JP2022001047A - Hiv−1感染と複製に必須な遺伝子を切断するcrispr/casの構築物のレンチウイルスによる送達 - Google Patents
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- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
Abstract
【課題】ゲノム編集によってプロウイルスHIV−1を不活性化してウイルス配列を切り出し、それによって新生ウイルスの産生を不活性化する組成物、方法及びシステムを提供する。【解決手段】いくつかの実施形態において、プロウイルスDNAは、CRISPR/Cas9レンチウイルス構築物を使用して、組み込まれたウイルスDNAのLTR領域を標的化することによって切り出される。レンチウイルス構築物の使用は、有利には***標的細胞及び非***標的細胞の両方の形質導入を可能にする。【選択図】図1
Description
本発明は、一般にバイオテクノロジーの分野に関する。より詳細には、本発明がゲノム編集技術に関する。さらにより詳細には、本発明がHIV−1を不活性化するCRISPR/Cas9系の、レンチウイルスに基づく細胞の形質導入に関する。
[政府の支援]
本発明は、NIH SBIR Grant 1R43AI110285−01、復員軍人援護局から授与されたMerit Review Award No.1I01BX000260−01、NIMHから授与されたR01 MH097949(BWL)の下での政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、NIH SBIR Grant 1R43AI110285−01、復員軍人援護局から授与されたMerit Review Award No.1I01BX000260−01、NIMHから授与されたR01 MH097949(BWL)の下での政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
[配列一覧への参照]
EFS−Webを介してASCIIテキストファイルの通り提出された配列リストは、35U.S.C.§1.52(e)に従って参照により本明細書に組み込まれる。Sequence ListingのASCIIテキストファイル名は「2017−05−10 Sequence Listing As−Filed 118431−027WO1.TXT」であり、ASCIIテキストファイルの作成日は2017年5月10日であり、ASCIIテキストファイルのサイズは3KBである。
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HIV−1感染に対する現在の抗レトロウイルス治療(ART)は、感染細胞による新しいビリオンの産生をブロックするために、ウイルスライフサイクルにおける重要な段階を効果的に中断する。しかしながら、その有効性にもかかわらず、ARTにおいて使用される薬剤は、新しいウイルス粒子の合成に使用される構造遺伝子及び調節遺伝子を含んだ組み込まれたプロウイルスを標的としない。ARTを中止すると、潜伏性HIV感染細胞リザーバからのウイルス再発により、血漿ウイルス量の増加と標的細胞感染の新たなサイクルを招く。さらに、ARTはHIV感染細胞を死滅させない。HIV感染患者は、治療中断の期間が短くても死亡率の増加につながることが示されているため、生涯にわたりARTを受け続けなければならないことを意味する。これらの薬物の長期使用は、臓器毒性のリスク及びウイルス耐性の誘発の可能性があるために、慎重なモニタリングを必要とする。
CRISPR/Casと呼ばれる原核生物の先天性免疫機構は、最近、真核生物ゲノム中の遺伝子の特異的標的化及び修飾を可能にするように改変された。原核生物では、Casと呼ばれるエンドヌクレアーゼと共に一本鎖RNA分子が、侵入ウイルスのゲノムを切断することによって病原体侵入を遮断する(Marraffiniら、Nat.Rev. Genetics 11:181−190(2010)を参照のこと)。2012年に、CharpentierとDoudnaは、真核細胞で機能するようにタイプII細菌Cas遺伝子(Cas9)の配列を改変することに成功した。その後まもなく、ガイドRNA(gRNA)とCas9を用いて真核生物の遺伝子を切断・不能化するゲノム工学が、多様な細胞系にまたがったいくつかのグループによって成功裏に報告された。真核生物では、ゲノム標的DNA配列に相補的なガイドRNAがCas9と協同して、不完全に修復された二本鎖切断を誘導することによって、特定の遺伝子を破壊する。これは、切断部位での挿入及び欠失(Indels)をもたらし、その結果、異常な転写及び翻訳をもたらす。
CRISPR/Cas技術は、プラスミド上に担持されたモデルHIVプロウイルス配列中の単一領域を切断するガイドRNA及びCas9遺伝子を発現するプラスミドを、ヒト細胞系にトランスフェクトすることによって、HIV系に適用されてきた(Ebinaら、Sci.Rep.3:2510(2013)を参照のこと)。その後すぐに、プロウイルスの5’末端及び3’末端の両方を標的とする複数のガイドRNAの使用が、細胞系において全HIVプロウイルスゲノムを完全に切除し、そしてその後の再感染から細胞を保護することが実証された(Huら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA 111:11461−11466(2014)参照のこと)。
しかし、ガイドRNA及びCas9遺伝子の送達、HIV感染患者を治療するための治療様式として、特に休止白血球へのin vivo又はex vivoの送達については課題が残っている。プラスミドDNAの送達が使用可能な選択肢ではないことは、明らかである。したがって、上記のような従来の実施において見られる、これらの重大な問題を克服するシステム及び方法が必要とされている。
一態様では、本発明は1つ以上のガイドRNAをコードする核酸と、Clustered Regularly Interspaced Shord Palindromic Repeats−Associated(Cas)タンパク質をコードする核酸を保有する、本明細書中に記載される「g−LV」などのレンチウイルスベクターに関し、ここで、前記ガイドRNAは、標的HIV−1 DNA配列とハイブリダイズする。コードされたCasタンパク質は、好ましくはCas9タンパク質である。
別の態様では、本発明は、(a)1つ以上のガイドRNA、又は前記1つ以上のガイドRNAをコードする核酸(ここで、前記ガイドRNAは標的HIV−1 DNA配列とハイブリダイズする);及び(b)Cas9タンパク質、又は前記タンパク質をコードする核酸を含む、レンチウイルスベクターを含むキットを提供する。一実施形態では、キットは、レンチウイルスベクター及びそれを必要とするヒト対象への投与に適した薬学的に許容される賦形剤を含有するバイアル又は他の容器を含む。
さらに別の態様において、本発明は、ヒト細胞における標的ヒト免疫不全ウイルス1(HIV−1)DNA配列の機能又は存在を、細胞をIn vitro又はIn vivoのいずれかで保有するレンチウイルスベクターと接触させることによって阻害する方法に関し、該方法は:(a)1つ以上のガイドRNA、又は前記1つ以上のガイドRNAをコードする核酸;及び(b)Cas9タンパク質、又は前記Cas9タンパク質をコードする核酸を含み、前記ガイドRNAは標的HIV−1 DNA配列とハイブリダイズし、それによって標的HIV−1 DNA配列の機能又は存在を阻害する。
本発明の態様は、さらに下記を含む。
[1]
ヒト対象の末梢血単核細胞(PBMC)におけるHIV−1産生を抑制する方法であって、以下のステップを含む方法:
PBMCを、ウイルスベクターを含む組成物と接触させ、それによって前記ウイルスベクターがPBMCに入り、
前記ウイルスベクターはガイドRNA及びヒト化Casエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、
前記ガイドRNAはプロウイルスHIV−1ゲノムに含まれるDNA配列に相補的であり、
前記ヒト化CasエンドヌクレアーゼはPBMCにおいてタンパク質として発現される場合、前記ガイドRNAの存在下で、前記ウイルスベクターと接触したPBMCのプロウイルスHIV−1ゲノム内で切断し、それによってHIV−1産生を抑制する。
[2]
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、[1]に記載の方法。
[3]
前記ヒト化CasがCas9である、[1]に記載の方法。
[4]
前記ガイドRNAが、前記プロウイルスHIV−1の長い末端反復(LTR)内で切断する、[1]に記載の方法。
[5]
前記PBMCが、リンパ球及びマクロファージからなる群より選択される、[1]に記載の方法。
[6]
前記ガイドRNAが前記プロウイルスHIV−1の長い末端反復(LTR)内で切断し、前記ガイドRNAに相補的なDNA配列が、前記プロウイルスHIV−1 LTRに存在するDNA配列であり、前記接触ステップが、前記細胞がHIV−1に感染する前に行われる、[5]に記載の方法。
[7]
前記DNA配列がU3DNA配列である、[6]に記載の方法。
[8]
前記ガイドRNAが前記プロウイルスHIV−1の長い末端反復(LTR)内で切断し、前記ガイドRNAに相補的なDNA配列が、前記プロウイルスHIV−1のLTRに存在するDNA配列であり、前記接触ステップが、前記細胞がHIV−1に感染した後に行われる、[5]に記載の方法。
[9]
前記DNA配列がU3 DNA配列である、[8]に記載の方法。
[10]
前記ガイドRNAが前記プロウイルスHIV−1の長い末端反復(LTR)内で切断し、前記ガイドRNAに相補的なDNA配列が前記プロウイルスHIV−1 LTRに存在するDNA配列であり、前記接触ステップの前に前記ヒト対象から前記PBMCを取り出すステップをさらに含む、[5]に記載の方法。
[11]
前記DNA配列がU3 DNA配列である、[10]に記載の方法。
[12]
前記ガイドRNAが前記プロウイルスHIV−1の長い末端反復(LTR)内で切断し、前記ガイドRNAに相補的なDNA配列が前記プロウイルスHIV−1 LTRに存在するDNA配列であり、前記ヒト対象において前記接触ステップを行うステップをさらに含む、[5]に記載の方法。
[13]
前記DNA配列がU3 DNA配列である、[12]に記載の方法。
[14]
前記ガイドRNAに相補的なDNA配列が、プロウイルスHIV−1 LTR中に存在するU3 DNA配列である、[1]に記載の方法。
[15]
前記接触ステップが、前記細胞がHIV−1に感染する前に行われる、[1]に記載の方法。
[16]
前記接触ステップが、前記細胞がHIV−1に感染した後に行われる、[1]に記載の方法。
[17]
前記接触ステップにおける前記組成物が、前記ヒト対象への投与のための薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、[1]に記載の方法。
[18]
前記接触ステップを行う前に、前記ヒト対象から前記PBMCを取り出すステップをさらに含む、[1]に記載の方法。
[19]
前記接触ステップを行った後、前記PBMCを前記ヒト対象に戻すステップをさらに含む、[18]に記載の方法。
[20]
前記ウイルスベクターが、特定の細胞型に結合するエンベロープタンパク質を含むビリオン内にパッケージされる、[1]に記載の方法。
[21]
前記レンチウイルスベクターが、特定の細胞型に結合するエンベロープタンパク質を含むビリオン内にパッケージされる、[2]に記載の方法。
[22]
1つ以上のガイドRNA、及びCrustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats−Associated(Cas)タンパク質をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターであって、前記ガイドRNAが、標的HIV−1 DNA配列とハイブリダイズする、レンチウイルスベクター。
[23]
前記Casタンパク質がCas9タンパク質である、[22]に記載のレンチウイルスベクター。
[24]
前記レンチウイルスベクターがg−LVである、[22]に記載のレンチウイルスベクター。
[25]
(a)標的HIV−1 DNA配列とハイブリダイズする、1つ以上のガイドRNA、又は前記1つ以上のガイドRNAをコードする核酸;及び
(b)Cas9タンパク質、又は前記タンパク質をコードする核酸、を含む、レンチウイルスベクターを含むキット。
[26]
前記レンチウイルスベクター及びそれを必要とするヒト対象への投与に適切な薬学的に受容可能な賦形剤を含むバイアル又は他の容器をさらに含む、[25]に記載のキット。
[27]
[22]に記載のレンチウイルスベクターを含む医薬組成物。
本発明の態様は、さらに下記を含む。
[1]
ヒト対象の末梢血単核細胞(PBMC)におけるHIV−1産生を抑制する方法であって、以下のステップを含む方法:
PBMCを、ウイルスベクターを含む組成物と接触させ、それによって前記ウイルスベクターがPBMCに入り、
前記ウイルスベクターはガイドRNA及びヒト化Casエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、
前記ガイドRNAはプロウイルスHIV−1ゲノムに含まれるDNA配列に相補的であり、
前記ヒト化CasエンドヌクレアーゼはPBMCにおいてタンパク質として発現される場合、前記ガイドRNAの存在下で、前記ウイルスベクターと接触したPBMCのプロウイルスHIV−1ゲノム内で切断し、それによってHIV−1産生を抑制する。
[2]
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、[1]に記載の方法。
[3]
前記ヒト化CasがCas9である、[1]に記載の方法。
[4]
前記ガイドRNAが、前記プロウイルスHIV−1の長い末端反復(LTR)内で切断する、[1]に記載の方法。
[5]
前記PBMCが、リンパ球及びマクロファージからなる群より選択される、[1]に記載の方法。
[6]
前記ガイドRNAが前記プロウイルスHIV−1の長い末端反復(LTR)内で切断し、前記ガイドRNAに相補的なDNA配列が、前記プロウイルスHIV−1 LTRに存在するDNA配列であり、前記接触ステップが、前記細胞がHIV−1に感染する前に行われる、[5]に記載の方法。
[7]
前記DNA配列がU3DNA配列である、[6]に記載の方法。
[8]
前記ガイドRNAが前記プロウイルスHIV−1の長い末端反復(LTR)内で切断し、前記ガイドRNAに相補的なDNA配列が、前記プロウイルスHIV−1のLTRに存在するDNA配列であり、前記接触ステップが、前記細胞がHIV−1に感染した後に行われる、[5]に記載の方法。
[9]
前記DNA配列がU3 DNA配列である、[8]に記載の方法。
[10]
前記ガイドRNAが前記プロウイルスHIV−1の長い末端反復(LTR)内で切断し、前記ガイドRNAに相補的なDNA配列が前記プロウイルスHIV−1 LTRに存在するDNA配列であり、前記接触ステップの前に前記ヒト対象から前記PBMCを取り出すステップをさらに含む、[5]に記載の方法。
[11]
前記DNA配列がU3 DNA配列である、[10]に記載の方法。
[12]
前記ガイドRNAが前記プロウイルスHIV−1の長い末端反復(LTR)内で切断し、前記ガイドRNAに相補的なDNA配列が前記プロウイルスHIV−1 LTRに存在するDNA配列であり、前記ヒト対象において前記接触ステップを行うステップをさらに含む、[5]に記載の方法。
[13]
前記DNA配列がU3 DNA配列である、[12]に記載の方法。
[14]
前記ガイドRNAに相補的なDNA配列が、プロウイルスHIV−1 LTR中に存在するU3 DNA配列である、[1]に記載の方法。
[15]
前記接触ステップが、前記細胞がHIV−1に感染する前に行われる、[1]に記載の方法。
[16]
前記接触ステップが、前記細胞がHIV−1に感染した後に行われる、[1]に記載の方法。
[17]
前記接触ステップにおける前記組成物が、前記ヒト対象への投与のための薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、[1]に記載の方法。
[18]
前記接触ステップを行う前に、前記ヒト対象から前記PBMCを取り出すステップをさらに含む、[1]に記載の方法。
[19]
前記接触ステップを行った後、前記PBMCを前記ヒト対象に戻すステップをさらに含む、[18]に記載の方法。
[20]
前記ウイルスベクターが、特定の細胞型に結合するエンベロープタンパク質を含むビリオン内にパッケージされる、[1]に記載の方法。
[21]
前記レンチウイルスベクターが、特定の細胞型に結合するエンベロープタンパク質を含むビリオン内にパッケージされる、[2]に記載の方法。
[22]
1つ以上のガイドRNA、及びCrustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats−Associated(Cas)タンパク質をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターであって、前記ガイドRNAが、標的HIV−1 DNA配列とハイブリダイズする、レンチウイルスベクター。
[23]
前記Casタンパク質がCas9タンパク質である、[22]に記載のレンチウイルスベクター。
[24]
前記レンチウイルスベクターがg−LVである、[22]に記載のレンチウイルスベクター。
[25]
(a)標的HIV−1 DNA配列とハイブリダイズする、1つ以上のガイドRNA、又は前記1つ以上のガイドRNAをコードする核酸;及び
(b)Cas9タンパク質、又は前記タンパク質をコードする核酸、を含む、レンチウイルスベクターを含むキット。
[26]
前記レンチウイルスベクター及びそれを必要とするヒト対象への投与に適切な薬学的に受容可能な賦形剤を含むバイアル又は他の容器をさらに含む、[25]に記載のキット。
[27]
[22]に記載のレンチウイルスベクターを含む医薬組成物。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び添付の図面を検討した後に、当業者により容易に明らかになるであろう。
本発明の構造及び動作は、以下の詳細な説明及び添付の図面を検討することによって理解されるのであろう。
[イントロダクション及び概要]
ヒト対象におけるプロウイルスHIV−1の活性を予防又は阻害するためのベクター、キット、及び方法を提供する。本発明によれば、HIV−1 DNA標的配列の活性又は機能は、標的配列が転写及び/又は翻訳され得ない場合に阻害される。この点において、HIV−1 DNA標的は、変異導入されていても切り詰められていても良い。ベクターは、HIV−1ゲノムの一部に特異的に組み込まれたDNAの切断を指示する、CRISPR/Cas9系の成分の送達に適合したレンチウイルスベクターを包含する。キットは、ベクター及び付属物を含む。本発明による方法は、ヒト対象の細胞にベクターを導入するためのin vivo及びex vivo技術を包含する。レンチウイルスベクターの使用は、有利には、***している細胞、並びに休止している(すなわち、***していない)細胞の形質導入を可能にする。この説明を読めば、様々な代替実施形態及び代替用途において、本発明をどのように実施するかが当業者には明らかになるであろう。本発明の様々な実施形態を本明細書で説明するが、これらの実施形態は単に例として提示したものであり、限定するものではないことを理解されたい。したがって、様々な代替の実施形態のこの詳細な説明は、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲又は幅を限定するものと解釈されるべきではない。
ヒト対象におけるプロウイルスHIV−1の活性を予防又は阻害するためのベクター、キット、及び方法を提供する。本発明によれば、HIV−1 DNA標的配列の活性又は機能は、標的配列が転写及び/又は翻訳され得ない場合に阻害される。この点において、HIV−1 DNA標的は、変異導入されていても切り詰められていても良い。ベクターは、HIV−1ゲノムの一部に特異的に組み込まれたDNAの切断を指示する、CRISPR/Cas9系の成分の送達に適合したレンチウイルスベクターを包含する。キットは、ベクター及び付属物を含む。本発明による方法は、ヒト対象の細胞にベクターを導入するためのin vivo及びex vivo技術を包含する。レンチウイルスベクターの使用は、有利には、***している細胞、並びに休止している(すなわち、***していない)細胞の形質導入を可能にする。この説明を読めば、様々な代替実施形態及び代替用途において、本発明をどのように実施するかが当業者には明らかになるであろう。本発明の様々な実施形態を本明細書で説明するが、これらの実施形態は単に例として提示したものであり、限定するものではないことを理解されたい。したがって、様々な代替の実施形態のこの詳細な説明は、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲又は幅を限定するものと解釈されるべきではない。
本明細書中に開示される特定の実施形態は、レンチウイルスベクターを使用するCRISPR/Cas9系の非常に有効な送達を提供する。例えば、本明細書中に開示される1つの方法は、レンチウイルスに基づくHIV−1のLTR内の配列を標的とするガイドRNAの送達を可能にし、ガイドRNAは、Cas9タンパク質の存在下で、HIV−1プロウイルスの少なくとも一部の切除を容易にする。WO2014/165349A1により同定される公開PCT出願(その開示は参照により組み込まれる)は、ヒト細胞のゲノムからHIV−1プロウイルスDNAを切除するためのCRISPR/Cas9システムの使用を記載する。しかしながら、この文献は、Cas9エンドヌクレアーゼ及びHIV特異的ガイドRNAをコードする核酸配列を、ヒトの細胞に送達するためのベクターとしてレンチウイルスを使用することを開示していない。
本開示は、HIV感染の標的である白血球に、「導入遺伝子」と呼ばれる特定の遺伝子配列を送達するためのレンチウイルスベクターの開発を提供する。導入遺伝子は、細菌CRISPR/Cas系に基づく2つの遺伝子を含む。第1の遺伝子は、組み込まれたHIV遺伝子に結合するように設計されたガイドRNA(guide RNA)(すなわち、gRNA)をコードする。第2の遺伝子は、gRNAによって指示される領域で二本鎖DNAを切断する酵素をコードするCas9遺伝子である。ガイドRNAとCas9酵素は一緒に機能して、標的とされる遺伝子内のDNAを切断する(すなわち、破壊する)。レンチウイルスベクターはまた、標的タンパク質(例えば、抗体又は他の型のエンベロープ遺伝子)を用いて改変されて、ベクターを選択された細胞に指向し得る。このような技術は、当業者に周知である。
本明細書に開示されるアプローチは、CRISPR/Cas9ゲノム工学的手法を用いてHIV感染リンパ球からのウイルス産生を抑制するための、レンチウイルス送達システムを使用する。以下に開示されるように、5’及び3’の長い末端反復(LTR)領域の両方に存在する、HIV−1プロウイルスのU3DNA配列中の領域を標的とするガイドRNAを、関連するCas9酵素と共に、VSV−g偽型レンチウイルスベクター(LV)によって末梢血単核細胞(PBMC)に送達した。PBMCの培養物は最初にHIV−1で感染させるか、又はHIV−1で感染させる前にLVで形質導入した。いずれの実験プロトコールにおいても、U3特異的ガイドRNAによる形質導入は、細胞がHIV−1を産生することを妨げた。興味深いことに、Cas9遺伝子のみを発現するLVは、同様の結果を有し、遺伝子切断以外の1つ以上のさらなる機構が、HIV−1感染を阻害又は予防し得ることを示唆した。LV形質導入細胞によって分泌される炎症分子の分析は、LV形質導入によって誘導される特定の可溶性サイトカイン及び他の炎症分子が、抗HIV効果に寄与し得ることを示唆した。我々の知見は、CRISPR/Casゲノム工学が、ARTを中止しようとするHIV患者における使用のための有効な治療アプローチであり得ることを示す。この場合、潜伏性HIV感染細胞のLV形質導入はプロウイルスを切断し、新しいビリオンの転写を防止し、一方、非感染細胞のLV形質導入は、これらの細胞をHIV−1による感染に対して抵抗性にするだろう。
開示された手順は、HIV感染PBMCからのウイルス産生を効果的に抑制し、また、非感染PBMCがHIV−1に感染するのを防いだ。HIV感染細胞において、ガイドRNA+Cas9は組み込まれたプロウイルスを切断し、新しいビリオン産生に必要な構造遺伝子又は調節遺伝子の転写を効果的に妨げる。非感染PBMCにおいて、ガイドRNA及びCas9遺伝子は、それらが構成的に発現される宿主ゲノムに安定に組み込まれ、HIV−1 cDNA組込みを妨げ、及び/又は組込み後のプロウイルスを切断する。我々の実験的アプローチでは、PBMCをHIV−1に感染させ、2日後にLVで形質導入するか、又は最初にLVで形質導入し、次いで2日後にHIV−1でチャレンジした。
結果はまた、g−LVで形質導入されたJ−Lat細胞のクローン化集団が、TNFαによって再活性化され得ず、組み込まれたプロウイルス配列からGFP又はp24のいずれかを産生し得ないことを示した。これらのクローンにおいて、プロウイルス領域を増幅するためにPCRを用いたその後の分析では、プロウイルス領域の完全な切除を示した。これは、U3領域(U3Bと呼ばれる)へのガイドRNAが、5’及び3’LTRの両方に存在する核酸配列を標的とするために起こったものである。対照的に、e−LVで形質導入されたJ−Lat細胞のクローン(すなわち、gRNAをコードしなかった)はTNFαで活性化される能力を保持し、GFP及びp24の両方を産生した。TNFαによる転写活性化は、CRISPR/Cas切断後のプロウイルスのコンピテンシーの迅速なスクリーニングとして役立ち得ることから、J−Lat細胞を使用して、プロウイルス領域の切除を実証した。
g−LV又はe−LVのいずれかで形質導入されたHIV感染PBMCからのHIV−1産生の抑制もまた、本明細書に開示される。e−LVはプロウイルス特異的gRNA配列を含まないため、この発見は予想外であった。この知見は、e−LVによって誘導される先天性抗ウイルス応答の誘導に起因する可能性がある。LV形質導入後の抗ウイルス応答の誘導は、いくつかの理由による可能性が高い。LVはTLR7を含む多くの先天性免疫受容体に結合し、活性化することができる一本鎖RNAゲノムを発現する。活性化されると、これらの受容体は、培養物中の隣接細胞を病原体から保護することができる分子の分泌をもたらす。これは、PBMCのサブセットのみがLVで形質導入された(GFP発現のフローサイトメトリー分析によって決定される15〜60%)にもかかわらず、集団中の細胞の大多数が12日の実験期間を通して感染から保護されたという知見を説明し得る。
集約すると、本明細書に提示した結果は、HIV−1プロウイルスを切断するためのgRNA及びCas9遺伝子のLV送達が、HIV−1感染から未感染PBMCを保護し、感染細胞からのHIV−1産生もブロックすることを確認した。LTRのU3領域(U3Bと呼ぶ)に設計されたgRNA配列は、感染細胞からプロウイルス配列全体を切り出した。プロウイルス配列に対するガイドRNAの直接的な効果に加えて、本発明者らはまた、Cas9遺伝子(すなわち、gRNAを含まない)のみのLV送達もまた、HIV−1からの非感染PBMCを保護し、そして感染細胞からのHIV−1産生をブロックすることを開示する。分泌された炎症分子の分析から、導入遺伝子がHIV−1感染から細胞を保護する能力を有する免疫調節応答を誘導したことが示唆される。
[CRISPR/Cas9システムの一般的特徴]
CRISPRシステムの3つのクラス(タイプI、II及びIII)は、当業者によく知られている。本発明の特定の実施形態において、単一のエフェクター酵素Cas9でdsDNAを切断するために、タイプII CRISPRシステムが用いられる。対照的に、タイプI及びタイプIIIシステムは、複合体として作用する複数の異なるエフェクターを必要とする(Makarova et al、Nat.。Rev. Microbiol. 9:467(2011))。原核生物では、タイプIIエフェクターシステムは、スペーサー含有CRISPR遺伝子座から転写された長いpre−crRNA、多機能Cas9タンパク質、及びgRNAプロセシングのためのtracrRNAから構成される。tracrRNAはpre−crRNAのスペーサーを分離する反復領域にハイブリダイズし、内因性RNase IIIによるdsRNA切断を開始し、続いてCas9による各スペーサー内での第2の切断事象が起こり、tracrRNA及びCas9と会合したままである成熟crRNAを産生する。しかし、ガイドRNA(gRNA)と呼ばれるtracrRNA:crRNA融合物は、真核細胞中及びin vitroで機能しうるため、RNase III及びcrRNAプロセシング全般の必要性を排除されることが示された(Jinek et al、Science 337:816(2012))。従って、本発明の特定の実施形態において、ガイドRNA分子が、HIV−1 DNA配列を標的化するために使用される。本発明のガイドRNA分子は、80〜130ヌクレオチド、90〜120ヌクレオチド又は100〜110ヌクレオチドの長さの範囲のサイズであり得、RNAから構成される。特定の実施形態ではガイドRNAが配列R−GU UUU AGA GCU AAU AAGC AAG UUA AAA UAA GGC UCC GUU AUC AAC UUG AAA AAG UGG CAC CGA GU GCT TTT TT(配列番号1)を有し、ここで、RはHIV−1 DNA標的配列に特異的にハイブリダイズするスペーサー配列である。
CRISPRシステムの3つのクラス(タイプI、II及びIII)は、当業者によく知られている。本発明の特定の実施形態において、単一のエフェクター酵素Cas9でdsDNAを切断するために、タイプII CRISPRシステムが用いられる。対照的に、タイプI及びタイプIIIシステムは、複合体として作用する複数の異なるエフェクターを必要とする(Makarova et al、Nat.。Rev. Microbiol. 9:467(2011))。原核生物では、タイプIIエフェクターシステムは、スペーサー含有CRISPR遺伝子座から転写された長いpre−crRNA、多機能Cas9タンパク質、及びgRNAプロセシングのためのtracrRNAから構成される。tracrRNAはpre−crRNAのスペーサーを分離する反復領域にハイブリダイズし、内因性RNase IIIによるdsRNA切断を開始し、続いてCas9による各スペーサー内での第2の切断事象が起こり、tracrRNA及びCas9と会合したままである成熟crRNAを産生する。しかし、ガイドRNA(gRNA)と呼ばれるtracrRNA:crRNA融合物は、真核細胞中及びin vitroで機能しうるため、RNase III及びcrRNAプロセシング全般の必要性を排除されることが示された(Jinek et al、Science 337:816(2012))。従って、本発明の特定の実施形態において、ガイドRNA分子が、HIV−1 DNA配列を標的化するために使用される。本発明のガイドRNA分子は、80〜130ヌクレオチド、90〜120ヌクレオチド又は100〜110ヌクレオチドの長さの範囲のサイズであり得、RNAから構成される。特定の実施形態ではガイドRNAが配列R−GU UUU AGA GCU AAU AAGC AAG UUA AAA UAA GGC UCC GUU AUC AAC UUG AAA AAG UGG CAC CGA GU GCT TTT TT(配列番号1)を有し、ここで、RはHIV−1 DNA標的配列に特異的にハイブリダイズするスペーサー配列である。
原核生物では、タイプII CRISPR干渉は、Cas9がDNA二重鎖を巻き戻し、切断すべきcrRNAにマッチする配列を検索して生じる。標的認識は、標的DNA中の「プロトスペーサー」配列とcrRNA中の残りのスペーサー配列との間の相補性の検出時に起こる。Cas9は、正しいProtospacer−adjacentモチーフ
(PAM)が3’末端にも存在する場合にのみDNAを切断する。異なるタイプIIのシステムは、異なるPAM要件を有する。S.pyogenes系はNGG配列を必要とし、ここで、Nは任意のヌクレオチドであり得る(Maliら、Science 339:823−6(2013))。S. thermophilus Type IIシステムはNGGNG(Horvathら、Science 327:167(2010))及びNAGAAW(Deveauら、J.Bacteriol190:1390(2008))を必要とするが、別のS.mutansシステムはNGG又はNAARを許容する(van der Ploegら、Microbiology 155:1966(2009))。
(PAM)が3’末端にも存在する場合にのみDNAを切断する。異なるタイプIIのシステムは、異なるPAM要件を有する。S.pyogenes系はNGG配列を必要とし、ここで、Nは任意のヌクレオチドであり得る(Maliら、Science 339:823−6(2013))。S. thermophilus Type IIシステムはNGGNG(Horvathら、Science 327:167(2010))及びNAGAAW(Deveauら、J.Bacteriol190:1390(2008))を必要とするが、別のS.mutansシステムはNGG又はNAARを許容する(van der Ploegら、Microbiology 155:1966(2009))。
本発明の特定の実施形態では、gRNAはHIV−1 DNAのLTR部分を標的とする。LTRは新しいビリオンを組み立てるのに必須である遺伝子の転写を促進及び調節し、並びに感染性粒子にパッケージングされるHIV−1ゲノム全体を転写するように機能する。組み込まれたプロウイルスにはLTRの2つのコピーがあり、それによって本標的のサイズを2倍にする。上記で同定されたLTR標的配列は必要とされるPAM配列を有し、そしてHIV−1に独特であり、ヒトゲノムにおいて交差反応相同性を有しない。ヒトゲノムはLTR様配列を有する多くの他のレトロウイルスを含むので、これは特に重要である。したがって、非感染細胞において、非常に低い細胞毒性が予想されるか、又は細胞毒性が予想されない。
タイプII CRISPRシステムは、HNH型システム(Streptococcus様;Neisseria meningitidisセロタイプA株Z2491又はCASS4に対するNmeniサブタイプとしても知られる)を含み、Cas9はcrRNAを生成し、標的DNAを十分に切断する。Cas9は、少なくとも2つのヌクレアーゼドメイン、アミノ末端付近のRuvC様ヌクレアーゼドメイン、及びタンパク質の中央のHNH(又はMcrA様)ヌクレアーゼドメインを含む。HNHヌクレアーゼドメインが制限酵素に多く見られ、エンドヌクレアーゼ活性を有することを考えれば(Kleanthous et al、Nat.Struct.Biol. 6:243−52(1999); Jakubauskas et al., J. Mol. Biol. 370:157−169(2007))、このドメインが標的切断に関与することが示唆される。さらに、S.thermophilusタイプII CRISPR−Casシステムについて、プラスミド及びファージDNAの標的化がインビボで実証されており(Garneauら、Nature 468:67−71(2010))、Cas9の不活性化で干渉が失われることが示されている(Barrangouら、Science 315:1709−12(2007))。本発明のいくつかの実施形態において、HIV−1標的配列の切断に使用されるCasタンパク質は、タイプII Casタンパク質である。他の実施形態では、Casタンパク質がStreptococcus thermophilus、Listeria innocua、Neisseria meningitidis又はS.pyogenesから単離されたタイプII Casタンパク質である。他の実施形態において、Casタンパク質は、Streptococcus thermophilus(GENBANK登録番号YP_820832参照)、Listeria innocua(GENBANK登録番号NP_472073参照)、Neisseria meningitidis(GENBANK登録番号YP_002342100参照)又はS.pyogenes(GENBANK登録番号AK33936及びNP_269215参照)から単離されたCas9タンパク質である。これらの種改変体に加えて、Cas9タンパク質は特異性又は効力を改善する操作された変異を保有し得る(Slaymakerら、Science 351:84−88(2016))。特定の実施形態において、Cas9タンパク質は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。Cas9タンパク質をコードする核酸を有するプラスミドは、例えばAddgene(Cambridge, MA)などのレポジトリソースから入手可能である。このようなプラスミドの例には、pMJ806(S.pyogenes Cas9)、pMJ823(L.innocua Cas9)、pMJ824(S.thermophilus Cas9)、pMJ839(N.meningitides Cas9)、及びpMJ920(ヒトコドン最適化Cas9)が含まれる。
核への進入を容易にするために、本発明のCasタンパク質は、核局在化配列(nuclear localization sequence)(NLS)を含み得る。用語「核局在化配列」は、このような配列を有するか、又はこのような配列に連結された分子の、真核細胞の核への移動を誘導するアミノ酸配列を意味する。この文脈において、「有する」という語は好ましくは核局在化配列が分子の一部を形成すること、すなわち、共有結合(例えば、インフレームタンパク質融合)によって分子の残りの部分に連結されることを意味する。この文脈において「連結された」という用語は、核局在化配列と、例えば共有結合、水素結合又はイオン相互作用によって、真核細胞の核に導入されるべき別の分子との間の任意の可能な連結を意味する。この文脈における「核内への移動」という言葉は、分子が核内へ移動することを意味する。
核移行は、直接的及び間接的手段によって検出することができる。例えば、核局在化配列又は転位した分子(例えば、Casタンパク質又はガイドRNA)を蛍光色素で標識する場合(標識キットは例えば、Pierce又はMolecular Probesから市販されている)、蛍光又は共焦点レーザー走査顕微鏡によって直接観察することができる。転位はまた、核局在化配列又は転位した分子(例えば、Casタンパク質又はガイドRNA)が、コロイド金などの電子密度の高い材料で標識される場合、電子顕微鏡によって評価され得る(Oliver Methods MolBiol.115:341−345(1999))。転位は、標的HIV−1 DNA配列の切断を測定するなどの間接的な方法で評価することができる。
多くの核局在化配列が当該分野で記載されており、そして本発明に関連して使用され得る。当業者は、多数の例示的な核局在化配列がHowellらによって、WO2014/165349(その開示は参考として援用される)に記載されていることを理解するであろう。
[有用なレンチウイルスベクター]
本発明のレンチウイルスベクターは、以前に使用された可能性のある異なるベクターに優るいくつかの利点を有する。例えば、MoMuLV(moloney murine leukemia virus)に基づく組換えレトロウイルスベクターは、ウイルスが自身のゲノムを、核膜を通して移動させる機構を有さないので、***している細胞にしか感染できない。従って、ウイルスゲノムは核膜が有糸***の間に自然に分解される場合にのみ、宿主細胞ゲノムへのアクセスできる。HIV−1に基づく、本明細書中に記載される手順において使用される組換えレンチウイルスは、宿主細胞の核膜を通してそのゲノムを輸送し得る。組換えレンチウイルスベクターは、LTR及びPsi遺伝子の配列がレトロウイルスベクターとは異なる。さらに、レンチウイルスのパッケージングはレトロウイルスとは異なり、パッケージングプラスミド中のGag及びPol遺伝子の配列が2つの系において異なる。しかし、ガイドRNA及びCas9の発現を駆動する内部エレメントは、レンチウイルス系とレトロウイルス系との間で同一であり得る。これは、2つのシステム間の交換を可能にし、ステップが***細胞のみに特異的に感染することを要するか否かに応じて、同等のレンチウイルス又はレトロウイルスを作製する。いくつかの例において、レトロウイルス系は、***している細胞をターゲットとすることが癌に対して特異性もたらすという点で、癌の治療剤として好ましい。レンチウイルスのベースベクターはFUGW(非営利のプラスミドレポジトリーADDGENEからプラスミド#14883として入手可能;Hongら、Science 2002 2月1日,295(5556): 868−72)が当業者に良く知られている。本発明を開発する過程で行われた修飾には、ユビキチンプロモーターによって駆動されるGFP−T2A−Cas9の挿入(例えば、Williamsら、Sci.Rep.6,25611;doi: 10.1038/srep25611(2016)を参照のこと;その全体が参照により本明細書に組み込まれる)、及びU6プロモーターによって駆動されるHIV−1特異的ガイドRNAの使用が含まれる。
本発明のレンチウイルスベクターは、以前に使用された可能性のある異なるベクターに優るいくつかの利点を有する。例えば、MoMuLV(moloney murine leukemia virus)に基づく組換えレトロウイルスベクターは、ウイルスが自身のゲノムを、核膜を通して移動させる機構を有さないので、***している細胞にしか感染できない。従って、ウイルスゲノムは核膜が有糸***の間に自然に分解される場合にのみ、宿主細胞ゲノムへのアクセスできる。HIV−1に基づく、本明細書中に記載される手順において使用される組換えレンチウイルスは、宿主細胞の核膜を通してそのゲノムを輸送し得る。組換えレンチウイルスベクターは、LTR及びPsi遺伝子の配列がレトロウイルスベクターとは異なる。さらに、レンチウイルスのパッケージングはレトロウイルスとは異なり、パッケージングプラスミド中のGag及びPol遺伝子の配列が2つの系において異なる。しかし、ガイドRNA及びCas9の発現を駆動する内部エレメントは、レンチウイルス系とレトロウイルス系との間で同一であり得る。これは、2つのシステム間の交換を可能にし、ステップが***細胞のみに特異的に感染することを要するか否かに応じて、同等のレンチウイルス又はレトロウイルスを作製する。いくつかの例において、レトロウイルス系は、***している細胞をターゲットとすることが癌に対して特異性もたらすという点で、癌の治療剤として好ましい。レンチウイルスのベースベクターはFUGW(非営利のプラスミドレポジトリーADDGENEからプラスミド#14883として入手可能;Hongら、Science 2002 2月1日,295(5556): 868−72)が当業者に良く知られている。本発明を開発する過程で行われた修飾には、ユビキチンプロモーターによって駆動されるGFP−T2A−Cas9の挿入(例えば、Williamsら、Sci.Rep.6,25611;doi: 10.1038/srep25611(2016)を参照のこと;その全体が参照により本明細書に組み込まれる)、及びU6プロモーターによって駆動されるHIV−1特異的ガイドRNAの使用が含まれる。
上記のFUGW塩基レンチウイルスベクターに加えて、本発明における使用において、本明細書で意図される他の適切なレンチウイルスベクターは、任意の適切なレンチウイルスに由来し得るか、又は任意の適切なレンチウイルスに由来することができる(米国特許第9,339,512号(これはその全体が本明細書中で参考として援用される)を参照のこと)。組換えレンチウイルス粒子は、本明細書中に記載されるガイドRNA及びCAS9遺伝子などのような、目的のヌクレオチド(nucleotide of interest,NOI)で標的細胞を形質導入し得る。いったん細胞内に入ると、ベクター粒子からのRNAゲノムはDNAに逆転写され、標的細胞のゲノムに組み込まれる。
レンチウイルスベクターは、レトロウイルスベクターのより大きな群の一部である。レンチウイルスの詳細なリストは、Coffinら(1997)「Retroviruses」Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: JM Coffin、SM Hughes、HE Varmus pp 758−763)に見出され得る。簡単に言えば、レンチウイルスは、霊長類と非霊長類の群に分けられる。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒト自己免疫不全症候群(AIDS)原因因子、及びサル免疫不全ウイルス(SIV)が挙げられるが、これらに限定されない。非霊長類レンチウイルス群には、プロトタイプ「スローウイルス」ビスナ/マエディウイルス(VMV)、並びに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ感染性貧血ウイルス(EIAV)、及びより最近記載されたネコ免疫不全ウイルス(FIV)及びウシ免疫不全ウイルス(BIV)が含まれる。
レンチウイルスは、レンチウイルスが***細胞及び非***細胞の両方に感染する能力を有するという点で、レトロウイルスファミリーの他のメンバーとは異なる(Lewisら(1992)EMBO J 11(8):3053−3058)及びLewis及びEmerman(1994)J Virol 68(1): 510−516). 対照的に、MLVのような他のレトロウイルスは、例えば、筋肉、脳、肺及び肝臓組織を構成するような非***又はゆっくり***する細胞に感染することができない。
本明細書中で使用されるレンチウイルスベクターは、レンチウイルスに由来する少なくとも1つの構成部分を含むベクターである。好ましくは、その構成部分は、ベクターが細胞に感染し、遺伝子を発現し、又は複製されるための生物学的機構に関与する。
レトロウイルス及びレンチウイルスゲノムの基本構造は、多くの共通の特徴(例えば、5’LTR及び3’LTR)を共有する。それらの間又はその内部には、ゲノムがパッケージングされることを可能にするパッケージングシグナル、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノムへの組み込みを可能にする組み込み部位、並びにパッケージング成分(これらはウイルス粒子のアセンブリに必要なポリペプチドである)をコードするgag、pol及びenv遺伝子が位置する。レンチウイルスはHIVにおけるrev及びRRE配列のようなさらなる特徴を有し、これは、感染した標的細胞の核から細胞質への組み込まれたプロウイルスのRNA転写物を、効率的にエクスポートすることを可能にする。
プロウイルスでは、ウイルス遺伝子の両端に長い末端反復配列(LTR)と呼ばれる領域が隣接している。LTRは、プロウイルスの組み込み及び転写に関与する。LTRはまた、エンハンサー−プロモーター配列としても役立ち、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。
LTR自体は、U3、R及びU5と呼ばれる3つの要素に分割することができる同一の配列である。U3は、RNAの3’末端に固有の配列に由来する。RはRNAの両末端で繰り返される配列に由来し、U5はRNAの5’末端に固有の配列に由来する。3つのエレメントのサイズは、異なるウイルスの間でかなり変化し得る。
欠損レンチウイルスベクターゲノムにおいて、gag、pol及びenvは、欠損していても機能していなくてもよい。RNAの両末端のR領域は反復配列である。U5及びU3は、それぞれRNAゲノムの5’及び3’末端における特有の配列を表す。
本発明の典型的なレンチウイルスベクターでは、複製に必須な1つ以上のタンパク質コード領域の少なくとも一部をウイルスから除去することができる。これは、ウイルスベクターの複製を欠損させる。標的非***宿主細胞に形質導入、及び/又はそのゲノムを宿主ゲノムに組み込むことができるNOI(本明細書中に記載され、本明細書中に記載されるg−LVに記載されるガイドRNS及びCAS9遺伝子など)を含むベクターを生成するために、ウイルスゲノムの一部をNOIで置き換えることもできる。
一実施形態では、レンチウイルスベクターは、国際公開第2007/071994号に記載されているような非組込みベクターである。さらなる態様において、ベクターは、全欠損しているか、部分的に欠損したウイルスRNA配列を送達する能力を有する。さらなる実施形態において、送達されるRNA上に位置するヘテロ結合ドメイン(gagに対してヘテロ)及びgag又はpol上のホモ結合ドメインは、送達されるRNAのパッケージングを確実にするために使用され得る。これらのベクターは両方とも、WO2007/072056に記載されている。
レンチウイルスベクターは「非霊長類」ベクター、すなわち、霊長類、特にヒトに主に感染しないウイルスに由来するものであってもよい。非霊長類レンチウイルスの例は、霊長類に自然に感染しないレンチウイルス科のいずれのメンバーでもよく、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、マエディビスナウイルス(MVV)又はウマ感染性貧血ウイルス(EIAV)を含み得る。
いくつかの任意の実施形態において、本発明のベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。用語「組換えレンチウイルスベクター」は、パッケージング成分の存在下で、標的細胞に感染し得るウイルス粒子へのRNAゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なレンチウイルス遺伝情報を有するベクターをいう。標的細胞の感染は、逆転写及び標的細胞ゲノムへの組込みを含み得る。組換えレンチウイルスベクターは、ベクターによって標的細胞に送達される非ウイルスコード配列を保有する。組換えレンチウイルスベクターは、最終標的細胞内で感染性レンチウイルス粒子を産生するための複製を独立して行うことができない。通常、組換えレンチウイルスベクターは、機能的なgag−pol及び/又はenv遺伝子及び/又は複製に必須の他の遺伝子を欠く。本発明のベクターは、スプリットイントロンベクターとして構成することができる。スプリットイントロンベクターは、PCT特許出願WO99/15683に記載されている。
場合により、本発明の組換えレンチウイルスベクターは、最小のウイルスゲノムを有する。本明細書中で使用される場合、用語「最小ウイルスゲノム」はウイルスベクターが非必須要素を除去し、そして標的宿主細胞に目的のヌクレオチド配列を感染させ、形質導入し、そして送達するために必要とされる機能性を提供するために、必須要素を保持するように操作されていることを意味する。この戦略の更なる詳細は、我々のWO98/17815に見出すことができる。
図1A及び1Bはそれぞれ、DNA標的(例えば、gRNA)、及びgRNA及びヒト化Cas9配列を形質導入するために有用な例示的なレンチウイルスベクターの構造を図示する。図1Aは、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列に下線を引いたgRNA(5’〜3’)を設計するために使用したDNA標的配列を示す。U3A、U3B、及びU3Cと称されるHIV−1プロウイルスLTR U3領域へのガイドRNA配列を列挙する。さらに、Katnal2遺伝子に対する標的配列を、分泌サイトカイン実験のための無関係なgRNAとして使用した。図1Bは、HIV−1;欠失U3領域(ΔU3)、調節領域(R)及びU5領域、パッケージングシグナル(Ψ)、rev応答エレメント(RRE)、及び中央ポリプリントラクト(cPPT、Flapエレメント)を有する5’LTR(灰色のボックス)に由来する遺伝子領域を示す、組み込まれたg−LV導入遺伝子を概略的に示す。プロモーターを白い矢印で示す: U6はU6小核RNA(small nuclear RNAs)の哺乳類プロモーターであり、Ubiqはヒトユビキチンcプロモーターである。転写産物は太線で囲まれたボックスとして示される;gRNAがゲノム中のDNA配列を標的とするガイドRNAであり、GFPは緑色蛍光タンパク質をコードし、T2Aは自己切断ペプチドであり、そしてhCas9は、ヒト化Cas9エンドヌクレアーゼである。WPREは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントである。3’LTRはまた、調節領域及びU5領域の上流でU3領域が欠失している(ΔU3)。
開示された手順に関連して、有用なレンチウイルスベクターは3つの異なる核酸構築物をパッケージング細胞系に同時トランスフェクトすることによって構築された(図2Cを参照のこと;より詳細にはこれらの構築物(図2A及び2Bに描写される)がパッケージング細胞系(例えば、HEK293FT細胞)にトランスフェクトされた。パッケージング細胞は、パッケージングプラスミド及びエンベローププラスミド中のタンパク質を転写及び翻訳し(図2Aに示す)、細胞の培地に分泌されたレンチウイルスベクターを産生した。図2Bに示す構築物は、ガイドRNA及びヒト化Cas9遺伝子を有するトランスジーンである。同時トランスフェクトされた細胞からの培地は、回収、濃縮、及び力価決定して、トランスジーン(図2Bに示される)を選んだ細胞に形質導入するために使用した。選択された細胞に対するレンチウイルスベクターのターゲティング特異性は、細胞表面レセプターに対する抗体又はリガンドに対する遺伝子を含めることによって、又はエンベロープ遺伝子を、結合の細胞特異性を提供する別のものに置き換えることによって増加され得る。これらの抗体、リガンド、又はエンベロープ遺伝子は、パッケージング、エンベロープ、及びトランスファープラスミドと同時にHEK293FT細胞にトランスフェクトされる。
次いで、このアプローチによって産生されたレンチウイルスは、標的細胞(例えば、ヒトマクロファージ及びT細胞)に添加され得る。レンチウイルス上のエンベロープタンパク質は標的細胞の表面上の特異的又は非特異的レセプターに結合し、そしてエンドソームを介して標的細胞に内在化される。そこで、導入遺伝子(ガイドRNAとCas9遺伝子をもつ)が核に移行し、ゲノムに組み込まれる。一旦組み込まれると、ガイドRNA配列はU6プロモーターから転写され、Cas9及び任意の緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子はユビキチンプロモーターから転写され、次いで機能的タンパク質に翻訳される。Cas9タンパク質は有利にはそれを核に向ける核局在化配列を有し、そこで、それは、ガイドRNAと一緒に機能して、ヒトゲノム中の特定の領域に結合し、そして切断する。
[ガイドRNAをコードする配列]
図3は、PAM配列(ヌクレオチドの後部配列;PAM配列に下線を引く)を有するHIV−1プロウイルスの標的DNA配列のために設計されたガイドRNA(ヌクレオチドの前部配列)の例を示す。示されるように、これらの2つの配列は一致する。しかし、ガイドRNAは、標的DNA配列の相補鎖に結合する(この図には示さず)。
図3は、PAM配列(ヌクレオチドの後部配列;PAM配列に下線を引く)を有するHIV−1プロウイルスの標的DNA配列のために設計されたガイドRNA(ヌクレオチドの前部配列)の例を示す。示されるように、これらの2つの配列は一致する。しかし、ガイドRNAは、標的DNA配列の相補鎖に結合する(この図には示さず)。
[統計解析]
HIV−1感染後のPBMC p24産生からのデータの分析を、ANOVAによって行った。スチューデントのt検定でp≦0.05が得られた場合、データは統計的に有意であるとみなされた。特定のp値は、各図の凡例に記載されている。データは、3つ又は4つの異なる血液細胞ドナーのいずれかからの実験の平均±標準誤差として表され、各実験条件は3回測定される。
HIV−1感染後のPBMC p24産生からのデータの分析を、ANOVAによって行った。スチューデントのt検定でp≦0.05が得られた場合、データは統計的に有意であるとみなされた。特定のp値は、各図の凡例に記載されている。データは、3つ又は4つの異なる血液細胞ドナーのいずれかからの実験の平均±標準誤差として表され、各実験条件は3回測定される。
[医薬組成物]
本発明のレンチウイルスベクターは、医薬組成物の形態で提供され得る。医薬組成物は遺伝子治療によって個体を処置するために使用され得、ここで、組成物は治療有効量の特定のレンチウイルスベクターを含む。
本発明のレンチウイルスベクターは、医薬組成物の形態で提供され得る。医薬組成物は遺伝子治療によって個体を処置するために使用され得、ここで、組成物は治療有効量の特定のレンチウイルスベクターを含む。
ウイルス調製物は、超遠心分離によって濃縮され得る。WO2009/153563は、レンチウイルスベクターの下流プロセシングのための方法を記載する。得られる医薬組成物は、少なくとも107 T.U./mL、例えば107〜109 T.U./mL、又は少なくとも109 T.U./mLを有することができる。(力価は、HEK293T細胞株の標準D17で力価が測定された形質導入単位/mL(T.U./mL)で表される。
医薬組成物は、ヒト又は動物、例えば霊長類動物対象又はコンパニオンアニマル対象を治療するために使用することができる。
組成物は場合により、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントを含んでもよい。医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図される投与経路及び標準的な医薬実施に関して選択することができる。医薬組成物は担体、賦形剤又は希釈剤として(又はこれらに加えて)、任意の適切なバインダー、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤、及び標的部位へのウイルス侵入を補助又は増加し得る他の担体(例えば、脂質送達系など)を含み得る。
組成物は場合により、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントを含んでもよい。医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図される投与経路及び標準的な医薬実施に関して選択することができる。医薬組成物は担体、賦形剤又は希釈剤として(又はこれらに加えて)、任意の適切なバインダー、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤、及び標的部位へのウイルス侵入を補助又は増加し得る他の担体(例えば、脂質送達系など)を含み得る。
[治療及び/又は予防の方法]
「g−LV」などの本発明のレンチウイルスベクターはHIV感染個体を処置し、AIDSの発症を遅延させ、そしてAIDS患者をインビボ及びエクスビボの両方で処置するために使用され得る。別の実施形態において、本発明のレンチウイルスベクターは、健康な個体に投与することによって、HIV感染を予防するために使用され得る。
「g−LV」などの本発明のレンチウイルスベクターはHIV感染個体を処置し、AIDSの発症を遅延させ、そしてAIDS患者をインビボ及びエクスビボの両方で処置するために使用され得る。別の実施形態において、本発明のレンチウイルスベクターは、健康な個体に投与することによって、HIV感染を予防するために使用され得る。
一実施形態では、HIV感染を治療又は予防するためのin vivo方法が提供される。被験体に、g−LVなどのような本発明のレンチウイルスベクターを投与する。レンチウイルスベクターは、薬学的に適切な塩及び溶媒和物と共にパッケージされ得、HIVウイルスに感染した個体又はAIDS患者に投与され得る。
本発明のレンチウイルスベクターは、単位投薬形態で好都合に投与され得、そして医薬分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子治療レンチウイルス剤が滅菌水又は生理食塩水、ポリアルキレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレンなどのような、HIV感染を治療するための少なくとも1つの他の一般的な賦形剤をさらに含む。
本発明のレンチウイルスベクターは薬学的に受容可能な非毒性賦形剤又はキャリア(例えば、塩及び溶媒和物)との混合によって、薬学的組成物に処方され得る。このような化合物及び組成物は、非経口投与のための静脈内形態、皮下形態、又は筋肉内形態、特に生理緩衝水溶液中の液体溶液又は懸濁液の形態;経口投与のための特に錠剤又はカプセルの形態;又は鼻腔内投与のための吸入形態、特に粉末、点鼻薬、又はエアロゾルの形態;又は適用のための液体溶液又は懸濁液の粘膜形態で調製され得る。持続放出組成物も本発明に包含される。他の投与経路のための組成物は、標準的な方法を使用して所望により調製され得る。
他の実施形態において、本発明はまた、少なくとも1つの包装材及び包装材内に含まれる、g−LVなどのような本発明のレンチウイルスベクターを含む、製品に関する。包装材は、本発明のレンチウイルスベクターがHIV感染及びAIDSを処置するために使用され得ることを示すラベル又は添付文書を含み得る。
本明細書に記載されるように、in vivo及びex vivo方法の両方が本明細書において意図され、この方法はHIV感染個体を処置し、AIDSの発症を遅延させ、そしてAIDS患者を処置するために特に有用である。一実施形態では、ex vivo法がHIV感染個体を治療し、AIDSの発症を遅延させ、AIDS患者を治療するのに特に有用であり、骨髄幹細胞のex vivo形質転換を利用する。この特定の実施形態では、患者から骨髄を採取するための標準的な臨床手順が使用される。この特定のex vivo手順の利点は、T細胞及びマクロファージを含む全てのタイプの血液細胞に複製及び分化する造血幹細胞を主に標的とすることである。
一実施形態では、ex vivo手順が任意選択で、HIV感染個体から骨髄を採取することを含む。骨髄由来の造血幹細胞は、当該分野で公知の方法を用いて単離及び培養され、そして医薬組成物中の治療有効量の本発明のレンチウイルスベクターで形質転換される。次いで、形質転換された造血幹細胞は本明細書中に記載されるように、HIVプロウイルス配列の破壊、根絶及び/又は排除を確認するために検証する。スクリーニング及び選択後、トランスフェクトされた造血幹細胞を、HIV感染個体に移植して戻す。
g−LVなどのようなレンチウイルスベクター組成物と共に使用するためのex vivo手順の別の実施形態において、PBMC、T細胞及び/又はマクロファージはHIV感染個体又はAIDS患者から単離され、次いで、単離された細胞は本発明のレンチウイルスベクター組成物で形質転換される。この特定のex vivo手順はHIV感染個体から血液を採取することを必要とし、次いで、PBMC細胞、T細胞及び/又はマクロファージは、血液から単離され、培養され、そして治療有効量の本明細書に記載の本発明のレンチウイルスベクターで形質転換される。次いで、形質転換されたPBMC、T細胞及び/又はマクロファージを検証して、本明細書中に記載されるようなHIVプロウイルス配列の破壊、根絶及び/又は排除を確認する。スクリーニング及び選択後、形質転換されたPBMC、T細胞及び/又はマクロファージは、HIV感染個体に輸血して戻される。
本発明は、gRNA及びCas9遺伝子を含むレンチウイルスベクターによるHIV感染患者の処置を包含する。gRNAはHIVプロウイルスに特異的であるべきである。この点において、本発明は、HIV特異的導入遺伝子を有するレンチウイルスベクターで非感染細胞又はHIV感染細胞のいずれかを形質導入することを包含する。実施例8は、既にHIV−1に感染した細胞のウイルス形質導入を扱う。実施例9は、HIV−1による感染に先行するウイルス形質導入を扱う。この治療的介入は、HIVを有する患者、又は抗レトロウイルス療法の前、間、又は後にHIVに罹患する危険性が高い患者に投与される。一つの態様において、治療的介入は、それらが「エリートコントローラー」であるか、又はそれらが抗レトロウイルス療法を受けているか、若しくは受けているかのいずれかの理由でそれらのウイルス血症が抑制されている間に、投与される。一実施形態では、この治療介入が、高リスク個体においてHIVを予防するための予防的治療「ワクチン」として投与され得る。患者は、それらの循環免疫細胞が大部分非感染である場合に処置される。レンチウイルスベクターによる1回以上の注入の後、抗レトロウイルス療法は中止され得る。本明細書中に開示されるアプローチによって、HIVプロウイルス特異的ガイドRNAで形質導入された細胞は、その後のウイルスの復活によるHIV感染から保護される。
[末梢血細胞を単離及び活性化する方法]
正常ヒトドナーの全血から末梢血単核細胞(PBMC)を得た。全血を、等量の生理食塩水で希釈し、Ficoll−Hypaque(Amersham, Piscataway,NJ)のクッション上に重層し、そして400×gで30分間遠心分離した。PBMCインターフェースを回収し、3回洗浄し、2mMグルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、及び10%ウシ胎児血清(Atlanta Biologicals, Atlanta,GA)(cRPMI)を補充したRPMI 1640培地(Corning Cellgrow, Manassas,VA)中で2×106細胞/mlに希釈した。PBMC画分中のリンパ球を、2μg/mlのフィトヘマグルチニンP(Sigma Chemical Company;St.Louis, MO)の添加によって48時間活性化した。次いで、細胞を無血清RPMI1640で3回洗浄し、cRPMIで1×106細胞/mlに調整した。
正常ヒトドナーの全血から末梢血単核細胞(PBMC)を得た。全血を、等量の生理食塩水で希釈し、Ficoll−Hypaque(Amersham, Piscataway,NJ)のクッション上に重層し、そして400×gで30分間遠心分離した。PBMCインターフェースを回収し、3回洗浄し、2mMグルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、及び10%ウシ胎児血清(Atlanta Biologicals, Atlanta,GA)(cRPMI)を補充したRPMI 1640培地(Corning Cellgrow, Manassas,VA)中で2×106細胞/mlに希釈した。PBMC画分中のリンパ球を、2μg/mlのフィトヘマグルチニンP(Sigma Chemical Company;St.Louis, MO)の添加によって48時間活性化した。次いで、細胞を無血清RPMI1640で3回洗浄し、cRPMIで1×106細胞/mlに調整した。
各ドナーを、CCR5におけるデルタ32変異(Δ32)が存在しないことについて予めスクリーニングした。簡潔には、ゲノムDNAを、Qiagen AL緩衝液中での溶解によって1〜2×106のPBMCから単離し、プロテアーゼで処理し、そしてQIAmpカラム上で、製造者の指示に従って精製した。約200ナノグラムの精製DNAを、フォワードプライマー: 5’−GATAGGTACCTGGCTGTCGTCCAT−3’(配列番号:2)及びリバースプライマー: 5’−ACCAGCCCAAGATGACTATCT−3’(配列番号:3)を利用したPCRに供した。ホモ接合野生型CCR5は239塩基対(bp)産物を与えたが、Δ32変異は207bp産物を生じた。この突然変異についてヘテロ接合性のドナーは、239bp産物及び207bp産物の両方を発現した。野生型CCR5についてホモ接合性のドナーのみをこの研究に使用した。
[ガイドRNA配列の同定方法]
HIV−1プロウイルスにおける候補gRNA標的配列を、Gene Construction Kitソフトウェア(Textco Biosoftware, West Lebanon, NH)を用いて同定し、そしてNational Center for Biotechnology InformationのBLASTプログラムを用いてヒトゲノムDNAに対する意図しない相同性について試験した。これらの配列を、Gibson法(New England Biolabsからキットとして入手可能)によって、ヒトU6プロモーター(Addgeneプラスミド#41824)の転写制御下で、ガイドRNAスキャフォールドを含むAddgeneベクターにクローニングした。抗生物質耐性形質転換体をDNA配列決定により確認した。ガイドRNAを、X−tremeGENE(Roche #06 366)をトランスフェクション剤として用いてJ−Lat 10.6細胞に一過性トランスフェクションすることで、ヒト化Cas9遺伝子を有するプラスミド(Addgene plasmid 41815)と同時トランスフェクトした場合の切断の有効性について試験した。10ng/mlのTNFα(R&D Systems;Minneapolis, MN)活性化後のJ−LatプロウイルスGFP発現の誘導の喪失は、プロウイルスに対するガイド配列の特異性を示した。これらの研究で使用したガイドRNAは、5’及び3’LTR領域の両方に存在するU3の領域(「U3B」と呼ばれる)を標的とした。さらに、U3における2つの他の領域へのガイドRNAを同定した(「U3A」及び「U3C」)。これらのガイドRNAの標的配列を図1Aに示す。図3は、例示的なgRNA(ヌクレオチドのトップ配列)が標的遺伝子領域にどのように相補的に結合するかを示す。
HIV−1プロウイルスにおける候補gRNA標的配列を、Gene Construction Kitソフトウェア(Textco Biosoftware, West Lebanon, NH)を用いて同定し、そしてNational Center for Biotechnology InformationのBLASTプログラムを用いてヒトゲノムDNAに対する意図しない相同性について試験した。これらの配列を、Gibson法(New England Biolabsからキットとして入手可能)によって、ヒトU6プロモーター(Addgeneプラスミド#41824)の転写制御下で、ガイドRNAスキャフォールドを含むAddgeneベクターにクローニングした。抗生物質耐性形質転換体をDNA配列決定により確認した。ガイドRNAを、X−tremeGENE(Roche #06 366)をトランスフェクション剤として用いてJ−Lat 10.6細胞に一過性トランスフェクションすることで、ヒト化Cas9遺伝子を有するプラスミド(Addgene plasmid 41815)と同時トランスフェクトした場合の切断の有効性について試験した。10ng/mlのTNFα(R&D Systems;Minneapolis, MN)活性化後のJ−LatプロウイルスGFP発現の誘導の喪失は、プロウイルスに対するガイド配列の特異性を示した。これらの研究で使用したガイドRNAは、5’及び3’LTR領域の両方に存在するU3の領域(「U3B」と呼ばれる)を標的とした。さらに、U3における2つの他の領域へのガイドRNAを同定した(「U3A」及び「U3C」)。これらのガイドRNAの標的配列を図1Aに示す。図3は、例示的なgRNA(ヌクレオチドのトップ配列)が標的遺伝子領域にどのように相補的に結合するかを示す。
[ガイドRNA及びCas9をレンチウイルスベクターにクローニングする方法]
トランスファーベクターへのクローニングのために選択された特異的gRNA配列を、TNFα活性化後のJ−Lat10.6インジケーター細胞に組み込まれたプロウイルスからのGFP誘導をブロックする活性に基づいて選択した。このスクリーニングに基づいて、3つのgRNA(U3A、U3B及びU3Cと呼ばれる)をFUGW由来の自己不活化レンチウイルス導入ベクターにクローニングした。FUGWベクターはHIV−1に基づき、HIV−1 Flapエレメント、ヒトユビキチン−cプロモーター、GFP、及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WRE)を含む。ヒト化Cas9(AddGene pX330由来)を、自己切断ペプチドT2Aを介してGFPに連結し、ユビキチン−cプロモーターの転写制御下にあるように、このトランスファーベクターにクローニングした。このトランスファーベクターをさらに改変して、Flapエレメントに隣接するPacI及びBstB1制限エンドヌクレアーゼ切断部位を導入し、それによって、U6プロモーター及び標的配列並びにgRNAスキャフォールドを包含するPCR産物のクローニングを可能にした(図1B)。我々の対照LVは、GFP−Cas9遺伝子(「空LV」又は「e−LV」と呼ばれる)のみを発現するように設計された。
トランスファーベクターへのクローニングのために選択された特異的gRNA配列を、TNFα活性化後のJ−Lat10.6インジケーター細胞に組み込まれたプロウイルスからのGFP誘導をブロックする活性に基づいて選択した。このスクリーニングに基づいて、3つのgRNA(U3A、U3B及びU3Cと呼ばれる)をFUGW由来の自己不活化レンチウイルス導入ベクターにクローニングした。FUGWベクターはHIV−1に基づき、HIV−1 Flapエレメント、ヒトユビキチン−cプロモーター、GFP、及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WRE)を含む。ヒト化Cas9(AddGene pX330由来)を、自己切断ペプチドT2Aを介してGFPに連結し、ユビキチン−cプロモーターの転写制御下にあるように、このトランスファーベクターにクローニングした。このトランスファーベクターをさらに改変して、Flapエレメントに隣接するPacI及びBstB1制限エンドヌクレアーゼ切断部位を導入し、それによって、U6プロモーター及び標的配列並びにgRNAスキャフォールドを包含するPCR産物のクローニングを可能にした(図1B)。我々の対照LVは、GFP−Cas9遺伝子(「空LV」又は「e−LV」と呼ばれる)のみを発現するように設計された。
[レンチウイルスの製造方法]
レンチウイルスパッケージングは、当業者によく知られている方法により、3つのプラスミド(pCMVdelta8.9、pVSV−g、及びFUGWベースのトランスファーベクター)を用いたHEK293 FT細胞(Invitrogen;Grand Island, NY)のリン酸カルシウムによるトランスフェクションを行った。簡潔には、細胞を、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM、高グルコース)(GIBCO 12440−053)、10%ウシ胎児血清(FBS)、0.1mM Non−Essential Amino Acids、2mM L−グルタミン、1%Pen−Strep、及び500μg/mlジェネティシン中で維持した。細胞増殖を最適化するために、これらの細胞をトリプシン処理し、トランスフェクションの前日に10cmプレートあたり2.5〜3.0×106の細胞で再プレーティングし、そして10cmプレートあたり約10μgのトランスファーベクター、6.5μgのpCMVdelta8.9及び4.5μgのpVSV−gでジェネティシンの非存在下でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、培地を、0.5%FBS及び0.4mg/mlカフェインを加えたIMDMと交換した。レンチウイルス粒子を含有する上清を、トランスフェクションの48時間後及び72時間後に回収し、遠心分離して細胞破片を除去し、0.45μm PVDFフィルターを通して濾過した。ウイルス粒子を、滅菌ポリエチレングリコール6000及び塩化ナトリウムを最終濃度がそれぞれ8%及び0.3Mとなるよう添加し、4℃で12時間以上インキュベートし、続いて2,500×gで45分間遠心分離することによって濃縮した。上清を完全に除去し、ペレットを滅菌リン酸緩衝生理食塩水に溶解した。72時間後に、レンチウイルスをHEK293 FT細胞上で、GFP発現のための連続希釈及び蛍光顕微鏡検査によって力価測定した。力価は常に107〜109形質導入単位/mlであった。濃縮LVを−80℃で5〜10μlに分注して保存した。レンチウイルスベクターの調製はまた、トランスファーベクターに加えて3つのプラスミドが使用される「第3世代」レンチウイルスベクター系を使用する。第1のプラスミドはgag及びpol遺伝子を有し、pMDLg/pRRE(Addgeneプラスミド#12251)と呼ばれ、第2のプラスミドはrev遺伝子を有し、pRSV−Rev(Addgeneプラスミド#12253)と呼ばれる。エンベロープ遺伝子を含む第3のプラスミドは、VSV−g遺伝子(Addgene pMD2.G、#12259)を発現する。
レンチウイルスパッケージングは、当業者によく知られている方法により、3つのプラスミド(pCMVdelta8.9、pVSV−g、及びFUGWベースのトランスファーベクター)を用いたHEK293 FT細胞(Invitrogen;Grand Island, NY)のリン酸カルシウムによるトランスフェクションを行った。簡潔には、細胞を、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM、高グルコース)(GIBCO 12440−053)、10%ウシ胎児血清(FBS)、0.1mM Non−Essential Amino Acids、2mM L−グルタミン、1%Pen−Strep、及び500μg/mlジェネティシン中で維持した。細胞増殖を最適化するために、これらの細胞をトリプシン処理し、トランスフェクションの前日に10cmプレートあたり2.5〜3.0×106の細胞で再プレーティングし、そして10cmプレートあたり約10μgのトランスファーベクター、6.5μgのpCMVdelta8.9及び4.5μgのpVSV−gでジェネティシンの非存在下でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、培地を、0.5%FBS及び0.4mg/mlカフェインを加えたIMDMと交換した。レンチウイルス粒子を含有する上清を、トランスフェクションの48時間後及び72時間後に回収し、遠心分離して細胞破片を除去し、0.45μm PVDFフィルターを通して濾過した。ウイルス粒子を、滅菌ポリエチレングリコール6000及び塩化ナトリウムを最終濃度がそれぞれ8%及び0.3Mとなるよう添加し、4℃で12時間以上インキュベートし、続いて2,500×gで45分間遠心分離することによって濃縮した。上清を完全に除去し、ペレットを滅菌リン酸緩衝生理食塩水に溶解した。72時間後に、レンチウイルスをHEK293 FT細胞上で、GFP発現のための連続希釈及び蛍光顕微鏡検査によって力価測定した。力価は常に107〜109形質導入単位/mlであった。濃縮LVを−80℃で5〜10μlに分注して保存した。レンチウイルスベクターの調製はまた、トランスファーベクターに加えて3つのプラスミドが使用される「第3世代」レンチウイルスベクター系を使用する。第1のプラスミドはgag及びpol遺伝子を有し、pMDLg/pRRE(Addgeneプラスミド#12251)と呼ばれ、第2のプラスミドはrev遺伝子を有し、pRSV−Rev(Addgeneプラスミド#12253)と呼ばれる。エンベロープ遺伝子を含む第3のプラスミドは、VSV−g遺伝子(Addgene pMD2.G、#12259)を発現する。
[PBMCのHIV−1感染及びLV形質導入の方法]
活性化されたPBMCを、125TCID50/106細胞のHIV−1BaLで5時間感染させた後、取り込まれていないウイルスを5時間洗い流した。細胞を3回洗浄し、10単位/mlのインターロイキン2(IL−2)(Invitrogen;Carlsbad, CA)を含むcRPMI中に置いた。
活性化されたPBMCを、125TCID50/106細胞のHIV−1BaLで5時間感染させた後、取り込まれていないウイルスを5時間洗い流した。細胞を3回洗浄し、10単位/mlのインターロイキン2(IL−2)(Invitrogen;Carlsbad, CA)を含むcRPMI中に置いた。
活性化PBMCを、HIV−1感染の前又は後に、HIV特異的ガイドRNA+Cas9−GFP(g−LV)又はCas9−GFPのみ(e−LV)を発現する精製LVで形質導入した。細胞形質導入の時点で、LVのアリコートを氷上で解凍し、5秒間微量遠心分離機で回転させ、直ちに、1mlのcRPMI中の24ウェルプレートのウェルに播種したPBMCに加えた。プレートを穏やかに旋回させてレンチウイルスベクターを分散させ、次いで、細胞を洗浄する前に、5%CO2を含む37℃インキュベーター中に5時間置いた。PBMCは、HIV−1による感染又はLVによる形質導入の後、10単位/mlのIL−2を含むcRPMI中で維持した。その後、我々は、HIV−1p24キット(Perkin Elmer;Waltham, MA)を用いるELISAによって、培養上清中のHIV−1p24レベルを定量した。
[g−LVによるプロビラル切断を示す方法]
特異的ガイドRNA配列による組み込まれたプロウイルスの切断及び/又は切除を確認するために、J−Lat10.6細胞をg−LV又はe−LVベクターのいずれかを形質導入し、次いで、細胞集団を限界希釈クローニングに供した。LVで形質導入されたクローンは、中程度レベルの平均蛍光強度(MFI)レベルで導入遺伝子のGFP−Cas9領域から構成的にGFPを発現した。GFP陽性クローンを増殖させ、10ng/ml TNFαで24時間活性化し、次いで、組み込まれたプロウイルスからのde novo GFP発現について評価した。組み込まれたプロウイルスからのGFP発現はより明るいMFIを有し、蛍光ピークは、組み込まれた導入遺伝子からの構成的GFP産生と明確に区別可能であった。ELISAを用いて、分泌p24のレベルを測定した。
特異的ガイドRNA配列による組み込まれたプロウイルスの切断及び/又は切除を確認するために、J−Lat10.6細胞をg−LV又はe−LVベクターのいずれかを形質導入し、次いで、細胞集団を限界希釈クローニングに供した。LVで形質導入されたクローンは、中程度レベルの平均蛍光強度(MFI)レベルで導入遺伝子のGFP−Cas9領域から構成的にGFPを発現した。GFP陽性クローンを増殖させ、10ng/ml TNFαで24時間活性化し、次いで、組み込まれたプロウイルスからのde novo GFP発現について評価した。組み込まれたプロウイルスからのGFP発現はより明るいMFIを有し、蛍光ピークは、組み込まれた導入遺伝子からの構成的GFP産生と明確に区別可能であった。ELISAを用いて、分泌p24のレベルを測定した。
J−LatクローンをPCR分析にかけ、HIVプロウイルスのvpr−tat領域(176塩基対)をフォワードプライマー: GGCGTTACTCGACAGAGGAG(配列番号4)及びリバースプライマー: TCCTGCCATAGGAGATGCCT (配列番号5)を用いて特異的に検出した。Vpr−tat配列は、5’及び3’LTRのU3領域からそれぞれ5.5Kb及び3.4Kbである。内部対照として、CCR5遺伝子配列(239塩基対、上記プライマー)のPCRを使用して、等しいテンプレートローディングを確認した。g−LV及びe−LVクローンの両方からのPCR産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析し、そしてGelRed核酸染色(Biotium;Hayward, CA)での染色によって可視化した。
[マルチプレックスサイトカインアッセイの実施方法]
HIV−1感染又はLV形質導入後に培地に分泌されたサイトカインを、Milliporeヒトサイトカインマルチプレックスキット(EMD Millipore Corporation;Billerica, MA)を用いて測定した。組換えサイトカイン標準からの較正曲線を、サンプルと同じ培地中で3倍希釈を繰り返して調製した。高スパイク及び低スパイク(刺激されたヒトPBMC及び樹状細胞由来の上清)を、サイトカイン回収を決定するために含めた。標準及びスパイクを3連で測定し、サンプルを1回測定し、ブランク値を全ての読み取り値から差し引いた。全てのアッセイは、96ウェル濾過プレート(Millipore;Billerica, MA)中で、光から保護しながら室温で直接実施した。
HIV−1感染又はLV形質導入後に培地に分泌されたサイトカインを、Milliporeヒトサイトカインマルチプレックスキット(EMD Millipore Corporation;Billerica, MA)を用いて測定した。組換えサイトカイン標準からの較正曲線を、サンプルと同じ培地中で3倍希釈を繰り返して調製した。高スパイク及び低スパイク(刺激されたヒトPBMC及び樹状細胞由来の上清)を、サイトカイン回収を決定するために含めた。標準及びスパイクを3連で測定し、サンプルを1回測定し、ブランク値を全ての読み取り値から差し引いた。全てのアッセイは、96ウェル濾過プレート(Millipore;Billerica, MA)中で、光から保護しながら室温で直接実施した。
簡潔には、ウェルを、1%BSAを含有する100μlのPBSで予備湿潤させ、次いで、ビーズ、標準、サンプル、スパイク、又はブランクを、100μlの最終容量で添加し、そして室温で30分間、連続振盪しながら一緒にインキュベートした。ビーズを1%BSA及び0.5%Tween20を含有する100μlのPBSで3回洗浄した。ビオチン化抗体のカクテル(50μl/ウェル)をビーズに添加し、連続振盪しながらさらに30分間インキュベートした。ビーズを3回洗浄し、次いでストレプトアビジン−PEを10分間添加した。ビーズを再び3回洗浄し、1%BSA及び0.5%Tween20を含有する125μlのPBSに懸濁した。ビーズの蛍光強度を、Bio−Plexアレイリーダーを用いて測定した。5つのパラメトリック曲線フィッティングを有するBio−Plex Managerソフトウェアをデータ分析に使用した。
[HIV−1感染PBMCへのLV形質導入はHIV−1産生を遮断する]
活性化PBMCを、U3BガイドRNA及びCas9を含むLV(g−LV)、又はGFP−Cas9遺伝子のみを発現するLV(e−LV)で形質導入する48時間前にHIV−1BaLで感染させた。これらの細胞培養物の各々からの上清を、形質導入後の種々の日に回収し、そして上清中のp24の濃度を、HIV−1生産の指標としてELISAにより測定した。図4に示すように、感染後12日間を通してHIV単独で感染させたウェルではp24レベルの定常的な増加が観察されたが、g−LV又はe−LVのいずれかで形質導入した培養物は、12日間を通してHIV p24産生の抑制を示した。図4に示すデータは3つの異なる実験をまとめたものであり、各実験条件は3連で実施した。
活性化PBMCを、U3BガイドRNA及びCas9を含むLV(g−LV)、又はGFP−Cas9遺伝子のみを発現するLV(e−LV)で形質導入する48時間前にHIV−1BaLで感染させた。これらの細胞培養物の各々からの上清を、形質導入後の種々の日に回収し、そして上清中のp24の濃度を、HIV−1生産の指標としてELISAにより測定した。図4に示すように、感染後12日間を通してHIV単独で感染させたウェルではp24レベルの定常的な増加が観察されたが、g−LV又はe−LVのいずれかで形質導入した培養物は、12日間を通してHIV p24産生の抑制を示した。図4に示すデータは3つの異なる実験をまとめたものであり、各実験条件は3連で実施した。
[HIV−1曝露前のg−LV又はe−LVの導入はPBMCを感染から保護する]
PHA活性化PBMCをg−LV又はe−LVで形質導入して、ガイドRNA及びCas9配列の事前組み込みがHIV−1感染からPBMCを保護するかどうかを評価した。全ての培養物を、トランスフェクション後2日目にHIV−1に感染させた。これらの培養物では、g−LV及びe−LV形質導入細胞の両方がその後のHIV−1感染に対して耐性であった。図5Aに提示されるデータは3つの異なる実験の編集であり、各実験条件は3連で実施された。
PHA活性化PBMCをg−LV又はe−LVで形質導入して、ガイドRNA及びCas9配列の事前組み込みがHIV−1感染からPBMCを保護するかどうかを評価した。全ての培養物を、トランスフェクション後2日目にHIV−1に感染させた。これらの培養物では、g−LV及びe−LV形質導入細胞の両方がその後のHIV−1感染に対して耐性であった。図5Aに提示されるデータは3つの異なる実験の編集であり、各実験条件は3連で実施された。
別々の実験において、本発明者らはLV形質導入後3日目及び4日目にe−LV又はg−LV形質導入細胞をHIV−1処理し、これらの細胞がHIV−1感染からも保護されることを示した。この手順の結果を図5Bに示す。
[LV形質導入PBMCによって産生される炎症性ケモカイン]
LV形質導入後にPBMCがHIV感染に抵抗できる代替機構を調べるために、上清を、HIV−1による感染後様々な時点で、g−LV、e−LV、又は導入遺伝子(FUGW)においてガイドRNA又はCas9を発現しないLVによる形質導入後に、PBMCからの41の異なる炎症性サイトカインについてのLuminexマルチプレックスアッセイを用いて分析した。g−LVは、ガイドRNA配列U3A、U3B、U3C、及びKatnal−2を有するものを含んだ。Katnal 2(カタニンp60サブユニットA−like 2)は細胞微小管の迅速な再編成を促進するように機能するタンパク質を産生し、無関係なガイドRNA制御として選択された。対照PBMCは、いずれのウイルスベクターでも処理しなかった。
LV形質導入後にPBMCがHIV感染に抵抗できる代替機構を調べるために、上清を、HIV−1による感染後様々な時点で、g−LV、e−LV、又は導入遺伝子(FUGW)においてガイドRNA又はCas9を発現しないLVによる形質導入後に、PBMCからの41の異なる炎症性サイトカインについてのLuminexマルチプレックスアッセイを用いて分析した。g−LVは、ガイドRNA配列U3A、U3B、U3C、及びKatnal−2を有するものを含んだ。Katnal 2(カタニンp60サブユニットA−like 2)は細胞微小管の迅速な再編成を促進するように機能するタンパク質を産生し、無関係なガイドRNA制御として選択された。対照PBMCは、いずれのウイルスベクターでも処理しなかった。
サイトカイン/ケモカイン発現の3つの一般的パターンが観察された。1つのパターンにおいて、特定のサイトカイン/ケモカインは、72時間にわたる感染/形質導入条件のいずれにおいても発現されなかった。発現されなかったサイトカインには、TGFα、FLT−3L、IL−12P70、PDGF−AA及びPDGF−BBが含まれた。第2のパターンは、刺激(HIV−1、LV、又は処置なし)にかかわらず構成的に分泌されたサイトカイン/ケモカインを例示した。これらには、EGF、FGF2、エオタキシン、GM−CSF、フラクタリン、IL−10、IL−12P40、MDC、IL−13、IL−15、sCD40L、IL−17α、IL−1Rα、IL−3、IL−4、IL−5、IL−7、IP−10、MIP−1α、MIP−1β、RANTES、TNFα及びTNF−βが含まれた。IL−2は全ての条件で存在したが、このサイトカインをPBMC培地に添加したため、このサイトカインの誘導に関する結論を評価することはできない。第3のパターンは、LVがガイドRNAの有無にかかわらずCas9遺伝子を発現したLV形質導入後にのみ発現したサイトカインを含んだ。図6に示すように、この第3の発現パターンを表すサイトカイン及びケモカインは、G−CSF、IFN−α2、IFN−γ、GRO、MCP−3、IL−1α、IL−1β、IL−6、IL−8、IL−9、VEGF、及びMCP−1を含んでいた。これらの12のサイトカイン又はケモカインのいずれも、対照条件下、又はHIV−1若しくはFUGW LVへの曝露後に有意な量で産生されなかった。
[U3B Guide RNA Plus Cas9はJ−Lat細胞のプロウイルス配列を排除する]
J−Lat10.6細胞はHIV−1に対する調節遺伝子のいくつかを欠くが、LTRの制御下でGFP及びgagを含む修飾された組み込まれたHIV−1プロウイルスを含むため、潜伏HIV感染細胞のモデルとして使用した。さらに、TNFαはこれらのJ−Lat細胞においてプロウイルス転写を活性化することができ、GFP及びp24産生の両方をもたらす。J‐Latのe‐LV及びg‐LV形質導入クローンもGFP Cas9遺伝子からGFPを発現するので、TNFα活性化前後のJ‐Lat細胞の二重蛍光強度プロフィールを比較した。図6Aに示されるように、親(クローニングされていない)J−Lat細胞は、細胞の約80%においてGFPの明るいピークを誘導する。したがって、親細胞は天然の状態ではGFPを発現しないが、約80%の細胞においてTNF−α活性化後に高強度GFP発現を発現するように誘導することができる。図6Bは、e−LVで形質導入された代表的なJ−Latクローンからの組み込まれた導入遺伝子からのより低い強度のGFPピーク、及びTNFα活性化後の組み込まれたプロウイルスからのより明るい蛍光ピークの誘導の両方を示す。従って、e−LVで形質導入されたJ−Latクローンは、導入遺伝子からの低強度レベルのGFPと、TNF−α活性化後のより明るい強度GFPとを発現する。図6Cは、g−LVで形質導入された代表的なJ−Latクローンを示し、TNFα活性化後の第2のより明るいGFPピークの誘導の欠如を示す。従って、g−LVで形質導入されたJ−Latクローンは導入遺伝子からの低強度レベルのGFPを発現し、TNF−α活性化後のより明るい強度のGFPピークの誘導はない。親J−Latクローン及びe−LV形質導入クローンも、培養上清中に分泌されたp24を産生したが、g−LVクローンは産生しなかった。このタンパク質のレベルは図6A〜6Cの凡例に記載されている。
J−Lat10.6細胞はHIV−1に対する調節遺伝子のいくつかを欠くが、LTRの制御下でGFP及びgagを含む修飾された組み込まれたHIV−1プロウイルスを含むため、潜伏HIV感染細胞のモデルとして使用した。さらに、TNFαはこれらのJ−Lat細胞においてプロウイルス転写を活性化することができ、GFP及びp24産生の両方をもたらす。J‐Latのe‐LV及びg‐LV形質導入クローンもGFP Cas9遺伝子からGFPを発現するので、TNFα活性化前後のJ‐Lat細胞の二重蛍光強度プロフィールを比較した。図6Aに示されるように、親(クローニングされていない)J−Lat細胞は、細胞の約80%においてGFPの明るいピークを誘導する。したがって、親細胞は天然の状態ではGFPを発現しないが、約80%の細胞においてTNF−α活性化後に高強度GFP発現を発現するように誘導することができる。図6Bは、e−LVで形質導入された代表的なJ−Latクローンからの組み込まれた導入遺伝子からのより低い強度のGFPピーク、及びTNFα活性化後の組み込まれたプロウイルスからのより明るい蛍光ピークの誘導の両方を示す。従って、e−LVで形質導入されたJ−Latクローンは、導入遺伝子からの低強度レベルのGFPと、TNF−α活性化後のより明るい強度GFPとを発現する。図6Cは、g−LVで形質導入された代表的なJ−Latクローンを示し、TNFα活性化後の第2のより明るいGFPピークの誘導の欠如を示す。従って、g−LVで形質導入されたJ−Latクローンは導入遺伝子からの低強度レベルのGFPを発現し、TNF−α活性化後のより明るい強度のGFPピークの誘導はない。親J−Latクローン及びe−LV形質導入クローンも、培養上清中に分泌されたp24を産生したが、g−LVクローンは産生しなかった。このタンパク質のレベルは図6A〜6Cの凡例に記載されている。
e−LVクローンと比較したg−LV形質導入クローンにおけるプロウイルス遺伝子破壊の程度を決定するために、PCRアッセイを実施して、プロウイルスの中央の領域(ガイドRNAによって標的化されたU3配列から4.5キロ塩基)を増幅した。電気泳動分析により、親J−Lat細胞がPCR反応に用いられるDNA鋳型を提供する場合に得られる、長さ176bpの増幅産物が認められた。同様に、e−LVコンストラクト(すなわち、HIV−1特定gRNAをコードしない)で形質導入された3つのJ−LatクローンがDNA鋳型を提供した場合、同じバンドが観察された。これらの場合の各々における176bpの増幅産物の産生は、HIV−1プロウイルスDNAの存在を示した。対照的に、g−LV構築物(すなわち、コードされたHIV−1特異的gRNA)で形質導入された3つのJ−LatクローンがDNA鋳型を提供した場合、176bp増幅産物は合成されなかった。この結果は、HIV−1プロウイルス配列がゲノムから有利に切り出されたことを示した。CCR5遺伝子の239bp増幅産物は、7つの試験のそれぞれにおいて検出され、それによって、プロウイルスDNAの切除を証明する試験の結果は陰性であることを確認した。簡単に言えば、g−LVクローン中のプロウイルス配列は切り出されたが、この領域まるごとが分析した全てのe−LVクローン中に存在した。
開示された実施形態の上記の説明は、当業者が本発明を製造又は使用できるようにするために提供される。これらの実施形態に対する様々な修正は当業者には容易に明らかであり、本明細書で説明される一般的な原理は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態に適用することができる。したがって、本明細書で提示される説明及び図面は本発明の現在好ましい実施形態を表し、したがって、本発明によって広く企図される主題を表すことを理解されたい。さらに、本発明の範囲は当業者に明らかとなり得る他の実施形態を完全に包含し、したがって、本発明の範囲は限定されないことが理解される。
Claims (8)
- ヒト対象の末梢血単核細胞(PBMC)におけるHIV−1産生を抑制するための組成物であって:
ウイルスベクターを含み、
前記ウイルスベクターはヒト化Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含みかつプロウイルス特異的gRNA配列を含まず、
前記PBMCはプロウイルス特異的gRNA配列を含むベクターと接触せず、
前記PBMCを前記組成物と接触させることによって前記ウイルスベクターが前記PBMCに入り、それによってHIV−1産生が抑制され、
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、組成物。 - 前記PBMCが、リンパ球及びマクロファージからなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記接触が、前記細胞がHIV−1に感染する前に行われる、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記接触が、前記細胞がHIV−1に感染した後に行われる、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記ヒト対象への投与のための薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記接触を行う前に、前記ヒト対象から前記PBMCを取り出す、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記接触を行った後、前記PBMCを前記ヒト対象に戻す、請求項6に記載の組成物。
- 前記ウイルスベクターが、特定の細胞型に結合するエンベロープタンパク質を含むビリオン内にパッケージされる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
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