JP2021535100A - M2マクロファージ極性化を調節する方法及び治療におけるその使用 - Google Patents
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Abstract
それを必要とする対象において、M2/Mマクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法が提供される。該方法は、(a)IL33及び/又はGM−SCFの存在下で好塩基球を培養すること;並びに(b)培養後に治療有効量の好塩基球を対象に投与し、それにより、対象のM2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療すること、を含む。【選択図】なし
Description
この出願は、2018年8月24日に出願された米国特許出願第62/722,196号からの優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、M2マクロファージ極性化を調節する方法、及び治療におけるその使用に関する。
哺乳動物の組織は、線維芽細胞、上皮、内皮、及び免疫系統を含む多様な細胞型からなる。胚発生中の組織形成には、特定の環境状況において、異なる細胞型間の協調機能及びクロストークが必要である。肺の特殊な確約された細胞型への発生は、独自の経路及び機能特性を特徴とする高度に調節されたプロセスである。並行して、免疫系の細胞は、間質細胞と相互作用し、組織の分化、成長、及び機能に影響を与える活性な免疫コンパートメントを確立するために、造血部位から肺へと遊走する。
哺乳動物の肺は中枢呼吸器であり、特殊な細胞型の多様なセットを特徴としている。肺のガス交換は、特殊な上皮細胞で構成される肺胞で発生し、1型肺胞(AT)細胞はガス交換を仲介し、AT2細胞はサーファクタントを分泌して肺の表面張力を維持する(Whitsett and Alenghat,2015)。肺胞上皮細胞は、小管期(E16.5)と球形嚢期(E18.5)の間で相互の前駆細胞から分岐し、形態及び遺伝子発現に劇的な変化をもたらす(Treutlein et al.,2014)。もう1つの主要な細胞型は肺胞マクロファージ(AM)であり、肺胞腔からサーファクタントを取り除き、重要な免疫調節物質として作用し、肺の不要な免疫反応を抑制する(Hussell and Bell,2014)。AMは胎児の肝臓胚前駆細胞に由来し、自己維持型であり、成人の骨髄からの寄与がない(Epelman et al.,2014;Hashimoto et al.,2013;Murphy et al.,2008;Shibata et al.,2001)。肺マクロファージの第1の波は胚の12.5日(E12.5)に現れ、続いて胎児肝臓由来の単球に由来する第2の波が現れ、肺胞マクロファージから成熟AMへの分化軸を継続する(Ginhoux,2014;Ginhoux and Jung,2014;Hoeffel and Ginhoux,2018;Kopf et al.,2015;Tan and Krasnow,2016)。
異常な免疫活性化は、慢性炎症、線維症、及び自己免疫反応を含む組織損傷及び病状を引き起こす可能性があるため、各組織、特に肺における免疫反応は、厳密に調節され、その要件に適合させる必要がある。したがって、各組織は、免疫コンパートメントと相互作用し、細胞の遺伝子発現及びクロマチンランドスケープを形成する独自のシグナル伝達環境を備えている(Butovsky et al.,2014;Cipolletta et al.,2015;Cohen et al.,2014;Greter et al.,2012;Hussell and Bell,2014;Lavin et al.,2014;Okabe and Medzhitov,2014;Panduro et al.,2016;Yu et al.,2017)。肺の状況では、AMは組織特異的な表現型を示し、遺伝子の発現及び機能から明らかである(Gautier et al.,2012;Guilliams et al.,2013b;Kopf et al.,2015;Lavin et al.,2014)。ex vivoでAMを成長させる試みは成功していないため、肺胞形成プロセス中の動的シグナル伝達の理解には大きな隔たりがある(Fejer et al.,2013)。肺マクロファージの発達及び成熟は、上皮細胞(主にAT2)、先天性リンパ球(ILC)、及びAM自体から伝達される様々な成長及び分化の手がかりに依存することが示された(de Kleer et al.,2016;Guilliams et al.,2013a;Saluzzo et al.,2017;Yu et al.,2017)。ましてや、肺における他の肺に存在する免疫及び非免疫細胞型の機能及びクロストークは、現在、ほとんど理解されていない。
好塩基球は、細胞質に小葉状の核及び分泌顆粒が存在することを特徴とする、短命の顆粒球細胞であると考えられている。好塩基球は、血流に入って巡回する前に、骨髄で成熟を完了する。寄生虫感染及びアレルギー性疾患等の病的状態では、好塩基球が動員されて組織実質に侵入し(Min et al.,2004;Mukai et al.,2005;Oh et al.,2007)、それらの主な機能は、アレルギーにおけるTh2応答の誘導、及び蠕虫感染後のIL−4分泌の主な原因とされている(Mack et al.,2005;Min et al.,2004;Sokol et al.,2009;Sullivan and Locksley,2009;Tschopp et al.,2006;Tsujimura et al.,2008)。
したがって、マクロファージ極性化の能動的調節は、抗炎症及び抗癌療法の開発におけるアプローチである。
追加の関連する背景技術:
国際公開第2016185026号公報
欧州特許第3072525号公報A1
国際公開第2017097876号公報
Wynn TA,Nat Rev Immunol.2015 May;15(5):271−82.
国際公開第2016185026号公報
欧州特許第3072525号公報A1
国際公開第2017097876号公報
Wynn TA,Nat Rev Immunol.2015 May;15(5):271−82.
Whitsett and Alenghat,2015
Treutlein et al.,2014
Hussell and Bell,2014
Epelman et al.,2014
Hashimoto et al.,2013
Murphy et al.,2008
Shibata et al.,2001
Ginhoux,2014
Ginhoux and Jung,2014
Hoeffel and Ginhoux,2018
Kopf et al.,2015
Tan and Krasnow,2016
Butovsky et al.,2014
Cipolletta et al.,2015
Cohen et al.,2014
Greter et al.,2012
Lavin et al.,2014
Okabe and Medzhitov,2014
Panduro et al.,2016
Yu et al.,2017
Gautier et al.,2012
Guilliams et al.,2013b
Fejer et al.,2013
de Kleer et al.,2016
Guilliams et al.,2013a
Saluzzo et al.,2017
Min et al.,2004
Mukai et al.,2005
Oh et al.,2007
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、それを必要とする対象において、M2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法が提供され、該方法は、
(a)IL33及び/又はGM−SCFの存在下で好塩基球を培養すること、並びに
(b)培養後、治療有効量の好塩基球を対象に投与し、
それにより、対象においてM2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療すること、を含む。
(a)IL33及び/又はGM−SCFの存在下で好塩基球を培養すること、並びに
(b)培養後、治療有効量の好塩基球を対象に投与し、
それにより、対象においてM2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療すること、を含む。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、それを必要とする対象において、M2/M1マクロファージ比を増加することから利益を得ることができる疾患又は障害の治療において使用するための、IL33及び/又はGM−SCFの存在下で培養することによって生成された治療有効量の好塩基球が提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、好塩基球は、血液循環好塩基球であるか、又は骨髄に由来する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、該方法は、(a)の前にさらに、
(i)骨髄又は末梢血から好塩基球を分離すること、
(ii)IL−3の存在下で好塩基球を骨髄又は末梢血から分化させて、分化した培養物を得ること、
(iii)分化した培養物からcKIT−集団を分離すること、を含む。
(i)骨髄又は末梢血から好塩基球を分離すること、
(ii)IL−3の存在下で好塩基球を骨髄又は末梢血から分化させて、分化した培養物を得ること、
(iii)分化した培養物からcKIT−集団を分離すること、を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、(ii)は、培養において8〜10日間行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、(a)は最大48時間実施される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養は、肺の好塩基球表現型を達成するように行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、肺好塩基球表現型は、Csf1、Il6、Il13、L1cam、Il4、Ccl3、Ccl4、Ccl6、Ccl9及びHgfからなる群から選択される成長因子及びサイトカインの発現を含み、血液循環好塩基球で発現はより高い。
本発明のいくつかの実施形態によれば、肺好塩基球表現型は、Il6、Il13、Cxcl2、Tnf、Osm及びCcl4の発現シグネチャーを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、肺好塩基球表現型は、Fcera1+、Il3ra+(Cd123)、Itga2+(Cd49b)、Cd69+、Cd244+(2B4)、Itgam+(Cd11b)、Cd63+、Cd24a+、Cd200r3+、Il2ra+、Il18rap+及びC3ar1+の発現シグネチャーを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、好塩基球はヒトである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、好塩基球は、Fcer1、Il13ra1、Itga2、Cd69、Cd244、Itgam、Cd63、Cd24、Il2ra、Il18rap及びC3ar1の発現シグネチャーを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、好塩基球は対象に対して自家である。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、それを必要とする対象において、M2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法が提供され、該方法は、IL6、IL13、及びHGFからなる群から選択される治療有効量のシグナル伝達分子を対象に投与し、それにより、対象のM2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療すること、を含む。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、対象においてM2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害の治療に使用するためのIL6、IL13及びHGFからなる群から選択される治療有効量のシグナル伝達分子が提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、治療有効量は、M1/M2マクロファージ比を増加させる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象はヒト対象である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、投与は局所投与経路のものである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、投与は肺に対するものである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、M2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害は、炎症性疾患である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、炎症性疾患は、敗血症(sepsis)、敗血症(septicemia)、肺炎、敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群(SIRS)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性肺損傷、誤嚥性肺炎(aspiration pneumanitis)、感染症、膵炎、細菌血症、腹膜炎、腹部膿瘍、外傷による炎症、手術による炎症、慢性炎症性疾患、虚血、臓器又は組織の虚血再灌流障害、疾患による組織損傷、化学療法又は放射線療法による組織損傷、及び摂取、吸入、注入、注射又は送達された物質に対する反応、糸球体腎炎、腸感染症、日和見感染症、並びに大規模な手術又は透析を受けている対象、免疫不全の対象、免疫抑制剤を摂取している対象、HIV/AIDSの対象、心内膜炎が疑われる対象、発熱のある対象、原因不明の発熱のある対象、嚢胞性線維症、糖尿病の対象、慢性腎不全の対象、気管支拡張症の対象、慢性閉塞性肺疾患の対象、慢性気管支炎、気腫又は喘息の対象、熱性好中球減少症の対象、髄膜炎の対象、敗血症性関節炎の対象、***症の対象、壊死性筋膜炎の対象、他のグループA連鎖球菌感染症の疑いのある対象、脾臓切除術を受けた対象、再発性又は腸球菌感染症の疑いのある対象、感染リスクの増加に関連する他の医学的及び外科的状態、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、髄膜炎菌血症、ポンプ後症候群(post−pump syndrome)、心臓スタン症候群、脳卒中、うっ血性心不全、肝炎、喉頭蓋炎(epiglotittis)、E.coli 0157:H7、マラリア、ガス壊疽、毒素性ショック症候群、子癇前症、子癇、HELP症候群、マイコバクテリアによる結核(mycobacterial tuberculosis)、カリニ性肺炎(Pneumocystic carinii)、肺炎、リーシュマニア症、溶血性***症候群/血栓性血小板減少性紫斑病、デング出血熱、骨盤炎症性疾患、レジオネラ、ライム病、インフルエンザA、エプスタイン−バーウイルス(pelvic inflammatory disease)、脳炎、炎症性疾患及び自己免疫疾患(関節リウマチ、骨関節炎、進行性全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、特発性肺線維症、サルコイドーシス、過敏性肺炎、全身性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、心臓、肝臓、肺腎臓骨髄を含む移植、移植片対宿主病、移植片拒絶、鎌状赤血球貧血、ネフローゼ症候群、OKT3等の薬剤の毒性、サイトカイン療法、クリオピリン関連周期熱症候群及び肝硬変を含む)からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、M2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害は、自己免疫疾患である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、自己免疫疾患は、アディソン病、アレルギー、円形脱毛症、アルツハイマー病、抗好中球細胞質抗体(ANCA)関連血管炎、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群(ヒューズ症候群)、関節炎、喘息、粥状動脈硬化、動脈硬化巣、自己免疫疾患(例えば、ループス、RA、MS、グレイブス病等)、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、無***症、ベーチェット病、バーガー病、水疱性類天疱瘡、心筋症、心血管疾患、セリアック病/コアリアック病、慢性疲労免疫機能障害症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIPD)、慢性再発性多発ニューロパチー(ギラン−バレ症候群)、チャーグ−ストラウス症候群(CSS)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症(CAD)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、CREST症候群、クローン病、皮膚炎、ヘルペス、皮膚筋炎、糖尿病、円盤状ループス、湿疹後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァン症候群、眼球突出(Exopthalmos)、線維筋痛症、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、免疫増殖性疾患又は障害(例えば、乾癬)、炎症性腸疾患(クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む)、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、間質性肺疾患、若年性糖尿病、若年性関節炎、若年性特発性関節炎(JIA)、川崎病、ランバート−イートン筋無力症候群、扁平苔癬、ループス、ループス腎炎、リンパ球性下垂体炎(Lymphoscytic Lypophisitis)、メニエール病/急性播種性脳脊髄神経根障害、混合性結合組織病、多発性硬化症(MS)、筋肉リウマチ、筋痛性脳脊髄炎(ME)、重症筋無力症、
眼の炎症、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発軟骨炎、多腺性症候群(Polyglandular Syndromes)(ウィタカー症候群)、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変/自己免疫性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群/反応性関節炎、再狭窄、リウマチ
熱、
リウマチ性疾患、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強皮症、シェーグレン症候群(Sjorgen’s Syndrome)、スティフ・マン症候群、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、全身性硬化症、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、甲状腺炎、1型糖尿病、2型糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、及びウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される。
眼の炎症、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発軟骨炎、多腺性症候群(Polyglandular Syndromes)(ウィタカー症候群)、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変/自己免疫性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群/反応性関節炎、再狭窄、リウマチ
熱、
リウマチ性疾患、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強皮症、シェーグレン症候群(Sjorgen’s Syndrome)、スティフ・マン症候群、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、全身性硬化症、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、甲状腺炎、1型糖尿病、2型糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、及びウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、M2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害は、肺疾患である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、M2/M1マクロファージは、肺胞マクロファージを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、M2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)である。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、それを必要とする対象においてM1/M2マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法であって、障害が好塩基球に関連せず、対象において好塩基球又は好塩基球の活性を枯渇させることを含み、それにより、対象のM1/M2マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療することを含む、方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、枯渇は、好塩基球又は好塩基球の活性を枯渇させる薬剤によるものである。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、それを必要とする対象においてM1/M2マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害の治療に使用するための好塩基球又は好塩基球の活性を枯渇させる薬剤が提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤は、少なくとも1つの好塩基球マーカーに向けられる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤は、FceR1a、IL33R及び/又はCSF2Rbを標的とする。
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤は、GM−CSF及び/又はIL33を標的とする。
本発明のいくつかの実施形態によれば、枯渇はex−vivoで行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、枯渇はin−vitroで行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、好塩基球は、血液循環好塩基球である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、好塩基球は、肺に存在する好塩基球である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、枯渇は局所的な方法で行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、M1/M2マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害は癌である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、M1/M2マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害は黒色腫である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、M1/M2マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害は、肺線維症である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、M1/M2マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる補助疾患又は障害は、癌、線維性疾患からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、M1/M2マクロファージ比を増加させる方法が提供され、該方法は、マクロファージの近傍から肺好塩基球表現型を有する好塩基球を枯渇させるか、又は好塩基球の活性を枯渇させ、それによってM1/M2マクロファージ比を増加させる。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、M2/M1マクロファージ比を増加させる方法が提供され、該方法は、マクロファージ又は好塩基球のエフェクターの近傍に肺好塩基球表現型を有する好塩基球を濃縮することを含み、それによってM2/M1マクロファージ比を増加させる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、濃縮は、GM−CSF及び/又はIL33によるものである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、エフェクターは、IL6、IL13及びHGFからなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、該方法はex−vivoで行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、該方法はin−vivoで行われる。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び/又は科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施形態の実施又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び/又は材料を以下に説明する。矛盾する場合は、定義を含む特許明細書が優先される。さらに、材料、方法、及び例は例示にすぎず、必ずしも限定することを意図するものではない。
添付の図面を参照して、本発明のいくつかの実施形態を例としてのみ本明細書に記載する。ここで詳細に図面を具体的に参照すると、示される詳細は、例として、本発明の実施形態の例示的な議論を目的とすることが強調される。これに関して、図面と共に考慮される説明によれば、本発明の実施形態がどのように実施され得るかは当業者に明らかとなろう。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、M2マクロファージ極性化を調節する方法、及び治療におけるその使用に関する。
本発明の少なくとも1つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるか、又は実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であるか、又は様々な方法で実施又は実行され得る。
単球前駆細胞に由来するマクロファージは、局所組織環境に応じて特定の分化を起こす。さまざまなマクロファージ機能は、マクロファージ上の受容体相互作用のタイプ及びサイトカインの存在に関連している。Tヘルパータイプ1及びTヘルパータイプ2(TH1−TH2)極性化と同様に、マクロファージの極性化活性化の2つの異なる状態、古典的に活性化された(M1)マクロファージ表現型及び代替的に活性化された(M2)マクロファージ表現型が定義されている。T細胞と同様に、いくつかの活性化マクロファージといくつかの抑制性マクロファージがあるため、マクロファージをそれらの特定の機能的活動に基づいて定義する必要がある。古典的に活性化された(M1)マクロファージは、TH1細胞性免疫応答におけるエフェクター細胞の役割を果たす。代替的に活性化された(M2)マクロファージは、免疫抑制及び組織修復に関与しているようである。これらの理由から、M1/M2の比率を調整することは、一方では炎症及び自己免疫、他方では癌の治療に関連するアプローチと見なされてきた。
本発明を実践に還元する一方で、本発明者らは、肺胞に近接して存在する好塩基球の肺常在集団を特定した。これらの好塩基球は、独特の遺伝子発現表現型及びサイトカイン/成長因子分泌を特徴とする。それらは、肺の肺胞マクロファージの成熟及び機能を導く上で重要な役割を果たす。肺に存在する好塩基球表現型は、肺に限定されない病状の特徴でもあることが示唆されており、M1/M2の調節から利益を得ることができる病状の治療に有益である可能性があることを示唆している。
具体的には、本発明者らは、肺発生の主要な時点に沿った50,770個の細胞の単一細胞RNA配列決定による免疫及び非免疫肺細胞の広範なプロファイリングを報告する。非常に多様な細胞型及び状態のセットが観察され、原始細胞から成熟AMまでのマクロファージタイプの3つの波を含む発生軌道の複雑な動態が特定された。相互作用するリガンド及び受容体の分析により、相互作用の高度に接続されたネットワークが明らかになり、肺で主要な成長因子及びサイトカインシグナル伝達を発現する細胞として好塩基球が強調された。肺の好塩基球は肺胞に近接して存在し、末梢循環好塩基球とは大きく異なる肺特異的表現型を示す。Il1rl1(IL−33受容体)ノックアウトマウス及びin vitro培養を使用して、本発明者らは、肺好塩基球の教育が、肺環境からのGM−CSF(Csf2)及びIL−33のコンビナトリアルな刷り込みによって媒介され、これらのサイトカインを導入することによってin vitroで系統発生を繰り返せることを発見した。抗体枯渇戦略、好塩基球のジフテリア毒素媒介選択的枯渇、及びin−vitro共培養実験を使用して、本発明者らは、好塩基球が肺における肺胞マクロファージ(AM)の成熟及び機能を導く上で重要な役割を果たすことを実証する。これらの知見は、マクロファージ操作及び好塩基球ベースの治療法への新しい臨床戦略を開く。
したがって、本発明の一態様によれば、M2/M1マクロファージ比を増加させる方法が提供される。この方法は、マクロファージ又は当該好塩基球のエフェクターの近傍に肺好塩基球表現型を有する好塩基球を濃縮し、それによってM2/M1マクロファージ比を増加させることを含む。
本明細書で使用される場合、「M1マクロファージ」は、炎症誘発性遺伝子の発現を特徴とするマクロファージを指し、典型的には、TH1細胞性免疫応答におけるエフェクター機能を備えている。本発明のいくつかの実施形態によるM1マクロファージは、FACSを使用することによって、又はそれらのサイトカイン分泌プロファイル(例えば、TNFα、IL1b)によって同定することができ、例えばELISAによって、又はRT−PCRを使用すること等によってRNAレベルで定量することができる。
本明細書で使用される場合、「M2マクロファージ」は、免疫抑制活性及び組織修復を備えたマクロファージを指す。本発明のいくつかの実施形態によるM2マクロファージは、FACSを使用する等の特定のマーカー(例えば、MRC1、ARG1)を使用する細胞数によって、又はそれらのサイトカイン分泌プロファイル(例えば、IL−10、CCL17、CCL22)によって定量化することができ、また例えばELISAによって、又はRT−PCRを使用する等のRNAレベルで定量化することができる。
本明細書で使用される場合、「肺胞マクロファージ」又は「AM」は、肺胞に見られるマクロファージのタイプを指す。AMは胎児の肝臓胚前駆細胞に由来し、自己維持型であり、成人の骨髄からの寄与がない。
マウスAMは、抗CD45、抗CD11c、抗F4/80、及び/又は抗SIGLEC−Fを使用して識別され得る。
ヒトAMは、抗CD45及び/又は抗CD11cを使用して識別され得る。
本明細書で使用される場合、「増加する」とは、当技術分野で周知の方法(以下の実施例の欄を参照)によってアッセイした場合に、上記濃縮がない場合(例えば、GM−CSF、IL33、IL6及び/又はIL13)と比較したM2/M1比(M2極性化)の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、さらには95%の増加を指す。
M2/M1マクロファージ比の増加は、M2極性化を意味する。
前述のように、本発明のこの態様の方法は、肺の好塩基球表現型を有する好塩基球を濃縮することによって実施される。
本発明者らは、肺好塩基球表現型がin vitroで獲得され得ることを示した(以下の実施例の欄を参照)。
本明細書で使用される場合、「肺好塩基球表現型」は、構造的及び/又は機能的表現型を指す。
特定の実施形態によれば、構造的表現型は、ヒト細胞の場合、Fcera1+、Il3ra+(Cd123)、Itga2+(Cd49b)、Cd69+、Cd244+(2B4)、Itgam+(Cd11b)、Cd63+、Cd24a+、Cd200r3+、Il2ra+、Il18rap+及びC3ar1+;又はFcer1+、Il13ra1+、Itga2+、Cd69+、Cd244+、Itgam+、Cd63+、Cd24+、Il2ra+、Il18rap+及びC3ar1+を含む。
追加又は代替の実施形態によれば、構造表現型は、Csf1、Il6、Il13、L1cam、Il4、Ccl3、Ccl4、Ccl6、Ccl9及びHgf等の重要なサイトカイン及び成長因子の発現を含む。
追加の又は代替の実施形態によれば、構造的表現型は、重要なサイトカイン及び成長因子Il6、Il13、及びHgfの発現を含む。
追加又は代替の実施形態によれば、構造的表現型は、Il6、Il13、Cxcl2、Tnf、Osm、及びCcl4の発現を含む独自の遺伝子シグネチャーを特徴とする血液循環好塩基球の別個の遺伝子発現プロファイルを含む。
「機能的表現型」とは、マクロファージに対するM2極性化の影響を指す。
特定の実施形態によれば、好塩基球は哺乳動物の好塩基球である。
特定の実施形態によれば、好塩基球はヒト好塩基球である。
一実施形態によれば、濃縮は、GM−CSF及び/又はIL33と接触することによるものである。
一実施形態によれば、濃縮は、GM−CSF及びIL33と接触することによるものである。
本明細書で使用される場合、本明細書に記載の「接触」又は方法は、in−vivo、ex−vivo、又はin−vitroで実施することができる。
特定の実施形態によれば、濃縮は、in vitro又はex vivoで行われる。
本明細書で使用される「好塩基球」は、顆粒球と呼ばれる特定のタイプの白血球を指し、これは、塩基性色素及び二葉核(bi−lobed nucleus)によって染色され得る大きな細胞質顆粒を特徴とし、外観が別のタイプの顆粒球である肥満細胞に類似している。好塩基球は最も一般的でない顆粒球であり、循環血液白血球のわずか0.5%を占め、寿命はわずか2〜3日(in vivo)と短い。好塩基球は、骨髄中の顆粒球−単球前駆細胞に由来し、ここで、好塩基球前駆細胞及び肥満細胞前駆細胞は、中間の二能性好塩基球−肥満細胞前駆細胞から生じる(Arinobu et al.2005 and Arinobu et al.2009)。表1は、さまざまな系統の細胞型に関連するマーカーを示している。
好塩基球は、ヒトとマウスの間で一貫している特定のマーカーの発現によって識別することができる。表2を参照されたい。
Schroeder 2009 Ad.Immunol.Adv Immunol.101,123−161、Hida et al 2009 Nat.Immunol.10,214−222、及びHeneberg 2011 Cu.Pharm.Design 17,3753−3771からのデータ。
特定の実施形態によれば、好塩基球は、骨髄又は末梢血から単離される。
特定の実施形態によれば、好塩基球は以下のように生成される:
(i)好塩基球を骨髄から分離する。
(ii)IL−3の存在下で好塩基球を末梢血から分化させて、分化した培養物を得る;
(iii)分化した培養物からcKIT−集団を分離する。
(i)好塩基球を骨髄から分離する。
(ii)IL−3の存在下で好塩基球を末梢血から分化させて、分化した培養物を得る;
(iii)分化した培養物からcKIT−集団を分離する。
例示的なプロトコルによれば、骨髄(BM)前駆細胞は、所定の濃度、例えば、0.1×106〜1x106細胞/mlで採取及び培養される。BM由来マクロファージ(MΦ)の分化のために、BM細胞をM−CSFの存在下で6〜10日間、例えば8日間培養する。次いで、細胞をこすり取る。BM由来好塩基球の分化のために、BM細胞をIL−3の存在下で7〜10日間(例えば、9〜10日)培養する。続いて、好塩基球をCD117−集団(cKit;Miltenyi Biotec)の磁気活性化セルソーティングによって濃縮し、16時間再播種する。分化中、培養物を標準培地に入れることができる。
ex−vivo法は、組織培養で、又は可能であればアフェレーシス等の閉鎖系で行うことができる。
骨髄培養物又は循環好塩基球(末梢血)培養物を、分化因子で処理する。細胞の生存のために、IL−3(5〜20ng/ml、例えば10ng/ml)及びM−CSF(5〜20ng/ml、例えば10ng/ml);並びに/又はマクロファージのM2極性化を調節できる好塩基球に対する細胞活性化のために、IL33(30〜70ng/ml、例えば50ng/ml)及び/若しくはGM−CSF(30〜70ng/ml、例えば50ng/ml)を添加しながら培養を行うことができる。典型的には、細胞活性化は、48時間以下、例えば、6〜48時間、12〜48時間、24〜48時間、12〜36時間、18〜24時間、例えば、24時間(例えば、IL33+GM−CSF)で行われる。
本明細書で使用される場合、「マクロファージの近傍で」は、好塩基球とマクロファージの共培養を指す場合がある。あるいは、「マクロファージの近傍」は、in vivoで肺好塩基球表現型を有する有効量の好塩基球、又はM2マクロファージへの極性化を可能にするための当該好塩基球の有効量のエフェクターが存在するように濃縮することを指す場合がある。
肺好塩基球表現型を有する好塩基球のエフェクターには、IL6、IL13及び/又はHGF(肝細胞成長因子)が含まれるが、これらに限定されない。
別の態様によれば、M1/M2マクロファージ比を増加させる方法、マクロファージの近傍から肺好塩基球表現型を有する好塩基球を枯渇させること、又は当該好塩基球の活性を枯渇させ、それによってM1/M2マクロファージ比を増加させる方法が提供される。
M1/M2マクロファージ比の増加は、M1極性化も指す。
本明細書で使用される場合、「増加する」とは、当技術分野で周知の方法(以下の実施例の欄を参照)によってアッセイした場合に、上記枯渇がない場合と比較したM1/M2比(M1極性化)の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、さらには95%の増加を指す。
肺好塩基球表現型を有する好塩基球を枯渇することは、当技術分野で知られている任意の方法によって実施することができ、いくつかは以下に記載されている。
一実施形態によれば、枯渇は、好塩基球マーカーを標的とする薬剤によってもたらされ得る。
そのようなマーカーは、上に記載されており、例えば、Fcera1+、Il3ra+(Cd123)、Itga2+(Cd49b)、Cd69+、Cd244+(2B4)、Itgam+(Cd11b)、Cd63+、Cd24a+、Cd200r3+、Il2ra+、Il18rap+及びC3ar1+;又はFcer1+、Il13ra1+、Itga2+、Cd69+、Cd244+、Itgam+、Cd63+、Cd24+、Il2ra+、Il18rap+及びC3ar1+、又は表2に列挙される通りである。
特定の実施形態によれば、枯渇は、肺好塩基球表現型を有し、他の細胞集団ではない好塩基球を特異的に排除するように実施される(他の細胞集団の枯渇は、20%、15%、10%、5%、1%を超えて影響を受けず、各値は異なる実施形態と見なされる)。
特定の実施形態によれば、そのような薬剤は、抗Fcera1+抗体等の抗体であり得る。
抗体の種類の選択は、抗体が誘発するように設計されている免疫エフェクター機能に依存する。
特定の実施形態によれば、抗体はFcドメインを含む。
特定の実施形態によれば、抗体はネイキッド抗体である。
本明細書で使用される場合、「ネイキッド抗体」という用語は、異種エフェクター部分、例えば治療部分を含まない抗体を指す。
特定の実施形態によれば、抗体は、典型的には好塩基球を死滅させ、それによってM1/M2マクロファージ比を増加させるための異種エフェクター部分を含む。エフェクター部分は、タンパク性又は非タンパク性であり得て、後者は通常、抗体及びコンジュゲートパートナーの官能基を使用して生成される。エフェクター部分は、小分子化学化合物及びポリペプチドを含む任意の分子であり得る。エフェクター部分の非限定的な例としては、限定されるものではないが、サイトカイン、細胞傷害性抗体、毒素、放射性同位体、化学療法抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、及び他の治療的に活性な抗体が挙げられる。異種治療部分に関する追加の説明を、以下にさらに提供する。
抗体は、単一特異性(1つのエピトープ又はタンパク質を認識できる)、二重特異性(2つのエピトープ又はタンパク質に結合できる)、又は多重特異性(複数のエピトープ又はタンパク質を認識できる)の場合がある。
特定の実施形態によれば、抗体は単一特異性抗体である。
特定の実施形態によれば、抗体は二重特異性抗体である。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープを特異的に認識して結合することができる抗体である。異なるエピトープは、同じ分子内又は異なる分子上にあり得、その結果、二重特異性抗体は、単一のRTN4ポリペプチドと並んで2つの異なるポリペプチド上の2つの異なるエピトープを特異的に認識及び結合することができる。あるいは、二重特異性抗体は、例えば、RTN4、及び限定されるものではないが、例えば、CD2、CD3、CD28、B7、CD64、CD32、CD16等の別のエフェクター分子に結合することができる。二重特異性抗体を産生する方法は当技術分野で知られており、例えば、米国特許第4,474,893号、同第5,959,084号、及び同第7,235,641号、同第7,183,076号、米国特許出願公開第20080219980号及び国際公開第2010/115589号、同第2013150043号及び同第2012118903号に開示されており、いずれも本明細書に完全に組み込まれ、そして、例えば、化学的架橋(Brennan,et al.,Science 229,81(1985);Raso,et al.,J.BioI.Chern.272,27623(1997))、ジスルフィド交換、ハイブリッド−ハイブリドーマの産生(クアドローマ(quadromas))、転写及び翻訳によって二重特異性抗体を具体化する単一のポリペプチド鎖を生成するもの、又は転写及び翻訳によって共有結合して二重特異性抗体を生成することができる複数のポリペプチド鎖を生成するものが挙げられる。企図される二重特異性抗体はまた、完全に化学合成によって作製することができる。
2つ以上の原子価を有する抗体もまた企図される。
他の特定の実施形態によれば、抗体は多重特異性抗体である。
特定の実施形態によれば、抗体は、コンジュゲート抗体(すなわち、2つの共有結合した抗体から構成される抗体)である。
抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。
特定の実施形態によれば、抗体はモノクローナル抗体である。
特定の実施形態によれば、抗体はポリクローナル抗体である。
ポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びにそれらのフラグメントを産生する方法は、当技術分野で周知である(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988を参照されたい)。
本発明のいくつかの実施形態による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解加水分解によって、又はフラグメントをコードするDNAのE.coli若しくは哺乳動物細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養又は他のタンパク質発現系)での発現によって調製することができる。抗体フラグメントは、従来の方法による抗体全体のペプシン又はパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントは、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって生成されて、F(ab’)2で示される5Sフラグメントを提供することができる。このフラグメントは、チオール還元剤、及び任意にジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のブロッキング基を使用してさらに切断され、3.5S Fab’一価フラグメントを生成することができる。あるいは、ペプシンを使用した酵素的切断により、2つの一価Fab’フラグメント及びFcフラグメントが直接生成される。これらの方法は、例えば、Goldenberg、米国特許第4,036,945号及び同第4,331,647号、並びにそこに含まれる参考文献によって記載されており、これらの特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Porter,R.R.[Biochem.J.73:119−126(1959)]も参照されたい。一価の軽重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、又は他の酵素的、化学的若しくは遺伝的技術等の抗体を切断する他の方法も、無傷の抗体によって認識されるフラグメントが抗原に結合する限り、使用され得る。
Fvフラグメントは、VH鎖及びVL鎖の会合を含む。Inbar et al.[Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 69:2659−62(19720]に記載されているように、この会合は非共有的であり得る。あるいは、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって連結されるか、又はグルタルアルデヒド等の化学物質によって架橋され得る。好ましくは、Fvフラグメントは、ペプチドリンカーによって接続されたVH及びVL鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質(sFv)は、オリゴヌクレオチドによって接続されたVH及びVLドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、その後、E.coli等の宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを含む単一のポリペプチド鎖を合成する。sFvを生成するための方法は、例えば、[Whitlow and Filpula,Methods 2:97−105(1991);Bird et al.,Science 242:423−426(1988);Pack et al.,Bio/Technology 11:1271−77(1993);及び米国特許第4,946,778号によって記載され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドである。CDRペプチド(「最小認識ユニット」)は、目的の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって取得できる。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製される。例えば、Larrick and Fry[Methods,2:106−10(1991)]を参照されたい。
ヒトの治療又は診断のために、ヒト化抗体が好ましく使用されることが理解されるであろう。
特定の実施形態によれば、抗体はヒト化抗体である。非ヒト(例えば、マウス)抗体のヒト化形態は、免疫グロブリンのキメラ分子、免疫グロブリン鎖、又は非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むそれらのフラグメント(Fv、Fab、Fab’、F(ab’).sub.2、又は抗体の他の抗原結合サブシーケンス等)である。ヒト化抗体には、残基がレシピエントの相補性決定領域(CDR)を形成するヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)が含まれ、これが所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギ等の非ヒト種(ドナー抗体)のCDRからの残基によって置き換えられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基が対応する非ヒト残基に置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、インポートされたCDR又はフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、CDR領域のすべて又は実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンの領域及びFR領域のすべて又は実質的にすべてに対応し、これらは、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのFcの少なくとも一部を含むであろう[Jones et al.,Nature,321:522−525(1986);Riechmann et al.,Nature,332:323−329(1988);及びPresta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593−596(1992)].
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野でよく知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された1つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしばインポート残基と呼ばれ、通常、インポート可変ドメインから取得される。ヒト化は、基本的には、げっ歯類のCDR又はCDR配列をヒト抗体の対応する配列に置き換えることによる、Winterらの方法に従って実行することができる[Jones et al.,Nature,321:522−525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323−327(1988);Verhoeyen et al.,Science,239:1534−1536(1988)]。したがって、そのようなヒト化抗体はキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)であり、無傷のヒト可変ドメインよりも実質的に少ないものが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は通常、いくつかのCDR残基及びおそらくいくつかのFR残基がげっ歯類抗体の類似部位からの残基で置換されているヒト抗体である。
別の実施形態によれば、枯渇は、マクロファージとのシグナル通信を防ぐために、好塩基球の活性を枯渇させることによってもたらされる。
特定の実施形態によれば、そのような活性は、IL6、IL13及び/又はHGFのものである。
これらの分子のいずれかの活性の阻害は、これらのリガンドに対する抗体、又はこれらのリガンドに結合してそれらの機能を妨げる「デコイ」とも呼ばれる可溶性受容体を使用して行うことができる。
典型的には、そのような可溶性受容体は、受容体分子の細胞外部分を含み、膜貫通ドメイン(複数の場合がある)及び細胞質ドメイン(複数の場合がある)を欠いている。
HGFの受容体はc−Met受容体である。
IL6の受容体は、CD126としても知られるインターロイキン6受容体(IL6R)である。
IL13の受容体はインターロイキン13受容体である。
c−MET、IL6R及びIL13Rの小分子阻害剤は当技術分野で周知であり、いくつかはすでに臨床使用されている。c−Met阻害剤の例には、クラスI及びクラスIIのATP競合性小分子c−Met阻害剤、例えば、JNJ−38877605、PF−04217903、XL880、フォレチニブ及びAMG458と並んで、チバンチニブ(ARQ197)等のATP−非競合的小分子c−Met阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。IL6R阻害剤(例えば、抗体、トシリズマブ、サリルマブ)、IL6の小分子阻害剤の例は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2013019690号に教示されている。IL13R阻害剤の例はASLAN004である。
特定の組織への特異性を確保するために(必要な場合)、薬剤は、例えば組織マーカーに向けられるか、又は例えば肺活動のために、例えば鼻腔内投与のために局所的に投与される特定の送達ビヒクルを伴うことができる。投与方法は以下に記載されている。
本明細書で使用される場合、「枯渇」は、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上、さらには所望の細胞のFACSによって決定される完全な除去を指し、それらの細胞は肺表現型の好塩基球又はM2マクロファージである。
RNAの発現レベルを検出する方法
RNAの発現レベルを検出する方法
本発明のいくつかの実施形態の細胞におけるRNAの発現レベルは、当技術分野で知られている方法を使用して決定することができる。
ノーザンブロット分析:この方法は、RNA混合物中の特定のRNAを検出することを含む。RNAサンプルは、塩基対間の水素結合を防ぐ薬剤(ホルムアルデヒド等)で処理することにより変性され、すべてのRNA分子が折りたたまれていない線形コンフォメーションを持つようにする。次に、個々のRNA分子を、ゲル電気泳動によってサイズに応じて分離し、変性RNAが付着するニトロセルロース又はナイロンベースのメンブレンに転写する。次に、メンブレンを標識DNAプローブに曝露する。プローブは、放射性同位元素又は酵素結合ヌクレオチドを使用して標識することができる。検出には、オートラジオグラフィー、比色反応、又は化学発光を使用できる。この方法により、特定のRNA分子の量の定量、及び電気泳動中のゲル内の移動距離を示す膜上の相対位置によるその同一性の決定の両方が可能になる。
RT−PCR分析:この方法では、比較的まれなRNA分子のPCR増幅を使用する。まず、RNA分子を細胞から精製し、逆転写酵素(MMLV−RT等)、及びオリゴdT、ランダムヘキサマー又は遺伝子特異的プライマー等のプライマーを使用して相補DNA(cDNA)に変換する。次に、遺伝子特異的プライマー及びTaq DNAポリメラーゼを適用することにより、PCR増幅反応がPCR機器で実行される。当業者は、特定のRNA分子を検出するのに適した遺伝子特異的プライマーの長さ及び配列、並びにPCR条件(すなわち、アニーリング温度、サイクル数等)を選択することができる。PCRサイクルの数を調整し、増幅産物を既知の対照と比較することにより、半定量的RT−PCR反応を使用できることが理解されよう。
RNA in situハイブリダイゼーション染色:この方法では、DNA又はRNAプローブが細胞内に存在するRNA分子に付着する。一般に、細胞を最初に顕微鏡スライドに固定して細胞構造を維持し、RNA分子が分解されるのを防ぎ、次に標識プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーに供される。ハイブリダイゼーションバッファーは、プローブの非特異的結合を回避しながら、in situでそれらの標的mRNA分子とのDNA又はRNAプローブの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするホルムアミド及び塩(例えば、塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウム)等の試薬を含む。当業者は、特定のプローブ及び細胞のタイプに合わせて、ハイブリダイゼーション条件(すなわち、温度、塩及びホルムアミドの濃度等)を調整することができる。ハイブリダイゼーションに続いて、結合していないプローブを洗い流し、結合したプローブを既知の方法を使用して検出する。例えば、放射性標識プローブが使用される場合であれば、スライドは、放射性標識プローブを使用して生成されたシグナルを明らかにする写真乳剤に供される。プローブが酵素で標識されている場合であれば、比色反応を形成するために酵素特異的基質が追加される。プローブが蛍光標識を使用して標識されている場合であれば、結合したプローブは蛍光顕微鏡を使用して明らかにされる。プローブがタグ(例えば、ジゴキシゲニン、ビオチン等)を使用して標識されている場合であれば、結合したプローブは、既知の方法を使用して検出できるタグ特異的抗体との相互作用に続いて検出することができる。
In situ RT−PCR染色:この方法は、Nuovo GJ,et al.[Intracellular localization of polymerase chain reaction(PCR)−amplified hepatitis C cDNA.Am J Surg Pathol.1993,17:683−90]、及びKomminoth P,et al.[Evaluation of methods for hepatitis C virus detection in archival liver biopsies.Comparison of histology,immunohistochemistry,in situ hybridization,reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT−PCR)and in situ RT−PCR.Pathol Res Pract.1994,190:1017−25]に記載されている。簡単に説明すると、RT−PCR反応は、標識ヌクレオチドをPCR反応に組み込むことにより、固定した細胞に対して実施される。反応は、Arcturus Engineering(カリフォルニア州マウンテンビュー)から入手可能なレーザーキャプチャーマイクロダイセクションPixCell I LCMシステム等の特定のin situ RT−PCR装置を使用して行われる。
タンパク質の発現及び/又は活性を検出する方法
タンパク質の発現及び/又は活性を検出する方法
本発明のいくつかの実施形態の培養物の細胞において発現されるタンパク質の発現及び/又は活性レベルは、当技術分野で知られている方法を使用して決定され得る。
酵素免疫測定法(ELISA):この方法は、タンパク質基質を含むサンプル(固定細胞やタンパク質溶液等)をマイクロタイタープレートのウェル等の表面に固定することを含む。酵素に結合した基質特異的抗体が適用され、基質に結合することができる。次に、抗体の存在は、抗体に結合した酵素を使用する比色反応によって検出及び定量化される。この方法で一般的に使用される酵素には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼが含まれる。適切に較正され、応答の線形範囲内にある場合、サンプルに存在する基質の量は、生成される色の量に比例する。基質標準は、一般的に定量精度を向上させるために使用される。
ウエスタンブロット:この方法は、アクリルアミドゲルを使用して基質を他のタンパク質から分離した後、基質をメンブレン(ナイロン又はPVDF等)に転写することを含む。次に、基質の存在を、基質に特異的な抗体によって検出し、次いで抗体結合試薬によって検出する。抗体結合試薬は、例えば、プロテインA又は他の抗体であり得る。抗体結合試薬は、上記のように放射性標識又は酵素結合され得る。検出は、オートラジオグラフィー、比色反応、又は化学発光によるものであり得る。この方法により、基質の定量、及び電気泳動中のゲル内の移動距離を示す膜上の相対位置によるその同一性の決定の両方が可能になる。
ラジオイムノアッセイ(RIA):あるバージョンでは、この方法は、アガロースビーズ等の沈殿可能な担体上に固定化された特異的抗体及び放射性標識抗体結合タンパク質(例えば、I125で標識されたプロテインA)を用いて、目的のタンパク質(すなわち、基質)を沈殿させることを含む。沈殿したペレットのカウント数は、基質の量に比例する。
RIAの代替バージョンでは、標識された基質及び標識されていない抗体結合タンパク質が使用される。未知の量の基質を含むサンプルがさまざまな量で追加される。標識された基質からの沈殿数の減少は、添加されたサンプル中の基質の量に比例する。
蛍光活性化細胞ソーティング(FACS):この方法は、基質特異的抗体による細胞内での基質のin situ検出を含む。基質特異的抗体はフルオロフォアに結合している。検出は、各細胞が光線を通過するときに放出される光の波長を読み取る細胞選別機によって行われる。この方法は、2つ以上の抗体を同時に使用することができる。
免疫組織化学的分析:この方法は、基質特異的抗体による固定細胞における基質のin situ検出を含む。基質特異的抗体は、酵素結合又はフルオロフォアに結合され得る。検出を、顕微鏡検査、及び主観的な又は自動の評価によって行う。酵素結合抗体を使用する場合は、比色反応が必要になる場合がある。免疫組織化学の後に、例えばヘマトキシリン又はギムザ染色を使用した細胞核の対比染色がしばしば続くことが理解されよう。
本明細書に記載の方法のいずれかによって得られるex−vivo又はin−vitroの細胞又は細胞集団もまた、本発明のいくつかの実施形態により企図される。本発明のいくつかの実施形態に従って得られた細胞集団は、生理学的環境で見られるものよりも高い純度のレベルを特徴とする(例えば、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上の細胞が、例えば好塩基球、又はそこから分化した細胞若しくはマクロファージ等の目的の細胞である)。
述べたように、記載された方法のいずれも、ex−vivo又はin−vivoで実施することができる。
M1マクロファージとM2マクロファージのバランスを調整する能力により、本発明の教示を治療に活かすことができる。
したがって、本発明の一態様によれば、それを必要とする対象において、M2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法が提供され、該方法は、
(a)IL33及び/又はGM−SCFの存在下で好塩基球を培養すること、並びに
(b)培養後、治療有効量の好塩基球を対象に投与し、
それにより、対象においてM2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療すること、を含む。
(a)IL33及び/又はGM−SCFの存在下で好塩基球を培養すること、並びに
(b)培養後、治療有効量の好塩基球を対象に投与し、
それにより、対象においてM2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療すること、を含む。
別の態様によれれば、それを必要としている対象において、M2/M1マクロファージ比を増加することから利益を得ることができる疾患又は障害の治療において使用するための、IL33及び/又はGM−SCFの存在下で培養することによって生成された治療有効量の好塩基球が提供される。
別の態様によれば、それを必要とする対象において、M2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法であって、IL6、IL13、及びHGFからなる群から選択される治療有効量のシグナル伝達分子を対象に投与し、それにより、対象のM2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療すること、を含む、方法が提供される。
別の態様によれば、対象においてM2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害の治療に使用するための、IL6、IL13及びHGFからなる群から選択される治療有効量のシグナル伝達分子が提供される。
本明細書で使用される場合、「対象」は、M1/M2マクロファージ比の増加から利益を得ることができる疾患若しくは障害、又はM2/M1マクロファージ比の増加から利益を得ることができる疾患若しくは障害に苦しむ対象を指す。あるいは、対象はそのような疾患又は障害を発症するリスクがある。
好塩基球を投与する場合、細胞は自家、非自家、同種、同系、又は異種(必要に応じて適切な免疫抑制を伴う)であり得る。
本明細書で使用される「M2/M1マクロファージ比の増加から利益を得ることができる疾患又は障害」は、炎症誘発性サイトカインの分泌によって証明されるような免疫系を抑制することによって改善することができる疾患又は障害(全体としての病状)を指す。
これには通常、炎症、自己免疫、又は傷害が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「炎症性疾患」という用語は、サイトカイン、ケモカイン又は炎症性細胞(例えばマクロファージ)の活性によって部分的に媒介される、病原体、損傷細胞、身体的損傷又は刺激物等の有害な刺激に対する急性又は慢性の限局性又は全身性応答を指し、ほとんどの場合、痛み、発赤、腫れ、及び組織機能の障害を特徴とする。炎症性疾患は、敗血症(sepsis)、敗血症(septicemia)、肺炎、敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群(SIRS)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性肺損傷、誤嚥性肺炎、感染症、膵炎、細菌血症、腹膜炎、腹部膿瘍、外傷による炎症、手術による炎症、慢性炎症性疾患、虚血、臓器又は組織の虚血再灌流障害、疾患による組織損傷、化学療法又は放射線療法による組織損傷、及び摂取、吸入、注入、注射又は送達された物質に対する反応、糸球体腎炎、腸感染症、日和見感染症、並びに大規模な手術又は透析を受けている対象、免疫不全の対象、免疫抑制剤を摂取している対象、HIV/AIDSの対象、心内膜炎が疑われる対象、発熱のある対象、原因不明の発熱のある対象、嚢胞性線維症、糖尿病の対象、慢性腎不全の対象、気管支拡張症の対象、慢性閉塞性肺疾患の対象、慢性気管支炎、気腫又は喘息の対象、熱性好中球減少症の対象、髄膜炎の対象、敗血症性関節炎の対象、***症の対象、壊死性筋膜炎の対象、他のグループA連鎖球菌感染症の疑いのある対象、脾臓切除術を受けた対象、再発性又は腸球菌感染症の疑いのある対象、感染リスクの増加に関連する他の医学的及び外科的状態、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、髄膜炎菌血症、ポンプ後症候群(post−pump syndrome)、心臓スタン症候群、脳卒中、うっ血性心不全、肝炎、喉頭蓋炎(epiglotittis)、E.coli 0157:H7、マラリア、ガス壊疽、毒素性ショック症候群、子癇前症、子癇、HELP症候群、マイコバクテリアによる結核(mycobacterial tuberculosis)、カリニ性肺炎(Pneumocystic carinii)、肺炎、リーシュマニア症、溶血性***症候群/血栓性血小板減少性紫斑病、デング出血熱、骨盤炎症性疾患、レジオネラ、ライム病、インフルエンザA、エプスタイン−バーウイルス(pelvic inflammatory disease)、脳炎、炎症性疾患及び自己免疫疾患(関節リウマチ、骨関節炎、進行性全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、特発性肺線維症、サルコイドーシス、過敏性肺炎、全身性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、心臓、肝臓、肺腎臓骨髄を含む移植、移植片対宿主病、移植片拒絶、鎌状赤血球貧血、ネフローゼ症候群、OKT3等の薬剤の毒性、サイトカイン療法、クリオピリン関連周期熱症候群及び肝硬変を含む)からなる群から選択され得る。
本明細書で使用される場合、「自己免疫疾患」は、個体自身の組織から生じ、それを対象とする疾患又は障害である。自己免疫疾患の例としては、限定されるものではないが、アディソン病、アレルギー、円形脱毛症、アルツハイマー病、抗好中球細胞質抗体(ANCA)関連血管炎、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群(ヒューズ症候群)、関節炎、喘息、粥状動脈硬化、動脈硬化巣、自己免疫疾患(例えば、ループス、RA、MS、グレイブス病等)、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、無***症、ベーチェット病、バーガー病、水疱性類天疱瘡、心筋症、心血管疾患、セリアック病/コアリアック病、慢性疲労免疫機能障害症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIPD)、慢性再発性多発ニューロパチー(ギラン−バレ症候群)、チャーグ−ストラウス症候群(CSS)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症(CAD)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、CREST症候群、クローン病、皮膚炎、ヘルペス、皮膚筋炎、糖尿病、円盤状ループス、湿疹後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァン症候群、眼球突出(Exopthalmos)、線維筋痛症、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、免疫増殖性疾患又は障害(例えば、乾癬)、炎症性腸疾患(クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む)、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、間質性肺疾患、若年性糖尿病、若年性関節炎、若年性特発性関節炎(JIA)、川崎病、ランバート−イートン筋無力症候群、扁平苔癬、ループス、ループス腎炎、リンパ球性下垂体炎(Lymphoscytic Lypophisitis)、メニエール病/急性播種性脳脊髄神経根障害、混合性結合組織病、多発性硬化症(MS)、筋肉リウマチ、筋痛性脳脊髄炎(ME)、重症筋無力症、
眼の炎症、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発軟骨炎、多腺性症候群(Polyglandular Syndromes)(ウィタカー症候群)、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変/自己免疫性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群/反応性関節炎、再狭窄、リウマチ熱、リウマチ性疾患、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強皮症、シェーグレン症候群(Sjorgen’s Syndrome)、スティフ・マン症候群、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、全身性硬化症、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、甲状腺炎、1型糖尿病、2型糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
眼の炎症、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発軟骨炎、多腺性症候群(Polyglandular Syndromes)(ウィタカー症候群)、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変/自己免疫性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群/反応性関節炎、再狭窄、リウマチ熱、リウマチ性疾患、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強皮症、シェーグレン症候群(Sjorgen’s Syndrome)、スティフ・マン症候群、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、全身性硬化症、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、甲状腺炎、1型糖尿病、2型糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
本明細書で使用される「M1/M2マクロファージ比の増加から利益を得ることができる疾患又は障害」は、炎症誘発性サイトカインの分泌によって証明されるような免疫系を活性化することによって改善することができる疾患又は障害(全体としての病状)を指す。
そのようなものは、典型的には、癌、例えば、転移性癌、例えば特発性肺線維症(IPF)等の進行性線維性疾患、肝線維症、全身性硬化症、アレルギー及び喘息、アテローム性動脈硬化症及びアルツハイマー病、肺線維症、肝臓線維症が挙げられるが、これらに限定されない。特に、本発明の方法は、癌の治療に特に適している。本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、当技術分野でその一般的な意味を有し、固形腫瘍及び血液腫瘍(blood−borne tumors)を含むが、これらに限定されない。癌という用語には、皮膚、組織、臓器、骨、軟骨、血液及び血管の疾患が含まれる。「癌」という用語は、原発性癌及び転移性癌の両方をさらに包含する。本発明の方法及び組成物によって治療され得る癌の例としては、限定されるものではないが、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、***、結腸、食道、胃腸管、歯茎、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮に由来する癌細胞が挙げられる。加えて、癌は、これらに限定されるものではないが、具体的には以下の組織型であり得る:新生物、悪性;癌腫;癌腫、未分化;巨細胞及び紡錘細胞の癌;小細胞癌;乳頭癌;扁平上皮癌;リンパ上皮癌;基底細胞癌;毛母癌;移行上皮癌;乳頭状移行上皮癌;腺癌;ガストリノーマ、悪性;胆管癌;肝細胞癌;肝細胞癌と胆管癌の混合型;小柱腺癌;腺様嚢胞癌;腺腫性ポリープにおける腺癌;腺癌、家族性大腸腺腫症;固形癌;カルチノイド腫瘍、悪性;細気管支肺胞上皮腺癌;乳頭腺癌;色素嫌性癌;好酸性癌;好酸性腺癌;好塩基球癌;明細胞腺癌;顆粒細胞がん;濾胞腺癌;乳頭状及び濾胞性腺癌;非被包性硬化性;副腎皮質癌;子宮内膜癌;皮膚付属器癌;アポクリン腺癌;皮脂腺癌;耳垢;腺癌;粘表皮癌;嚢胞腺癌;乳頭状嚢胞腺癌;乳頭状漿液嚢胞腺癌;粘液性嚢胞腺癌;粘液性腺癌;印環細胞癌;浸潤性導管癌;髄様癌;小葉癌;炎症性癌;パジェット病、***;腺房細胞癌;腺扁平上皮癌;扁平上皮化生を伴う腺癌;胸腺腫、悪性;卵巣間質腫、悪性;莢膜細胞腫、悪性;顆粒膜細胞腫、悪性;アンドロブラストーマ、悪性;セルトリ細胞腫;ライディッヒ細胞腫、悪性;脂質細胞腫瘍(lipid cell tumor)、悪性;パラガングリオーマ、悪性;***外パラガングリオーマ(extra−mammary paraganglioma)、悪性;褐色細胞腫;血管球血管肉腫;悪性黒色腫;無色素性メラノーマ;表在拡大型黒色腫;巨大色素性母斑における悪性黒色腫;類上皮細胞黒色腫;青色母斑、悪性;肉腫;線維肉腫;線維性組織球腫、悪性;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胚性横紋筋肉腫;胞巣状横紋筋肉腫;間質性肉腫;混合腫瘍、悪性;ミュラー混合腫瘍;腎芽腫;肝芽腫;癌肉腫;間葉腫、悪性;ブレンナー腫瘍、悪性;葉状腫瘍、悪性;滑膜肉腫;中皮腫、悪性;未分化胚細胞腫;胚性癌腫;テラトーマ、悪性;卵巣甲状腺腫、悪性;絨毛癌;中腎腫、悪性;血管肉腫;血管内皮腫、悪性;カポジ肉腫;血管周囲細胞腫、悪性;リンパ管肉腫;骨肉腫;傍骨骨肉腫;軟骨肉腫;軟骨芽細胞腫、悪性;間葉性軟骨肉腫;骨巨細胞腫;ユーイング肉腫;歯原性腫瘍、悪性;エナメル上皮歯牙肉腫;エナメル上皮腫、悪性;エナメル上皮線維肉腫;松果体腫、悪性;脊索腫;神経膠腫、悪性;上衣腫;星状細胞腫;原形質星状細胞腫;原線維性星細胞腫;星状芽細胞腫;膠芽腫;乏突起神経膠腫;乏突起膠芽細胞腫;原始神経外胚葉性;小脳肉腫;神経節芽細胞腫;神経芽細胞腫;網膜芽細胞腫;嗅覚神経腫瘍;髄膜腫、悪性;神経線維肉腫;神経鞘腫、悪性;顆粒細胞腫瘍、悪性;悪性リンパ腫;ホジキン病;ホジキンリンパ腫;側肉芽腫;悪性リンパ腫、小リンパ球性;悪性リンパ腫、大細胞、びまん性;悪性リンパ腫、濾胞性;菌状息肉症;その他の特定の非ホジキンリンパ腫;悪性組織球症;多発性骨髄腫;肥満細胞肉腫;免疫増殖性小腸疾患;白血病;リンパ性白血病;形質細胞性白血病;赤白血病;リンパ肉腫細胞白血病;骨髄性白血病;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球性白血病;肥満細胞白血病;巨核芽球性白血病;骨髄性肉腫;及び有毛細胞白血病。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、骨への転移性癌の治療に特に適しており、転移性癌は、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、白血病及びリンパ腫を含む血球悪性腫瘍;頭頸部癌;食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管又は胆嚢の癌を含む消化管癌;卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌、及び子宮頸癌を含む女性生殖器の悪性腫瘍;膀胱癌;神経芽細胞腫を含む脳腫瘍;肉腫、骨肉腫;並びに悪性黒色腫又は扁平上皮癌を含む皮膚癌である。
本発明のいくつかの実施形態の細胞又は薬剤(例えば、サイトカイン、成長因子、抗体)は、生物自体に、又は適切な担体又は賦形剤と混合される医薬組成物で投与することができる。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、生理学的に適切な担体及び賦形剤等の他の化学成分を用いた、本明細書に記載の活性成分の1つ以上の調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
本明細書において、「有効成分」という用語は、生物学的効果に関与する細胞又は薬剤(例えば、サイトカイン、成長因子、抗体)を指す。
以下、同じ意味で使用され得る「生理学的に許容可能な担体」及び「薬学的に許容可能な担体」という句は、生物に重大な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性及び特性を無効にしない担体又は希釈剤を指す。これらの句にはアジュバントが含まれる。
本明細書では、「賦形剤」という用語は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖及び様々な種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、並びにポリエチレングリコールが挙げられる。
薬物の処方及び投与のための技術は、“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,PAの最新版に見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。
適切な投与経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸、又は筋肉内、皮下及び髄内注射を含む、非経口送達と並んで、くも膜下腔内、直接心室内、心臓内、例えば、右心室若しくは左心室腔、一般的な冠状動脈内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内の注射を含み得る。
中枢神経系(CNS)への薬物送達のための従来のアプローチとしては以下が挙げられる:脳神経外科戦略(例えば、脳内注射又は脳室内注入);BBBの内因性輸送経路の1つを利用する試みにおける、薬剤の分子操作(例えば、それ自体がBBBを通過することができない薬剤と組み合わせて内皮細胞表面分子に親和性を有する輸送ペプチドを含むキメラ融合タンパク質の産生);薬剤の脂溶性を高めるように設計された薬理学的戦略(例えば、水溶性薬剤の脂質又はコレステロール担体への複合化);及び高浸透圧破壊によるBBBの完全性の一時的な破壊(頸動脈へのマンニトール溶液の注入又はアンギオテンシンペプチド等の生物学的に活性な薬剤の使用に起因する)。しかしながら、これらの戦略のそれぞれには、侵襲的外科手術に関連する固有のリスク、内因性輸送システムに固有の制限によって課されるサイズ制限、中枢神経系の外側で活動する可能性のあるキャリアモチーフで構成されるキメラ分子の全身投与に関連する潜在的に望ましくない生物学的副作用、及びBBBが破壊されている脳の領域内での脳損傷のリスクの可能性等の制限があり、これらは最適ではない送達方法となる。
あるいは、例えば、医薬組成物を患者の組織領域に直接注射することにより、全身的ではなく局所的な方法で医薬組成物を投与することができる。特定の実施形態によれば、局所治療は、鼻腔内投与等による肺への治療である。
本明細書に記載の肺投与細胞又は薬剤。
肺投与は、当業者に知られている適切な手段によって達成することができる。典型的には、肺投与は、吸入中に、送達デバイスから対象の口腔への生物学的活性物質の分配を必要とする。例えば、細胞又は薬剤を含む組成物は、使用される送達デバイスに応じて、医薬組成物の水性若しくは非水溶液又は懸濁液形態、あるいは固体又は乾燥粉末形態から得られるエアロゾル又は他の適切な調製物の吸入を介して投与される。そのような送達デバイスは当技術分野で周知であり、ネブライザー、定量吸入器、及び乾燥粉末吸入器、あるいは懸濁液又は固体若しくは乾燥粉末の形として医薬組成物を水溶液又は非水溶液として分配することを可能にする任意の他の適切な送達機構を含むが、これらに限定されない。中枢及び/又は末梢肺領域への直接送達を含む、肺投与を介して対象に細胞又は薬剤を送達するための方法には、乾燥粉末吸入器(DPI)、定量吸入器(MDI)デバイス、及びネブライザーが含まれるが、これらに限定されない。
「組織」という用語は、1つ以上の機能を実施するように設計された細胞からなる生物の一部を指す。例としては、限定されるものではないが、脳組織、網膜、皮膚組織、肝組織、膵臓組織、骨、軟骨、結合組織、血液組織、筋肉組織、心臓組織、脳組織、血管組織、腎組織、肺組織、性腺組織、造血組織が挙げられる。
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、当技術分野で周知のプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠形成、研和(levigating)、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥のプロセスによって製造され得る。
そのため、本発明のいくつかの実施形態に従って使用するための医薬組成物は、有効成分を薬学的に使用できる調製物に加工することを容易にする賦形剤及び助剤を含む1つ以上の生理学的に許容可能な担体を使用して従来の方法で製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路によって異なる。
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水等の生理学的に適合性のあるバッファーにおいて製剤化され得る。経粘膜投与では、浸透するバリアに適した浸透剤を製剤化において使用する。そのような浸透剤は、当技術分野で一般的に知られている。
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物を当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化され得る。そのような担体は、患者による経口摂取のために、医薬組成物を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方することを可能にする。経口使用のための薬理学的調製物は、固体賦形剤を使用して作製でき、任意に、得られた混合物を粉砕し、必要に応じて適切な助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して、錠剤又は糖衣錠コアを得ることができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖;例えば、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロース等のセルロース調製物;及び/又はポリビニルピロリドン(PVP)等の生理学的に許容可能なポリマー等の充填剤である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、若しくはアルギン酸等の崩壊剤、又はアルギン酸ナトリウム等のそれらの塩を添加することができる。
糖衣錠コアには適切なコーティングが施されている。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物を任意に含み得る濃縮糖溶液を使用することができる。染料又は顔料は、識別のために、又は活性化合物の用量の異なる組み合わせを特徴づけるために、錠剤又は糖衣錠コーティングに添加され得る。
経口的に使用できる医薬組成物には、ゼラチンで作られたプッシュフィットカプセルと並んで、ゼラチン、及びグリセロール又はソルビトール等の可塑剤で作られた柔らかく密封されたカプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトース等の充填剤、デンプン等の結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、及び任意に安定剤と混合した有効成分を含み得る。ソフトカプセルでは、有効成分は、脂肪油、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコール等の適切な液体に溶解又は懸濁され得る。さらに、安定剤を加えることができる。経口投与用のすべての製剤は、選択した投与経路に適した投与量でなければならない。
頬側投与の場合、組成物は、従来の方法で処方された錠剤又はトローチの形態をとることができる。
経鼻吸入による投与の場合、本発明のいくつかの実施形態による使用のための有効成分は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン又は二酸化炭素を使用した、加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定することができる。ディスペンサーで使用するための例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジは、化合物の粉末混合物、及びラクトース又はデンプン等の適切な粉末ベースを含むように処方することができる。
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、ボーラス注射又は連続注入による非経口投与用に処方することができる。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルで、又は任意に防腐剤を添加した複数回投与容器で提示することができる。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳濁液であり得、そして懸濁剤、安定剤及び/又は分散剤等の配合剤を含み得る。
非経口投与用の医薬組成物には、水溶性形態の活性製剤の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁液は、適切な油性又は水ベースの注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグリセリド若しくはリポソーム等の合成脂肪酸エステルが含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストラン等の懸濁液の粘度を増加させる物質を含み得る。必要に応じて、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解度を増加させる適切な安定剤又は薬剤を含み得る。
あるいは、有効成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、無菌のパイロジェンフリーの水ベースの溶液により構成するための粉末形態であり得る。
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物はまた、例えば、カカオバター又は他のグリセリド等の従来の坐剤ベースを使用して、坐剤又は保持浣腸等の直腸組成物に処方され得る。
本発明のいくつかの実施形態の文脈での使用に適した医薬組成物には、有効成分が意図された目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物が含まれる。より具体的には、治療有効量とは、障害の症状を予防、緩和若しくは改善する(例えば、上記のように)、又は治療されている対象の生存を延長するのに有効な有効成分(細胞又は薬剤(例えば、サイトカイン、成長因子、抗体))の量を意味する。
治療有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らして、当業者の能力の範囲内である。
本発明の方法で使用される任意の調製物について、治療有効量又は用量は、最初にin vitro及び細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量は、所望の濃度又は力価を達成するために動物モデルで処方することができる。このような情報をヒトの有用な用量をより正確に決定するために使用できる。
本明細書に記載の有効成分の毒性及び治療効果は、in vitro、細胞培養又は実験動物における標準的な製薬手順によって決定することができる。これらのin vitro及び細胞培養アッセイ、並びに動物実験から得られたデータは、ヒトで使用するための投与量の範囲を策定する際に使用することができる。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて変化し得る。正確な処方、投与経路、及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる。(例えば、“The Pharmacological Basis of Therapeutics”,第1章第1頁のFingl,et al.,1975を参照)。
投与量及び間隔は、有効成分の有効(例えば、肺組織)レベルが生物学的効果(最小有効濃度、MEC)を誘導又は抑制するのに十分であるように個別に調整され得る。MECは調製ごとに異なるが、in vitroデータから推定できる。MECするために必要な投与量は、個々の特性及び経路によって異なる。血漿濃度を決定するために検出アッセイを使用することができる。
治療される状態の重症度及び応答性に応じて、投薬は、単回又は複数回の投与であり得、治療の過程は、数日から数週間、又は治癒がもたらされるか、若しくは病状の減少が達成されるまで続く。
投与される組成物の量は、もちろん、治療される対象、苦痛の重症度、投与の方法、処方する医師の判断等に依存するであろう。
本発明のいくつかの実施形態の組成物は、必要に応じて、有効成分を含む1つ以上の単位剤形を含み得る、FDA承認キット等のパック又はディスペンサーデバイスで提示され得る。パックは、例えば、ブリスターパック等の金属又はプラスチック箔を含み得る。パック又はディスペンサーデバイスには、投与手順が添付されている場合がある。パック又はディスペンサーは、医薬品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の容器に関連する通知によって適応させることもでき、この通知は、組成物、又はヒト若しくは動物用の投与の形態の機関による承認を反映している。このような通知は、例えば、処方薬について米国食品医薬品局によって承認されたラベル、又は承認された製品挿入物に関するものである可能性がある。適合性のある薬学的担体に処方された本発明の調製物を含む組成物もまた、調製され、適切な容器に入れられ、そして上でさらに詳述されるように、指定の状態の治療用に標識され得る。
「治療する」という用語は、病状(疾患、障害又は状態)の発症を阻害、予防若しくは阻止すること、及び/又は病状の軽減、寛解若しくは退行を引き起こすことを指す。当業者は、様々な方法論及びアッセイを使用して病状の進展を評価することができ、同様に、様々な方法論及びアッセイを使用して、病状の減少、寛解又は退行を評価できることを理解するであろう。
本明細書で使用される場合、「予防する」という用語は、疾患のリスクがある可能性があるが、まだ疾患を有すると診断されていない対象において、疾患、障害又は状態が発生しないようにすることを指す。
本明細書で使用される場合、「治療レジメン」という句は、治療のタイプ、投与量、スケジュール、及び/又はそれを必要とする対象(例えば、病態を診断された対象)に提供される治療の期間を指定する治療計画を指す。選択される治療レジメンは、最良の臨床転帰(例えば、病状の完全な治癒)をもたらすと予想される積極的なもの、又は病状の症状を軽減するが病状の不完全な治癒をもたらす可能性があるより穏やかなものであり得る。特定の場合において、より積極的な治療レジメンは、対象へのいくらかの不快感又は有害な副作用(例えば、健康な細胞又は組織への損傷)と関連し得ることが理解されるであろう。治療の種類には、外科的介入(例えば、病変、病変細胞、組織、又は臓器の除去)、細胞補充療法、局所モード又は全身モードの治療薬(例えば、受容体アゴニスト、アンタゴニスト、ホルモン、化学療法剤)の投与、外部ソース(例えば、外部ビーム)及び/又は内部ソース(例えば、密封小線源治療)及び/又はそれらの任意の組み合わせを使用する放射線療法への曝露が含まれ得る。治療の投与量、スケジュール及び期間は、病状の重症度及び選択された治療のタイプに応じて変化し得、当業者は、治療の投与量、スケジュール及び期間で治療のタイプを調整することができる。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、±10%を指す。
「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(includes)」、「含む(including)」、「有する(having)」という用語及びそれらの複合体は、「含むがこれらに限定されない」を意味する。
「からなる(consisting of)」という用語は、「含む、及び限定される」ことを意味する。
「本質的にからなる」という用語は、組成物、方法又は構造が追加の成分、工程及び/又は部品を含み得るが、追加の成分、工程及び/又は部品が特許請求の範囲の組成物、方法、若しくは構造の基本的及び新規の特性を実質的に変更しない場合に限り、を意味する。
本明細書で使用される場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の参照を含む。例えば、「化合物」又は「少なくとも1つの化合物」という用語は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
本出願を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能なサブレンジを具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、1〜6等の範囲の記述は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等と並んで、その範囲内の個々の番号、例えば1、2、3、4、5、及び6等のサブレンジを具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
本明細書で数値範囲が示されるときはいつでも、示された範囲内の引用された数字(分数又は整数)を含むことを意味する。第1の表示番号と第2の表示番号との間の「範囲/その間の範囲」及び第1の表示番号から第2の表示番号までの「範囲/その範囲」という句は、本明細書では同じ意味で使用され、第1及び第2の表示番号、並びにそれらの間のすべての分数及び整数を含むことを意味する。
本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、所与のタスクを達成するための様式、手段、手法及び手順を指し、限定されるものではないが、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の専門家に知られているか、又は彼らによって既知の様式、手段、手法及び手順から容易に開発されるそれらの様式、手段、手法及び手順を含む。
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、状態の進行を無効にする、実質的に阻害する、遅らせる若しくは逆転させる、状態の臨床的若しくは審美的症状を実質的に改善する、又は状態の臨床的若しくは審美的症状の出現を実質的に防止することを含む。
特定の配列表を参照する場合、そのような参照は、例えば、配列決定エラー、クローニングエラー、又は塩基置換、塩基欠失若しくは塩基付加をもたらす他の変更に起因するマイナーな配列変異を含むものとして、その相補的配列に実質的に対応する配列も包含すると理解されるものとするが、ただし、そのような変異の頻度は、50ヌクレオチドに1未満、あるいは100ヌクレオチドに1未満、あるいは200ヌクレオチドに1未満、あるいは500ヌクレオチドに1未満、あるいは、1000ヌクレオチドに1未満、あるいは5,000ヌクレオチドに1未満、あるいは10,000ヌクレオチドに1未満である。
明確にするために、別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴もまた、単一の実施形態で組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴はまた、別個に、又は任意の適切なサブコンビネーションで、又は本発明の他の任意の説明された実施形態に適したものとして提供され得る。様々な実施形態の文脈で説明される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは動作しない場合を除いて、それらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。
上記に描写され、以下の特許請求の範囲に記載されている本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例において実験的裏付けを見出す。
ここで、以下の実施例を参照すれば、これらの実施例は、上記の説明と共に、本発明のいくつかの実施形態を非限定的な方法で示している。
一般に、本明細書で使用される命名法及び本発明で利用される実験手順には、分子的、生化学的、微生物学的及び組換えDNA技術が含まれる。このような手法は、文献で詳しく説明されている。例えば、“Molecular Cloning:A laboratory Manual”Sambrook et al.,(1989);“Current Protocols in Molecular Biology”Volumes I−III Ausubel,R.M.,ed.(1994);Ausubel et al.,“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,“A Practical Guide to Molecular Cloning”,John Wiley&Sons,New York(1988);Watson et al.,“Recombinant DNA”,Scientific American Books,New York;Birren et al.(eds)“Genome Analysis:A Laboratory Manual Series”,Vols.1−4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998);米国特許第4,666,828号、同第4,683,202号、同第4,801,531号、同第5,192,659号、及び同第5,272,057号に記載される方法論;“Cell Biology:A Laboratory Handbook”,Volumes I−III Cellis,J.E.,ed.(1994);“Culture of Animal Cells−A Manual of Basic Technique”by Freshney,Wiley−Liss,N.Y.(1994),Third Edition;“Current Protocols in Immunology“Volumes I−III Coligan J.E.,ed.(1994);Stites et al.(eds),”Basic and Clinical Immunology“(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);Mishell and Shiigi(eds),“Selected Methods in Cellular Immunology”,W.H.Freeman and Co.,New York(1980);利用可能な免疫アッセイは、特許及び科学文献に広範に記載さており、例えば、米国特許第3,791,932号、同第3,839,153号、同第3,850,752号、同第3,850,578号、同第3,853,987号、同第3,867,517号、同第3,879,262号、同第3,901,654号、同第3,935,074号、同第3,984,533号、同第3,996,345号、同第4,034,074号、同第4,098,876号、同第4,879,219号、同第5,011,771号、及び同第5,281,521号;“Oligonucleotide Synthesis”Gait,M.J.,ed.(1984);“Nucleic Acid Hybridization”Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985);“Transcription and Translation”Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1984);“Animal Cell Culture”Freshney,R.I.,ed.(1986);”Immobilized Cells and Enzymes“IRL Press,(1986);“A Practical Guide to Molecular Cloning“Perbal,B.,(1984)and“Methods in Enzymology” Vol.1−317,Academic Press;“PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications”,Academic Press,San Diego,CA(1990);Marshak et al.,”Strategies for Protein Purification and Characterization−A Laboratory Course Manual“CSHL Press(1996)を参照されたい。これらはすべて本明細書に完全に記載されているかのように参照することによって組み込まれる。その他の一般的な参照が、この文書全体で提供されている。その中の手順は当技術分野でよく知られていると考えられており、読者の便宜のために提供されている。そこに含まれるすべての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
材料及び方法
マウス
性別及び年齢を一致させたMcpt8−Cre+/−DTAfl/+及びMcpt8−Cre+/−DTA+/+同腹仔対照を使用した。YFPを発現するMcpt8−Cre(B6.129−Mcpt8tm1(Cre)Lksy/J)(Sullivan et al.,2011))及びDTA(B6.129P2−Gt(ROSA)26Sortm1(DTA)Lky/J)(Voehringer et al.,2008)マウスはスタンフォード大学のStephen Galliから提供され、元々はジャクソン研究所から入手されたものであった。Il1rl1−/−(Townsend et al.,2000)マウスは、ケンブリッジMRC分子生物学研究所のAndrew McKenzieから提供された。これらのマウスはすべて、特定病原体除去条件下でウィーン医科大学の動物施設で飼育及び維持された。すべての実験はオーストリアの法律に従って実施され、オーストリア連邦科学研究省(BMWFW−66.009/0146−WF/V/3b/2015)によって承認された。C57BL/6 WT妊娠、新生仔、成体マウスをHarlanから入手した。マウスをワイツマン科学研究所の動物繁殖センターにおいて特定病原体除去条件下で飼育した。すべての動物は、施設内動物管理使用委員会によって策定された規則に従って取り扱われた。
マウス
性別及び年齢を一致させたMcpt8−Cre+/−DTAfl/+及びMcpt8−Cre+/−DTA+/+同腹仔対照を使用した。YFPを発現するMcpt8−Cre(B6.129−Mcpt8tm1(Cre)Lksy/J)(Sullivan et al.,2011))及びDTA(B6.129P2−Gt(ROSA)26Sortm1(DTA)Lky/J)(Voehringer et al.,2008)マウスはスタンフォード大学のStephen Galliから提供され、元々はジャクソン研究所から入手されたものであった。Il1rl1−/−(Townsend et al.,2000)マウスは、ケンブリッジMRC分子生物学研究所のAndrew McKenzieから提供された。これらのマウスはすべて、特定病原体除去条件下でウィーン医科大学の動物施設で飼育及び維持された。すべての実験はオーストリアの法律に従って実施され、オーストリア連邦科学研究省(BMWFW−66.009/0146−WF/V/3b/2015)によって承認された。C57BL/6 WT妊娠、新生仔、成体マウスをHarlanから入手した。マウスをワイツマン科学研究所の動物繁殖センターにおいて特定病原体除去条件下で飼育した。すべての動物は、施設内動物管理使用委員会によって策定された規則に従って取り扱われた。
腫瘍細胞株
B16F10マウス黒色腫細胞を、10%FCS、100U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン、及び1mM l−グルタミン(Biological Industries)を添加したDMEMで維持した。細胞を、加湿した5%CO2雰囲気で37℃で培養した。
B16F10マウス黒色腫細胞を、10%FCS、100U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン、及び1mM l−グルタミン(Biological Industries)を添加したDMEMで維持した。細胞を、加湿した5%CO2雰囲気で37℃で培養した。
方法の詳細
肺の解離及び単一細胞ソーティング
単一細胞実験を、E12.5、E16.5、E18.5、及びE19.5のマウス胎児肺、並びにPNの1、6、7、10、16、30時間、2日及び7日の新生仔肺、また成体マウスの肺(8〜12週齢)に対して実施した。一般に、胚実験は1匹の同腹児のプールされた兄弟肺で行われた(E12.5では6つの肺がプールされ、E16.5、E18.5、E19.5では3つの肺がプールされ、PN時点では2つの肺がプールされ、成人の肺の場合、サンプルはプールされなかった)。胚は凍結した表面に置くことによって安楽死させたが、PN及び成体マウスは麻酔の過剰摂取によって犠牲にした。E12.5を除くすべての時点で、肺を解剖する前に、右心室から冷PBSを注射してマウスを灌流した。肺組織をマウスから解剖し、肺解離キット(Miltenyi Biotec)を使用して半分の組織をホモジナイズし、単一細胞プロトコルに適合させたため、酵素インキュベーションを15分間持続させた(8週間の成体マウスの場合、酵素消化は20分間持続させた)。以前に考証されているように(Treutlein et al.,2014)、肺の残りの半分を解離し、エラスターゼ(3U/ml、Worthington)及びDNase(0.33U/ml/Sigma−Adrich)を含むDMEM/F12培地(Sigma−Aldrich)を細胞に短時間添加し、37℃で15分間頻繁に攪拌しながらインキュベートした。次に、10%FBS、1U/mlペニシリン、及び1Umlストレプトマイシン(Biological Industries)を添加した等量のDMEM/F12を単細胞懸濁液に添加した。解離後、同じ肺の単細胞懸濁液をあわせ、400g、5分、4℃で遠心分離した。すべてのサンプルを70μmナイロンメッシュフィルターで濾過し、氷冷ソーティングバッファー(0.2mM EDTA pH8及び0.5%BSAを添加したPBS)に入れた。
肺の解離及び単一細胞ソーティング
単一細胞実験を、E12.5、E16.5、E18.5、及びE19.5のマウス胎児肺、並びにPNの1、6、7、10、16、30時間、2日及び7日の新生仔肺、また成体マウスの肺(8〜12週齢)に対して実施した。一般に、胚実験は1匹の同腹児のプールされた兄弟肺で行われた(E12.5では6つの肺がプールされ、E16.5、E18.5、E19.5では3つの肺がプールされ、PN時点では2つの肺がプールされ、成人の肺の場合、サンプルはプールされなかった)。胚は凍結した表面に置くことによって安楽死させたが、PN及び成体マウスは麻酔の過剰摂取によって犠牲にした。E12.5を除くすべての時点で、肺を解剖する前に、右心室から冷PBSを注射してマウスを灌流した。肺組織をマウスから解剖し、肺解離キット(Miltenyi Biotec)を使用して半分の組織をホモジナイズし、単一細胞プロトコルに適合させたため、酵素インキュベーションを15分間持続させた(8週間の成体マウスの場合、酵素消化は20分間持続させた)。以前に考証されているように(Treutlein et al.,2014)、肺の残りの半分を解離し、エラスターゼ(3U/ml、Worthington)及びDNase(0.33U/ml/Sigma−Adrich)を含むDMEM/F12培地(Sigma−Aldrich)を細胞に短時間添加し、37℃で15分間頻繁に攪拌しながらインキュベートした。次に、10%FBS、1U/mlペニシリン、及び1Umlストレプトマイシン(Biological Industries)を添加した等量のDMEM/F12を単細胞懸濁液に添加した。解離後、同じ肺の単細胞懸濁液をあわせ、400g、5分、4℃で遠心分離した。すべてのサンプルを70μmナイロンメッシュフィルターで濾過し、氷冷ソーティングバッファー(0.2mM EDTA pH8及び0.5%BSAを添加したPBS)に入れた。
肺解離プロトコルの較正のために、成体マウスの肺に由来する細胞に以下を添加した。1)リベラーゼ(50μg/ml、Sigma−Aldrich)及びDNase(1μg/ml、Roche)を含むDMEM(Biological Industries);2)コラゲナーゼIV(1mg/ml、Worthington)及びディスパーゼ(2.4U/ml、Sigma−Adrich)を含むPBS Ca+Mg+(Biological Industries);3)上記のように、エラスターゼ及びDNaseを含むDMEM/F12(Sigma−Aldrich);及び4)上記のように、肺解離キット(Miltenyi biotec)に由来する酵素。37℃で20分間頻繁に攪拌しながら酵素消化した後、10%FBS、1U/mlペニシリン、及び1Umlストレプトマイシン(Biological Industries)を添加した等量のDMEM、又はソーティングバッファーを、リベラーゼ及びコラゲナーゼ−ディスパーゼ処理からの単一細胞懸濁液にそれぞれ添加した。MARS−seq分析のために、ダブレット及び赤血球を除外した後、すべての生細胞を選別した。各解離技術によって抽出された細胞の単一細胞分析は、細胞型の異なる分布を示した(図示していない)。次に、本発明者らは、解離酵素に由来する特定の細胞型を優先することなく、免疫及び非免疫コンパートメントから広範囲の細胞集団を抽出する研究のために解離プロトコルを選択した。したがって、研究に沿った肺消化は、上皮細胞及びAMの抽出につながるエラスターゼ消化と、免疫コンパートメントからのさまざまな細胞集団の抽出につながるmiltenyiキットプロトコルの組み合わせであった。重要なことに、これらの消化は、コラゲナーゼ−−ディスパーゼ及びリベラーゼ処理後に本発明者らが見出した内皮優勢のような、どの細胞型の優先度でも特徴づけられなかったが(図示していない)、単一細胞マップで観察される細胞のパーセンテージは、さまざまな肺解離法に依存している(図1B、2B〜C)。
末梢血細胞の単離
末梢血細胞を20μlのヘパリンで懸濁し、0.2mM EDTA pH8及び0.5%BSAを添加したPBSで洗浄した。細胞をficoll−Paque(商標)PLUS(PBSと1:1の比率、Sigma−Adrich)で懸濁し、破壊も加速もせずに460g、20分、10℃で遠心分離した。単核細胞のリング状の層を新しいチューブに移し、冷PBSで2回洗浄し、400g、5分、4℃で遠心分離し、40μmメッシュフィルターを通過させた後、氷冷ソーティングバッファーに懸濁した。
末梢血細胞を20μlのヘパリンで懸濁し、0.2mM EDTA pH8及び0.5%BSAを添加したPBSで洗浄した。細胞をficoll−Paque(商標)PLUS(PBSと1:1の比率、Sigma−Adrich)で懸濁し、破壊も加速もせずに460g、20分、10℃で遠心分離した。単核細胞のリング状の層を新しいチューブに移し、冷PBSで2回洗浄し、400g、5分、4℃で遠心分離し、40μmメッシュフィルターを通過させた後、氷冷ソーティングバッファーに懸濁した。
腫瘍微小環境の解離
腫瘍微小環境から好塩基球を精製するために、1×106個の細胞を100μlのPBSに懸濁し、8週間のマウスに皮下(s.c.)注射した。固形腫瘍を注射の10日後に採取し、小片に切断し、DNase(12.5μg/ml、Sigma−Adrich)及びコラゲナーゼIV(1mg/ml、Worthington)を添加したRPMI−1640で懸濁した。GentleMacs組織ホモジナイザー(Miltenyi Biotec)で組織をホモジナイズし、37℃で10分間インキュベートした。機械的及び酵素的解離を2回行った後、細胞を洗浄し、赤血球溶解バッファー(Sigma−Aldrich)及びDNase(0.33U/ml、Sigma−Adrich)に懸濁し、室温で5分間インキュベートし、冷PBSで2回洗浄し、40μmメッシュフィルターを通過させ、400g、5分、4℃で遠心分離した後、氷冷ソーティングバッファーに再懸濁した。
腫瘍微小環境から好塩基球を精製するために、1×106個の細胞を100μlのPBSに懸濁し、8週間のマウスに皮下(s.c.)注射した。固形腫瘍を注射の10日後に採取し、小片に切断し、DNase(12.5μg/ml、Sigma−Adrich)及びコラゲナーゼIV(1mg/ml、Worthington)を添加したRPMI−1640で懸濁した。GentleMacs組織ホモジナイザー(Miltenyi Biotec)で組織をホモジナイズし、37℃で10分間インキュベートした。機械的及び酵素的解離を2回行った後、細胞を洗浄し、赤血球溶解バッファー(Sigma−Aldrich)及びDNase(0.33U/ml、Sigma−Adrich)に懸濁し、室温で5分間インキュベートし、冷PBSで2回洗浄し、40μmメッシュフィルターを通過させ、400g、5分、4℃で遠心分離した後、氷冷ソーティングバッファーに再懸濁した。
脾臓の解離
組織を8週齢の雌から採取し、アキュターゼ溶液(Sigma−Adrich)で懸濁し、GentleMacs組織ホモジナイザー(Miltenyi Biotec)でホモジナイズし、37℃で10分間頻繁に攪拌しながらインキュベートした。細胞を洗浄し、赤血球溶解バッファー(Sigma−Aldrich)及びDNase(0.33U/ml、Sigma−Adrich)に懸濁し、室温で3分間インキュベートし、冷PBSで2回洗浄し、40μmメッシュフィルターを通過させ、400g、5分、4℃で遠心分離した後、氷冷ソーティングバッファーに再懸濁した。
組織を8週齢の雌から採取し、アキュターゼ溶液(Sigma−Adrich)で懸濁し、GentleMacs組織ホモジナイザー(Miltenyi Biotec)でホモジナイズし、37℃で10分間頻繁に攪拌しながらインキュベートした。細胞を洗浄し、赤血球溶解バッファー(Sigma−Aldrich)及びDNase(0.33U/ml、Sigma−Adrich)に懸濁し、室温で3分間インキュベートし、冷PBSで2回洗浄し、40μmメッシュフィルターを通過させ、400g、5分、4℃で遠心分離した後、氷冷ソーティングバッファーに再懸濁した。
肝臓の解離
肝臓からの好塩基球を、Seglen(Seglen,1973)の2段階コラゲナーゼ灌流法を修正して単離した。消化工程を、製造業者の指示に従って、Liberase(20μg/ml;Roche Diagnostics)を使用して実行した。肝臓を細かく刻み、PBSで懸濁し、30g、5分、4℃で遠心分離した。上清を新しいチューブに集め(肝細胞を除去するため)、PBSで懸濁し、30g、5分、4℃で遠心分離した(この工程を2回繰り返した)。2回目の洗浄後、上清を新しいチューブに回収し、500g、5分、4℃で遠心分離し、氷冷ソーティングバッファーに再懸濁した。
肝臓からの好塩基球を、Seglen(Seglen,1973)の2段階コラゲナーゼ灌流法を修正して単離した。消化工程を、製造業者の指示に従って、Liberase(20μg/ml;Roche Diagnostics)を使用して実行した。肝臓を細かく刻み、PBSで懸濁し、30g、5分、4℃で遠心分離した。上清を新しいチューブに集め(肝細胞を除去するため)、PBSで懸濁し、30g、5分、4℃で遠心分離した(この工程を2回繰り返した)。2回目の洗浄後、上清を新しいチューブに回収し、500g、5分、4℃で遠心分離し、氷冷ソーティングバッファーに再懸濁した。
フローサイトメトリー及びソーティング
細胞集団を、SORP−aria(BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ)又はAriaFusion装置(BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ)により選別した。以下の抗体を使用してサンプルを染色した:eF780コンジュゲート固定可能生存性色素、eFluor450コンジュゲートTER−119、APCコンジュゲートCD45、FITCコンジュゲートCD117(cKit)、及びPerCPCy5.5コンジュゲートF4/80はeBioscienceから購入し、PerCP Cy5.5コンジュゲートFCεRa1(MAR1)、APC−Cy7コンジュゲートLy6G、FITCコンジュゲートCD3、PE−Cy7コンジュゲートCD19、PE−Cy7コンジュゲートCD31、APC−Cy7コンジュゲートCD326、APC/Cy7コンジュゲートTER−119、AF700コンジュゲートCD45、パシフィックブルーコンジュゲートCD49b、PEコンジュゲートFcer1a、PE/Cy7コンジュゲートCD117、FITCコンジュゲートLy6C、PEコンジュゲートCD11c、BV605コンジュゲートCD11b及びBV605コンジュゲートLy−6CはBiolegendから購入し、FITCコンジュゲートCD11CはBD−Pharmingenから購入した。
細胞集団を、SORP−aria(BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ)又はAriaFusion装置(BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ)により選別した。以下の抗体を使用してサンプルを染色した:eF780コンジュゲート固定可能生存性色素、eFluor450コンジュゲートTER−119、APCコンジュゲートCD45、FITCコンジュゲートCD117(cKit)、及びPerCPCy5.5コンジュゲートF4/80はeBioscienceから購入し、PerCP Cy5.5コンジュゲートFCεRa1(MAR1)、APC−Cy7コンジュゲートLy6G、FITCコンジュゲートCD3、PE−Cy7コンジュゲートCD19、PE−Cy7コンジュゲートCD31、APC−Cy7コンジュゲートCD326、APC/Cy7コンジュゲートTER−119、AF700コンジュゲートCD45、パシフィックブルーコンジュゲートCD49b、PEコンジュゲートFcer1a、PE/Cy7コンジュゲートCD117、FITCコンジュゲートLy6C、PEコンジュゲートCD11c、BV605コンジュゲートCD11b及びBV605コンジュゲートLy−6CはBiolegendから購入し、FITCコンジュゲートCD11CはBD−Pharmingenから購入した。
選別する前に、生/死細胞を評価するため細胞をDAPI又は固定可能な生存性色素で染色し、40μmメッシュで濾過した。全免疫細胞集団の選別では、サンプルはCD45+でゲートされ、全間質細胞の選別ではCD45−でゲートされ、好塩基球の分離では、ダブレット、死細胞と赤血球を除外した後、サンプルはCD45+FCεR1α+cKit−でゲートされた。各単一細胞のマーカーレベルを記録するために、FACS Diva 7の「インデックスソーティング」機能を単一細胞ソーティング中にアクティブ化した。単一細胞の配列決定及び分析に続いて、各表面マーカーをゲノムワイド発現プロファイルにリンクした。ゲーティング戦略を最適化するためにこの方法論を使用した。単離された生細胞を、2μLの溶解溶液及び単一細胞RNA−seq用のバーコード付きポリ(T)逆転写(RT)プライマーを含む384ウェル細胞捕捉プレートに単一細胞ソーティングした(Jaitin et al.,2014;Paul et al.,2015)。データ分析中、無細胞対照として、4つの空のウェルを各384ウェルプレートに保持した。選別後すぐに、各プレートをスピンダウンして細胞が溶解溶液に確実に浸るようにし、処理されるまで−80℃で保存した。
肺好塩基球によって発現される受容体のタンパク質レベルを評価するために、本発明者らは、PEコンジュゲートCD131(CSF2Rb、Miltenyi Biotec)、PE/Cy7コンジュゲートIL−33R(Biolegend)、及びPacificBlueコンジュゲートCD49b(Biolegend)の細胞表面染色を行った。肺好塩基球によって発現されるリガンドの細胞内タンパク質レベルを評価するために、細胞を、10%FCS、1mM l−グルタミン、100U/mlペニシリン、100mg/mlストレプトマイシン(Biological Industries)、及びGolgiStop(1:1000;IL−13の場合、BD bioscience、カリフォルニア州サンノゼ)又はBrefeldin A溶液(1:1000、IL−6の場合、Biolegend)を添加したRPMI−1640と共に、37℃で2時間インキュベートして、細胞内サイトカインの発現を可能にし、細胞外分泌を防止した。Cytofix/Cytopermキットを製造業者の指示(BD bioscience、カリフォルニア州サンノゼ)に従って使用して、細胞を洗浄、固定、透過処理し、表面及び細胞内タンパク質を染色した。細胞内実験では、次の抗体を使用した:PEコンジュゲートIL−6(Biolegend)、PEコンジュゲートIL−13(eBioscience)、及び対応するアイソタイプ対照PEコンジュゲートラットIgG1(Biolegend)。BD FACSDIVAソフトウェア(BD Bioscience)及びFlowJoソフトウェア(FlowJo、LLC)を使用して細胞を分析した。
BM由来細胞の培養
BM前駆細胞を8週齢のC57BL/6マウスから採取し、0.5×106細胞/mlの濃度で培養した。BM−MΦ分化のために、BM培養物をM−CSF(50ng/ml;Peprotech)の存在下で8日間培養した。8日目に、細胞を冷PBSでこすり取り、96ウェル平底組織培養プレートに16時間再播種した。BM由来の好塩基球を分化させるために、BM培養物をIL−3(30ng/ml;Peprotech)の存在下で10日間培養した。好塩基球を、CD117−集団(cKit;Miltenyi Biotec)の磁気活性化細胞ソーティングによって濃縮し、96ウェル平底組織培養プレートに16時間再播種した。すべてのBM培養を、10%FCS、1mM l−グルタミン、100U/mlペニシリン、100 mg/mlストレプトマイシン(Biological Industries)を添加した標準培地RPMI−1640で行った。4日ごとにBM培養物を分化因子M−CSF(50ng/ml)又はIL−3(30ng/ml)で処理した。BM由来細胞の再播種後、共培養及び単培養細胞を0.5×106細胞/ml(共培養では1:1の比率)の濃度で播種し、IL−3(10ng/ml)及び細胞生存のためのM−CSF(10ng/ml)、細胞活性化のためのIL33(50ng/ml;Peprotech)又はGM−CSF(50ng/ml;Peprotech)を添加した。
BM前駆細胞を8週齢のC57BL/6マウスから採取し、0.5×106細胞/mlの濃度で培養した。BM−MΦ分化のために、BM培養物をM−CSF(50ng/ml;Peprotech)の存在下で8日間培養した。8日目に、細胞を冷PBSでこすり取り、96ウェル平底組織培養プレートに16時間再播種した。BM由来の好塩基球を分化させるために、BM培養物をIL−3(30ng/ml;Peprotech)の存在下で10日間培養した。好塩基球を、CD117−集団(cKit;Miltenyi Biotec)の磁気活性化細胞ソーティングによって濃縮し、96ウェル平底組織培養プレートに16時間再播種した。すべてのBM培養を、10%FCS、1mM l−グルタミン、100U/mlペニシリン、100 mg/mlストレプトマイシン(Biological Industries)を添加した標準培地RPMI−1640で行った。4日ごとにBM培養物を分化因子M−CSF(50ng/ml)又はIL−3(30ng/ml)で処理した。BM由来細胞の再播種後、共培養及び単培養細胞を0.5×106細胞/ml(共培養では1:1の比率)の濃度で播種し、IL−3(10ng/ml)及び細胞生存のためのM−CSF(10ng/ml)、細胞活性化のためのIL33(50ng/ml;Peprotech)又はGM−CSF(50ng/ml;Peprotech)を添加した。
BM好塩基球と、肺由来の単球及び未分化マクロファージとの共培養では、本発明者らは、30時間PN肺からCD45+CD115+骨髄細胞を選別し、上記のようにin vitro実験を行った。
MARS−seqライブラリーの調製
単一細胞ライブラリーを以前に記載されたように調製した(Jaitin et al.,2014)。簡単に説明すると、細胞捕捉プレートに分類された細胞に由来するmRNAにバーコードを付け、cDNAに変換し、自動パイプラインを使用してプールした。次に、プールされたサンプルをT7 in vitro転写によって直線的に増幅し、ライゲーション、RT及びPCR中にサンプルにプールバーコード及びillumina配列をタグ付けすることにより、得られたRNAが断片化され、シーケンシング対応ライブラリーに変換される。細胞の各プールをライブラリーの品質について試験紙、濃度を前述のように評価する(Jaitin et al.,2014)。
単一細胞ライブラリーを以前に記載されたように調製した(Jaitin et al.,2014)。簡単に説明すると、細胞捕捉プレートに分類された細胞に由来するmRNAにバーコードを付け、cDNAに変換し、自動パイプラインを使用してプールした。次に、プールされたサンプルをT7 in vitro転写によって直線的に増幅し、ライゲーション、RT及びPCR中にサンプルにプールバーコード及びillumina配列をタグ付けすることにより、得られたRNAが断片化され、シーケンシング対応ライブラリーに変換される。細胞の各プールをライブラリーの品質について試験紙、濃度を前述のように評価する(Jaitin et al.,2014)。
肺に存在する好塩基球の枯渇
新生仔の肺における好塩基球の枯渇については、本発明者らは、以前の研究(Denzel et al.,2008;Guilliams et al.,2013)に基づいてプロトコルを較正した。マウスに7μlの100μg抗Fcεr1α(MAR1;eBioscience)又はIgGアイソタイプ対照(アルメニアハムスター、eBioscience)を、生後10時間及び15時間の2回注射した。肺を、出生後30時間で注射された新生仔から精製し、CD45+細胞をRNA−seq分析のために選別した。
新生仔の肺における好塩基球の枯渇については、本発明者らは、以前の研究(Denzel et al.,2008;Guilliams et al.,2013)に基づいてプロトコルを較正した。マウスに7μlの100μg抗Fcεr1α(MAR1;eBioscience)又はIgGアイソタイプ対照(アルメニアハムスター、eBioscience)を、生後10時間及び15時間の2回注射した。肺を、出生後30時間で注射された新生仔から精製し、CD45+細胞をRNA−seq分析のために選別した。
食作用アッセイ
食作用アッセイを、以前に記載されたように実施した(Sharif et al.,2014)。AMを気管支肺胞洗浄(BAL)によって分離した。簡単に説明すると、マウスの気管を露出させ、滅菌18ゲージベンフロン(BD Biosciences)でカニューレを挿入し、10mlの滅菌生理食塩水を0.5mlステップで注入した。回収されたBAL液(95%超AMを含む)の総細胞数を、Neubauerチャンバーを使用して数えた。細菌の食作用を評価するために、1〜2.5×105のAMを播種し、10%ウシ胎児血清(FCS)、1%ペニシリン及び1%ストレプトマイシンを含むRPMIに3時間付着させた。次に、AMをFITC標識熱不活化肺炎球菌(MOI 100)と共に37℃又は4℃で45分間インキュベートした(陰性対照として)。細胞を洗浄し、プロテイナーゼK(50μg/ml)と共に氷上で10分間インキュベートして、付着した細菌を除去した。細菌の取り込みをフローサイトメトリーによって評価し、食作用指数を(MFI×37℃での陽性細胞%)マイナス(MFI×4℃での陽性細胞%)として計算した。
食作用アッセイを、以前に記載されたように実施した(Sharif et al.,2014)。AMを気管支肺胞洗浄(BAL)によって分離した。簡単に説明すると、マウスの気管を露出させ、滅菌18ゲージベンフロン(BD Biosciences)でカニューレを挿入し、10mlの滅菌生理食塩水を0.5mlステップで注入した。回収されたBAL液(95%超AMを含む)の総細胞数を、Neubauerチャンバーを使用して数えた。細菌の食作用を評価するために、1〜2.5×105のAMを播種し、10%ウシ胎児血清(FCS)、1%ペニシリン及び1%ストレプトマイシンを含むRPMIに3時間付着させた。次に、AMをFITC標識熱不活化肺炎球菌(MOI 100)と共に37℃又は4℃で45分間インキュベートした(陰性対照として)。細胞を洗浄し、プロテイナーゼK(50μg/ml)と共に氷上で10分間インキュベートして、付着した細菌を除去した。細菌の取り込みをフローサイトメトリーによって評価し、食作用指数を(MFI×37℃での陽性細胞%)マイナス(MFI×4℃での陽性細胞%)として計算した。
一分子蛍光in situハイブリダイゼーション(smFISH)
7日齢の新生仔をPBSで灌流した。肺組織を採取し、4%パラホルムアルデヒド中4℃で3時間固定し、2%パラホルムアルデヒド中の30%スクロースで4℃で一晩インキュベートし、OCTに包埋した。ハイブリダイゼーションには凍結切片(6μm)を使用した。プローブライブラリーを、前述のように設計及び構築した(Itzkovitz et al.,2012、Stellaris Fish Probes番号SMF−1082−5、SMF−1063−5、SMF 1065−5)。一分子FISHプローブライブラリーは、長さ20bpsの48個のプローブで構成されていた。Il1rl1、Il33、及びMcpt8プローブのsmFISHプローブライブラリーは、それぞれCy3、AF594、及びcy5に連結された。ハイブリダイゼーションを30℃で一晩行った。核染色用のDAPI色素を洗浄中に追加した。画像を60倍及び100倍の油浸対物レンズを備えたNikon Ti−E倒立蛍光顕微鏡、並びにMetaMorphソフトウェア(Molecular Devices、ペンシルベニア州ダウニントン)を使用するPhotometrics Pixis 1024 CCDカメラで撮影した。smFISH分子を、細胞のDAPI染色内でのみ数えた。
7日齢の新生仔をPBSで灌流した。肺組織を採取し、4%パラホルムアルデヒド中4℃で3時間固定し、2%パラホルムアルデヒド中の30%スクロースで4℃で一晩インキュベートし、OCTに包埋した。ハイブリダイゼーションには凍結切片(6μm)を使用した。プローブライブラリーを、前述のように設計及び構築した(Itzkovitz et al.,2012、Stellaris Fish Probes番号SMF−1082−5、SMF−1063−5、SMF 1065−5)。一分子FISHプローブライブラリーは、長さ20bpsの48個のプローブで構成されていた。Il1rl1、Il33、及びMcpt8プローブのsmFISHプローブライブラリーは、それぞれCy3、AF594、及びcy5に連結された。ハイブリダイゼーションを30℃で一晩行った。核染色用のDAPI色素を洗浄中に追加した。画像を60倍及び100倍の油浸対物レンズを備えたNikon Ti−E倒立蛍光顕微鏡、並びにMetaMorphソフトウェア(Molecular Devices、ペンシルベニア州ダウニントン)を使用するPhotometrics Pixis 1024 CCDカメラで撮影した。smFISH分子を、細胞のDAPI染色内でのみ数えた。
組織学及び免疫組織化学
組織学的検査のために、パラフィン包埋肺切片を指定の時点で採取した。proSP−Cを染色するために、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチし、抗原を抗原アンマスキング溶液(Vector Laboratories、H−3300)で回収した。ロバ血清でブロッキングを行い、スライドを抗proSP−C(Abcam)で染色した後、二次ヤギ抗ウサギIgG抗体(Vector Laboratories)で染色し、Vectastain ELITEキット(Vector Laboratories)を使用してシグナル増幅を行った。F4/80染色では、プロテアーゼタイプXIV(SIGMA)を使用して抗原を回収した後、ウサギ血清でブロッキングし、ラット抗マウスF4/80 mAb(AbD Serotec)で染色した。二次ウサギ抗ラットIgG Ab(Vector Laboratories)を適用し、Vectastain ELITEキット(Vector Laboratories)でシグナルを増幅した。Mcpt8染色では、抗GFP Ab(Abcam)を使用し、続いて二次ビオチン化ウサギ−抗ヤギIgG Ab(Vector Laboratories)を使用した。検出には、ペルオキシダーゼ基質キット(Vector)又はVector VIPペルオキシダーゼキット(Vector Laboratories)を適用した。細胞構造をヘマトキシリン又はメチルグリーンで対比染色し、オリンパスFSX100顕微鏡で写真を撮影した。
組織学的検査のために、パラフィン包埋肺切片を指定の時点で採取した。proSP−Cを染色するために、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチし、抗原を抗原アンマスキング溶液(Vector Laboratories、H−3300)で回収した。ロバ血清でブロッキングを行い、スライドを抗proSP−C(Abcam)で染色した後、二次ヤギ抗ウサギIgG抗体(Vector Laboratories)で染色し、Vectastain ELITEキット(Vector Laboratories)を使用してシグナル増幅を行った。F4/80染色では、プロテアーゼタイプXIV(SIGMA)を使用して抗原を回収した後、ウサギ血清でブロッキングし、ラット抗マウスF4/80 mAb(AbD Serotec)で染色した。二次ウサギ抗ラットIgG Ab(Vector Laboratories)を適用し、Vectastain ELITEキット(Vector Laboratories)でシグナルを増幅した。Mcpt8染色では、抗GFP Ab(Abcam)を使用し、続いて二次ビオチン化ウサギ−抗ヤギIgG Ab(Vector Laboratories)を使用した。検出には、ペルオキシダーゼ基質キット(Vector)又はVector VIPペルオキシダーゼキット(Vector Laboratories)を適用した。細胞構造をヘマトキシリン又はメチルグリーンで対比染色し、オリンパスFSX100顕微鏡で写真を撮影した。
全肺葉分析のために、Zeiss Axio Imager.Z1顕微鏡(Carl Zeiss Inc.、ドイツ国イエナ)を備えたTissueFAXSイメージングシステム(TissueGnostics GmbH)を使用してスライドをスキャンした。画像をPCO PixelFlyカメラ(Zeiss)を使用して撮影した。
組織透徹
組織透徹プロトコルを、前述のように実施した(Fuzik et al.,2016)。要するに、指定の時点での肺を、PBSで1回灌流し、その後、PBS中の7.5%ホルムアルデヒドで灌流した。肺葉をPBS中の7.5%ホルムアルデヒドで室温で一晩固定した。CUBIC試薬1(25重量%尿素、25重量%N,N,N’,N’−テトラキス(2−ヒドロキシプロピル)エチレンジアミン及び15重量%Triton X−100)を使用して4日間(30時間PN、8.5日目)又は37℃で7日(8週齢)を用いて、肺葉を透徹した。PBSで繰り返し洗浄した後、肺葉をブロッキング溶液(PBS、2.5%BSA、0.5%Triton X−100、3%正常ロバ血清)でインキュベートし、その後、一次抗体溶液(1:100;ヤギ抗マウスGFP、abcam)に37℃で4日間(30時間PN、8.5日目)又は5日間(8週齢)入れた。洗浄した後、二次抗体溶液(1:500;ロバ抗ヤギAF555、Invitrogen)を37℃で4日間(30時間PN、8.5日)又は5日間(8週齢)加えた。PBSで再洗浄し、7.5%ホルムアルデヒド中、室温で2時間固定した後、洗浄工程を繰り返し、肺葉をCUBIC試薬2(50重量%スクロース、25重量%尿素、10重量%2,20,20’−ニトリロトリエタノール及び0.1%体積/体積%Triton X−100)においてさらに4日間(30時間PN、8.5日目)又は7日間(8週齢)インキュベートした。Zeiss Z1ライトシート顕微鏡を使用して、5倍の検出対物レンズ、561のレーザー励起波長で5倍の照明光学系、及び0.56倍のズームにより、測定された屈折率1.45のCUBIC試薬2において透徹した肺葉を画像化した。Zスタックを、マルチビュータイルスキャンモードで、ライトシートの厚さが8.42μm、露光量が441.9msの両面照明によって取得した。ステッチング、3D再構成、視覚化、及びレンダリングを、Arivis Vision4D Zeiss Edition(v.2.12)を使用して実行した。
組織透徹プロトコルを、前述のように実施した(Fuzik et al.,2016)。要するに、指定の時点での肺を、PBSで1回灌流し、その後、PBS中の7.5%ホルムアルデヒドで灌流した。肺葉をPBS中の7.5%ホルムアルデヒドで室温で一晩固定した。CUBIC試薬1(25重量%尿素、25重量%N,N,N’,N’−テトラキス(2−ヒドロキシプロピル)エチレンジアミン及び15重量%Triton X−100)を使用して4日間(30時間PN、8.5日目)又は37℃で7日(8週齢)を用いて、肺葉を透徹した。PBSで繰り返し洗浄した後、肺葉をブロッキング溶液(PBS、2.5%BSA、0.5%Triton X−100、3%正常ロバ血清)でインキュベートし、その後、一次抗体溶液(1:100;ヤギ抗マウスGFP、abcam)に37℃で4日間(30時間PN、8.5日目)又は5日間(8週齢)入れた。洗浄した後、二次抗体溶液(1:500;ロバ抗ヤギAF555、Invitrogen)を37℃で4日間(30時間PN、8.5日)又は5日間(8週齢)加えた。PBSで再洗浄し、7.5%ホルムアルデヒド中、室温で2時間固定した後、洗浄工程を繰り返し、肺葉をCUBIC試薬2(50重量%スクロース、25重量%尿素、10重量%2,20,20’−ニトリロトリエタノール及び0.1%体積/体積%Triton X−100)においてさらに4日間(30時間PN、8.5日目)又は7日間(8週齢)インキュベートした。Zeiss Z1ライトシート顕微鏡を使用して、5倍の検出対物レンズ、561のレーザー励起波長で5倍の照明光学系、及び0.56倍のズームにより、測定された屈折率1.45のCUBIC試薬2において透徹した肺葉を画像化した。Zスタックを、マルチビュータイルスキャンモードで、ライトシートの厚さが8.42μm、露光量が441.9msの両面照明によって取得した。ステッチング、3D再構成、視覚化、及びレンダリングを、Arivis Vision4D Zeiss Edition(v.2.12)を使用して実行した。
定量化と統計分析
低レベルの処理及びフィルタリング
すべてのRNA−Seqライブラリー(等モル濃度でプール)を、Illumina NextSeq 500を使用して、単一細胞あたり58,585リードのメジアンシーケンシング深度で配列決定した。配列をマウスゲノム(mm9)にマッピングし、逆多重化し、前述のようにフィルタリングし(Jaitin et al.,2014)、さらなる処理のために単一細胞内の異なる転写産物を定義する固有分子識別子(UMI)のセットを抽出した。本発明者らは、空のMARS−seqウェルの統計を使用して、データ内のスプリアスUMIのレベルを推定した(ノイズのメジアン2.7%、図示されていない)。読み取りのマッピングを、HISAT(バージョン0.1.6)を使用して行い(Kim et al.,2015)、複数のマッピング位置を持つ読み取りを除外した。読み取りは、参照用にUCSCゲノムブラウザーを使用して、エクソンにマッピングされている場合は遺伝子に関連付けられていた。同じ鎖上のゲノム位置を共有する異なる遺伝子のエクソンを、連結された遺伝子記号を持つ単一の遺伝子と見みなした。UMIが500未満の細胞を、分析から除外した。フィルタリング後、細胞には細胞あたり2,483個の固有の分子のメジアンが含まれていた。すべてのダウンストリーム分析をRで実施した。
低レベルの処理及びフィルタリング
すべてのRNA−Seqライブラリー(等モル濃度でプール)を、Illumina NextSeq 500を使用して、単一細胞あたり58,585リードのメジアンシーケンシング深度で配列決定した。配列をマウスゲノム(mm9)にマッピングし、逆多重化し、前述のようにフィルタリングし(Jaitin et al.,2014)、さらなる処理のために単一細胞内の異なる転写産物を定義する固有分子識別子(UMI)のセットを抽出した。本発明者らは、空のMARS−seqウェルの統計を使用して、データ内のスプリアスUMIのレベルを推定した(ノイズのメジアン2.7%、図示されていない)。読み取りのマッピングを、HISAT(バージョン0.1.6)を使用して行い(Kim et al.,2015)、複数のマッピング位置を持つ読み取りを除外した。読み取りは、参照用にUCSCゲノムブラウザーを使用して、エクソンにマッピングされている場合は遺伝子に関連付けられていた。同じ鎖上のゲノム位置を共有する異なる遺伝子のエクソンを、連結された遺伝子記号を持つ単一の遺伝子と見みなした。UMIが500未満の細胞を、分析から除外した。フィルタリング後、細胞には細胞あたり2,483個の固有の分子のメジアンが含まれていた。すべてのダウンストリーム分析をRで実施した。
データ処理及びクラスタリング
メタセルパイプライン(Giladi et al.,2018)を使用して、有益な遺伝子を導き出し、細胞−細胞間の類似性を計算し、K−nnグラフカバーを計算し、細胞の凝集グループ(又はメタセル)におけるRNAの分布を導き出し、ブートストラップ分析及びリサンプリングされたデータのグラフカバーの計算を使用して、強く分離されたクラスターを導出する。方法及びダウンストリーム分析の完全な説明を図に示す。特に明記されていない限り、デフォルトのパラメーターを使用した。
メタセルパイプライン(Giladi et al.,2018)を使用して、有益な遺伝子を導き出し、細胞−細胞間の類似性を計算し、K−nnグラフカバーを計算し、細胞の凝集グループ(又はメタセル)におけるRNAの分布を導き出し、ブートストラップ分析及びリサンプリングされたデータのグラフカバーの計算を使用して、強く分離されたクラスターを導出する。方法及びダウンストリーム分析の完全な説明を図に示す。特に明記されていない限り、デフォルトのパラメーターを使用した。
肺の発達のクラスタリングを、免疫(CD45+)コンパートメントと非免疫(CD45−)コンパートメントを組み合わせて実施した。ヘモグロビン遺伝子の高い(64超)複合発現を伴う細胞を廃棄した(Hba−a2、Alas2、Hba−a1、Hbb−b2、Hba−x、Hbb−b1)。本発明者らは、ブートストラップを使用して、堅牢なクラスタリングを導出した(500回の反復、各反復で細胞の70%をリサンプリングし、最小クラスターサイズを20に設定してコクラスターマトリックスをクラスタリングする)。メタセルでは、それ以上のフィルタリング又はクラスター分割は実行されなかった。
得られたメタセルにセルタイプに注釈を付けるために、本発明者らは、メトリックFPgene,mc(図示していない)を使用し、これは、各遺伝子とメタセルについて、メタセル内のこの遺伝子の幾何平均及びすべてのメタセルにわたる幾何平均のメジアンの間の倍率変化を表す。FPメトリックは、バックグラウンドと比較して、その中で強く過剰発現している各メタセル遺伝子を強調する。本発明者らは、次に、このメトリックを使用して、Clic5(AT1)、Ear2(マクロファージ)、Cd79b(B細胞)等の系統特異的遺伝子の発現のためにメタセルを「着色」した。各遺伝子には、Clic5によるAT1の着色は、Epcamによる一般的な上皮の着色よりも優先されるように、FPしきい値及び優先度インデックスが与えられた。選択した遺伝子、優先度、及び倍率変化のしきい値パラメーターは次のとおりである。
軌道の発見
軌道を推測し、発生の疑似時間に沿って細胞を整列させるために、本発明者らは、公開されたパッケージであるSlingshotを使用した(Street et al.,2017)。つまり、Slingshotは、既存のクラスターを使用して系統階層(最小スパニングツリー、MSTに基づく)を推測し、各クラスターの細胞を疑似時間軌道に揃えるツールである。本発明者らのデータは複雑で、多くの連結成分及び時点が含まれているため、本発明者らは、相互接続された細胞型のサブセット、つまりE16.5単球とマクロファージII及びIII(データセットa)、並びに線維芽細胞系統(データセットb)にSlingshotを適用することを選択した。
軌道を推測し、発生の疑似時間に沿って細胞を整列させるために、本発明者らは、公開されたパッケージであるSlingshotを使用した(Street et al.,2017)。つまり、Slingshotは、既存のクラスターを使用して系統階層(最小スパニングツリー、MSTに基づく)を推測し、各クラスターの細胞を疑似時間軌道に揃えるツールである。本発明者らのデータは複雑で、多くの連結成分及び時点が含まれているため、本発明者らは、相互接続された細胞型のサブセット、つまりE16.5単球とマクロファージII及びIII(データセットa)、並びに線維芽細胞系統(データセットb)にSlingshotを適用することを選択した。
データセットaについては、本発明者らは、すべてのマクロファージII〜IIIと、Ly6c2の相対的発現が低い単球メタセル(分化した単球を除き、E16.5単球を保持)に対してSlingshotを実施した。各データセットについて、本発明者らは、細胞型間で異なる遺伝子のセットを選択した(FDR補正カイ2乗検定、q<10−3、倍率変化2超)。本発明者らは、細胞サイズに正規化された対数変換されたUMIに対してPCAを実施した。本発明者らは、単球及び初期線維芽細胞を開始クラスターとして、7つの上位主成分でSlingshotを実行した。
本発明者らは、最初に、E18.5日目に強いAT1及びAT2シグネチャーを観察する。これは、前駆上皮細胞の消失と平行している。このことから、本発明者らは、本発明者らの発生コホートでは正確な分岐点が高い時間分解能でサンプリングされておらず、この特定のケースではSlingshotが非効率的であると仮定した。代わりに、本発明者らは、E16.5日目の前駆上皮細胞がすでにAT1又はAT2のいずれかへと刺激されているかどうかを調べた。上皮前駆細胞におけるAT1AT2プライミングを検出するために、本発明者らは、AT1及びAT2の公開された遺伝子リスト(Treutlein et al.,2014)を使用し、次の用語で2つのスコアを計算した。
次に、本発明者らは、上皮前駆細胞のスコア分布を調べた。
次に、本発明者らは、上皮前駆細胞のスコア分布を調べた。
相互作用マップ
すべての肺の相互作用を視覚化するために、本発明者らは、公開されているリガンドと受容体のペアのデータセットを使用した(Ramilowski et al.,2015)。本発明者らは、少なくとも1つのメタセル(メタセルサイズに正規化)に13を超えるUMIを持つすべてのLRを含む、寛大なフィルタリング(lenient filtering)を適用した。本発明者らは、対数変換されたUMI(1000UMIにダウンサンプリング)間のスピアマン相関を計算し、階層的クラスタリングを使用してLRモジュール(K=15のcutree)を識別した。本発明者らは、LRモジュール間のスピアマン相関を計算し、ρ>0.4のモジュール間のエッジを接続して、相互作用グラフのスキャフォルドを作成し、Rgraphvizパッケージでグラフを生成した。本発明者らは、ρ>0.05のすべてのLRにわたる平均x、y座標を計算することにより、グラフスキャフォルドに単一のLRを投影した(図3B)。
すべての肺の相互作用を視覚化するために、本発明者らは、公開されているリガンドと受容体のペアのデータセットを使用した(Ramilowski et al.,2015)。本発明者らは、少なくとも1つのメタセル(メタセルサイズに正規化)に13を超えるUMIを持つすべてのLRを含む、寛大なフィルタリング(lenient filtering)を適用した。本発明者らは、対数変換されたUMI(1000UMIにダウンサンプリング)間のスピアマン相関を計算し、階層的クラスタリングを使用してLRモジュール(K=15のcutree)を識別した。本発明者らは、LRモジュール間のスピアマン相関を計算し、ρ>0.4のモジュール間のエッジを接続して、相互作用グラフのスキャフォルドを作成し、Rgraphvizパッケージでグラフを生成した。本発明者らは、ρ>0.05のすべてのLRにわたる平均x、y座標を計算することにより、グラフスキャフォルドに単一のLRを投影した(図3B)。
間質−間質及び免疫−免疫相互作用の濃縮を決定するために、本発明者らは、各LRについて、主に間質又は免疫コンパートメントで発現しているかどうかを決定した(log2倍率変化1超、図示していない)。本発明者らは、S−SとI−Iの相互作用の数を計算し、無作為に生成された10,000個のグラフと比較した。重要なのは、相互作用グラフが規則的ではないため、本発明者らは、無作為に生成されたグラフごとにノードの度数を保持したことである。リガンド機能グループを、David GOアノテーションツール(Huang da et al.,2009)から抽出し、手動でキュレーション(curated)した。
図3E〜Hにおける投影では、LRを発現する細胞型を、その発現が他のすべての細胞より2倍以上高い場合に決定した。
細胞の肺クラスターモデルへのマッピング
既存の参照単一細胞データセット及びクラスターモデル、並びに単一細胞プロファイルの新しいセットを前提として、本発明者らは、上記のように、変換されたマーカー遺伝子UMIでピアソン相関が最も高いK(K=10)参照細胞を新しい細胞ごとに抽出する。これらのK近傍でのクラスターメンバーシップの分布を使用して、新しいセル参照クラスターを定義した(過半数の得票による)。
既存の参照単一細胞データセット及びクラスターモデル、並びに単一細胞プロファイルの新しいセットを前提として、本発明者らは、上記のように、変換されたマーカー遺伝子UMIでピアソン相関が最も高いK(K=10)参照細胞を新しい細胞ごとに抽出する。これらのK近傍でのクラスターメンバーシップの分布を使用して、新しいセル参照クラスターを定義した(過半数の得票による)。
好塩基球プロファイリング、ex vivo及び共培養分析
本発明者らは、メタセルパイプラインを使用して、次のデータセットを分析及びフィルタリングした:(a)肺及び血液由来の好塩基球(図4E〜G);(b)Il1rl1ノックアウト及び対照(図5G〜H);(c)ex vivoで増殖した好塩基球(図5J〜L、S5D);(d)並びにマクロファージ及び好塩基球のex vivo共培養(図6L〜M、S6J)。メタセル分析をデフォルト設定で実施した。各データセットにおいて、本発明者らは、メジアンに対してMcpt8の平均発現が増加したメタセルを選択することにより、好塩基球と濾過された汚染物質を特定した。共培養実験(d)では、Csf1rの平均発現の増加によりメタセルがマクロファージとして決定された。
本発明者らは、メタセルパイプラインを使用して、次のデータセットを分析及びフィルタリングした:(a)肺及び血液由来の好塩基球(図4E〜G);(b)Il1rl1ノックアウト及び対照(図5G〜H);(c)ex vivoで増殖した好塩基球(図5J〜L、S5D);(d)並びにマクロファージ及び好塩基球のex vivo共培養(図6L〜M、S6J)。メタセル分析をデフォルト設定で実施した。各データセットにおいて、本発明者らは、メジアンに対してMcpt8の平均発現が増加したメタセルを選択することにより、好塩基球と濾過された汚染物質を特定した。共培養実験(d)では、Csf1rの平均発現の増加によりメタセルがマクロファージとして決定された。
TissueFAXS画像をMATLAB(登録商標)(R2014b)によって処理した肺胞のセグメンテーションを、カスタムメイドのパイプラインによって実施した。画像をグレースケールに変換し、15ピクセルのディスクサイズで拡張、開閉した。肺胞を200の強度しきい値によって決定した。300,000ピクセルを超える領域は破棄した。核のセグメンテーションを、同様のパイプライン(ディスクサイズ=5ピクセル)によって実施し、その後、ウォーターシェッドアルゴリズムを適用し、極小値を検出した。画像をL*A*B色空間に変換し、各核の平均値を収集した。切片の端にある核は廃棄した。面積<Tarea、平均輝度>Tl又は高い真円度スコア(>Tcirc)の核は廃棄した。肺胞までの核の距離(ピクセル単位)をbwdist法を使用して計算した。好塩基球(YFP+)は、暗褐色がかった色相によって他の核と区別される(図4A)。したがって、本発明者らは、平均輝度が低く、平均bカラーチャネルが高い(平均(b)−平均(l)>Tbaso)ことにより、好塩基球を特定した。PNの8.5日目の肺葉では、本発明者らは、次のパラメーターを使用した:Tarea=50;Tl=60;Tcirc=5;Tbaso=−40。8週齢の肺葉では、本発明者らは、次のパラメーターを使用した:Tarea=20;Tl=60;Tcirc=5;Tbaso=−40。結果が低品質の切片の影響を受けないことを検証するために、本発明者らは、各TissueFAXSの肺葉からランダムに小切片(subsection)を選択し、画像の鮮明さを手動で検査した。本発明者らは、肺葉ごとに少なくとも200の好塩基球が得られるまで、又は肺葉に好塩基球が存在しなくなるまで繰り返した。本発明者らは、肺胞までの距離の有意性を次のように試験した:各肺葉について、すべての核の距離を個別にランク変換した。次に、本発明者らは、各肺葉から無作為にNbaso核を選択し(Nbasoはその肺葉内の好塩基球の数を表す)、ランク付けされた距離のメジアンを計算した。本発明者らは、この順列プロセスを各時点で105回繰り返し、観測されたランク付けされた距離のメジアンと比較した。
データ及びソフトウェアの可用性
データ及びソフトウェアの可用性
報告されたすべてのデータは、GEO、アクセッション番号GSE119228にアップロード及び保存される。ソフトウェア及びカスタムコードはリクエストに応じて利用できる。
(実施例1)
発生中の肺細胞型の包括的なマップ
肺の発生及び恒常性に対するさまざまな免疫細胞及び非免疫細胞のタイプと状態の寄与を理解するために、本発明者らは、肺の発生の重要な時点に沿って単一細胞プロファイルを収集した。細胞表面マーカー又は選択的組織解離手順に起因するバイアスを回避するために、本発明者らは、広範なゲーティング戦略と許容組織解離プロトコルを組み合わせて、肺にある免疫細胞及び非免疫細胞の包括的なレパートリーを作成した(図示していない;方法)。本発明者らは、肺胚及び出生後の発達の複数の時点から細胞を高密度にサンプリングし、インデックスソーティング(MARS−seq)と組み合わせた大規模並行単一細胞RNA−seqを実行した(Jaitin et al.,2014)(図1A;図示せず)。本発明者らは、主要な胚発生段階:初期形態形成(E12.5)、小管期(E16.5)及び球形嚢期(E18.5〜E19.5;後期E)から細胞を収集した。本発明者らは、さらに、出生直後(出生後1、6、7、10時間、PN初期)、出生後16時間、30時間(PN中期)と並んで、出生後2日及び7日で、肺胞形成の出生後の段階から細胞を収集した(図1A)。肺細胞マップを構築するために、本発明者らは、17匹のマウスから10,196個のCD45−(非免疫)及び10,904個のCD45+(免疫)単一細胞をプロファイリングし、メタセルアルゴリズムを使用して均一で堅牢な細胞グループを特定し(「メタセル」;方法)(Giladi et al.,2018)、260の最も転写的に異なる亜集団の詳細なマップを得た(図示していない)。免疫及び非免疫の単一細胞の2次元表現は、細胞が多様な系統に分離していることを明らかにした(図1B)。免疫コンパートメントでは、NK細胞(Ccl5の高発現を特徴とする)、ILCサブセット2(Il7r及びRora)、T細胞(Trbc2)及びB細胞(Cd19)(図1C)を含むリンパ系統が検出されたが、単球及び骨髄性細胞は、好中球(Retnlg)、好塩基球(Mcpt8)、肥満細胞(Mcpt4)、DC(Siglech)、単球(F13a1)、及びマクロファージの3つの異なるサブセット(Macrophage I−III;Ear2)に分離された。遺伝子発現による注釈は、従来のFACSインデックスによってさらに裏付けられた(図示していない)。その広大な不均一性にもかかわらず、非免疫コンパートメント(CD45−)のクラスター化により、上皮(Epcam発現でマークした)、内皮(Cdh5)及び線維芽細胞(Col1a2)の3つの主要な系統が明らかになった。肺の発生に関する以前の特徴(Treutlein et al.,2014)と一致して、上皮細胞は、上皮前駆細胞(高Epcam)、AT1細胞(Akap5)、AT2細胞(Lamp3)、クラブ細胞(Scgb3a2)及び繊毛細胞(Foxj1)の亜集団に分類され、一方、線維芽細胞サブセットには、線維芽細胞の前駆細胞、平滑筋細胞(Enpp2)、マトリックス線維芽細胞(Mfap4)、及び周皮細胞(Gucy1a3)が含まれていた(図1B〜C)。全体として、これらのデータは、発達の重要な期間中の豊富な肺細胞型と非常にまれな肺細胞型(すべての細胞の0.1%超)の両方の詳細なマップを提供し、これを肺の分化、成熟、及び細胞動態を研究するためにさらに使用することができる。
発生中の肺細胞型の包括的なマップ
肺の発生及び恒常性に対するさまざまな免疫細胞及び非免疫細胞のタイプと状態の寄与を理解するために、本発明者らは、肺の発生の重要な時点に沿って単一細胞プロファイルを収集した。細胞表面マーカー又は選択的組織解離手順に起因するバイアスを回避するために、本発明者らは、広範なゲーティング戦略と許容組織解離プロトコルを組み合わせて、肺にある免疫細胞及び非免疫細胞の包括的なレパートリーを作成した(図示していない;方法)。本発明者らは、肺胚及び出生後の発達の複数の時点から細胞を高密度にサンプリングし、インデックスソーティング(MARS−seq)と組み合わせた大規模並行単一細胞RNA−seqを実行した(Jaitin et al.,2014)(図1A;図示せず)。本発明者らは、主要な胚発生段階:初期形態形成(E12.5)、小管期(E16.5)及び球形嚢期(E18.5〜E19.5;後期E)から細胞を収集した。本発明者らは、さらに、出生直後(出生後1、6、7、10時間、PN初期)、出生後16時間、30時間(PN中期)と並んで、出生後2日及び7日で、肺胞形成の出生後の段階から細胞を収集した(図1A)。肺細胞マップを構築するために、本発明者らは、17匹のマウスから10,196個のCD45−(非免疫)及び10,904個のCD45+(免疫)単一細胞をプロファイリングし、メタセルアルゴリズムを使用して均一で堅牢な細胞グループを特定し(「メタセル」;方法)(Giladi et al.,2018)、260の最も転写的に異なる亜集団の詳細なマップを得た(図示していない)。免疫及び非免疫の単一細胞の2次元表現は、細胞が多様な系統に分離していることを明らかにした(図1B)。免疫コンパートメントでは、NK細胞(Ccl5の高発現を特徴とする)、ILCサブセット2(Il7r及びRora)、T細胞(Trbc2)及びB細胞(Cd19)(図1C)を含むリンパ系統が検出されたが、単球及び骨髄性細胞は、好中球(Retnlg)、好塩基球(Mcpt8)、肥満細胞(Mcpt4)、DC(Siglech)、単球(F13a1)、及びマクロファージの3つの異なるサブセット(Macrophage I−III;Ear2)に分離された。遺伝子発現による注釈は、従来のFACSインデックスによってさらに裏付けられた(図示していない)。その広大な不均一性にもかかわらず、非免疫コンパートメント(CD45−)のクラスター化により、上皮(Epcam発現でマークした)、内皮(Cdh5)及び線維芽細胞(Col1a2)の3つの主要な系統が明らかになった。肺の発生に関する以前の特徴(Treutlein et al.,2014)と一致して、上皮細胞は、上皮前駆細胞(高Epcam)、AT1細胞(Akap5)、AT2細胞(Lamp3)、クラブ細胞(Scgb3a2)及び繊毛細胞(Foxj1)の亜集団に分類され、一方、線維芽細胞サブセットには、線維芽細胞の前駆細胞、平滑筋細胞(Enpp2)、マトリックス線維芽細胞(Mfap4)、及び周皮細胞(Gucy1a3)が含まれていた(図1B〜C)。全体として、これらのデータは、発達の重要な期間中の豊富な肺細胞型と非常にまれな肺細胞型(すべての細胞の0.1%超)の両方の詳細なマップを提供し、これを肺の分化、成熟、及び細胞動態を研究するためにさらに使用することができる。
(実施例2)
肺の区画化は、細胞のダイナミクスの波によって形作られる。
胚発生中及び出生直後、肺はその成熟及び空気中の酸素への突然の曝露による劇的な環境変化を起こす。したがって、本発明者らの分析は、メタセルの組成がこれらの時点で大きく変化することを示している(図2A)。細胞型レベルでは、免疫及び非免疫組成物の最も顕著な細胞動態が妊娠中に観察された(図2B〜C)。特に、組織解離プロトコルは細胞型の存在量に影響を与える可能性があるため、相対量としてのみ見なすことができる(図示していない)。初期の時点(E12.5)では、免疫コンパートメントは主にマクロファージ(51%のCD45+細胞)で構成され、特にサブセットI、単球(10%)及び肥満細胞(11%)に関連していたが、小管期(E16.5)では単球、マクロファージ(サブセットII)、好中球及び好塩基球が優勢で(それぞれ、58%、13%、7%、4%)、マクロファージIサブセットはほとんど減少していた。妊娠後期から始まって、すべての主要な免疫細胞集団が存在し、その後の動態は、リンパ系細胞コンパートメント(B及びT細胞)の着実な増加を示し、PNの7日目で免疫集団の最大32%に達し、マクロファージ集団の組成を変更する(図2B)。免疫コンパートメントと同様に、非免疫細胞組成の動態は妊娠中に最も顕著であり(図2C)、E12.5は、主に未分化線維芽細胞(83%)及び前駆上皮細胞(10%)で構成されていた。E16.5では、周皮細胞の出現、内皮の増加、及びマトリックス線維芽細胞の出現と並行して、前駆上皮サブセットが増加し続け(30%)、クララ細胞の新しい上皮細胞サブセット(5%)が出現した。細胞組成は妊娠後期以降安定し、平滑筋線維芽細胞が出現し、上皮がAT1細胞及びAT2A細胞に分岐した(図2C)。これらの細胞動態は、生物学的複製全体で一貫していた(図示していない)。
肺の区画化は、細胞のダイナミクスの波によって形作られる。
胚発生中及び出生直後、肺はその成熟及び空気中の酸素への突然の曝露による劇的な環境変化を起こす。したがって、本発明者らの分析は、メタセルの組成がこれらの時点で大きく変化することを示している(図2A)。細胞型レベルでは、免疫及び非免疫組成物の最も顕著な細胞動態が妊娠中に観察された(図2B〜C)。特に、組織解離プロトコルは細胞型の存在量に影響を与える可能性があるため、相対量としてのみ見なすことができる(図示していない)。初期の時点(E12.5)では、免疫コンパートメントは主にマクロファージ(51%のCD45+細胞)で構成され、特にサブセットI、単球(10%)及び肥満細胞(11%)に関連していたが、小管期(E16.5)では単球、マクロファージ(サブセットII)、好中球及び好塩基球が優勢で(それぞれ、58%、13%、7%、4%)、マクロファージIサブセットはほとんど減少していた。妊娠後期から始まって、すべての主要な免疫細胞集団が存在し、その後の動態は、リンパ系細胞コンパートメント(B及びT細胞)の着実な増加を示し、PNの7日目で免疫集団の最大32%に達し、マクロファージ集団の組成を変更する(図2B)。免疫コンパートメントと同様に、非免疫細胞組成の動態は妊娠中に最も顕著であり(図2C)、E12.5は、主に未分化線維芽細胞(83%)及び前駆上皮細胞(10%)で構成されていた。E16.5では、周皮細胞の出現、内皮の増加、及びマトリックス線維芽細胞の出現と並行して、前駆上皮サブセットが増加し続け(30%)、クララ細胞の新しい上皮細胞サブセット(5%)が出現した。細胞組成は妊娠後期以降安定し、平滑筋線維芽細胞が出現し、上皮がAT1細胞及びAT2A細胞に分岐した(図2C)。これらの細胞動態は、生物学的複製全体で一貫していた(図示していない)。
以前の研究(Kopf et al.,2015;Tan and Krasnow,2016)に従って、本発明者らは、マクロファージI〜IIIと呼ばれる3つの異なるマクロファージサブセットを特定した。これらのサブセットは発生の間、波状に現れ、マクロファージIは妊娠初期に優勢であり、マクロファージIIは出生前後に頂点に達し、マクロファージIIIは妊娠後期から着実に増加し、PNの7日目で過半数になった(図2D)。マクロファージI細胞は、マクロファージサブセットII〜IIIとは転写的に異なる。特に、マクロファージサブセットII〜IIIはE16.5単球と連続的な転写スペクトルを形成し(図2E)、マクロファージII及びIIIは、卵黄嚢起源の可能性があるマクロファージサブセットIではなく、胎児肝臓単球から分化することを示唆している(Ginhoux,2014;Tan and Krasnow,2016)(図2E)。単球及びマクロファージサブセットの最も可能性の高い分化軌道を推論するために、本発明者らは、疑似時間推論にSlingshotを使用し(Street et al.,2017)、E18.5以降のマクロファージ遺伝子の段階的な取得を特徴づけた(後期E、図2F)。Slingshot軌跡は、発生時点に沿ったマクロファージサブセットの線形遷移を示唆する。転写的に、マクロファージI細胞は高レベルのCx3cr1及び補体遺伝子(C1qa、C1qb)を発現した(図2G)。マクロファージIIは、分子的に単球を連想させ、Ccr2、F13a1、Il1b、及び中間レベルの肺胞マクロファージ(AM)に特徴的な遺伝子Il1rn、Lpl、Pparg及びClec7a等を発現していた(Kopf et al.,2015;Schneider et al.,2014)(図2G)。マクロファージIIIは、Pparg、Fabp4、Fabp5、Il1rn、Car4、Lpl、Clec7a、及びItgaxを含むAMの特徴的な遺伝子の独自のセットを発現した(Gautier et al.,2012;Lavin et al.,2014)(図2F〜G)。本発明者らは、同様に、線維芽細胞及び上皮系統の分化の波を再構築し、平滑筋及びマトリックス線維芽細胞の分岐に関連する主な遺伝子(図示していない)、並びに上皮前駆細胞のAT1細胞及びAT2細胞へのプライミング(図示していない)を強調した。まとめると、本発明者らのデータは、肺の発達に沿った細胞型組成及び遺伝子発現プログラムの両方で厳密に規制された動的変化を明らかにする。異なる細胞型にわたるこれらの細胞及び分子の動態は、これらのプログラムが細胞クロストークの複雑なネットワークによって調整されていることを示唆している。
(実施例3)
肺の好塩基球は、免疫及び非免疫コンパートメントと広く相互作用する。
多細胞生物では、不均一な細胞型が複雑な通信ネットワークを形成し、主にリガンドと受容体(LR)間の相互作用によって媒介されるため、組織機能が出現する(Zhou et al.,2018)。単一細胞マップでLRペアを調べると、組織の運命を形作る中心的な細胞成分が明らかになる可能性がある(Camp et al.,2017;Zhou et al.,2018)。細胞間の細胞相互作用を体系的にマッピングし、発達を制御する潜在的なコミュニケーション因子を明らかにするために、本発明者らは、すべての肺細胞型間のLRペアを特徴づけた(図3A)。簡単に説明すると、本発明者らは、リガンドを受容体にリンクする公開データセットを使用して、少なくとも1つのメタセルで発現するすべてのLRをフィルタリングし、各リガンド又は受容体をすべての細胞全体及び発生時点に沿ったその発現プロファイルに関連付けた(方法)(Ramilowski et al.,2015)。
肺の好塩基球は、免疫及び非免疫コンパートメントと広く相互作用する。
多細胞生物では、不均一な細胞型が複雑な通信ネットワークを形成し、主にリガンドと受容体(LR)間の相互作用によって媒介されるため、組織機能が出現する(Zhou et al.,2018)。単一細胞マップでLRペアを調べると、組織の運命を形作る中心的な細胞成分が明らかになる可能性がある(Camp et al.,2017;Zhou et al.,2018)。細胞間の細胞相互作用を体系的にマッピングし、発達を制御する潜在的なコミュニケーション因子を明らかにするために、本発明者らは、すべての肺細胞型間のLRペアを特徴づけた(図3A)。簡単に説明すると、本発明者らは、リガンドを受容体にリンクする公開データセットを使用して、少なくとも1つのメタセルで発現するすべてのLRをフィルタリングし、各リガンド又は受容体をすべての細胞全体及び発生時点に沿ったその発現プロファイルに関連付けた(方法)(Ramilowski et al.,2015)。
発生中の肺では、LRのモジュールは主に細胞型によってクラスター化されている(図示していない)。ただし、一部のLRでは、本発明者らは、発生中に同じ細胞型で発現レベルの有意な変化を特定することができた(図示していない)。本発明者らは、リガンド及び受容体をそれらの相関構造に基づいて予測し、すべてのLR及びそれらの相互作用をグラフで表現し、それらの細胞型関連モジュールへの分離を強調した(図3B、方法)。肺のLRマップは、免疫コンパートメント(I)とそれ自体の間、及び非免疫コンパートメント(NI)とそれ自体の間のLR相互作用の濃縮、並びにコンパートメント間の相互作用の枯渇(I−I及びNI−NI相互作用、p<10−4、図示していない)を特徴とする、免疫コンパートメントと非免疫コンパートメントのコミュニケーションパターン間の明確な分離を示した(図3C)。特に、クロストークの大部分は各コンパートメント内で発生するが、散発的なI−NI及びNI−Iの相互作用には、組織の発生及び恒常性のための重要なシグナル伝達経路が含まれる可能性がある。次に、本発明者らは、特定のリガンドファミリー及び経路を機能グループに分類した(方法)。予想通り、サイトカイン及び補体系の構成要素は、主に免疫コンパートメント、及びそれらを認識する受容体に見られた(図3D−E)。補完的に、非免疫コンパートメントは、成長因子、マトリックスシグナル伝達、細胞接着リガンド及び受容体が豊富であった(図3D−E)。
コンパートメント間及びコンパートメント内の多数の相互作用に関与する重要な細胞通信ハブを特定するために、本発明者らは、さまざまな細胞型でLR発現パターンを調べた(図示していない)。非免疫コンパートメントより、Tgfb3及びWntリガンドであるWnt5aを発現する平滑筋線維芽細胞(Nabhan et al.,2018)、並びにインターロイキン33(Il33)及びサーファクタントタンパク質(Sfpta1)の排他的発現を特徴とするAT2細胞が、複雑なNI−NI及びNI−Iシグナル伝達に関与していた(図3F〜G)(Saluzzo et al.,2017)。免疫コンパートメント内で、本発明者らは、単球及びマクロファージにおけるCsf2rb及びCsf1r等の独自の細胞サブセットの分化及び成熟に重要な特徴的な受容体の発現を観察した(Ginhoux,2014;Guilliams et al.,2013;Schneider et al.,2014)(図示していない)。ここで、以前はAMの分化に重要な役割を果たすとされていたILC(de Kleer et al.,2016;Saluzzo et al.,2017)が、Csf2を発現する主要な細胞として見られた(GM−CSF、図3H)。驚くべきことに、免疫コンパートメントのまれな集団(1.5%)を含む好塩基球は、免疫コンパートメントと非免疫コンパートメントの両方と相互作用する、豊富で複雑なLRプロファイルを示した。相互作用マップは、Csf1、Il6、Il13及びHgf等の多くの主要なサイトカイン及び成長因子の主な供給源として好塩基球を強調し(図3I)、それらの対応する受容体は固有の肺に存在する肺細胞によって発現された。全体として、本発明者らの分析は、肺の免疫細胞型と非免疫細胞型の間及びそれらの内部の潜在的な新規クロストーク回路を発見しながら、肺の発生過程における重要で確立されたLR相互作用を確認する。
(実施例4)
肺の好塩基球は、明確な空間的局在及び遺伝子シグネチャーを特徴とする。
好塩基球の豊富な相互作用プロファイル(図3I)に照らして、本発明者らは、これらの細胞が、肺の合図に応答することと、微小環境を変更することの両方によって、肺内の細胞コミュニケーションにおいて中心的な役割を果たしている可能性があると仮定した。肺好塩基球の空間的局在を特定するために、本発明者らは、Mcpt8YFP/+トランスジェニックマウスモデルを実施し、肺実質内のYFP+好塩基球が、30時間PN、8.5日PN、及び8週齢のマウスで肺胞に近接して局在することを観察した(図7A)。本発明者らは、肺葉全体の切片のTissueFAXS画像を半自動計算分析と組み合わせて、好塩基球を正確に識別し、肺におけるそれらの空間的局在を定量化した(方法)。本発明者らは、好塩基球は、PNの8.5日目に無作為に選択された細胞よりも肺胞の近くに存在する可能性が高く、8週齢の成体マウスではそれほど存在しないことを観察した(図4A〜B、方法)。肺実質の好塩基球の空間構成をさらに測定するために、本発明者らは、組織の透徹を行った後、さまざまな時点でMcpt8YFP/+マウスの左肺葉を画像化した。抗GFP抗体染色により、好塩基球が肺葉全体に分布していることがさらに確認された(図4C)。
肺の好塩基球は、明確な空間的局在及び遺伝子シグネチャーを特徴とする。
好塩基球の豊富な相互作用プロファイル(図3I)に照らして、本発明者らは、これらの細胞が、肺の合図に応答することと、微小環境を変更することの両方によって、肺内の細胞コミュニケーションにおいて中心的な役割を果たしている可能性があると仮定した。肺好塩基球の空間的局在を特定するために、本発明者らは、Mcpt8YFP/+トランスジェニックマウスモデルを実施し、肺実質内のYFP+好塩基球が、30時間PN、8.5日PN、及び8週齢のマウスで肺胞に近接して局在することを観察した(図7A)。本発明者らは、肺葉全体の切片のTissueFAXS画像を半自動計算分析と組み合わせて、好塩基球を正確に識別し、肺におけるそれらの空間的局在を定量化した(方法)。本発明者らは、好塩基球は、PNの8.5日目に無作為に選択された細胞よりも肺胞の近くに存在する可能性が高く、8週齢の成体マウスではそれほど存在しないことを観察した(図4A〜B、方法)。肺実質の好塩基球の空間構成をさらに測定するために、本発明者らは、組織の透徹を行った後、さまざまな時点でMcpt8YFP/+マウスの左肺葉を画像化した。抗GFP抗体染色により、好塩基球が肺葉全体に分布していることがさらに確認された(図4C)。
肺の好塩基球を分子的に特徴づけるために、本発明者らは、フローサイトメトリーによってそれらを広範囲に分離しようとした。本発明者らは、データで特定された好塩基球特異的マーカー(CD45+FceR1α+cKit−)をゲートし、MARS−seq分析を使用してソーティング戦略を検証した(図7B〜C)。Mcpt8YFP/+トランスジェニックマウスの分析は、CD45+FceR1α+cKit−細胞の84%がYFP+細胞であり、98%が好塩基球マーカーCD49bを発現することを示した(図74D〜E)。全肺組織あたりの好塩基球の定量化は、組織の発生に沿ってこの集団の漸進的な蓄積を示し(図4D)、免疫集団(CD45+)内のそのパーセンテージは安定したままであった(図7F)。肺の好塩基球が循環で観察されない独特の常在性発現プログラムを持っているかどうかを調べるために、本発明者らは、MARS−seq分析用に肺及び末梢血から時点が一致する好塩基球を選別した(図7F)。肺好塩基球の遺伝子発現プロファイルは、Il6、Il13、Cxcl2、Tnf、Osm、及びCcl4の発現を含む独自の遺伝子シグネチャーを特徴とする血液循環好塩基球とは異なっていた(図4E〜F)。この独自の遺伝子シグネチャーは、成体の肺に存在する好塩基球において持続した(図4F〜G、7G、表4)。
特に、リガンドIl6、Hgf、及びL1camは、他の肺免疫細胞及び非免疫細胞と比較して、肺好塩基球によってのみ発現される(図7H〜I)。一緒に、本発明者らは、肺に存在する好塩基球が組織実質内に存在し、肺胞の近くに特異的に局在し、循環する対応物と比較して、明確で持続的な肺に特徴的なシグナル伝達及び遺伝子プログラムを獲得することを示す。
(実施例5)
IL33及びGM−CSFは、肺胞好塩基球の転写アイデンティティを刷り込む。
肺に存在する好塩基球は独特の遺伝子発現シグネチャーを示したため、本発明者らは、肺の好塩基球受容体の分化の手がかりとして役立つ可能性のある肺特異的シグナルのデータを分析した(図示していない)。Csf2(GM−CSF)は造血成長因子であり、肺の微小環境、特にAMの形成におけるその役割が、長い間確立されてきた(Ginhoux,2014;Guilliams et al.,2013;Shibata et al.,2001)。興味深いことに、本発明者らは、肺におけるCsf2発現の主な原因は、ILC及び好塩基球自体に由来し、AT2細胞からの寄与はごくわずかであることを見出した。すべての肺細胞の中で、好塩基球は、Csf2の主要な受容体であるCsf2rbの最も高いRNA及びタンパク質レベルを発現した(図5A〜B)。さらに、好塩基球及び肥満細胞は、Il33に特異的に結合する受容体Il1rl1(IL33R/ST2)の最も高いRNA及びタンパク質レベルを発現した(図5C〜D)。以前の報告では、主にAT2細胞によって発現される、細胞分化及び肺成熟の主要な駆動物質としてIL−33が特定された。具体的には、肺ILC−2は、その機能をIL33−ST2シグナル伝達に依存することが以前に報告されている(de Kleer et al.,2016;Saluzzo et al.,2017)。Il1rl1及びIl33遺伝子の出生後肺組織の一分子蛍光in situハイブリダイゼーション(smFISH)染色は、好塩基球マーカーMcpt8と共に、これらの遺伝子の隣接細胞での共発現を示し、好塩基球及びAT2細胞が肺組織の空間的近接して存在すること示唆している(図5E)。成体の肺組織でのAT2及び好塩基球の免疫組織化学(IHC)染色により、これらの結果が確認され、このシグナル伝達を肺胞ニッチに局在化した(図5F)。肺好塩基球遺伝子発現プロファイルに対するIL−33シグナル伝達の影響を機能的に検証するために、本発明者らは、MARS−seq分析のためにIl1rl1(IL33R)ノックアウトマウスの肺から好塩基球を精製した。本発明者らは、Il1rl1欠損肺好塩基球は、肺に存在する好塩基球に特異的な遺伝子の多くの発現を欠いており、血液循環好塩基球と高い類似性を示すことを見出し(図5G〜H、8A)、これは、IL−33シグナル伝達が肺好塩基球の特定の遺伝子シグネチャーの大部分を媒介していることを示唆している。
IL33及びGM−CSFは、肺胞好塩基球の転写アイデンティティを刷り込む。
肺に存在する好塩基球は独特の遺伝子発現シグネチャーを示したため、本発明者らは、肺の好塩基球受容体の分化の手がかりとして役立つ可能性のある肺特異的シグナルのデータを分析した(図示していない)。Csf2(GM−CSF)は造血成長因子であり、肺の微小環境、特にAMの形成におけるその役割が、長い間確立されてきた(Ginhoux,2014;Guilliams et al.,2013;Shibata et al.,2001)。興味深いことに、本発明者らは、肺におけるCsf2発現の主な原因は、ILC及び好塩基球自体に由来し、AT2細胞からの寄与はごくわずかであることを見出した。すべての肺細胞の中で、好塩基球は、Csf2の主要な受容体であるCsf2rbの最も高いRNA及びタンパク質レベルを発現した(図5A〜B)。さらに、好塩基球及び肥満細胞は、Il33に特異的に結合する受容体Il1rl1(IL33R/ST2)の最も高いRNA及びタンパク質レベルを発現した(図5C〜D)。以前の報告では、主にAT2細胞によって発現される、細胞分化及び肺成熟の主要な駆動物質としてIL−33が特定された。具体的には、肺ILC−2は、その機能をIL33−ST2シグナル伝達に依存することが以前に報告されている(de Kleer et al.,2016;Saluzzo et al.,2017)。Il1rl1及びIl33遺伝子の出生後肺組織の一分子蛍光in situハイブリダイゼーション(smFISH)染色は、好塩基球マーカーMcpt8と共に、これらの遺伝子の隣接細胞での共発現を示し、好塩基球及びAT2細胞が肺組織の空間的近接して存在すること示唆している(図5E)。成体の肺組織でのAT2及び好塩基球の免疫組織化学(IHC)染色により、これらの結果が確認され、このシグナル伝達を肺胞ニッチに局在化した(図5F)。肺好塩基球遺伝子発現プロファイルに対するIL−33シグナル伝達の影響を機能的に検証するために、本発明者らは、MARS−seq分析のためにIl1rl1(IL33R)ノックアウトマウスの肺から好塩基球を精製した。本発明者らは、Il1rl1欠損肺好塩基球は、肺に存在する好塩基球に特異的な遺伝子の多くの発現を欠いており、血液循環好塩基球と高い類似性を示すことを見出し(図5G〜H、8A)、これは、IL−33シグナル伝達が肺好塩基球の特定の遺伝子シグネチャーの大部分を媒介していることを示唆している。
肺の環境シグナルであるIL−33及びGM−CSFが肺の好塩基球表現型の誘導に直接関与しているかどうかを試験するために、本発明者らは、これらのサイトカインを添加した培地で骨髄(BM)由来の好塩基球を培養するin vitroシステムを使用した。本発明者らは、BM由来細胞をIL3添加培地で分化させ、cKitのネガティブセレクションにより好塩基球を単離し(BM好塩基球)、増殖培地のみ(IL3)の存在下、又は肺サイトカイン環境のさまざまな組み合わせ、すなわちGM−CSF及び/又はIL−33と共に培養した(図5I、8B〜C)。本発明者らは、IL−33及びGM−CSFはそれぞれ特定の転写プログラムを誘導することがわった(図8D)。IL−33は、リガンドIl6、Il13、Il1b、Tnf、Cxcl2及びCsf2と並んで、転写因子Pou2f2(図5J、8E)を含む肺好塩基球遺伝子シグネチャーの大部分を誘導したが、GM−CSFは肺好塩基球遺伝子プログラムのより小さなセットを誘導した。興味深いことに、本発明者らは、GM−CSFとIL−33の両方と共に培養された細胞が両方のプログラムを活性化することを見出し、これはBM好塩基球シグネチャーに対する両方のサイトカインのコンビナトリアル効果を示唆している(図5K、8F)。さらに、GM−CSF/IL−33分化プログラムに遺伝子発現プロファイルを投影することにより、in vivoの肺及び血液好塩基球を再検討すると、循環からの好塩基球と比較して、肺に存在する好塩基球における両方の発現プログラムの時点に依存しないアップレギュレーションが明らかになった(図5L)。2つの独立したシグナル伝達プログラムのさらなる裏付けは、Il1rl1ノックアウトマウスから得られ、これは、Il1rl1ノックアウト好塩基球がGM−CSF誘導遺伝子の発現を変化させることなくIL−33プログラムを混乱させることを示した(図8G)。一緒に、ノックアウトデータ及びin vitroアッセイの組み合わせは、肺環境が好塩基球に強力な転写プログラムを刻印することを示し、これは、IL−33が優勢で、GM−CSFの寄与が少ない、少なくとも2つの独立したシグナル伝達経路によって媒介される。
(実施例6)
肺好塩基球は、肺胞マクロファージ表現型をナイーブマクロファージに刷り込む。
好塩基球による重要な肺シグナル伝達分子の発現は、それらのシグナル伝達活性、及び他の肺に存在する細胞の独特の表現型の形成における貢献を探求することを本発明者らに促した。肺に存在する好塩基球は、3つの重要な骨髄成長因子であるIl6、Il13、及びCsf1を高度に発現するため、本発明者らは、Il6ra、Il13ra、及びCsf1rを介して他の骨髄細胞、特にマクロファージと相互作用する可能性があると仮定した(図3A〜I、6A〜D、9A)。好塩基球(Mcpt8)及びマクロファージ(F4/80)のIHCは、肺胞形成プロセス中に肺実質内でそれらの空間的近接性を示した(図6E)。マクロファージの分化に対する好塩基球の影響を評価するために、本発明者らは、肺骨髄細胞の成熟に対する肺好塩基球の枯渇の影響を試験した。この目的のために、本発明者らは、抗Fcεr1α(MAR1)抗体又はアイソタイプ対照を新生仔マウスに鼻腔内投与して好塩基球の局所枯渇を誘発し(12時間及び16時間PNで2回注射;方法)、MARS−seq分析のために肺CD45+細胞を30時間PNで収集した。(図9B)。抗Fcεr1α抗体は、FACSとMARS−seqの両方で測定された他の免疫細胞の存在比率を乱すことなく、肺の好塩基球を効率的かつ特異的に枯渇させた(図6F、9C〜D)。肺の好塩基球の枯渇は、マクロファージコンパートメント内のAM画分(マクロファージIII)の減少と結びついていた(図6G)。さらに、好塩基球が枯渇した肺に由来するマクロファージは、抗炎症(M2)モジュール(Clec7a、Ccl17)を含む成熟AMを連想させる遺伝子の発現の減少、及びマクロファージIIに関連する遺伝子の増加を示した(p=10−4;図6H、9E〜F)。具体的には、本発明者らは、AMの特徴的な遺伝子であるIl1rn、Ear1、Lpl、Clec7a、及びSiglec5のレベルのダウンレギュレーションを、マクロファージII及び単球で共有される遺伝子であるF13a1の誘導と同時に観察した(図6I)。適切なAM成熟プロセスは、肺免疫調節及び食細胞としての役割にとって重要であるため、本発明者らは、成体のAM機能に対する構成的好塩基球枯渇の影響をさらに特性評価した。このために、本発明者らは、特に好塩基球が枯渇した成体Mcpt8cre/+DTAfl/+マウスの気管支肺胞洗浄液(BALF)に由来する細胞を同腹仔対照と比較した。どちらの条件でも、BALF細胞は98%AMで構成されていた(図9G)。ただし、Mcpt8cre/+DTAfl/+BALFは、対照同腹仔と比較して全体的に細胞数が少なかった(図6J)。重要なことに、Mcpt8cre/+DTAfl/+由来のAMは、対照と比較して、不活化細菌の貪食作用が損なわれていた(図6K)。一緒に、本発明者らのデータは、肺好塩基球のAMニッチがAMの分化、区画化及び貪食特性にとって重要であることを示している。
肺好塩基球は、肺胞マクロファージ表現型をナイーブマクロファージに刷り込む。
好塩基球による重要な肺シグナル伝達分子の発現は、それらのシグナル伝達活性、及び他の肺に存在する細胞の独特の表現型の形成における貢献を探求することを本発明者らに促した。肺に存在する好塩基球は、3つの重要な骨髄成長因子であるIl6、Il13、及びCsf1を高度に発現するため、本発明者らは、Il6ra、Il13ra、及びCsf1rを介して他の骨髄細胞、特にマクロファージと相互作用する可能性があると仮定した(図3A〜I、6A〜D、9A)。好塩基球(Mcpt8)及びマクロファージ(F4/80)のIHCは、肺胞形成プロセス中に肺実質内でそれらの空間的近接性を示した(図6E)。マクロファージの分化に対する好塩基球の影響を評価するために、本発明者らは、肺骨髄細胞の成熟に対する肺好塩基球の枯渇の影響を試験した。この目的のために、本発明者らは、抗Fcεr1α(MAR1)抗体又はアイソタイプ対照を新生仔マウスに鼻腔内投与して好塩基球の局所枯渇を誘発し(12時間及び16時間PNで2回注射;方法)、MARS−seq分析のために肺CD45+細胞を30時間PNで収集した。(図9B)。抗Fcεr1α抗体は、FACSとMARS−seqの両方で測定された他の免疫細胞の存在比率を乱すことなく、肺の好塩基球を効率的かつ特異的に枯渇させた(図6F、9C〜D)。肺の好塩基球の枯渇は、マクロファージコンパートメント内のAM画分(マクロファージIII)の減少と結びついていた(図6G)。さらに、好塩基球が枯渇した肺に由来するマクロファージは、抗炎症(M2)モジュール(Clec7a、Ccl17)を含む成熟AMを連想させる遺伝子の発現の減少、及びマクロファージIIに関連する遺伝子の増加を示した(p=10−4;図6H、9E〜F)。具体的には、本発明者らは、AMの特徴的な遺伝子であるIl1rn、Ear1、Lpl、Clec7a、及びSiglec5のレベルのダウンレギュレーションを、マクロファージII及び単球で共有される遺伝子であるF13a1の誘導と同時に観察した(図6I)。適切なAM成熟プロセスは、肺免疫調節及び食細胞としての役割にとって重要であるため、本発明者らは、成体のAM機能に対する構成的好塩基球枯渇の影響をさらに特性評価した。このために、本発明者らは、特に好塩基球が枯渇した成体Mcpt8cre/+DTAfl/+マウスの気管支肺胞洗浄液(BALF)に由来する細胞を同腹仔対照と比較した。どちらの条件でも、BALF細胞は98%AMで構成されていた(図9G)。ただし、Mcpt8cre/+DTAfl/+BALFは、対照同腹仔と比較して全体的に細胞数が少なかった(図6J)。重要なことに、Mcpt8cre/+DTAfl/+由来のAMは、対照と比較して、不活化細菌の貪食作用が損なわれていた(図6K)。一緒に、本発明者らのデータは、肺好塩基球のAMニッチがAMの分化、区画化及び貪食特性にとって重要であることを示している。
本発明者らは、in vivoでのAM成熟に対する肺好塩基球の影響により、肺好塩基球が単球又はナイーブマクロファージのAMシグネチャーへの移行を直接促進できるかどうか尋ねた。この仮説のため、本発明者らは、in vitro共培養アッセイを実施した。ナイーブBM由来マクロファージ(BM−MΦ)を、好塩基球を肺好塩基球表現型へと刺激する環境シグナル伝達である、GM−CSFとIL−33の組み合わせの有無にかかわらず、単独で培養するか、両方の細胞型(それぞれ、M−CSF及びIL−3)を支持する増殖培地でBM好塩基球と共培養した(図9H、方法)。BM好塩基球とBM−MΦの共培養は、どの条件でも以前に特徴づけられた好塩基球表現型を変化させなかった(図9I)。ただし、メタセル分析は、好塩基球の有無にかかわらず培養されたBM−MΦの間の明確な区別を示した(図6L)。重要なことに、肺環境で刺激された(GM−CSF+IL33)好塩基球の存在下で増殖したBM−MΦのみが、抗炎症(M2)モジュール(Cc17、Clec7a、Arg1、及びItgax;図6L〜M、9J))を含むAMに関連する遺伝子をアップレギュレートした。特に、BM−MΦ極性化に対するこの効果は、マクロファージが肺環境サイトカイン(GM−CSF及びIL−33)のみを添加した培地で培養された場合には見られず、これらのサイトカインが好塩基球を介したシグナル伝達効果を媒介することを示している(図6L〜M)。本発明者らは、以前に代替の抗炎症(M2)極性化表現型と関連づけられているマクロファージサブセットIII(成熟AM)とIIの間で差次的に発現される多くの遺伝子に影響を及ぼす、他のすべての条件と比較して、肺環境で刺激された好塩基球と共培養されたBM−MΦの遺伝子発現の大きく再現性のある変化を特徴づけた(p<10−10;図6M〜N、9K〜L)(Gordon,2003)。AM成熟に対する肺環境刺激好塩基球の直接効果をさらに調べるために、本発明者らは、次に、主に単球及び未分化AMを含むCD45+CD115+骨髄細胞を30時間PN肺から精製し、共培養実験を行った(図9G)。重要なことに、in vitroにおいてナイーブBM−MΦで誘導された同じ肺好塩基球プログラム(図6M)はまた、肺環境で刺激された好塩基球(GM−CSF+IL−33)で培養された単球及び未分化AMでもアップレギュレートされたのに対し(図6O)、好塩基球が枯渇した肺に由来するマクロファージではダウンレギュレートされていた(図6P)。これらのデータは、好塩基球表現型が組織の環境的な合図によって刷り込まれている可能性があり、その結果、それらが、組織の骨髄細胞における免疫調節活性を媒介していることを示唆している。したがって、本発明者らは、8週齢のマウスの肺に由来する好塩基球の遺伝子発現プロファイルを、B16黒色腫細胞株を注射したマウスの腫瘍微小環境から、並びに8週齢のマウスの脾臓及び肝臓から単離した好塩基球と比較した(図9M)。すべての組織の好塩基球は好塩基球マーカー遺伝子(Mcpt8、Cpa3、Cd200r3、Fcer1α等)を高度に発現したが、肺シグネチャーは排他的であり、主にIl4、Il6、Osm及びIl13等の免疫抑制遺伝子の発現において腫瘍由来の好塩基球との類似性がより高かった(図9M〜N)。まとめると、本発明者らのデータは、肺環境からの指令的なシグナルが好塩基球にサイトカイン及び成長因子の独自の特徴を刷り込み、その後、食細胞及び抗炎症マクロファージへのAMの極性化を含む重要なシグナルを他の肺に存在する細胞に伝播することを示している。
本発明は、その特定の実施形態と併せて説明されてきたが、多くの代替、修正、及び変形が当業者には明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲に含まれるそのようなすべての代替案、修正及び変形を包含することが意図されている。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許又は特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における参考文献の引用又は識別は、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。欄の見出しが使用されている限り、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。
さらに、本出願の優先権書類は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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Claims (47)
- それを必要とする対象において、M2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法であって、
(a)IL33及び/又はGM−SCFの存在下で好塩基球を培養すること、並びに
(b)前記培養後、治療有効量の前記好塩基球を前記対象に投与し、
それにより、前記対象においてM2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害を治療すること、を含む、方法。 - それを必要とする対象において、M2/M1マクロファージ比を増加することから利益を得ることができる疾患又は障害の治療において使用するための、IL33及び/又はGM−SCFの存在下で培養することによって生成された治療有効量の好塩基球。
- 前記好塩基球が血液循環好塩基球であるか、又は骨髄に由来する、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
- (a)の前に、
(i)前記好塩基球を骨髄又は末梢血から単離すること;
(ii)分化した培養物を得るために、IL−3の存在下で前記好塩基球を前記骨髄又は末梢血から分化させること;
(iii)前記分化した培養物からcKIT集団を単離すること、を更に含む、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。 - 前記(ii)が培養物中で8〜10日間行われる、請求項4に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
- 前記(a)が最大48時間行われる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
- 肺好塩基球表現型を達成するように前記培養が行われる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
- 前記肺好塩基球表現型が、Csf1、Il6、Il13、L1cam、Il4、Ccl3、Ccl4、Ccl6、Ccl9及びHgfからなる群から選択される成長因子及びサイトカインの発現を含み、前記発現が血液循環好塩基球よりも高い、請求項7に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
- 前記肺好塩基球表現型が、Il6、Il13、Cxcl2、Tnf、Osm及びCcl4の発現シグネチャーを含む、請求項7又は8に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
- 前記肺好塩基球表現型が、Fcera1+、Il3ra+(Cd123)、Itga2+(Cd49b)、Cd69+、Cd244+(2B4)、Itgam+(Cd11b)、Cd63+、Cd24a+、Cd200r3+、Il2ra+、Il18rap+及びC3ar1+の発現シグネチャーを含む、請求項7又は8に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
- 前記好塩基球がヒトである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
- 前記好塩基球が、Fcer1、Il13ra1、Itga2、Cd69、Cd244、Itgam、Cd63、Cd24、Il2ra、Il18rap及びC3ar1の発現シグネチャーを含む、請求項11に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
- 前記好塩基球が前記対象に対して自家である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
- それを必要とする対象において、M2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法であって、IL6、IL13、及びHGFからなる群から選択される治療有効量のシグナル伝達分子を前記対象に投与し、それにより、対象のM2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害を治療すること、を含む、方法。
- 対象においてM2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害の治療に使用するための、IL6、IL13及びHGFからなる群から選択される治療有効量のシグナル伝達分子。
- 前記治療有効量が、前記M1/M2マクロファージ比を増加させる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
- 前記対象がヒト対象である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
- 前記投与が局所投与経路のものである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
- 前記投与が肺に対するものである、請求項18に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
- M2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害が炎症性疾患である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
- 前記炎症性疾患が、敗血症(sepsis)、敗血症(septicemia)、肺炎、敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群(SIRS)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性肺損傷、誤嚥性肺炎(aspiration pneumanitis)、感染症、膵炎、細菌血症、腹膜炎、腹部膿瘍、外傷による炎症、手術による炎症、慢性炎症性疾患、虚血、臓器又は組織の虚血再灌流障害、疾患による組織損傷、化学療法又は放射線療法による組織損傷、及び摂取、吸入、注入、注射又は送達された物質に対する反応、糸球体腎炎、腸感染症、日和見感染症、並びに大規模な手術又は透析を受けている対象、免疫不全の対象、免疫抑制剤を摂取している対象、HIV/AIDSの対象、心内膜炎が疑われる対象、発熱のある対象、原因不明の発熱のある対象、嚢胞性線維症、糖尿病の対象、慢性腎不全の対象、気管支拡張症の対象、慢性閉塞性肺疾患の対象、慢性気管支炎、気腫又は喘息の対象、熱性好中球減少症の対象、髄膜炎の対象、敗血症性関節炎の対象、***症の対象、壊死性筋膜炎の対象、他のグループA連鎖球菌感染症の疑いのある対象、脾臓切除術を受けた対象、再発性又は腸球菌感染症の疑いのある対象、感染リスクの増加に関連する他の医学的及び外科的状態、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、髄膜炎菌血症、ポンプ後症候群(post−pump syndrome)、心臓スタン症候群、脳卒中、うっ血性心不全、肝炎、喉頭蓋炎(epiglotittis)、E.coli 0157:H7、マラリア、ガス壊疽、毒素性ショック症候群、子癇前症、子癇、HELP症候群、マイコバクテリアによる結核(mycobacterial tuberculosis)、カリニ性肺炎(Pneumocystic carinii)、肺炎、リーシュマニア症、溶血性***症候群/血栓性血小板減少性紫斑病、デング出血熱、骨盤炎症性疾患、レジオネラ、ライム病、インフルエンザA、エプスタイン−バーウイルス(pelvic inflammatory disease)、脳炎、炎症性疾患及び自己免疫疾患(関節リウマチ、骨関節炎、進行性全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、特発性肺線維症、サルコイドーシス、過敏性肺炎、全身性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、心臓、肝臓、肺腎臓骨髄を含む移植、移植片対宿主病、移植片拒絶、鎌状赤血球貧血、ネフローゼ症候群、OKT3等の薬剤の毒性、サイトカイン療法、クリオピリン関連周期熱症候群及び肝硬変を含む)からなる群から選択される、請求項20に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
- M2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害が自己免疫疾患である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
- 前記自己免疫疾患が、アディソン病、アレルギー、円形脱毛症、アルツハイマー病、抗好中球細胞質抗体(ANCA)関連血管炎、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群(ヒューズ症候群)、関節炎、喘息、粥状動脈硬化、動脈硬化巣、自己免疫疾患(例えば、ループス、RA、MS、グレイブス病等)、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、無***症、ベーチェット病、バーガー病、水疱性類天疱瘡、心筋症、心血管疾患、セリアック病/コアリアック病、慢性疲労免疫機能障害症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIPD)、慢性再発性多発ニューロパチー(ギラン−バレ症候群)、チャーグ−ストラウス症候群(CSS)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症(CAD)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、CREST症候群、クローン病、皮膚炎、ヘルペス、皮膚筋炎、糖尿病、円盤状ループス、湿疹後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァン症候群、眼球突出(Exopthalmos)、線維筋痛症、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、免疫増殖性疾患又は障害(例えば、乾癬)、炎症性腸疾患(クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む)、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、間質性肺疾患、若年性糖尿病、若年性関節炎、若年性特発性関節炎(JIA)、川崎病、ランバート−イートン筋無力症候群、扁平苔癬、ループス、ループス腎炎、リンパ球性下垂体炎(Lymphoscytic Lypophisitis)、メニエール病/急性播種性脳脊髄神経根障害、混合性結合組織病、多発性硬化症(MS)、筋肉リウマチ、筋痛性脳脊髄炎(ME)、重症筋無力症、
眼の炎症、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発軟骨炎、多腺性症候群(Polyglandular Syndromes)(ウィタカー症候群)、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変/自己免疫性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群/反応性関節炎、再狭窄、リウマチ熱、リウマチ性疾患、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強皮症、シェーグレン症候群(Sjorgen’s Syndrome)、スティフ・マン症候群、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、全身性硬化症、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、甲状腺炎、1型糖尿病、2型糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、及びウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される、請求項22に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。 - M2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害が肺疾患である、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
- 前記M2/M1マクロファージが肺胞マクロファージを含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
- M2/M1マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害が慢性閉塞性肺疾患(COPD)である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
- それを必要とする対象においてM1/M2マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法であって、前記障害が好塩基球に関連せず、前記対象において好塩基球又は前記好塩基球の活性を枯渇させることを含み、それにより、対象のM1/M2マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害を治療することを含む、方法。
- 前記枯渇が、前記好塩基球又は前記好塩基球の前記活性を枯渇させる薬剤による、請求項27に記載の方法。
- それを必要とする対象においてM1/M2マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害の治療に使用するために、好塩基球又は前記好塩基球の活性を枯渇させる薬剤。
- 前記薬剤が少なくとも1つの好塩基球マーカーに向けられている、請求項27〜29のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
- 前記薬剤がFceR1a、IL33R及び/又はCSF2Rbを標的とする、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
- 前記薬剤がGM−CSF及び/又はIL33を標的とする、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
- 前記枯渇がex−vivoで行われる、請求項27〜31のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
- 前記枯渇がin−vitroで行われる、請求項27〜31のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
- 前記好塩基球が血液循環好塩基球である、請求項27〜34のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
- 前記好塩基球が肺に存在する好塩基球である、請求項27〜34のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
- 前記枯渇が局所的な方法で行われる、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
- M1/M2マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害が癌である、請求項27〜37のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
- M1/M2マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害が黒色腫である、請求項38に記載の方法又は薬剤。
- M1/M2マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害が肺線維症である、請求項27〜34のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
- M1/M2マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害が、癌、線維性疾患からなる群から選択される、請求項27〜37のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
- M1/M2マクロファージ比を増加させる方法であって、マクロファージの近傍から肺好塩基球表現型を有する好塩基球を枯渇させること、又は前記好塩基球の活性を枯渇させることにより、M1/M2マクロファージ比を増加させる方法。
- M2/M1マクロファージ比を増加させる方法であって、マクロファージの近傍に肺好塩基球表現型を有する好塩基球又は前記好塩基球のエフェクターを濃縮することを含み、それによりM2/M1マクロファージ比を増加させる、方法。
- 前記濃縮がGM−CSF及び/又はIL33によるものである、請求項43に記載の方法。
- 前記エフェクターが、IL6、IL13及びHGFからなる群から選択される、請求項43に記載の方法。
- ex−vivoで実施される、請求項42〜45のいずれか一項に記載の方法。
- in−vivoで実施される、請求項42〜45のいずれか一項に記載の方法。
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