JP2021533740A - 単一細胞における核バーコード化および捕捉 - Google Patents

単一細胞における核バーコード化および捕捉 Download PDF

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Abstract

本明細書の開示は、単一核捕捉およびバーコード化を単一のステップにおいて行う際に使用するのに好適な方法、組成物、およびキットを含む。一部の実施形態では、本方法は、核単離組成物を使用して核を単離するステップを含む。核単離組成物は、核の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる核結合試薬を含み得る。本方法は、バーコードを使用して核内の標的をバーコード化して、シーケンシング分析のためのバーコード化された標的を生成するステップを含み得る。

Description

関連出願
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． §１１９（ｅ）のもとに、２０１８年８月３日に出願された米国仮特許出願第６２／７１４，２２２号の利益を主張し、この関連出願の内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、概して、標的の分子バーコード化の分野に関し、より具体的には、核バーコード化に関する。
核酸バーコードに連結されたビーズを使用したバーコード化などの方法および技法は、例えば、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して、遺伝子発現プロファイルを解析して単一細胞の状態を決定することなど、単一細胞分析に有用である。しかしながら、単一細胞分析のために単一細胞懸濁液を調製することは困難であり得る。
本明細書の開示は、複数の細胞における標的の数を決定するための方法の実施形態を含む。一部の実施形態では、本方法は、核単離組成物を使用して、複数の細胞の複数の核を単離するステップであって、核単離組成物が、核結合試薬を含み、核結合試薬が、核の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる、ステップと、複数のバーコードを使用して、複数の核内の複数の標的をバーコード化して、複数のバーコード化された標的を生成するステップであって、複数のバーコードのそれぞれが、分子標識配列および標的結合領域を含み、複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードの分子標識配列が、異なる配列を含む、ステップと、複数のバーコード化された標的のシーケンシングデータを得るステップと、シーケンシングデータ内の複数のバーコードの分子標識配列を使用して、複数の細胞における複数の標的のそれぞれの数を概算するステップとを含む。
一部の実施形態では、複数の核を単離するステップは、複数の細胞の複数の核を、核単離組成物と接触させて、核結合試薬に結合した核を生成するステップを含む。複数の核を単離するステップは、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬を使用して、核結合試薬に結合した核を単離するステップを含み得る。
一部の実施形態では、核結合試薬は、第１のエピトープと会合しており、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、第１のエピトープ結合試薬を含む。第１のエピトープは、ビオチン、ハプテン、またはこれらの組合せを含み得る。ハプテンは、ジゴキシゲニン、２，４−ジニトロフェノール、フルオレセイン、またはこれらの組合せを含み得る。核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、抗ハプテン抗体を含み得る。核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはこれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、核結合試薬は、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第一級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、またはこれらの組合せからなる群から選択される官能基を含む。一部の実施形態では、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第一級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、またはこれらの組合せからなる群から選択される官能基を含む。
一部の実施形態では、核結合試薬は、核の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる一次抗体を含み、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体を含む。
一部の実施形態では、核結合試薬は、炭水化物結合試薬を含む。炭水化物結合試薬は、炭水化物結合タンパク質を含み得る。炭水化物結合タンパク質は、レクチンを含み得る。レクチンは、マンノース結合レクチン、ガラクトース結合レクチン、Ｎ−アセチルガラクトサミン結合レクチン、Ｎ−アセチルグルコサミン結合レクチン、Ｎ−アセチルノイラミン酸結合レクチン、フコース結合レクチン、またはこれらの組合せを含み得る。レクチンは、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、レンチルレクチン（ＬＣＨ）、スノードロップレクチン（ＧＮＡ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）凝集素（ＲＣＡ）、ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）、ジャカリン（ＡＩＬ）、ヘアリーベッチレクチン（ＶＶＬ）、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）、エルダーベリーレクチン（ＳＮＡ）、イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）白血球凝集素（ＭＡＬ）、イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）赤血球凝集素（ＭＡＨ）、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）凝集素（ＵＥＡ）、ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ）レクチン（ＡＡＬ）、またはこれらの組合せを含み得る。レクチンは、凝集素であり得るか、またはそれを含み得る。凝集素は、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）であり得るか、またはそれを含み得る。炭水化物結合タンパク質は、動物、細菌、ウイルス、真菌、またはこれらの組合せに由来し得るか、またはそれから誘導され得る。炭水化物結合タンパク質は、植物に由来し得るか、またはそれから誘導され得る。植物は、タチナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）、マツユキソウ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、パラミツ（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、ナヨクサフジ（Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、セイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ）、イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）、ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ）、またはこれらの組合せであり得る。
一部の実施形態では、核の１つまたは複数の成分は、糖、オリゴ糖、多糖、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含む。核の１つまたは複数の成分は、単糖、二糖、ポリオール、マルトオリゴ糖、非マルトオリゴ糖、デンプン、非デンプン多糖、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含み得る。核の１つまたは複数の成分は、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、マルトデキストリン、ラフィノース、スタキオース、フルクトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、加工デンプン、グリコーゲン、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ハイドロコロイド、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含み得る。核の１つまたは複数の成分は、α−Ｄ−マンノシル残基、α−Ｄ−グルコシル残基、高α−マンノース型の分岐鎖α−マンノシド構造、ハイブリッド型および二分岐複合型Ｎ−グリカンの分岐鎖α−マンノシド構造、二分岐および三分岐複合型Ｎ−グリカンのフコシル化コア領域、α １−３およびα １−６連結型高マンノース構造、Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃβ１−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、（Ｓｉａ）Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ（シアル酸）、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ（ＮＡｃ）−Ｒ、Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｇｃα２，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）、Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｇｃα２，３Ｇａｌβ１，３（Ｎｅｕ５Ａｃα２，６）ＧａｌＮａｃ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３／４）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｒ２−ＧｌｃＮＡｃβ１−４（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ１、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含み得る。核の１つまたは複数の成分は、糖タンパク質、糖脂質、またはこれらの組合せを含み得る。
一部の実施形態では、核の１つまたは複数の成分は、ラミン、エメリン、ネスプリン、ヌリム、ＵＮＣ−８３、クラール（Ｋｌａｒ）、ＺＹＧ−１２、Ｋｍｓ１ｐ、ＵＮＣ−８４、クラロイド（Ｋｌａｒｏｉｄ）、ＳＵＮ−１、Ｓａｄ１ｐ、ＬＢＲ、ＭＡＮ１、ＬＡＰ１、ＬＡＰ２、ＬＩＮＫ、核膜孔複合体、これらの一部分、またはこれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、核結合試薬は、核単離粒子と会合している。核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、核単離粒子と会合していてもよい。核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、核単離粒子に固定化または部分的に固定化されていてもよい。例えば、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、可逆的、不可逆的、共有結合的、非共有結合的、またはこれらの組合せで、核単離粒子と会合していてもよい。別の例として、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、核単離粒子に包埋されていてもよく、部分的に包埋されていてもよく、包埋されていなくてもよく、封入されていてもよく、部分的に封入されていてもよく、封入されていなくてもよく、またはこれらの組合せであってもよい。一部の実施形態では、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、切断可能なリンカーを通じて核単離粒子と会合している。切断可能なリンカーは、例えば、化学的に切断可能な連結、光切断可能な連結、酸不安定性リンカー、熱感受性連結、酵素的に切断可能な連結、またはこれらの組合せを含み得る。
一部の実施形態では、核単離粒子は、核単離ビーズを含む。核単離粒子は、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。核単離粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含み得る。核単離粒子は、崩壊可能であり得る。核単離粒子は、核単離崩壊可能ハイドロゲル粒子を含み得る。一部の実施形態では、核結合試薬に結合した核を単離するステップは、核結合試薬に結合した核を、複数の核単離粒子と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、核結合試薬に結合した核を複数の核単離粒子と接触させるステップの前に、核結合試薬に結合した核を、複数のヌル粒子と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、核単離粒子に対するヌル粒子の比は、少なくとも１０：１である。ヌル粒子は、一部の実施形態では、磁気特性を含まない。一部の実施形態では、ヌル粒子は、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬を含まない。一部の実施形態では、ヌル粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、またはこれらの組合せからなる群から選択される材料を含む。一部の実施形態では、複数のヌル粒子は、核単離粒子の凝集を低減させるか、または核単離粒子の凝集を予防するか、またはその両方である。一部の実施形態では、核結合試薬に結合した核を複数の核単離粒子と接触させるステップは、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬を通じて核単離粒子に結合した複数の核を生成する。一部の実施形態では、核結合試薬に結合した核を複数の核単離粒子と接触させるステップの後の、単一の核単離粒子に結合した核のパーセンテージは、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。一部の実施形態では、核結合試薬に結合した核を複数の核単離粒子と接触させるステップの後の、単一の核に結合したまたはいずれの核にも結合していない核単離粒子のパーセンテージは、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。
一部の実施形態では、核結合試薬に結合した核を単離するステップは、磁気除去、遠心分離、またはこれらの任意の組合せによって、核単離粒子を単離するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、複数の核単離粒子を単離するステップの前に、核単離粒子に結合した複数の核を、遊離した第１のエピトープと接触させるステップであって、遊離した第１のエピトープが、第１のエピトープのすべてまたは一部分を占める、ステップを含む。一部の実施形態では、複数のバーコードは、核単離粒子と会合している。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子に固定化されていてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子に部分的に固定化されていてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子に封入されていてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子に部分的に封入されていてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子に封入されていなくてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子に包埋されていてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子に部分的に包埋されていてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子に包埋されていなくてもよい。
一部の実施形態では、核結合試薬は、核エンベロープ表面成分結合試薬を含み、核結合試薬は、１つまたは複数の核エンベロープ表面成分に特異的に結合することが可能であり得る。
一部の実施形態では、本方法は、複数のバーコードを使用して複数の核内の複数の標的をバーコード化して複数のバーコード化された標的を生成するステップの前に、複数の核を溶解させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、核単離組成物を使用して複数の細胞の複数の核を単離するステップの前に、複数の細胞の核を溶解させることなく複数の細胞を溶解させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、複数の核を溶解させるステップの前に、複数の核を分割するステップを含む。一部の実施形態では、複数の核を分割するステップは、複数の核を複数の区画に分割するステップを含み、複数の区画のうちの１つの区画が、複数の核に由来する単一の核を含む。一部の実施形態では、複数の区画は、マイクロウェルアレイのマイクロウェルを含む。一部の実施形態では、複数の区画は、複数の液滴を含む。一部の実施形態では、複数の区画のうちの２つ以上の区画は、単一の核を含む。一部の実施形態では、複数の区画のうちの１つの区画は、単一の核および単一の核単離粒子を含む。一部の実施形態では、複数の区画のうちの１つの区画は、単一の核および単一のバーコード化粒子を含む。一部の実施形態では、複数の区画のうちの１つの区画は、単一の核、単一の核単離粒子、および単一のバーコード化粒子を含む。
一部の実施形態では、本方法は、核単離組成物を使用して複数の細胞の複数の核を単離するステップの前に、複数の細胞を透過処理する（例えば、その形質膜を溶解させる）ステップと、オルガネラ結合試薬を含むオルガネラ捕捉組成物を使用して、複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラを枯渇させるステップであって、オルガネラ結合試薬が、複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる、ステップとを含む。１つまたは複数のオルガネラを枯渇させるステップは、複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラを、オルガネラ捕捉組成物と接触させて、オルガネラ成分結合試薬に結合した１つまたは複数のオルガネラを生成するステップを含み得る。１つまたは複数のオルガネラを枯渇させるステップは、オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬を使用して、オルガネラ結合試薬に結合した１つまたは複数のオルガネラを枯渇させるステップを含む。オルガネラ結合試薬は、第２のエピトープと会合していてもよく、オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、第２のエピトープ結合試薬を含み得る。
一部の実施形態では、第２のエピトープは、ビオチン、ハプテン、またはこれらの組合せを含み得る。ハプテンは、ジゴキシゲニン、２，４−ジニトロフェノール、フルオレセイン、またはこれらの組合せを含み得る。オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、抗ハプテン抗体を含み得る。オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはこれらの組合せを含み得る。オルガネラ結合試薬は、複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる一次抗体を含み得、オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体を含み得る。
一部の実施形態では、オルガネラ結合試薬は、オルガネラ捕捉粒子と会合している。オルガネラ結合試薬は、オルガネラ捕捉粒子に固定化または部分的に固定化されていてもよい。例えば、オルガネラ結合試薬は、可逆的、不可逆的、共有結合的、非共有結合的、またはこれらの組合せで、オルガネラ捕捉粒子と会合していてもよい。別の例として、オルガネラ結合試薬は、オルガネラ捕捉粒子に包埋されていてもよく、部分的に包埋されていてもよく、包埋されていなくてもよく、封入されていてもよく、部分的に封入されていてもよく、封入されていなくてもよく、またはこれらの組合せであってもよい。
一部の実施形態では、オルガネラ捕捉粒子は、オルガネラ捕捉ビーズを含む。オルガネラ捕捉粒子は、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。オルガネラ捕捉粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含み得る。
一部の実施形態では、オルガネラ捕捉組成物を使用して複数の細胞のオルガネラを枯渇させるステップは、磁気除去、遠心分離、またはこれらの任意の組合せによって、１つまたは複数のオルガネラ捕捉粒子を枯渇させるステップを含み得る。オルガネラは、複数の細胞のミトコンドリアを含み得る。複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分は、ＡＢＣＤ３、ＥＳＲ２、ＮＯＳ３、ＡＬＢ、ＨＩＦ１Ａ、ＮＲ３Ｃ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＨＫ１、ＰＧＲ、ＣＡＳＱ１、ＨＳＰＡ１Ａ、ＰＨＢ、ＣＬＴＣ、ＨＳＰＤ１、ＰＬＮ、ＣＯＸ４Ｉ１、ＩＦＭ１、ＳＯＤ１、ＣＰＳ１、ＬＧＡＬＳ３、ＴＰ５３、シトクロムＣオキシダーゼ、ＭＡＰＴ、ＴＰ５Ｂ、ＥＲＮ１、ＭＴ−ＣＯ１、ＶＤＡＣ１、またはこれらの組合せを含み得る。
一部の実施形態では、オルガネラ結合試薬は、オルガネラ表面成分結合試薬を含み得、１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分は、１つまたは複数のオルガネラ表面成分を含み得、オルガネラ結合試薬は、１つまたは複数のオルガネラ表面成分に特異的に結合することが可能であり得る。核結合試薬は、核インデックス化オリゴヌクレオチドを含み得、核インデックス化オリゴヌクレオチドは、核インデックス化配列を含む。
一部の実施形態では、本方法は、複数のバーコードを使用して、核インデックス化オリゴヌクレオチドをバーコード化して、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを生成するステップと、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドのシーケンシングデータを得るステップとを含む。核インデックス化オリゴヌクレオチドをバーコード化するステップは、複数のバーコードを使用して、確率的にバーコード化して、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを生成するステップを含み得る。複数のバーコードを使用して核インデックス化オリゴヌクレオチドをバーコード化するステップは、複数のバーコードを、核インデックス化オリゴヌクレオチドと接触させて、核インデックス化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを生成するステップと、核インデックス化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを伸長させて、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを生成するステップとを含み得る。バーコードを伸長させるステップは、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、バーコードを伸長させて、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを生成するステップを含み得る。バーコードを伸長させるステップは、逆転写酵素を使用して、バーコードを伸長させて、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを生成するステップを含み得る。
一部の実施形態では、本方法は、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを増幅させて、複数のバーコード化された核インデックス化アンプリコンを得るステップを含み得る。複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを増幅させるステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、分子標識配列の少なくとも一部分および核インデックス化オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分を増幅させるステップを含み得る。複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドのシーケンシングデータを得るステップは、複数のバーコード化された核インデックス化アンプリコンのシーケンシングデータを得るステップを含み得る。複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドのシーケンシングデータを得るステップは、分子標識配列の少なくとも一部分および核インデックス化オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分をシーケンシングするステップを含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコードは、バーコード化粒子と会合している。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、バーコード化粒子に固定化されていてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、バーコード化粒子に部分的に固定化されていてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、バーコード化粒子に封入されていてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、バーコード化粒子に部分的に封入されていてもよい。バーコード化粒子は、崩壊可能であり得る。バーコード化粒子は、バーコード化ビーズを含み得る。バーコード化粒子は、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。バーコード化粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含み得る。バーコード化粒子は、崩壊可能ハイドロゲル粒子を含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコードを使用して複数の標的をバーコード化して複数のバーコード化された標的を生成するステップは、標的のコピーを、バーコードの標的結合領域と接触させるステップと、複数のバーコードを使用して、複数の標的を逆転写して、複数のバーコード化された標的を生成するステップとを含む。本方法は、複数のバーコード化された標的のシーケンシングデータを得るステップの前に、複数のバーコード化された標的を増幅させて、複数の増幅したバーコード化された標的を生成するステップを含み得る。バーコード化された標的を増幅して複数の増幅したバーコード化された標的を生成するステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、バーコード化された標的を増幅させて、複数の増幅したバーコード化された標的を生成するステップを含み得る。本方法は、複数の増幅したバーコード化された標的を増幅させて、複数のバーコード化された標的のアンプリコンを生成するステップを含み得る。複数の増幅したバーコード化された標的を増幅させるステップは、分子標識配列および複数の標的のうちの１つの標的の配列、またはその一部分を増幅させて、複数のバーコード化された標的のアンプリコンを生成するステップを含み得る。複数の増幅したバーコード化された標的を増幅させるステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、複数の増幅したバーコード化された標的を増幅させて、複数のバーコード化された標的のアンプリコンを生成するステップを含み得る。複数のバーコードを使用して細胞の複数の標的をバーコード化して複数のバーコード化された標的を生成するステップは、複数の確率的バーコードを使用して、細胞の複数の標的を確率的にバーコード化して、複数の確率的にバーコード化された標的を生成するステップを含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識配列、ユニバーサルプライマーの結合部位、またはこれらの任意の組合せを含み、複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードの細胞標識配列は、同一の配列を含む。標的結合領域は、ポリ（ｄＴ）領域を含み得る。複数のバーコードの少なくとも１００個の分子標識配列は、異なる配列を含み得る。複数のバーコードの少なくとも１０００個の分子標識配列は、異なる配列を含み得る。複数のバーコードの少なくとも１００００個の分子標識配列は、異なる配列を含み得る。複数のバーコードの分子標識配列は、ランダム配列を含み得る。標的結合領域は、遺伝子特異的配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ランダム多量体、またはこれらの任意の組合せを含み得る。複数の細胞は、組織試料を含む。複数の細胞は、例えば、上皮組織試料、凍結細胞、固定細胞、ホルマリン固定パラフィン包埋細胞、腫瘍細胞、固定腫瘍細胞、凍結腫瘍細胞、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍細胞、またはこれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、複数の細胞は、１つまたは複数の核外細胞成分を含む。核外細胞成分の非限定的な例は、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、サイトゾル、小胞、リソソーム、形質膜、葉緑体、ミトコンドリア内マトリックス、ミトコンドリア内膜、膜間腔、ミトコンドリア外膜、分泌小胞、滑面小胞体、粗面小胞体、ゴルジ体、ファゴソーム、エンドソーム、エクソソーム、形質膜、微小管、微小線維、中間径線維、フィロポディア、ラッフル、ラメリポディア、サルコメア、接着域、ポドソーム、リボソーム、マイクロソーム、脂質ラフト、細胞壁、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の核外細胞成分は、１つまたは複数の望ましくない核酸種を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の核外細胞成分のうちの少なくとも１つの存在量は、複数の核を単離することによって低減されるか、１つもしくは複数のオルガネラを枯渇させることによって低減されるか、またはその両方である。一部の実施形態では、複数の細胞は、複数の標的および１つまたは複数の望ましくない核酸種を含む。一部の実施形態では、望ましくない核酸種は、核ではないオルガネラから誘導される。一部の実施形態では、望ましくない核酸種は、シボソームＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の望ましくない核酸種のうちの少なくとも１つの存在量は、複数の核を単離すること、１つもしくは複数のオルガネラを枯渇させること、またはその両方によって、低減される。一部の実施形態では、１つまたは複数の望ましくない核酸種は、複数の細胞の核酸含量のうちの約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、またはそれ以上に達する。一部の実施形態では、望ましくない核酸種は、複数のバーコード化された標的のアンプリコンの４０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満に相当する。一部の実施形態では、複数のバーコード化された標的のシーケンシングデータを得るステップは、複数のシーケンシングリードを生成するステップを含む。望ましくない核酸種のシーケンシングリードは、例えば、総シーケンシングリードの４０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満であり得る。
本明細書の開示は、バーコード化組成物の実施形態を含む。一部の実施形態では、バーコード化組成物は、核結合試薬を含む核単離組成物であって、核結合試薬が、核の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる、核単離組成物と、複数のバーコードであって、複数のバーコードのそれぞれが、分子標識配列および標的結合領域を含み、複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードの分子標識配列が、異なる配列を含む、複数のバーコードとを含む。
一部の実施形態では、組成物は、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬を含む。核結合試薬は、第１のエピトープと会合していてもよく、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、第１のエピトープ結合試薬を含み得る。第１のエピトープは、ビオチン、ハプテン、またはこれらの組合せを含み得る。ハプテンは、ジゴキシゲニン、２，４−ジニトロフェノール、フルオレセイン、またはこれらの組合せを含み得る。核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、抗ハプテン抗体を含み得る。核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはこれらの組合せを含み得る。
一部の実施形態では、核結合試薬は、核の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる一次抗体を含み、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体を含む。
一部の実施形態では、核結合試薬は、炭水化物結合試薬を含む。炭水化物結合試薬は、炭水化物結合タンパク質を含み得る。炭水化物結合タンパク質は、レクチンを含み得る。レクチンは、マンノース結合レクチン、ガラクトース結合レクチン、Ｎ−アセチルガラクトサミン結合レクチン、Ｎ−アセチルグルコサミン結合レクチン、Ｎ−アセチルノイラミン酸結合レクチン、フコース結合レクチン、またはこれらの組合せを含み得る。レクチンは、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、レンチルレクチン（ＬＣＨ）、スノードロップレクチン（ＧＮＡ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）凝集素（ＲＣＡ）、ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）、ジャカリン（ＡＩＬ）、ヘアリーベッチレクチン（ＶＶＬ）、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）、エルダーベリーレクチン（ＳＮＡ）、イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）白血球凝集素（ＭＡＬ）、イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）赤血球凝集素（ＭＡＨ）、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）凝集素（ＵＥＡ）、ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ）レクチン（ＡＡＬ）、またはこれらの組合せを含み得る。レクチンは、凝集素であり得るか、またはそれを含み得る。凝集素は、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）であり得るか、またはそれを含み得る。炭水化物結合タンパク質は、動物、細菌、ウイルス、または真菌に由来し得るか、またはそれから誘導され得る。炭水化物結合タンパク質は、植物に由来し得るか、またはそれから誘導され得る。植物は、タチナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）、マツユキソウ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、パラミツ（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、ナヨクサフジ（Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、セイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ）、イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）、ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ）、またはこれらの組合せであり得る。
一部の実施形態では、核の１つまたは複数の成分は、糖、オリゴ糖、多糖、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含む。核の１つまたは複数の成分は、単糖、二糖、ポリオール、マルトオリゴ糖、非マルトオリゴ糖、デンプン、非デンプン多糖、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含み得る。核の１つまたは複数の成分は、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、マルトデキストリン、ラフィノース、スタキオース、フルクトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、加工デンプン、グリコーゲン、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ハイドロコロイド、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含み得る。核の１つまたは複数の成分は、α−Ｄ−マンノシル残基、α−Ｄ−グルコシル残基、高α−マンノース型の分岐鎖α−マンノシド構造、ハイブリッド型および二分岐複合型Ｎ−グリカンの分岐鎖α−マンノシド構造、二分岐および三分岐複合型Ｎ−グリカンのフコシル化コア領域、α １−３およびα １−６連結型高マンノース構造、Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃβ１−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、（Ｓｉａ）Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ（シアル酸）、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ（ＮＡｃ）−Ｒ、Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｇｃα２，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）、Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｇｃα２，３Ｇａｌβ１，３（Ｎｅｕ５Ａｃα２，６）ＧａｌＮａｃ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３／４）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｒ２−ＧｌｃＮＡｃβ１−４（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ１、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含み得る。核の１つまたは複数の成分は、糖タンパク質、糖脂質、またはこれらの組合せを含み得る。
一部の実施形態では、核結合試薬は、核単離粒子と会合している。核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、核単離粒子と会合していてもよい。核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、核単離粒子に固定化または部分的に固定化されていてもよい。核単離粒子は、核単離ビーズを含み得る。核単離粒子は、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。核単離粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含み得る。核単離粒子は、崩壊可能であり得る。核単離粒子は、核単離崩壊可能ハイドロゲル粒子を含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコードは、核単離粒子と会合している。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子に固定化されていてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子に部分的に固定化されていてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子に封入されていてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子に部分的に封入されていてもよい。
一部の実施形態では、核の１つまたは複数の成分は、ラミン、エメリン、ネスプリン、ヌリム、ＵＮＣ−８３、クラール、ＺＹＧ−１２、Ｋｍｓ１ｐ、ＵＮＣ−８４、クラロイド、ＳＵＮ−１、Ｓａｄ１ｐ、ＬＢＲ、ＭＡＮ１、ＬＡＰ１、ＬＡＰ２、ＬＩＮＫ、核膜孔複合体、これらの一部分、またはこれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、核結合試薬は、核エンベロープ表面成分結合試薬を含み、核結合試薬は、１つまたは複数の核エンベロープ表面成分に特異的に結合することが可能であり得る。
一部の実施形態では、組成物は、オルガネラ結合試薬を含むオルガネラ捕捉組成物を含み、オルガネラ結合試薬は、１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる。組成物は、オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬を含み得る。オルガネラ結合試薬は、第２のエピトープと会合していてもよく、オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、第２のエピトープ結合試薬を含み得る。第２のエピトープは、ビオチン、ハプテン、またはこれらの組合せを含み得る。ハプテンは、ジゴキシゲニン、２，４−ジニトロフェノール、フルオレセイン、またはこれらの組合せを含み得る。オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、抗ハプテン抗体を含み得る。オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはこれらの組合せを含み得る。オルガネラ結合試薬は、複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる一次抗体を含み得、オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体を含み得る。
一部の実施形態では、オルガネラ結合試薬は、オルガネラ捕捉粒子と会合している。オルガネラ結合試薬は、オルガネラ捕捉粒子に固定化または部分的に固定化されていてもよい。オルガネラ捕捉粒子は、オルガネラ捕捉ビーズを含み得る。オルガネラ捕捉粒子は、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。オルガネラ捕捉粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含み得る。
一部の実施形態では、オルガネラは、複数の細胞のミトコンドリアを含む。複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分は、ＡＢＣＤ３、ＥＳＲ２、ＮＯＳ３、ＡＬＢ、ＨＩＦ１Ａ、ＮＲ３Ｃ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＨＫ１、ＰＧＲ、ＣＡＳＱ１、ＨＳＰＡ１Ａ、ＰＨＢ、ＣＬＴＣ、ＨＳＰＤ１、ＰＬＮ、ＣＯＸ４Ｉ１、ＩＦＭ１、ＳＯＤ１、ＣＰＳ１、ＬＧＡＬＳ３、ＴＰ５３、シトクロムＣオキシダーゼ、ＭＡＰＴ、ＴＰ５Ｂ、ＥＲＮ１、ＭＴ−ＣＯ１、ＶＤＡＣ１、またはこれらの組合せを含み得る。
一部の実施形態では、オルガネラ結合試薬は、オルガネラ表面成分結合試薬を含み、１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分は、１つまたは複数のオルガネラ表面成分を含み得、オルガネラ結合試薬は、１つまたは複数のオルガネラ表面成分に特異的に結合することが可能であり得る。
一部の実施形態では、核結合試薬は、核インデックス化オリゴヌクレオチドを含み得、核インデックス化オリゴヌクレオチドは、核インデックス化配列を含む。複数のバーコードは、バーコード化粒子と会合していてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、バーコード化粒子に固定化されていてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、バーコード化粒子に部分的に固定化されていてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、バーコード化粒子に封入されていてもよい。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、バーコード化粒子に部分的に封入されていてもよい。バーコード化粒子は、崩壊可能であり得る。バーコード化粒子は、バーコード化ビーズを含み得る。バーコード化粒子は、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。バーコード化粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含み得る。バーコード化粒子は、崩壊可能ハイドロゲル粒子を含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識配列、ユニバーサルプライマーの結合部位、またはこれらの任意の組合せを含み、複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードの細胞標識配列は、同一の配列を含む。
標的結合領域は、ポリ（ｄＴ）領域を含み得る。複数のバーコードの少なくとも１００個の分子標識配列は、異なる配列を含み得る。複数のバーコードの少なくとも１０００個の分子標識配列は、異なる配列を含み得る。複数のバーコードの少なくとも１００００個の分子標識配列は、異なる配列を含み得る。複数のバーコードの分子標識配列は、ランダム配列を含み得る。標的結合領域は、遺伝子特異的配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ランダム多量体、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
非限定的な例示的バーコード（例えば、確率的バーコード）を示す図である。 バーコード化および電子計数（例えば、確率的バーコード化および電子計数）の非限定的な例示的ワークフローを示す図である。 複数の標的からバーコード化された標的（例えば、確率的にバーコード化された標的）のインデックス化されたライブラリーを生成するための非限定的な例示的プロセスを示す略図である。 核バーコード化ワークフロー（例えば、確率的バーコード化）の非限定的な例示的略図を示す。 オルガネラ（例えば、ミトコンドリア）除去を含むバーコード化ワークフロー（例えば、確率的バーコード化）の非限定的な例示的略図を示す。 核捕捉およびバーコード化のワークフローの非限定的な例示的略図を示す。 核捕捉およびバーコード化のワークフローの非限定的な例示的略図を示す。
以下の詳細な説明において、本明細書の一部を形成する添付の図面への参照がなされる。図面では、類似の記号は、文脈により別途示されない限り、典型的には類似の構成要素を特定する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載される例示的な実施形態は、制限することを意味するものではない。本明細書に提示される主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の実施形態を用いることができ、他の変更を行うことができる。概して本明細書に記載され、図面で図示されている本開示の態様は、広範な異なる構成で配置、置換え、組合せ、分離、および設計がなされてもよく、それらのすべてが、本明細書において明示的に企図され、本明細書の開示の一部をなすことが、容易に理解される。
本明細書において参照されるすべての特許、公開特許出願、他の刊行物、およびＧｅｎＢａｎｋからの配列、ならびに他のデータベースは、関連技術に関してその全体が参照により組み込まれる。
核酸または標的、例えば、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子の数を決定することは、例えば、異なる発生段階にあるかまたは異なる環境条件下にある細胞において発現される遺伝子を特定するために、臨床上重要である。しかしながら、特に分子の数が非常に少ない場合には、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）の絶対数を決定することは非常に困難であり得る。試料中の分子の絶対数を決定する１つの方法は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。理想的には、ＰＣＲにより、それぞれのサイクルで同一の分子コピーが得られる。しかしながら、ＰＣＲは、それぞれの分子が確率的な見込みで複製し、この見込みは、ＰＣＲサイクルおよび遺伝子配列によって変動し、増幅バイアスおよび不正確な遺伝子発現測定値をもたらすため、欠点を有し得る。
固有の分子標識（ＭＬ、分子インデックス（ＭＩ）とも称される）を有するバーコード（例えば、確率的バーコード）を使用して、分子数を計数することができる。それぞれの細胞標識に固有の分子標識を有するバーコードを使用して、それぞれの細胞における分子の数を計数することができる。バーコード化の非限定的な例示的アッセイとしては、Ｐｒｅｃｉｓｅ（商標）アッセイ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ））、Ｒｅｓｏｌｖｅ（商標）アッセイ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ））、またはＲｈａｐｓｏｄｙ（商標）アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ））が挙げられる。しかしながら、これらの方法および技法は、エラーが導入される可能性があり、補正されなければ細胞計数が過大に概算され得る。
Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）アッセイは、ポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドに、多数の、例えば、６５６１〜６５５３６個の固有の分子標識を有するバーコード（例えば、確率的バーコード）の枯渇しないプールを利用して、逆転写（ＲＴ）ステップの間に資料中のすべてのポリ（Ａ）−ｍＲＮＡにハイブリダイズさせることができる。分子標識に加えて、バーコードの細胞標識を使用して、マイクロウェルプレートのそれぞれのウェルにおけるそれぞれの単一細胞を特定することができる。バーコードは、ユニバーサルＰＣＲプライミング部位を含み得る。ＲＴの間に、標的遺伝子分子は、バーコードとランダムに反応する。それぞれの標的分子は、バーコード（例えば、確率的バーコード）にハイブリダイズし、その結果、バーコード化された相補的リボヌクレオチド酸（ｃＤＮＡ）分子（例えば、確率的にバーコード化されたｃＤＮＡ分子が生成され得る。標識した後、マイクロウェルプレートのマイクロウェルから得られたバーコード化されたｃＤＮＡ分子を、ＰＣＲ増幅およびシーケンシングのために単一のチューブにプールしてもよい。未加工のシーケンシングデータを分析して、固有の分子標識を有するバーコードの数を得ることができる。
本明細書の開示は、複数の細胞における標的の数を決定するための方法の実施形態を含む。一部の実施形態では、本方法は、核単離組成物を使用して、複数の細胞の複数の核を単離するステップであって、核単離組成物が、核結合試薬を含み、核結合試薬が、核の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる、ステップと、複数のバーコードを使用して、複数の核内の複数の標的をバーコード化して、複数のバーコード化された標的を生成するステップであって、複数のバーコードのそれぞれが、分子標識配列および標的結合領域を含み、複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードの分子標識配列が、異なる配列を含む、ステップと、複数のバーコード化された標的のシーケンシングデータを得るステップと、シーケンシングデータ内の複数のバーコードの分子標識配列を使用して、複数の細胞における複数の標的のそれぞれの数を概算するステップとを含む。
本明細書の開示は、バーコード化組成物の実施形態を含む。一部の実施形態では、バーコード化組成物は、核結合試薬を含む核単離組成物であって、核結合試薬が、核の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる、核単離組成物と、複数のバーコードであって、複数のバーコードのそれぞれが、分子標識配列および標的結合領域を含み、複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードの分子標識配列が、異なる配列を含む、複数のバーコードとを含む。
定義
別途定義されない限り、本明細書に使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。例えば、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY 1989)を参照されたい。本開示の目的で、次の用語を、以下に定義する。
本明細書で使用される場合、「アダプター」という用語は、会合した核酸の増幅またはシーケンシングを容易にするための配列を意味し得る。会合した核酸は、標的核酸を含み得る。会合した核酸は、空間標識、標的標識、試料標識、インデックス化標識、バーコード、確率的バーコード、または分子標識のうちの１つまたは複数を含み得る。アダプターは、線形であり得る。アダプターは、事前にアデニル化されたアダプターであってもよい。アダプターは、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。１つまたは複数のアダプターが、核酸の５’末端または３’末端に配置され得る。アダプターが５’末端および３’末端に公知の配列を含む場合、公知の配列は、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。ポリヌクレオチドの５’末端および／または３’末端に配置されるアダプターは、表面に固定化された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能であり得る。アダプターは、一部の実施形態では、ユニバーサル配列を含み得る。ユニバーサル配列は、２つ以上の核酸分子に共通しているヌクレオチド配列の領域であり得る。２つ以上の核酸分子は、異なる配列の領域を有し得る。したがって、例えば、５’アダプターは、同一および／またはユニバーサル核酸配列を含み得、３’アダプターは、同一および／またはユニバーサル配列を含み得る。複数の核酸分子の異なるメンバーにユニバーサル配列が存在し得ることにより、ユニバーサル配列に相補的である単一のユニバーサルプライマーを使用した複数の異なる配列の複製または増幅が可能となり得る。同様に、少なくとも１つ、２つ（例えば、１対）、またはそれ以上のユニバーサル配列が、核酸分子の集合体の異なるメンバーに存在し得ることにより、ユニバーサル配列に相補的である少なくとも１つ、２つ（例えば、１対）、またはそれ以上の単一のユニバーサルプライマーを使用した複数の異なる配列の複製または増幅が可能となり得る。したがって、ユニバーサルプライマーには、そのようなユニバーサル配列にハイブリダイズすることができる配列が含まれる。標的核酸配列を有する分子を、異なる標的核酸配列の一方または両方の末端にユニバーサルアダプター（例えば、非標的核酸配列）を付加するように改変してもよい。標的核酸に結合した１つまたは複数のユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマーのハイブリダイゼーションのための部位を提供し得る。標的核酸に結合した１つまたは複数のユニバーサルプライマーは、互いに同じであっても異なってもよい。
本明細書で使用される場合、「会合した」または「と会合した」という用語は、２つ以上の種が、ある時点で一緒に位置しているとして特定可能であることを意味し得る。会合は、２つ以上の種が、類似の容器内にあるかまたはそこにあったことを意味し得る。会合は、例えば、２つ以上の種に関するデジタル情報が記憶されており、種のうちの１つまたは複数がある時点で一緒に位置していたと決定するために使用することができる、情報的会合であってもよい。会合は、直接的または間接的な物理的会合であってもよい。一部の実施形態では、２つ以上の会合した種は、互いにまたは共通の固体もしくは半固体表面に「係留されている」、「結合している」、または「固定化されている」。会合は、合成粒子またはビーズなどの固体または半固体支持体に標識を結合させるための共有結合的または非共有結合的手段を指し得る。会合は、標的と標識との間の共有結合であってもよい。
本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、２つのヌクレオチド間の正確な対合の能力を指し得る。例えば、核酸の所与の位置にあるヌクレオチドが、別の核酸のヌクレオチドと水素結合することができる場合、２つの核酸は、その位置において互いに相補的であると考えられる。２つの一本鎖核酸分子間の相補性は、ヌクレオチドのうちのいくつかだけが結合する「部分的」であってもよく、または一本鎖分子間に全相補性が存在する完全なものであってもよい。第１のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列に相補的である場合、第２の配列の「相補体」であると称され得る。第１のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列が第２の配列の逆転物である（すなわち、ヌクレオチドの順序が逆転している）配列に相補的である場合、第２の配列の「逆相補体」であると称され得る。本明細書で使用される場合、「相補体」、「相補的」、および「逆相補体」という用語は、互換可能に使用することができる。ある分子が別の分子にハイブリダイズすることができる場合、それは、ハイブリダイズしている分子の相補体であり得ることが、本開示から理解される。
本明細書で使用される場合、「デジタル計数」という用語は、試料中の標的分子の数を概算するための方法を指し得る。デジタル計数は、試料中の標的と会合している固有の標識の数を決定するステップを含み得る。この確率的手法は、分子計数の問題を、同一の分子の位置決定および特定のうちの１つを、事前に定義した標識セットの検出に関する一連のはい／いいえ式のデジタル質問に変換する。
本明細書で使用される場合、「標識」または「複数の標識」という用語は、試料内の標的と会合した核酸コードを指し得る。標識は、例えば、核酸標識であり得る。標識は、全体的または部分的に増幅可能な標識であってもよい。標識は、全体的または部分的にシーケンシング可能な標識であってもよい。標識は、異なるものとして特定可能な天然の核酸の一部分であってもよい。標識は、公知の配列であってもよい。標識は、核酸配列の接合部、例えば、天然および非天然の配列の接合部を含み得る。本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、「インデックス」、「タグ」、または「標識タグ」という用語と互換可能に使用することができる。標識は、情報を運ぶことができる。例えば、様々な実施形態では、標識は、試料の同一性、試料の供給源、細胞の同一性、および／または標的を判定するために使用することができる。
本明細書で使用される場合、「枯渇しないリザーバ」という用語は、多数の異なる標識で構成される確率的バーコードのプールを指し得る。枯渇しないリザーバは、枯渇しないリザーバを標的のプールと会合させたときに、それぞれの標的が固有の確率的バーコードと会合する可能性が高くなるように、多数の異なる確率的バーコードを含み得る。それぞれの標識した標的分子の固有性は、ランダム選択の統計学によって決定することができ、標識の多様性と比較して、集団内の同一な標的分子のコピー数に依存する。結果として得られる標識した標的分子のサイズは、バーコード化プロセスの確率的性質によって決定することができ、次いで、検出された確率的バーコードの数の分析により、もともとの集団または試料中に存在している標的分子数の計算が可能となる。固有の確率的バーコードの数に対する存在する標的分子の数の比が、低い場合、標識した標的分子は、固有性が高い（すなわち、１つを上回る標的分子が１つの所与の標識で標識されることになる確率は非常に低い）。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド配列またはその断片を指す。核酸は、ヌクレオチドを含み得る。核酸は、細胞に対して外因性であっても内因性であってもよい。核酸は、無細胞環境で存在してもよい。核酸は、遺伝子またはその断片であり得る。核酸は、ＤＮＡであり得る。核酸は、ＲＮＡであり得る。核酸は、１つまたは複数のアナログ（例えば、改変された骨格、糖、または核酸塩基）を含み得る。アナログの一部の非限定的な例としては、５−ブロモウラシル、ペプチド核酸、ゼノ核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コーディセピン、７−デアザ−ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に連結したローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン連結ヌクレオチド、蛍光塩基アナログ、ＣｐＧアイランド、メチル−７−グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、キューオシン、およびワイオシンが挙げられる。「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「標的ポリヌクレオチド」、および「標的核酸」は、互換可能に使用することができる。
核酸は、新しいかまたは亢進された特性（例えば、改善された安定性）を有する核酸をもたらすように、１つまたは複数の改変（例えば、塩基改変、骨格改変）を含んでもよい。核酸は、核酸親和性タグを含んでもよい。ヌクレオシドは、塩基−糖の組合せであり得る。ヌクレオシドの塩基部分は、複素環式塩基であり得る。そのような複素環式塩基の２つのもっとも一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されたリン酸基をさらに含んだヌクレオシドであり得る。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについては、リン酸基は、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分に連結され得る。核酸を形成する際、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合的に連結させて、線形ポリマー化合物を形成し得る。次に、この線形ポリマー化合物のそれぞれの末端が、さらに結合されて、環状化合物が形成され得るが、線形化合物が、一般的には好適である。加えて、線形化合物は、内部ヌクレオチド塩基相補性を有し得、したがって、完全または部分的に二本鎖の化合物が生じるような様式でフォールディングし得る。核酸内において、リン酸基は、一般に、核酸のヌクレオシド間骨格を形成すると称され得る。連結または骨格は、３’と５’のホスホジエステル連結であり得る。
核酸は、改変された骨格および／または改変されたヌクレオシド間連結を含み得る。改変された骨格には、骨格にリン原子を保持するものおよび骨格にリン原子を有さないものが含まれ得る。リン原子を中に含む好適な改変された核酸骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート、例えば、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、およびノルマル３’−５’連結を有するボラノホスフェート、２’−５’連結アナログ、ならびに逆極性を有するものを挙げることができ、ここで、１つまたは複数のヌクレオチド間連結は、３’と３’、５’と５’、または２’と２’の連結である。
核酸は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つもしくは複数のヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結によって形成されるポリヌクレオチド骨格を含み得る。これらには、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有するもの、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ2成分部分を有するその他のものを挙げることができる。
核酸は、核酸模倣体を含み得る。「模倣体」という用語は、フラノース環のみ、またはフラノース環およびヌクレオチド間連結の両方が、非フラノース基で置き換えられたポリヌクレオチドを含むことを意図し得、フラノース環のみの置換えは、糖代理物であると称され得る。複素環式塩基部分または改変された複素環式塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持され得る。１つのそのような核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。ＰＮＡでは、ポリヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられ得る。ヌクレオチドは保持されてもよく、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物における骨格は、２つ以上の連結されたアミノエチルグリシン単位を含み得、これにより、ＰＮＡにアミド含有骨格が提供される。複素環式塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合され得る。
核酸は、モルホリノ骨格構造を含み得る。例えば、核酸は、リボース環の代わりに６員モルホリノ環を含み得る。これらの実施形態のうちのいくつかでは、ホスホロジアミデートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間連結により、ホスホジエステル連結を置き換えることができる。
核酸は、モルホリノ環に結合した複素環式塩基を有する連結されたモルホリノ単位（すなわち、モルホリノ核酸）を含み得る。連結基は、モルホリノ核酸においてモルホリノモノマー単位を連結し得る。非イオン性モルホリノベースのオリゴマー化合物は、細胞内タンパク質との望ましくない相互作用をあまり有さない可能性がある。モルホリノベースのポリヌクレオチドは、核酸の非イオン性模倣体であり得る。モルホリノクラス内の様々な化合物は、異なる連結基を使用して結合することができる。ポリヌクレオチド模倣体のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と称され得る。核酸分子に通常存在するフラノース環を、シクロヘキセニル環で置き換えることができる。ＣｅＮＡ ＤＭＴで保護されたホスホロアミダイトモノマーを調製し、ホスホロアミダイトケミストリーを使用したオリゴマー化合物の合成に使用することができる。ＣｅＮＡモノマーを核酸鎖に組み込むことにより、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性を増加させることができる。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然の複合体に類似する安定性で、核酸相補体と複合体を形成することができる。さらなる改変には、２’−ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に連結され、それによって２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン連結が形成され、それによって二環式糖部分が形成される、ロックド核酸（ＬＮＡ）を挙げることができる。連結は、２’酸素原子および４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ2−）基であり得、ここで、ｎは、１または２である。ＬＮＡおよびＬＮＡアナログは、相補性核酸との非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０℃）、３’−エクソヌクレアーゼ分解に対する安定性、および良好な可溶性特性を示し得る。
核酸はまた、核酸塩基（単純に「塩基」と称されることが多い）改変または置換も含み得る。本明細書で使用される場合、「改変されていない」または「天然の」核酸塩基としては、プリン塩基（例えば、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））、ならびにピリミジン塩基（例えば、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ））を挙げることができる。改変された核酸塩基としては、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、ピリミジン塩基の５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびに他のアルキル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、および他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを挙げることができる。改変された核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）を挙げることができる。
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、標的を含む組成物を指し得る。開示される方法、デバイス、およびシステムによる分析に好適な試料としては、細胞、組織、器官、または生物が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「試料採取デバイス」または「デバイス」という用語は、試料の切片を採取し、かつ／または基質上に切片を配置することができる、デバイスを指し得る。試料デバイスは、例えば、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）機、細胞分取機、生検ニードル、生検デバイス、組織切片化デバイス、マイクロ流体デバイス、ブレードグリッド、および／またはミクロトームを指し得る。
本明細書で使用される場合、「固体支持体」という用語は、複数の確率的バーコードが結合され得る固体または半固体表面を指し得る。固体支持体は、核酸を（例えば、共有結合的または非共有結合的に）固定化することができる、プラスチック、セラミック、金属、またはポリマー材料（例えば、ハイドロゲル）で構成される任意の種類の固体、多孔質、または中空の球体、ボール、ベアリング、シリンダー、または他の類似の構成を包含し得る。固体支持体は、球状（例えば、マイクロスフェア）であり得る別個の粒子を含み得るか、または非球状もしくは不規則な形状、例えば、立方体、立方体様、ピラミッド形、円筒形、円錐形、長方形、もしくは円盤形などを有し得る。アレイに離間配置された複数の固体支持体は、基質を含まない場合がある。固体支持体は、粒子、例えば、合成粒子またはビーズであってもよい。
固体支持体は、「基質」を指し得る。基質は、ある種の固体支持体であり得る。基質は、本開示の方法を行うことができる、連続的な固体または半固体表面を指し得る。基質は、例えば、アレイ、カートリッジ、チップ、デバイス、およびスライドを指し得る。
本明細書で使用される場合、「空間標識」という用語は、空間内の位置と会合され得る標識を指し得る。
本明細書で使用される場合、「確率的バーコード」という用語は、標識を含むポリヌクレオチド配列を指し得る。確率的バーコードは、確率的バーコード化に使用することができるポリヌクレオチド配列であり得る。確率的バーコードは、試料内の標的を定量するために使用することができる。確率的バーコードは、標識を標的に会合させた後に発生し得るエラーを制御するために使用することができる。例えば、確率的バーコードは、増幅またはシーケンシングエラーを評価するために使用することができる。標的と会合した確率的バーコードは、確率的バーコード−標的または確率的バーコード−タグ−標的と称され得る。
本明細書で使用される場合、「遺伝子特異的確率的バーコード」という用語は、標識および遺伝子特異的である標的結合領域を含むポリヌクレオチド配列を指し得る。確率的バーコードは、確率的バーコード化に使用することができるポリヌクレオチド配列であり得る。確率的バーコードは、試料内の標的を定量するために使用することができる。確率的バーコードは、標識を標的に会合させた後に発生し得るエラーを制御するために使用することができる。例えば、確率的バーコードは、増幅またはシーケンシングエラーを評価するために使用することができる。標的と会合した確率的バーコードは、確率的バーコード−標的または確率的バーコード−タグ−標的と称され得る。
本明細書で使用される場合、「確率的バーコード化」という用語は、核酸のランダムな標識化（例えば、バーコード化）を指し得る。確率的バーコード化は、ポアソン再帰戦略を利用して、標識を会合させ、標的と会合した標識を定量することができる。本明細書で使用される場合、「確率的バーコード化」という用語は、「遺伝子特異的確率的バーコード化」と互換可能に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、確率的バーコードと会合され得る組成物を指し得る。開示される方法、デバイス、およびシステムによる分析に好適な例示的な標的としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｔＲＮＡなどが挙げられる。標的は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一部の実施形態では、標的は、タンパク質であり得る。一部の実施形態では、標的は、脂質である。
本明細書で使用される場合、「逆転写酵素」という用語は、逆転写酵素活性を有する（すなわち、ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの合成を触媒する）酵素の群を指し得る。一般に、そのような酵素としては、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、細菌逆転写酵素、ＩＩ群イントロン由来逆転写酵素、およびこれらの変異体、バリアント、または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。非レトロウイルス逆転写酵素としては、非ＬＴＲレトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、およびＩＩ群イントロン逆転写酵素が挙げられる。ＩＩ群イントロン逆転写酵素の例としては、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＬＩ．ＬｔｒＢイントロン逆転写酵素、サーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）ＴｅＩ４ｃイントロン逆転写酵素、またはゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＧｓＩ−ＩＩＣイントロン逆転写酵素が挙げられる。逆転写酵素の他のクラスとしては、非レトロウイルス逆転写酵素の多数のクラス（すなわち、とりわけ、レトロン、ＩＩ群イントロン、および多様性発生レトロエレメント）を挙げることができる。
シグナル細胞標識を特定するためのシステムおよび方法が、本明細書において開示される。一部の実施形態では、本方法は、（ａ）複数の確率的バーコードを使用して、細胞の試料において複数の標的を確率的にバーコード化して、複数の確率的にバーコード化された標的を作製するステップであって、複数の確率的バーコードのそれぞれが、細胞標識および分子標識を含む、ステップと、（ｂ）複数の確率的にバーコード化された標的のシーケンシングデータを得るステップと、（ｃ）複数の確率的バーコードの細胞標識のそれぞれと会合した別個の配列を有する分子標識の数を決定するステップと、（ｄ）細胞標識のそれぞれと会合した別個の配列を有する分子標識の数に基づいて、複数の確率的バーコードの細胞標識のそれぞれのランクを決定するステップと、（ｅ）（ｃ）において決定された細胞標識のそれぞれと会合した別個の配列を有する分子標識の数および（ｄ）において決定された細胞標識のそれぞれのランクに基づいて、累積和プロットを生成するステップと、（ｆ）累積和プロットの二次微分プロットを生成するステップと、（ｇ）累積和プロットの二次微分プロットの最小値を決定するステップであって、二次微分プロットの最小値が、細胞標識の閾値に対応する、ステップと、（ｈ）細胞標識のそれぞれを、（ｃ）において決定された細胞標識のそれぞれと会合した別個の配列を有する分子標識の数および（ｇ）において決定された細胞標識閾値に基づいて、シグナル細胞標識またはノイズ細胞標識として特定するステップとを含む。
バーコード
バーコード化、例えば、確率的バーコード化は、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５０２９９７８４号、国際公開第ＷＯ２０１５０３１６９１号、ならびにFu et al, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2011 May 31;108(22):9026-31およびFan et al., Science (2015) 347(6222):1258367に記載されており、これらの刊行物のそれぞれの内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるバーコードは、標的を確率的に標識する（例えば、バーコード化する、タグ付けする）ために使用することができるポリヌクレオチド配列であり得る、確率的バーコードであり得る。バーコードは、確率的バーコードの異なるバーコード配列の数の、標識しようとする標的のうちの任意のものの発生の数に対する比が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る場合に、確率的バーコードと称され得る。標的は、例えば、同一またはほぼ同一な配列を有するｍＲＮＡ分子を含むｍＲＮＡ種であり得る。バーコードは、確率的バーコードの異なるバーコード配列の数の、標識しようとする標的のうちの任意のものの発生の数に対する比が、少なくともまたは多くとも、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１である場合に、確率的バーコードと称され得る。確率的バーコードのバーコード配列は、分子標識と称され得る。
バーコード、例えば、確率的バーコードは、１つまたは複数の標識を含み得る。例示的な標識としては、ユニバーサル標識、細胞標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、試料標識、プレート標識、空間標識、および／または空間前（ｐｒｅ−ｓｐａｔｉａｌ）標識を挙げることができる。図１は、空間標識を有する例示的なバーコード１０４を示す。バーコード１０４は、バーコードを固体支持体１０８に連結させることができる５’アミンを含み得る。バーコードは、ユニバーサル標識、次元標識（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｌａｂｅｌ）、空間標識、細胞標識、および／または分子標識を含み得る。バーコード内の異なる標識（ユニバーサル標識、次元標識、空間標識、細胞標識、および分子標識を含むがこれらに限定されない）の順序は、変動し得る。例えば、図１に示されるように、ユニバーサル標識がもっとも５’側の標識であってもよく、分子標識がもっとも３’側の標識であってもよい。空間標識、次元標識、および細胞標識は、任意の順序であってよい。一部の実施形態では、ユニバーサル標識、空間標識、次元標識、細胞標識、および分子標識は、任意の順序である。バーコードは、標的結合領域を含み得る。標的結合領域は、試料内の標的（例えば、標的核酸、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ）と相互作用し得る。例えば、標的結合領域は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部と相互作用することができるオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る。一部の事例では、バーコードの標識（例えば、ユニバーサル標識、次元標識、空間標識、細胞標識、およびバーコード配列）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチド、またはそれ以上離間していてもよい。
標識、例えば、細胞標識は、エラー補正能力を提供するように設計され得る、定義された長さ、例えば、それぞれが７ヌクレオチドずつの（一部のハミングエラー補正コードにおいて使用されるビット数と同等の）固有の核酸部分配列セットを含み得る。７ヌクレオチドの配列を含むエラー補正用部分配列セットは、セット内の配列の任意の対での組合せが、定義された「遺伝子距離」（またはミスマッチ塩基数）を呈するように設計することができ、例えば、エラー補正用部分配列セットは、３ヌクレオチドの遺伝子距離を呈するように設計することができる。この場合、標識した標的核酸分子の配列データセットにおけるエラー補正配列の考察（以下により詳細に記載される）により、増幅またはシーケンシングエラーを検出または補正することが可能となり得る。一部の実施形態では、エラー補正コードを作成するために使用される核酸部分配列の長さは、変動し得、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、３１、４０、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。一部の実施形態では、他の長さの核酸部分配列が、エラー補正コードを作成するために使用されてもよい。
バーコードは、標的結合領域を含み得る。標的結合領域は、試料内の標的と相互作用し得る。標的は、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、それぞれがポリ（Ａ）尾部を含むＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せであり得るか、またはこれらを含み得る。一部の実施形態では、複数の標的は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み得る。
一部の実施形態では、標的結合領域は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部と相互作用することができるオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る。バーコードの標識のうちの１つまたは複数（例えば、ユニバーサル標識、次元標識、空間標識、細胞標識、およびバーコード配列（例えば、分子標識））は、バーコードの残りの標識のうちの別の１つまたは２つから、１つまたは複数のスペーサーによって離間していてもよい。スペーサーは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチド、またはそれ以上の長さであり得る。一部の実施形態では、バーコードの標識のいずれも、スペーサーによって離間していない。
ユニバーサル標識
バーコードは、１つまたは複数のユニバーサル標識を含み得る。一部の実施形態では、１つまたは複数のユニバーサル標識は、所与の固体支持体に結合したバーコードのセットにおいて、すべのバーコードについて同じであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数のユニバーサル標識は、複数の粒子（例えば、合成粒子、例えば、ビーズ）に結合したすべてのバーコードについて同じであり得る。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、シーケンシングプライマーにハイブリダイズすることができる核酸配列を含み得る。シーケンシングプライマーは、ユニバーサル標識を含むバーコードをシーケンシングするために使用することができる。シーケンシングプライマー（例えば、ユニバーサルシーケンシングプライマー）は、高スループットのシーケンシングプラットホームと会合したシーケンシングプライマーを含み得る。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、ＰＣＲプライマーにハイブリダイズすることができる核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、シーケンシングプライマーおよびＰＣＲプライマーにハイブリダイズすることができる核酸配列を含み得る。シーケンシングプライマーまたはＰＣＲプライマーにハイブリダイズすることができるユニバーサル標識の核酸配列は、プライマー結合部位と称され得る。ユニバーサル標識は、バーコードの転写を開始させるために使用することができる配列を含み得る。ユニバーサル標識は、バーコードまたはバーコード内の領域の伸長のために使用することができる配列を含み得る。ユニバーサル標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。例えば、ユニバーサル標識は、少なくとも約１０個のヌクレオチドを含み得る。ユニバーサル標識は、例えば、少なくともまたは多くとも、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチドの長さであり得る。一部の実施形態では、バーコードを支持体から切断することを可能にするために、切断可能なリンカーまたは改変されたヌクレオチドが、ユニバーサル標識配列の一部となっていてもよい。
次元標識
バーコードは、１つまたは複数の次元標識を含み得る。一部の実施形態では、次元標識は、標識化（例えば、確率的標識化）が発生した次元に関する情報を提供する核酸配列を含み得る。例えば、次元標識は、標的が確率的にバーコード化された時間に関する情報を提供することができる。次元標識は、試料におけるバーコード化（例えば、確率的バーコード化）の時間と関連付けられてもよい。次元標識は、標識化の時点で活性化され得る。異なる次元標識は、異なる時点で活性化され得る。次元標識は、標的、標的の群、および／または試料が確率的にバーコード化された順序に関する情報を提供する。例えば、細胞集団は、細胞周期のＧ０期に、確率的にバーコード化され得る。細胞は、細胞周期のＧ１期に、バーコード（例えば、確率的バーコード）で再びパルスされ得る。細胞は、細胞周期のＳ期に、バーコードで再びパルスされ得るなどとなり得る。それぞれのパルス（例えば、細胞周期のそれぞれの段階）におけるバーコードは、異なる次元標識を含み得る。このようにすると、次元標識により、細胞周期のどの段階でどの標的が標識されたかに関する情報が得られる。次元標識は、多くの異なる生物学的時間を調べることができる。例示的な生物学的時間としては、細胞周期、転写（例えば、転写開始）、および転写物分解を挙げることができるが、これらに限定されない。別の例では、試料（例えば、細胞、細胞集団）は、薬物および／または治療法での処置の前および／または後に、確率的に標識され得る。別個の標的のコピー数の変化により、薬物および／または治療法に対する試料の応答を示すことができる。
次元標識は、活性化可能であり得る。活性化可能な次元標識は、特定の時点で活性化させることができる。活性化可能な標識は、例えば、継続的に活性化させることができる（例えば、停止されない）。活性化可能な次元標識は、例えば、可逆的に活性化可能であってもよい（例えば、活性化可能な次元標識は、作動させることができ、停止させることができる）。次元標識は、例えば、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上、可逆的に活性化可能であってもよい。次元標識は、例えば、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上、可逆的に活性化可能であってもよい。一部の実施形態では、次元標識は、蛍光、光、化学的事象（例えば、切断、別の分子のライゲーション、改変の付加（例えば、ペグ化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、脱アセチル化、脱メチル化）、光化学的事象（例えば、光ケージング）、および非天然のヌクレオチドの導入により活性化させることができる。
次元標識は、一部の実施形態では、所与の固体支持体（例えば、合成粒子、例えば、ビーズ）に結合したすべてのバーコード（例えば、確率的バーコード）について同一であってもよいが、異なる固体支持体（例えば、合成粒子）については異なり得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％が、同じ次元標識を含み得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも６０％が、同じ次元標識を含み得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも９５％が、同じ次元標識を含み得る。
複数の固体支持体（例えば、合成粒子）に、１０6個以上もの多くの固有の次元標識配列が提示されてもよい。次元標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。次元標識は、例えば、少なくともまたは多くとも、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチドの長さであり得る。次元標識は、約５〜約２００個のヌクレオチドを含み得る。次元標識は、約１０〜約１５０個のヌクレオチドを含み得る。次元標識は、約２０〜約１２５ヌクレオチドの長さを含み得る。
空間標識
バーコードは、１つまたは複数の空間標識を含み得る。一部の実施形態では、空間標識は、バーコードと会合した標的分子の空間配向に関する情報を提供する、核酸配列を含み得る。空間標識は、試料における座標と関連付けられ得る。座標は、固定座標であってもよい。例えば、座標は、基質に関連して固定され得る。空間標識は、二次元または三次元グリッドを参照するものであってもよい。座標は、ランドマークに対して固定され得る。ランドマークは、空間内で特定可能であり得る。ランドマークは、画像化することができる構造体であり得る。ランドマークは、生物学的構造体、例えば、解剖学的ランドマークであり得る。ランドマークは、細胞ランドマーク、例えば、オルガネラであり得る。ランドマークは、非天然のランドマーク、例えば、特定可能な識別子、例えば、カラーコード、バーコード、磁気特性、蛍光、放射性、もしくは固有のサイズもしくは形状を有する構造体であってもよい。空間標識は、物理的区画（例えば、ウェル、容器、マイクロスフェア、チューブ、マイクロカプセル、または液滴）と関連付けられていてもよい。一部の実施形態では、複数の空間標識が、空間内の１つまたは複数の位置をコードするために、一緒に使用される。
空間標識は、所与の固体支持体（例えば、合成粒子、例えば、ビーズ）に結合したすべてのバーコードについて同一であってもよいが、異なる固体支持体（例えば、合成粒子）については異なり得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の同じ空間標識を含むバーコードのパーセンテージは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の同じ空間標識を含むバーコードのパーセンテージは、少なくともまたは多くとも、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％であり得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも６０％が、同じ空間標識を含み得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも９５％が、同じ空間標識を含み得る。
複数の固体支持体（例えば、合成粒子、例えば、ビーズ）に、１０6個以上もの多くの固有の空間標識配列が提示されてもよい。空間標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。空間標識は、例えば、少なくともまたは多くとも、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチドの長さであり得る。空間標識は、約５〜約２００個のヌクレオチドを含み得る。空間標識は、約１０〜約１５０個のヌクレオチドを含み得る。空間標識は、約２０〜約１２５ヌクレオチドの長さを含み得る。
細胞標識
バーコードは、１つまたは複数の細胞標識を含み得る。一部の実施形態では、細胞標識は、どの標的核酸がどの細胞を起源としているかを決定するための情報を提供する、核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、細胞標識は、所与の固体支持体（例えば、合成粒子、例えば、ビーズ）に結合したすべてのバーコードについて同一であるが、異なる固体支持体（例えば、合成粒子）については異なる。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の同じ細胞標識を含むバーコードのパーセンテージは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の同じ細胞標識を含むバーコードのパーセンテージは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％であり得るか、またはおよそでこれらの値であり得る。例えば、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも６０％が、同じ細胞標識を含み得る。別の例として、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも９５％が、同じ細胞標識を含み得る。
複数の固体支持体（例えば、合成粒子）に、１０6個以上もの多くの固有の細胞標識配列が提示されてもよい。細胞標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。細胞標識は、例えば、少なくともまたは多くとも、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチドの長さであり得る。例えば、細胞標識は、約５〜約２００個のヌクレオチドを含み得る。別の例として、細胞標識は、約１０〜約１５０個のヌクレオチドを含み得る。さらに別の例として、細胞標識は、約２０〜約１２５ヌクレオチドの長さを含み得る。
バーコード配列
バーコードは、１つまたは複数のバーコード配列を含み得る。一部の実施形態では、バーコード配列は、バーコードにハイブリダイズした標的核酸種の特定の種類に関する情報の特定をもたらす、核酸配列を含み得る。バーコード配列は、バーコード（例えば、標的結合領域）にハイブリダイズした標的核酸種の特定の発生に関するカウンタを提供する（例えば、およその近似値を提供する）、核酸配列を含む。
一部の実施形態では、バーコード配列の多様なセットが、所与の固体支持体（例えば、合成粒子、例えば、ビーズ）に結合される。一部の実施形態では、１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の固有の分子標識配列が存在し得る。例えば、複数のバーコードは、別個の配列を有する約６５６１個のバーコード配列を含み得る。別の例として、複数のバーコードは、別個の配列を有する約６５５３６個のバーコード配列を含み得る。一部の実施形態では、少なくともまたは多くとも、１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、または１０9個の固有のバーコード配列が存在し得る。固有の分子標識配列は、所与の固体支持体（例えば、合成粒子）に結合していてもよい。
バーコードは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。バーコードは、例えば、少なくともまたは多くとも、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチドの長さであり得る。
分子標識
確率的バーコードは、１つまたは複数の分子標識を含み得る。分子標識は、バーコード配列を含み得る。一部の実施形態では、分子標識は、確率的バーコードにハイブリダイズした標的核酸種の特定の種類に関する情報の特定をもたらす、核酸配列を含み得る。分子標識は、確率的バーコード（例えば、標的結合領域）にハイブリダイズした標的核酸種の特定の発生に対するカウンタを提供する、核酸配列を含む。
一部の実施形態では、分子標識の多様なセットが、所与の固体支持体（例えば、合成粒子、例えば、ビーズ）に結合される。一部の実施形態では、１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、または数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくは数もしくは範囲の固有の分子標識配列が存在し得る。例えば、複数の確率的バーコードは、別個の配列を有する約６５６１個の分子標識を含み得る。別の例として、複数の確率的バーコードは、別個の配列を有する約６５５３６個の分子標識を含み得る。一部の実施形態では、少なくともまたは多くとも、１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、または１０9個の固有の分子標識配列が存在し得る。固有の分子標識配列を有する確率的バーコード化は、所与の固体支持体（例えば、合成粒子）に結合していてもよい。
複数の確率的バーコードを使用した確率的バーコード化については、異なる分子標識配列の数と、標的のうちの任意のものの発生の数との比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る。標的は、同一またはほぼ同一な配列を有するｍＲＮＡ分子を含むｍＲＮＡ種であり得る。一部の実施形態では、異なる分子標識配列の数と、標的のうちの任意のものの発生の数との比は、少なくともまたは多くとも、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、または１００：１である。
分子標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。分子標識は、例えば、少なくともまたは多くとも、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチドの長さであり得る。
標的結合領域
バーコードは、１つまたは複数の標的結合領域、例えば、捕捉プローブを含み得る。一部の実施形態では、標的結合領域は、目的の標的とハイブリダイズし得る。一部の実施形態では、標的結合領域は、標的（例えば、標的核酸、例えば、分析しようとする細胞核酸）に特異的にハイブリダイズする核酸配列を含み得る。例えば、標的結合領域は、特定の遺伝子配列において、標的核酸にハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、標的結合領域は、特定の標的核酸の特定の位置に結合（例えば、ハイブリダイズ）することができる核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、標的結合領域は、制限酵素部位オーバーハング（例えば、ＥｃｏＲＩ粘着末端オーバーハング）への特異的ハイブリダイゼーションが可能である核酸配列を含み得る。バーコードは、次いで、制限部位オーバーハングに相補的な配列を含む任意の核酸分子にライゲーションすることができる。
一部の実施形態では、標的結合領域は、非特異的標的核酸配列を含み得る。非特異的標的核酸配列は、標的核酸の特定の配列とは独立して、複数の標的核酸に結合することができる配列を指し得る。例えば、標的結合領域は、ランダム多量体配列、またはｍＲＮＡ分子上のポリ（Ａ）尾部にハイブリダイズするオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る。ランダム多量体配列は、例えば、ランダム二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、または任意の長さのそれ以上の多量体配列であり得る。一部の実施形態では、標的結合領域は、所与の合成粒子（例えば、ビーズ）に結合したすべてのバーコードについて、同じである。一部の実施形態では、所与の合成粒子に結合した複数のバーコードの標的結合領域は、２つ以上の異なる標的結合配列を含み得る。標的結合領域は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。標的結合領域は、多くとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。
一部の実施形態では、標的結合領域は、ポリアデニル化末端を含むｍＲＮＡとハイブリダイズすることができるオリゴ（ｄＴ）を含み得る。標的結合領域は、遺伝子特異的であり得る。例えば、標的結合領域は、標的の特定の領域にハイブリダイズするように構成され得る。標的結合領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、３０、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。標的結合領域は、少なくともまたは多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの長さであり得る。標的結合領域は、約５〜３０ヌクレオチドの長さであり得る。バーコードが遺伝子特異的標的結合領域を含む場合、バーコードは、本明細書において、遺伝子特異的バーコードと称され得る。
一部の実施形態では、バーコードは、標的結合領域を含まない。一部の実施形態では、バーコードは、試料の１つまたは複数の細胞におけるｍＲＮＡ分子の一部、ほとんど、実質的にすべて、またはすべてに対して低い結合親和性を有する（例えば、結合しない）配列を有する標的結合領域に対応する領域を含む。例えば、バーコードは、目的のｍＲＮＡ分子に結合しない配列を有し得る、標的結合領域に対応する領域を含み得る。第１のバーコードの標的結合領域が、ｍＲＮＡ分子のポリ（Ａ）尾部にハイブリダイズすることができるオリゴ（ｄＴ）配列を含む場合、第２のバーコードの対応する領域は、例えば、ポリ（ｄＴ）配列に類似しないかまたは実質的に類似しない、配列を含み得る。第１のバーコードの標的結合領域が、特定の遺伝子配列に特異的にハイブリダイズすることができる配列を有する標的結合領域を含む場合、第２のバーコードの対応する領域は、例えば、標的結合領域に類似しないかまたは実質的に類似しない配列を含み得る。
配向特性
バーコードは、バーコードを配向する（例えば、アライメント）するために使用することができる１つまたは複数の配向特性を含み得る。バーコードは、等電点電気泳動のための部分を含み得る。異なるバーコードは、異なる等電点電気泳動点を含み得る。これらのバーコードを試料に導入すると、試料は、バーコードを公知の様式で配向するために、等電点電気泳動を受け得る。このようにして、配向特性を使用して、試料におけるバーコードの公知のマップを展開することができる。例示的な配向特性としては、電気泳動移動度（例えば、バーコードのサイズに基づく）、等電点、スピン、導電性、および／または自己アセンブリを挙げることができる。例えば、自己アセンブリの配向特性を有するバーコードは、活性化されると、特定の配向（例えば、核酸ナノ構造）に自己アセンブルし得る。
親和性特性
バーコードは、１つまたは複数の親和性特性を含み得る。例えば、空間標識は、親和性特性を含み得る。親和性特性としては、別の実体（例えば、細胞受容体）へのバーコードの結合を促進することができる化学的および／または生物学的部分を挙げることができる。例えば、親和性特性は、抗体、例えば、試料上の特定の部分（例えば、受容体）に特異的な抗体を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、バーコードを、特定の細胞種または分子へと誘導し得る。特定の細胞種または分子にあるおよび／またはその近傍にある標的を、確率的に標識することができる。親和性特性は、一部の実施形態では、抗体がバーコードを特定の位置へと誘導し得るため、空間標識のヌクレオチド配列に加えて、空間情報を提供することができる。抗体は、治療用抗体、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。抗体は、ヒト化またはキメラであってもよい。抗体は、ネイキッド抗体または融合抗体であってもよい。
抗体は、全長（すなわち、天然に存在するかもしくは通常の免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスによって形成される）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（すなわち、特異的結合）部分、例えば、抗体断片であり得る。
抗体断片は、例えば、抗体の一部分、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどであり得る。一部の実施形態では、抗体断片は、全長抗体によって認識されるものと同じ抗原に結合することができる。抗体断片としては、抗体の可変領域からなる単離された断片、例えば、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、ならびに軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）を挙げることができる。例示的な抗体としては、がん細胞に対する抗体、ウイルスに対する抗体、細胞表面受容体（ＣＤ８、ＣＤ３４、ＣＤ４５）に結合する抗体、および治療用抗体を挙げることができるが、これらに限定されない。
ユニバーサルアダプタープライマー
バーコードは、１つまたは複数のユニバーサルアダプタープライマーを含み得る。例えば、遺伝子特異的バーコード、例えば、遺伝子特異的確率的バーコードは、ユニバーサルアダプタープライマーを含み得る。ユニバーサルアダプタープライマーは、すべてのバーコードにわたってユニバーサルなヌクレオチド配列を指し得る。ユニバーサルアダプタープライマーは、遺伝子特異的バーコードを構築するために使用することができる。ユニバーサルアダプタープライマーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、３０ヌクレオチド、またはこれらのうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。ユニバーサルアダプタープライマーは、少なくともまたは多くとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの長さであり得る。ユニバーサルアダプタープライマーは、５〜３０ヌクレオチドの長さであり得る。
リンカー
バーコードが、１つを上回る種類の標識（例えば、１つを上回る細胞標識または１つを上回るバーコード配列、例えば、１つの分子標識）を含む場合、標識には、リンカー標識配列が散在していてもよい。リンカー標識配列は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。リンカー標識配列は、多くとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。一部の事例では、リンカー標識配列は、１２ヌクレオチドの長さである。リンカー標識配列は、バーコードの合成を容易にするために使用することができる。リンカー標識は、エラー補正（例えば、ハミング）コードを含み得る。
固体支持体
本明細書において開示されるバーコード、例えば、確率的バーコードは、一部の実施形態では、固体支持体と会合していてもよい。固体支持体は、例えば、粒子または合成粒子であり得る。一部の実施形態では、バーコード配列の一部またはすべて、例えば、固体支持体上の複数のバーコード（例えば、第１の複数のバーコード）の確率的バーコード（例えば、第１のバーコード配列）の分子標識は、少なくとも１つのヌクレオチドが異なる。同じ固体支持体上のバーコードの細胞標識は、同じであり得る。異なる固体支持体上のバーコードの細胞標識は、少なくとも１つのヌクレオチドが異なり得る。例えば、第１の固体支持体上の第１の複数のバーコードの第１の細胞標識は、同じ配列を有してもよく、第２の固体支持体上の第２の複数のバーコードの第２の細胞標識は、同じ配列を有してもよい。第１の固体支持体上の第１の複数のバーコードの第１の細胞標識および第２の固体支持体上の第２の複数のバーコードの第２の細胞標識は、少なくとも１つのヌクレオチドが異なり得る。細胞標識は、例えば、約５〜２０ヌクレオチド長であり得る。バーコード配列は、例えば、約５〜２０ヌクレオチド長であり得る。合成粒子は、例えば、ビーズであり得る。
合成粒子は、例えば、シリカゲルビーズ、細孔制御ガラスビーズ、磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ／Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、セルロースビーズ、ポリスチレンビーズ、またはこれらの任意の組合せであり得る。合成粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、またはこれらの任意の組合せなどの材料を含み得る。
一部の実施形態では、合成粒子は、ポリマー粒子、例えば、バーコードまたは確率的バーコードで官能化された変形可能な粒子またはゲル粒子（例えば、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）からのゲルビーズ）であり得る。一部の実装形態では、ゲル粒子は、１つまたは複数のポリマー系ゲルを含み得る。ゲル粒子は、例えば、１つまたは複数のポリマー前駆体を液滴に封入することによって、生成することができる。ポリマー前駆体を、促進剤（例えば、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ））に曝露すると、ゲル粒子が生成され得る。
一部の実施形態では、粒子は、分解可能であり得る。例えば、ポリマー粒子またはビーズは、例えば、所望される条件下において、溶解、融解、または分解し得る。所望される条件には、環境条件が含まれ得る。所望される条件は、制御された様式で、ポリマー粒子の溶解、融解、または分解をもたらし得る。ゲル粒子は、化学的刺激、物理的刺激、生物学的刺激、熱刺激、磁気刺激、電気刺激、光刺激、またはこれらの任意の組合せに起因して、溶解、融解、または分解し得る。
試薬、例えば、オリゴヌクレオチドバーコードは、合成粒子の内部表面（例えば、オリゴヌクレオチドバーコードおよび／もしくはオリゴヌクレオチドバーコードを生成するために使用される材料の拡散を通じてアクセス可能な内部）、ならびに／またはゲル粒子もしくは本明細書に記載される任意の他のマイクロカプセルの外部表面に連結／固定化されていてもよい。粒子は、例えば、ゲルビーズであってもよい。会合（例えば、連結または固定化）は、任意の形態の化学結合（例えば、共有結合、イオン結合）または物理的現象（例えば、ファンデルワールス力、双極子間相互作用など）を介してもよい。一部の実施形態では、試薬の粒子または本明細書に記載される任意の他の固体支持体（例えば、マイクロカプセル）への会合（例えば、連結または固定化）は、例えば、不安定性部分を介する（例えば、本明細書に記載される化学的架橋剤を含む、化学的架橋剤を介する）ものなど、可逆的であり得る。刺激を適用すると、不安定性部分は、切断され、固定化された試薬が遊離され得る。一部の実施形態では、不安定性部分は、ジスルフィド結合である。例えば、オリゴヌクレオチドバーコードがジスルフィド結合を介してゲル粒子に固定化されている事例では、ジスルフィド結合を還元剤に曝露することにより、ジスルフィド結合が切断され、オリゴヌクレオチドバーコードが粒子から遊離され得る。不安定性部分は、ゲル粒子、ビーズ、もしくはマイクロカプセルの一部として、試薬をゲルビーズもしくはマイクロカプセルに連結させる化学的リンカーの一部として、および／または試薬の一部として導入され得る。一部の実施形態では、複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、粒子に固定化されていてもよく、粒子に部分的に固定化されていてもよく、粒子に封入されていてもよく、粒子に部分的に封入されていてもよく、またはこれらの任意の組合せであってもよい。
一部の実施形態では、粒子（例えば、ゲルビーズ）は、ポリマー、熱感受性ポリマー、光感受性ポリマー、磁性ポリマー、ｐＨ感受性ポリマー、塩感受性ポリマー、化学感受性ポリマー、高分子電解質、多糖、ペプチド、タンパク質、および／またはプラスチックを含むがこれらに限定されない、広範な異なるポリマーを含み得る。ポリマーとしては、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（スチレンスルホネート）（ＰＳＳ）、ポリ（アリルアミン）（ＰＡＡｍ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（ジアリルジメチル−アンモニウムクロリド）（ＰＤＡＤＭＡＣ）、ポリ（ピロール）（ＰＰｙ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰＯＮ）、ポリ（ビニルピリジン）（ＰＶＰ）、ポリ（メタクリル酸）（ＰＭＡＡ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ（テトラヒドロフラン）（ＰＴＨＦ）、ポリ（フタルアルデヒド）（ＰＴＨＦ）、ポリ（ヘキシルビオロゲン）（ＰＨＶ）、ポリ（Ｌ−リシン）（ＰＬＬ）、ポリ（Ｌ−アルギニン）（ＰＡＲＧ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）などの材料を挙げることができるが、これらに限定されない。
多数の化学的刺激を使用して、粒子の崩壊、溶解、または分解をトリガーすることができる。これらの化学変化の例としては、粒子壁へのｐＨに媒介される変化、架橋結合の化学的切断を介した粒子壁の崩壊、粒子壁の脱重合のトリガー、および粒子壁のスイッチング反応を挙げることができるが、これらに限定されない。バルク変化を使用して、粒子の崩壊をトリガーすることもできる。
様々な刺激を通じたマイクロカプセルまたは粒子に対するバルク変化または物理的変化はまた、試薬を放出するためのカプセルの設計において、多くの利点を提供する。バルク変化または物理的変化は、巨視的規模で発生し、粒子の破裂は、刺激によって誘導される機械−物理力の結果である。これらのプロセスとしては、圧力に誘導される破裂、粒子壁の融解、または粒子壁の多孔性の変化を挙げることができるが、これらに限定されない。
生物学的刺激もまた、粒子の崩壊、溶解、または分解をトリガーするために使用することができる。一般に、生物学的トリガーは、化学的トリガーに似ているが、多くの例では、生体分子、または酵素、ペプチド、糖、脂肪酸、核酸などといった生体系において一般に見出される分子を使用する。例えば、粒子は、特定のプロテアーゼによる切断に対して感受性であるペプチド架橋を有するポリマーを含み得る。より具体的には、１つの例では、ＧＦＬＧＫペプチド架橋を含むマイクロカプセルを含み得る。プロテアーゼカテプシンＢなどの生物学的トリガーを添加すると、シェル壁のペプチド架橋が切断され、粒子の内容物が放出される。他の事例では、プロテアーゼは、熱活性化され得る。別の例では、粒子は、セルロースを含むシェル壁を含む。加水分解性酵素であるキトサンの添加が、セルロース結合の切断、シェル壁の脱重合、およびその内部の内容物の放出の生物学的トリガーとしての機能を果たす。
粒子はまた、熱刺激を適用するとその内容物を放出するように誘導することもできる。温度の変化は、粒子に様々な変化を引き起こし得る。熱の変化は、粒子壁が崩壊するように粒子の融解を引き起こし得る。他の事例では、熱は、粒子が崩壊または爆発するように、粒子の内部成分の内圧を増加させ得る。なおも他の事例では、熱は、粒子を圧縮され脱水された状態へと変換させ得る。熱はまた、粒子の壁内の熱感受性ポリマーに対して作用して、粒子の崩壊を引き起こすことができる。
マイクロカプセルの粒子壁に磁性ナノ粒子を含めることにより、粒子の崩壊をトリガーすること、ならびに粒子をアレイにおいて誘導することができる。本開示のデバイスは、いずれかの目的で磁性粒子を含み得る。１つの例では、Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子を高分子電解質含有粒子に組み込むことにより、振動磁界刺激の存在下において崩壊がトリガーされる。
粒子はまた、電気刺激の結果として、崩壊、溶解、または分解され得る。前の節に記載されている磁性粒子と同様に、電気感受性粒子により、粒子の崩壊、ならびに電界におけるアライメント、電気伝導、または酸化還元反応などの他の機能の両方をトリガーすることが可能となり得る。１つの例では、電気感受性材料を含有する粒子は、内部試薬の放出を制御することができるように、電界においてアライメントされる。他の例では、電界は、粒子壁自体内における酸化還元反応を誘導し得、これにより多孔性が増加し得る。
光刺激もまた、粒子を崩壊させるために使用することができる。多数の光トリガーが、可能であり、これには、特定の範囲の波長の光子を吸収することができるナノ粒子および発色団などの様々な分子を使用するシステムが含まれ得る。例えば、金属酸化物コーティングを、カプセルトリガーとして使用することができる。ＳｉＯ2をコーティングした高分子電解質カプセルのＵＶ照射は、粒子壁の崩壊をもたらし得る。さらに別の例では、光スイッチ可能な材料、例えば、アゾベンゼン基を、粒子壁に組み込んでもよい。ＵＶまたは可視光を適用すると、これらのような化学物質は、光子を吸収して可逆的なシスからトランスへの異性化を受ける。この態様では、光スイッチの組込みにより、光トリガーを適用すると崩壊し得るかまたはより多孔性となり得る粒子壁が得られる。
例えば、図２に示されるバーコード化（例えば、確率的バーコード化）の非限定的な例では、ブロック２０８において、細胞、例えば、単一細胞を、マイクロウェルアレイの複数のマイクロウェルに導入した後、ブロック２１２において、粒子を、マイクロウェルアレイの複数のマイクロウェルに導入することができる。それぞれのマイクロウェルは、１つの粒子を含み得る。粒子は、複数のバーコードを含み得る。バーコードは、粒子に結合した５’アミン領域を含み得る。バーコードは、ユニバーサル標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、標的結合領域、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
本明細書において開示されるバーコードは、固体支持体（例えば、粒子またはビーズ）と会合していてもよい（例えば、それに結合していてもよい）。固体支持体と会合しているバーコードは、それぞれが、固有の配列を有する少なくとも１００または１０００個のバーコード配列を含む群から選択される、バーコード配列を含み得る。一部の実施形態では、固体支持体と会合している異なるバーコードは、異なる配列のバーコード配列を含み得る。一部の実施形態では、固体支持体と会合しているあるパーセンテージのバーコードは、同じ細胞標識を含む。例えば、パーセンテージは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る。別の例として、パーセンテージは、少なくともまたは多くとも、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％であり得る。一部の実施形態では、固体支持体と会合しているバーコードは、同じ細胞標識を有し得る。異なる固体支持体と会合しているバーコードは、固有の配列を有する少なくとも１００または１０００個の細胞標識を含む群から選択される、異なる細胞標識を有し得る。
本明細書において開示されるバーコードは、固体支持体（例えば、粒子またはビーズ）に会合していてもよい（例えば、それに結合していてもよい）。一部の実施形態では、試料における複数の標識を確率的にバーコード化するステップは、複数のバーコードと会合した複数の合成粒子を含む固体支持体を用いて行うことができる。一部の実施形態では、固体支持体は、複数のバーコードと会合した複数の合成粒子を含み得る。異なる固体支持体上の複数のバーコードの空間標識は、少なくとも１つのヌクレオチドが異なり得る。固体支持体は、例えば、二次元または三次元で複数のバーコードを含み得る。合成粒子は、ビーズであり得る。粒子は、シリカゲルビーズ、細孔制御ガラスビーズ、磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ／Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、セルロースビーズ、ポリスチレンビーズ、またはこれらの任意の組合せであり得る。固体支持体としては、ポリマー、マトリックス、ハイドロゲル、ニードルアレイデバイス、抗体、またはこれらの任意の組合せを挙げることができる。一部の実施形態では、固体支持体は、自由に浮動することができる。一部の実施形態では、固体支持体は、半固体または固体アレイに包埋されていてもよい。バーコードは、固体支持体と会合していなくてもよい。バーコードは、個別のヌクレオチドであってもよい。バーコードは、基質と会合していてもよい。
本明細書で使用される場合、「係留された」、「結合した」、および「固定化された」という用語は、互換可能に使用され、バーコードを固体支持体に結合させるための共有結合的または非共有結合的手段を指し得る。様々な異なる固体支持体のうちのいずれかを、事前に合成したバーコードを結合させるため、またはバーコードのインサイツでの固相合成のための固体支持体として使用することができる。
一部の実施形態では、固体支持体は、粒子、例えば、ビーズである。粒子は、核酸を（例えば、共有結合的または非共有結合的に）固定化することができる１つまたは複数の種類の固体、多孔質、または中空の球体、ボール、ベアリング、シリンダー、または他の類似の構成を含み得る。粒子は、例えば、プラスチック、セラミック、金属、ポリマー材料、またはこれらの任意の組合せから構成され得る。粒子は、球状（例えば、マイクロスフェア）である別個の粒子であるか、もしくはそれを含み得るか、または非球状もしくは不規則な形状、例えば、立方体、立方体様、ピラミッド形、円筒形、円錐形、長方形、もしくは円盤形などを有し得る。一部の実施形態では、粒子は、非球体の形状であり得る。
粒子は、常磁性材料（例えば、マグネシウム、モリブデン、リチウム、およびタンタル）、超常磁性材料（例えば、フェライト（Ｆｅ3Ｏ4、マグネタイト）ナノ粒子）、強磁性材料（例えば、鉄、ニッケル、コバルト、これらの一部の合金、および一部の希土類金属化合物）、セラミック、プラスチック、ガラス、ポリスチレン、シリカ、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、アガロース、ハイドロゲル、ポリマー、セルロース、ナイロン、またはこれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない、様々な材料を含み得る。
一部の実施形態では、粒子（例えば、標識が結合される粒子）は、ハイドロゲルビーズである。一部の実施形態では、粒子は、ハイドロゲルを含む。
本明細書において開示される一部の実施形態は、１つまたは複数の粒子（例えば、ビーズ）を含む。粒子のそれぞれは、複数のオリゴヌクレオチド（例えば、バーコード）を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、バーコード配列（例えば、分子標識）、細胞標識、および標的結合領域（例えば、オリゴ（ｄＴ）配列、遺伝子特異的配列、ランダム多量体、またはこれらの組合せ）を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれの細胞標識配列は、同じであってもよい。異なる粒子上のオリゴヌクレオチドの細胞標識配列は、異なる粒子上のオリゴヌクレオチドを特定することができるように、異なってもよい。異なる細胞標識配列の数は、異なる実装形態では異なり得る。一部の実施形態では、細胞標識配列の数は、１０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、これらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、またはそれ以上であってもよい。一部の実施形態では、細胞標識配列の数は、少なくともまたは多くとも、１０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、１０6個、１０7個、１０8個、または１０9個であり得る。一部の実施形態では、複数の粒子のうちの１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、２０個以下、３０個以下、４０個以下、５０個以下、６０個以下、７０個以下、８０個以下、９０個以下、１００個以下、２００個以下、３００個以下、４００個以下、５００個以下、６００個以下、７００個以下、８００個以下、９００個以下、１０００個以下、またはそれ以上を上回らないものが、同じ細胞配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、同じ細胞配列を有するオリゴヌクレオチドを含む複数の粒子は、多くとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはそれ以上であり得る。一部の実施形態では、複数の粒子のうちのいずれもが、同じ細胞標識配列を有さない。
それぞれの粒子上の複数のオリゴヌクレオチドは、異なるバーコード配列（例えば、分子標識）を含み得る。一部の実施形態では、バーコード配列の数は、１０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る。一部の実施形態では、バーコード配列の数は、少なくともまたは多くとも、１０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、１０6個、１０7個、１０8個、または１０9個であり得る。例えば、複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１００個は、異なるバーコード配列を含む。別の例として、単一の粒子において、複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１００個、５００個、１０００個、５０００個、１００００個、１５０００個、２００００個、５００００個、これらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはそれよりも多くが、異なるバーコード配列を含む。一部の実施形態は、バーコードを含む複数の粒子を提供する。一部の実施形態では、標識しようとする標的の発生（またはコピーもしくは数）と、異なるバーコード配列との比は、少なくとも１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、またはそれ以上であり得る。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、試料標識、ユニバーサル標識、または両方をさらに含む。粒子は、例えば、ナノ粒子またはマイクロ粒子であり得る。
粒子のサイズは、変動し得る。例えば、粒子の径は、０．１マイクロメートル〜５０マイクロメートルの範囲に及び得る。一部の実施形態では、粒子の径は、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０マイクロメートル、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る。
粒子の径は、基質のウェルの径に関連し得る。一部の実施形態では、粒子の径は、ウェルの径よりも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、長いかまたは短くてもよい。粒子の径は、細胞（例えば、基質のウェルによって包囲される単一細胞）の径と関連し得る。一部の実施形態では、粒子の径は、ウェルの径よりも、少なくともまたは多くとも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、長いかまたは短くてもよい。粒子の径は、細胞（例えば、基質のウェルによって包囲される単一細胞）の径と関連し得る。一部の実施形態では、粒子の径は、細胞の径よりも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、長いかまたは短くてもよい。一部の実施形態では、粒子の径は、細胞の径よりも、少なくともまたは多くとも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、または３００％、長いかまたは短くてもよい。
粒子は、基質に結合および／または包埋されていてもよい。粒子は、ゲル、ハイドロゲル、ポリマー、および／またはマトリックスに結合および／または包埋されていてもよい。基質（例えば、ゲル、マトリックス、スキャフォールド、またはポリマー）内の粒子の空間位置は、位置アドレスとしての機能を果たし得る粒子上のバーコードに存在する空間標識を使用して特定することができる。
粒子の例としては、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）、ＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ、抗体コンジュゲートビーズ（例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ）、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、およびＢｃＭａｇ（商標）カルボキシル末端化磁性ビーズを挙げることができるが、これらに限定されない。
粒子は、量子ドットまたは蛍光色素と会合（例えば、それを含浸）させて、それを１つの蛍光光学チャネルまたは複数の光学チャネルにおいて蛍光性にすることができる。粒子は、酸化鉄または酸化クロムと会合させて、それを常磁性または強磁性にすることができる。粒子は、特定可能であり得る。例えば、粒子は、カメラを使用してイメージングすることができる。粒子は、粒子と会合した検出可能なコードを有し得る。例えば、粒子は、バーコードを含み得る。粒子は、例えば、有機または無機溶液中での膨張に起因して、サイズが変化し得る。粒子は、疎水性であり得る。粒子は、親水性であり得る。粒子は、生体適合性であり得る。
固体支持体（例えば、粒子）は、視覚化することができる。固体支持体は、視覚化タグ（例えば、蛍光色素）を含み得る。固体支持体（例えば、粒子）は、識別子（例えば、数字）をエッチングすることができる。識別子は、粒子のイメージングを通じて視覚化することができる。
固体支持体は、不溶性、半可溶性、または不溶性材料を含み得る。固体支持体は、そこに結合したリンカー、スキャフォールド、構築ブロック、または他の反応性部分が含まれる場合、「官能化」されたと称され得るが、固体支持体は、そこに結合したそのような反応性部分が欠如している場合、「非官能化」であり得る。固体支持体は、溶液中、例えばマイクロタイターウェル形式において、フロースルー形式、例えばカラムにおいて、またはディップスティックにおいて、自由に用いることができる。
固体支持体は、膜、紙、プラスチック、コーティング表面、平坦面、ガラス、スライド、チップ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。固体支持体は、樹脂、ゲル、マイクロスフェア、または他の幾何構成の形態をとり得る。固体支持体は、シリカチップ、マイクロ粒子、ナノ粒子、プレート、アレイ、キャリパー、平坦支持体、例えば、ガラス繊維フィルタ、ガラス面、金属面、金属面（鋼、金銀、アルミニウム、シリコン、および銅）、ガラス支持体、プラスチック支持体、シリコン支持体、チップ、フィルタ、膜、マイクロウェルプレート、スライド、多重ウェルプレートもしくは膜を含むプラスチック材料（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、二フッ化ポリビニリデンか形成される）、および／またはウエハ、コーム、ピンもしくはニードル（例えば、コンビナトリアル合成もしくは分析に好適なピンのアレイ）、または平坦面の穴もしくはナノリットルウェルのアレイ、例えば、ウエハ（例えば、シリコンウエハ）、底部がフィルタになっているか、もしくはなっていない穴を有するウエハにおける粒子（例えば、合成粒子、例えば、ビーズ）を含み得る。
固体支持体は、ポリマーマトリックス（例えば、ゲル、ハイドロゲル）を含み得る。ポリマーマトリックスは、細胞内空間（例えば、オルガネラの周囲）に浸透することが可能であり得る。ポリマーマトリックスは、循環系を通して送り出すことが可能であり得る。
固体支持体は、生体分子であり得る。例えば、固体支持体は、核酸、タンパク質、抗体、ヒストン、細胞区画、脂質、炭水化物などであり得るか、またはそれらを含み得る。生体分子である固体支持体は、増幅、翻訳、転写、分解、および／または改変（例えば、ペグ化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、メチル化）され得る。生体分子である固体支持体は、生体分子に結合している空間標識に加えて、空間および時間の情報を提供することができる。例えば、生体分子は、改変されていない場合は第１の高次構造を含み得るが、改変されている場合には第２の高次構造に変化し得る。異なる高次構造により、本開示のバーコード（例えば、確率的バーコード）を標的に曝露することができる。例えば、生体分子は、生体分子のフォールディングに起因してアクセス不可能となるバーコードを含み得る。生体分子が改変（例えば、アセチル化）されると、生体分子は、バーコードを曝露するように高次構造を変化させ得る。改変のタイミングは、本開示のバーコード化の方法に、別の時間次元を提供し得る。
一部の実施形態では、本開示のバーコード試薬を含む生体分子は、細胞の細胞質に位置していてもよい。活性化されると、生体分子は、核を移動させることができ、このときに、バーコード化が生じ得る。このようにすると、生体分子の改変により、バーコードによって特定される標的に関する追加の空間−時間情報がコードされ得る。
基質およびマイクロウェルアレイ
本明細書で使用される場合、基質は、ある種の固体支持体を指し得る。基質は、本開示のバーコードおよび確率的バーコードを含み得る固体支持体を指し得る。基質は、例えば、複数のマイクロウェルを含み得る。例えば、基質は、２つ以上のマイクロウェルを含むウェルアレイであり得る。一部の実施形態では、マイクロウェルは、容積が定義されている小さな反応チャンバを含み得る。一部の実施形態では、マイクロウェルは、１つまたは複数の細胞を取り込むことができる。一部の実施形態では、マイクロウェルは、１つのみの細胞を取り込むことができる。一部の実施形態では、マイクロウェルは、１つまたは複数の固体支持体を取り込むことができる。一部の実施形態では、マイクロウェルは、１つのみの固体支持体を取り込むことができる。一部の実施形態では、マイクロウェルは、単一の細胞および単一の固体支持体（例えば、粒子）を取り込む。マイクロウェルは、本開示のコンビナトリアルバーコード試薬を含み得る。
固体支持体上でのバーコードの合成
バーコード（例えば、確率的バーコード）は、固体支持体（例えば、粒子、例えば、合成粒子またはビーズ）上で合成され得る。予め合成されたバーコード（例えば、固体支持体に連結し得る５’アミンを含む）は、固体支持体およびバーコード上の官能基対に関与する種々の固定技法のいずれかによって、固体支持体（例えば、粒子）に結合され得る。バーコードは、官能基を含み得る。固体支持体（例えば、粒子）は、官能基を含み得る。バーコードの官能基および固体支持体の官能基は、例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せを含み得る。バーコード（例えば、確率的バーコード）は、例えば、バーコード上の５’アミノ基を官能化固体支持体のカルボキシル基に連結させること（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を使用すること）によって、固体支持体に係留され得る。残留した連結されていないバーコードは、複数回の濯ぎステップを実施することによって、反応混合物から除去され得る。一部の実施形態では、バーコードおよび固体支持体は、類似する結合化学を使用して、リンカー分子（例えば、短い、官能化炭化水素分子またはポリエチレンオキシド分子）を通じて、間接的に結合される。リンカーは、切断可能なリンカー、例えば、酸不安定性リンカーまたは光切断可能なリンカーであってもよい。
バーコード（例えば、確率的バーコード）は、いくつかの固相オリゴヌクレオチド合成技法、例えば、ホスホジエステル合成、ホスホトリエステル合成、亜リン酸トリエステル合成、およびホスホラミダイト合成のうちのいずれかを使用して、固体支持体（例えば、粒子）上で合成することができる。単一のヌクレオチドは、増加する係留バーコードに段階的に連結され得る。いくつかのオリゴヌクレオチドの短い、予め合成された配列（またはブロック）は、増加する係留バーコードに連結され得る。
バーコード（例えば、確率的バーコード）は、段階的な連結反応またはブロックの連結反応に、１または複数回のスプリットプール合成を点在させることによって合成することができ、スプリットプール合成では、合成粒子の全プールがいくつかのより小さな個々のプールに分割され、次いで、それぞれが異なる連結反応に供され、その後、個々のプールを組換えおよび混合することにより、粒子の全プールにわたって増加するバーコード配列をランダムにする。スプリットプール合成は、最大数の化学的化合物を最小数の化学的連結ステップを使用して合成するコンビナトリアル合成プロセスの一例である。このように作製された化合物ライブラリーの潜在的多様性は、各連結ステップに利用できる特有のビルディングブロック（例えば、ヌクレオチド）の数、およびライブラリーを作製するために使用される連結ステップの数によって決定される。例えば、各ステップにおいて４つの異なるヌクレオチドを使用する１０回の連結を含むスプリットプール合成によって、４10＝１，０４８，５７６の特有なヌクレオチド配列が得られることになる。一部の実施形態では、スプリットプール合成は、化学的連結よりもむしろ、ポリメラーゼ伸長またはライゲーション反応などの酵素的方法を使用して実施することができる。例えば、スプリットプールポリメラーゼ伸長反応の各回では、所与のプールにおいて粒子に係留されたバーコードの３’末端に、セミランダムプライマー、例えば、５’−（Ｍ）k−（Ｘ）i−（Ｎ）j−３’（式中、（Ｘ）iは、ｉヌクレオチド長であるヌクレオチドのランダム配列であり（（Ｘ）iのすべての可能な組合せを含むプライマーのセット）、（Ｎ）jは特定のヌクレオチド（または一連のｊ個のヌクレオチド）であり、かつ（Ｍ）kは特定のヌクレオチド（または一連のｋ個のヌクレオチド）である）の構造を有するプライマーのセットの５’末端をハイブリダイズさせることができ、ここで、異なるデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）は各プールに添加され、ポリメラーゼによって、係留されたオリゴヌクレオチド中に組み込まれる。
バーコード化の方法
本開示は、試料中の別個の標的の数を概算するための方法を提供する。一部の実施形態では、複数の標的をバーコード化するステップは、複数のバーコードを複数の標的にハイブリダイズさせ、バーコード化された標的（例えば、確率的にバーコード化された標的）を作製するステップを含む。複数の標的をバーコード化するステップは、バーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーを生成するステップを含み得る。バーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーを生成するステップは、複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）を含む固体支持体を用いて実施され得る。
試料とバーコードを接触させるステップ
本開示は、試料（例えば、細胞）を本開示の基質に接触させるための方法を提供する。例えば、細胞、臓器、または組織の薄切片を含む試料を、バーコード（例えば、確率的バーコード）に接触させることができる。例えば、重力流によって、細胞を接触させることができ、その場合、細胞は定着して単層を形成し得る。試料は、組織薄片であってもよい。薄片を基質上に配置することができる。試料は、一次元であってもよい（例えば、平面表面を形成してもよい）。例えば、基質上で細胞を増殖させる／培養することによって、試料（例えば、細胞）を基質全体に広げることができる。
バーコードが標的と近接して存在する場合、標的は、バーコードにハイブリダイズし得る。それぞれ別個の標的が、本開示の別個のバーコードと会合し得るように、バーコードを、非枯渇的比率で接触させることができる。標的とバーコードとの間の効率的な会合を確実にするために、標的をバーコードと架橋させてもよい。
細胞溶解
細胞およびバーコードの分配後に、細胞を溶解させて、標的分子を遊離させることができる。細胞溶解は、種々の手段のいずれかによって、例えば、化学的もしくは生化学的手段によって、浸透圧ショックによって、または熱溶解、機械溶解、もしくは光学溶解によって達成することができる。界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、Ｌｉドデシルスルフェート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、またはＮＰ−４０）、有機溶媒（例えば、メタノールまたはアセトン）、もしくは消化酵素（例えば、プロテイナーゼＫ、ペプシン、またはトリプシン）、またはこれらの任意の組合せを含む細胞溶解緩衝液を添加することによって、細胞を溶解させてもよい。標的とバーコードとの会合を増加させるために、例えば、温度を低下させるおよび／またはライセートの粘度を増加させることによって、標的分子の拡散速度を変化させてもよい。
一部の実施形態では、濾紙を使用することによって、試料を溶解させてもよい。濾紙は、濾紙の上を溶解緩衝液で浸漬可能である。試料の溶解および基質への試料の標的のハイブリダイゼーションを促進可能な圧力で試料に適用することができる。
一部の実施形態では、溶解は、機械溶解、熱溶解、光学溶解、および／または化学溶解によって実施することができる。化学溶解には、プロテイナーゼＫ、ペプシン、およびトリプシンなどの消化酵素の使用が含まれてもよい。溶解は、基質への溶解緩衝液の添加によって実施することができる。溶解緩衝液は、トリスＨＣｌを含んでもよい。溶解緩衝液は、少なくとも約、または最大約０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．５Ｍ、もしくは１Ｍまたはそれより多いかもしくは少ないトリスＨＣｌを含んでもよい。溶解緩衝液は、約０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．５Ｍ、または１ＭのトリスＨＣｌを含んでもよい。溶解緩衝液のｐＨは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより高い値であってもよい。溶解緩衝液のｐＨは、最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより高い値であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液のｐＨは、約７．５である。溶解緩衝液は、塩（例えば、ＬｉＣｌ）を含んでもよい。溶解緩衝液中の塩濃度は、少なくとも約０．１、０．５、もしくは１Ｍまたはそれより高くてもよい。溶解緩衝液中の塩濃度は、最大約０．１、０．５、もしくは１Ｍまたはそれより高くてもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の塩濃度は、約０．５Ｍである。溶解緩衝液は、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、Ｌｉドデシルスルフェート、ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、ｔｗｅｅｎ、ＮＰ−４０）を含んでもよい。溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、少なくとも約０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、もしくは７％、またはそれより高い割合であってもよい。溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、最大約０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、もしくは７％、またはそれより高い割合であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、約１％のＬｉドデシルスルフェートである。溶解のための方法において使用される時間は、使用される界面活性剤の量に依存し得る。一部の実施形態では、使用される界面活性剤が多いほど、溶解のために必要とされる時間は少ない。溶解緩衝液は、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ）を含んでもよい。溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、少なくとも約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、もしくは３０ｍＭ、またはそれより高くてもよい。溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、最大約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、もしくは３０ｍＭ、またはそれより高くてもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、約１０ｍＭである。溶解緩衝液は、還元試薬（例えば、ベータ−メルカプトエタノール、ＤＴＴ）を含んでもよい。溶解緩衝液中の還元試薬の濃度は、少なくとも約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、もしくは２０ｍＭまたはそれより高くてもよい。溶解緩衝液中の還元試薬の濃度は、最大約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、もしくは２０ｍＭまたはそれより高くてもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の還元試薬の濃度は、約５ｍＭである。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、約０．１ＭのトリスＨＣｌ（約ｐＨ７．５）、約０．５ＭのＬｉＣｌ、約１％のリチウムドデシルスルフェート、約１０ｍＭのＥＤＴＡ、および約５ｍＭのＤＴＴを含んでもよい。
溶解は、約４、１０、１５、２０、２５、または３０℃の温度で実施することができる。溶解は、約１、５、１０、１５、２０分、またはそれより長い時間実施することができる。溶解された細胞は、少なくとも約１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００個、またはそれより多い標的核酸分子を含んでもよい。溶解された細胞は、最大約１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００個、またはそれより多い標的核酸分子を含んでもよい。
標的核酸分子へのバーコードの結合
細胞の溶解およびそれからの核酸分子の放出の後に、核酸分子は、共局在化された固体支持体のバーコードとランダムに会合し得る。会合には、標的核酸分子の相補的部分へのバーコードの標的認識領域のハイブリダイゼーションが含まれ得る（例えば、バーコードのオリゴ（ｄＴ）は、標的のポリ（Ａ）テールと相互作用し得る）。ハイブリダイゼーションに使用されるアッセイ条件（例えば、緩衝液のｐＨ、イオン強度、温度など）は、特定の安定なハイブリッドの形成を促進するように選択することができる。一部の実施形態では、溶解された細胞から放出された核酸分子は、基質上の複数のプローブと会合し得る（例えば、基板上のプローブとハイブリダイズする）。プローブが、オリゴ（ｄＴ）を含む場合、ｍＲＮＡ分子は、プローブにハイブリダイズし、逆転写され得る。オリゴヌクレオチドのオリゴ（ｄＴ）部分は、ｃＤＮＡ分子の第１鎖合成のためのプライマーとして作用し得る。例えば、図２のブロック２１６に示すバーコード化の非限定的な例において、ｍＲＮＡ分子は、粒子上のバーコードにハイブリダイズし得る。例えば、一本鎖ヌクレオチド断片は、バーコードの標的結合領域にハイブリダイズし得る。
結合は、バーコードの標的認識領域と標的核酸分子の一部分とのライゲーションをさらに含み得る。例えば、標的結合領域は、制限部位オーバーハング（例えば、ＥｃｏＲＩ付着末端オーバーハング）への特異的ハイブリダイゼーションが可能となり得る核酸配列を含み得る。アッセイの手順は、制限酵素（例えば、ＥｃｏＲＩ）で標的核酸を処置して、制限部位オーバーハングを生成することをさらに含み得る。次いで、バーコードは、制限部位オーバーハングに相補的な配列を含む任意の核酸分子にライゲートされ得る。２つの断片を接続するために、リガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）を使用することができる。
例えば、図２のブロック２２０に示すバーコード化の非限定的な例では、複数の細胞（または複数の試料）に由来する標識標的（例えば、標的−バーコード分子）を、次に、例えば、チューブ中にプールすることができる。例えば、バーコードおよび／または標的−バーコード分子が結合した粒子を回収することによって、標識標的をプールすることができる。
結合した標的−バーコード分子の固体支持体ベースのコレクションの回収は、磁性粒子および外部から印加された磁界の使用によって実現され得る。標的−バーコード分子がプールされたら、すべてのさらなる処理を単一反応槽内で進行させることができる。さらなる処理としては、例えば、逆転写反応、増幅反応、切断反応、解離反応、および／または核酸伸長反応が挙げることができる。さらなる処理反応は、マイクロウェル内で、すなわち、複数の細胞から標識標的核酸分子を最初にプールすることなく、実施することができる。
核酸伸長反応（例えば、逆転写）
本開示は、核酸伸長反応、例えば、逆転写（例えば、図２のブロック２２４）を使用して、標的−バーコードコンジュゲートを作製するための方法を提供する。標的−バーコードコンジュゲートは、バーコードと標的核酸のすべてまたは一部分の相補配列（すなわち、バーコード化されたｃＤＮＡ分子、例えば、確率的にバーコード化されたｃＤＮＡ分子）とを含み得る。会合したＲＮＡ分子の逆転写は、逆転写酵素と一緒に逆転写プライマーを添加することによって起こり得る。逆転写プライマーは、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー、または標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。オリゴ（ｄＴ）プライマーは、１２〜１８ヌクレオチド長であってもよく、または約１２〜１８ヌクレオチド長であってもよく、哺乳動物ｍＲＮＡの３’末端の内在性ポリ（Ａ）テールに結合する。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーは、種々の相補部位でｍＲＮＡに結合し得る。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、目的のｍＲＮＡを選択的にプライミングする。
一部の実施形態では、標識ＲＮＡ分子の逆転写は、逆転写プライマーの添加によって起こり得る。一部の実施形態では、逆転写プライマーは、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー、または標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーである。一般的に、オリゴ（ｄＴ）プライマーは、１２〜１８ヌクレオチド長であり、哺乳動物ｍＲＮＡの３’末端の内在性ポリ（Ａ）＋テールに結合する。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーは、種々の相補部位でｍＲＮＡに結合し得る。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、目的のｍＲＮＡを選択的にプライミングする。
逆転写は、繰り返し起こり、複数の標識ｃＤＮＡ分子を生じ得る。本明細書に開示される方法は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回の逆転写反応を行うステップを含み得る。本方法は、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００回の逆転写反応を行うステップを含み得る。
増幅
標識標的核酸分子の複数のコピーを作製するために、１または複数回の核酸増幅反応（例えば、図２のブロック２２８）を実施することができる。増幅は、複数の標的核酸配列が同時に増幅される、多重方式で実施することができる。増幅反応を使用して、核酸分子にシーケンシングアダプターを付加することができる。増幅反応は、存在する場合、試料標識のうちの少なくとも一部分を増幅することを含み得る。増幅反応は、細胞標識および／またはバーコード配列（例えば、分子標識）のうちの少なくとも一部分を増幅することを含み得る。増幅反応は、試料タグ、細胞標識、空間標識、バーコード（例えば、分子標識）、標的核酸、またはこれらの組合せのうちの少なくとも一部分を増幅することを含み得る。増幅反応は、複数の核酸の０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、１００％、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲もしくは数を増幅することを含み得る。本方法は、試料標識、細胞標識、空間標識、および／またはバーコード配列（例えば、分子標識）を含む標的−バーコード分子のｃＤＮＡコピーを１つまたは複数生成するために、１または複数回のｃＤＮＡ合成反応を行うステップをさらに含み得る。
一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、増幅を実施することができる。本明細書で使用する場合、ＰＣＲは、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長により特定のＤＮＡ配列をｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅するための反応を指し得る。本明細書で使用する場合、ＰＣＲは、以下に限定されないが、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、およびアセンブリＰＣＲを含む、反応の派生形を包含し得る。
標識核酸の増幅は、非ＰＣＲベースの方法を含み得る。非ＰＣＲベースの方法の例としては、以下に限定されないが、多重置換増幅（ＭＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ローリングサークル増幅、またはサークル−サークル増幅が挙げられる。他の非ＰＣＲベースの増幅方法としては、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的を増幅するためのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ駆動ＲＮＡ転写増幅またはＲＮＡ指向ＤＮＡ合成および転写の多重サイクル、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ならびにＱβレプリカーゼ（Ｑβ）法、パリンドロームプローブの使用、鎖置換増幅、制限エンドヌクレアーゼを使用するオリゴヌクレオチド駆動増幅、プライマーが核酸配列にハイブリダイズされかつ得られた二本鎖が伸長反応および増幅の前に切断される増幅方法、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く核酸ポリメラーゼを使用する鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、ならびに分岐伸長増幅（ＲＡＭ）が挙げられる。一部の実施形態では、増幅は、環化転写物を生成しない。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、標識核酸（例えば、標識ＲＮＡ、標識ＤＮＡ、標識ｃＤＮＡ）上でポリメラーゼ連鎖反応を行い、標識アンプリコン（例えば、確率標識アンプリコン）を生成するステップをさらに含む。標識アンプリコンは、二本鎖分子であってもよい。二本鎖分子は、二本鎖ＲＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、またはＤＮＡ分子にハイブリダイズされたＲＮＡ分子を含み得る。二本鎖分子の一方または両方の鎖は、試料標識、空間標識、細胞標識、および／またはバーコード配列（例えば、分子標識）を含み得る。標識アンプリコンは、一本鎖分子であってもよい。一本鎖分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せを含み得る。本開示の核酸は、合成核酸または改変核酸を含み得る。
増幅は、１つまたは複数の非天然ヌクレオチドの使用を含み得る。非天然ヌクレオチドは、光不安定性またはトリガー性のヌクレオチドを含み得る。非天然ヌクレオチドの例としては、以下に限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸およびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）を挙げることができる。非天然ヌクレオチドを増幅反応の１または複数回のサイクルに添加することができる。非天然ヌクレオチドの添加を使用して、増幅反応の特定のサイクルまたは時点として産物を同定することができる。
１または複数回の増幅反応を行うことは、１つまたは複数のプライマーの使用を含み得る。１つまたは複数のプライマーは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５またはそれより多いヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５またはそれより多いヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、１２未満〜１５ヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識標的（例えば、確率標識標的）のうちの少なくとも一部分にアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識標的の３’末端または５’末端にアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識標的の内部領域にアニールし得る。内部領域は、複数の標識標的の３’末端から少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００または１０００ヌクレオチドであってもよい。１つまたは複数のプライマーは、プライマーの一定パネルを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数のカスタムプライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の対照プライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の遺伝子特異的プライマーを含み得る。
１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含み得る。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニールし得る。１つまたは複数のカスタムプライマーは、第１の試料標識、第２の試料標識、空間標識、細胞標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、標的、またはこれらの任意の組合せにアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーおよびカスタムプライマーを含み得る。カスタムプライマーは、１つまたは複数の標的を増幅するように設計され得る。標的は、１つまたは複数の試料中の全核酸のサブセットを含み得る。標的は、１つまたは複数の試料中の全標識標的のサブセットを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも９６個またはそれより多いカスタムプライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも９６０個またはそれより多いカスタムプライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも９６００個またはそれより多いカスタムプライマーを含み得る。１つまたは複数のカスタムプライマーは、２つ以上の異なる標識核酸にアニールし得る。２つ以上の異なる標識核酸は、１つまたは複数の遺伝子に対応し得る。
任意の増幅スキームを本開示の方法において使用することができる。例えば、一スキームでは、１回目のＰＣＲによって、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプライマー１の配列に対するプライマーを使用して、粒子（例えば、ビーズ）に結合した分子を増幅することができる。２回目のＰＣＲでは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプライマー２の配列に隣接するネステッド遺伝子特異的プライマー、およびユニバーサルＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプライマー１の配列に対するプライマーを使用して、第１のＰＣＲ産物を増幅することができる。３回目のＰＣＲでは、Ｐ５およびＰ７ならびに試料インデックスが付加されて、ＰＣＲ産物をＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリーに入れる。１５０ｂｐ×２シーケンシングを使用するシーケンシングは、リード１上の細胞標識およびバーコード配列（例えば、分子標識）、リード２上の遺伝子、ならびにインデックス１リード上の試料インデックスを明らかにし得る。
一部の実施形態では、化学的切断を使用して基質から核酸を除去することができる。例えば、核酸中に存在する化学基または修飾塩基を使用して、固体支持体からのその除去を促進することができる。例えば、酵素を使用して、核酸を基質から除去することができる。例えば、核酸は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって、基質から除去することができる。例えば、ｄＵＴＰまたはｄｄＵＴＰを含有する核酸のウラシル−ｄ−グリコシラーゼ（ＵＤＧ）による処理を使用して、核酸を基質から除去することができる。例えば、ヌクレオチド切除を実施する酵素、例えば、塩基除去修復酵素、例えば、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼを使用して、核酸を基質から除去することができる。一部の実施形態では、光切断可能な基と光とを使用して、核酸を基質から除去することができる。一部の実施形態では、切断可能なリンカーを、核酸を基質から除去するために使用することができる。例えば、切断可能なリンカーは、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／ニュートラアビジン、Ｉｇ−プロテインＡ、光不安定性リンカー、酸もしくは塩基不安定性リンカー基、またはアプタマーのうちの少なくとも１つを含み得る。
プローブが遺伝子特異的である場合、分子は、プローブにハイブリダイズし、逆転写および／または増幅され得る。一部の実施形態では、核酸が合成された（例えば、逆転写された）後に、増幅され得る。増幅は、複数の標的核酸配列が同時に増幅される多重方式で実施することができる。増幅によって、核酸にシーケンシングアダプターを付加し得る。
一部の実施形態では、増幅は、例えば、ブリッジ増幅を用いて基質上で実施することができる。基質上でオリゴ（ｄＴ）プローブを使用するブリッジ増幅に適合する末端を生成するために、ｃＤＮＡにホモポリマーテールを付加することができる。ブリッジ増幅では、テンプレート核酸の３’末端に相補的なプライマーは、固体粒子に共有結合される各対の第１のプライマーであってもよい。テンプレート核酸を含有する試料が粒子に接触しており、かつ１回の熱サイクルが実施される場合、テンプレート分子は第１のプライマーにアニールされ、かつ第１のプライマーはヌクレオチドの添加によって順方向に伸長して、テンプレート分子とテンプレートに相補的な新たに形成されたＤＮＡ鎖とからなる二本鎖分子を形成し得る。次のサイクルの加熱ステップでは、二本鎖分子は変性されて、粒子からテンプレート分子を放出し、第１のプライマーを通じて粒子に結合した相補的ＤＮＡ鎖を残存させ得る。続くアニーリングおよび伸長ステップのアニーリング段階では、相補鎖は、第１のプライマーから除去された位置の相補鎖のセグメントに相補的な第２のプライマーにハイブリダイズし得る。このハイブリダイゼーションにより、相補鎖は、共有結合により第１のプライマーにかつハイブリダイゼーションにより第２のプライマーに固定化されたブリッジを第１および第２のプライマー間に形成し得る。伸長段階では、第２のプライマーは、同一の反応混合物中にヌクレオチドを添加することにより逆方向に伸長し、それにより、ブリッジを二本鎖ブリッジに変換し得る。次いで、次のサイクルが開始し、二本鎖ブリッジは変性されて、それぞれ第１および第２のプライマーを通じて粒子表面に結合した一方の末端と、それぞれ未結合の他方の末端とを有する２つの一本鎖核酸分子を得ることができる。この第２のサイクルのアニーリングおよび伸長ステップでは、各鎖は同一の粒子上のこれまで未使用であったさらなる相補的プライマーにハイブリダイズして、新たな一本鎖ブリッジを形成し得る。この時点でハイブリダイズされる２つのこれまで未使用であったプライマーは、伸長して２つの新たなブリッジを二本鎖ブリッジに変換する。
増幅反応は、複数の核酸の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％を増幅することを含み得る。
標識核酸の増幅は、ＰＣＲベースの方法または非ＰＣＲベースの方法を含み得る。標識核酸の増幅は、標識核酸の指数関数的増幅を含み得る。標識核酸の増幅は、標識核酸の線形増幅を含み得る。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施することができる。ＰＣＲは、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長による特定のＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅のための反応を指し得る。ＰＣＲは、以下に限定されないが、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、サプレッションＰＣＲ、セミサプレッシブＰＣＲ、およびアセンブリＰＣＲを含む、反応の派生形を包含し得る。
一部の実施形態では、標識核酸の増幅は、非ＰＣＲベースの方法を含む。非ＰＣＲベースの方法の例としては、以下に限定されないが、多重置換増幅（ＭＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ローリングサークル増幅、またはサークル−サークル増幅が挙げられる。他の非ＰＣＲベースの増幅方法としては、ＤＮＡもしくはＲＮＡ標的を増幅するためのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ駆動ＲＮＡ転写増幅もしくはＲＮＡ指向ＤＮＡ合成および転写の多重サイクル、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、にＱβレプリカーゼ（Ｑβ）法、パリンドロームプローブの使用、鎖置換増幅、制限エンドヌクレアーゼを使用するオリゴヌクレオチド駆動増幅、プライマーが核酸配列にハイブリダイズされかつ得られた二本鎖が伸長反応および増幅の前に切断される増幅方法、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く核酸ポリメラーゼを使用する鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、ならびに／または分岐伸長増幅（ＲＡＭ）が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、増幅アンプリコン（例えば、標的）上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行うステップをさらに含む。アンプリコンは二本鎖分子であってもよい。二本鎖分子は、二本鎖ＲＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、またはＤＮＡ分子にハイブリダイズされたＲＮＡ分子を含み得る。二本鎖分子の一方または両方の鎖は、試料タグまたは分子識別子標識を含み得る。代替的に、アンプリコンは、一本鎖分子であってもよい。一本鎖分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せを含み得る。本発明の核酸は、合成核酸または改変核酸を含み得る。
一部の実施形態では、本方法は、多数のアンプリコンを生成するために標識核酸を繰返し増幅するステップを含む。本明細書に開示される方法は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回の増幅反応を行うステップを含み得る。代替的に、本方法は、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００回の増幅反応を行うステップを含む。
増幅は、複数の核酸を含む１つまたは複数の試料に１つまたは複数の対照核酸を添加することをさらに含み得る。増幅は、複数の核酸に１つまたは複数の対照核酸を添加することをさらに含み得る。対照核酸は、対照標識を含み得る。
増幅は、１つまたは複数の非天然ヌクレオチドの使用を含み得る。非天然ヌクレオチドは、光不安定性および／またはトリガー性ヌクレオチドを含み得る。非天然ヌクレオチドの例としては、以下に限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸およびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が挙げられる。非天然ヌクレオチドを増幅反応の１または複数回のサイクルに添加することができる。非天然ヌクレオチドの添加を使用して、増幅反応の特定のサイクルまたは時点として産物を同定することができる。
増幅反応を１または複数回行うことは、１つまたは複数のプライマーの使用を含み得る。１つまたは複数のプライマーは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、少なくとも約７〜９ヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、１２未満〜１５ヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識核酸のうちの少なくとも一部分にアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識核酸の３’末端および／または５’末端にアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識核酸の内部領域にアニールし得る。内部領域は、複数の標識核酸の３’末端から少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または１０００ヌクレオチドであってもよい。１つまたは複数のプライマーは、プライマーの一定パネルを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数のカスタムプライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の対照プライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数のハウスキーピング遺伝子プライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含み得る。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニールし得る。１つまたは複数のカスタムプライマーは、第１の試料タグ、第２の試料タグ、分子識別子標識、核酸またはその産物にアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーおよびカスタムプライマーを含み得る。カスタムプライマーは、１つまたは複数の標的核酸を増幅するように設計され得る。標的核酸は、１つまたは複数の試料中の全核酸のサブセットを含み得る。一部の実施形態では、プライマーは、本開示のアレイに結合したプローブである。
一部の実施形態では、試料中の複数の標的をバーコード化するステップ（例えば、確率的にバーコード化するステップ）は、バーコード化された断片のインデックス化されたライブラリーを生成するステップをさらに含む。異なるバーコードのバーコード配列（例えば、異なる確率的バーコードの分子標識）は、互いに異なっていてもよい。バーコード化された標的（例えば、確率的にバーコード化された標的）のインデックス化されたライブラリーを生成するステップは、試料中の複数の標的から複数のインデックス化されたポリヌクレオチドを生成するステップを含む。例えば、第１のインデックス化された標的と第２のインデックス化された標的とを含むバーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーについて、第１のインデックス化されたポリヌクレオチドの標識領域は、第２のインデックス化されたポリヌクレオチドの標識領域と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲で異なっていてもよい。一部の実施形態では、バーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーを生成するステップは、複数の標的、例えば、ｍＲＮＡ分子を、ポリ（Ｔ）領域および標識領域を含む複数のオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、各々がｃＤＮＡ領域および標識領域を含む一本鎖標識ｃＤＮＡ分子を生成するために、逆転写酵素を使用して第１鎖合成を行うステップとを含み、ここで、複数の標的は、異なる配列のうちの少なくとも２つのｍＲＮＡ分子を含み、複数のオリゴヌクレオチドは、異なる配列のうちの少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。バーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーを生成するステップは、一本鎖標識ｃＤＮＡ分子を増幅して、二本鎖標識ｃＤＮＡ分子を生成するステップと、二本鎖標識ｃＤＮＡ分子上でネステッドＰＣＲを行って、標識アンプリコンを生成するステップとをさらに含み得る。一部の実施形態では、本方法は、アダプター−標識アンプリコンを生成するステップを含み得る。
確率的にバーコード化するステップにより、個々の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子を標識するための核酸バーコードまたはタグが使用され得る。一部の実施形態では、これは、ＤＮＡバーコードまたはタグがｍＲＮＡから生成される際に、ｃＤＮＡ分子にこれらを付加するステップを含む。ネステッドＰＣＲは、ＰＣＲ増幅バイアスの最小化を実施することができる。例えば、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用するシーケンシングのためにアダプターを付加することができる。例えば、図２のブロック２３２の標的の１つまたは複数のコピーの細胞標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、およびヌクレオチド断片の配列を決定するために、シーケンシング結果を使用することができる。
図３は、バーコード化された標的（例えば、確率的にバーコード化された標的）、例えばｍＲＮＡのインデックス化されたライブラリーを生成する非限定的な例示的プロセスを示す略図である。ステップ１に示されるように、逆転写プロセスによって、特有のバーコード配列（例えば、分子標識）、細胞標識、およびユニバーサルＰＣＲ部位を含む各ｍＲＮＡ分子がコードされ得る。例えば、ＲＮＡ分子３０２のポリ（Ａ）テール領域３０８への、バーコード（例えば、確率バーコード）３１０のセットのハイブリダイゼーション（例えば、確率論的ハイブリダイゼーション）によって、ＲＮＡ分子３０２を逆転写して、ｃＤＮＡ領域３０６を含む標識ｃＤＮＡ分子３０４を生成することができる。バーコード３１０のそれぞれは、標的結合領域、例えば、ポリ（ｄＴ）領域３１２、バーコード配列または分子標識３１４、およびユニバーサルＰＣＲ領域３１６を含み得る。
一部の実施形態では、細胞標識は、３〜２０ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、バーコード配列（例えば、分子標識）は、３〜２０ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、複数の確率的バーコードのそれぞれは、ユニバーサル標識および細胞標識のうちの１つまたは複数をさらに含み、ユニバーサル標識は、固体支持体上の複数の確率的バーコードについて同じであり、細胞標識は、固体支持体上の複数の確率的バーコードについて同じである。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、３〜２０ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、細胞標識は、３〜２０ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、標識領域３１４は、バーコード配列または分子標識３１８および細胞標識３２０を含み得る。一部の実施形態では、標識領域３１４は、ユニバーサル標識、次元標識、および細胞標識のうちの１つまたは複数を含み得る。バーコード配列または分子標識３１８は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。細胞標識３２０は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサル標識は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサル標識は、固体支持体上の複数の確率的バーコードについて同じであってもよく、細胞標識は、固体支持体上の複数の確率的バーコードについて同じであってもよい。次元標識は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。
一部の実施形態では、標識領域３１４は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、もしくはこれらの値のいずれかの間の数もしくは範囲の異なる標識、例えば、バーコード配列もしくは分子標識３１８および細胞標識３２０を含むか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なる標識、例えば、バーコード配列もしくは分子標識３１８および細胞標識３２０を含むか、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なる標識、例えば、バーコード配列もしくは分子標識３１８および細胞標識３２０を含むか、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なる標識、例えば、バーコード配列もしくは分子標識３１８および細胞標識３２０を含み得る。各標識は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。バーコードまたは確率的バーコード３１０のセットは、１０、２０、４０、５０、７０、８０、９０、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、１０20、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のバーコードもしくは確率的バーコード３１０を含有するか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のバーコードもしくは確率的バーコード３１０を含有するか、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のバーコードもしくは確率的バーコード３１０を含有するか、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のバーコードもしくは確率的バーコード３１０であり得る。また、バーコードまたは確率的バーコード３１０のセットは、例えば、それぞれ、特有の標識領域３１４を含有し得る。過剰なバーコードまたは確率的バーコード３１０を除去するために、標識ｃＤＮＡ分子３０４は精製されてもよい。精製には、Ａｍｐｕｒｅビーズ精製が含まれてもよい。
ステップ２に示すように、ステップ１の逆転写プロセスからの産物は、１チューブ中にプールされ、第１のＰＣＲプライマープールおよび第１のユニバーサルＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ増幅され得る。プールすることは、特有の標識領域３１４によって可能である。特に、標識ｃＤＮＡ分子３０４を増幅して、ネステッドＰＣＲ標識アンプリコン３２２を生成することができる。増幅は、多重ＰＣＲ増幅を含み得る。増幅は、単一反応量で９６多重プライマーを用いる多重ＰＣＲ増幅を含み得る。一部の実施形態では、多重ＰＣＲ増幅は、単一反応量で、１０、２０、４０、５０、７０、８０、９０、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、１０20、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲の多重プライマーを利用するか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の多重プライマーを利用するか、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の多重プライマーを利用するか、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の多重プライマーを利用することができる。増幅は、特定の遺伝子を標的とするカスタムプライマー３２６Ａ〜Ｃの第１のＰＣＲプライマープール３２４と、ユニバーサルプライマー３２８とを含み得る。カスタムプライマー３２６は、標識ｃＤＮＡ分子３０４のｃＤＮＡ部分３０６’内の領域とハイブリダイズし得る。ユニバーサルプライマー３２８は、標識ｃＤＮＡ分子３０４のユニバーサルＰＣＲ領域３１６とハイブリダイズし得る。
図３のステップ３に示すように、ステップ２のＰＣＲ増幅からの産物は、ネステッドＰＣＲプライマープールおよび第２のユニバーサルＰＣＲプライマーを用いて増幅され得る。ネステッドＰＣＲは、ＰＣＲ増幅バイアスを最小限に抑えることができる。例えば、ネステッドＰＣＲ標識アンプリコン３２２は、ネステッドＰＣＲによってさらに増幅することができる。ネステッドＰＣＲは、単一反応量でネステッドＰＣＲプライマー３３２ａ〜ｃのネステッドＰＣＲプライマープール３３０と、第２のユニバーサルＰＣＲプライマー３２８’とを含む多重ＰＣＲを含み得る。ネステッドＰＣＲプライマープール３２８は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有するか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有するか、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有するか、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有し得る。ネステッドＰＣＲプライマー３３２は、アダプター３３４を含有し、標識アンプリコン３２２のｃＤＮＡ部分３０６’’内の領域とハイブリダイズし得る。ユニバーサルプライマー３２８’は、アダプター３３６を含有し、標識アンプリコン３２２のユニバーサルＰＣＲ領域３１６とハイブリダイズし得る。よって、ステップ３は、アダプター標識アンプリコン３３８を生成する。一部の実施形態では、ネステッドＰＣＲプライマー３３２と第２のユニバーサルＰＣＲプライマー３２８’は、アダプター３３４および３３６を含有しなくてもよい。代わりに、アダプター３３４および３３６は、ネステッドＰＣＲの産物とライゲートして、アダプター標識アンプリコン３３８を生成することができる。
ステップ４に示すように、ステップ３からのＰＣＲ産物は、ライブラリー増幅プライマーを使用するシーケンシングのためにＰＣＲ増幅され得る。特に、アダプター３３４および３３６を使用して、アダプター標識アンプリコン３３８に関する１または複数回の追加のアッセイを行うことができる。アダプター３３４および３３６は、プライマー３４０および３４２とハイブリダイズされ得る。１つまたは複数のプライマー３４０および３４２は、ＰＣＲ増幅プライマーであってもよい。１つまたは複数のプライマー３４０および３４２は、シーケンシングプライマーであってもよい。アダプター標識アンプリコン３３８のさらなる増幅のために、１つまたは複数のアダプター３３４および３３６を使用することができる。アダプター標識アンプリコン３３８のシーケンシングのために、１つまたは複数のアダプター３３４および３３６を使用することができる。プライマー３４２は、プレートインデックス３４４を含有することができ、これによって、バーコードまたは確率的バーコード３１０の同じセットを使用して生成されたアンプリコンを、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用する１回のシーケンシング反応でシーケンシングすることができる。
核をバーコード化する方法および組成物
本明細書の開示は、単一の核捕捉とバーコード化の両方を（例えば、単一のステップで）実施するための方法、組成物、およびキットを含む。単一細胞懸濁液を実施または調製する必要性を最小限にする（例えば、排除する）一方で、単核のシーケンシングを単一の細胞トランスクリプトーム分析（または他の単一細胞オミクスまたはマルチオミクス分析、例えば、単一細胞のタンパク質発現プロファイルを決定するためのプロテオミクス分析）のために使用することができる。単一細胞懸濁液を調製することは、例えば、特定の試料調製物、例えば、凍結組織に関して技術的に困難である場合がある。この方法は、核の単離ステップを含む。例えば、核エンベロープ特異的抗体、例えば、抗ＬＡＭＩＮを使用して、他の細胞内成分から核を分離することができる。
一部の実施形態では、これらの抗体は、エピトープ（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはフルオレセインを含む強力なエピトープ）もしくはその特定の抗体を表す分子バーコードおよび／またはその両方と会合し得る（例えば、コンジュゲートし得る）。会合したエピトープ（例えば、コンジュゲートしたエピトープ）によって、超遠心分離ステップを使用せずに、核の迅速な単離ステップが可能となり得る。例えば、複数の試料を一緒にプールして、単回の下流の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ライブラリー調製手順を実施する場合に、会合したバーコード（例えば、コンジュゲートしたバーコード）を使用して、試料のインデックス化を実施することができる。一部の実施形態では、試料のインデックス化は、単核に関する試料のインデックス化を含み得る。一部の実施形態では、試料のインデックス化は、単核および単一細胞に関する試料のインデックス化を含み得る。
一部の実施形態では、抗体バーコードは、ヌクレオチドバーコードであってもよく、またはヌクレオチドバーコードを含んでもよい。例えば、ヌクレオチドバーコードは、少なくとも１０塩基対の長さであってもよい。ヌクレオチドバーコードは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または逆転写もしくは他のＤＮＡ重合ステップに適合する他の合成ヌクレオチドであってもよく、またはそれらを含んでもよい。ヌクレオチドバーコードは、内在性細胞内ｍＲＮＡを模倣するためおよび下流のライブラリー調製に適合するバーコードを作製するために、３’ポリ（ｄＡ）テールを含んでもよい場合がある。次いで、核がどの試料に由来するかを決定するために、バーコード配列情報は、それぞれの核と一緒にシーケンシングした後、脱多重化され得る。バーコード化された抗体およびこれらの使用、例えば、バーコード化された抗体を使用する細胞の試料インデックス化は、それぞれの内容が参照によりその全体として組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／００８８１１２号および米国特許出願第１５／９３７，７１３号に記載されている。
核をバーコード化する方法
図４Ａ〜４Ｂは、核のバーコード化のワークフロー（例えば、確率的バーコード化）の非限定的な例示的略図を示す。ホモジナイザー（例えば、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー）、界面活性剤、または酵素的方法を使用して、細胞溶解を実施することができる。例えば、エピトープ（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、およびフルオレセインなどの強力なエピトープ）および任意で、核を標識するためのバーコードオリゴヌクレオチドにコンジュゲートした核エンベロープタンパク質（例えば、ＬＡＭＩＮ）に特異的な抗体によって核を捕捉することができる。エピトープに対する二次抗体を使用して、精製のために核をプルダウンさせ（例えば、細胞質断片から引き離し）、その後、単一細胞分析アッセイを使用してＲＮＡ／ＤＮＡを捕捉することができる（例えば、Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ））。
本明細書の開示は、複数の細胞（例えば、図４Ａ〜４Ｂに示される細胞４０４）において、標的の数を決定するための方法４００の実施形態を含む。方法４００は、細胞溶解、核の分離および単離、核溶解、および単一細胞分析（例えば、単一細胞のトランスクリプトームまたはプロテオーム分析）のためのバーコード化を含み得る。
一部の実施形態では、方法４００は、核単離組成物を使用して、複数の細胞の複数の核を単離するステップを含む。単離された複数の核は、図４Ａ〜４Ｂに示される核エンベロープ４１２を含む核４０８を含み得る。単一細胞方法（例えば、Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ））を使用して、単離された核の含量（例えば、ｍＲＮＡ含量またはタンパク質含量）、例えば、核４０８のｍＲＮＡ分子４１６を分析することができる。核単離組成物は、核結合試薬を含み得る。核結合試薬は、核の１つまたは複数の成分（例えば、図４Ａ〜４Ｂに示される細胞４０４の細胞核４０８の核エンベロープ４１２上の核エンベロープタンパク質４２０）に特異的に結合可能であり得る。
単離された核の数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、単離された核の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、単離された核の数は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11もしくは１０12であってもよい。
核単離組成物中の核結合試薬の数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、核単離組成物中の核結合試薬の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、核単離組成物中の核結合試薬の数は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００であってもよい。
核結合試薬は、核の１つまたは複数の成分に結合し得る。一部の実施形態では、核の１つの成分に結合する核結合試薬の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、核の１つの成分に結合する核結合試薬の数は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００であってもよい。
核単離組成物中の核結合試薬が結合することができる核の成分の数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、核単離組成物中の核結合試薬が結合することができる核の成分の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、核単離組成物中の核結合試薬が結合することができる核の成分の数は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００であってもよい。
方法４００は、複数のバーコードを使用して、複数の核において複数の標的（例えば、図４Ａ〜４Ｂに示されるｍＲＮＡ分子４１６）をバーコード化して、複数のバーコード化された標的を生成するステップを含み得る。複数のバーコードのそれぞれは、分子標識配列および標的結合領域を含んでもよく、複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードの分子標識配列は、異なる配列を含んでもよい。方法４００は、複数のバーコード化された標的のシーケンシングデータを得るステップを含み得る。方法４００は、シーケンシングデータ内の複数のバーコードの分子標識配列を使用して、複数の細胞における複数の標的のそれぞれの数を概算するステップを含み得る。図４Ａ〜４Ｂでは、細胞４０４は、ミトコンドリアタンパク質４２８を有する１つまたは複数のミトコンドリア４２４を含み得る。
一部の実施形態では、複数の核を単離するステップは、複数の細胞の複数の核を、核単離組成物（例えば、図４Ａ〜４Ｂに示される核エンベロープタンパク質特異的抗体４３２ａ〜４３２ｃ）と接触させて、核結合試薬に結合した核を生成するステップを含む。複数の核を単離するステップは、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬（例えば、図４Ａ〜４Ｂに示されるエピトープ結合試薬４４４）を使用して、核結合試薬に結合した核を単離するステップを含み得る。
核の成分および核結合試薬
一部の実施形態では、核結合試薬は、第１のエピトープ（例えば、図４Ａ〜４Ｂに示されるエピトープ４３６）に会合し、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、第１のエピトープ結合試薬を含む。第１のエピトープは、ビオチン、ハプテン、またはこれらの組合せを含み得る。ハプテンは、ジゴキシゲニン、２，４−ジニトロフェノール、フルオレセイン、またはこれらの組合せを含み得る。核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、抗ハプテン抗体を含み得る。核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはこれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、第１のエピトープおよび／または第１のエピトープ結合試薬は、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第一級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、またはこれらのいずれかの組合せなどの親和性部分であってもよい。第１のエピトープおよび第１のエピトープ結合試薬は、結合対、例えば、ビオチン／ストレプトアビジンのメンバーであってもよい。
核結合試薬に会合した異なる第１のエピトープの数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、核結合試薬に会合した異なる第１のエピトープの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、核結合試薬に会合した異なる第１のエピトープの数は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００であってもよい。
核結合試薬に会合した第１のエピトープの分子の数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、核結合試薬に会合した第１のエピトープの分子の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、核結合試薬に会合した第１のエピトープの分子の数は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００であってもよい。
一部の実施形態では、核結合試薬は、核の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる一次抗体（例えば、図４Ａ〜４Ｂに示される核エンベロープタンパク質特異的抗体４３２ａ〜４３２ｃ）を含み、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体を含む。
一部の実施形態では、核結合試薬は、核エンベロープ表面成分結合試薬（例えば、核エンベロープタンパク質特異的抗体）を含み、核結合試薬は、１つまたは複数の核エンベロープ表面成分に特異的に結合することができる場合がある。
一部の実施形態では、核結合試薬は、炭水化物結合試薬を含む。炭水化物結合試薬は、炭水化物結合タンパク質を含み得る。炭水化物結合タンパク質は、レクチンを含み得る。レクチンは、マンノース結合レクチン、ガラクトース結合レクチン、Ｎ−アセチルガラクトサミン結合レクチン、Ｎ−アセチルグルコサミン結合レクチン、Ｎ−アセチルノイラミン酸結合レクチン、フコース結合レクチン、またはこれらの組合せを含み得る。レクチンは、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、レンチルレクチン（ＬＣＨ）、スノードロップレクチン（ＧＮＡ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）凝集素（ＲＣＡ）、ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）、ジャカリン（ＡＩＬ）、ヘアリーベッチレクチン（ＶＶＬ）、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）、エルダーベリーレクチン（ＳＮＡ）、イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）白血球凝集素（ＭＡＬ）、イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）赤血球凝集素（ＭＡＨ）、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）凝集素（ＵＥＡ）、ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ）レクチン（ＡＡＬ）、またはこれらの組合せを含み得る。レクチンは、凝集素であってもよく、またはそれを含んでもよい。凝集素は、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）であってもよく、またはそれを含んでもよい。炭水化物結合タンパク質は、動物、細菌、ウイルス、真菌、またはこれらの組合せからのものであってもよく、またはそれらに由来してもよい。炭水化物結合タンパク質は、植物からのものであってもよく、またはそれに由来してもよい。植物は、タチナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）、マツユキソウ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、パラミツ（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、ナヨクサフジ（Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、セイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ）、イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）、ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ）、またはこれらの組合せであってもよい。
一部の実施形態では、核の１つまたは複数の成分は、糖、オリゴ糖、多糖、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含む。核の１つまたは複数の成分は、単糖、二糖、ポリオール、マルトオリゴ糖、非マルトオリゴ糖、デンプン、非デンプン多糖、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含み得る。核の１つまたは複数の成分は、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、マルトデキストリン、ラフィノース、スタキオース、フラクトオリゴ糖（ｆｒｕｃｔｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄ）、アミロース、アミロペクチン、加工デンプン、グリコーゲン、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ハイドロコロイド、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含み得る。核の１つまたは複数の成分は、α−Ｄ−マンノシル残基、α−Ｄ−グルコシル残基、高α−マンノース型の分岐α−マンノシド構造、ハイブリッド型および二分岐複合型Ｎ−グリカンの分岐α−マンノシド構造、二分岐および三分岐複合型Ｎ−グリカンのフコシル化コア領域、α １−３およびα １−６連結高マンノース構造、Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃβ１−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、（Ｓｉａ）Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ（シアル酸）、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ（ＮＡｃ）−Ｒ、Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｇｃα２，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）、Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｇｃα２，３Ｇａｌβ１，３（Ｎｅｕ５Ａｃα２，６）ＧａｌＮａｃ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３／４）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｒ２−ＧｌｃＮＡｃβ１−４（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ１、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含み得る。核の１つまたは複数の成分は、糖タンパク質、糖脂質、またはこれらの組合せを含み得る。
一部の実施形態では、核の１つまたは複数の成分は、ラミン、エメリン、ネスプリン、ヌリム、ＵＮＣ−８３、クラール、ＺＹＧ−１２、Ｋｍｓ１ｐ、ＵＮＣ−８４、クラロイド、ＳＵＮ−１、Ｓａｄ１ｐ、ＬＢＲ、ＭＡＮ１、ＬＡＰ１、ＬＡＰ２、ＬＩＮＫ、核膜孔複合体、これらの一部分、またはこれらの組合せを含む。核の１つまたは複数の成分の数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、核の１つまたは複数の成分の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、核の１つまたは複数の成分の数は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００であってもよい。
核単離粒子
一部の実施形態では、核結合試薬は、核単離粒子に会合している。核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、核単離粒子（図４Ａ〜４Ｂに示される表面を有する粒子４４８）に会合し得る。核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、核単離粒子上に固定化、または部分的に固定化されてもよい。例えば、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬（例えば、エピトープ結合試薬４４４）は、可逆的に、非可逆的に、共有結合的に、非共有結合的に、またはこれらの組合せで、核単離粒子に会合されていてもよい。別の例として、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、核単離粒子に埋め込まれているか、部分的に埋め込まれているか、埋め込まれていないか、封入されているか、部分的に封入されているか、封入されていないか、またはこれらの組合せであってもよい。一部の実施形態では、第１のエピトープ結合試薬は、切断可能なリンカーを通じて核単離粒子に会合している（例えば、固定化されている、部分的に固定化されている、封入されている、部分的に封入されている）。切断可能なリンカーは、第１のエピトープ結合試薬を核単離粒子に作動可能に連結させ得る。切断可能なリンカーは、化学的に切断可能な連結、光切断可能な連結、酸不安定性リンカー、熱感受性連結、酵素的に切断可能な連結、またはこれらの組合せを含み得る。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ヌル粒子が提供される。一部の実施形態では、ヌル粒子は、複数のバーコード、磁気特性、および／または核結合試薬に特異的に結合することができる試薬（例えば、第１のエピトープ結合試薬）を含まない。ヌル粒子は、複数のバーコード、磁気特性、および／または第１のエピトープ結合試薬の非存在以外のすべての態様において、核単離粒子に似ていてもよい。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、遊離した第１のエピトープが提供される。遊離した第１のエピトープは、第１のエピトープのすべてまたは一部分を含み得る。一部の実施形態では、遊離した第１のエピトープは、未結合の第１のエピトープ結合試薬に結合し得る。
一部の実施形態では、核単離粒子は、核単離ビーズを含む。核単離粒子は、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの組合せを含み得る。核単離粒子は、は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含み得る。核単離粒子は、崩壊可能であってもよい。核単離粒子は、核単離崩壊可能ハイドロゲル粒子を含み得る。
一部の実施形態では、核結合試薬に結合した核を単離するステップは、磁気除去、遠心分離、またはこれらの任意の組合せによって核単離粒子を単離するステップを含み得る。一部の実施形態では、複数のバーコードは、核単離粒子に会合している。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子上に固定化され得る。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子上に部分的に固定化され得る。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子内に封入され得る。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子内に部分的に封入され得る。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子内に封入されてない。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子内に埋め込まれ得る。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子内に部分的に埋め込まれ得る。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、核単離粒子内に埋め込まれない。
核インデックス化オリゴヌクレオチド
一部の実施形態では、核結合試薬は、核インデックス化オリゴヌクレオチドを含み得る（例えば、図４Ａ〜４Ｂに示される核エンベロープタンパク質特異的抗体４３２ａに会合したバーコード４４０ａ）。核インデックス化オリゴヌクレオチドは、核インデックス化配列を含み得る。方法４００は、複数のバーコードを使用して、核インデックス化オリゴヌクレオチドをバーコード化して（例えば、細胞核のインデックス化の試料として）、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを生成するステップと、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドのシーケンシングデータを得るステップとを含み得る。核インデックス化オリゴヌクレオチドをバーコード化するステップは、複数のバーコードを使用して、確率的にバーコード化して、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを生成するステップを含み得る。複数のバーコードを使用して、核インデックス化オリゴヌクレオチドをバーコード化するステップは、複数のバーコードを、核インデックス化オリゴヌクレオチドと接触させて、核インデックス化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたバーコードを生成するステップと、核インデックス化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたバーコードを伸長させて、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを生成するステップとを含み得る。バーコードを伸長させるステップは、ＤＮＡポリメラーゼを使用してバーコードを伸長させて、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを生成するステップを含み得る。バーコードを伸長させるステップは、逆転写酵素を使用してバーコードを伸長させて、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを生成するステップを含み得る。
核結合試薬に会合した（例えば、それに結合した、コンジュゲートしたなど）核インデックス化オリゴヌクレオチドの数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、核結合試薬に会合した核インデックス化オリゴヌクレオチドの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、核結合試薬に会合した核インデックス化オリゴヌクレオチドの数は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００であってもよい。
核結合試薬に会合した核インデックス化オリゴヌクレオチドは、同一の配列（または同一の核インデックス化配列）または異なる配列（または異なる核インデックス化配列）を有し得る。一部の実施形態では、同一の配列（または同一の核インデックス化配列）を有する核結合試薬に会合した核インデックス化オリゴヌクレオチドの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、同一の配列（または同一の核インデックス化配列）を有する核結合試薬に会合した核インデックス化オリゴヌクレオチドの数は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００であってもよい。一部の実施形態では、異なる配列（または異なる核インデックス化配列）を有する核結合試薬に会合した核インデックス化オリゴヌクレオチドの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、異なる配列（または異なる核インデックス化配列）を有する核結合試薬に会合した核インデックス化オリゴヌクレオチドの数は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００であってもよい。
一部の実施形態では、方法４００は、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを増幅させて、複数のバーコード化された核インデックス化アンプリコンを生成するステップを含み得る。複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを増幅させるステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、分子標識配列のうちの少なくとも一部分および核インデックス化オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部分を増幅させるステップを含み得る。複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドのシーケンシングデータを得るステップは、複数のバーコード化された核インデックス化アンプリコンのシーケンシングデータを得るステップを含み得る。複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドのシーケンシングデータを得るステップは、分子標識配列のうちの少なくとも一部分および核インデックス化オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部分をシーケンシングするステップを含み得る。
バーコード化粒子
一部の実施形態では、複数のバーコードは、バーコード化粒子に会合している。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、バーコード化粒子上に固定化され得る。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、バーコード化粒子上に部分的に固定化され得る。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、バーコード化粒子内に封入され得る。複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、バーコード化粒子内に部分的に封入され得る。バーコード化粒子は、崩壊可能であってもよい。バーコード化粒子は、バーコード化ビーズを含み得る。バーコード化粒子は、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの組合せを含み得る。バーコード化粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含み得る。バーコード化粒子は、崩壊可能ハイドロゲル粒子を含み得る。
バーコードおよびバーコード化
一部の実施形態では、複数のバーコードを使用して複数の標的をバーコード化して複数のバーコード化された標的を生成するステップは、標的のコピーをバーコードの標的結合領域と接触させるステップと、複数のバーコードを使用して、複数の標的を逆転写して、複数のバーコード化された標的を生成するステップとを含む。方法４００は、複数のバーコード化された標的のシーケンシングデータを得るステップの前に、複数のバーコード化された標的を増幅させて、複数の増幅したバーコード化された標的を生成するステップを含み得る。バーコード化された標的を増幅させて、複数の増幅したバーコード化された標的を生成するステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、バーコード化された標的を増幅させて、複数の増幅したバーコード化された標的を生成するステップを含み得る。方法４００は、複数の増幅したバーコード化された標的を増幅させて、複数のバーコード化された標的のアンプリコンを生成するステップを含み得る。複数の増幅したバーコード化された標的を増幅させるステップは、分子標識配列および複数の標的のうちの１つの標的の配列、またはこれらの一部分を増幅させて、複数のバーコード化された標的のアンプリコンを生成するステップを含み得る。複数の増幅したバーコード化された標的を増幅させるステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、複数の増幅したバーコード化された標的を増幅させて、複数のバーコード化された標的のアンプリコンを生成するステップを含み得る。複数のバーコードを使用して、細胞の複数の標的をバーコード化して、複数のバーコード化された標的を生成するステップは、複数の確率的バーコードを使用して、細胞の複数の標的を確率的にバーコード化して、複数の確率的にバーコード化された標的を生成するステップを含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコードのそれぞれは、細胞標識配列、ユニバーサルプライマーに対する結合部位、またはこれらの任意の組合せを含み、かつ複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードの細胞標識配列は、同一の配列を含む。標的結合領域は、ポリ（ｄＴ）領域を含み得る。複数のバーコードのうちの少なくとも１００個の分子標識配列は、異なる配列を含み得る。複数のバーコードのうちの少なくとも１０００個の分子標識配列は、異なる配列を含み得る。複数のバーコードのうちの少なくとも１００００個の分子標識配列は、異なる配列を含み得る。複数のバーコードのうちの分子標識配列は、ランダム配列を含み得る。標的結合領域は、遺伝子特異的配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ランダムマルチマー、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
細胞溶解
一部の実施形態では、方法４００は、複数のバーコードを使用して、複数の核内の複数の標的をバーコード化して、複数のバーコード化された標的を生成する前に、複数の核を溶解させるステップを含む。一部の実施形態では、方法４００は、核単離組成物を使用して、複数の細胞の複数の核を単離する前に、複数の細胞の核を溶解させることなく複数の細胞を溶解させるステップを含む。
核バーコード化組成物
本明細書の開示は、バーコード化組成物の実施形態を含む。一部の実施形態では、バーコード化組成物は、核結合試薬を含む核単離組成物であって、核結合試薬が、核の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる、核単離組成物と、複数のバーコードであって、複数のバーコードのそれぞれが、分子標識配列および標的結合領域を含み、複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードの分子標識配列が、異なる配列を含む、複数のバーコードとを含む。一部の実施形態では、組成物は、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬を含む。核結合試薬は、第１のエピトープと会合してもよく、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、第１のエピトープ結合試薬を含んでもよい。一部の実施形態では、第１のエピトープ結合試薬は、切断可能なリンカーを通じて核単離粒子に会合している（例えば、固定化されている、部分的に固定化されている、封入されている、部分的に封入されている）。切断可能なリンカーは、第１のエピトープ結合試薬を核単離粒子に作動可能に連結させ得る。切断可能なリンカーは、化学的に切断可能な連結、光切断可能な連結、酸不安定性リンカー、熱感受性連結、酵素的に切断可能な連結、またはこれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、核結合試薬は、核の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる一次抗体を含み、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体を含む。一部のこのような実施形態では、前記二次抗体は、切断可能なリンカーを通じて核単離粒子に連結されている。一部の実施形態では、核結合試薬は、炭水化物結合試薬を含む。炭水化物結合試薬は、炭水化物結合タンパク質を含み得る。一部の実施形態では、核結合試薬は、核単離粒子に会合している。一部の実施形態では、複数のバーコードは、核単離粒子に会合している。一部の実施形態では、核結合試薬は、核インデックス化オリゴヌクレオチドを含み得、核インデックス化オリゴヌクレオチドは、核インデックス化配列を含む。複数のバーコードは、バーコード化粒子と会合し得る。
オルガネラ除去方法および組成物
本明細書の開示はまた、単一細胞トランスクリプトーム分析（または他の単一細胞オミクスもしくはマルチオミクス分析、例えば、単一細胞のタンパク質発現プロファイルを決定するためのプロテオミクス分析）のためにオルガネラ除去または単離を実施するための方法、組成物、およびシステムも含む。一部の実施形態では、抗体、例えば、エピトープに会合している抗体を使用して、オルガネラ除去ステップを実施することができる。例えば、１つまたは複数の強力なエピトープにコンジュゲートした抗体をオルガネラ除去ステップのために使用することができる。オルガネラ除去ステップでは、ＮＧＳライブラリー調製のための、夾雑物のより少ない細胞質および／または核のＲＮＡを得ることができる。例えば、ＮＧＳライブラリー調製のために精製されたまたはより清澄な細胞質および／または核のＲＮＡを得ることができる。オルガネラ除去ステップは、オルガネラ特異的ＲＮＡ、例えば、ミトコンドリアＲＮＡが、シーケンシングリード（例えば、シーケンシングリードの大多数）に寄与し得るため、単一細胞のライブラリー調製のために有用であり得る。一部の実施形態では、オルガネラ除去ステップは、ミトコンドリア特異的抗体（または別のミトコンドリア特異的結合試薬）を有するミトコンドリアの除去を含む。例えば、オルガネラ除去ステップは、ＲＮＡのミトコンドリア枯渇プールにおいて１つまたは複数の下流プロセスを実施しながら、単一のステップでミトコンドリア特異的抗体（または別のミトコンドリア特異的結合試薬）を有するミトコンドリアの除去を含み得る。下流プロセスは、トランスクリプトーム分析のためのｃＤＮＡ合成および単一細胞プロテオミクス分析のための核酸伸長反応を含み得る。一部の実施形態では、ミトコンドリア夾雑物は、単一細胞分析（例えば、全トランスクリプトーム分析またはプロテオミクス分析）では低下（例えば、排除）され得る。
一部の実施形態では、核のバーコード化および単離は、単一のステップで起こり得る。一部の実施形態では、ミトコンドリア含量（例えば、ＲＮＡ）の枯渇は、ライブラリー調製の開始時に起こり得る。一部の実施形態では、核のバーコード化および単離ならびにオルガネラ除去は、単一のステップで起こり得るかまたは時間内に終了し得る。
図５Ａ〜５Ｂは、オルガネラ（例えば、ミトコンドリア）除去を伴うバーコード化ワークフロー（例えば、確率的バーコード化）の非限定的な例示的略図を示す。方法５００は、細胞溶解（例えば、１つまたは複数のオルガネラを溶解させることなく細胞を溶解させる光溶解緩衝液を使用する）、オルガネラの結合および除去（例えば、ミトコンドリアの結合および除去）、その後の単一細胞分析（例えば、単一細胞発現プロファイル分析）を含み得る。例えば、エピトープ（例えば、ビオチン、フルオレセイン、およびＤＩＧなどの強力なエピトープ）と会合した（例えば、コンジュゲートした）抗体による、ミトコンドリアなどのオルガネラの選択的除去は、ＮＧＳライブラリーの夾雑物を低減（例えば、最小化または回避）することができる。オルガネラ除去ステップは、図４Ａ〜４Ｂを参照して記載された核バーコード化方法４００またはＲｈａｐｓｏｄｙ（商標）アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ））などの単一細胞ワークフローの一部であってもよい。
一部の実施形態では、方法５００は、核単離組成物を使用して複数の細胞の複数の核を単離するステップの前に、またはその際に、複数の細胞に浸透する（例えば、１つまたは複数のオルガネラの膜をインタクトに保ちながら形質膜を選択的に透過性にするおよび／または溶解させる）ステップと、オルガネラ結合試薬を含むオルガネラ捕捉組成物（例えば、図５Ａ〜５Ｂに示される抗体５３２ａ）を使用して、複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラ（例えば、ミトコンドリア５２４）を枯渇させるステップであって、オルガネラ結合試薬が、複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる、ステップとを含む。１つまたは複数のオルガネラを枯渇させるステップは、複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラを、オルガネラ捕捉組成物と接触させて、オルガネラ成分結合試薬に結合した１つまたは複数のオルガネラを生成するステップを含み得る。１つまたは複数のオルガネラを枯渇させるステップは、オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬を使用して、オルガネラ結合試薬に結合した１つまたは複数のオルガネラを枯渇させるステップを含み得る。オルガネラ結合試薬は、第２のエピトープ（例えば、エピトープ５３６）と会合していてもよく、オルガネラ結合試薬（例えば、エピトープ結合試薬５４４）に特異的に結合することができる試薬は、第２のエピトープ結合試薬を含み得る。
オルガネラ捕捉組成物中のオルガネラ結合試薬の数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、オルガネラ捕捉組成物中のオルガネラ結合試薬の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、オルガネラ捕捉組成物中のオルガネラ結合試薬の数は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００であってもよい。
オルガネラに結合するオルガネラ捕捉組成物中のオルガネラ結合試薬の数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、オルガネラに結合するオルガネラ捕捉組成物中のオルガネラ結合試薬の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、オルガネラに結合するオルガネラ捕捉組成物中のオルガネラ結合試薬の数は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００であってもよい。
オルガネラ捕捉組成物中のオルガネラ結合試薬が結合し得るオルガネラ数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、オルガネラ捕捉組成物中のオルガネラ結合試薬が結合し得るオルガネラ数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、オルガネラ捕捉組成物中のオルガネラ結合試薬が結合し得るオルガネラ数は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００であってもよい。
除去または枯渇された異なるオルガネラの数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、除去または枯渇された異なるオルガネラの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、除去または枯渇された異なるオルガネラの数は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００であってもよい。
除去または枯渇されたオルガネラの分子の数は、異なる実施形態において異なっていてもよい。一部の実施形態では、除去または枯渇されたオルガネラの分子の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、除去または枯渇されたオルガネラの分子の数は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００であってもよい。
一部の実施形態では、第２のエピトープは、ビオチン、ハプテン、またはこれらの組合せを含み得る。ハプテンは、ジゴキシゲニン、２，４−ジニトロフェノール、フルオレセイン、またはこれらの組合せを含み得る。オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、抗ハプテン抗体を含み得る。オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはこれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、第２のエピトープおよび／または第２のエピトープ結合試薬は、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第一級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、またはこれらの任意の組合せなどの親和性部分であってもよい。第２のエピトープおよび第２のエピトープ結合試薬は、結合対、例えば、ビオチン／ストレプトアビジンのメンバーであってもよい。オルガネラ結合試薬は、複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる一次抗体を含んでもよく、かつオルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体を含んでもよい。
一部の実施形態では、オルガネラ結合試薬は、オルガネラ表面成分結合試薬を含んでもよく、１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分は、１つまたは複数のオルガネラ表面成分を含んでもよく、かつオルガネラ結合試薬は、１つまたは複数のオルガネラ表面成分に特異的に結合することができる場合がある。
オルガネラ捕捉粒子
一部の実施形態では、オルガネラ結合試薬（例えば、第２のエピトープ結合試薬）に特異的に結合することができる試薬は、オルガネラ捕捉粒子（例えば、図５Ａ〜５Ｂに示される表面を有する粒子５４８）に会合している。オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、オルガネラ捕捉粒子上に、固定化されているか、または部分的に固定化されていてもよい。例えば、オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、可逆的に、非可逆的に、共有結合的に、非共有結合的に、またはこれらの組合せで、オルガネラ捕捉粒子に会合されていてもよい。別の例として、オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、オルガネラ捕捉粒子に埋め込まれているか、部分的に埋め込まれているか、埋め込まれていないか、封入されているか、部分的に封入されているか、封入されていないか、またはこれらの組合せであってもよい。
一部の実施形態では、オルガネラ捕捉粒子は、オルガネラ捕捉ビーズを含む。オルガネラ捕捉粒子は、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。オルガネラ捕捉粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含み得る。
一部の実施形態では、オルガネラ捕捉組成物を使用して複数の細胞のオルガネラを枯渇させるステップは、磁気除去、遠心分離、またはこれらの任意の組合せによって１つまたは複数のオルガネラ捕捉粒子を枯渇させるステップを含み得る。オルガネラは、複数の細胞のミトコンドリアを含み得る。複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分は、ＡＢＣＤ３、ＥＳＲ２、ＮＯＳ３、ＡＬＢ、ＨＩＦ１Ａ、ＮＲ３Ｃ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＨＫ１、ＰＧＲ、ＣＡＳＱ１、ＨＳＰＡ１Ａ、ＰＨＢ、ＣＬＴＣ、ＨＳＰＤ１、ＰＬＮ、ＣＯＸ４Ｉ１、ＩＦＭ１、ＳＯＤ１、ＣＰＳ１、ＬＧＡＬＳ３、ＴＰ５３、シトクロムＣオキシダーゼ、ＭＡＰＴ、ＴＰ５Ｂ、ＥＲＮ１、ＭＴ−ＣＯ１、ＶＤＡＣ１、またはこれらの組合せを含み得る。
オルガネラ除去組成物
一部の実施形態では、組成物は、オルガネラ結合試薬を含むオルガネラ捕捉組成物を含み、オルガネラ結合試薬は、１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる。組成物は、オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬を含み得る。オルガネラ結合試薬は、第２のエピトープに会合していてもよく、オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、第２のエピトープ結合試薬を含み得る。一部の実施形態では、オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、オルガネラ捕捉粒子に会合している。一部の実施形態では、オルガネラ結合試薬は、オルガネラ表面成分結合試薬を含み、１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分は、１つまたは複数のオルガネラ表面成分を含んでもよく、かつオルガネラ結合試薬は、１つまたは複数のオルガネラ表面成分に特異的に結合可能であり得る。
シーケンシング
一部の実施形態では、異なるバーコード化された標的（例えば、確率的にバーコード化された標的）の数を概算するステップは、標識標的、空間標識、分子標識、試料標識、細胞標識、またはその任意の産物（例えば、標識アンプリコン、または標識ｃＤＮＡ分子）の配列を決定するステップを含み得る。増幅した標的をシーケンシングに供することができる。バーコード化された標的（例えば、確率的にバーコード化された標的）またはその任意の産物の配列を決定するステップは、シーケンシング反応を行って、試料標識のうちの少なくとも一部分、空間標識、細胞標識、分子標識、標識標的（例えば、確率標識標的）のうちの少なくとも一部分、その相補体、その逆相補体、またはこれらの任意の組合せの配列を決定するステップを含み得る。
バーコード化された標的または確率的にバーコード化された標的（例えば、増幅した核酸、標識核酸、標識核酸のｃＤＮＡコピーなど）の配列の決定は、以下に限定されないが、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング（ＳＢＨ）、ライゲーションによるシーケンシング（ＳＢＬ）、定量的インクリメンタル蛍光ヌクレオチド付加シーケンシング（ＱＩＦＮＡＳ）、段階的ライゲーションおよび切断、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、分子ビーコン、ＴａｑＭａｎリポータプローブ消化、パイロシーケンシング、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕシーケンシング（ＦＩＳＳＥＱ）、ＦＩＳＳＥＱビーズ、ワブル（ｗｏｂｂｌｅ）シーケンシング、多重シーケンシング、重合コロニー（ＰＯＬＯＮＹ）シーケンシング；ナノグリッドローリングサークルシーケンシング（ＲＯＬＯＮＹ）、対立遺伝子特異的オリゴライゲーションアッセイ（例えば、オリゴライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、ライゲートした線状プローブおよびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）読み出しを使用する単一テンプレート分子ＯＬＡ、ライゲートした錠型（ｐａｄｌｏｃｋ）プローブ、またはライゲートした環状錠型プローブおよびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）読み出しを使用する単一テンプレート分子ＯＬＡ）などを含む様々なシーケンシング方法を使用して実施することができる。
一部の実施形態では、バーコード化された標的（例えば、確率的にバーコード化された標的）またはその任意の産物の配列を決定するステップは、ペアエンドシーケンシング、ナノポアシーケンシング、ハイスループットシーケンシング、ショットガンシーケンシング、ダイターミネータシーケンシング、マルチプルプライマーＤＮＡシーケンシング、プライマーウォーキング、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシシーケンシング、マキシム・ギルバート（Ｍａｘｉｍ Ｇｉｌｂｅｒｔ）シーケンシング、パイロシーケンシング、真の単一分子シーケンシング、またはこれらの任意の組合せを含む。あるいは、バーコード化された標的またはその任意の産物の配列は、電子顕微鏡検査または化学−感受性電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイによって決定することができる。
Ｒｏｃｈｅ ４５４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｏｌｅｘａ、ＡＢＩ−ＳＯＬｉＤ、ＩＯＮ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｅｌｉｃｏｓ、またはＰｏｌｏｎａｔｏｒプラットホームなどのプラットホームを使用する環状アレイシーケンシングなどのハイスループットシーケンシング方法も利用することができる。一部の実施形態では、シーケンシングは、ＭｉＳｅｑシーケンシングを含み得る。一部の実施形態では、シーケンシングは、ＨｉＳｅｑシーケンシングを含み得る。
標識標的（確率標識標的）は、生物のゲノムの遺伝子の約０．０１％〜生物のゲノムの遺伝子の約１００％を占める核酸を含み得る。例えば、複数の多量体を含む標的相補領域を使用して、試料中の相補配列を含有する遺伝子を捕捉することによって、生物のゲノムの遺伝子の約０．０１％〜生物のゲノムの遺伝子の約１００％をシーケンシングすることができる。一部の実施形態では、バーコード化された標的は、生物のトランスクリプトームの転写物の約０１％〜生物のトランスクリプトームの転写物の約１００％を占める核酸を含む。例えば、ポリ（Ｔ）テールを含む標的相補領域を使用して、試料からｍＲＮＡを捕捉することによって、生物のトランスクリプトームの転写物の約０．５０１％〜生物のトランスクリプトームの転写物の約１００％をシーケンシングすることができる。
複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）の空間標識および分子標識の配列を決定するステップは、複数のバーコードの０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、１００％、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲をシーケンシングするステップを含み得る。複数のバーコードの標識、例えば、試料標識、空間標識、および分子標識の配列を決定するステップは、複数のバーコードの１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、１０16、１０17、１０18、１０19、１０20、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲をシーケンシングするステップを含み得る。複数のバーコードの一部またはすべてをシーケンシングするステップは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドまたは塩基のリード長の配列を生成するステップを含み得る。
シーケンシングするステップは、バーコード化された標的のうちの少なくとも、または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくはそれより多いヌクレオチドまたは塩基対をシーケンシングするステップを含み得る。例えば、シーケンシングするステップは、複数のバーコード化された標的に関するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施することによって、５０、７５、または１００以上のヌクレオチドのリード長を有するシーケンシングを有するシーケンシングデータを生成するステップを含み得る。シーケンシングするステップは、バーコード化された標的のうちの少なくとも、または少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、もしくはそれより多いヌクレオチドまたは塩基対をシーケンシングするステップを含み得る。シーケンシングするステップは、バーコード化された標的のうちの少なくとも、または少なくとも約１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１００００、もしくはそれより多いヌクレオチドまたは塩基対をシーケンシングするステップを含み得る。
シーケンシングするステップは、ラン当たり少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、またはそれより多いシーケンシングリードを含み得る。一部の実施形態では、シーケンシングするステップは、ラン当たり少なくとも、または少なくとも約１，５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１００００、もしくはそれより多いシーケンシングリードを含む。シーケンシングするステップは、ラン当たり約１，６００，０００，０００以下のシーケンシングリードを含み得る。シーケンシングするステップは、ラン当たり約２００，０００，０００以下のリードを含み得る。
試料
一部の実施形態では、１つまたは複数の試料中に複数の標的が含まれていてもよい。試料は、１つもしくは複数の細胞、または１つもしくは複数の細胞由来の核酸を含み得る。試料は、単一細胞または単一細胞由来の核酸であってもよい。１つまたは複数の細胞は、１つまたは複数の細胞型のものであってもよい。１つまたは複数の細胞型のうちの少なくとも１つは、脳細胞、心臓細胞、がん細胞、循環腫瘍細胞、器官細胞、上皮細胞、転移性細胞、良性細胞、一次細胞、循環細胞、またはこれらの任意の組合せであってもよい。
本開示の方法に使用するための試料は、１つまたは複数の細胞を含み得る。試料は、１つまたは複数の細胞を指し得る。一部の実施形態では、複数の細胞は、１つまたは複数の細胞型を含み得る。１つまたは複数の細胞型のうちの少なくとも１つは、脳細胞、心臓細胞、がん細胞、循環腫瘍細胞、器官細胞、上皮細胞、転移性細胞、良性細胞、一次細胞、循環細胞、またはこれらの任意の組合せであってもよい。一部の実施形態では、細胞は、がん組織、例えば、乳がん、肺がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、膵がん、脳がん、黒色腫および非黒色腫皮膚がんなどから切除されたがん細胞である。一部の実施形態では、細胞は、がんに由来するが、体液から収集される（例えば、循環腫瘍細胞）。がんの非限定的な例としては、腺腫、腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、小細胞癌、大細胞未分化癌、軟骨肉腫、および線維肉腫を挙げることができる。試料は、組織、細胞単層、固定細胞、組織片、またはこれらの任意の組合せを含み得る。試料は、生体試料、臨床試料、環境試料、生体体液、組織、または対象からの細胞を含み得る。試料は、ヒト、哺乳動物、イヌ、ラット、マウス、魚類、ハエ、蠕虫、植物、真菌、細菌、ウイルス、脊椎動物、または無脊椎動物から得ることができる。
一部の実施形態では、細胞は、ウイルスに感染しており、かつウイルスオリゴヌクレオチドを含有する細胞である。一部の実施形態では、ウイルス感染は、一本鎖（＋鎖または「センス」）ＤＮＡウイルス（例えば、パルボウイルス）、または二本鎖ＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）などのウイルスによって引き起こされ得る。一部の実施形態では、細胞は、細菌である。これらは、グラム陽性またはグラム陰性細菌のいずれかを含み得る。一部の実施形態では、細胞は、真菌である。一部の実施形態では、細胞は、原生動物またはその他の寄生生物である。
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、１つまたは複数の細胞を指し得る。一部の実施形態では、細胞は、正常細胞、例えば、異なる発生段階のヒト細胞、または異なる器官もしくは組織型に由来するヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、非ヒト細胞、例えば、他のタイプの哺乳動物細胞（例えば、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ウシ、またはウマ）である。一部の実施形態では、細胞は、他のタイプの動物または植物細胞である。他の実施形態では、細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であってもよい。
一部の実施形態では、細胞は、細胞をビーズに会合させる前に選別される。例えば、細胞は、蛍光活性化細胞分取または磁気活性化細胞分取、またはより一般的にはフローサイトメトリーによって選別することができる。細胞はサイズ別に濾過されてもよい。一部の実施形態では、リテンテートは、ビーズに会合される細胞を含有する。一部の実施形態では、フロースルーは、ビーズに会合される細胞を含有する。
試料は、複数の細胞を指し得る。試料は、細胞の単層を指し得る。試料は、薄い切片（例えば、組織薄片）を指し得る。試料は、一次元のアレイに配置することができる細胞の固体または半固体コレクションを指し得る。
望ましくない核酸種を除去する方法
単一細胞分析、例えば、単一細胞全トランスクリプトーム分析（ＷＴＡ）は、目的としない標的または標的種（例えば、本明細書において、望ましくないかまたは不必要な核酸または核酸種とも称される、目的としない核酸または核酸種）が存在するか、非常に豊富に存在することによって阻害され得る。多くの試料中では、非核オルガネラ（例えば、ミトコンドリアｍＲＮＡおよびリボソームＲＮＡ）に由来する核酸は、非常に豊富に存在するおよび／または望ましくない場合がある。例えば、異種ｃＤＮＡ試料について、ＰＣＲは、通常、過剰なサイクルで実施され、低エクスプレッサーを適切に増幅し、これらのシナリオでは、ネイティブ遺伝子発現プロファイルは、通常、優位な高エクスプレッサーＰＣＲ産物によって歪められる。ＰＣＲ産物のこのような偏りを正すための方法は、分子インデックスであるが、ミトコンドリアｍＲＮＡなどの高エクスプレッサーは、実験解釈にほとんど寄与せずにシーケンシングランを支配することが多いため、分子インデックスカウントに対するシーケンシングコストは高いと考えられる。核酸試料中の存在量の少ない種の相対的存在量を増加させるための以前の努力には、ライブラリー正規化方法が含まれている。本明細書に開示された一部の実施形態は、複数の核酸分子から望ましくない核酸種（例えば、非核オルガネラ、ｍｔＲＮＡ、ｒＲＮＡに由来する核酸）を除去する方法を提供する。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、複数の核酸標的分子を含む試料を提供するステップを含む。試料は、一部の実施形態では、１つまたは複数の望ましくない核酸種を含み得る。複数の核酸標的分子および／または望ましくない核酸種が、様々な核酸標的分子を含み得ることが当業者によって認識されるであろう。例えば、核酸標的分子および／または望ましくない核酸種は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、ｍｔＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ分子、またはこれらの任意の組合せを含み得る。核酸標的分子は、二本鎖または一本鎖であってもよい。一部の実施形態では、複数の核酸標的分子は、１つまたは複数の非核オルガネラに由来する核酸を含み得る。一部の実施形態では、複数の核酸標的分子は、ポリＡ ＲＮＡ分子を含み得る。一部の実施形態では、複数の核酸標的分子は、少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１，０００，０００、またはそれより多い核酸種を含む。
試料は、例えば、複数の核酸標的分子、および１つまたは複数の望ましくない核酸種（例えば、非核オルガネラに由来する核酸）を含み得る。１つまたは複数の望ましくない核酸種は、異なる量で試料中に存在してもよい。例えば、１つまたは複数の望ましくない核酸種は、試料の核酸含量のうちの約、または少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくはそれより高い割合、もしくは１００％、もしくはこれらの値のうちの２つの間の範囲に及んでもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数の望ましくない核酸種は、試料の核酸含量のうちの少なくとも約１０％に及ぶ。一部の実施形態では、１つまたは複数の望ましくない核酸種は、試料の核酸含量のうちの少なくとも約３０％に及ぶ。一部の実施形態では、１つまたは複数の望ましくない核酸種は、試料の核酸含量のうちの少なくとも約５０％に及ぶ。望ましくない核酸種は、様々な型の核酸分子であってもよく、またはそれを含んでもよい。例えば、１つまたは複数の望ましくない核酸種のうちの少なくとも１種は、リボソームタンパク質ｍＲＮＡ、ミトコンドリアｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、イントロン配列、非常に豊富に存在する配列、またはこれらの組合せであってもよい。一部の実施形態では、望ましくない核酸種は、ｍＲＮＡ種であるか、またはそれを含む。ｍＲＮＡ種は、例えば、ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡ種、リボソーム遺伝子のｍＲＮＡ種、ミトコンドリア遺伝子のｍＲＮＡ種、非常に豊富に存在する遺伝子のｍＲＮＡ種、またはこれらの任意の組合せの１つまたは複数であってもよい。一部の実施形態では、望ましくない核酸種は、ＤＮＡ種であるか、またはそれを含む。ＤＮＡ種は、例えば、ハウスキーピング遺伝子のＤＮＡ種、リボソーム遺伝子のＤＮＡ種、ミトコンドリア遺伝子のＤＮＡ種、非常に豊富に存在する遺伝子のＤＮＡ種、またはこれらの任意の組合せの１つまたは複数であってもよい。一部の実施形態では、望ましくない核酸種は、ＤＮＡ種およびＲＮＡ種であるか、またはこれらを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の核単離および／またはオルガネラ枯渇方法は、試料中の複数の核酸標的分子と比較して、１つまたは複数の望ましくない核酸種（例えば、非核オルガネラに由来する核酸）の存在量を有意に低減させ得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、試料中の１つまたは複数の望ましくない核酸種の存在量を低減させ得る。例えば、本明細書に開示される方法および組成物は、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも２０種、少なくとも５０種、少なくとも１００種、少なくとも２００種、少なくとも５００種、少なくとも１，０００種、またはそれより多くの、試料中の望ましくない核酸種の存在量を低減させ得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、試料中の１種または複数の望ましくない核酸種のそれぞれの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％まで、存在量を低減させ得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の望ましくない核酸種の存在量は、本明細書に記載されているオルガネラ枯渇および／または核単離の前の出発試料中の核酸標的分子の少なくとも１つの存在量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５５％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、またはそれより高い割合、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の範囲まで低減させ得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物が、他の核酸標的分子に会合した異なる分子標識配列の数を有意に低減させずに、望ましくない核酸種の存在量を低減し得ることが認識されるであろう。例えば、本明細書に開示される方法および組成物は、他の核酸標的分子に会合した異なる分子標識配列の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％を保持しながら、望ましくない核酸種の存在量を低減させ得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、他の核酸標的分子に会合した異なる分子標識配列の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％を保持しながら、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％まで、望ましくない核酸種の存在量を低減させ得る。一部の実施形態では、望ましくない核酸種の存在量を低減させることによって、他の核酸標的分子に会合した異なる分子標識配列の数は有意に低減されない。
一部の実施形態では、本明細書に記載の核単離および／またはオルガネラ枯渇方法を使用した後、望ましくない核酸種に関するシーケンシングリードは、シーケンシングリード全体の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、またはそれより低い割合である。一部の実施形態では、望ましくない核酸種に関するシーケンシングリードは、シーケンシングリード全体の４０％未満である。一部の実施形態では、望ましくない核酸種に関するシーケンシングリードは、シーケンシングリード全体の３０％未満である。一部の実施形態では、望ましくない核酸種に関するシーケンシングリードは、シーケンシングリード全体の２０％未満である。一部の実施形態では、望ましくない核酸種に関するシーケンシングリードは、シーケンシングリード全体の１０％未満である。一部の実施形態では、本明細書に記載の核単離および／またはオルガネラ枯渇方法を使用した後、望ましくない核酸種に関するシーケンシングリードは、本明細書に記載の核単離および／またはオルガネラ枯渇方法を使用しない場合の望ましくない核酸に関するシーケンシングリードの６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満まで低減される。一部の実施形態では、本明細書に記載の核単離および／またはオルガネラ枯渇方法を使用した後、望ましくない核酸種に関するシーケンシングリードは、本明細書に記載の核単離および／またはオルガネラ枯渇方法を使用しない場合の望ましくない核酸に関するシーケンシングリードの６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の範囲まで、または約６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の範囲まで低減される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、望ましくない核酸種のシーケンシングリード：分子標識の比を低下させるおよび／または核酸標的分子のシーケンシングリード：分子標識の比を増大させることによってシーケンシング効率を改善し得る。例えば、望ましくない核酸種に関する分子標識に対するシーケンシングリードの比は、２０未満、１５未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満、または１未満であってもよい。一部の実施形態では、望ましくない核酸種に関する分子標識に対するシーケンシングリードの比は、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の範囲である。
上記の実施形態のいくつかの態様を以下の実施例でさらに詳しく開示するが、これらの実施例は、本開示の範囲を制限することを何ら意図しない。
（実施例１）
核捕捉およびバーコード化のワークフロー
この実施例は、核捕捉およびバーコード化に関するワークフローを実証する。図６Ａ〜６Ｆは、核単離および単一細胞プロファイリングに関する非限定的な例示的ワークフローの略図である。ワークフローは、細胞溶解を含み得る（例えば、核膜および／または１つまたは複数のオルガネラを溶解させることなく、形質膜を溶解させる光溶解緩衝液を使用する）。ワークフローは、１つまたは複数のオルガネラ（例えば、ミトコンドリア）の選択的枯渇を含み得る。ワークフローは、それぞれの核を核インデックス化配列（例えば、試料インデックス化のために）を含む核インデックス化オリゴヌクレオチドと会合させるステップを含み得る。ワークフローは、１つまたは複数の細胞成分から核を単離するステップを含み得る。ワークフローは、個々の核を区画に分割するステップおよび核溶解を行うステップを含み得る。ワークフローは、単一細胞分析（例えば、Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ））、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（商標）Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）））のための標的核酸分子および／または核インデックス化オリゴヌクレオチドをバーコード化する（例えば、確率的にバーコード化する）ステップを含み得る。
試料組成物
試料６０１は、複数の細胞６０２を含み得る。本開示の方法において使用するための試料は、単一細胞懸濁液を生成することが技術的に困難または不可能であるものであってもよい（例えば、凍結細胞、固定細胞、組織標本、腫瘍標本、上皮組織、ホルマリン固定パラフィン包埋細胞、およびこれらの組合せ）。細胞は、形質膜６０４および細胞核６０６を含み得る。細胞核は、核エンベロープ６０８および１つまたは複数の核酸標的分子６１２を含み得る。核エンベロープは、１つまたは複数の核エンベロープ表面成分６１０、例えば、核エンベロープタンパク質（例えば、ラミン）を含み得る。核は、１つまたは複数の標的核酸分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（長鎖ｎｃＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ））を含み得る。細胞は、本明細書に記載されている１つまたは複数のオルガネラ（例えば、リボソーム、ミトコンドリア）を含んでもよく、かつ１つまたは複数のオルガネラは、１つまたは複数のオルガネラ表面成分を含んでもよい。ミトコンドリア６１６は、オルガネラ表面成分（例えば、ミトコンドリア表面成分６１８）を含み得る。細胞はまた、核外細胞成分６１４を含み得る。核外細胞成分は、例えば、所望されない核外細胞質成分（例えば、単一細胞発現プロファイリングに対して不必要および／または有害な分子）を含み得る。核外細胞成分は、細胞質断片を含み得る。核外細胞成分は、オルガネラを含み得る。核外細胞成分は、ミトコンドリアを含み得る。核外細胞成分は、リボソームを含み得る。核外細胞成分は、粗面小胞体を含み得る。核外細胞成分は、１つまたは複数の所望されない核酸（例えば、リボソームＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ）を含み得る。核外細胞成分は、本明細書に開示される単一細胞発現分析方法を妨害する１つまたは複数の巨大分子を含み得る。核外細胞成分６１４は、例えば、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、サイトゾル、小胞、リソソーム、形質膜、葉緑体、ミトコンドリア内マトリックス、ミトコンドリア内膜、膜間腔、ミトコンドリア外膜、分泌小胞、滑面小胞体、粗面小胞体、ゴルジ体、ファゴソーム、エンドソーム、エキソソーム、形質膜、微小管、微小線維、中間径線維、フィロポディア、ラッフル、ラメリポディア、サルコメア、接着域、ポドソーム、リボソーム、マイクロソーム、脂質ラフト、細胞壁、およびこれらの組合せを含み得る。
形質膜溶解
ワークフローは、試料６０１の細胞６０２の集団の形質膜溶解（ステップ６００ａ）を含み得る。形質膜溶解によって、図６Ａに示したように、核、オルガネラ、および核外細胞成分（例えば、リボソーム）の複数の集団を含むライセートが生じ得る。この方法は、核エンベロープを溶解させることなく、複数の細胞を溶解させるステップを含み得る。この方法は、オルガネラ膜を溶解させることなく、複数の細胞を溶解させるステップを含み得る。この方法は、核エンベロープを溶解させることなく、複数の細胞を溶解させるステップとオルガネラ膜を溶解させるステップとを含み得る。形質膜溶解は、ホモジナイザー（例えば、Ｄｏｕｎｃｅのホモジナイザー）、界面活性剤、または酵素的方法を使用して実施され得る。
オルガネラ表面成分結合試薬と接触させるステップ
ワークフローは、ライセートを１つまたは複数のオルガネラ表面成分結合試薬と接触させるステップ（ステップ６００ｂ）を含み得る。第２のエピトープ６２２は、オルガネラ表面成分結合試薬６２０（例えば、オルガネラ結合試薬）と会合（例えば、固定化、部分的に固定化、封入、部分的に封入）されていてもよい。第２のエピトープ６２２は、本明細書に記載されている強力なエピトープ（例えば、ビオチン、フルオレセイン、および／またはＤＩＧ）を含み得る。オルガネラ表面成分結合試薬６２０は、１つまたは複数のオルガネラ（例えば、ミトコンドリア）の１つまたは複数の成分、例えば、ミトコンドリア表面成分６１８（図６Ｂに示したように）などに特異的に結合可能であり得る。複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラをオルガネラ表面成分結合試薬と接触させるステップによって、オルガネラ成分結合試薬に結合した１つまたは複数のオルガネラが生じ得る。オルガネラ表面成分結合試薬６２０は、ミトコンドリア特異的抗体（または別のミトコンドリア特異的結合試薬）を含み得る。
オルガネラ捕捉粒子と接触させるステップ
ワークフローは、ライセートを１つまたは複数のオルガネラ捕捉粒子と接触させるステップ（ステップ６００ｃ）を含み得る。オルガネラ捕捉粒子６３０は、本明細書に記載されているオルガネラ結合試薬（例えば、図６Ｂに示した第２のエピトープ結合試薬６３２）に特異的に結合することができる試薬を含み得る。第２のエピトープ結合試薬６３２は、オルガネラ捕捉粒子６３０と会合（例えば、固定化、部分的に固定化、封入、部分的に封入）されていてもよい。一部の実施形態では、オルガネラ表面成分結合試薬６２０は、第２のエピトープを含まない。一部のこのような実施形態では、オルガネラ表面成分結合試薬は、１つまたは複数のオルガネラ（例えば、ミトコンドリア）の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる一次抗体を含んでもよく、オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体を含む。ステップ６００ｃによって、オルガネラ表面成分結合試薬を通じてオルガネラ捕捉粒子に結合した１つまたは複数のオルガネラが生じ得る。
オルガネラ捕捉粒子の除去
ワークフローは、オルガネラ捕捉粒子の除去を含み得る（ステップ６００ｄ）。オルガネラ捕捉粒子の除去は、磁性除去、遠心分離、濾過、またはこれらの任意の組合せによって起こり得る。ステップ６００ｄによって、１つまたは複数のオルガネラの枯渇したライセートが生じ得る。
核結合試薬と接触させるステップ
ワークフローは、ライセートを１つまたは複数の核結合試薬と接触させるステップ（ステップ６００ｅ）を含み得る。核結合試薬６４０は、第１のエピトープ６４２を含み得る。第１のエピトープ６４２は、例えば、本明細書に記載されている強力なエピトープ（例えば、ビオチン、フルオレセイン、および／またはＤＩＧ）を含み得る。核結合試薬６４０は、核の１つまたは複数の成分（例えば、核エンベロープタンパク質）、例えば、核エンベロープ表面成分６１０など（図６Ｃに示したように）に特異的に結合可能であり得る。一部の実施形態では、核結合試薬は、炭水化物結合試薬（例えば、炭水化物結合タンパク質、レクチン）を含む。核を核結合試薬と接触させるステップによって、核結合試薬に結合した核が生じ得る。核結合試薬６４０は、核インデックス化オリゴヌクレオチド６４４を含み得る。核インデックス化オリゴヌクレオチド６４４は、核インデックス化配列（例えば、試料のインデックス化のために）を含み得る。核インデックス化オリゴヌクレオチド６４４は、ワークフロー全体を通して、核に会合したままであってもよい。一部の実施形態では、ワークフローは、核が、核インデックス化オリゴヌクレオチドを含む核結合試薬によって一旦結合すると、異なる試料から核をプールするステップを含み得る。
核単離粒子およびヌル粒子と接触させるステップ
ワークフローは、ライセートを核単離粒子およびヌル粒子と接触させるステップ（ステップ６００ｆ）を含み得る。核単離粒子６５０は、本明細書に記載されている核結合試薬（例えば、図６Ｄに示したように第１のエピトープ結合試薬６５２）に特異的に結合することができる試薬を含み得る。第１のエピトープ結合試薬６５２は、核単離粒子と会合（例えば、固定化、部分的に固定化、封入、部分的に封入）されていてもよい。核結合試薬は、核の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる一次抗体を含んでもよく、かつ核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体を含んでもよい。複数のバーコード６５４は、核単離粒子と会合（例えば、固定化、部分的に固定化、封入、部分的に封入）されていてもよい。
図６Ｄに示したように、ステップ６００ｆによって、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬を通じて、核単離粒子に結合した核を生じ得る。一部の実施形態では、試料内の核の集団を、本明細書において提供される方法に従って、核外細胞成分から分離することができる。一部の実施形態では、試料内の核の集団を、本明細書において提供される方法に従って、互いから個々に分離（例えば、単離）することができる。本明細書に開示される組成物および方法の一部の実施形態は、核単離粒子の凝集塊を低減または排除するために任意に使用されてもよい。本明細書において提供される方法および組成物の一部の実施形態を使用して、例えば、（１）個々の核単離粒子の２つ以上の核への結合を低減もしくは排除するおよび／または（２）個々の核の多核単離粒子への結合を低減もしくは排除することができる。
一部の実施形態では、接触させるステップの後の、単一の核に結合した核単離粒子または核に結合していない核単離粒子のパーセンテージは、０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、接触させるステップの後の、単一の核に結合した核単離粒子または核に結合していない核単離粒子のパーセンテージは、少なくとも、または最大で０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％であってもよい。
一部の実施形態では、接触させるステップの後の、単一の核単離粒子に結合した核のパーセンテージは、０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、接触させるステップの後の、単一の核単離粒子に結合した核のパーセンテージは、少なくとも、または最大で０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％であってもよい。
一部の実施形態では、単一の核の核単離粒子への結合は、ポアソン分布に従い得る。一部の実施形態では、単一の核の核単離粒子への結合は、非ポアソン分布に従い得る。試料の２つの別個の核が同じ核単離粒子に結合し得る確率は、１０-6、１０-5、１０-4、１０-3、１０-2、もしくは１０-1もしくはそれより高いか、または少なくとも１０-6、１０-5、１０-4、１０-3、１０-2、もしくは１０-1もしくはそれより高くてもよい。試料の２つの別個の核が同じ核単離粒子に結合し得る確率は、最大１０-6、１０-5、１０-4、１０-3、１０-2、または１０-1またはそれより高くてもよい。単一の核が、２つ以上の別個の核単離粒子に同時に結合し得る確率は、１０-6、１０-5、１０-4、１０-3、１０-2、もしくは１０-1もしくはそれより高いか、または少なくとも１０-6、１０-5、１０-4、１０-3、１０-2、もしくは１０-1もしくはそれより高くてもよい。単一の核が２つ以上の別個の核単離粒子に同時に結合し得る確率は、最大１０-6、１０-5、１０-4、１０-3、１０-2、または１０-1またはそれより高くてもよい。
一部の実施形態では、ワークフローは、ライセートを核単離粒子６５０およびヌル粒子６５６と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、ヌル粒子６５６は、複数のバーコード、磁気特性、および／または核結合試薬に特異的に結合することができる試薬（例えば、第１のエピトープ結合試薬）を含まない。ヌル粒子は、複数のバーコード、磁気特性、および／または核結合試薬に特異的に結合することができる試薬（例えば、第１のエピトープ結合試薬）の非存在以外のすべての態様において、核単離粒子に似ていてもよい。一部の実施形態では、核単離粒子と接触させるステップの前に、ライセートをヌル粒子と接触させる。一部の実施形態では、ライセートをヌル粒子および核単離粒子と同時に接触させる。ヌル粒子と接触させるステップによって、（１）個々の核単離粒子の２つ以上の核への結合を低減もしくは排除させるおよび／または（２）個々の核の複数の核単離粒子への結合を低減もしくは排除させることができる。
一部の実施形態では、ヌル粒子に対する核単離粒子の比は、１：１００〜１００：１の範囲に及ぶ。一部の実施形態では、ヌル粒子に対する核単離粒子の比は、最大１０：１である。一部の実施形態では、ヌル粒子に対する核単離粒子の比は、最大１００：１である。一部の実施形態では、ヌル粒子に対する核単離粒子の比は、最大１：１０００である。一部の実施形態では、ヌル粒子に対する核単離粒子の比は、少なくとも１：１０である。一部の実施形態では、ヌル粒子に対する核単離粒子の比は、少なくとも１：１００である。一部の実施形態では、ヌル粒子に対する核単離粒子の比は、少なくとも１：１０００である。
一部の実施形態では、ヌル粒子に対する核単離粒子の比は、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．５、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４１、１：４２、１：４３、１：４４、１：４５、１：４６、１：４７、１：４８、１：４９、１：５０、１：５１、１：５２、１：５３、１：５４、１：５５、１：５６、１：５７、１：５８、１：５９、１：６０、１：６１、１：６２、１：６３、１：６４、１：６５、１：６６、１：６７、１：６８、１：６９、１：７０、１：７１、１：７２、１：７３、１：７４、１：７５、１：７６、１：７７、１：７８、１：７９、１：８０、１：８１、１：８２、１：８３、１：８４、１：８５、１：８６、１：８７、１：８８、１：８９、１：９０、１：９１、１：９２、１：９３、１：９４、１：９５、１：９６、１：９７、１：９８、１：９９、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００、１：６０００、１：７０００、１：８０００、１：９０００、１：１００００もしくは値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、約１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．５、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４１、１：４２、１：４３、１：４４、１：４５、１：４６、１：４７、１：４８、１：４９、１：５０、１：５１、１：５２、１：５３、１：５４、１：５５、１：５６、１：５７、１：５８、１：５９、１：６０、１：６１、１：６２、１：６３、１：６４、１：６５、１：６６、１：６７、１：６８、１：６９、１：７０、１：７１、１：７２、１：７３、１：７４、１：７５、１：７６、１：７７、１：７８、１：７９、１：８０、１：８１、１：８２、１：８３、１：８４、１：８５、１：８６、１：８７、１：８８、１：８９、１：９０、１：９１、１：９２、１：９３、１：９４、１：９５、１：９６、１：９７、１：９８、１：９９、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００、１：６０００、１：７０００、１：８０００、１：９０００、１：１００００もしくは値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、ヌル粒子に対する核単離粒子の比は、少なくとも、または最大で１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．５、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４１、１：４２、１：４３、１：４４、１：４５、１：４６、１：４７、１：４８、１：４９、１：５０、１：５１、１：５２、１：５３、１：５４、１：５５、１：５６、１：５７、１：５８、１：５９、１：６０、１：６１、１：６２、１：６３、１：６４、１：６５、１：６６、１：６７、１：６８、１：６９、１：７０、１：７１、１：７２、１：７３、１：７４、１：７５、１：７６、１：７７、１：７８、１：７９、１：８０、１：８１、１：８２、１：８３、１：８４、１：８５、１：８６、１：８７、１：８８、１：８９、１：９０、１：９１、１：９２、１：９３、１：９４、１：９５、１：９６、１：９７、１：９８、１：９９、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００、１：６０００、１：７０００、１：８０００、１：９０００もしくは１：１００００であってもよい。
本明細書において提供される方法および組成物の一部の実施形態は、（１）個々の核単離粒子の２つ以上の核への結合を低減もしくは排除するおよび／または（２）個々の核の複数の核単離粒子への結合を低減もしくは排除するために、フローサイトメトリーを用いる。例えば、それぞれ単一の核を含む一連の液滴とそれぞれ単一の核とを含む一連の液滴が合わさって、それぞれ単一の核と単一の核単離粒子とを含む一連の液滴が生じ得る。液滴内での単一の核の単一の核単離粒子への結合後、一連の液滴のうちのそれぞれの液滴は、本明細書に記載されている遊離した第１のエピトープを含む別の一連の液滴と合わさってもよい。核単離粒子上の第１のエピトープ結合部位が飽和した後、複数の液滴がプールされ、本開示の下流の方法に供され得る。
遊離した第１のエピトープと接触させるステップ
ワークフローは、ライセートを遊離した第１のエピトープと接触させるステップ（ステップ６００ｇ）を含み得る。遊離した第１のエピトープ６６０は、第１のエピトープ６４２のすべてまたは一部分を含み得る。遊離した第１のエピトープは、核単離粒子に会合した未結合の第１のエピトープ結合試薬（例えば、図６Ｅに示される第１のエピトープ結合試薬６５２）に結合し得る。ステップ６００ｇの後に、核結合試薬の結合部位のほとんどまたはすべては飽和され（例えば、遊離した第１のエピトープまたは核結合試薬の第１のエピトープのいずれかが結合して）、それによって、核単離粒子の核への追加の結合はいずれも低減されるかまたは防止され得る。遊離した第１のエピトープと接触させるステップによって、ワークフローの下流でヌル粒子から分離された場合、核単離粒子の凝集が防止され得る。
一部の実施形態では、核単離粒子に対する遊離した第１のエピトープの比は、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．５、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４１、１：４２、１：４３、１：４４、１：４５、１：４６、１：４７、１：４８、１：４９、１：５０、１：５１、１：５２、１：５３、１：５４、１：５５、１：５６、１：５７、１：５８、１：５９、１：６０、１：６１、１：６２、１：６３、１：６４、１：６５、１：６６、１：６７、１：６８、１：６９、１：７０、１：７１、１：７２、１：７３、１：７４、１：７５、１：７６、１：７７、１：７８、１：７９、１：８０、１：８１、１：８２、１：８３、１：８４、１：８５、１：８６、１：８７、１：８８、１：８９、１：９０、１：９１、１：９２、１：９３、１：９４、１：９５、１：９６、１：９７、１：９８、１：９９、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００、１：６０００、１：７０００、１：８０００、１：９０００、１：１００００もしくは値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．５、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４１、１：４２、１：４３、１：４４、１：４５、１：４６、１：４７、１：４８、１：４９、１：５０、１：５１、１：５２、１：５３、１：５４、１：５５、１：５６、１：５７、１：５８、１：５９、１：６０、１：６１、１：６２、１：６３、１：６４、１：６５、１：６６、１：６７、１：６８、１：６９、１：７０、１：７１、１：７２、１：７３、１：７４、１：７５、１：７６、１：７７、１：７８、１：７９、１：８０、１：８１、１：８２、１：８３、１：８４、１：８５、１：８６、１：８７、１：８８、１：８９、１：９０、１：９１、１：９２、１：９３、１：９４、１：９５、１：９６、１：９７、１：９８、１：９９、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００、１：６０００、１：７０００、１：８０００、１：９０００、１：１００００もしくは値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、核単離粒子に対する遊離した第１のエピトープの比は、少なくとも、または最大で１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．５、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４１、１：４２、１：４３、１：４４、１：４５、１：４６、１：４７、１：４８、１：４９、１：５０、１：５１、１：５２、１：５３、１：５４、１：５５、１：５６、１：５７、１：５８、１：５９、１：６０、１：６１、１：６２、１：６３、１：６４、１：６５、１：６６、１：６７、１：６８、１：６９、１：７０、１：７１、１：７２、１：７３、１：７４、１：７５、１：７６、１：７７、１：７８、１：７９、１：８０、１：８１、１：８２、１：８３、１：８４、１：８５、１：８６、１：８７、１：８８、１：８９、１：９０、１：９１、１：９２、１：９３、１：９４、１：９５、１：９６、１：９７、１：９８、１：９９、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００、１：６０００、１：７０００、１：８０００、１：９０００もしくは１：１００００であってもよい。
一部の実施形態では、遊離した第１のエピトープと接触させるステップの後、１つまたは複数の未結合の第１のエピトープ結合試薬を含む核単離粒子のパーセンテージは、０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、遊離した第１のエピトープと接触させるステップの後、１つまたは複数の未結合の第１のエピトープ結合試薬を含む核単離粒子のパーセンテージは、少なくとも、または最大で０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％であってもよい。
核単離粒子の単離
ワークフローは、核単離粒子の単離（ステップ６００ｈ）を含み得る。核単離粒子（およびそれに結合した核）の単離は、磁性除去、濾過、遠心分離、またはこれらの任意の組合せによって、核単離粒子を単離するステップを含み得る。ステップ６００ｈによって、オルガネラおよび／または核外細胞成分の枯渇した単離された複数の核単離粒子（それぞれ１個または０個の核に結合した）が生成され得る。
分割、核溶解、およびバーコード化
ワークフローは、分割するステップ、核溶解、およびバーコード化するステップを含み得る（ステップ６００ｉ）。複数の核およびそれに結合した核単離粒子は、複数の区画に分割され得る。一部の実施形態では、複数の核は、前記核の複数の区画へ分割するステップの前に、核単離粒子から分離される。区画は、マイクロウェル、液滴、またはエマルションであってもよい。複数の区画のうちの１つの区画は、複数の核に由来する単一の核およびそれが会合した核単離粒子を含み得る。複数の区画のうちの１つの区画は、複数の核およびバーコード化粒子由来の単一の核を含んでもよい。複数の区画のうちの１つの区画は、複数の核に由来する単一の核、それが会合した核単離粒子、およびバーコード化粒子を含み得る。一部の実施形態では、マイクロウェルの寸法（例えば、マイクロウェルの深さ）は、ウェル内に含有されるアッセイ緩衝液および他の試薬も効率的に交換しながら、核および核単離粒子のトラッピング効率を最適化するために選択される。一旦分割されると、核は、本明細書において提供される方法に従って溶解され得る。バーコード化するステップは、核単離粒子の複数のバーコードおよび／またはバーコード粒子を使用して、本明細書において提供される方法に従って，複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドおよび／またはバーコード化された標的を生成するステップを含み得る。ステップ６００ｉの産物（例えば、バーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドおよび／またはバーコード化された標的）は、本明細書において提供される下流の方法を受けて、単一細胞発現プロファイルを生成し得る。
一部の実施形態では、ワークフローの１つまたは複数のステップは遠心分離を含む。一部の実施形態では、ワークフローの１つまたは複数のステップは、遠心分離を含まない。一部の実施形態では、ワークフローのステップはいずれも、遠心分離を含まない。一部の実施形態では、ワークフローは、ステップ６００ａ、ステップ６００ｂ、ステップ６００ｃ、ステップ６００ｄ、ステップ６００ｅ、ステップ６００ｆ、ステップ６００ｇ、ステップ６００ｈ、および／またはステップ６００ｉのうちの１つまたは複数を含まない。例えば、一部の実施形態では、方法は、オルガネラ表面成分結合試薬と接触させるステップ（ステップ６００ｂ）、オルガネラ捕捉粒子と接触させるステップ（ステップ６００ｃ）、および／またはオルガネラ捕捉粒子の除去（ステップ６００ｄ）を含まない。任意で、ステップ６００ａは、複数の細胞を溶解させるステップおよび核エンベロープを溶解させることなく、オルガネラ膜を溶解させるステップを含み、したがって、ステップ６００ｂ、ステップ６００ｃ、および／またはステップ６００ｄは行われない。一部の実施形態では、オルガネラの夾雑物および／または核外細胞成分の夾雑物（例えば、ミトコンドリアの夾雑物）は、ワークフローのステップ６００ｂ、ステップ６００ｃ、および／またはステップ６００ｄを行うことなく、単一細胞分析（例えば、全トランスクリプトーム分析またはプロテオミクス分析）のために低減（例えば、排除）され得る。一部の実施形態では、ステップ６００ａ、ステップ６００ｂ、ステップ６００ｃ、ステップ６００ｄ、ステップ６００ｅ、ステップ６００ｆ、ステップ６００ｇ、ステップ６００ｈ、および／またはステップ６００ｉのうちの１つまたは複数は、同時に実施される。例えば、オルガネラ表面成分結合試薬と接触させるステップ（ステップ６００ｂ）およびオルガネラ捕捉粒子と接触させるステップ（ステップ６００ｃ）は、同時に起こり得る。一部のこのような実施形態では、オルガネラ表面成分結合試薬は、オルガネラ捕捉粒子と会合している。オルガネラ表面成分結合試薬は、オルガネラ捕捉粒子上に固定化、または部分的に固定化されていてもよい。例えば、オルガネラ表面成分結合試薬は、可逆的に、非可逆的に、共有結合的に、非共有結合的に、またはこれらの任意の組合せで、オルガネラ捕捉粒子と会合されていてもよい。別の例として、オルガネラ表面成分結合試薬は、オルガネラ捕捉粒子に埋め込まれているか、部分的に埋め込まれているか、埋め込まれていないか、封入されているか、部分的に封入されているか、封入されていないか、またはこれらの組合せであってもよい。
一部の実施形態では、核結合試薬は、第１のエピトープを含まない。一部のこのような実施形態では、核結合試薬は、核の１つまたは複数の成分（例えば、核エンベロープタンパク質）に特異的に結合することができる一次抗体を含んでもよく、かつ核単離粒子は、一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体に会合している。一部のこのような実施形態では、遊離した一次抗体（遊離した第１のエピトープの代わりに）は、核単離粒子を単離する前に、ライセートと接触していてもよい。
（実施例２）
核捕捉およびバーコード化のワークフロー
この例は、核捕捉およびバーコード化に関するワークフローを実証する。図７Ａ〜７Ｃは、核単離および単一細胞プロファイリングに関する非限定的な例示的ワークフローの略図である。ワークフローは、細胞溶解を含み得る（例えば、核膜および／または１つまたは複数のオルガネラを溶解させることなく、形質膜を溶解させる光溶解緩衝液を使用する）。ワークフローは、それぞれの核を核インデックス化配列（例えば、試料インデックス化のために）を含む核インデックス化オリゴヌクレオチドと会合させるステップを含み得る。ワークフローは、１つまたは複数の細胞成分および／またはオルガネラから核を単離するステップを含み得る。ワークフローは、個々の核を区画に分割するステップおよび核溶解を行うステップを含み得る。ワークフローは、単一細胞分析（例えば、Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ））、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（商標）Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）））のための標的核酸分子および／または核インデックス化オリゴヌクレオチドをバーコード化する（例えば、確率的にバーコード化する）ステップを含み得る。
試料組成物
試料７０１は、複数の細胞７０２を含み得る。本開示の方法において使用するための試料は、単一細胞懸濁液を生成することが技術的に困難または不可能であるものであってもよい（凍結細胞、固定細胞、組織標本、腫瘍標本、上皮組織、ホルマリン固定パラフィン包埋細胞、およびこれらの組合せ）。細胞は、形質膜７０４および細胞核７０６を含み得る。細胞核は、核エンベロープ７０８および１つまたは複数の核酸標的分子７１２を含み得る。核エンベロープは、１つまたは複数の核エンベロープ表面成分７１０、例えば、核エンベロープタンパク質（例えば、ラミン）を含み得る。核は、１つまたは複数の標的核酸分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（長鎖ｎｃＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ））を含み得る。細胞は、本明細書に記載されている１つまたは複数のオルガネラ（例えば、リボソーム、ミトコンドリア）を含んでもよく、かつ１つまたは複数のオルガネラは、１つまたは複数のオルガネラ表面成分を含んでもよい。ミトコンドリア７１６は、オルガネラ表面成分（例えば、ミトコンドリア表面成分７１８）を含み得る。細胞はまた、核外細胞成分７１４を含み得る。核外細胞成分は、所望されない核外細胞質成分（例えば、単一細胞発現プロファイリングに対して不必要および／または有害な分子）を含み得る。核外細胞成分は、細胞質断片を含み得る。核外細胞成分は、オルガネラを含み得る。核外細胞成分は、ミトコンドリアを含み得る。核外細胞成分は、リボソームを含み得る。核外細胞成分は、粗面小胞体を含み得る。核外細胞成分は、１つまたは複数の所望されない核酸（例えば、リボソームＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ）を含み得る。核外細胞成分は、本明細書に開示される単一細胞発現分析方法を妨害する１つまたは複数の巨大分子を含み得る。核外細胞成分７１４は、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、サイトゾル、小胞、リソソーム、形質膜、葉緑体、ミトコンドリア内マトリックス、ミトコンドリア内膜、膜間腔、ミトコンドリア外膜、分泌小胞、滑面小胞体、粗面小胞体、ゴルジ体、ファゴソーム、エンドソーム、エキソソーム、形質膜、微小管、微小線維、中間径線維、フィロポディア、ラッフル、ラメリポディア、サルコメア、接着域、ポドソーム、リボソーム、マイクロソーム、脂質ラフト、細胞壁、およびこれらの組合せを含み得る。
形質膜溶解
ワークフローは、試料７０１の細胞７０２の集団の形質膜溶解（ステップ７００ａ）を含み得る。形質膜溶解は、図７Ａに示したように、核、オルガネラ、および核外細胞成分（例えば、リボソーム）の複数の集団を含むライセートを生成し得る。この方法は、核エンベロープを溶解させることなく、複数の細胞を溶解させるステップを含み得る。この方法は、オルガネラ膜を溶解させることなく、複数の細胞を溶解させるステップを含み得る。この方法は、核エンベロープを溶解させることなく、複数の細胞を溶解させるステップとオルガネラ膜を溶解させるステップとを含み得る。形質膜溶解は、ホモジナイザー（例えば、Ｄｏｕｎｃｅのホモジナイザー）、界面活性剤、または酵素的方法を使用して実施され得る。一部の実施形態では、ワークフローは、ステップ７００ｂを実施する前に、ライセートをオルガネラ表面成分結合試薬と接触させるステップ、ライセートをオルガネラ捕捉粒子と接触させるステップ、および／または前記オルガネラ捕捉粒子の除去（例えば、実施例１のステップ６００ｂ、ステップ６００ｃ、および／またはステップ６００ｄ）を含む。
核結合試薬と接触させるステップ
ワークフローは、ライセートを１つまたは複数の核結合試薬と接触させるステップ（ステップ７００ｂ）を含み得る。核結合試薬７４０は、第１のエピトープ７４２を含み得る。第１のエピトープ７４２は、本明細書に記載されている強力なエピトープ（例えば、ビオチン、フルオレセイン、および／またはＤＩＧ）を含み得る。核結合試薬７４０は、核の１つまたは複数の成分（例えば、核エンベロープタンパク質）、例えば、核エンベロープ表面成分７１０（図７Ｂに示したように）などに特異的に結合可能であり得る。一部の実施形態では、核結合試薬は、炭水化物結合試薬（例えば、炭水化物結合タンパク質、レクチン）を含む。核を核結合試薬と接触させるステップによって、核結合試薬に結合した核が生じ得る。核結合試薬７４０は、核インデックス化オリゴヌクレオチド７４４を含み得る。核インデックス化オリゴヌクレオチド７４４は、核インデックス化配列（例えば、試料のインデックス化のために）を含み得る。核インデックス化オリゴヌクレオチド７４４は、ワークフロー全体を通して、核に会合したままであってもよい。一部の実施形態では、ワークフローは、核が、核インデックス化オリゴヌクレオチドを含む核結合試薬によって一旦結合すると、異なる試料から核をプールするステップを含み得る。
核単離粒子と接触させるステップ
ワークフローは、ライセートを１つまたは複数の核単離粒子と接触させるステップ（ステップ７００ｃ）を含み得る。核単離粒子７５０は、本明細書に記載されている核結合試薬（例えば、図７Ｂに示した第１のエピトープ結合試薬７５２）に特異的に結合することができる試薬を含み得る。第１のエピトープ結合試薬７５２は、切断可能なリンカー７８０と通じて、核単離粒子と会合（例えば、固定化、部分的に固定化、封入、部分的に封入）されていてもよい。切断可能なリンカー７８０は、第１のエピトープ結合試薬７５２を核単離粒子７５０に作動可能に連結させ得る。切断可能なリンカーは、化学的に切断可能な連結、光切断可能な連結、酸不安定性リンカー、熱感受性連結、酵素的に切断可能な連結、またはこれらの組合せを含み得る。核結合試薬は、核の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる一次抗体を含んでもよく、かつ核結合試薬に特異的に結合することができる試薬は、一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体を含んでもよく、ここで、前記二次抗体は、切断可能なリンカーを通じて、核単離粒子に連結している。図７Ｂに示されたように、ステップ７００ｃは、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬によって、核単離粒子に結合した核を生成し得る。
核単離粒子の単離
ワークフローは、核単離粒子の単離を含み得る（ステップ７００ｄ）。核単離粒子（およびそれに結合した核）の単離は、磁性除去、濾過、遠心分離、またはこれらの任意の組合せによって、核単離粒子を単離するステップを含み得る。ステップ７００ｄは、オルガネラおよび／または核外細胞成分の枯渇した複数の単離された核単離粒子（およびそれに結合した核）を生成し得る。
リンカーの切断および核単離粒子の除去
ワークフローは、切断可能なリンカーの切断（それによって、核単離粒子からの核の分離を実現する）および核単離粒子の除去（ステップ７００ｅ）を含み得る。複数の単離された核単離粒子（およびそれに結合した核）は、切断可能なリンカーの切断を実現するのに必要な条件に曝露させてもよい。このような条件は、静電環境（例えば、高ｐＨ、低ｐＨ）、温度（例えば、熱切断可能な）、光の選択波長（例えば、光切断可能な）、化学的化合物（例えば、化学的に切断可能な）、酵素（例えば、酵素切断可能な）を含み得る。切断可能なリンカーが切断されると、核は、核単離粒子ともはや会合されていなくてもよい。核からの核単離粒子の除去は、磁性除去、遠心分離、濾過、またはこれらの任意の組合せによって起こり、これによって、精製された核の集団を生じ得る。
分割、核溶解、およびバーコード化
ワークフローは、分割するステップ、核溶解、およびバーコード化するステップを含み得る（ステップ７００ｆ）。複数の核が、複数の区画に分割され得る。区画は、マイクロウェル、液滴、またはエマルションであってもよい。複数の区画のうちの１つの区画は、複数の核からの単一の核を含み得る。複数の区画のうちの１つの区画は、複数の核およびバーコード化粒子由来の単一の核を含んでもよい。一部の実施形態では、マイクロウェルの寸法（例えば、マイクロウェルの深さ）は、ウェル内に含有されるアッセイ緩衝液および他の試薬も効率的に交換しながら、核およびバーコード化粒子のトラッピング効率を最適化するために選択される。
一部の実施形態では、エマルション、マイクロウェル、またはウェルは、１つの核のみを含有する。一部の実施形態では、１〜２，０００，０００のエマルション、マイクロウェル、またはウェルはそれぞれ、１つの核のみを含有する。一部の実施形態では、本方法は、最大１つの核を各エマルション、マイクロウェル、またはウェル中に分配するステップを含む。一部の実施形態では、単一の固体支持体および単一の核は、エマルション、マイクロウェル、またはウェルに分配される。一部の実施形態では、１〜２，０００，０００のエマルション、マイクロウェル、またはウェルはそれぞれ、それに分配された１つの核および１つの固体支持体を含む。一部の実施形態では、本方法は、エマルション、マイクロウェル、またはウェル当たり最大１つの固体支持体を分配するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、１〜２，０００，０００のマイクロウェル、エマルション、またはウェルのそれぞれに、１つの固体支持体および１つの核を分配するステップを含む。一部の実施形態では、核の分配は、ランダムであるかまたはランダムではない。一部の実施形態では、核の分配は、確率的である。一部の実施形態では、核は、細胞選別機によって分配される。一部の実施形態では、核は、１つまたは複数のウェル、マイクロウェル、またはエマルションを、最大１つの核が１つまたは複数のウェル、マイクロウェル、またはエマルションに分配されるように希釈した核の希釈液と接触させることによって分配される。
一部の例では、核の集団に由来する核は、本開示の基質のウェル中に分離（例えば、単離）され得る。例えば、核の集団は、分離前に希釈され得る。核の集団は、基質のウェルの少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が単一の核を受容するように希釈され得る。核の集団は、基質のウェルの最大１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が単一の核を受容するように希釈され得る。核の集団は、希釈された集団における核の数が、基質上のウェルの数の１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるか、または少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるように希釈され得る。核の集団は、希釈された集団における核の数が、基質上のウェルの数の１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるか、または少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるように希釈され得る。一部の例では、核の集団は、核の数が、基質におけるウェルの数の約１０％であるように希釈される。
単一の核の基質のウェル中への分配は、ポアソン分布に従ってもよい。例えば、基質のウェルが２つ以上の核を有する、少なくとも０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％、またはそれより高い確率が存在し得る。基質のウェルが２つ以上の核を有する、少なくとも０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％、またはそれより高い確率が存在し得る。単一の核の基質のウェル中への分配は、ランダムであってもよい。単一の核の基質のウェル中への分配は、ランダムでなくてもよい。核は、基質のウェルが１つの核のみを受容するように分離されてもよい。
一旦分割されると、核は、本明細書において提供される方法に従って溶解され得る。バーコード化するステップは、バーコード化粒子の複数のバーコードを使用して、本明細書において提供される方法に従って複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドおよび／またはバーコード化された標的を生成するステップを含み得る。ステップ７００ｆの産物（例えば、バーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドおよび／またはバーコード化された標的）は、本明細書において提供される下流の方法を受けて、単一細胞発現プロファイルを生成し得る。
一部の実施形態では、ワークフローの１つまたは複数のステップは、遠心分離を含む。一部の実施形態では、ワークフローの１つまたは複数のステップは、遠心分離を含まない。一部の実施形態では、ワークフローのステップはいずれも、遠心分離を含まない。一部の実施形態では、ワークフローは、ステップ７００ａ、ステップ７００ｂ、ステップ７００ｃ、ステップ７００ｄ、ステップ７００ｅ、および／またはステップ７００ｆのうちの１つまたは複数を含まない。例えば、核結合試薬は、切断可能なリンカーを通じて、核単離粒子に会合（例えば、固定化、部分的に固定化、封入、部分的に封入）されていてもよい。一部の実施形態では、ワークフローのステップ７００ａ、ステップ７００ｂ、ステップ７００ｃ、ステップ７００ｄ、ステップ７００ｅ、および／またはステップ７００ｆのうちの１つまたは複数が、同時に実施される。例えば、核結合試薬と接触させるステップ（ステップ７００ｂ）および核単離粒子と接触させるステップ（ステップ７００ｃ）は同時に起こり得る。
以前に記載された実施形態の少なくとも一部では、実施形態において使用される１つまたは複数のエレメントは、このような置き換えが技術的に実施不可能でなければ、別の実施形態において交換可能に使用され得る。特許請求された主題の範囲から逸脱することなく、以上に記載の方法および構造に種々の他の省略、追加および変更を行いうることが当業者によって認識されるであろう。このような変更および変化はすべて、添付の特許請求の範囲に規定される主題の範囲内に含まれることが意図される。
本明細書の実質的に任意の複数形および／または単数形の用語の使用に関連して、文脈上および／または適用上適切であれば、当業者は、複数形から単数形へおよび／または単数形から複数形への変換が可能である。明確にするために種々の単数形／複数形の入替えを本明細書に明示的に記述し得る。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、別段に文脈上明確に規定されていなければ、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、複数の参照が含まれる。本明細書において、「または（ｏｒ）」へのいずれの言及も、別段に記載されていなければ、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を包含することを意図する。
一般的には、本明細書において、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本文）で使用される用語は、全般的に、「オープン」用語であることが意図されることが当業者によって理解されるであろう（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「以下に限定されないが、〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」と解釈されるべきであり、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも〜を有する（ｈａｖｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」と解釈されるべきであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は「以下に限定されないが、〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ ｂｕｔ ｉｓ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」と解釈されるべきであるなど）。さらに、導入された請求項の記載の特定数が意図される場合、このような意図は請求項で明示的に記載され、このような記載の非存在下では、このような意図は存在しないことが、当業者によって理解されるであろう。例えば、理解の一助として、以下の添付の特許請求の範囲は、請求項の記載を導入するために、導入語句「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」および「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」の使用を含み得る。しかし、このような語句の使用は、たとえ同一の請求項が、「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」または「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という導入語句および「ａ」または「ａｎ」のような不定冠詞を含む場合でも、「ａ」または「ａｎ」という不定冠詞による請求項の記載の導入がこのような導入された請求項の記載を含むいかなる特定の請求項もそのような記載を１つのみ含む実施形態に限定することを意味するものと解釈させるべきではなく（例えば、「ａ」および／または「ａｎ」は、「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」または「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を意味すると解釈されるべきである）、請求項の記載を導入するために使用される定冠詞の使用についても同様である。さらに、たとえ特定数の導入された請求項の記載が明示的に記載されたとしても、このような記載は少なくとも記載された数を意味すると解釈されるべきであることを当業者は認識するであろう（例えば、「２つの記載」という他の修飾語を含まない無修飾の記載は、少なくとも２つの記載、または２つ以上の記載を意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つなど」に類似した慣例が使用される場合、一般的には、このような構成は当業者がその慣例を理解する意味であることが意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、以下に限定されないが、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢの両方、ＡとＣの両方、ＢとＣの両方、および／またはＡとＢとＣの全部などを有するシステムを含むことになる）。「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つなど」に類似した慣例が使用される場合、一般的には、このような構成は当業者がその慣例を理解する意味であることが意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、以下に限定されないが、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢの両方、ＡとＣの両方、ＢとＣの両方、および／またはＡとＢとＣの全部などを有するシステムを含むことになる）。さらに、２つ以上の代替用語を表す実質上任意の選言的な語および／または語句は、明細書、請求項、または図面にかかわらず、用語の１つ、用語のいずれか、または用語の両方を含む可能性が企図されると理解されるべきであることが当業者によって理解されるであろう。
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群により記述される場合、それにより、本開示は、マーカッシュ群の任意の個別のメンバーまたはメンバーの下位群によっても記述されることが、当業者に認識されるであろう。
当業者に理解されるように、あらゆる目的で、例えば、明細書の提供に関して、本明細書に開示された範囲はすべて、あらゆる可能な下位範囲およびその下位範囲の組合せも包含する。いずれの列挙された範囲も、十分に記述されたものとしてかつその範囲が少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などされ得るものとして容易に認識可能である。非限定的な例として、本明細書で考察した各範囲は、下３分の１、中３分の１、上３分の１などに容易に分解可能である。同様に、当業者に理解されるように、「最大」、「少なくとも」、「より多い」、「より少ない」などの表現はすべて、記載された数を含み、以上で考察したように後続的に下位範囲に分解可能な範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は、それぞれ個々のメンバーを含む。よって、例えば、１〜３個の物品を有する群は、１、２、または３個の物品を有する群を指す。同様に、１〜５個の物品を有する群は、１、２、３、４、または５個の物品を有する群を指し、他も同様である。
様々な態様および実施形態が本明細書に開示されているが、他の態様および実施形態が当業者にとって明らかであろう。本明細書に開示される様々な態様および実施形態は、例示を目的とし、限定を意図するものではなく、以下の請求項によって示されている真の範囲および精神を有する。

Claims (243)

  1. 複数の細胞における標的の数を決定するための方法であって、
    核単離組成物を使用して複数の細胞の複数の核を単離するステップであって、
    核単離組成物が、核結合試薬を含み、
    核結合試薬が、核の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる、ステップと、
    複数のバーコードを使用して、複数の核内の複数の標的をバーコード化して、複数のバーコード化された標的を生成するステップであって、
    複数のバーコードのそれぞれが、分子標識配列および標的結合領域を含み、
    複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードの分子標識配列が、異なる配列を含む、ステップと、
    複数のバーコード化された標的のシーケンシングデータを得るステップと、
    シーケンシングデータ内の複数のバーコードの分子標識配列を使用して、複数の細胞における複数の標的のそれぞれの数を概算するステップと
    を含む、方法。
  2. 複数の核を単離するステップが、
    複数の細胞の複数の核を、核単離組成物と接触させて、核結合試薬に結合した核を生成するステップ
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 複数の核を単離するステップが、
    核結合試薬に特異的に結合することができる試薬を使用して、核結合試薬に結合した核を単離するステップ
    を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 核結合試薬が、第１のエピトープと会合しており、
    核結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、第１のエピトープ結合試薬を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 第１のエピトープが、ビオチン、ハプテン、またはこれらの組合せを含む、請求項４に記載の方法。
  6. ハプテンが、ジゴキシゲニン、２，４−ジニトロフェノール、フルオレセイン、またはこれらの組合せを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 核結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、抗ハプテン抗体を含む、請求項５〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 核結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはこれらの組合せを含む、請求項５に記載の方法。
  9. 核結合試薬が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第一級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびこれらの組合せからなる群から選択される官能基を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 核結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第一級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびこれらの組合せからなる群から選択される官能基を含む、請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 核結合試薬が、核の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる一次抗体を含み、
    核結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体を含む、請求項３に記載の方法。
  12. 核結合試薬が、炭水化物結合試薬を含む、請求項３に記載の方法。
  13. 炭水化物結合試薬が、炭水化物結合タンパク質を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 炭水化物結合タンパク質が、レクチンを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. レクチンが、マンノース結合レクチン、ガラクトース結合レクチン、Ｎ−アセチルガラクトサミン結合レクチン、Ｎ−アセチルグルコサミン結合レクチン、Ｎ−アセチルノイラミン酸結合レクチン、フコース結合レクチン、またはこれらの組合せを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. レクチンが、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、レンチルレクチン（ＬＣＨ）、スノードロップレクチン（ＧＮＡ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）凝集素（ＲＣＡ）、ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）、ジャカリン（ＡＩＬ）、ヘアリーベッチレクチン（ＶＶＬ）、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）、エルダーベリーレクチン（ＳＮＡ）、イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）白血球凝集素（ＭＡＬ）、イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）赤血球凝集素（ＭＡＨ）、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）凝集素（ＵＥＡ）、ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ）レクチン（ＡＡＬ）、またはこれらの組合せを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. レクチンが、凝集素である、請求項１４に記載の方法。
  18. 凝集素が、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）である、請求項１７に記載の方法。
  19. 炭水化物結合タンパク質が、動物、細菌、ウイルス、または真菌に由来するか、またはそれから誘導される、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 炭水化物結合タンパク質が、植物に由来するか、またはそれから誘導される、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  21. 植物が、タチナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）、マツユキソウ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、パラミツ（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、ナヨクサフジ（Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、セイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ）、イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）、ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ）、またはこれらの組合せである、請求項２０に記載の方法。
  22. 核結合試薬が、核単離粒子と会合している、請求項３〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 核結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、核単離粒子と会合している、請求項２２に記載の方法。
  24. 核結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、核単離粒子に固定化されている、請求項２３に記載の方法。
  25. 核結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、切断可能なリンカーを通じて核単離粒子と会合している、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 切断可能なリンカーが、化学的に切断可能な連結、光切断可能な連結、酸不安定性リンカー、熱感受性連結、酵素的に切断可能な連結、またはこれらの組合せを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 核単離粒子が、核単離ビーズを含む、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 核単離粒子が、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、ハイドロゲルビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 核単離粒子が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 核単離粒子が、崩壊可能である、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 核単離粒子が、核単離崩壊可能ハイドロゲル粒子を含む、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 核結合試薬に結合した核を単離するステップが、核結合試薬に結合した核を、複数の核単離粒子と接触させるステップを含む、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 核結合試薬に結合した核を複数の核単離粒子と接触させるステップの前に、核結合試薬に結合した核を、複数のヌル粒子と接触させるステップを含む、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 核単離粒子に対するヌル粒子の比が、少なくとも１０：１である、請求項３３に記載の方法。
  35. ヌル粒子が、磁気特性を含まない、請求項３３〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. ヌル粒子が、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬を含まない、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. ヌル粒子が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、またはこれらの組合せからなる群から選択される材料を含む、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 複数のヌル粒子が、核単離粒子の凝集を低減させる、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 複数のヌル粒子が、核単離粒子の凝集を予防する、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  40. 核結合試薬に結合した核を複数の核単離粒子と接触させるステップが、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬を通じて核単離粒子に結合した複数の核を生成する、請求項２２〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 核結合試薬に結合した核を複数の核単離粒子と接触させるステップの後の、単一の核単離粒子に結合した核のパーセンテージが、少なくとも９０％である、請求項４０に記載の方法。
  42. 核結合試薬に結合した核を複数の核単離粒子と接触させるステップの後の、単一の核単離粒子に結合した核のパーセンテージが、少なくとも９５％である、請求項４０に記載の方法。
  43. 核結合試薬に結合した核を複数の核単離粒子と接触させるステップの後の、単一の核単離粒子に結合した核のパーセンテージが、少なくとも９９％である、請求項４０に記載の方法。
  44. 核結合試薬に結合した核を複数の核単離粒子と接触させるステップの後の、単一の核に結合したまたはいずれの核にも結合していない核単離粒子のパーセンテージが、少なくとも９０％である、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 核結合試薬に結合した核を複数の核単離粒子と接触させるステップの後の、単一の核に結合したまたはいずれの核にも結合していない核単離粒子のパーセンテージが、少なくとも９５％である、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
  46. 核結合試薬に結合した核を複数の核単離粒子と接触させるステップの後の、単一の核に結合したまたはいずれの核にも結合していない核単離粒子のパーセンテージが、少なくとも９９％である、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
  47. 核結合試薬に結合した核を単離するステップが、
    磁気除去、遠心分離、またはこれらの任意の組合せによって、核単離粒子を単離するステップ
    を含む、請求項２２〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 複数の核単離粒子を単離するステップの前に、核単離粒子に結合した複数の核を、遊離した第１のエピトープと接触させるステップであって、遊離した第１のエピトープが、第１のエピトープのすべてまたは一部分を占める、ステップを含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 複数のバーコードが、核単離粒子と会合している、請求項２２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードが、核単離粒子に固定化されている、請求項２２〜４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードが、核単離粒子に部分的に固定化されている、請求項２２〜５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードが、核単離粒子に封入されている、請求項２２〜５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードが、核単離粒子に部分的に封入されている、請求項２２〜５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 核の１つまたは複数の成分が、ラミン、エメリン、ネスプリン、ヌリム、ＵＮＣ−８３、クラール（Ｋｌａｒ）、ＺＹＧ−１２、Ｋｍｓ１ｐ、ＵＮＣ−８４、クラロイド（Ｋｌａｒｏｉｄ）、ＳＵＮ−１、Ｓａｄ１ｐ、ＬＢＲ、ＭＡＮ１、ＬＡＰ１、ＬＡＰ２、ＬＩＮＫ、核膜孔複合体、これらの一部分、またはこれらの組合せを含む、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 核の１つまたは複数の成分が、糖、オリゴ糖、多糖、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含む、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 核の１つまたは複数の成分が、単糖、二糖、ポリオール、マルトオリゴ糖、非マルトオリゴ糖、デンプン、非デンプン多糖、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含む、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 核の１つまたは複数の成分が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、マルトデキストリン、ラフィノース、スタキオース、フルクトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、加工デンプン、グリコーゲン、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ハイドロコロイド、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含む、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 核の１つまたは複数の成分が、α−Ｄ−マンノシル残基、α−Ｄ−グルコシル残基、高α−マンノース型の分岐鎖α−マンノシド構造、ハイブリッド型および二分岐複合型Ｎ−グリカンの分岐鎖α−マンノシド構造、二分岐および三分岐複合型Ｎ−グリカンのフコシル化コア領域、α １−３およびα １−６連結型高マンノース構造、Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃβ１−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、（Ｓｉａ）Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ（シアル酸）、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ（ＮＡｃ）−Ｒ、Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｇｃα２，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）、Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｇｃα２，３Ｇａｌβ１，３（Ｎｅｕ５Ａｃα２，６）ＧａｌＮａｃ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３／４）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｒ２−ＧｌｃＮＡｃβ１−４（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ１、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含む、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 核の１つまたは複数の成分が、糖タンパク質、糖脂質、またはこれらの組合せを含む、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 核結合試薬が、核エンベロープ表面成分結合試薬を含み、
    核結合試薬が、１つまたは複数の核エンベロープ表面成分に特異的に結合することができる、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 複数のバーコードを使用して複数の核内の複数の標的をバーコード化して複数のバーコード化された標的を生成するステップの前に、複数の核を溶解させるステップ
    を含む、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 核単離組成物を使用して複数の細胞の複数の核を単離するステップの前に、複数の細胞の核を溶解させることなく複数の細胞を溶解させるステップ
    を含む、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
  63. 核単離組成物を使用して複数の細胞の複数の核を単離するステップの前に、
    複数の細胞の形質膜を溶解させるステップと、
    オルガネラ結合試薬を含むオルガネラ捕捉組成物を使用して、複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラを枯渇させるステップであって、
    オルガネラ結合試薬が、複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる、ステップと
    を含む、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. １つまたは複数のオルガネラを枯渇させるステップが、
    複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラを、オルガネラ捕捉組成物と接触させて、オルガネラ成分結合試薬に結合した１つまたは複数のオルガネラを生成するステップ
    を含む、請求項６３に記載の方法。
  65. １つまたは複数のオルガネラを枯渇させるステップが、
    オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬を使用して、オルガネラ結合試薬に結合した１つまたは複数のオルガネラを枯渇させるステップ
    を含む、請求項６４に記載の方法。
  66. オルガネラ結合試薬が、第２のエピトープと会合しており、
    オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、第２のエピトープ結合試薬を含む、請求項６３〜６５のいずれか１項に記載の方法。
  67. 第２のエピトープが、ビオチン、ハプテン、またはこれらの組合せを含む、請求項６６に記載の方法。
  68. ハプテンが、ジゴキシゲニン、２，４−ジニトロフェノール、フルオレセイン、またはこれらの組合せを含む、請求項６７に記載の方法。
  69. オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、抗ハプテン抗体を含む、請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはこれらの組合せを含む、請求項６９に記載の方法。
  71. オルガネラ結合試薬が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第一級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される官能基を含む、請求項６３〜７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第一級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される官能基を含む、請求項６５〜７１のいずれか１項に記載の方法。
  73. オルガネラ結合試薬が、複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる一次抗体を含み、
    オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体を含む、請求項７０〜７２のいずれか１項に記載の方法。
  74. オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、オルガネラ捕捉粒子と会合している、請求項６３〜７１のいずれか１項に記載の方法。
  75. オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、オルガネラ捕捉粒子に固定化されている、請求項７４に記載の方法。
  76. オルガネラ捕捉粒子が、オルガネラ捕捉ビーズを含む、請求項７４〜７５のいずれか１項に記載の方法。
  77. オルガネラ捕捉粒子が、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
  78. オルガネラ捕捉粒子が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む、請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の方法。
  79. オルガネラ捕捉組成物を使用して複数の細胞のオルガネラを枯渇させるステップが、
    磁気除去、遠心分離、またはこれらの任意の組合せによって、１つまたは複数のオルガネラ捕捉粒子を枯渇させるステップ
    を含む、請求項７４〜７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. オルガネラが、複数の細胞のミトコンドリアを含む、請求項６３〜７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分が、ＡＢＣＤ３、ＥＳＲ２、ＮＯＳ３、ＡＬＢ、ＨＩＦ１Ａ、ＮＲ３Ｃ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＨＫ１、ＰＧＲ、ＣＡＳＱ１、ＨＳＰＡ１Ａ、ＰＨＢ、ＣＬＴＣ、ＨＳＰＤ１、ＰＬＮ、ＣＯＸ４Ｉ１、ＩＦＭ１、ＳＯＤ１、ＣＰＳ１、ＬＧＡＬＳ３、ＴＰ５３、シトクロムＣオキシダーゼ、ＭＡＰＴ、ＴＰ５Ｂ、ＥＲＮ１、ＭＴ−ＣＯ１、ＶＤＡＣ１、またはこれらの組合せを含む、請求項６３〜８０のいずれか１項に記載の方法。
  82. オルガネラ結合試薬が、オルガネラ表面成分結合試薬を含み、
    １つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分が、１つまたは複数のオルガネラ表面成分を含み、
    オルガネラ結合試薬が、１つまたは複数のオルガネラ表面成分に特異的に結合することができる、請求項６３〜８１のいずれか１項に記載の方法。
  83. 核結合試薬が、核インデックス化オリゴヌクレオチドを含み、核インデックス化オリゴヌクレオチドが、核インデックス化配列を含む、請求項１〜８２のいずれか１項に記載の方法。
  84. 複数の核を溶解させるステップの前に、複数の核を分割する、請求項６２〜８３のいずれか１項に記載の方法。
  85. 複数の核を分割するステップが、複数の核を複数の区画に分割するステップを含み、複数の区画のうちの１つの区画が、複数の核に由来する単一の核を含む、請求項８４に記載の方法。
  86. 複数の区画が、マイクロウェルアレイのマイクロウェルを含む、請求項８５に記載の方法。
  87. 複数の区画が、複数の液滴を含む、請求項８５に記載の方法。
  88. 複数の区画のうちの２つ以上の区画が、単一の核を含む、請求項８４〜８７のいずれか１項に記載の方法。
  89. 複数の区画のうちの１つの区画が、単一の核および単一の核単離粒子を含む、請求項８４〜８８のいずれか１項に記載の方法。
  90. 複数の区画のうちの１つの区画が、単一の核および単一のバーコード化粒子を含む、請求項８４〜８８のいずれか１項に記載の方法。
  91. 複数の区画のうちの１つの区画が、単一の核、単一の核単離粒子、および単一のバーコード化粒子を含む、請求項８４〜８８のいずれか１項に記載の方法。
  92. 複数のバーコードを使用して、核インデックス化オリゴヌクレオチドをバーコード化して、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを生成するステップと、
    複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドのシーケンシングデータを得るステップと
    を含む、請求項８３〜９１のいずれか１項に記載の方法。
  93. 核インデックス化オリゴヌクレオチドをバーコード化するステップが、
    複数のバーコードを使用して、確率的にバーコード化して、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを生成するステップ
    を含む、請求項９２に記載の方法。
  94. 複数のバーコードを使用して核インデックス化オリゴヌクレオチドをバーコード化するステップが、
    複数のバーコードを、核インデックス化オリゴヌクレオチドと接触させて、核インデックス化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたバーコードを生成するステップと、
    核インデックス化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたバーコードを伸長させて、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを生成するステップと
    を含む、請求項９２〜９３のいずれか１項に記載の方法。
  95. バーコードを伸長させるステップが、
    ＤＮＡポリメラーゼを使用してバーコードを伸長させて、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを生成するステップ
    を含む、請求項９４に記載の方法。
  96. バーコードを伸長させるステップが、
    逆転写酵素を使用してバーコードを伸長させて、複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを生成するステップ
    を含む、請求項９４に記載の方法。
  97. 複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを増幅させて、複数のバーコード化された核インデックス化アンプリコンを得るステップ
    を含む、請求項９４〜９６のいずれか１項に記載の方法。
  98. 複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドを増幅させるステップが、
    ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、分子標識配列の少なくとも一部分および核インデックス化オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分を増幅させるステップ
    を含む、請求項９７に記載の方法。
  99. 複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドのシーケンシングデータを得るステップが、
    複数のバーコード化された核インデックス化アンプリコンのシーケンシングデータを得るステップ
    を含む、請求項９７〜９８のいずれか１項に記載の方法。
  100. 複数のバーコード化された核インデックス化オリゴヌクレオチドのシーケンシングデータを得るステップが、分子標識配列の少なくとも一部分および核インデックス化オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分をシーケンシングするステップを含む、請求項９９に記載の方法。
  101. 複数のバーコードが、バーコード化粒子と会合している、請求項１〜１００のいずれか１項に記載の方法。
  102. 複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードが、バーコード化粒子に固定化されている、請求項１０１に記載の方法。
  103. 複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードが、バーコード化粒子に部分的に固定化されている、請求項１０１〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
  104. 複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードが、バーコード化粒子に封入されている、請求項１０１〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
  105. 複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードが、バーコード化粒子に部分的に封入されている、請求項１０１〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
  106. バーコード化粒子が、崩壊可能である、請求項１０１〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
  107. バーコード化粒子が、バーコード化ビーズを含む、請求項１０１〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
  108. バーコード化粒子が、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１０７に記載の方法。
  109. バーコード化粒子が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む、請求項１０１〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
  110. バーコード化粒子が、崩壊可能ハイドロゲル粒子を含む、請求項１０１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
  111. 複数のバーコードを使用して複数の標的をバーコード化して複数のバーコード化された標的を生成するステップが、
    標的のコピーをバーコードの標的結合領域と接触させるステップと、
    複数のバーコードを使用して、複数の標的を逆転写して、複数のバーコード化された標的を生成するステップと
    を含む、請求項１〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
  112. 複数のバーコード化された標的のシーケンシングデータを得るステップの前に、複数のバーコード化された標的を増幅させて、複数の増幅したバーコード化された標的を生成するステップ
    を含む、請求項１〜１１１のいずれか１項に記載の方法。
  113. バーコード化された標的を増幅させて複数の増幅したバーコード化された標的を生成するステップが、
    ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、バーコード化された標的を増幅させて、複数の増幅したバーコード化された標的を生成するステップ
    を含む、請求項１１２に記載の方法。
  114. 複数の増幅したバーコード化された標的を増幅させて、複数のバーコード化された標的のアンプリコンを生成するステップ
    を含む、請求項１１２〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
  115. 複数の増幅したバーコード化された標的を増幅させるステップが、
    分子標識配列および複数の標的のうちの１つの標的の配列、またはその一部分を増幅させて、複数のバーコード化された標的のアンプリコンを生成するステップ
    を含む、請求項１１４に記載の方法。
  116. 複数の増幅したバーコード化された標的を増幅させるステップが、
    ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、複数の増幅したバーコード化された標的を増幅させて、複数のバーコード化された標的のアンプリコンを生成するステップ
    を含む、請求項１１４〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
  117. 複数のバーコードを使用して細胞の複数の標的をバーコード化して複数のバーコード化された標的を生成するステップが、
    複数の確率的バーコードを使用して、細胞の複数の標的を確率的にバーコード化して、複数の確率的にバーコード化された標的を生成するステップ
    を含む、請求項１〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
  118. 複数のバーコードのそれぞれが、細胞標識配列、ユニバーサルプライマーの結合部位、またはこれらの任意の組合せを含み、
    複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードの細胞標識配列が、同一の配列を含む、請求項１〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
  119. 標的結合領域が、ポリ（ｄＴ）領域を含む、請求項１〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
  120. 複数のバーコードの少なくとも１００個の分子標識配列が、異なる配列を含む、請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
  121. 複数のバーコードの少なくとも１０００個の分子標識配列が、異なる配列を含む、請求項１〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
  122. 複数のバーコードの少なくとも１００００個の分子標識配列が、異なる配列を含む、請求項１〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
  123. 複数のバーコードの分子標識配列が、ランダム配列を含む、請求項１〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
  124. 標的結合領域が、遺伝子特異的配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ランダム多量体、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
  125. 複数の細胞が、組織試料を含む、請求項１〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
  126. 複数の細胞が、上皮組織試料を含む、請求項１〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
  127. 複数の細胞が、凍結細胞を含む、請求項１〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
  128. 複数の細胞が、固定細胞を含む、請求項１〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
  129. 複数の細胞が、ホルマリン固定パラフィン包埋細胞を含む、請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
  130. 複数の細胞が、腫瘍細胞を含む、請求項１〜１２９のいずれか１項に記載の方法。
  131. 複数の細胞が、固定腫瘍細胞を含む、請求項１〜１３０のいずれか１項に記載の方法。
  132. 複数の細胞が、凍結腫瘍細胞を含む、請求項１〜１３１のいずれか１項に記載の方法。
  133. 複数の細胞が、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍細胞を含む、請求項１〜１３２のいずれか１項に記載の方法。
  134. 複数の細胞が、１つまたは複数の核外細胞成分を含む、請求項１〜１３３のいずれか１項に記載の方法。
  135. 核外細胞成分が、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、サイトゾル、小胞、リソソーム、形質膜、葉緑体、ミトコンドリア内マトリックス、ミトコンドリア内膜、膜間腔、ミトコンドリア外膜、分泌小胞、滑面小胞体、粗面小胞体、ゴルジ体、ファゴソーム、エンドソーム、エクソソーム、形質膜、微小管、微小線維、中間径線維、フィロポディア、ラッフル、ラメリポディア、サルコメア、接着域、ポドソーム、リボソーム、マイクロソーム、脂質ラフト、細胞壁、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１３４に記載の方法。
  136. 核外細胞成分が、ミトコンドリアを含む、請求項１３４〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
  137. 核外細胞成分が、リボソームを含む、請求項１３４〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
  138. １つまたは複数の核外細胞成分が、１つまたは複数の望ましくない核酸種を含む、請求項１３４〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
  139. １つまたは複数の核外細胞成分のうちの少なくとも１つの存在量が、複数の核を単離することによって低減される、請求項１３４〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
  140. １つまたは複数の核外細胞成分のうちの少なくとも１つの存在量が、１つまたは複数のオルガネラを枯渇させることによって低減される、請求項１３４〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
  141. 複数の細胞が、複数の標的および１つまたは複数の望ましくない核酸種を含む、請求項１〜１４０のいずれか１項に記載の方法。
  142. 望ましくない核酸種が、核以外のオルガネラに由来する、請求項１４１に記載の方法。
  143. 望ましくない核酸種が、リボソームＲＮＡを含む、請求項１４１〜１４２のいずれか１項に記載の方法。
  144. 望ましくない核酸種が、ミトコンドリアＲＮＡを含む、請求項１４１〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
  145. 望ましくない核酸種が、ミトコンドリアＤＮＡを含む、請求項１４１〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
  146. １つまたは複数の望ましくない核酸種のうちの少なくとも１つの存在量が、複数の核を単離することによって低減される、請求項１４１〜１４５のいずれか１項に記載の方法。
  147. １つまたは複数の望ましくない核酸種のうちの少なくとも１つの存在量が、１つまたは複数のオルガネラを枯渇させることによって低減される、請求項１４１〜１４５のいずれか１項に記載の方法。
  148. １つまたは複数の望ましくない核酸種が、複数の細胞の核酸含量のうちの約５０％に達する、請求項１４１〜１４７のいずれか１項に記載の方法。
  149. １つまたは複数の望ましくない核酸種が、複数の細胞の核酸含量のうちの約６０％に達する、請求項１４１〜１４７のいずれか１項に記載の方法。
  150. １つまたは複数の望ましくない核酸種が、複数の細胞の核酸含量のうちの約７０％に達する、請求項１４１〜１４７のいずれか１項に記載の方法。
  151. １つまたは複数の望ましくない核酸種が、複数の細胞の核酸含量のうちの約８０％に達する、請求項１４１〜１４７のいずれか１項に記載の方法。
  152. 望ましくない核酸種が、複数のバーコード化された標的のアンプリコンの４０％未満に相当する、請求項１４１〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
  153. 望ましくない核酸種が、複数のバーコード化された標的のアンプリコンの２０％未満に相当する、請求項１４１〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
  154. 望ましくない核酸種が、複数のバーコード化された標的のアンプリコンの１０％未満に相当する、請求項１４１〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
  155. 望ましくない核酸種が、複数のバーコード化された標的のアンプリコンの５％未満に相当する、請求項１４１〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
  156. 複数のバーコード化された標的のシーケンシングデータを得るステップが、複数のシーケンシングリードを生成するステップを含む、請求項１４１〜１５５のいずれか１項に記載の方法。
  157. 望ましくない核酸種のシーケンシングリードが、総シーケンシングリードの４０％未満である、請求項１５６に記載の方法。
  158. 望ましくない核酸種のシーケンシングリードが、総シーケンシングリードの２０％未満である、請求項１５６に記載の方法。
  159. 望ましくない核酸種のシーケンシングリードが、総シーケンシングリードの１０％未満である、請求項１５６に記載の方法。
  160. 望ましくない核酸種のシーケンシングリードが、総シーケンシングリードの５％未満である、請求項１５６に記載の方法。
  161. 核結合試薬を含む核単離組成物であって、
    核結合試薬が、核の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる、核単離組成物と、
    複数のバーコードであって、
    複数のバーコードのそれぞれが、分子標識配列および標的結合領域を含み、
    複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードの分子標識配列が、異なる配列を含む、複数のバーコードと
    を含む、バーコード化組成物。
  162. 核結合試薬に特異的に結合することができる試薬を含む、請求項１６１に記載の組成物。
  163. 核結合試薬が、第１のエピトープと会合しており、
    核結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、第１のエピトープ結合試薬を含む、請求項１６２に記載の組成物。
  164. 第１のエピトープが、ビオチン、ハプテン、またはこれらの組合せを含む、請求項１６３に記載の組成物。
  165. ハプテンが、ジゴキシゲニン、２，４−ジニトロフェノール、フルオレセイン、またはこれらの組合せを含む、請求項１６４に記載の組成物。
  166. 核結合試薬が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第一級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される官能基を含む、請求項１６１〜１６５のいずれか１項に記載の組成物。
  167. 核結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第一級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される官能基を含む、請求項１６２〜１６６のいずれか１項に記載の組成物。
  168. 核結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、抗ハプテン抗体を含む、請求項１６４〜１６５のいずれか１項に記載の組成物。
  169. 核結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはこれらの組合せを含む、請求項１６４に記載の組成物。
  170. 核結合試薬が、核の１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる一次抗体を含み、
    核結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体を含む、請求項１６２に記載の組成物。
  171. 核結合試薬が、炭水化物結合試薬を含む、請求項１６２に記載の組成物。
  172. 炭水化物結合試薬が、炭水化物結合タンパク質を含む、請求項１７１に記載の組成物。
  173. 炭水化物結合タンパク質が、レクチンを含む、請求項１７２に記載の組成物。
  174. レクチンが、マンノース結合レクチン、ガラクトース結合レクチン、Ｎ−アセチルガラクトサミン結合レクチン、Ｎ−アセチルグルコサミン結合レクチン、Ｎ−アセチルノイラミン酸結合レクチン、フコース結合レクチン、またはこれらの組合せを含む、請求項１７３に記載の組成物。
  175. レクチンが、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、レンチルレクチン（ＬＣＨ）、スノードロップレクチン（ＧＮＡ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）凝集素（ＲＣＡ）、ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）、ジャカリン（ＡＩＬ）、ヘアリーベッチレクチン（ＶＶＬ）、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）、エルダーベリーレクチン（ＳＮＡ）、イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）白血球凝集素（ＭＡＬ）、イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）赤血球凝集素（ＭＡＨ）、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）凝集素（ＵＥＡ）、ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ）レクチン（ＡＡＬ）、またはこれらの組合せを含む、請求項１７４に記載の組成物。
  176. レクチンが、凝集素である、請求項１７３に記載の組成物。
  177. 凝集素が、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）である、請求項１７６に記載の組成物。
  178. 炭水化物結合タンパク質が、動物、細菌、ウイルス、または真菌に由来するか、またはそれから誘導される、請求項１７２〜１７７のいずれか１項に記載の組成物。
  179. 炭水化物結合タンパク質が、植物に由来するか、またはそれから誘導される、請求項１７２〜１７７のいずれか１項に記載の組成物。
  180. 植物が、タチナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）、マツユキソウ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、パラミツ（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、ナヨクサフジ（Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、セイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ）、イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）、ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ）、またはこれらの組合せである、請求項１７９に記載の組成物。
  181. 核結合試薬が、核単離粒子と会合している、請求項１６１〜１８０のいずれか１項に記載の組成物。
  182. 核結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、核単離粒子と会合している、請求項１８１に記載の組成物。
  183. 核結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、核単離粒子に固定化されている、請求項１８２に記載の組成物。
  184. 核結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、切断可能なリンカーを通じて核単離粒子と会合している、請求項１８２〜１８３のいずれか１項に記載の組成物。
  185. 切断可能なリンカーが、化学的に切断可能な連結、光切断可能な連結、酸不安定性リンカー、熱感受性連結、酵素的に切断可能な連結、またはこれらの組合せを含む、請求項１８４に記載の組成物。
  186. 核単離粒子が、核単離ビーズを含む、請求項１８１〜１８５のいずれか１項に記載の組成物。
  187. 核単離粒子が、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、ハイドロゲルビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１８１〜１８６のいずれか１項に記載の組成物。
  188. 核単離粒子が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む、請求項１８１〜１８７のいずれか１項に記載の組成物。
  189. 核単離粒子が、崩壊可能である、請求項１８１〜１８８のいずれか１項に記載の組成物。
  190. 核単離粒子が、核単離崩壊可能ハイドロゲル粒子を含む、請求項１８１〜１８９のいずれか１項に記載の組成物。
  191. 複数のバーコードが、核単離粒子と会合している、請求項１８１〜１９０のいずれか１項に記載の組成物。
  192. 複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードが、核単離粒子に固定化されている、請求項１８１〜１９１のいずれか１項に記載の組成物。
  193. 複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードが、核単離粒子に部分的に固定化されている、請求項１８１〜１９２のいずれか１項に記載の組成物。
  194. 複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードが、核単離粒子に封入されている、請求項１８１〜１９３のいずれか１項に記載の組成物。
  195. 複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードが、核単離粒子に部分的に封入されている、請求項１８１〜１９４のいずれか１項に記載の組成物。
  196. 核の１つまたは複数の成分が、ラミン、エメリン、ネスプリン、ヌリム、ＵＮＣ−８３、クラール、ＺＹＧ−１２、Ｋｍｓ１ｐ、ＵＮＣ−８４、クラロイド、ＳＵＮ−１、Ｓａｄ１ｐ、ＬＢＲ、ＭＡＮ１、ＬＡＰ１、ＬＡＰ２、ＬＩＮＫ、核膜孔複合体、これらの一部分、またはこれらの組合せを含む、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の請求項１８１〜１９５のいずれか１項に記載の組成物。
  197. 核の１つまたは複数の成分が、糖、オリゴ糖、多糖、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含む、請求項１８１〜１９６のいずれか１項に記載の組成物。
  198. 核の１つまたは複数の成分が、単糖、二糖、ポリオール、マルトオリゴ糖、非マルトオリゴ糖、デンプン、非デンプン多糖、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含む、請求項１８１〜１９７のいずれか１項に記載の組成物。
  199. 核の１つまたは複数の成分が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、マルトデキストリン、ラフィノース、スタキオース、フルクトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、加工デンプン、グリコーゲン、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ハイドロコロイド、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含む、請求項１８１〜１９８のいずれか１項に記載の組成物。
  200. 核の１つまたは複数の成分が、α−Ｄ−マンノシル残基、α−Ｄ−グルコシル残基、高α−マンノース型の分岐鎖α−マンノシド構造、ハイブリッド型および二分岐複合型Ｎ−グリカンの分岐鎖α−マンノシド構造、二分岐および三分岐複合型Ｎ−グリカンのフコシル化コア領域、α １−３およびα １−６連結型高マンノース構造、Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃβ１−Ｒ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、（Ｓｉａ）Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ（シアル酸）、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ（ＮＡｃ）−Ｒ、Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｇｃα２，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）、Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｇｃα２，３Ｇａｌβ１，３（Ｎｅｕ５Ａｃα２，６）ＧａｌＮａｃ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌ−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３／４）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｒ２−ＧｌｃＮＡｃβ１−４（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ１、これらの誘導体、またはこれらの組合せを含む、請求項１８１〜１９９のいずれか１項に記載の組成物。
  201. 核の１つまたは複数の成分が、糖タンパク質、糖脂質、またはこれらの組合せを含む、請求項１８１〜２００のいずれか１項に記載の組成物。
  202. 核結合試薬が、核エンベロープ表面成分結合試薬を含み、
    核結合試薬が、１つまたは複数の核エンベロープ表面成分に特異的に結合することができる、請求項１８１〜２０１のいずれか１項に記載の組成物。
  203. オルガネラ結合試薬を含み、
    オルガネラ結合試薬が、１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる、請求項１６１〜２０２のいずれか１項に記載の組成物。
  204. オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬を含む、請求項２０３に記載の組成物。
  205. オルガネラ結合試薬が、第２のエピトープと会合しており、
    オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、第２のエピトープ結合試薬を含む、請求項２０３〜２０４のいずれか１項に記載の組成物。
  206. 第２のエピトープが、ビオチン、ハプテン、またはこれらの組合せを含む、請求項２０５に記載の組成物。
  207. ハプテンが、ジゴキシゲニン、２，４−ジニトロフェノール、フルオレセイン、またはこれらの組合せを含む、請求項２０６に記載の組成物。
  208. オルガネラ結合試薬が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第一級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される官能基を含む、請求項２０３〜２０７のいずれか１項に記載の組成物。
  209. オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第一級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される官能基を含む、請求項２０４〜２０８のいずれか１項に記載の組成物。
  210. オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、抗ハプテン抗体を含む、請求項２０５〜２０７のいずれか１項に記載の組成物。
  211. オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはこれらの組合せを含む、請求項２０８に記載の組成物。
  212. オルガネラ結合試薬が、複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分に特異的に結合することができる一次抗体を含み、
    オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体を含む、請求項２１１に記載の組成物。
  213. オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、オルガネラ捕捉粒子と会合している、請求項２０３〜２１２のいずれか１項に記載の組成物。
  214. オルガネラ結合試薬に特異的に結合することができる試薬が、オルガネラ捕捉粒子に固定化されている、請求項２１３に記載の組成物。
  215. オルガネラ捕捉粒子が、オルガネラ捕捉ビーズを含む、請求項２１３〜２１４のいずれか１項に記載の組成物。
  216. オルガネラ捕捉粒子が、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、ハイドロゲルビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項２１３〜２１５のいずれか１項に記載の組成物。
  217. オルガネラ捕捉粒子が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む、請求項２１３〜２１６のいずれか１項に記載の組成物。
  218. オルガネラが、複数の細胞のミトコンドリアを含む、請求項２０３〜２１７のいずれか１項に記載の組成物。
  219. 複数の細胞の１つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分が、ＡＢＣＤ３、ＥＳＲ２、ＮＯＳ３、ＡＬＢ、ＨＩＦ１Ａ、ＮＲ３Ｃ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＨＫ１、ＰＧＲ、ＣＡＳＱ１、ＨＳＰＡ１Ａ、ＰＨＢ、ＣＬＴＣ、ＨＳＰＤ１、ＰＬＮ、ＣＯＸ４Ｉ１、ＩＦＭ１、ＳＯＤ１、ＣＰＳ１、ＬＧＡＬＳ３、ＴＰ５３、シトクロムＣオキシダーゼ、ＭＡＰＴ、ＴＰ５Ｂ、ＥＲＮ１、ＭＴ−ＣＯ１、ＶＤＡＣ１、またはこれらの組合せを含む、請求項２０３〜２１８のいずれか１項に記載の組成物。
  220. オルガネラ結合試薬が、オルガネラ表面成分結合試薬を含み、
    １つまたは複数のオルガネラの１つまたは複数の成分が、１つまたは複数のオルガネラ表面成分を含み、
    オルガネラ結合試薬が、１つまたは複数のオルガネラ表面成分に特異的に結合することができる、請求項２０３〜２１９のいずれか１項に記載の組成物。
  221. 核結合試薬が、核インデックス化オリゴヌクレオチドを含み、核インデックス化オリゴヌクレオチドが、核インデックス化配列を含む、請求項１６１〜２２０のいずれか１項に記載の組成物。
  222. 複数のバーコードが、バーコード化粒子と会合している、請求項２２１に記載の組成物。
  223. 複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードが、バーコード化粒子に固定化されている、請求項２２２に記載の組成物。
  224. 複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードが、バーコード化粒子に部分的に固定化されている、請求項２２２〜２２３のいずれか１項に記載の組成物。
  225. 複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードが、バーコード化粒子に封入されている、請求項２２２〜２２４のいずれか１項に記載の組成物。
  226. 複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードが、バーコード化粒子に部分的に封入されている、請求項２２２〜２２５のいずれか１項に記載の組成物。
  227. バーコード化粒子が、崩壊可能である、請求項２２２〜２２６のいずれか１項に記載の組成物。
  228. バーコード化粒子が、バーコード化ビーズを含む、請求項２２２〜２２７のいずれか１項に記載の組成物。
  229. バーコード化粒子が、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、ハイドロゲルビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項２２８に記載の組成物。
  230. バーコード化粒子が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む、請求項２２２〜２２９のいずれか１項に記載の組成物。
  231. バーコード化粒子が、崩壊可能ハイドロゲル粒子を含む、請求項２２２〜２３０のいずれか１項に記載の組成物。
  232. 複数のバーコードのそれぞれが、細胞標識配列、ユニバーサルプライマーの結合部位、またはこれらの任意の組合せを含み、
    複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードの細胞標識配列が、同一の配列を含む、請求項１６１〜２３１のいずれか１項に記載の組成物。
  233. 標的結合領域が、ポリ（ｄＴ）領域を含む、請求項１６１〜２３２のいずれか１項に記載の組成物。
  234. 複数のバーコードの少なくとも１００個の分子標識配列が、異なる配列を含む、請求項１６１〜２３３のいずれか１項に記載の組成物。
  235. 複数のバーコードの少なくとも１０００個の分子標識配列が、異なる配列を含む、請求項１６１〜２３４のいずれか１項に記載の組成物。
  236. 複数のバーコードの少なくとも１００００個の分子標識配列が、異なる配列を含む、請求項１６１〜２３５のいずれか１項に記載の組成物。
  237. 複数のバーコードの分子標識配列が、ランダム配列を含む、請求項１６１〜２３６のいずれか１項に記載の組成物。
  238. 標的結合領域が、遺伝子特異的配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ランダム多量体、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１６１〜２３７のいずれか１項に記載の組成物。
  239. ヌル粒子を含む、請求項１６１〜２３８のいずれか１項に記載の組成物。
  240. ヌル粒子が、磁気特性を含まない、請求項２３９に記載の組成物。
  241. ヌル粒子が、核結合試薬に特異的に結合することができる試薬を含まない、請求項２３９〜２４０のいずれか１項に記載の組成物。
  242. ヌル粒子が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む、請求項２３９〜２４１のいずれか１項に記載の組成物。
  243. 遊離した第１のエピトープを含み、遊離した第１のエピトープが、第１のエピトープのすべてまたは一部分を占める、請求項１６１〜２４２のいずれか１項に記載の組成物。
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