JP2019519250A - Ｈｉｖ−１感染と複製に必須な遺伝子を切断するｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓの構築物のレンチウィルスによる送達 - Google Patents

Abstract

ゲノム編集によってプロウィルスＨＩＶ−１を不活性化してウィルス配列を切り出し、それによって新生ウィルスの産生を不活性化する組成物、方法及びシステム。いくつかの実施形態において、プロウィルスＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９レンチウィルス構築物を使用して、組み込まれたウィルスＤＮＡのＬＴＲ領域を標的化することによって切り出される。レンチウィルス構築物の使用は、有利には***標的細胞及び非***標的細胞の両方の形質導入を可能にする。
【選択図】図１

Description

本発明は、一般にバイオテクノロジーの分野に関する。より詳細には、本発明がゲノム編集技術に関する。さらにより詳細には、本発明がＨＩＶ−１を不活性化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の、レンチウィルスに基づく細胞の形質導入に関する。

［政府の支援］
本発明は、ＮＩＨ ＳＢＩＲ Ｇｒａｎｔ １Ｒ４３ＡＩ１１０２８５−０１、復員軍人援護局から授与されたＭｅｒｉｔ Ｒｅｖｉｅｗ Ａｗａｒｄ Ｎｏ．１Ｉ０１ＢＸ０００２６０−０１、ＮＩＭＨから授与されたＲ０１ ＭＨ０９７９４９（ＢＷＬ）の下での政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。

［配列一覧への参照］
ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩテキストファイルの通り提出された配列リストは、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１．５２（ｅ）に従って参照により本明細書に組み込まれる。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＬｉｓｔｉｎｇのＡＳＣＩＩテキストファイル名は「２０１７−０５−１０ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ Ａｓ−Ｆｉｌｅｄ １１８４３１−０２７ＷＯ１．ＴＸＴ」であり、ＡＳＣＩＩテキストファイルの作成日は２０１７年５月１０日であり、ＡＳＣＩＩテキストファイルのサイズは３ＫＢである。

ＨＩＶ−１感染に対する現在の抗レトロウィルス治療（ＡＲＴ）は、感染細胞による新しいビリオンの産生をブロックするために、ウィルスライフサイクルにおける重要な段階を効果的に中断する。しかしながら、その有効性にもかかわらず、ＡＲＴにおいて使用される薬剤は、新しいウィルス粒子の合成に使用される構造遺伝子及び調節遺伝子を含んだ組み込まれたプロウィルスを標的としない。ＡＲＴを中止すると、潜伏性ＨＩＶ感染細胞リザーバからのウィルス再発により、血漿ウィルス量の増加と標的細胞感染の新たなサイクルを招く。さらに、ＡＲＴはＨＩＶ感染細胞を死滅させない。ＨＩＶ感染患者は、治療中断の期間が短くても死亡率の増加につながることが示されているため、生涯にわたりＡＲＴを受け続けなければならないことを意味する。これらの薬物の長期使用は、臓器毒性のリスク及びウィルス耐性の誘発の可能性があるために、慎重なモニタリングを必要とする。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓと呼ばれる原核生物の先天性免疫機構は、最近、真核生物ゲノム中の遺伝子の特異的標的化及び修飾を可能にするように改変された。原核生物では、Ｃａｓと呼ばれるエンドヌクレアーゼと共に一本鎖ＲＮＡ分子が、侵入ウィルスのゲノムを切断することによって病原体侵入を遮断する（Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：１８１−１９０（２０１０）を参照のこと）。２０１２年に、ＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒとＤｏｕｄｎａは、真核細胞で機能するようにタイプＩＩ細菌Ｃａｓ遺伝子（Ｃａｓ９）の配列を改変することに成功した。その後まもなく、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とＣａｓ９を用いて真核生物の遺伝子を切断・不能化するゲノム工学が、多様な細胞系にまたがったいくつかのグループによって成功裏に報告された。真核生物では、ゲノム標的ＤＮＡ配列に相補的なガイドＲＮＡがＣａｓ９と協同して、不完全に修復された二本鎖切断を誘導することによって、特定の遺伝子を破壊する。これは、切断部位での挿入及び欠失（Ｉｎｄｅｌｓ）をもたらし、その結果、異常な転写及び翻訳をもたらす。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術は、プラスミド上に担持されたモデルＨＩＶプロウィルス配列中の単一領域を切断するガイドＲＮＡ及びＣａｓ９遺伝子を発現するプラスミドを、ヒト細胞系にトランスフェクトすることによって、ＨＩＶ系に適用されてきた（Ｅｂｉｎａら、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：２５１０（２０１３）を参照のこと）。その後すぐに、プロウィルスの５’末端及び３’末端の両方を標的とする複数のガイドＲＮＡの使用が、細胞系において全ＨＩＶプロウィルスゲノムを完全に切除し、そしてその後の再感染から細胞を保護することが実証された（Ｈｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １１１：１１４６１−１１４６６（２０１４）参照のこと）。

しかし、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９遺伝子の送達、ＨＩＶ感染患者を治療するための治療様式として、特に休止白血球へのｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの送達については課題が残っている。プラスミドＤＮＡの送達が使用可能な選択肢ではないことは、明らかである。したがって、上記のような従来の実施において見られる、これらの重大な問題を克服するシステム及び方法が必要とされている。

一態様では、本発明は１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸と、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｄ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸を保有する、本明細書中に記載される「ｇ−ＬＶ」などのレンチウィルスベクターに関し、ここで、前記ガイドＲＮＡは、標的ＨＩＶ−１ ＤＮＡ配列とハイブリダイズする。コードされたＣａｓタンパク質は、好ましくはＣａｓ９タンパク質である。

別の態様では、本発明は、（ａ）１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸（ここで、前記ガイドＲＮＡは標的ＨＩＶ−１ ＤＮＡ配列とハイブリダイズする）；及び（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質、又は前記タンパク質をコードする核酸を含む、レンチウィルスベクターを含むキットを提供する。一実施形態では、キットは、レンチウィルスベクター及びそれを必要とするヒト対象への投与に適した薬学的に許容される賦形剤を含有するバイアル又は他の容器を含む。

さらに別の態様において、本発明は、ヒト細胞における標的ヒト免疫不全ウィルス１（ＨＩＶ−１）ＤＮＡ配列の機能又は存在を、細胞をＩｎ ｖｉｔｒｏ又はＩｎ ｖｉｖｏのいずれかで保有するレンチウィルスベクターと接触させることによって阻害する方法に関し、該方法は：（ａ）１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸；及び（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質、又は前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を含み、前記ガイドＲＮＡは標的ＨＩＶ−１ ＤＮＡ配列とハイブリダイズし、それによって標的ＨＩＶ−１ ＤＮＡ配列の機能又は存在を阻害する。

本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び添付の図面を検討した後に、当業者により容易に明らかになるであろう。

本発明の構造及び動作は、以下の詳細な説明及び添付の図面を検討することによって理解されるのであろう。

図１Ａ〜１Ｂは、本発明を実証するために使用される核酸配列及び構築物を示す。図１Ａは、ｇＲＮＡの標的として働く配列（Ｕ３Ａ＝配列番号６；Ｕ３Ｂ＝配列番号７；Ｕ３Ｃ＝配列番号８；及びＨＩＶと関係なし＝配列番号９）を示す。プロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）（ＰＡＭ）配列は下線で示した。図１Ｂは、ｇＲＮＡ及びヒト化Ｃａｓ９タンパク質（ｈＣａｓ９）をコードする配列の配置を示すレンチウィルスベクターの概略図である。

図２Ａ〜２Ｄは、ＨＩＶ−１特異的ｇＲＮＡ及びヒト化Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子配列を送達するための、レンチウィルスベクターのコンストラクトを概略的に示す。パネルＡは、パッケージング及びエンベロープ産生のために使用される遺伝子配列を担持する２つのプラスミドを示す。パネルＢは、ＨＩＶ−１特異的ｇＲＮＡ及びヒト化Ｃａｓ９タンパク質をコードするクローン化配列を含むプラスミド構築物を示す。パネルＣは、組換えウィルスの産生を示す。パネルＤは、得られる組み込まれたレンチウィルス構築物を示す。

図３は、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ由来のスペーサー配列を有するｇＲＮＡ転写物（配列番号１０、５’から３’方向）の二次構造を示す。配列番号１１は、図３に示すＨＩＶ−１プロウィルスのＬＴＲにおける標的配列である。

図４は、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９の両方の遺伝子（ｇ−ＬＶ）、又はＣａｓ９遺伝子（ｅ−ＬＶ）のみを含む導入遺伝子を発現するレンチウィルスベクターで形質導入されたＨＩＶ感染ＰＢＭＣ培養物からのＨＩＶ−１産生の抑制を示す棒グラフの集合である。ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣを培養開始時（０日目）にＨＩＶ−１_ＢａＬで感染させ、次いでＨＩＶ感染後２日目にＬＶで形質導入した。上清を、ＬＶ形質導入後３、５、８及び１２日目に回収し、ＨＩＶ−１ｐ２４レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。形質導入後１２日目まで、ｇ−ＬＶ（特異的ガイドＲＮＡ）又はｅ−ＬＶ（Ｃａｓ９）のみのベクターで形質導入した培養物において、ＨＩＶ−１ｐ２４の抑制が観察された。単一のアスタリスク（＊）はｐ≦０．０５、三つのアスタリスク（＊＊＊）はｐ≦０．０００５を示し、黒いバーはＨＩＶ−１_ＢａＬに感染したが組換えレンチウィルスベクターは形質導入しなかった培養の結果を示す。灰色の棒は、ＨＩＶ−１_ＢａＬに感染させ、続いてＨＩＶ−１特異的ｇＲＮＡ（ｇ−ＬＶ）を保有する組換えレンチウィルスベクターで形質導入した培養物からの結果を示す。白抜きの棒は、ＨＩＶ−１_ＢａＬに感染させ、続いてＨＩＶ−１特異的ｇＲＮＡを有さない空の組換えレンチウィルスベクター（ｅ−ＬＶ）で形質導入した培養物からの結果を示す。結果は３つの異なるドナーを用いた３つの別々の実験の平均であり、各条件は３回実施された。

図５Ａ〜５Ｂは、ｇ−ＬＶ又はｅ−ＬＶのいずれかによる形質導入によるＨＩＶ−１感染からの健康なＰＢＭＣの防御についての証拠を提供する棒グラフである。ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣを、培養開始時（０日目）にｇ−ＬＶ（特異的ガイドＲＮＡ）又はｅ−ＬＶ（Ｃａｓ９のみ）ベクターのいずれかで形質導入し、次いで、ＬＶ形質導入後２日目にＨＩＶ−１_ＢａＬで感染させ（図５Ａ）、又は４日目にＨＩＶ−１で感染させた（図５Ｂ）。上清をＨＩＶ感染後日に回収し、ＨＩＶ−１ｐ２４レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。ＨＩＶ−１感染の抑制は、培養期間を通してｇ−ＬＶ又はｅ−ＬＶベクターのいずれかで観察された。三つのアスタリスクはｐ＜＝０．０００５を示す。示したデータは３つの異なるドナーを用いた３つの別々の実験の平均であり、各条件で３回実施した。

図６Ａ〜６Ｃは、ｇ−ＬＶによるＪ−Ｌａｔ１０．６細胞の形質導入後にＨＩＶ−１プロウィルス発現が遮断されることを示すフローサイトメトリー結果を示す。Ｊ−Ｌａｔ細胞を、ＴＮＦ−α活性化の前後にフローサイトメトリーによって、組み込まれた導入遺伝子又は組み込まれたプロウィルス配列のいずれかからのＧＦＰ発現について分析した。図６Ａ〜６Ｃは親細胞（パネルＡ）、又はｅ−ＬＶ（パネルＢ）又はｇ−ＬＶ（パネルＣ）のいずれかで選択された個々の形質導入されたクローンのフローサイトメトリー図を示し、ＨＩＶ−１ｐ２４レベル（ナノグラム／ミリリットル）もＥＬＩＳＡによって評価し、各ヒストグラムの凡例に記載した。「Ｎ．Ｄ．」は、「検出されない」ことを示す。

［イントロダクション及び概要］
ヒト対象におけるプロウィルスＨＩＶ−１の活性を予防又は阻害するためのベクター、キット、及び方法を提供する。本発明によれば、ＨＩＶ−１ ＤＮＡ標的配列の活性又は機能は、標的配列が転写及び／又は翻訳され得ない場合に阻害される。この点において、ＨＩＶ−１ ＤＮＡ標的は、変異導入されていても切り詰められていても良い。ベクターは、ＨＩＶ−１ゲノムの一部に特異的に組み込まれたＤＮＡの切断を指示する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の成分の送達に適合したレンチウィルスベクターを包含する。キットは、ベクター及び付属物を含む。本発明による方法は、ヒト対象の細胞にベクターを導入するためのｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏ技術を包含する。レンチウィルスベクターの使用は、有利には、***している細胞、並びに休止している（すなわち、***していない）細胞の形質導入を可能にする。この説明を読めば、様々な代替実施形態及び代替用途において、本発明をどのように実施するかが当業者には明らかになるであろう。本発明の様々な実施形態を本明細書で説明するが、これらの実施形態は単に例として提示したものであり、限定するものではないことを理解されたい。したがって、様々な代替の実施形態のこの詳細な説明は、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲又は幅を限定するものと解釈されるべきではない。

本明細書中に開示される特定の実施形態は、レンチウィルスベクターを使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の非常に有効な送達を提供する。例えば、本明細書中に開示される１つの方法は、レンチウィルスに基づくＨＩＶ−１のＬＴＲ内の配列を標的とするガイドＲＮＡの送達を可能にし、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質の存在下で、ＨＩＶ−１プロウィルスの少なくとも一部の切除を容易にする。ＷＯ２０１４／１６５３４９Ａ１により同定される公開ＰＣＴ出願（その開示は参照により組み込まれる）は、ヒト細胞のゲノムからＨＩＶ−１プロウィルスＤＮＡを切除するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用を記載する。しかしながら、この文献は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ及びＨＩＶ特異的ガイドＲＮＡをコードする核酸配列を、ヒトの細胞に送達するためのベクターとしてレンチウィルスを使用することを開示していない。

本開示は、ＨＩＶ感染の標的である白血球に、「導入遺伝子」と呼ばれる特定の遺伝子配列を送達するためのレンチウィルスベクターの開発を提供する。導入遺伝子は、細菌ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に基づく２つの遺伝子を含む。第１の遺伝子は、組み込まれたＨＩＶ遺伝子に結合するように設計されたガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）（すなわち、ｇＲＮＡ）をコードする。第２の遺伝子は、ｇＲＮＡによって指示される領域で二本鎖ＤＮＡを切断する酵素をコードするＣａｓ９遺伝子である。ガイドＲＮＡとＣａｓ９酵素は一緒に機能して、標的とされる遺伝子内のＤＮＡを切断する（すなわち、破壊する）。レンチウィルスベクターはまた、標的タンパク質（例えば、抗体又は他の型のエンベロープ遺伝子）を用いて改変されて、ベクターを選択された細胞に指向し得る。このような技術は、当業者に周知である。

本明細書に開示されるアプローチは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム工学的手法を用いてＨＩＶ感染リンパ球からのウィルス産生を抑制するための、レンチウィルス送達システムを使用する。以下に開示されるように、５’及び３’の長い末端反復（ＬＴＲ）領域の両方に存在する、ＨＩＶ−１プロウィルスのＵ３ＤＮＡ配列中の領域を標的とするガイドＲＮＡを、関連するＣａｓ９酵素と共に、ＶＳＶ−ｇ偽型レンチウィルスベクター（ＬＶ）によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に送達した。ＰＢＭＣの培養物は最初にＨＩＶ−１で感染させるか、又はＨＩＶ−１で感染させる前にＬＶで形質導入した。いずれの実験プロトコールにおいても、Ｕ３特異的ガイドＲＮＡによる形質導入は、細胞がＨＩＶ−１を産生することを妨げた。興味深いことに、Ｃａｓ９遺伝子のみを発現するＬＶは、同様の結果を有し、遺伝子切断以外の１つ以上のさらなる機構が、ＨＩＶ−１感染を阻害又は予防し得ることを示唆した。ＬＶ形質導入細胞によって分泌される炎症分子の分析は、ＬＶ形質導入によって誘導される特定の可溶性サイトカイン及び他の炎症分子が、抗ＨＩＶ効果に寄与し得ることを示唆した。我々の知見は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム工学が、ＡＲＴを中止しようとするＨＩＶ患者における使用のための有効な治療アプローチであり得ることを示す。この場合、潜伏性ＨＩＶ感染細胞のＬＶ形質導入はプロウィルスを切断し、新しいビリオンの転写を防止し、一方、非感染細胞のＬＶ形質導入は、これらの細胞をＨＩＶ−１による感染に対して抵抗性にするだろう。

開示された手順は、ＨＩＶ感染ＰＢＭＣからのウィルス産生を効果的に抑制し、また、非感染ＰＢＭＣがＨＩＶ−１に感染するのを防いだ。ＨＩＶ感染細胞において、ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９は組み込まれたプロウィルスを切断し、新しいビリオン産生に必要な構造遺伝子又は調節遺伝子の転写を効果的に妨げる。非感染ＰＢＭＣにおいて、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９遺伝子は、それらが構成的に発現される宿主ゲノムに安定に組み込まれ、ＨＩＶ−１ ｃＤＮＡ組込みを妨げ、及び／又は組込み後のプロウィルスを切断する。我々の実験的アプローチでは、ＰＢＭＣをＨＩＶ−１に感染させ、２日後にＬＶで形質導入するか、又は最初にＬＶで形質導入し、次いで２日後にＨＩＶ−１でチャレンジした。

結果はまた、ｇ−ＬＶで形質導入されたＪ−Ｌａｔ細胞のクローン化集団が、ＴＮＦαによって再活性化され得ず、組み込まれたプロウィルス配列からＧＦＰ又はｐ２４のいずれかを産生し得ないことを示した。これらのクローンにおいて、プロウィルス領域を増幅するためにＰＣＲを用いたその後の分析では、プロウィルス領域の完全な切除を示した。これは、Ｕ３領域（Ｕ３Ｂと呼ばれる）へのガイドＲＮＡが、５’及び３’ＬＴＲの両方に存在する核酸配列を標的とするために起こったものである。対照的に、ｅ−ＬＶで形質導入されたＪ−Ｌａｔ細胞のクローン（すなわち、ｇＲＮＡをコードしなかった）はＴＮＦαで活性化される能力を保持し、ＧＦＰ及びｐ２４の両方を産生した。ＴＮＦαによる転写活性化は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断後のプロウィルスのコンピテンシーの迅速なスクリーニングとして役立ち得ることから、Ｊ−Ｌａｔ細胞を使用して、プロウィルス領域の切除を実証した。

ｇ−ＬＶ又はｅ−ＬＶのいずれかで形質導入されたＨＩＶ感染ＰＢＭＣからのＨＩＶ−１産生の抑制もまた、本明細書に開示される。ｅ−ＬＶはプロウィルス特異的ｇＲＮＡ配列を含まないため、この発見は予想外であった。この知見は、ｅ−ＬＶによって誘導される先天性抗ウィルス応答の誘導に起因する可能性がある。ＬＶ形質導入後の抗ウィルス応答の誘導は、いくつかの理由による可能性が高い。ＬＶはＴＬＲ７を含む多くの先天性免疫受容体に結合し、活性化することができる一本鎖ＲＮＡゲノムを発現する。活性化されると、これらの受容体は、培養物中の隣接細胞を病原体から保護することができる分子の分泌をもたらす。これは、ＰＢＭＣのサブセットのみがＬＶで形質導入された（ＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析によって決定される１５〜６０％）にもかかわらず、集団中の細胞の大多数が１２日の実験期間を通して感染から保護されたという知見を説明し得る。

集約すると、本明細書に提示した結果は、ＨＩＶ−１プロウィルスを切断するためのｇＲＮＡ及びＣａｓ９遺伝子のＬＶ送達が、ＨＩＶ−１感染から未感染ＰＢＭＣを保護し、感染細胞からのＨＩＶ−１産生もブロックすることを確認した。ＬＴＲのＵ３領域（Ｕ３Ｂと呼ぶ）に設計されたｇＲＮＡ配列は、感染細胞からプロウィルス配列全体を切り出した。プロウィルス配列に対するガイドＲＮＡの直接的な効果に加えて、本発明者らはまた、Ｃａｓ９遺伝子（すなわち、ｇＲＮＡを含まない）のみのＬＶ送達もまた、ＨＩＶ−１からの非感染ＰＢＭＣを保護し、そして感染細胞からのＨＩＶ−１産生をブロックすることを開示する。分泌された炎症分子の分析から、導入遺伝子がＨＩＶ−１感染から細胞を保護する能力を有する免疫調節応答を誘導したことが示唆される。

［ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの一般的特徴］
ＣＲＩＳＰＲシステムの３つのクラス（タイプＩ、ＩＩ及びＩＩＩ）は、当業者によく知られている。本発明の特定の実施形態において、単一のエフェクター酵素Ｃａｓ９でｄｓＤＮＡを切断するために、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムが用いられる。対照的に、タイプＩ及びタイプＩＩＩシステムは、複合体として作用する複数の異なるエフェクターを必要とする（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔ．。Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９：４６７（２０１１））。原核生物では、タイプＩＩエフェクターシステムは、スペーサー含有ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写された長いｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ、多機能Ｃａｓ９タンパク質、及びｇＲＮＡプロセシングのためのｔｒａｃｒＲＮＡから構成される。ｔｒａｃｒＲＮＡはｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのスペーサーを分離する反復領域にハイブリダイズし、内因性ＲＮａｓｅ ＩＩＩによるｄｓＲＮＡ切断を開始し、続いてＣａｓ９による各スペーサー内での第２の切断事象が起こり、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣａｓ９と会合したままである成熟ｃｒＲＮＡを産生する。しかし、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と呼ばれるｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合物は、真核細胞中及びｉｎ ｖｉｔｒｏで機能しうるため、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ及びｃｒＲＮＡプロセシング全般の必要性を排除されることが示された（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６（２０１２））。従って、本発明の特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ分子が、ＨＩＶ−１ ＤＮＡ配列を標的化するために使用される。本発明のガイドＲＮＡ分子は、８０〜１３０ヌクレオチド、９０〜１２０ヌクレオチド又は１００〜１１０ヌクレオチドの長さの範囲のサイズであり得、ＲＮＡから構成される。特定の実施形態ではガイドＲＮＡが配列R−GU UUU AGA GCU AAU AAGC AAG UUA AAA UAA GGC UCC GUU AUC AAC UUG AAA AAG UGG CAC CGA GU GCT TTT TT（配列番号１）を有し、ここで、ＲはＨＩＶ−１ ＤＮＡ標的配列に特異的にハイブリダイズするスペーサー配列である。

原核生物では、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ干渉は、Ｃａｓ９がＤＮＡ二重鎖を巻き戻し、切断すべきｃｒＲＮＡにマッチする配列を検索して生じる。標的認識は、標的ＤＮＡ中の「プロトスペーサー」配列とｃｒＲＮＡ中の残りのスペーサー配列との間の相補性の検出時に起こる。Ｃａｓ９は、正しいＰｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ−ａｄｊａｃｅｎｔモチーフ（ＰＡＭ）が３’末端にも存在する場合にのみＤＮＡを切断する。異なるタイプＩＩのシステムは、異なるＰＡＭ要件を有する。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ系はＮＧＧ配列を必要とし、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る（Ｍａｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３−６（２０１３））。Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｔｙｐｅ ＩＩシステムはＮＧＧＮＧ（Ｈｏｒｖａｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７（２０１０））及びＮＡＧＡＡＷ（Ｄｅｖｅａｕら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１９０：１３９０（２００８））を必要とするが、別のＳ．ｍｕｔａｎｓシステムはＮＧＧ又はＮＡＡＲを許容する（ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５５：１９６６（２００９））。

本発明の特定の実施形態では、ｇＲＮＡはＨＩＶ−１ ＤＮＡのＬＴＲ部分を標的とする。ＬＴＲは新しいビリオンを組み立てるのに必須である遺伝子の転写を促進及び調節し、並びに感染性粒子にパッケージングされるＨＩＶ−１ゲノム全体を転写するように機能する。組み込まれたプロウィルスにはＬＴＲの２つのコピーがあり、それによって本標的のサイズを２倍にする。上記で同定されたＬＴＲ標的配列は必要とされるＰＡＭ配列を有し、そしてＨＩＶ−１に独特であり、ヒトゲノムにおいて交差反応相同性を有しない。ヒトゲノムはＬＴＲ様配列を有する多くの他のレトロウィルスを含むので、これは特に重要である。したがって、非感染細胞において、非常に低い細胞毒性が予想されるか、又は細胞毒性が予想されない。

タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＨＮＨ型システム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ様；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセロタイプＡ株Ｚ２４９１又はＣＡＳＳ４に対するＮｍｅｎｉサブタイプとしても知られる）を含み、Ｃａｓ９はｃｒＲＮＡを生成し、標的ＤＮＡを十分に切断する。Ｃａｓ９は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメイン、アミノ末端付近のＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン、及びタンパク質の中央のＨＮＨ（又はＭｃｒＡ様）ヌクレアーゼドメインを含む。ＨＮＨヌクレアーゼドメインが制限酵素に多く見られ、エンドヌクレアーゼ活性を有することを考えれば（Ｋｌｅａｎｔｈｏｕｓ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ６：２４３−５２（１９９９）； Ｊａｋｕｂａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３７０：１５７−１６９（２００７））、このドメインが標的切断に関与することが示唆される。さらに、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムについて、プラスミド及びファージＤＮＡの標的化がインビボで実証されており（Ｇａｒｎｅａｕら、Ｎａｔｕｒｅ ４６８：６７−７１（２０１０））、Ｃａｓ９の不活性化で干渉が失われることが示されている（Ｂａｒｒａｎｇｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５：１７０９−１２（２００７））。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＩＶ−１標的配列の切断に使用されるＣａｓタンパク質は、タイプＩＩ Ｃａｓタンパク質である。他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ又はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓから単離されたタイプＩＩ Ｃａｓタンパク質である。他の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＹＰ＿８２０８３２参照）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＰ＿４７２０７３参照）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＹＰ＿００２３４２１００参照）又はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＫ３３９３６及びＮＰ＿２６９２１５参照）から単離されたＣａｓ９タンパク質である。これらの種改変体に加えて、Ｃａｓ９タンパク質は特異性又は効力を改善する操作された変異を保有し得る（Ｓｌａｙｍａｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１：８４−８８（２０１６））。特定の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を有するプラスミドは、例えばＡｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）などのレポジトリソースから入手可能である。このようなプラスミドの例には、ｐＭＪ８０６（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９）、ｐＭＪ８２３（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ Ｃａｓ９）、ｐＭＪ８２４（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９）、ｐＭＪ８３９（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９）、及びｐＭＪ９２０（ヒトコドン最適化Ｃａｓ９）が含まれる。

核への進入を容易にするために、本発明のＣａｓタンパク質は、核局在化配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＮＬＳ）を含み得る。用語「核局在化配列」は、このような配列を有するか、又はこのような配列に連結された分子の、真核細胞の核への移動を誘導するアミノ酸配列を意味する。この文脈において、「有する」という語は好ましくは核局在化配列が分子の一部を形成すること、すなわち、共有結合（例えば、インフレームタンパク質融合）によって分子の残りの部分に連結されることを意味する。この文脈において「連結された」という用語は、核局在化配列と、例えば共有結合、水素結合又はイオン相互作用によって、真核細胞の核に導入されるべき別の分子との間の任意の可能な連結を意味する。この文脈における「核内への移動」という言葉は、分子が核内へ移動することを意味する。

核移行は、直接的及び間接的手段によって検出することができる。例えば、核局在化配列又は転位した分子（例えば、Ｃａｓタンパク質又はガイドＲＮＡ）を蛍光色素で標識する場合（標識キットは例えば、Ｐｉｅｒｃｅ又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから市販されている）、蛍光又は共焦点レーザー走査顕微鏡によって直接観察することができる。転位はまた、核局在化配列又は転位した分子（例えば、Ｃａｓタンパク質又はガイドＲＮＡ）が、コロイド金などの電子密度の高い材料で標識される場合、電子顕微鏡によって評価され得る（Ｏｌｉｖｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ＭｏｌＢｉｏｌ．１１５：３４１−３４５（１９９９））。転位は、標的ＨＩＶ−１ ＤＮＡ配列の切断を測定するなどの間接的な方法で評価することができる。

多くの核局在化配列が当該分野で記載されており、そして本発明に関連して使用され得る。当業者は、多数の例示的な核局在化配列がＨｏｗｅｌｌらによって、ＷＯ２０１４／１６５３４９（その開示は参考として援用される）に記載されていることを理解するであろう。

［有用なレンチウィルスベクター］
本発明のレンチウィルスベクターは、以前に使用された可能性のある異なるベクターに優るいくつかの利点を有する。例えば、ＭｏＭｕＬＶ（ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）に基づく組換えレトロウィルスベクターは、ウィルスが自身のゲノムを、核膜を通して移動させる機構を有さないので、***している細胞にしか感染できない。従って、ウィルスゲノムは核膜が有糸***の間に自然に分解される場合にのみ、宿主細胞ゲノムへのアクセスできる。ＨＩＶ−１に基づく、本明細書中に記載される手順において使用される組換えレンチウィルスは、宿主細胞の核膜を通してそのゲノムを輸送し得る。組換えレンチウィルスベクターは、ＬＴＲ及びＰｓｉ遺伝子の配列がレトロウィルスベクターとは異なる。さらに、レンチウィルスのパッケージングはレトロウィルスとは異なり、パッケージングプラスミド中のＧａｇ及びＰｏｌ遺伝子の配列が２つの系において異なる。しかし、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９の発現を駆動する内部エレメントは、レンチウィルス系とレトロウィルス系との間で同一であり得る。これは、２つのシステム間の交換を可能にし、ステップが***細胞のみに特異的に感染することを要するか否かに応じて、同等のレンチウィルス又はレトロウィルスを作製する。いくつかの例において、レトロウィルス系は、***している細胞をターゲットとすることが癌に対して特異性もたらすという点で、癌の治療剤として好ましい。レンチウィルスのベースベクターはＦＵＧＷ（非営利のプラスミドレポジトリーＡＤＤＧＥＮＥからプラスミド＃１４８８３として入手可能；Ｈｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２ ２月１日，２９５（５５５６）： ８６８−７２）が当業者に良く知られている。本発明を開発する過程で行われた修飾には、ユビキチンプロモーターによって駆動されるＧＦＰ−Ｔ２Ａ−Ｃａｓ９の挿入（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６，２５６１１；ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓｒｅｐ２５６１１（２０１６）を参照のこと；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、及びＵ６プロモーターによって駆動されるＨＩＶ−１特異的ガイドＲＮＡの使用が含まれる。

上記のＦＵＧＷ塩基レンチウィルスベクターに加えて、本発明における使用において、本明細書で意図される他の適切なレンチウィルスベクターは、任意の適切なレンチウィルスに由来し得るか、又は任意の適切なレンチウィルスに由来することができる（米国特許第９，３３９，５１２号（これはその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。組換えレンチウィルス粒子は、本明細書中に記載されるガイドＲＮＡ及びＣＡＳ９遺伝子などのような、目的のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＯＩ）で標的細胞を形質導入し得る。いったん細胞内に入ると、ベクター粒子からのＲＮＡゲノムはＤＮＡに逆転写され、標的細胞のゲノムに組み込まれる。

レンチウィルスベクターは、レトロウィルスベクターのより大きな群の一部である。レンチウィルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎら（１９９７）「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ： ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８−７６３）に見出され得る。簡単に言えば、レンチウィルスは、霊長類と非霊長類の群に分けられる。霊長類レンチウィルスの例としては、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、ヒト自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）原因因子、及びサル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。非霊長類レンチウィルス群には、プロトタイプ「スローウィルス」ビスナ／マエディウィルス（ＶＭＶ）、並びに関連するヤギ関節炎脳炎ウィルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウィルス（ＥＩＡＶ）、及びより最近記載されたネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）及びウシ免疫不全ウィルス（ＢＩＶ）が含まれる。

レンチウィルスは、レンチウィルスが***細胞及び非***細胞の両方に感染する能力を有するという点で、レトロウィルスファミリーの他のメンバーとは異なる（Ｌｅｗｉｓら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ １１（８）：３０５３−３０５８）及びＬｅｗｉｓ及びＥｍｅｒｍａｎ（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（１）： ５１０−５１６）． 対照的に、ＭＬＶのような他のレトロウィルスは、例えば、筋肉、脳、肺及び肝臓組織を構成するような非***又はゆっくり***する細胞に感染することができない。

本明細書中で使用されるレンチウィルスベクターは、レンチウィルスに由来する少なくとも１つの構成部分を含むベクターである。好ましくは、その構成部分は、ベクターが細胞に感染し、遺伝子を発現し、又は複製されるための生物学的機構に関与する。

レトロウィルス及びレンチウィルスゲノムの基本構造は、多くの共通の特徴（例えば、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ）を共有する。それらの間又はその内部には、ゲノムがパッケージングされることを可能にするパッケージングシグナル、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノムへの組み込みを可能にする組み込み部位、並びにパッケージング成分（これらはウィルス粒子のアセンブリに必要なポリペプチドである）をコードするｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子が位置する。レンチウィルスはＨＩＶにおけるｒｅｖ及びＲＲＥ配列のようなさらなる特徴を有し、これは、感染した標的細胞の核から細胞質への組み込まれたプロウィルスのＲＮＡ転写物を、効率的にエクスポートすることを可能にする。

プロウィルスでは、ウィルス遺伝子の両端に長い末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれる領域が隣接している。ＬＴＲは、プロウィルスの組み込み及び転写に関与する。ＬＴＲはまた、エンハンサー−プロモーター配列としても役立ち、ウィルス遺伝子の発現を制御することができる。

ＬＴＲ自体は、Ｕ３、Ｒ及びＵ５と呼ばれる３つの要素に分割することができる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に固有の配列に由来する。ＲはＲＮＡの両末端で繰り返される配列に由来し、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に固有の配列に由来する。３つのエレメントのサイズは、異なるウィルスの間でかなり変化し得る。

欠損レンチウィルスベクターゲノムにおいて、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖは、欠損していても機能していなくてもよい。ＲＮＡの両末端のＲ領域は反復配列である。Ｕ５及びＵ３は、それぞれＲＮＡゲノムの５’及び３’末端における特有の配列を表す。

本発明の典型的なレンチウィルスベクターでは、複製に必須な１つ以上のタンパク質コード領域の少なくとも一部をウィルスから除去することができる。これは、ウィルスベクターの複製を欠損させる。標的非***宿主細胞に形質導入、及び／又はそのゲノムを宿主ゲノムに組み込むことができるＮＯＩ（本明細書中に記載され、本明細書中に記載されるｇ−ＬＶに記載されるガイドＲＮＳ及びＣＡＳ９遺伝子など）を含むベクターを生成するために、ウィルスゲノムの一部をＮＯＩで置き換えることもできる。

一実施形態では、レンチウィルスベクターは、国際公開第２００７／０７１９９４号に記載されているような非組込みベクターである。さらなる態様において、ベクターは、全欠損しているか、部分的に欠損したウィルスＲＮＡ配列を送達する能力を有する。さらなる実施形態において、送達されるＲＮＡ上に位置するヘテロ結合ドメイン（ｇａｇに対してヘテロ）及びｇａｇ又はｐｏｌ上のホモ結合ドメインは、送達されるＲＮＡのパッケージングを確実にするために使用され得る。これらのベクターは両方とも、ＷＯ２００７／０７２０５６に記載されている。

レンチウィルスベクターは「非霊長類」ベクター、すなわち、霊長類、特にヒトに主に感染しないウィルスに由来するものであってもよい。非霊長類レンチウィルスの例は、霊長類に自然に感染しないレンチウィルス科のいずれのメンバーでもよく、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウィルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウィルス（ＣＡＥＶ）、マエディビスナウィルス（ＭＶＶ）又はウマ感染性貧血ウィルス（ＥＩＡＶ）を含み得る。

いくつかの任意の実施形態において、本発明のベクターは、組換えレンチウィルスベクターである。用語「組換えレンチウィルスベクター」は、パッケージング成分の存在下で、標的細胞に感染し得るウィルス粒子へのＲＮＡゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なレンチウィルス遺伝情報を有するベクターをいう。標的細胞の感染は、逆転写及び標的細胞ゲノムへの組込みを含み得る。組換えレンチウィルスベクターは、ベクターによって標的細胞に送達される非ウィルスコード配列を保有する。組換えレンチウィルスベクターは、最終標的細胞内で感染性レンチウィルス粒子を産生するための複製を独立して行うことができない。通常、組換えレンチウィルスベクターは、機能的なｇａｇ−ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ遺伝子及び／又は複製に必須の他の遺伝子を欠く。本発明のベクターは、スプリットイントロンベクターとして構成することができる。スプリットイントロンベクターは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／１５６８３に記載されている。

場合により、本発明の組換えレンチウィルスベクターは、最小のウィルスゲノムを有する。本明細書中で使用される場合、用語「最小ウィルスゲノム」はウィルスベクターが非必須要素を除去し、そして標的宿主細胞に目的のヌクレオチド配列を感染させ、形質導入し、そして送達するために必要とされる機能性を提供するために、必須要素を保持するように操作されていることを意味する。この戦略の更なる詳細は、我々のＷＯ９８／１７８１５に見出すことができる。

図１Ａ及び１Ｂはそれぞれ、ＤＮＡ標的（例えば、ｇＲＮＡ）、及びｇＲＮＡ及びヒト化Ｃａｓ９配列を形質導入するために有用な例示的なレンチウィルスベクターの構造を図示する。図１Ａは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に下線を引いたｇＲＮＡ（５’〜３’）を設計するために使用したＤＮＡ標的配列を示す。Ｕ３Ａ、Ｕ３Ｂ、及びＵ３Ｃと称されるＨＩＶ−１プロウィルスＬＴＲ Ｕ３領域へのガイドＲＮＡ配列を列挙する。さらに、Ｋａｔｎａｌ２遺伝子に対する標的配列を、分泌サイトカイン実験のための無関係なｇＲＮＡとして使用した。図１Ｂは、ＨＩＶ−１；欠失Ｕ３領域（ΔＵ３）、調節領域（Ｒ）及びＵ５領域、パッケージングシグナル（Ψ）、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、及び中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ、Ｆｌａｐエレメント）を有する５’ＬＴＲ（灰色のボックス）に由来する遺伝子領域を示す、組み込まれたｇ−ＬＶ導入遺伝子を概略的に示す。プロモーターを白い矢印で示す： Ｕ６はＵ６小核ＲＮＡ（small nuclear RNAs）の哺乳類プロモーターであり、Ｕｂｉｑはヒトユビキチンｃプロモーターである。転写産物は太線で囲まれたボックスとして示される；ｇＲＮＡがゲノム中のＤＮＡ配列を標的とするガイドＲＮＡであり、ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質をコードし、Ｔ２Ａは自己切断ペプチドであり、そしてｈＣａｓ９は、ヒト化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。ＷＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウィルス転写後調節エレメントである。３’ＬＴＲはまた、調節領域及びＵ５領域の上流でＵ３領域が欠失している（ΔＵ３）。

開示された手順に関連して、有用なレンチウィルスベクターは３つの異なる核酸構築物をパッケージング細胞系に同時トランスフェクトすることによって構築された（図２Ｃを参照のこと；より詳細にはこれらの構築物（図２Ａ及び２Ｂに描写される）がパッケージング細胞系（例えば、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞）にトランスフェクトされた。パッケージング細胞は、パッケージングプラスミド及びエンベローププラスミド中のタンパク質を転写及び翻訳し（図２Ａに示す）、細胞の培地に分泌されたレンチウィルスベクターを産生した。図２Ｂに示す構築物は、ガイドＲＮＡ及びヒト化Ｃａｓ９遺伝子を有するトランスジーンである。同時トランスフェクトされた細胞からの培地は、回収、濃縮、及び力価決定して、トランスジーン（図２Ｂに示される）を選んだ細胞に形質導入するために使用した。選択された細胞に対するレンチウィルスベクターのターゲティング特異性は、細胞表面レセプターに対する抗体又はリガンドに対する遺伝子を含めることによって、又はエンベロープ遺伝子を、結合の細胞特異性を提供する別のものに置き換えることによって増加され得る。これらの抗体、リガンド、又はエンベロープ遺伝子は、パッケージング、エンベロープ、及びトランスファープラスミドと同時にＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトされる。

次いで、このアプローチによって産生されたレンチウィルスは、標的細胞（例えば、ヒトマクロファージ及びＴ細胞）に添加され得る。レンチウィルス上のエンベロープタンパク質は標的細胞の表面上の特異的又は非特異的レセプターに結合し、そしてエンドソームを介して標的細胞に内在化される。そこで、導入遺伝子（ガイドＲＮＡとＣａｓ９遺伝子をもつ）が核に移行し、ゲノムに組み込まれる。一旦組み込まれると、ガイドＲＮＡ配列はＵ６プロモーターから転写され、Ｃａｓ９及び任意の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子はユビキチンプロモーターから転写され、次いで機能的タンパク質に翻訳される。Ｃａｓ９タンパク質は有利にはそれを核に向ける核局在化配列を有し、そこで、それは、ガイドＲＮＡと一緒に機能して、ヒトゲノム中の特定の領域に結合し、そして切断する。

［ガイドＲＮＡをコードする配列］
図３は、ＰＡＭ配列（ヌクレオチドの後部配列；ＰＡＭ配列に下線を引く）を有するＨＩＶ−１プロウィルスの標的ＤＮＡ配列のために設計されたガイドＲＮＡ（ヌクレオチドの前部配列）の例を示す。示されるように、これらの２つの配列は一致する。しかし、ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列の相補鎖に結合する（この図には示さず）。

［統計解析］
ＨＩＶ−１感染後のＰＢＭＣ ｐ２４産生からのデータの分析を、ＡＮＯＶＡによって行った。スチューデントのｔ検定でｐ≦０．０５が得られた場合、データは統計的に有意であるとみなされた。特定のｐ値は、各図の凡例に記載されている。データは、３つ又は４つの異なる血液細胞ドナーのいずれかからの実験の平均±標準誤差として表され、各実験条件は３回測定される。

［医薬組成物］
本発明のレンチウィルスベクターは、医薬組成物の形態で提供され得る。医薬組成物は遺伝子治療によって個体を処置するために使用され得、ここで、組成物は治療有効量の特定のレンチウィルスベクターを含む。

ウィルス調製物は、超遠心分離によって濃縮され得る。ＷＯ２００９／１５３５６３は、レンチウィルスベクターの下流プロセシングのための方法を記載する。得られる医薬組成物は、少なくとも１０^７ Ｔ．Ｕ．／ｍＬ、例えば１０^７〜１０^９ Ｔ．Ｕ．／ｍＬ、又は少なくとも１０^９ Ｔ．Ｕ．／ｍＬを有することができる。（力価は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株の標準Ｄ１７で力価が測定された形質導入単位／ｍＬ（Ｔ．Ｕ．／ｍＬ）で表される。

医薬組成物は、ヒト又は動物、例えば霊長類動物対象又はコンパニオンアニマル対象を治療するために使用することができる。
組成物は場合により、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントを含んでもよい。医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図される投与経路及び標準的な医薬実施に関して選択することができる。医薬組成物は担体、賦形剤又は希釈剤として（又はこれらに加えて）、任意の適切なバインダー、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤、及び標的部位へのウィルス侵入を補助又は増加し得る他の担体（例えば、脂質送達系など）を含み得る。

［治療及び／又は予防の方法］
「ｇ−ＬＶ」などの本発明のレンチウィルスベクターはＨＩＶ感染個体を処置し、ＡＩＤＳの発症を遅延させ、そしてＡＩＤＳ患者をインビボ及びエクスビボの両方で処置するために使用され得る。別の実施形態において、本発明のレンチウィルスベクターは、健康な個体に投与することによって、ＨＩＶ感染を予防するために使用され得る。

一実施形態では、ＨＩＶ感染を治療又は予防するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法が提供される。被験体に、ｇ−ＬＶなどのような本発明のレンチウィルスベクターを投与する。レンチウィルスベクターは、薬学的に適切な塩及び溶媒和物と共にパッケージされ得、ＨＩＶウィルスに感染した個体又はＡＩＤＳ患者に投与され得る。

本発明のレンチウィルスベクターは、単位投薬形態で好都合に投与され得、そして医薬分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子治療レンチウィルス剤が滅菌水又は生理食塩水、ポリアルキレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレンなどのような、ＨＩＶ感染を治療するための少なくとも１つの他の一般的な賦形剤をさらに含む。

本発明のレンチウィルスベクターは薬学的に受容可能な非毒性賦形剤又はキャリア（例えば、塩及び溶媒和物）との混合によって、薬学的組成物に処方され得る。このような化合物及び組成物は、非経口投与のための静脈内形態、皮下形態、又は筋肉内形態、特に生理緩衝水溶液中の液体溶液又は懸濁液の形態；経口投与のための特に錠剤又はカプセルの形態；又は鼻腔内投与のための吸入形態、特に粉末、点鼻薬、又はエアロゾルの形態；又は適用のための液体溶液又は懸濁液の粘膜形態で調製され得る。持続放出組成物も本発明に包含される。他の投与経路のための組成物は、標準的な方法を使用して所望により調製され得る。

他の実施形態において、本発明はまた、少なくとも１つの包装材及び包装材内に含まれる、ｇ−ＬＶなどのような本発明のレンチウィルスベクターを含む、製品に関する。包装材は、本発明のレンチウィルスベクターがＨＩＶ感染及びＡＩＤＳを処置するために使用され得ることを示すラベル又は添付文書を含み得る。

本明細書に記載されるように、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏ方法の両方が本明細書において意図され、この方法はＨＩＶ感染個体を処置し、ＡＩＤＳの発症を遅延させ、そしてＡＩＤＳ患者を処置するために特に有用である。一実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ法がＨＩＶ感染個体を治療し、ＡＩＤＳの発症を遅延させ、ＡＩＤＳ患者を治療するのに特に有用であり、骨髄幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ形質転換を利用する。この特定の実施形態では、患者から骨髄を採取するための標準的な臨床手順が使用される。この特定のｅｘ ｖｉｖｏ手順の利点は、Ｔ細胞及びマクロファージを含む全てのタイプの血液細胞に複製及び分化する造血幹細胞を主に標的とすることである。

一実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ手順が任意選択で、ＨＩＶ感染個体から骨髄を採取することを含む。骨髄由来の造血幹細胞は、当該分野で公知の方法を用いて単離及び培養され、そして医薬組成物中の治療有効量の本発明のレンチウィルスベクターで形質転換される。次いで、形質転換された造血幹細胞は本明細書中に記載されるように、ＨＩＶプロウィルス配列の破壊、根絶及び／又は排除を確認するために検証する。スクリーニング及び選択後、トランスフェクトされた造血幹細胞を、ＨＩＶ感染個体に移植して戻す。

ｇ−ＬＶなどのようなレンチウィルスベクター組成物と共に使用するためのｅｘ ｖｉｖｏ手順の別の実施形態において、ＰＢＭＣ、Ｔ細胞及び／又はマクロファージはＨＩＶ感染個体又はＡＩＤＳ患者から単離され、次いで、単離された細胞は本発明のレンチウィルスベクター組成物で形質転換される。この特定のｅｘ ｖｉｖｏ手順はＨＩＶ感染個体から血液を採取することを必要とし、次いで、ＰＢＭＣ細胞、Ｔ細胞及び／又はマクロファージは、血液から単離され、培養され、そして治療有効量の本明細書に記載の本発明のレンチウィルスベクターで形質転換される。次いで、形質転換されたＰＢＭＣ、Ｔ細胞及び／又はマクロファージを検証して、本明細書中に記載されるようなＨＩＶプロウィルス配列の破壊、根絶及び／又は排除を確認する。スクリーニング及び選択後、形質転換されたＰＢＭＣ、Ｔ細胞及び／又はマクロファージは、ＨＩＶ感染個体に輸血して戻される。

本発明は、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９遺伝子を含むレンチウィルスベクターによるＨＩＶ感染患者の処置を包含する。ｇＲＮＡはＨＩＶプロウィルスに特異的であるべきである。この点において、本発明は、ＨＩＶ特異的導入遺伝子を有するレンチウィルスベクターで非感染細胞又はＨＩＶ感染細胞のいずれかを形質導入することを包含する。実施例８は、既にＨＩＶ−１に感染した細胞のウィルス形質導入を扱う。実施例９は、ＨＩＶ−１による感染に先行するウィルス形質導入を扱う。この治療的介入は、ＨＩＶを有する患者、又は抗レトロウィルス療法の前、間、又は後にＨＩＶに罹患する危険性が高い患者に投与される。一つの態様において、治療的介入は、それらが「エリートコントローラー」であるか、又はそれらが抗レトロウィルス療法を受けているか、若しくは受けているかのいずれかの理由でそれらのウィルス血症が抑制されている間に、投与される。一実施形態では、この治療介入が、高リスク個体においてＨＩＶを予防するための予防的治療「ワクチン」として投与され得る。患者は、それらの循環免疫細胞が大部分非感染である場合に処置される。レンチウィルスベクターによる１回以上の注入の後、抗レトロウィルス療法は中止され得る。本明細書中に開示されるアプローチによって、ＨＩＶプロウィルス特異的ガイドＲＮＡで形質導入された細胞は、その後のウィルスの復活によるＨＩＶ感染から保護される。

［末梢血細胞を単離及び活性化する方法］
正常ヒトドナーの全血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。全血を、等量の生理食塩水で希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のクッション上に重層し、そして４００×ｇで３０分間遠心分離した。ＰＢＭＣインターフェースを回収し、３回洗浄し、２ｍＭグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１０％ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）（ｃＲＰＭＩ）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏｗ， Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中で２×１０^６細胞／ｍｌに希釈した。ＰＢＭＣ画分中のリンパ球を、２μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニンＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）の添加によって４８時間活性化した。次いで、細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄し、ｃＲＰＭＩで１×１０^６細胞／ｍｌに調整した。

各ドナーを、ＣＣＲ５におけるデルタ３２変異（Δ３２）が存在しないことについて予めスクリーニングした。簡潔には、ゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＡＬ緩衝液中での溶解によって１〜２×１０^６のＰＢＭＣから単離し、プロテアーゼで処理し、そしてＱＩＡｍｐカラム上で、製造者の指示に従って精製した。約２００ナノグラムの精製ＤＮＡを、フォワードプライマー： ５’−ＧＡＴＡＧＧＴＡＣＣＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号：２）及びリバースプライマー： ５’−ＡＣＣＡＧＣＣＣＡＡＧＡＴＧＡＣＴＡＴＣＴ−３’（配列番号：３）を利用したＰＣＲに供した。ホモ接合野生型ＣＣＲ５は２３９塩基対（ｂｐ）産物を与えたが、Δ３２変異は２０７ｂｐ産物を生じた。この突然変異についてヘテロ接合性のドナーは、２３９ｂｐ産物及び２０７ｂｐ産物の両方を発現した。野生型ＣＣＲ５についてホモ接合性のドナーのみをこの研究に使用した。

［ガイドＲＮＡ配列の同定方法］
ＨＩＶ−１プロウィルスにおける候補ｇＲＮＡ標的配列を、Ｇｅｎｅ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔソフトウェア（Ｔｅｘｔｃｏ Ｂｉｏｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ， ＮＨ）を用いて同定し、そしてＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＢＬＡＳＴプログラムを用いてヒトゲノムＤＮＡに対する意図しない相同性について試験した。これらの配列を、Ｇｉｂｓｏｎ法（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓからキットとして入手可能）によって、ヒトＵ６プロモーター（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４１８２４）の転写制御下で、ガイドＲＮＡスキャフォールドを含むＡｄｄｇｅｎｅベクターにクローニングした。抗生物質耐性形質転換体をＤＮＡ配列決定により確認した。ガイドＲＮＡを、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ ＃０６ ３６６）をトランスフェクション剤として用いてＪ−Ｌａｔ １０．６細胞に一過性トランスフェクションすることで、ヒト化Ｃａｓ９遺伝子を有するプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ４１８１５）と同時トランスフェクトした場合の切断の有効性について試験した。１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）活性化後のＪ−ＬａｔプロウィルスＧＦＰ発現の誘導の喪失は、プロウィルスに対するガイド配列の特異性を示した。これらの研究で使用したガイドＲＮＡは、５’及び３’ＬＴＲ領域の両方に存在するＵ３の領域（「Ｕ３Ｂ」と呼ばれる）を標的とした。さらに、Ｕ３における２つの他の領域へのガイドＲＮＡを同定した（「Ｕ３Ａ」及び「Ｕ３Ｃ」）。これらのガイドＲＮＡの標的配列を図１Ａに示す。図３は、例示的なｇＲＮＡ（ヌクレオチドのトップ配列）が標的遺伝子領域にどのように相補的に結合するかを示す。

［ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９をレンチウィルスベクターにクローニングする方法］
トランスファーベクターへのクローニングのために選択された特異的ｇＲＮＡ配列を、ＴＮＦα活性化後のＪ−Ｌａｔ１０．６インジケーター細胞に組み込まれたプロウィルスからのＧＦＰ誘導をブロックする活性に基づいて選択した。このスクリーニングに基づいて、３つのｇＲＮＡ（Ｕ３Ａ、Ｕ３Ｂ及びＵ３Ｃと呼ばれる）をＦＵＧＷ由来の自己不活化レンチウィルス導入ベクターにクローニングした。ＦＵＧＷベクターはＨＩＶ−１に基づき、ＨＩＶ−１ Ｆｌａｐエレメント、ヒトユビキチン−ｃプロモーター、ＧＦＰ、及びウッドチャック肝炎ウィルス転写後調節エレメント（ＷＲＥ）を含む。ヒト化Ｃａｓ９（ＡｄｄＧｅｎｅ ｐＸ３３０由来）を、自己切断ペプチドＴ２Ａを介してＧＦＰに連結し、ユビキチン−ｃプロモーターの転写制御下にあるように、このトランスファーベクターにクローニングした。このトランスファーベクターをさらに改変して、Ｆｌａｐエレメントに隣接するＰａｃＩ及びＢｓｔＢ１制限エンドヌクレアーゼ切断部位を導入し、それによって、Ｕ６プロモーター及び標的配列並びにｇＲＮＡスキャフォールドを包含するＰＣＲ産物のクローニングを可能にした（図１Ｂ）。我々の対照ＬＶは、ＧＦＰ−Ｃａｓ９遺伝子（「空ＬＶ」又は「ｅ−ＬＶ」と呼ばれる）のみを発現するように設計された。

［レンチウィルスの製造方法］
レンチウィルスパッケージングは、当業者によく知られている方法により、３つのプラスミド（ｐＣＭＶｄｅｌｔａ８．９、ｐＶＳＶ−ｇ、及びＦＵＧＷベースのトランスファーベクター）を用いたＨＥＫ２９３ ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）のリン酸カルシウムによるトランスフェクションを行った。簡潔には、細胞を、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ、高グルコース）（ＧＩＢＣＯ １２４４０−０５３）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭ Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、及び５００μｇ／ｍｌジェネティシン中で維持した。細胞増殖を最適化するために、これらの細胞をトリプシン処理し、トランスフェクションの前日に１０ｃｍプレートあたり２．５〜３．０×１０^６の細胞で再プレーティングし、そして１０ｃｍプレートあたり約１０μｇのトランスファーベクター、６．５μｇのｐＣＭＶｄｅｌｔａ８．９及び４．５μｇのｐＶＳＶ−ｇでジェネティシンの非存在下でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、培地を、０．５％ＦＢＳ及び０．４ｍｇ／ｍｌカフェインを加えたＩＭＤＭと交換した。レンチウィルス粒子を含有する上清を、トランスフェクションの４８時間後及び７２時間後に回収し、遠心分離して細胞破片を除去し、０．４５μｍ ＰＶＤＦフィルターを通して濾過した。ウィルス粒子を、滅菌ポリエチレングリコール６０００及び塩化ナトリウムを最終濃度がそれぞれ８％及び０．３Ｍとなるよう添加し、４℃で１２時間以上インキュベートし、続いて２，５００×ｇで４５分間遠心分離することによって濃縮した。上清を完全に除去し、ペレットを滅菌リン酸緩衝生理食塩水に溶解した。７２時間後に、レンチウィルスをＨＥＫ２９３ ＦＴ細胞上で、ＧＦＰ発現のための連続希釈及び蛍光顕微鏡検査によって力価測定した。力価は常に１０^７〜１０^９形質導入単位／ｍｌであった。濃縮ＬＶを−８０℃で５〜１０μｌに分注して保存した。レンチウィルスベクターの調製はまた、トランスファーベクターに加えて３つのプラスミドが使用される「第３世代」レンチウィルスベクター系を使用する。第１のプラスミドはｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を有し、ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１２２５１）と呼ばれ、第２のプラスミドはｒｅｖ遺伝子を有し、ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１２２５３）と呼ばれる。エンベロープ遺伝子を含む第３のプラスミドは、ＶＳＶ−ｇ遺伝子（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐＭＤ２．Ｇ、＃１２２５９）を発現する。

［ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染及びＬＶ形質導入の方法］
活性化されたＰＢＭＣを、１２５ＴＣＩＤ_５０／１０^６細胞のＨＩＶ−１_ＢａＬで５時間感染させた後、取り込まれていないウィルスを５時間洗い流した。細胞を３回洗浄し、１０単位／ｍｌのインターロイキン２（ＩＬ−２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を含むｃＲＰＭＩ中に置いた。

活性化ＰＢＭＣを、ＨＩＶ−１感染の前又は後に、ＨＩＶ特異的ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９−ＧＦＰ（ｇ−ＬＶ）又はＣａｓ９−ＧＦＰのみ（ｅ−ＬＶ）を発現する精製ＬＶで形質導入した。細胞形質導入の時点で、ＬＶのアリコートを氷上で解凍し、５秒間微量遠心分離機で回転させ、直ちに、１ｍｌのｃＲＰＭＩ中の２４ウェルプレートのウェルに播種したＰＢＭＣに加えた。プレートを穏やかに旋回させてレンチウィルスベクターを分散させ、次いで、細胞を洗浄する前に、５％ＣＯ_２を含む３７℃インキュベーター中に５時間置いた。ＰＢＭＣは、ＨＩＶ−１による感染又はＬＶによる形質導入の後、１０単位／ｍｌのＩＬ−２を含むｃＲＰＭＩ中で維持した。その後、我々は、ＨＩＶ−１ｐ２４キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）を用いるＥＬＩＳＡによって、培養上清中のＨＩＶ−１ｐ２４レベルを定量した。

［ｇ−ＬＶによるプロビラル切断を示す方法］
特異的ガイドＲＮＡ配列による組み込まれたプロウィルスの切断及び／又は切除を確認するために、Ｊ−Ｌａｔ１０．６細胞をｇ−ＬＶ又はｅ−ＬＶベクターのいずれかを形質導入し、次いで、細胞集団を限界希釈クローニングに供した。ＬＶで形質導入されたクローンは、中程度レベルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）レベルで導入遺伝子のＧＦＰ−Ｃａｓ９領域から構成的にＧＦＰを発現した。ＧＦＰ陽性クローンを増殖させ、１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦαで２４時間活性化し、次いで、組み込まれたプロウィルスからのｄｅ ｎｏｖｏ ＧＦＰ発現について評価した。組み込まれたプロウィルスからのＧＦＰ発現はより明るいＭＦＩを有し、蛍光ピークは、組み込まれた導入遺伝子からの構成的ＧＦＰ産生と明確に区別可能であった。ＥＬＩＳＡを用いて、分泌ｐ２４のレベルを測定した。

Ｊ−ＬａｔクローンをＰＣＲ分析にかけ、ＨＩＶプロウィルスのｖｐｒ−ｔａｔ領域（１７６塩基対）をフォワードプライマー： ＧＧＣＧＴＴＡＣＴＣＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧ（配列番号４）及びリバースプライマー： ＴＣＣＴＧＣＣＡＴＡＧＧＡＧＡＴＧＣＣＴ （配列番号５）を用いて特異的に検出した。Ｖｐｒ−ｔａｔ配列は、５’及び３’ＬＴＲのＵ３領域からそれぞれ５．５Ｋｂ及び３．４Ｋｂである。内部対照として、ＣＣＲ５遺伝子配列（２３９塩基対、上記プライマー）のＰＣＲを使用して、等しいテンプレートローディングを確認した。ｇ−ＬＶ及びｅ−ＬＶクローンの両方からのＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析し、そしてＧｅｌＲｅｄ核酸染色（Ｂｉｏｔｉｕｍ；Ｈａｙｗａｒｄ， ＣＡ）での染色によって可視化した。

［マルチプレックスサイトカインアッセイの実施方法］
ＨＩＶ−１感染又はＬＶ形質導入後に培地に分泌されたサイトカインを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅヒトサイトカインマルチプレックスキット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）を用いて測定した。組換えサイトカイン標準からの較正曲線を、サンプルと同じ培地中で３倍希釈を繰り返して調製した。高スパイク及び低スパイク（刺激されたヒトＰＢＭＣ及び樹状細胞由来の上清）を、サイトカイン回収を決定するために含めた。標準及びスパイクを３連で測定し、サンプルを１回測定し、ブランク値を全ての読み取り値から差し引いた。全てのアッセイは、９６ウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）中で、光から保護しながら室温で直接実施した。

簡潔には、ウェルを、１％ＢＳＡを含有する１００μｌのＰＢＳで予備湿潤させ、次いで、ビーズ、標準、サンプル、スパイク、又はブランクを、１００μｌの最終容量で添加し、そして室温で３０分間、連続振盪しながら一緒にインキュベートした。ビーズを１％ＢＳＡ及び０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。ビオチン化抗体のカクテル（５０μｌ／ウェル）をビーズに添加し、連続振盪しながらさらに３０分間インキュベートした。ビーズを３回洗浄し、次いでストレプトアビジン−ＰＥを１０分間添加した。ビーズを再び３回洗浄し、１％ＢＳＡ及び０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１２５μｌのＰＢＳに懸濁した。ビーズの蛍光強度を、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアレイリーダーを用いて測定した。５つのパラメトリック曲線フィッティングを有するＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアをデータ分析に使用した。

［ＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣへのＬＶ形質導入はＨＩＶ−１産生を遮断する］
活性化ＰＢＭＣを、Ｕ３ＢガイドＲＮＡ及びＣａｓ９を含むＬＶ（ｇ−ＬＶ）、又はＧＦＰ−Ｃａｓ９遺伝子のみを発現するＬＶ（ｅ−ＬＶ）で形質導入する４８時間前にＨＩＶ−１ＢａＬで感染させた。これらの細胞培養物の各々からの上清を、形質導入後の種々の日に回収し、そして上清中のｐ２４の濃度を、ＨＩＶ−１生産の指標としてＥＬＩＳＡにより測定した。図４に示すように、感染後１２日間を通してＨＩＶ単独で感染させたウェルではｐ２４レベルの定常的な増加が観察されたが、ｇ−ＬＶ又はｅ−ＬＶのいずれかで形質導入した培養物は、１２日間を通してＨＩＶ ｐ２４産生の抑制を示した。図４に示すデータは３つの異なる実験をまとめたものであり、各実験条件は３連で実施した。

［ＨＩＶ−１曝露前のｇ−ＬＶ又はｅ−ＬＶの導入はＰＢＭＣを感染から保護する］
ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣをｇ−ＬＶ又はｅ−ＬＶで形質導入して、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９配列の事前組み込みがＨＩＶ−１感染からＰＢＭＣを保護するかどうかを評価した。全ての培養物を、トランスフェクション後２日目にＨＩＶ−１に感染させた。これらの培養物では、ｇ−ＬＶ及びｅ−ＬＶ形質導入細胞の両方がその後のＨＩＶ−１感染に対して耐性であった。図５Ａに提示されるデータは３つの異なる実験の編集であり、各実験条件は３連で実施された。

別々の実験において、本発明者らはＬＶ形質導入後３日目及び４日目にｅ−ＬＶ又はｇ−ＬＶ形質導入細胞をＨＩＶ−１処理し、これらの細胞がＨＩＶ−１感染からも保護されることを示した。この手順の結果を図５Ｂに示す。

［ＬＶ形質導入ＰＢＭＣによって産生される炎症性ケモカイン］
ＬＶ形質導入後にＰＢＭＣがＨＩＶ感染に抵抗できる代替機構を調べるために、上清を、ＨＩＶ−１による感染後様々な時点で、ｇ−ＬＶ、ｅ−ＬＶ、又は導入遺伝子（ＦＵＧＷ）においてガイドＲＮＡ又はＣａｓ９を発現しないＬＶによる形質導入後に、ＰＢＭＣからの４１の異なる炎症性サイトカインについてのＬｕｍｉｎｅｘマルチプレックスアッセイを用いて分析した。ｇ−ＬＶは、ガイドＲＮＡ配列Ｕ３Ａ、Ｕ３Ｂ、Ｕ３Ｃ、及びＫａｔｎａｌ−２を有するものを含んだ。Ｋａｔｎａｌ ２（カタニンｐ６０サブユニットＡ−ｌｉｋｅ ２）は細胞微小管の迅速な再編成を促進するように機能するタンパク質を産生し、無関係なガイドＲＮＡ制御として選択された。対照ＰＢＭＣは、いずれのウィルスベクターでも処理しなかった。

サイトカイン／ケモカイン発現の３つの一般的パターンが観察された。１つのパターンにおいて、特定のサイトカイン／ケモカインは、７２時間にわたる感染／形質導入条件のいずれにおいても発現されなかった。発現されなかったサイトカインには、ＴＧＦα、ＦＬＴ−３Ｌ、ＩＬ−１２Ｐ７０、ＰＤＧＦ−ＡＡ及びＰＤＧＦ−ＢＢが含まれた。第２のパターンは、刺激（ＨＩＶ−１、ＬＶ、又は処置なし）にかかわらず構成的に分泌されたサイトカイン／ケモカインを例示した。これらには、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、エオタキシン、ＧＭ−ＣＳＦ、フラクタリン、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２Ｐ４０、ＭＤＣ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ｓＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−１７α、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦα及びＴＮＦ−βが含まれた。ＩＬ−２は全ての条件で存在したが、このサイトカインをＰＢＭＣ培地に添加したため、このサイトカインの誘導に関する結論を評価することはできない。第３のパターンは、ＬＶがガイドＲＮＡの有無にかかわらずＣａｓ９遺伝子を発現したＬＶ形質導入後にのみ発現したサイトカインを含んだ。図６に示すように、この第３の発現パターンを表すサイトカイン及びケモカインは、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−γ、ＧＲＯ、ＭＣＰ−３、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＶＥＧＦ、及びＭＣＰ−１を含んでいた。これらの１２のサイトカイン又はケモカインのいずれも、対照条件下、又はＨＩＶ−１若しくはＦＵＧＷ ＬＶへの曝露後に有意な量で産生されなかった。

［Ｕ３Ｂ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ Ｐｌｕｓ Ｃａｓ９はＪ−Ｌａｔ細胞のプロウィルス配列を排除する］
Ｊ−Ｌａｔ１０．６細胞はＨＩＶ−１に対する調節遺伝子のいくつかを欠くが、ＬＴＲの制御下でＧＦＰ及びｇａｇを含む修飾された組み込まれたＨＩＶ−１プロウィルスを含むため、潜伏ＨＩＶ感染細胞のモデルとして使用した。さらに、ＴＮＦαはこれらのＪ−Ｌａｔ細胞においてプロウィルス転写を活性化することができ、ＧＦＰ及びｐ２４産生の両方をもたらす。Ｊ‐Ｌａｔのｅ‐ＬＶ及びｇ‐ＬＶ形質導入クローンもＧＦＰ Ｃａｓ９遺伝子からＧＦＰを発現するので、ＴＮＦα活性化前後のＪ‐Ｌａｔ細胞の二重蛍光強度プロフィールを比較した。図６Ａに示されるように、親（クローニングされていない）Ｊ−Ｌａｔ細胞は、細胞の約８０％においてＧＦＰの明るいピークを誘導する。したがって、親細胞は天然の状態ではＧＦＰを発現しないが、約８０％の細胞においてＴＮＦ−α活性化後に高強度ＧＦＰ発現を発現するように誘導することができる。図６Ｂは、ｅ−ＬＶで形質導入された代表的なＪ−Ｌａｔクローンからの組み込まれた導入遺伝子からのより低い強度のＧＦＰピーク、及びＴＮＦα活性化後の組み込まれたプロウィルスからのより明るい蛍光ピークの誘導の両方を示す。従って、ｅ−ＬＶで形質導入されたＪ−Ｌａｔクローンは、導入遺伝子からの低強度レベルのＧＦＰと、ＴＮＦ−α活性化後のより明るい強度ＧＦＰとを発現する。図６Ｃは、ｇ−ＬＶで形質導入された代表的なＪ−Ｌａｔクローンを示し、ＴＮＦα活性化後の第２のより明るいＧＦＰピークの誘導の欠如を示す。従って、ｇ−ＬＶで形質導入されたＪ−Ｌａｔクローンは導入遺伝子からの低強度レベルのＧＦＰを発現し、ＴＮＦ−α活性化後のより明るい強度のＧＦＰピークの誘導はない。親Ｊ−Ｌａｔクローン及びｅ−ＬＶ形質導入クローンも、培養上清中に分泌されたｐ２４を産生したが、ｇ−ＬＶクローンは産生しなかった。このタンパク質のレベルは図６Ａ〜６Ｃの凡例に記載されている。

ｅ−ＬＶクローンと比較したｇ−ＬＶ形質導入クローンにおけるプロウィルス遺伝子破壊の程度を決定するために、ＰＣＲアッセイを実施して、プロウィルスの中央の領域（ガイドＲＮＡによって標的化されたＵ３配列から４．５キロ塩基）を増幅した。電気泳動分析により、親Ｊ−Ｌａｔ細胞がＰＣＲ反応に用いられるＤＮＡ鋳型を提供する場合に得られる、長さ１７６ｂｐの増幅産物が認められた。同様に、ｅ−ＬＶコンストラクト（すなわち、ＨＩＶ−１特定ｇＲＮＡをコードしない）で形質導入された３つのＪ−ＬａｔクローンがＤＮＡ鋳型を提供した場合、同じバンドが観察された。これらの場合の各々における１７６ｂｐの増幅産物の産生は、ＨＩＶ−１プロウィルスＤＮＡの存在を示した。対照的に、ｇ−ＬＶ構築物（すなわち、コードされたＨＩＶ−１特異的ｇＲＮＡ）で形質導入された３つのＪ−ＬａｔクローンがＤＮＡ鋳型を提供した場合、１７６ｂｐ増幅産物は合成されなかった。この結果は、ＨＩＶ−１プロウィルス配列がゲノムから有利に切り出されたことを示した。ＣＣＲ５遺伝子の２３９ｂｐ増幅産物は、７つの試験のそれぞれにおいて検出され、それによって、プロウィルスＤＮＡの切除を証明する試験の結果は陰性であることを確認した。簡単に言えば、ｇ−ＬＶクローン中のプロウィルス配列は切り出されたが、この領域まるごとが分析した全てのｅ−ＬＶクローン中に存在した。

開示された実施形態の上記の説明は、当業者が本発明を製造又は使用できるようにするために提供される。これらの実施形態に対する様々な修正は当業者には容易に明らかであり、本明細書で説明される一般的な原理は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態に適用することができる。したがって、本明細書で提示される説明及び図面は本発明の現在好ましい実施形態を表し、したがって、本発明によって広く企図される主題を表すことを理解されたい。さらに、本発明の範囲は当業者に明らかとなり得る他の実施形態を完全に包含し、したがって、本発明の範囲は限定されないことが理解される。

Claims (27)

1. ヒト対象の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＨＩＶ−１産生を抑制する方法であって、以下のステップを含む方法：
   ＰＢＭＣを、ウィルスベクターを含む組成物と接触させ、それによって前記ウィルスベクターがＰＢＭＣに入り、
   前記ウィルスベクターはガイドＲＮＡ及びヒト化Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、
   前記ガイドＲＮＡはプロウィルスＨＩＶ−１ゲノムに含まれるＤＮＡ配列に相補的であり、
   前記ヒト化ＣａｓエンドヌクレアーゼはＰＢＭＣにおいてタンパク質として発現される場合、前記ガイドＲＮＡの存在下で、前記ウィルスベクターと接触したＰＢＭＣのプロウィルスＨＩＶ−１ゲノム内で切断し、それによってＨＩＶ−１産生を抑制する。
2. 前記ウィルスベクターがレンチウィルスベクターである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ヒト化ＣａｓがＣａｓ９である、請求項１に記載の方法。
4. 前記ガイドＲＮＡが、前記プロウィルスＨＩＶ−１の長い末端反復（ＬＴＲ）内で切断する、請求項１に記載の方法。
5. 前記ＰＢＭＣが、リンパ球及びマクロファージからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
6. 前記ガイドＲＮＡが前記プロウィルスＨＩＶ−１の長い末端反復（ＬＴＲ）内で切断し、前記ガイドＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列が、前記プロウィルスＨＩＶ−１ ＬＴＲに存在するＤＮＡ配列であり、前記接触ステップが、前記細胞がＨＩＶ−１に感染する前に行われる、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＤＮＡ配列がＵ３ＤＮＡ配列である、請求項６に記載の方法。
8. 前記ガイドＲＮＡが前記プロウィルスＨＩＶ−１の長い末端反復（ＬＴＲ）内で切断し、前記ガイドＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列が、前記プロウィルスＨＩＶ−１のＬＴＲに存在するＤＮＡ配列であり、前記接触ステップが、前記細胞がＨＩＶ−１に感染した後に行われる、請求項５に記載の方法。
9. 前記ＤＮＡ配列がＵ３ ＤＮＡ配列である、請求項８に記載の方法。
10. 前記ガイドＲＮＡが前記プロウィルスＨＩＶ−１の長い末端反復（ＬＴＲ）内で切断し、前記ガイドＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列が前記プロウィルスＨＩＶ−１ ＬＴＲに存在するＤＮＡ配列であり、前記接触ステップの前に前記ヒト対象から前記ＰＢＭＣを取り出すステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
11. 前記ＤＮＡ配列がＵ３ ＤＮＡ配列である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ガイドＲＮＡが前記プロウィルスＨＩＶ−１の長い末端反復（ＬＴＲ）内で切断し、前記ガイドＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列が前記プロウィルスＨＩＶ−１ ＬＴＲに存在するＤＮＡ配列であり、前記ヒト対象において前記接触ステップを行うステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
13. 前記ＤＮＡ配列がＵ３ ＤＮＡ配列である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ガイドＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列が、プロウィルスＨＩＶ−１ ＬＴＲ中に存在するＵ３ ＤＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
15. 前記接触ステップが、前記細胞がＨＩＶ−１に感染する前に行われる、請求項１に記載の方法。
16. 前記接触ステップが、前記細胞がＨＩＶ−１に感染した後に行われる、請求項１に記載の方法。
17. 前記接触ステップにおける前記組成物が、前記ヒト対象への投与のための薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
18. 前記接触ステップを行う前に、前記ヒト対象から前記ＰＢＭＣを取り出すステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
19. 前記接触ステップを行った後、前記ＰＢＭＣを前記ヒト対象に戻すステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ウィルスベクターが、特定の細胞型に結合するエンベロープタンパク質を含むビリオン内にパッケージされる、請求項１に記載の方法。
21. 前記レンチウィルスベクターが、特定の細胞型に結合するエンベロープタンパク質を含むビリオン内にパッケージされる、請求項２に記載の方法。
22. １つ以上のガイドＲＮＡ、及びＣｒｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質をコードする核酸を含むレンチウィルスベクターであって、前記ガイドＲＮＡが、標的ＨＩＶ−１ ＤＮＡ配列とハイブリダイズする、レンチウィルスベクター。
23. 前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項２２に記載のレンチウィルスベクター。
24. 前記レンチウィルスベクターがｇ−ＬＶである、請求項２２に記載のレンチウィルスベクター。
25. （ａ）標的ＨＩＶ−１ ＤＮＡ配列とハイブリダイズする、１つ以上のガイドＲＮＡ、又は前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸；及び
    （ｂ）Ｃａｓ９タンパク質、又は前記タンパク質をコードする核酸、を含む、
    レンチウィルスベクターを含むキット。
26. 前記レンチウィルスベクター及びそれを必要とするヒト対象への投与に適切な薬学的に受容可能な賦形剤を含むバイアル又は他の容器をさらに含む、請求項２５に記載のキット。
27. 請求項２２に記載のレンチウィルスベクターを含む医薬組成物。

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