JP2021534093A - 腫瘍処置用医薬の製造におけるｔｉｍ−３抗体の使用 - Google Patents

Abstract

腫瘍処置用医薬の製造におけるＴＩＭ−３抗体の使用を開示する。特に、非小細胞肺がん処置用医薬の製造におけるＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供し、ＴＩＭ−３抗体は、配列番号３３で示される重鎖可変領域および配列番号３６で示される軽鎖可変領域を含む。さらに、併用による腫瘍処置用医薬の製造におけるＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントおよびＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供する。

Description

本開示は、腫瘍処置用医薬の製造におけるＴＩＭ−３抗体の使用に関する。

Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ−２）とも称されるＴ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子３（ＴＩＭ−３）は、ＴＩＭファミリーのメンバーであるＩ型膜表面タンパク質である。ヒトＴＩＭ−３分子は３０１アミノ酸からなり、シグナルペプチド、Ｉｇ可変領域（ＩｇＶ領域）、Ｓｅｒ／Ｔｈｒに富むムチン領域、膜貫通領域、および細胞質領域を含み；ヒトＴＩＭ−３はマウスＴＩＭ−３との相同性が６３％である。

ＴＩＭ−３は、多くの方法で免疫系の機能を調節することができる。それはＴｈ１細胞表面のリガンドＧａｌ−９に結合してＴｈ１細胞応答をダウンレギュレートし、Ｔｈ１細胞のアポトーシスを誘導することができる。それは自己および同種免疫疾患（例えば全身性ループス、喘息）ならびに免疫寛容において重要な役割を果たす。

さらに、ＴＩＭ−３は、免疫細胞において発現されるだけではなく、卵巣がん、髄膜腫およびメラノーマといった腫瘍細胞においても過剰発現され、腫瘍増殖を直接に促進する。ＴＩＭ−３発現をダウンレギュレートすることにより、Ｈｅｌａ細胞の浸潤および転移を有意に抑制することができる。ＴＩＭ−３の過剰発現は、肺がん、胃がん、前立腺がんおよび子宮頸がんの予後不良に密接に関連する。血液がんにおいては、ＴＩＭ−３は急性骨髄性白血病の白血病幹細胞およびＭＤＳ患者の造血幹細胞において過剰発現し、ＴＩＭ−３＋造血幹細胞は、低分化、低アポトーシスおよび高増殖といった、悪性の生物学的特徴を有する。したがって、自然免疫系の機能を改善するためのＴＩＭ−３活性の阻害（例えばＴＩＭ−３抗体）は、腫瘍の新たな処置方法となることが期待される（例えば、Ngiow et a1., Cancer Res., 71(21): 1-5 (2011); Guo et a1., Journal of Translational Medicine, 11: 215 (2013); および Ngiow et a1., Cancer Res., 71(21): 6567-6571 (2011)参照）。

現在、ＴＩＭ−３抗体は、いくつかの特許出願、例えばＷＯ２０１１１５９８７７、ＷＯ２０１３００６４９０、ＷＯ２０１５１１７００２、ＷＯ２０１６１４４８０３、ＷＯ２０１６１６１２７０、ＵＳ２０１５０２１８２７４において記載されている。

ＷＯ２０１８１５３３６６（出願日：２０１８年２月２６日）には、活性が高く親和性および安定性に優れる新規ＴＩＭ−３抗体が記載されている。

腫瘍の免疫療法の例として、ＰＤ−１抗体の効果は明らかである。臨床データにより、ＰＤ−１抗体は、５年生存率を悪性腫瘍患者において１７％から３４％に、非小細胞肺がん患者において４％から１６％に高めうることが示されている。しかしながら、すべての患者がＰＤ−１抗体の恩恵を受けることができるわけではなく、ＰＤ−１抗体は全く効果がないか、または効果を短期間維持するに過ぎないことがある。

ＰＤ−１抗体に対する耐性の理由の１つは、腫瘍が新たな免疫回避経路であるＴＩＭ−３を生じていることにあると、Nature Communication（２０１６年２月）に報告されている。この研究において、抗ＰＤ−１耐性マウスモデルの作製にＥＧＦＲ（Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８）およびＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）変異肺がんマウスモデルがそれぞれ用いられた。研究者はまず、処置前および抗ＰＤ−１処置に対する耐性後のマウス腫瘍におけるＴ細胞数の変化を分析し；次いで、ＴＩＭ−３陽性発現と抗ＰＤ−１処置に対する耐性との関係を特に分析し；ＴＩＭ−３陽性発現は抗ＰＤ−１処置の期間に対して有意に時間依存的であり、ＴＩＭ−３陽性発現は処置前および処置感受性期間中は低いが、ＴＩＭ−３陽性発現は薬剤耐性が生じた後は有意に増加することを見出した。ＴＩＭ−３陽性発現は、Ｔ細胞におけるＰＤ−１抗体の結合度にも有意に関連づけられる。ＰＤ−１抗体に対するＴ細胞の結合度が高いほど、ＴＩＭ−３陽性発現が高い。結論として、抗ＰＤ−１療法が有効でないことは、ＴＩＭ−３発現のアップレギュレーションに関連付けられる。この分子は、Ｔ細胞の機能を抑制しＴ細胞不全を促進することによって、ＰＤ−１／Ｌ１と同様の方法で免疫回避を促進する（Nature volume 545, pages 60-65）。さらに、悪性腫瘍または進行固形腫瘍の処置用に、ＰＤ１との組み合わせられた２つのＴＩＭ−３抗体が臨床研究段階にある（NCT02608268およびNCT02817637）。この理由により、単独で、またはＰＤ−１との組み合わせで投与される新たな腫瘍処置用ＴＩＭ−３抗体の開発に、医薬研究者の関心が集まっている。

本開示は、腫瘍処置用医薬の製造におけるＴＩＭ−３抗体の使用を提供する。

いくつかの態様において、ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１４、１５および１６のアミノ酸配列またはそれとの配列同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列で示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲの配列；および配列番号１７、１８および１９のアミノ酸配列またはそれとの配列同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列で示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲの配列、からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ領域配列を含む。

いくつかの態様において、ＴＩＭ−３抗体の軽鎖および重鎖のＣＤＲ配列は次表に示される：

いくつかの態様において、ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８、４３および１０のアミノ酸配列またはそれとの配列同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列で示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲの配列；および配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列またはそれとの配列同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列で示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲの配列、からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ領域配列を含み、ここで、配列番号４３は配列ＤＩＩＰＸ_１Ｘ_２Ｘ_３ＧＳＫＹＮＱＫＦＫＤで示され、ここで、Ｘ_１はＮ、Ｌ、Ｖ、ＭまたはＥから選択され、Ｘ_２はＮ、Ｅ、Ｍ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、ＡまたはＶから選択され、Ｘ_３はＧまたはＡから選択される。

他のいくつかの態様において、ＴＩＭ−３抗体の軽鎖および重鎖のＣＤＲ配列は次表に示される：

好ましくは、いくつかの態様において、ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはその抗原結合フラグメントからなる群から選択される。

いくつかの態様において、ヒト化抗体軽鎖および重鎖可変領域の軽鎖および重鎖ＦＲ領域配列は、ヒト生殖細胞系列軽鎖および重鎖またはその変異配列にそれぞれ由来する。

さらに、いくつかの態様において、ヒト化抗体は、配列番号３１で示される重鎖可変領域またはそのバリアントを含み、好ましくはバリアントは配列番号３１で示される重鎖可変領域と比較して１〜１０のアミノ酸変異を含み、より好ましくはアミノ酸変異はアミノ酸復帰変異Ｑ３ＫおよびＲ８７Ｋであり；ヒト化抗体は、配列番号３２で示される軽鎖可変領域またはそのバリアントを含み、好ましくはバリアントは配列番号３２で示される軽鎖可変領域と比較して１〜１０のアミノ酸変異を含み、より好ましくはアミノ酸変異はアミノ酸復帰変異Ｑ３ＫおよびＩ４８Ｖ、Ｋ４５Ｑ、Ａ４３ＳおよびＴ８５Ｓからなる群から選択される。

上記ヒト化抗体重鎖および軽鎖可変領域の配列は次のとおりである：
重鎖可変領域の配列の配列番号３１：

軽鎖可変領域の配列の配列番号３２：

注：並びはＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４であり、配列中のイタリック体はＦＲ配列を表し、下線はＣＤＲ配列を表す。

いくつかの態様において、ヒト化ＴＩＭ−３抗体重鎖および軽鎖可変領域の配列は次のとおりである：
重鎖可変領域配列の配列番号３３：

軽鎖可変領域配列の配列番号３６：

いくつかの態様において、ヒト化抗体は、配列番号２０で示される重鎖可変領域またはそのバリアントを含み、好ましくはバリアントは配列番号２０で示される重鎖可変領域と比較して１〜１０のアミノ酸変異を含み、より好ましくはアミノ酸変異はアミノ酸復帰変異Ｄ８９Ｅ、Ｒ９８Ｔ、Ｇ４９Ａ、Ｍ４８Ｉ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ３８ＫおよびＶ６８Ａであり；ヒト化抗体は、配列番号２１で示される軽鎖可変領域またはそのバリアントを含み、好ましくはバリアントは配列番号２１で示される軽鎖可変領域と比較して１〜１０のアミノ酸変異を含み、より好ましくはアミノ酸変異はアミノ酸復帰変異Ａ４３Ｓである。

前記ヒト化抗体重鎖および軽鎖可変領域の配列は次のとおりである：
重鎖可変領域配列の配列番号２０：

軽鎖可変領域配列の配列番号２１：

注：並びはＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４であり、配列中のイタリック体はＦＲ配列を表し、下線はＣＤＲ配列を表す。

いくつかの態様において、ヒト化ＴＩＭ−３抗体重鎖および軽鎖可変領域の配列は次のとおりである：
重鎖可変領域配列の配列番号５１：

軽鎖可変領域配列の配列番号２９：

好ましくは、ＴＩＭ−３抗体は、さらにヒト抗体定常領域を含み、好ましくは配列番号４１で示されるヒト重鎖定常領域配列および好ましくは配列番号４２で示されるヒト軽鎖定常領域配列を含む、完全長抗体である。

重鎖定常領域配列は配列番号４１：

で示され、軽鎖定常領域配列は配列番号４２：

で示される。

いくつかの態様において、ＴＩＭ−３抗体の抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ディアボディ）、ジスルフィド結合安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）、およびＣＤＲを含むペプチドの抗原結合フラグメントからなる群から選択される。

他の一側面において、本開示による使用において記載されるＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントと組み合わせて投与される。

抗ＰＤ−１抗体は知られており、ＡＭＰ−２２４、ＧＬＳ−０１０、ＩＢＩ−３０８、ＲＥＧＮ−２８１０、ＰＤＲ−００１、ＢＧＢ−Ａ３１７、ピジリズマブ、ＰＦ−０６８０１５９１、ゲノリムズマブ（Genolimzumab）、ＣＡ−１７０、ＭＥＤＩ−０６８０、ＪＳ−００１、ＴＳＲ−０４２、カムレリズマブ、ぺムブロリズマブ、ＬＺＭ−００９、ＡＫ−１０３およびニボルマブから選択することができるが、それに限定されない。

好ましくは、ＰＤ−１抗体の軽鎖可変領域は、配列番号７６、配列番号７７および配列番号７８でそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み；抗ＰＤ−１抗体の重鎖可変領域は、配列番号７３、配列番号７４および配列番号７５でそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。

他の態様において、抗ＰＤ−１抗体の各ＣＤＲ配列は次表に示される：

好ましくは、抗ＰＤ−１抗体はヒト化抗体またはそのフラグメントである。

他の一態様において、本開示における抗ＰＤ−１抗体の抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよび（Ｆａｂ’）２フラグメントからなる群から選択される抗体フラグメントである。

免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを包含するがそれに限定されない、知られている任意のアイソタイプに由来しうる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を包含するがそれに限されないＩｇＧのサブクラスも当業者に知られている。「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされるＡｂクラスまたはサブクラス（例えばＩｇＭまたはＩｇＧ１）をいう。他のいくつかの態様において、本開示における抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの重鎖定常領域を含み、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの重鎖定常領域を含む。

他のいくつかの態様において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、κまたはλの軽鎖定常領域を含む。

さらに、好ましくは、ヒト化抗体軽鎖可変領域の配列は、配列番号８２で示される配列またはそのバリアントであり、好ましくは、バリアントは軽鎖可変領域において０〜１０のアミノ酸変異を有し、より好ましくは、アミノ酸変異はＡ４３Ｓであり；ヒト化抗体重鎖可変領域の配列は、配列番号８１またはそのバリアントで示され、好ましくは、バリアントは重鎖可変領域において０〜１０のアミノ酸変異を有し、より好ましくは、アミノ酸変異はＧ４４Ｒである。

いくつかの態様において、ヒト化抗ＰＤ−１抗体重鎖および軽鎖可変領域の配列は次のとおりである：
重鎖可変領域：

軽鎖可変領域：

好ましくは、ヒト化抗ＰＤ−１抗体軽鎖配列は、配列番号８０で示される配列またはそのバリアントであり；好ましくは、バリアントは軽鎖可変領域において０〜１０のアミノ酸変異を有し、より好ましくは、アミノ酸変異はＡ４３Ｓであり；ヒト化抗体重鎖配列は、配列番号７９で示される配列またはそのバリアントであり、好ましくは、バリアントは重鎖可変領域において０〜１０のアミノ酸変異を有し、より好ましくは、アミノ酸変異はＧ４４Ｒである。

他の一態様において、ヒト化抗ＰＤ−１抗体の軽鎖配列は配列番号８０で示される配列であり、重鎖配列は配列番号７９で示される配列である：
重鎖：

軽鎖：

本開示において記載するＴＩＭ−３抗体と組み合わせた抗ＰＤ−１抗体は、腫瘍処置用医薬の製造において薬学的相乗効果を示す。

本書に記載するＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト対象における投与量（患者体重にしたがって投与される）は、疾患の種類および重篤度によって、０．１〜１０．０ｍｇ／ｋｇであり、これは０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．２ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．６ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、５．２ｍｇ／ｋｇ、５．４ｍｇ／ｋｇ、５．６ｍｇ／ｋｇ、５．８ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、６．２ｍｇ／ｋｇ、６．４ｍｇ／ｋｇ、６．６ｍｇ／ｋｇ、６．８ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、７．２ｍｇ／ｋｇ、７．４ｍｇ／ｋｇ、７．６ｍｇ／ｋｇ、７．８ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、８．２ｍｇ／ｋｇ、８．４ｍｇ／ｋｇ、８．６ｍｇ／ｋｇ、８．８ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、９．２ｍｇ／ｋｇ、９．４ｍｇ／ｋｇ、９．６ｍｇ／ｋｇ、９．８ｍｇ／ｋｇ、１０．０ｍｇ／ｋｇでありうる。

他の一態様において、ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト対象における投与量（患者体重にしたがって投与される）は、１ｍｇ〜１０００ｍｇであり、これは、１．０ｍｇ、１．２ｍｇ、１．４ｍｇ、１．６ｍｇ、１．８ｍｇ、２．０ｍｇ、２．２ｍｇ、２．４ｍｇ、２．６ｍｇ、２．８ｍｇ、３．０ｍｇ、３．２ｍｇ、３．４ｍｇ、３．６ｍｇ、３．８ｍｇ、４．０ｍｇ、４．２ｍｇ、４．４ｍｇ、４．６ｍｇ、４．８ｍｇ、５．０ｍｇ、５．２ｍｇ、５．４ｍｇ、５．６ｍｇ、５．８ｍｇ、６．０ｍｇ、６．２ｍｇ、６．４ｍｇ、６．６ｍｇ、６．８ｍｇ、７．０ｍｇ、７．２ｍｇ、７．４ｍｇ、７．６ｍｇ、７．８ｍｇ、８．０ｍｇ、８．２ｍｇ、８．４ｍｇ、８．６ｍｇ、８．８ｍｇ、９．０ｍｇ、９．２ｍｇ、９．４ｍｇ、９．６ｍｇ、９．８ｍｇ、１０．０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、８５ｍｇ、９０ｍｇ、９５ｍｇ、１００ｍｇ、１０５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍｇ、１４０ｍｇ、１４５ｍｇ、１５０ｍｇ、１５５ｍｇ、１６０ｍｇ、１６５ｍｇ、１７０ｍｇ、１７５ｍｇ、１８０ｍｇ、１８５ｍｇ、１９０ｍｇ、１９５ｍｇ、２００ｍｇ、２０５ｍｇ、２１０ｍｇ、２１５ｍｇ、２２０ｍｇ、２２５ｍｇ、２３０ｍｇ、２３５ｍｇ、２４０ｍｇ、２４５ｍｇ、２５０ｍｇ、２５５ｍｇ、２６０ｍｇ、２６５ｍｇ、２７０ｍｇ、２７５ｍｇ、２８０ｍｇ、２８５ｍｇ、２９０ｍｇ、２９５ｍｇ、３００ｍｇ、３０５ｍｇ、３１０ｍｇ、３１５ｍｇ、３２０ｍｇ、３２５ｍｇ、３３０ｍｇ、３３５ｍｇ、３４０ｍｇ、３４５ｍｇ、３５０ｍｇ、３５５ｍｇ、３６０ｍｇ、３６５ｍｇ、３７０ｍｇ、３７５ｍｇ、３８０ｍｇ、３８５ｍｇ、３９０ｍｇ、３９５ｍｇ、４００ｍｇ、４０５ｍｇ、４１０ｍｇ、４１５ｍｇ、４２０ｍｇ、４２５ｍｇ、４３０ｍｇ、４３５ｍｇ、４４０ｍｇ、４４５ｍｇ、４５０ｍｇ、４５５ｍｇ、４６０ｍｇ、４６５ｍｇ、４７０ｍｇ、４７５ｍｇ、４８０ｍｇ、４８５ｍｇ、４９０ｍｇ、４９５ｍｇ、５００ｍｇ、５０５ｍｇ、５１０ｍｇ、５１５ｍｇ、５２０ｍｇ、５２５ｍｇ、５３０ｍｇ、５３５ｍｇ、５４０ｍｇ、５４５ｍｇ、５５０ｍｇ、５５５ｍｇ、５６０ｍｇ、５６５ｍｇ、５７０ｍｇ、５７５ｍｇ、５８０ｍｇ、５８５ｍｇ、５９０ｍｇ、５９５ｍｇ、６００ｍｇ、６０５ｍｇ、６１０ｍｇ、６１５ｍｇ、６２０ｍｇ、６２５ｍｇ、６３０ｍｇ、６３５ｍｇ、６４０ｍｇ、６４５ｍｇ、６５０ｍｇ、６５５ｍｇ、６６０ｍｇ、６６５ｍｇ、６７０ｍｇ、６７５ｍｇ、６８０ｍｇ、６８５ｍｇ、６９０ｍｇ、６９５ｍｇ、７００ｍｇ、７０５ｍｇ、７１０ｍｇ、７１５ｍｇ、７２０ｍｇ、７２５ｍｇ、７３０ｍｇ、７３５ｍｇ、７４０ｍｇ、７４５ｍｇ、７５０ｍｇ、７５５ｍｇ、７６０ｍｇ、７６５ｍｇ、７７０ｍｇ、７７５ｍｇ、７８０ｍｇ、７８５ｍｇ、７９０ｍｇ、７９５ｍｇ、８００ｍｇ、８０５ｍｇ、８１０ｍｇ、８１５ｍｇ、８２０ｍｇ、８２５ｍｇ、８３０ｍｇ、８３５ｍｇ、８４０ｍｇ、８４５ｍｇ、８５０ｍｇ、８５５ｍｇ、８６０ｍｇ、８６５ｍｇ、８７０ｍｇ、８７５ｍｇ、８８０ｍｇ、８８５ｍｇ、８９０ｍｇ、８９５ｍｇ、９００ｍｇ、９０５ｍｇ、９１０ｍｇ、９１５ｍｇ、９２０ｍｇ、９２５ｍｇ、９３０ｍｇ、９３５ｍｇ、９４０ｍｇ、９４５ｍｇ、９５０ｍｇ、９５５ｍｇ、９６０ｍｇ、９６５ｍｇ、９７０ｍｇ、９７５ｍｇ、９８０ｍｇ、９８５ｍｇ、９９０ｍｇ、９９５ｍｇ、１０００ｍｇ、好ましくは５０〜６００ｍｇ、最も好ましくは２００ｍｇでありうる。

投与頻度は疾患の種類および重篤度によって異なりうる。いくつかの態様において、本開示において記載するＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントの投与頻度は、週１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、６週に１回、または８週に１回である。

他の一態様において、本開示において記載するＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト対象に、２〜３週毎に１回につき５０〜６００ｍｇの用量で投与される。しかしながら、他の用量も有用であり得、好ましくは２〜３週毎に１回につき２００ｍｇである。

本書に記載される抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト対象における投与量は、０．１〜１０．０ｍｇ／ｋｇであり、これは０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．２ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．６ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、５．２ｍｇ／ｋｇ、５．４ｍｇ／ｋｇ、５．６ｍｇ／ｋｇ、５．８ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、６．２ｍｇ／ｋｇ、６．４ｍｇ／ｋｇ、６．６ｍｇ／ｋｇ、６．８ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、７．２ｍｇ／ｋｇ、７．４ｍｇ／ｋｇ、７．６ｍｇ／ｋｇ、７．８ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、８．２ｍｇ／ｋｇ、８．４ｍｇ／ｋｇ、８．６ｍｇ／ｋｇ、８．８ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、９．２ｍｇ／ｋｇ、９．４ｍｇ／ｋｇ、９．６ｍｇ／ｋｇ、９．８ｍｇ／ｋｇ、１０．０ｍｇ／ｋｇでありうる。

他の一態様において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト対象における投与量は、１ｍｇ〜１０００ｍｇであり、これは１．０ｍｇ、１．２ｍｇ、１．４ｍｇ、１．６ｍｇ、１．８ｍｇ、２．０ｍｇ、２．２ｍｇ、２．４ｍｇ、２．６ｍｇ、２．８ｍｇ、３．０ｍｇ、３．２ｍｇ、３．４ｍｇ、３．６ｍｇ、３．８ｍｇ、４．０ｍｇ、４．２ｍｇ、４．４ｍｇ、４．６ｍｇ、４．８ｍｇ、５．０ｍｇ、５．２ｍｇ、５．４ｍｇ、５．６ｍｇ、５．８ｍｇ、６．０ｍｇ、６．２ｍｇ、６．４ｍｇ、６．６ｍｇ、６．８ｍｇ、７．０ｍｇ、７．２ｍｇ、７．４ｍｇ、７．６ｍｇ、７．８ｍｇ、８．０ｍｇ、８．２ｍｇ、８．４ｍｇ、８．６ｍｇ、８．８ｍｇ、９．０ｍｇ、９．２ｍｇ、９．４ｍｇ、９．６ｍｇ、９．８ｍｇ、１０．０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、８５ｍｇ、９０ｍｇ、９５ｍｇ、１００ｍｇ、１０５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍｇ、１４０ｍｇ、１４５ｍｇ、１５０ｍｇ、１５５ｍｇ、１６０ｍｇ、１６５ｍｇ、１７０ｍｇ、１７５ｍｇ、１８０ｍｇ、１８５ｍｇ、１９０ｍｇ、１９５ｍｇ、２００ｍｇ、２０５ｍｇ、２１０ｍｇ、２１５ｍｇ、２２０ｍｇ、２２５ｍｇ、２３０ｍｇ、２３５ｍｇ、２４０ｍｇ、２４５ｍｇ、２５０ｍｇ、２５５ｍｇ、２６０ｍｇ、２６５ｍｇ、２７０ｍｇ、２７５ｍｇ、２８０ｍｇ、２８５ｍｇ、２９０ｍｇ、２９５ｍｇ、３００ｍｇ、３０５ｍｇ、３１０ｍｇ、３１５ｍｇ、３２０ｍｇ、３２５ｍｇ、３３０ｍｇ、３３５ｍｇ、３４０ｍｇ、３４５ｍｇ、３５０ｍｇ、３５５ｍｇ、３６０ｍｇ、３６５ｍｇ、３７０ｍｇ、３７５ｍｇ、３８０ｍｇ、３８５ｍｇ、３９０ｍｇ、３９５ｍｇ、４００ｍｇ、４０５ｍｇ、４１０ｍｇ、４１５ｍｇ、４２０ｍｇ、４２５ｍｇ、４３０ｍｇ、４３５ｍｇ、４４０ｍｇ、４４５ｍｇ、４５０ｍｇ、４５５ｍｇ、４６０ｍｇ、４６５ｍｇ、４７０ｍｇ、４７５ｍｇ、４８０ｍｇ、４８５ｍｇ、４９０ｍｇ、４９５ｍｇ、５００ｍｇ、５０５ｍｇ、５１０ｍｇ、５１５ｍｇ、５２０ｍｇ、５２５ｍｇ、５３０ｍｇ、５３５ｍｇ、５４０ｍｇ、５４５ｍｇ、５５０ｍｇ、５５５ｍｇ、５６０ｍｇ、５６５ｍｇ、５７０ｍｇ、５７５ｍｇ、５８０ｍｇ、５８５ｍｇ、５９０ｍｇ、５９５ｍｇ、６００ｍｇ、６０５ｍｇ、６１０ｍｇ、６１５ｍｇ、６２０ｍｇ、６２５ｍｇ、６３０ｍｇ、６３５ｍｇ、６４０ｍｇ、６４５ｍｇ、６５０ｍｇ、６５５ｍｇ、６６０ｍｇ、６６５ｍｇ、６７０ｍｇ、６７５ｍｇ、６８０ｍｇ、６８５ｍｇ、６９０ｍｇ、６９５ｍｇ、７００ｍｇ、７０５ｍｇ、７１０ｍｇ、７１５ｍｇ、７２０ｍｇ、７２５ｍｇ、７３０ｍｇ、７３５ｍｇ、７４０ｍｇ、７４５ｍｇ、７５０ｍｇ、７５５ｍｇ、７６０ｍｇ、７６５ｍｇ、７７０ｍｇ、７７５ｍｇ、７８０ｍｇ、７８５ｍｇ、７９０ｍｇ、７９５ｍｇ、８００ｍｇ、８０５ｍｇ、８１０ｍｇ、８１５ｍｇ、８２０ｍｇ、８２５ｍｇ、８３０ｍｇ、８３５ｍｇ、８４０ｍｇ、８４５ｍｇ、８５０ｍｇ、８５５ｍｇ、８６０ｍｇ、８６５ｍｇ、８７０ｍｇ、８７５ｍｇ、８８０ｍｇ、８８５ｍｇ、８９０ｍｇ、８９５ｍｇ、９００ｍｇ、９０５ｍｇ、９１０ｍｇ、９１５ｍｇ、９２０ｍｇ、９２５ｍｇ、９３０ｍｇ、９３５ｍｇ、９４０ｍｇ、９４５ｍｇ、９５０ｍｇ、９５５ｍｇ、９６０ｍｇ、９６５ｍｇ、９７０ｍｇ、９７５ｍｇ、９８０ｍｇ、９８５ｍｇ、９９０ｍｇ、９９５ｍｇ、１０００ｍｇ、好ましくは５０〜６００ｍｇ、最も好ましくは２００ｍｇでありうる。

投与頻度は疾患の種類および重篤度によって異なりうる。いくつかの態様において、本開示において記載する抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントの投与頻度は、週１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、６週に１回、または８週に１回である。

他の一態様において、本開示において記載する抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト対象に、２〜３週毎に１回につき５０〜６００ｍｇの用量で投与される。しかしながら、他の用量も有用であり得、好ましくは２〜３週毎に１回につき２００ｍｇである。

いくつかの態様において、ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト対象における投与量（患者体重にしたがって投与される）は０．１〜１０．０ｍｇ／ｋｇであり、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントの投与量は０．１〜１０．０ｍｇ／ｋｇである。

いくつかの態様において、ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト対象における投与量は１〜１０００ｍｇであり、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントの投与量は１〜１０００ｍｇであり、３週に１回投与される。

いくつかの態様において、ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト対象における投与量（患者体重にしたがって投与される）は１〜１０００ｍｇであり、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントの投与量は５０〜６００ｍｇであり、３週に１回投与される。
ントの投与量は１〜１０００ｍｇであり、３週に１回投与される。

いくつかの態様において、ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト対象における投与量（患者体重にしたがって投与される）は１〜１０００ｍｇであり、３週に１回投与され、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト対象における投与量（患者体重にしたがって投与される）は１〜１０００ｍｇである。

本開示において投与経路は、経口投与、非経口投与、経皮投与であり得、非経口投与は静脈内注射、皮下注射または筋肉内注射を包含するが、それに限定されない。

本開示の好ましい態様において、ＰＤ−１抗体は、皮下または静脈内注射のような注射により投与され、ＰＤ−１抗体は注射の前に注射可能な形態に製剤化されなければならない。特に、好ましくはＰＤ−１抗体の注射可能形態は、ＰＤ−１抗体、緩衝剤、安定剤および場合により界面活性剤を含む、注射用溶液または凍結乾燥粉末である。緩衝剤は、アセテート、シトレート、スクシネートおよびホスフェートからなる群から選択される１つ以上でありうる。安定剤は糖またはアミノ酸から選択されてよく、好ましくは二糖、例えばスクロース、ラクトース、トレハロースおよびマルトースから選択されうる。界面活性剤は、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、脂肪酸グリセリド、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルからなる群から選択され、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは好ましくはポリソルベート２０、４０、６０または８０、最も好ましくはポリソルベート２０である。ＰＤ−１抗体の最も好ましい注射可能形態は、ＰＤ−１抗体、酢酸緩衝剤、トレハロースおよびポリソルベート２０を含む。

本開示は、抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントおよび抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、医薬キットまたは医薬組成物をも提供する。

本開示は、腫瘍を有する患者に処置有効量のＴＩＭ−３抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは／および抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、腫瘍を処置する方法をも提供する。

本開示の使用において記載される腫瘍の例は、乳がん（例えばトリプルネガティブ乳がん）、肺がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば直腸がん、結腸直腸がん）、腎臓がん（例えば腎細胞がん）、肝臓がん（例えば肝細胞がん）、メラノーマ（例えば転移性メラノーマ）、非小細胞肺がん、リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性好中球性白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、免疫芽球性肥満細胞白血病、マントル細胞白血病、多発性骨髄腫、巨核芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、前骨髄球性白血病、赤白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）からなる群から選択されるが、それに限定されない。

他の一態様において、本開示の使用における腫瘍は、非小細胞肺がん、乳がん（例えばトリプルネガティブ乳がん）、メラノーマ（例えば転移性メラノーマ）、腎臓がん、結腸直腸がん、または肝臓がん、好ましくは結腸直腸がんまたは非小細胞肺がんである。

特に別に指定されて、本開示における用語は下記の定義を有する：
本開示において、いわゆる「…と組み合わせて」とは、投与の方法で、少なくとも１つの用量のＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントおよび少なくとも１つの用量の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントが、ある時間内に提供されて、両薬剤が薬理学的効能をもたらす薬理学的効果を示すことを意味する。この時間は、１投与サイクルでありうる。２つの薬剤は同時にまたは前後して投与されうる。

本開示において用いられる「ヒト化抗体」は、ＣＤＲグラフト抗体としても知られるが、マウスＣＤＲ配列をヒト抗体可変領域フレームワークにグラフトすることによって作製される抗体（すなわち、さまざまな種類のヒト生殖細胞系列抗体フレームワーク配列内で作製される抗体）をさす。ヒト化抗体は、マウスタンパク質成分を多量に含むキメラ抗体によって誘導される強い抗体反応を克服する。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公のＤＮＡデータベースまたは公開された文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「VBase」ヒト生殖細胞系列配列データベース（インターネットwww.mrccpe.com.ac.uk/vbaseにおいて利用可能）、およびKabat, EA, etc., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th editionに見出すことができる。本開示の好ましい態様において、ＰＤ−１ヒト化抗体のＣＤＲ配列は、配列番号７３、７４、７５、７６、７７および７８からなる群から選択される。

本開示において用いられる「マウス抗体」は、当分野における知識および技術にしたがって作製されるヒトＴＩＭ−３に対するモノクローナル抗体である。作製において、試験対象にＴＩＭ−３抗原が注射され、その後、所望の配列または機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマが分離される。本発明のいくつかの好ましい態様において、マウスＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスκ、λ鎖の軽鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含むか、またはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３の重鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含む。

本開示において用いられる「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域との融合によって形成される抗体であり、キメラ抗体はマウス抗体により誘導される免疫反応を軽減することができる。キメラ抗体を作製するために、特定のマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをまず作製し、マウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローン化し、次いで所望のようにヒト抗体の定常領域遺伝子をクローン化し、マウス可変領域遺伝子とヒト定常領域遺伝子とを連結してキメラ遺伝子を作製し、それを次いで発現ベクターに挿入することができ、最後にキメラ抗体分子を真核または原核細胞系において発現させる。本発明の好ましい態様において、ＴＩＭ−３キメラ抗体の抗体軽鎖は、ヒトκ、λ鎖の軽鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含む。ＴＩＭ−３キメラ抗体の抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含み、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４重鎖定常領域を含むか、またはアミノ酸変異（例えばＹＴＥ変異または復帰変異）を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４バリアントを含む。

本開示において用いられる抗ＰＤ−１抗体の「抗原結合フラグメント」とは、抗原結合活性を有するＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびヒトＰＤ−１に結合するＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメントをさし；「抗原結合フラグメント」は、本開示において記載される抗体の配列番号１〜配列番号６から選択される１つ以上のＣＤＲ領域を含む。Ｆｖフラグメントは、抗原結合部位をすべて有する最小の抗体フラグメントで、抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むが、定常領域は含まない。Ｆｖ抗体は一般に、ＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、抗原結合に必要な構造を形成することができる。また、さまざまなリンカーを使用して２つの抗体の可変領域を連結して１つのポリペプチド鎖、すなわち一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）を形成することができる。本開示において用語「ＰＤ−１に結合する」とは、ヒトＰＤ−１と相互作用する能力をさす。本開示において用語「抗原結合部位」とは、本開示の抗体または抗原結合フラグメントによって認識される抗原上の個々の三次元部位をさす。

本開示において記載されるＴＩＭ−３抗体の「抗原結合フラグメント」または「機能的フラグメント」とは、抗原（例えばＴＩＭ−３）に特異的に結合する能力を維持している、抗体の１つ以上のフラグメントをいう。抗体の抗原結合機能の発揮のために、完全長抗体のフラグメントを使用できることがわかっている。抗体に係る用語「抗原結合フラグメント」に包含される結合フラグメントの例には、次のものが含まれる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価フラグメント；（ii）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメント；（iii）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（iv）抗体の１つのアームに由来するＶＨおよびＶＬドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるシングルドメインまたはｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546）；および（vi）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）または（vii）場合により合成リンカーで連結された、２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせ。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは個別の遺伝子によってコードされるが、組換え法を用いてそれらを合成リンカーによって連結して、１価分子を形成するようにＶＬおよびＶＨ領域が相互にマッチされた単一のタンパク質鎖を生成できるようにすることができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と称される；例えば、Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883を参照されたい）。そのような一本鎖抗体も、抗体に係る用語「抗原結合フラグメント」包含されることが意図される。そのような抗体フラグメントは、当業者に知られる従来の技術を使用して得られ、フラグメントは、インタクトな抗体と同様の方法で、その機能についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的断片化によって作製することができる。抗体は、さまざまなアイソタイプの抗体、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体でありうる。

Ｆａｂは、分子量が約５００００の、抗原結合活性を有する抗体フラグメントで、ＩｇＧ抗体分子をプロテアーゼであるパパインで処理することによって得られ（Ｈ鎖の位置２２４のアミノ酸残基を切断する）、Ｈ鎖のＮ末端側ほぼ半分およびＬ鎖全体がジスルフィド結合によって連結されたものである。

本開示において記載されるＦａｂは、本発明のモノクローナル抗体（ヒトＴＩＭ−３を特異的に認識し、細胞外領域のアミノ酸配列またはその三次元構造に結合する）をパパインで処理することによって作製することができる。さらに、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核細胞発現ベクターまたは真核細胞発現ベクターに挿入し、ベクターを原核または真核生物に導入してＦａｂを発現させることによって作製することができる。

Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧヒンジ領域の２つのジスルフィド結合の下流部分をペプシン酵素で消化することによって得られる分子量約１０００００の抗体フラグメントであり、Ｆ（ａｂ’）２は抗原結合活性を有し、ヒンジの位置で連結された２つのＦａｂ領域を含む。

本開示において記載されるＦ（ａｂ’）２は、本発明のモノクローナル抗体（ヒトＴＩＭ−３を特異的に認識し、細胞外領域のアミノ酸配列またはその三次元構造に結合する）をペプシンで処理することによって作製することができる。さらに、Ｆ（ａｂ’）２は、後に記載するＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合で連結することにより作製することができる。

Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる、抗原結合活性を有する分子量約５００００の抗体フラグメントである。本発明のＦａｂ’は、本発明のＦ（ａｂ’）２（ＴＩＭ−３を特異的に認識し、細胞外領域のアミノ酸配列またはその三次元構造に結合する）を、ジチオスレイトールのような還元剤で処理することによって作製することができる。

さらに、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを原核細胞発現ベクターまたは真核細胞発現ベクターに挿入し、ベクターを原核生物または真核生物に導入してＦａｂ’を発現させることによって作製することができる。

本開示において記載される「一本鎖抗体」、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体重鎖可変ドメイン（または領域；ＶＨ）が抗体軽鎖可変ドメイン（または領域；ＶＬ）とリンカーで連結されている分子をさす。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ_２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ_２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを有する。従来の適当なリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはそのバリアントからなり、例えば１〜４反復バリアントを使用することができる（Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448）。本発明において使用することができる他のリンカーは、Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56およびRoovers et al. (2001), Cancer Immunolに記載されている。

本開示において記載されるｓｃＦｖは、以下の工程によって作製することができる：本発明のモノクローナル抗体（ヒトＴＩＭ−３を特異的に認識し、細胞外領域のアミノ酸配列またはその三次元構造に結合する）のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを作成し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを作製し、ＤＮＡを原核細胞発現ベクターまたは真核細胞発現ベクターに挿入し、その後、発現ベクターを原核または真核生物に導入してｓｃＦｖを発現させる。

本開示において記載される「有効量」は、医学的な状態の症状または病態を改善または防止するのに十分な量を含む。特定の患者または動物対象のための有効量は、処置する状態、患者の全身的健康状態、投与方法、投与経路、および副作用の重篤度といった因子によって異なりうる。有効量は、顕著な副作用または毒性作用を回避する最大の用量または投与スケジュールでありうる。

本開示において記載される「ＣＤＲ」とは、主に抗原結合に寄与する抗体可変ドメイン内の６つの超可変領域の１つをさす。最も一般的に用いられる６つのＣＤＲの定義の１つが、Kabat E.A. et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242に記載されている。本書に用いられるように、ＫａｂａｔのＣＤＲの定義は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｈ３、またはＬ１、Ｌ２、Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインのＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｈ２、ＣＤＲ Ｈ３、またはＨ２、Ｈ３）のみに適用される。

本開示における組換えられた抗体または抗原結合フラグメントを、従来の方法によって作製および精製することができる。例えば、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローン化し、ＧＳ発現ベクター中に組み込むことができる。組換え免疫グロブリン発現ベクターで、ＣＨＯ細胞を安定にトランスフェクトすることができる。より推奨される従来技術として、哺乳動物発現系によって抗体のグリコシル化を、特に、高度に保存されたＦｃ領域のＮ末端部位において、もたらすことができる。安定なクローンが、ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体の発現によって得られる。陽性クローンを、抗体産生のために、バイオリアクターの無血清培地中で増殖させる。分泌された抗体を含む培養培地を従来の方法で精製することができる。精製のために、例えば、Ａ−またはＧ−セファロースＦＦカラムを、調節したバッファーと共に使用することができる。非特異的に結合した成分を洗浄により除去する。その後、結合した抗体をｐＨ勾配法により溶出させ、抗体フラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出し、収集した。抗体を従来の方法で濾過し濃縮した。可溶性混合物およびポリマーの除去も、分子篩およびイオン交換といった従来の方法で行うことができる。得られた生成物は、直ちに冷凍する、例えば−７０℃で冷凍するか、または凍結乾燥する必要がある。

本開示において用いられる「処置」とは、内服または外用処置剤、例えば本発明の結合化合物の任意の１つを含む組成物を、１つ以上の疾患症状を有する患者に投与することをいい、処置剤は症状に対して処置効果を有することがわかっている。

ヒトと動物とでは、同じ薬剤に対する忍容性が大きく異なる。一般的に、動物はヒトよりも忍容性が高い。一般的に、以下の比を用いて換算がなされる：ヒト用の用量が１と規定されるとき、マウスおよびラット用には２５〜５０、ウサギおよびモルモット用には１５〜２０、ならびにイヌおよびネコ用には５〜１０。さらに、換算を行うのに、ヒトおよび動物の体表面積計算法を使用することができる。１）Xu Wenの式（Chinese Journal of Physiology, 12, 327, 1937）およびMech-Rubnerの式といったヒト体表面積計算法が一般的に考慮される。本開示において、ヒトとさまざまな種類の動物との間の薬剤用量換算のために、上記方法を適用することができる。

本開示において用いられる「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド間の配列類似性をいう。比較される２つの配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットで占められているとき、例えば２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンで占められているとき、分子はその位置において相同であると見做される。２つの配列間の相同性パーセンテージは、２つの配列においてマッチするまたは相同である位置の数を、比較される位置の数で除し、１００を乗じた関数である。例えば、最適な配列アラインメントにおいて、２つの配列において１０の位置のうちマッチするまたは相同である位置が６つある場合、２つの配列は相同性が６０％であると見做され；２つの配列において１００の位置のうちマッチするまたは相同である位置が９５ある場合、２つの配列は相同性が９５％であると見做される。一般的に、比較は、２つの配列が最大の相同性パーセントを得るようにアラインされたときになされる。

本開示において用いられる「医薬組成物」とは、本書に記載される化合物またはその生理学的／薬学的に許容される塩もしくは前駆体の１つ以上ならびに他の化学的成分を含む混合物をいう。例えば、他の成分は、生理学的／薬学的に許容しうる担体および賦形剤である。医薬組成物の目的は、活性成分の吸収およびそれによる生物学的活性に寄与する、生体への投与を促進することである。

全生存期間（ＯＳ）とは、任意の原因による死亡までのランダムな期間をいう。最後のフォローアップ時にまだ生存している対象については、ＯＳは最後のフォローアップ時点の打ち切りデータとしてカウントされる。フォローアップから脱落している対象については、ＯＳは、フォローアップ脱落前に最後に生存確認された時点における打ち切りデータとしてカウントされる。打ち切りデータのＯＳは、ランダムなグループ分けから打ち切りまでの期間として定義される。

奏効率（ＯＲＲ）とは、腫瘍があるレベルまで縮小し、ある期間にわたり維持された患者の割合をいい、ＣＲおよびＰＲ症例を包含する。腫瘍縮小効果（objective tumor response）を評価するために、固形がんの治療効果判定基準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors）（ＲＥＣＩＳＴ １．１基準）を使用した。対象は、測定可能な腫瘍病変をベースラインにおいて有していなければならず、効果判定基準はＲＥＣＩＳＴ １．１基準にしたがって、完全寛解（ＣＲ）、部分寛解（ＰＲ）、安定（ＳＤ）、および進行（ＰＤ）に分けられる。

病勢コントロール率（ＤＣＲ）：腫瘍がＣＲ／ＰＲ／ＳＤであるとの最初の評価時点から、ＰＤであるとの最初の評価時点または任意の原因による死亡までの期間。

１２箇月／２４箇月生存率（全生存率、ＯＳＲ）：初回投与から１２箇月／２４箇月のフォローアップ後にまだ生存している症例の割合。

病勢コントロール率（ＤＣＲ）：完全寛解（ＣＲ）または部分寛解（ＰＲ）または安定（ＳＤ≧８週）の最良総合効果（ＢＯＲ）を示す対象の割合をいう

完全寛解（ＣＲ）：すべての標的病変が消失する、およびすべての異常リンパ節（標的および非標的節を含む）のそれぞれの短径が＜１０ｍｍに短縮しなければならない。

部分寛解（ＰＲ）：すべての標的病変の直径の合計が、ベースラインレベルから少なくとも３０％減少する。

進行（ＰＤ）：すべての標的病変の直径の合計が、試験全体にわたり測定された前記合計の最小値である参照値と比較して少なくとも２０％増加する（ベースライン測定値が最小値である場合、ベースライン測定値が参照値として設定される）；さらに、直径の合計の絶対値が少なくとも５ｍｍ増加していなければならない（１つ以上の新たな病変の存在も進行と見做される）。

安定（ＳＤ）：標的病変の減少の程度がＰＲに達せず、増加の程度がＰＤレベルに達せず、それらの間にある。試験中、直径の合計の最小値を参照値として使用することができる。

ヒト非小細胞肺がんＨＣＣ８２７マウス異種移植腫瘍に対するＴＩＭ−３抗体の効果。 マウスにおける相対腫瘍体積に対する抗体の効果。

以下、実施例を挙げて本開示をさらに説明する。しかしながら、本開示の範囲はそれに限定されない。

実施例１．ＴＩＭ−３抗原および検出に用いられるタンパク質の調製
１．ＴＩＭ−３抗原のデザインおよび発現
UniProt Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ヒトＨＡＶＣＲ２、ヒトＴＩＭ−３、Uniprot No: Q8TDQ0）を、本発明のＴＩＭ−３のテンプレートとして使用し、本発明の抗原および検出用タンパク質のアミノ酸配列をデザインし、場合によりさまざまなタグをＴＩＭ−３タンパク質に融合し、その後、ｐＨｒベクター（自家製）またはｐＴａｒｇｅＴベクター（Promega, A1410）中にそれぞれクローン化した。ベクターを、２９３細胞において一過性に発現させるか、またはＣＨＯ−Ｓにおいて安定に発現させ、次いで精製して、コードされた本発明の抗原および検出用タンパク質を得た。特記しない限り、以下のＴＩＭ−３抗原はヒトＴＩＭ−３をいう。

マウスの免疫に使用されるＴＩＭ−３細胞外領域およびｈＩｇＧ１ Ｆｃの融合タンパク質：ＴＩＭ−３−Ｆｃ（配列番号１）

注：下線部はシグナルペプチドを表し、イタリック体の部分はＦｃを表す。

検出に使用されるＦｌａｇおよびＨｉｓタグ付きＴＩＭ−３細胞外領域：ＴＩＭ−３−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ（配列番号２）
ＴＩＭ−３−ｆｌａｇ−Ｈｉｓ

注：下線部はシグナルペプチドを表し、イタリック体の部分はＦｌａｇ−Ｈｉｓタグを表す。

ＴＩＭ−３過剰発現細胞株の作製に使用される完全長ＴＩＭ−３：
ＴＩＭ−３−完全長（配列番号３）

２．ＴＩＭ−３関連組換えタンパク質の精製、およびハイブリドーマ抗体および組換え抗体の精製
２．１ ＴＩＭ−３−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ組換えタンパク質の精製工程
サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去し、適当な体積に濃縮した。ＮＩ−ＮＴＡアフィニティーカラム（QIAGEN, Cat No. 30721）をＰＢＳで平衡化し、カラム体積の２〜５倍で洗った。不純物の除去後、細胞発現上清サンプルをカラムにロードした。カラムを、Ａ２８０の読み取り値がベースラインに低下するまでＰＢＳで洗った。カラムをＰＢＳで洗って不純物のタンパク質を流し、標的タンパク質を収集した。標的タンパク質は、洗浄バッファー（２０ｍＭイミダゾール）および溶出バッファー（３００ｍＭイミダゾール）で順次溶出し、溶出ピークを収集した。

収集した溶出液を、イオン交換（Hiload 16/600 Superdex 200カラム）によってさらに精製した。カラムを、ｐＨ７．４となるように約２カラム体積のＰＢＳで平衡化した。標的タンパク質を含むことが確認されている溶出バッファーを濃縮後にロードし、サンプルを収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ−ＭＳによって確認し、後の使用のために小分けした。

２．２ ハイブリドーマ、組換え抗体、およびＦｃ融合タンパク質の精製
細胞発現上清サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去し、ハイブリドーマ発現上清をプロテインＧカラムで精製し、組換え抗体およびＦｃ融合タンパク質発現上清をプロテインＡカラムで精製した。カラムを、Ａ２８０の読み取り値がベースラインに低下するまでＰＢＳで洗った。標的タンパク質を、１００ｍＭ酢酸ｐＨ３．０で溶出させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。溶出したサンプルを適当に濃縮し、ＰＢＳで平衡化したゲルクロマトグラフィーSuperdex 200（GE）によってさらに精製した。非凝集体のピークを収集し、後の使用のために小分けした。

実施例２．抗ヒトＴＩＭ−３モノクローナル抗体の調製
１．動物免疫
マウスを免疫することによって抗ヒトＴＩＭ−３モノクローナル抗体を製造した。６〜８週齢の雌ＳＪＬ白マウス（Beijing Charles River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., animal production license number: SCXK (Beijing) 2012-0001）を実験に使用した。飼育環境：ＳＰＦレベル。マウスを購入後、１２／１２時間の明／暗サイクル調節、温度２０〜２５℃、湿度４０〜６０％の実験室環境に１週間順応させた。環境に順応したマウスを、下記のプロトコルにしたがって免疫した。免疫用の抗原は、Ｆｃタグ付きのヒトＴＩＭ−３の細胞外領域であった（配列番号１）。

免疫プロトコル：マウスの免疫のために、QuickAntibody-Mouse5W（KX0210041）を使用した。抗原とアジュバントの比は１：１で、１回につき１０μｇ／マウスである（初回免疫／追加免疫）。抗原とアジュバントを素早く十分に混合してから、接種した。接種期間において、初回および２回目の免疫の間隔は２１日、以降の免疫の間隔は１４日とした。各免疫の７日後に採血し、マウス血清中の抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。血清中の抗体力価が高く、その力価がプラトーに達したマウスを、脾細胞融合のために選択した。脾細胞融合の３日前に追加免疫を行い、生理食塩液で調製した抗原溶液を２０μｇ／マウスで腹腔内（ＩＰ）注射した。

２．脾臓細胞融合
最適化したＰＥＧ仲介融合ステップを用いて脾臓リンパ球とミエローマ細胞Ｓｐ２／０細胞（ATCC（登録商標） CRL-8287（商標））を融合してハイブリドーマ細胞を得た。融合されたハイブリドーマ細胞を４〜５ Ｅ５／ｍｌの密度で完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴ、１×ＯＰＩを含むＤＭＥＭ培地）に再懸濁し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで播種し、５％ＣＯ_２中、３７℃で３〜４日間インキュベートし、その後、ＨＡＴ完全培地を１００μｌ／ウェルで加えて、ピンポイント様のクローンが形成されるまで細胞をさらに３〜４日間培養した。上清を除去し、２００μｌ／ウェルのＨＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＴ、１×ＯＰＩを含むＲＰＭＩ−１６４０培地）を加え、５％ＣＯ_２中、３７℃で３日間インキュベートし、その後、ＥＬＩＳＡによる検出を行った。

３．ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
ハイブリドーマ細胞の増殖密度にしたがって、ハイブリドーマ培養上清を結合ＥＬＩＳＡ法によって検出した（実施例４、試験実施例１参照）。結合ＥＬＩＳＡ法において確認された陽性ウェルの細胞上清を使用して、ＴＩＭ−３過剰発現細胞結合実験を行った（実施例４、試験実施例２参照）。タンパク質結合および細胞結合の両方に陽性であるウェル中の細胞を、凍結保存に間に合うように増幅し、単一の細胞クローンが得られるまで２〜３回サブクローニングすべきである。

ＴＩＭ−３結合ＥＬＩＳＡおよび細胞結合実験は、細胞サブクローニングのそれぞれに必要であった。ハイブリドーマクローンを上記実験によってスクリーニングし、分泌された抗体ｍＡｂ−１７０１およびｍＡｂ−１７９９を得た。抗体を、無血清細胞培養法によってさらに調製した。抗体を精製実施例にしたがって精製し、試験実施例での使用に供した。

４．ハイブリドーマ陽性クローンのシーケンシング
陽性ハイブリドーマからの配列のクローニング方法は、次のとおりであった。対数増殖期にあるハイブリドーマ細胞を収集し、Trizol（Invitrogen, Cat No. 15596-018）で、キットの指示書にしたがってＲＮＡを抽出し、逆転写のためにPrimeScript（商標）逆転写酵素キットを使用した（Takara, Cat No. 2680A）。逆転写によって得たｃＤＮＡをマウスＩｇプライマーセット（Novagen, TB326 Rev. B 0503）を用いるＰＣＲにより増幅し、シーケンシング会社に送った。ｍＡｂ−１７０１およびｍＡｂ−１７９９の重鎖および軽鎖可変領域のＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列を得た：
ｍＡｂ−１７０１重鎖可変領域（配列番号４）

ｍＡｂ−１７０１軽鎖可変領域（配列番号５）

ｍＡｂ−１７９９重鎖可変領域（配列番号６）

ｍＡｂ−１７９９軽鎖可変領域（配列番号７）

各抗体の軽鎖および重鎖のＣＤＲ配列を表１に示す。

実施例３．抗ヒトＴＩＭ−３マウスハイブリドーマモノクローナル抗体のヒト化
１．抗ＴＩＭ−３抗体ｍＡｂ−１７０１のヒト化
ヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域のＩＭＧＴ生殖細胞系列遺伝子データベースに対してＭＯＥソフトウェアによってアラインすることにより、ｍＡｂ−１７０１抗体と相同性の高い重鎖および軽鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子をテンプレートとして選択し、マウス抗体のＣＤＲを対応するヒトテンプレートにそれぞれグラフトして、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の並びの可変領域を形成した。Ｋａｂａｔナンバリングシステムによってアミノ基残基を同定し注釈付けした。

１．１ ハイブリドーマクローンｍＡｂ−１７０１用のヒト化フレームワークの選択
マウス抗体ｍＡｂ−１７０１のヒト化用の軽鎖テンプレートは、ＩＧＫＶ１−３３＊０１およびｈｊｋ４．１であり、ヒト化用の重鎖テンプレートは、ＩＧＨＶ１−１８＊０１およびｈｊｈ４．１であった。ヒト化された可変領域配列は次のとおりである：
ｈ１７０１ＶＨ−ＣＤＲグラフト（配列番号２０）

ｈ１７０１ＶＬ−ＣＤＲグラフト（配列番号２１）

注：並びはＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４で、配列中のイタリック体はＦＲ配列を示し、下線部はＣＤＲ配列を示す。

１．２ ｈ１７０１についてのテンプレートの選択および復帰変異のデザイン
具体的な変異のデザインを表２に示す：

注：例えば、Ａ４３Ｓは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにしたがう位置４３のＡがＳに復帰変異されることを意味する。「グラフト」は、マウス抗体ＣＤＲの配列がヒト生殖細胞系列ＦＲ領域に移植されたものを表す。

注：本表は、さまざまな変異の組み合わせによって得た配列を示す。ｈ１７０１−００７により示されるように、ヒト化マウス抗体ｈ１７０１−００７は２つの変異を有する（軽鎖ｈ１７０１＿ＶＬ．１Ａおよび重鎖ｈ１７０１＿ＶＨ．１Ａ）。他のものも同様の方法で示すことができる。

ヒト化１７０１の特定の配列は次のとおりである：
＞ｈ１７０１＿ＶＨ．１（ｈ１７０１ＶＨ−ＣＤＲグラフトと同じ；配列番号２２）

＞ｈ１７０１ｈ１７０１＿ＶＨ．１Ａ（配列番号２３）

＞ｈ１７０１＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号２４）

＞ｈ１７０１＿ＶＨ．１Ｃ（配列番号２５）

＞ｈ１７０１＿ＶＨ．１Ｄ（配列番号２６）

＞ｈ１７０１＿ＶＨ．１Ｅ（配列番号２７）

＞ｈ１７０１＿ＶＨ．１Ｆ（配列番号２８）

＞ｈ１７０１＿ＶＬ．１（ｈ１７０１ＶＬ−ＣＤＲグラフトと同じ；配列番号２９）

＞ｈ１７０１＿ＶＬ．１Ａ（配列番号３０）

２．抗ＴＩＭ−３抗体ｍＡｂ−１７９９のヒト化
ヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域のＩＭＧＴ生殖細胞系列遺伝子データベースに対してＭＯＥソフトウェアによってアラインすることにより、ｍＡｂ−１７９９抗体と相同性の高い重鎖および軽鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子をテンプレートとして選択し、マウス抗体のＣＤＲを対応するヒトテンプレートにそれぞれグラフトして、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の並びの可変領域を形成した。Ｋａｂａｔナンバリングシステムによってアミノ基残基を同定し注釈付けした。

２．１ ハイブリドーマクローン１７９９用のヒト化フレームワークの選択
マウス抗体１７９９のヒト化用の軽鎖テンプレートは、ＩＧＫＶ１−３９＊０１およびｈｊｋ２．１であり、ヒト化用の重鎖テンプレートは、ＩＧＨＶ３−７＊０１およびｈｊｈ４．１であった。ヒト化された可変領域配列は次のとおりである：
ｈ１７９９ＶＨ−ＣＤＲグラフト（配列番号３１）

ｈ１７９９ＶＬ−ＣＤＲグラフト（配列番号３２）

注：並びはＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４で、配列中のイタリック体はＦＲ配列を示し、下線部はＣＤＲ配列を示す。

２．２ ハイブリドクローン１７９９ついてのテンプレートの選択および復帰変異のデザイン；表４参照

注：例えば、Ｉ４８Ｖは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにしたがう位置４８のＩがＶに復帰変異されることを意味する。「グラフト」は、マウス抗体ＣＤＲの配列がヒト生殖細胞系列ＦＲ領域に移植されたものを表す。

注：本表は、さまざまな変異の組み合わせによって得た配列を示す。ｈ１７９９−００５により示されるように、ヒト化マウス抗体ｈ１７９９−００５は２つの変異を有する（軽鎖ｈ１７９９＿ＶＬ．１Ａおよび重鎖ｈ１７９９＿ＶＨ．１）。他のものも同様の方法で示すことができる。

ヒト化１７９９の特定の配列は次のとおりである：
＞ｈ１７９９＿ＶＨ．１（ｈ１７９９ＶＨ−ＣＤＲグラフトと同じ；配列番号３３）

＞ｈ１７９９＿ＶＨ．１Ａ（配列番号３４）

＞ｈ１７９９＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号３５）

＞ｈ１７９９＿ＶＬ．１（ｈ１７９９ＶＬ−ＣＤＲグラフトと同じ；配列番号３６）

＞ｈ１７９９＿ＶＬ．１Ａ（配列番号３７）

＞ｈ１７９９＿ＶＬ．１Ｂ（配列番号３８）

＞ｈ１７９９＿ＶＬ．１Ｃ（配列番号３９）

＞ｈ１７９９＿ＶＬ．１Ｄ（配列番号４０）

実施例４．組換えキメラ抗体およびヒト化抗体の作製および効果試験
該抗体用に、ヒト重鎖ＩｇＧ４／軽鎖κの定常領域を、対応する可変領域のそれぞれと組み合わせ、ＩｇＧ４抗体の安定性を高めるためにＦｃ部分にＳ２２８Ｐ変異を導入した。性能改善のために、当分野において知られる他の変異も使用することができる。

重鎖定常領域の配列は、配列番号４１：

で示され；軽鎖定常領域の配列は、配列番号４２：

で示される。

１．組換えキメラ抗体の分子クローニング
ハイブリドーマスクリーニングによって得た陽性の抗体分子をシーケンシングして、可変領域をコードする遺伝子の配列を得た。シーケンシングによって得た配列に基づいて、シーケンシングした遺伝子をテンプレートとして用いて、フォワードおよびリバースプライマーをデザインし；さまざまな抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子断片をＰＣＲによって作製し、次いで発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよびｈＩｇＧ４／ｈκ定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ）断片を有する）に相同的に組換え、組換えキメラ抗体完全長発現プラスミドＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ−ｐＨｒ／ＶＬ−ＣＬ−ｐＨｒを、２つのキメラ抗体Ｃｈ１７０１およびＣｈ１７９９用に作製した。

２．ヒト化抗体の分子クローニング
ヒト化デザイン後の抗体配列をコドン最適化に付して、ヒトコドン優先性を有するコーディング遺伝子配列を得、さまざまな抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子断片をＰＣＲによって作製するためのプライマーをデザインし、次いで断片を発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよびｈＩｇＧ４／ｈκ定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ）断片を有する）に相同的に組換えて、ヒト化抗体完全長発現プラスミドＶＨ−ＣＨ１−ＦＣ−ｐＨｒ／ＶＬ−ＣＬ−ｐＨｒを作製した。

３．組換えキメラ抗体およびヒト化抗体の発現および精製
抗体軽鎖および重鎖を個別に発現するプラスミドを１：１．２の比でＨＥＫ２９３Ｅ細胞に導入し、６日後に発現上清を採取し、高速で遠心分離して不純物を除去し、プロテインＡカラムで精製した。Ａ２８０の読み取りがベースラインに低下するまで、カラムをＰＢＳで洗った。目的のタンパク質を酸性の溶出溶液ｐＨ３．０〜ｐＨ３．５で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０〜９．０で中和した。溶出サンプルを適切に濃縮し、ＰＢＳ平衡化ゲルクロマトグラフィーSuperdex 200（GE）によってさらに精製した。凝集物のピークを除去し、モノマーのピークを採取して、後の使用のために小分けにした。

実施例５．ｈ１７０１抗体の部位特異的変異
脱アミド改変は、抗体において、後の段階で安定性に影響しうる一般的な化学的改変である。特に、ＣＤＲ領域のいくつかのアミノ酸が高度に脱アミド化、酸化または異性化され；そのような変異は一般に、できるだけ回避または低減されるべきである。加速安定性実験およびコンピューターでシミュレートされる抗体構造ならびにホットスポット予測によると、ｈ１７０１抗体の重鎖ＣＤＲ２におけるＮＮＧは、脱アミド化感受性の部位である。前記ＮＮＧは、ｈ１７０１抗体の重鎖可変領域の位置５４〜５６にそれぞれ位置する。アミノ酸の性質および抗体構造コンピューターシミュレーション技術にしたがって、前記位置のアミノ酸は、任意のアミノ酸で置換されうる。好ましくは、ｈ１７０１のＣＤＲ２ミュータントは、ＤＩＩＰＸ_１Ｘ_２Ｘ_３ＧＳＫＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号４３）で示され、ここで、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_３は、ｈ１７０１抗体重鎖可変領域における位置５４〜５６のアミノ酸残基であり；Ｘ_１はＡｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＭｅｔおよびＧｌｕからなる群から選択され；Ｘ_２はＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＶａｌからなる群から選択され；Ｘ_３はＧｌｙおよびＡｌａからなる群から選択される。

さらに、前記の位置５４〜５６における変異を含むＣＤＲ２を、さまざまな復帰変異を含むＦＲ領域と組み合わせて、以下の重鎖可変領域を形成することができる：
＞ｈ１７０１＿ＶＨ．１−ＣＤＲ２ミュータント（配列番号４４）

＞ｈ１７０１＿ＶＨ．１Ａ−ＣＤＲ２ミュータント（配列番号４５）

＞ｈ１７０１＿ＶＨ．１Ｂ−ＣＤＲ２ミュータント（配列番号４６）

＞ｈ１７０１＿ＶＨ．１Ｃ−ＣＤＲ２ミュータント（配列番号４７）

＞ｈ１７０１＿ＶＨ．１Ｄ−ＣＤＲ２ミュータント（配列番号４８）

＞ｈ１７０１＿ＶＨ．１Ｅ−ＣＤＲ２ミュータント（配列番号４９）

＞ｈ１７０１＿ＶＨ．１Ｆ−ＣＤＲ２ミュータント（配列番号５０）

ｈ１７０１のＨＣＤＲ２ミュータントに関する配列の例、および対応するＣＤＲ２ミュータントを含むヒト化配列ｈ１７０１＿ＶＨ．１Ｂ−ＣＤＲ２ミュータント（配列番号４６）を、以下のミュータントおよび表６に示す。

例として、ｈ１７０１−００９のＨＣＤＲ２におけるＮＮＧは、ＮＬＧ、ＮＶＧ、ＮＮＡ、ＮＭＡ、ＮＥＡ、ＮＨＡ、ＮＭＧ、ＮＥＧ、ＮＫＧ、ＮＡＧまたはＮＨＧとして変異されるようにデザインされた（前記重鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸ミュータントの配列は、それぞれ、配列番号５１〜６１で示される）。発現プラスミドの作製および２９３Ｅ発現を分子クローニングの方法によって行い、ミュータント抗体を精製し、その後さらに親和性および安定性について試験した。

例示バリアントの親和性検出の結果を、試験実施例１および３にそれぞれ示す。

ｈ１７０１−００９に対して一連のアミノ酸変異を行い、特に関連のある配列は表６に記載のものを包含するが、それに限定されない。化学的安定性試験の具体的な結果を試験実施例９において示す。

試験実施例１：ＨＣＣ８２７マウスにおけるヒト非小細胞肺がん皮下異種移植に対するＴＩＭ−３抗体の処置効果の評価および比較
実験動物および飼育条件
雌ＮＯＧマウスをBeijing Charles River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.（(Beijing China, Certificate number 11400700200456, license SCXK (Beijing) 2016-0006）から購入し、購入時に４〜６週齢であり、体重は約１８ｇであり、１２／１２時間の明／暗サイクル調節、２３±１℃の一定温度、５０〜６０％の湿度にて、ケージ１個当たり５匹で、食餌および水を自由に摂取させて維持した。

試験した抗体：
Ｃ２５−ｈＩｇＧ４（WTRC25, US6114143）：５．３９ｍｇ／ｍｌの濃度で、送達量は３７．７３ｍｇであった。
ｈ１７９９−００５：１２．００ｍｇ／ｍｌの濃度で、送達量は２７ｍｇであった。
ＭＢＧ−４５３（Novartis AG）：５．４４ｍｇ／ｍｌの濃度で、送達量は２５ｍｇであった。
ｈ１７０１−００９ＮＬＧ：６．３０ｍｇ／ｍｌの濃度で、送達量は２４ｍｇであった。

調製方法：無菌条件下にパイロジェンフリーのピペットチップを使用して上記抗体をＰＢＳで２ｍｇ／ｍｌに希釈し、全部で１０本のチューブに１．２ｍｌ／チューブで分注し、４℃で保存し、それぞれの注射用に１本のチューブを取り出した。

ＰＢＭＣ抽出
本実験に使用したＰＢＭＣは、２名の志願者の新鮮な血液から抽出した。抽出方法は次のとおりであった：
ａ）静脈血を、凝集を防ぐためにヘパリンで処理し、等体積の２％ＦＢＳ含有ＰＢＳと混合した；
ｂ）１５ｍｌの分離溶液１０７７を無菌的に５０ｍｌ分離チューブに移した（予め１０７７をよく混合するためにチューブを穏やかに反転させた）；
ｃ）２５ｍｌの希釈血液を遠心チューブ内の１０７７に注意深く加えた（希釈血液と１０７７を混合することなく、血液と１０７７の間に明らかな層を形成するように室温でゆっくりと加えた）；
ｄ）サンプルを室温で１０分間、１２００ｇで遠心分離した。赤血球および多核白血球を遠心分離により沈殿させ、単核リンパ球の層を１０７７の上に形成させた。リンパ球の上４〜６ｃｍの血漿を吸引した；
ｅ）リンパ球層およびリンパ球層下の１０７７の半分を吸引し、別の遠心チューブに移した。等体積のＰＢＳを加え、室温で８分間、３００ｇで遠心分離した；
ｆ）細胞をＰＢＳまたはＲＰＭＩ−１６４０培地で洗い、血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁させた。

試験工程：
２００μｌのＨＣＣ８２７細胞（１×１０^７細胞／マウス）（５０％マトリゲルを含む）を、ＮＯＧマウスの右肋骨部に皮下接種した。１６日後、大き過ぎるまたは小さ過ぎる腫瘍を有する動物を除外し、平均腫瘍体積約２１５ｍｍ^３のマウスをランダムに４群に分けた：無関係の抗体Ｃ２５ ＩｇＧ４ １０ｍｐｋ、ＭＢＧ−４５３ １０ｍｐｋ、ｈ１７９９−００５ １０ｍｐｋ、およびｈ１７０１−００９ＮＬＧ １０ｍｐｋ、各群に１０匹のマウス（０日目）；試験中、＃６０−００８Ｌ １０ｍｐｋの群における１匹が、ＰＢＭＣ注射後に持続的な体重減少を示し、１９日目に死亡した（ＧＶＨＤ罹患が疑われた）。実際に９匹の動物が含まれた。２名の志願者から新鮮抽出されたＰＢＭＣは１：１の比で混合し、混合物をＮＯＧマウスに５×１０^６細胞／１００μｌで腹腔内注射し、各抗体も、週に２回で全部で７回、腹腔内注射し（表１）；腫瘍体積および動物体重を週２回でモニターし、データを記録した。試験の終了時に、動物を安楽死させ、腫瘍を摘出し、重量測定した。

データ処理
ExcelおよびGraphPad Prism 5ソフトウェアを用いて、すべてのデータをプロットし、統計学的に分析した。

腫瘍体積（Ｖ）を、式：Ｖ＝１／２×ａ×ｂ^２［式中、ａおよびｂはそれぞれ、長さおよび幅を表す］にしたがって計算した。

相対腫瘍増殖速度Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ−Ｔ_０）／（Ｃ−Ｃ_０）×１００［式中、ＴおよびＣは、試験終了時の処置群および対照群の腫瘍体積を表し；Ｔ_０およびＣ_０は試験開始時の腫瘍体積を表す］

腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）＝１−Ｔ／Ｃ（％）

試験結果は次のことを示している：ＭＢＧ−４５３（１０ｍｐｋ、Ｉ.Ｐ.、ＢＩＷ×７）、ｈ１７９９−００５（１０ｍｐｋ、Ｉ.Ｐ.、ＢＩＷ×７）、およびｈ１７０１−００９ＮＬＧ（１０ｍｐｋ、Ｉ.Ｐ.、ＢＩＷ×７）の３つのＴＩＭ−３抗体は、ＨＣＣ８２７マウスにおいてヒト非小細胞肺がん皮下異種移植の増殖を顕著に抑制することができる。２１日目（最終測定）における平均腫瘍体積を小さいものから大きいものへと並べると、それぞれｈ１７９９−００５（１０ｍｐｋ、Ｉ.Ｐ.、ＢＩＷ×７）、ｈ１７０１−００９ＮＬＧ（１０ｍｐｋ、Ｉ.Ｐ.、ＢＩＷ×７）、ＭＢＧ−４５３（１０ｍｐｋ、Ｉ.Ｐ.、ＢＩＷ×７）の順であり；腫瘍抑制率はそれぞれ、１２０．８６％（ｐ＜０．００１）、８５．０１％（ｐ＜０．０５）および７８．１５％（ｐ＜０．０５）であった（表７および図１参照）。

インビトロの腫瘍重量は、腫瘍体積で観察されたのと一致する傾向を示す。３つのＴＩＭ−３抗体群の腫瘍重量はいずれも、無関係の抗体Ｃ２５ ＩｇＧ４（１０ｍｐｋ、Ｉ.Ｐ.、ＢＩＷ×７）のものよりも顕著に小さく、ｈ１７９９−００５（１０ｍｐｋ、Ｉ.Ｐ.、ＢＩＷ×７）、およびｈ１７０１−００９ＮＬＧ（１０ｍｐｋ、Ｉ.Ｐ.、ＢＩＷ×７）およびＭＢＧ−４５３（１０ｍｐｋ、Ｉ.Ｐ.、ＢＩＷ×７）はそれぞれ、最小、中程度および最大の重量を示す。いずれの群も、それぞれｐ＜０．００１、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０５で、Ｃ２５ ＩｇＧ４（１０ｍｐｋ、Ｉ.Ｐ.、ＢＩＷ×７）からの有意差を示した。

腫瘍を有するマウスはＴＩＭ−３抗体すべてに対して忍容性が高く、全投与プロセス中にわずかな体重変化を示したに過ぎず、ＰＢＭＣ注射後に持続的体重減少を示し１９日目に死亡しているのが見つかったｈ１７０１−００９ＮＬＧ（１０ｍｐｋ、Ｉ.Ｐ.、ＢＩＷ×７）群の１匹（この動物は死亡しているのが見つかった時、腹部が黒く、ピンセットで触れたときに皮膚が腐敗し、明らかな悪臭を伴った；死後時間は８時間を超えると推定された；死亡するまで持続的に体重減少したことを考慮すると、ヒトＰＢＭＣ移植後に異種移植片に対し寛容でなかったことによるＧＶＨＤ罹患がうたがわれた）を除き、明らかな体重減少といった、薬剤により誘導される症状は観察されなかった。

試験実施例２：マウス結腸がんＭＣ３８皮下異種移植に対するＴＩＭ−３抗体の効果の評価および比較
試験した薬剤の名称：
ＴＩＭ−３抗体であるｈ１７９９−００５
ＰＤ−１抗体であるマウスＰＤ−１抗体Ｊ４３（J Immunol. 196(1):144-55.）

試験工程：
１×１０^６個のマウス結腸がんＭＣ３８細胞をマウスの腋窩に注射した。腫瘍が平均体積５０〜２００ｍｍ^３まで増殖したら、腫瘍体積にしたがって動物をランダムにグループ分けし、投与を行った。４０匹のマウスを４群に分けた：陰性対照群（群１）、ＴＩＭ−３抗体３０ｍｇ／ｋｇ群（群２）、ＰＤ−１抗体５ｍｇ／ｋｇ群（群３）、およびＴＩＭ−３抗体とＰＤ−１抗体の併用群（群４）、各群１０匹；各群に対応する濃度の試験物質を、１０ｍｌ／ｋｇの投与体積で、併用投与群には２０ｍｌ／ｋｇの投与体積で、尾静脈注射により週２回、２１日間にわたり投与した。

試験結果：
１．陰性対照群における腫瘍体積が５８１±６３ｍｍ^３であったことと比較して、ＴＩＭ−３抗体３０ｍｇ／ｋｇ群、ＰＤ−１抗体５ｍｇ／ｋｇ群、および併用投与群における腫瘍体積はそれぞれ、４０６±３１（Ｐ＜０．０５）、２４５±２６（Ｐ＜０．０１） 、および１６６±１９（Ｐ＜０．００１）ｍｍ^３であり、有意に低下した；
２．陰性対照群における相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の値が５．３８±０．５６であったことと比較して、ＴＩＭ−３抗体３０ｍｇ／ｋｇ群、ＰＤ−１抗体５ｍｇ／ｋｇ群、および併用投与群におけるＲＴＶ値はそれぞれ、３．７６±０．３２（Ｐ＜０．０５）、２．２０±０．２１（Ｐ＜０．０１）および１．４４±０．０８（Ｐ＜０．００１）であった；Ｔ／Ｃ値はそれぞれ、６９．９１％、４０．９２％および２６．６６％であった；
３．陰性対照群における腫瘍重量が０．３５０２±０．０２９８ｇであったことと比較して、ＴＩＭ−３抗体３０ｍｇ／ｋｇ群、ＰＤ−１抗体５ｍｇ／ｋｇ群、および併用投与群における腫瘍重量はそれぞれ、０．２５５０±０．０１５９（Ｐ＜０．０１）、０．１８２０±０．０１７８（Ｐ＜０．００１）、および０．１１０２±０．０１０６ｇ（Ｐ＜０．００１）ｇであった；ＩＲはそれぞれ、２７．１９％、４８．０５％および６５．３６％であった；
４．腫瘍体積、ＲＴＶ値および腫瘍重量を分析した。ＴＩＭ−３抗体３０ｍｇ／ｋｇ群と比較して、併用投与群における腫瘍増殖抑制は顕著に高い（Ｐ＜０．００１）；ＰＤ−１抗体５ｍｇ／ｋｇ群と比較して、併用投与群における腫瘍増殖抑制は顕著に高い（Ｐ＜０．０５）。

Claims (20)

1. 腫瘍処置用医薬の製造におけるＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
2. ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが
   配列番号１４、１５および１６のアミノ酸配列またはそれとの配列同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列で示される抗体重鎖可変領域ＨＣＤＲ配列；および
   配列番号１７、１８および１９のアミノ酸配列またはそれとの配列同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列で示される抗体軽鎖可変領域ＬＣＤＲ配列
   からなる群から選択される１つ以上のＣＤＲ領域配列を含む、請求項１に記載の使用。
3. ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
4. ヒト化抗体が、ヒト生殖細胞系列軽鎖および重鎖またはそのミュータント配列にそれぞれ由来する軽鎖ＦＲ領域および重鎖ＦＲ領域配列を含む、請求項３に記載の使用。
5. ヒト化抗体が、配列番号３１で示される重鎖可変領域またはそのバリアントを含み、好ましくはバリアントが配列番号３１で示される重鎖可変領域と比較して１〜１０のアミノ酸変異を含み、より好ましくはアミノ酸変異がＱ３ＫおよびＲ８７Ｋのアミノ酸復帰変異であり；ヒト化抗体が、配列番号３２で示される軽鎖可変領域またはそのバリアントを含み、好ましくはバリアントが配列番号３２で示される軽鎖可変領域と比較して１〜１０のアミノ酸変異を含み、より好ましくはアミノ酸変異がＱ３ＫおよびＩ４８Ｖ、Ｋ４５Ｑ、Ａ４３ＳおよびＴ８５Ｓのアミノ酸復帰変異からなる群から選択される、請求項３に記載の使用。
6. ヒト化抗体が、配列番号３３で示される重鎖可変領域、および配列番号３６で示される軽鎖可変領域を含む、請求項３に記載の使用。
7. ＴＩＭ−３抗体が、さらにヒト抗体定常領域を含む、好ましくは配列番号４１で示されるヒト重鎖定常領域および好ましくは配列番号４２で示されるヒト軽鎖定常領域を含む、完全長抗体である、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
8. 抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ディアボディ）、ジスルフィド結合安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）、およびＣＤＲを含むペプチドの抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
9. 腫瘍が、乳がん、肺がん、肝臓がん、胃がん、結腸直腸がん、腎臓がん、メラノーマ、および非小細胞肺がんからなる群から選択され、好ましくは非小細胞肺がん、乳がん、メラノーマ、肝臓がん、結腸直腸がん、および腎臓がんからなる群から選択され、より好ましくは結腸直腸がんまたは非小細胞肺がんである、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
10. 腫瘍処置用医薬の製造のための、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントと組み合わせられたＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントの使用である、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
11. 抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒト化抗体またはそのフラグメントである、請求項１０に記載の使用。
12. 抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントからなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の使用。
13. 抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの重鎖定常領域を含み、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの重鎖定常領域を含む、請求項１１または１２に記載の使用。
14. 抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントが、κまたはλの軽鎖定常領域を含む、請求項１３に記載の使用。
15. 抗ＰＤ−１抗体が、配列番号８２で示される軽鎖可変領域またはそのバリアントを含み、好ましくは、バリアントが軽鎖可変領域において０〜１０のアミノ酸変異を有し、より好ましくは、アミノ酸変異がＡ４３Ｓであり；抗ＰＤ−１抗体が、配列番号８１で示される重鎖可変領域またはそのバリアントを含み、好ましくは、バリアントが重鎖可変領域において０〜１０のアミノ酸変異を有し、より好ましくは、アミノ酸変異がＧ４４Ｒである、請求項１１に記載の使用。
16. 抗ＰＤ−１抗体が、配列番号８０で示される軽鎖またはそのバリアントを含み、好ましくは、バリアントが軽鎖可変領域において０〜１０のアミノ酸変異を有し、より好ましくは、アミノ酸変異がＡ４３Ｓであり；抗ＰＤ−１抗体が、配列番号７９で示される重鎖またはそのバリアントを含み、好ましくは、バリアントが重鎖可変領域において０〜１０のアミノ酸変異を有し、より好ましくは、アミノ酸変異がＧ４４Ｒである、請求項１１に記載の使用。
17. 抗ＰＤ−１抗体が、配列番号８０で示される軽鎖、および配列番号７９で示される重鎖を含む、請求項１１に記載の使用。
18. ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒト対象に０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０．０ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で投与される、請求項１に記載の使用。
19. 抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒト対象に０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０．０ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で投与される、請求項１０に記載の使用。
20. 抗ＴＩＭ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、および抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物。

Images