を促進する有意な炎症応答を伴うかどうかを調べるために使用した。より高出力の図（図３）では、腫瘍壊死の百分率を、組織学的切片の複数の片を集めてチラパザミンとＨＡＬとでの処置後の腫瘍壊死の全体の百分率を評価することによって決定した。全体の腫瘍のうちの９９％超が壊死となったことを観察した。壊死性腫瘍の周辺領域を詳細に調べて炎症性細胞浸潤を探した。図３の挿入画像は、壊死性腫瘍の周辺領域がきわめて強い炎症性浸潤を有していたことを示しており、壊死が炎症応答を引き起こすという理論と一致する。

（実施例４）
肝細胞癌を有する、塞栓形成に好適である患者における、チラパザミンと動脈塞栓術（ＴＡＥ）との組合せを使用する腫瘍壊死の誘導。

ヒトにおいてＴＡＥと組み合わせたチラパザミンの臨床的忍容性および有効性を試験するために、第Ｉ相用量確定研究（dose-defining study）を米国の主要な医療センターで開始して、忍容性、予備的有効性を調べ、ＴＡＥと組み合わせたときのチラパザミンの推奨される第２相の用量（ＲＰ２Ｄ）を決定した。登録したＨＣＣ患者は、Ｃｈｉｌｄ－ＰｕｇｈクラスＡであり、外科候補ではなく、４つまでの腫瘍病変を有し、その大きさが１０ｃｍを超える腫瘍病変はなく、塞栓形成に好適であった。最初の１２名の評価可能な患者の結果は、分析に利用可能であった。

最初の２つのコホートで、チラパザミンを、５ｍｇ／ｍ^２および１０ｍｇ／ｍ^２で全身ＩＶ注射により投与し、これは、先の第３相研究で使用した用量２５０～３３０ｍｇ／ｍ^２よりも有意に少ない。用量は、チラパザミンおよび左肝動脈結紮のマウス研究（実施例１）ならびに動物モデル研究で実証された有力な結果から推定される中毒量の１／１０に相当する量に基づいて選択した。３名の患者は、いずれかのコホートに登録した。処置は、毒性または用量制限毒性（ＤＬＴ）が観察されず、すべてで忍容された。その後、ラット毒物学研究において、投与経路を、動脈内（ＩＡ）投与で良好に忍容されているプロファイルに基づく肝動脈経由のＩＡに切り換え、続いて肝動脈結紮を行った。ＩＡ経路の開始臨床用量は５ｍｇ／ｍ^２とし、これは忍容されると示されたＩＶ用量の５０％である。次いで、ＩＡコホートの用量を、おのおののコホートの３名の患者で１０ｍｇ／ｍ^２まで上方用量設定した。処置は、毒性または用量制限毒性（ＤＬＴ）が観察されないすべての患者で忍容された。

最初の１２名の患者の予備的有効性を分析し、図４に例示した。有効性の成果は、生存腫瘍の大きさだけが測定されるように、改訂版「固形腫瘍における応答評価基準（Response Evaluation Criteria In Solid Tumors）」（ＲＥＣＩＳＴ）の基準に基づくコ
ントラストＭＲＩによって読み取る。予備的有効性分析は、（図４）にあるような、コントラストで強調された病変を有していない６／１２の評価可能な患者で、ロバストな活性を示し、これは、すべての腫瘍組織が壊死になったことを示しており、すなわち、ＴＡＥとともにチラパザミンの単回処置後に、改訂版ＲＥＣＩＳＴによって、完全奏効（ＣＲ）を達成した。追加の３名の患者は、３０％を超える壊死または部分奏効（ＰＲ）を有していた。全体の奏効率（ＣＲ＋ＰＲ）は８３％であった。この結果は、過去に動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）を受けた１０，０００名を超える患者のメタ分析でＣＲ＋ＰＲが５０％と報告された歴史的対照と比べ、有意に良好である。

（実施例５）
チラパザミンと動脈塞栓術とで処置した他の腫瘍病変を有していた患者における、未処置の病変についての腫瘍の縮小。

第Ｉ相臨床研究で処置した１２名の患者において、数人の患者は複数の腫瘍病変を有し、１つの単回手技で処置することができなかった。１名の患者は、最大直径がそれぞれ１５ｍｍ、２６ｍｍ、１０ｍｍの大きさである３つの病変を有していた。血管供給に起因して、介入放射線医は２６ｍｍおよび１０ｍｍの病変を処置することを選び、それは、それらが互いに近くに位置していたためであった。１５ｍｍである第３の病変は、第１の手技では未処置のままにした。第６週で追跡ＭＲＩを実施したとき、処置した２つの病変がＣＲを達成し、ベースラインが１５ｍｍだった第３の病変はその最大直径がわずか９ｍｍまで縮小していたことを見出した。この知見と整合する１つの可能性のある説明は、２つの病変の処置が抗腫瘍免疫を誘導し、これが未処置の病変を小さくしたというものである。換言すれば、処置された２つの病変が、患者の免疫系を強化して、残っている腫瘍病変を制御するがんワクチンとして潜在的に役立った。

（実施例６）
非肝臓組織における、チラパザミンと血管破壊剤とを使用する腫瘍壊死の誘導。

腫瘍壊死を誘導する別のアプローチは、塞栓形成手技を受け入れにくいさまざまな固形腫瘍での適用のためのものである。この実施例において、固形腫瘍中で低酸素を誘導するアプローチは、血管破壊剤、例えばＤＭＸＡＡ（５，６－ジメチルキサンテノン－４－酢酸、ＡＳＡ４０４もしくはバジメザンとも呼ばれる）、またはコンブレタスタチンＡ４、コンブレタスタチンＡ４ホスフェートを含むスチルベン誘導体、またはｃｉｓ－３，４’，５－トリメトキシ－３’アミノスチルベン（スチルベン４ａ）の使用によるものである。これらの化合物は、腫瘍の血流を遮断して腫瘍低酸素を誘導することができることが実証されている（Chaplin DJ、２００６年）（Tozar GM、２００５年）。この実施例では、チラパザミンと、コンブレタスタチンＡ４またはＤＭＸＡＡとの組合せを、例として肺がん異種移植モデルにおいて調べて、腫瘍壊死を誘導するそれらの能力を試験した。

ＮＣＩ－Ｈ４６０ヒト肺がん細胞をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに皮下注射して腫瘍異種移植を形成することにより肺がんマウスモデルを作製して、チラパザミンと、２種の血管破壊剤、コンブレタスタチンＡ４またはＤＭＸＡＡとの組合せを試験した。腫瘍の平均体積が約４８０～５５０ｍｍ^３（直径およそ１ｃｍ）に達し、腫瘍が固形であり大きさが増加しているとき、腫瘍を保持しているマウスに、チラパザミン（３０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．）、およびコンブレタスタチンＡ４（１０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）またはＤＭＸＡＡ（２０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．）のいずれかを、週に１回、２用量投薬して、組合せが腫瘍壊死を誘導することが可能であることを確実にした。チラパザミンを最初に与え、次いで３～５分後にコンブレタスタチンＡ４またはＤＭＸＡＡを注射した。双方の血管破壊剤が、腫瘍血管系のほとんど即時の遮断を引き起こした。動物を、最初の投薬後３週間まで、任意の異常について観察した。

処置したマウスを３週目の終わりに屠殺し、腫瘍を、Ｈ＆Ｅ染色による組織学検査のために収集した。ほとんどの腫瘍が約５０～７０％の腫瘍壊死を呈し、その一方で、ノーマルセーラインで処置した対照の腫瘍は２０％未満の壊死を有していた。代表的な組織病理写真を図５に示す。鍵となる知見は、処置後の腫瘍壊死の領域が広大であること、および壊死性腫瘍の周囲に強い炎症性浸潤があることである。この結果は、腫瘍壊死は強い炎症反応と関連しそのため抗腫瘍免疫を高めることが可能であるという、ＨＣＣにおける先の知見と一致する。

チラパザミンと、ＴＡＥまたは血管破壊剤のいずれかとの組合せにより誘導された壊死性腫瘍によって自己腫瘍「ワクチン化」が達成されると、誘導されたＴ細胞の集団は、腫瘍微小環境の免疫抑制効果に起因して、腫瘍の最終的な制御において依然として長期にわたり効果がないことがある。したがって、チェックポイント阻害剤を維持療法として組み合わせて使用して、腫瘍内での免疫抑制効果を除去することを提案する。

（実施例７）
肺がんモデルにおいて投与される、ＨＡＢＡと低酸素誘導剤と免疫チェックポイント阻害剤との組合せ。

低酸素活性化生体還元剤と低酸素誘導剤との組合せでの免疫チェックポイント阻害剤の投与の効果を調べる研究では、抗ｍＰＤ－１、チラパザミン（ＴＰＺ）、コンブレタスタチンＡ４ホスフェート、５，６－ジメチルキサンテノン－４－酢酸（ＤＭＸＡＡ）、およびそれらのさまざまな組合せを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮下３ＬＬ同系肺がんモデルの処置において投与した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウス、雄を、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＳＬＡＣ（上海、中国、ＳＣＸＫ ２０１２－０００２）、週齢：６～８週、体重：１８～２２ｇ）から購入した。マウスを、各ケージに４匹入れ、恒温恒湿度のＳＰＦ室内に保持した。温度を２０．５～２４．５℃とした。湿度を４０％～７５％に保った。光のサイクルは、１２時間の明、１２時間の暗からなるものであった。マウスを、ポリカーボネートのケージ（３２５ｍｍ×２１０ｍｍ×１８０ｍｍ）に保持した。ケージ床の材料は、コーンコブとし、週に２回取り換えた。マウスは、研究の全期間中、照射滅菌化ドライ顆粒食物を自由に摂取させ、滅菌飲料水を自由に摂取させた。

３ＬＬ腫瘍細胞を、空気中５％ＣＯ_２の雰囲気中、３７℃にて、１０％の熱不活化ウシ胎児血清およびＬ－グルタミン（２ｍＭ）を補充したＤＭＥＭ媒体中の単層培養物としてｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。腫瘍細胞を、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により、週２回、ルーチン的に継代培養した。指数増殖期において成長している３ＬＬ腫瘍細胞を収集し、植え付けのためにカウントした。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスには、腫瘍の発達のために、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）０．０５ｍＬ中の３ＬＬ腫瘍細胞（細胞２×１０^５個）を、右側腹部下に植え付けた。処置を、植え付け９日後に開始し、そのとき腫瘍の平均体積は約４５５．６４ｍｍ^３に達していた。各研究群における処置投与を図６に示す（「Ｎ」は動物の数を表し、「ｉ．ｖ．」は静脈内注射を表し、「ｉ．ｐ．」は腹腔内注射を表す）。投薬体積を、体重に基づいて調整した（０．１ｍｇ／１０ｇ）。３ＬＬ同系モデルの腫瘍の大きさが、試験品での処置１１日後におよそ４０００ｍｍ^３に達したとき、腫瘍を外科的に切除し、Ｈ＆Ｅ染色およびＦ４／８０での免疫マーカー染色のために１０％ホルマリン中に固定した。

全腫瘍組織を、可能な限り速やかにトリミング後、１０％の中性緩衝ホルマリン中に置いた。固定した組織を、脱水、清浄、浸潤を介してブロック（複数可）へと処理した。手技は、自動化組織プロセッサでなされうる。ホルマリン固定パラフィン包埋試料を調製するため、続いて以下のステップを実施した。融解パラフィンを包埋型の中へ注入した。処理した組織を、適用可能な包埋面を下にして（泡の発生を避けるため）型の中へ置いた。組織を含むパラフィン型をクライオステージ上に置いた。次いで、パラフィンブロックを、ミクロトームを使用して、厚さ５μｍの切片に切り分けた。適切な切片を４５℃の蒸留水浴へ入れた。広げた切片を、スライドを介して水浴から引き抜き、次いでスライドを空気乾燥した。

ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のために、パラフィンスライドを６０℃のオーブン中に約２時間置き、次いで室温に冷却した。次いで、パラフィンスライドを、脱ワックスし、Ｈ＆Ｅ染色し、脱水し、クリアにし、標本にした。カバーガラスを、永久封入剤を使用して適用した。最後に、スライドを顕微鏡検査にかけ、写真を撮影した。腫瘍壊死の百分率（％）の算出を、腫瘍壊死の面積を腫瘍スライドの総面積で割って決定した。

図７は、抗ｍＰＤ－１、チラパザミン（ＴＰＺ）、コンブレタスタチンＡ４ホスフェート、５，６－ジメチルキサンテノン－４－酢酸（ＤＭＸＡＡ）、およびそれらのさまざまな組合せを含む試験品での処置後の、Ｈ＆Ｅ染色により示される腫瘍壊死率を示す。アステリスク（＊）は、マン－ホイットニー検定によってビヒクル群と比較した統計的有意性（Ｐ＜０．０５）を表す。ＴＰＺとコンブレタスタチンＡ４ホスフェートと抗ｍＰＤ－１との組合せは、ビヒクル群と比較して、腫瘍壊死率の有意な増加を示した。図８は、図７で描示したデータを提供している。

本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され記載されているが、当業者には、こうした実施形態が、例によってのみ提供されていることが明らかである。多くの変形、変更および置き換えが、今や、本発明から逸脱することなく当業者に想起される。本明細書に記載の本発明の実施形態へのさまざまな代替形態が、本発明を実行する際に利用されうることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物が、それらによりカバーされることが意図される。

Claims (1)

1. 明細書に記載の発明。

Images