JP2021529770A - 薬物送達のための組成物およびその使用方法 - Google Patents

薬物送達のための組成物およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

人工多能性幹細胞に由来し、治療剤を含む巨核球および血小板を産生するための方法が提供される。本開示はさらに、血小板または巨核球に治療剤を負荷するための、および作用物質を発現するように血小板または巨核球を遺伝学的に改変するための方法および組成物を提供する。本開示は、薬物送達のための、改変された巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板および血小板の組成物、それを産生するための方法、およびそれを使用する方法に関する。

Description

政府支援に関する記載
この研究は、以下の国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金、助成金番号：１Ｒ４４ＨＬ１３１０５０−０１、１Ｒ４３ＡＩ１２５１３４−０１Ａ１、および１ＳＢ１ＨＬ１３７５９１−０１により支援されたものである。政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
関連出願
本出願は、その全体がこれによって参照により本明細書に組み込まれる２０１８年６月２９日出願の米国仮出願第６２／６９２，２７７号の利益および優先権を主張する。
本開示は、薬物送達のための、改変された巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）、プレ血小板（ｐｒｅｐｌａｔｅｌｅｔ）および血小板の組成物、それを産生するための方法、およびそれを使用する方法に関する。
血小板は、活発な出血の部位における血餅形成および血管修復に関与する血液細胞である。生理的に、血小板は、骨髄において、骨髄中の細胞の＜０．１％を構成する巨核球（ＭＫ）と称される親細胞によって産生される。成熟ＭＫは、骨髄内の洞様血管の外に位置し、血小板前駆体（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）と称される長い構造が循環中に伸長している。血小板前駆体は、血小板産生のためのアセンブリラインとして機能し、それらの末端から血小板を逐次的に放出させる。
現在、血小板はもっぱらヒト志願者ドナーから得られ、欠乏がよく起こる。ドナー血小板間での広範な機能の変動性が、輸血の有効性を制限している。増え続ける血小板需要は、現状の供給量を約２０％超えており、緊急時には限られた血小板単位の在庫がすぐに枯渇する。
治療薬物の標的部位への効率的な送達は、治療有効性を最大化し、副作用を最小化するのに望ましい。様々なナノ粒子ベースの手法が、その強化された透過性および保持（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ；ＥＰＲ）効果のために、小分子の組織標的化送達を改善するために進展しているにもかかわらず、ナノ粒子手法は、タンパク質ベースの治療剤、例えば凝血因子またはＡｂ薬物のパッケージングにおいて、それらのサイズがより大きいために成功したことがない。さらに、ほとんどの標的化部位で、注射されたナノ粒子の約１％未満しか蓄積せず、繰り返しの注射で、ナノ製剤の一部の構成成分（例えばＰＥＧ）に対する有害な免疫応答が有効性を弱める可能性がある（Wilhelm Sea. Analysis of nanoparticle delivery to tumors. Nat Rev Mater. 2016; 1:16014）。組織標的化薬物送達をさらに増強するために、特定にはタンパク質ベースの治療剤のために、既存の生理学的プロセスを強化する新しい方法が緊急に求められている。
現在の、さらには計画された血小板の必要性を満たすための、加えて、薬物送達のための新しいビヒクルの産生のための、成分が明確な血小板単位のオンデマンド式の血小板産生のための方法が必要である。
Ｗｉｌｈｅｌｍ Ｓｅａ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍａｔｅｒ．（２０１６）１：１６０１４
一部の態様において、本開示は、薬物送達のためのｉＰＳＣ由来ｐｒｅＭＫ、ＭＫ、血小板前駆体、プレ血小板および血小板の組成物および使用方法を対象とする。
一部の態様において、治療剤を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来細胞を産生するための方法であって、第１の培養培地中で、多能性細胞を造血性内皮細胞に分化させるステップ；第２の培養培地中で、造血性内皮細胞を巨核球前駆細胞に分化させるステップ；巨核球前駆細胞を成熟巨核球に分化させるステップ；成熟巨核球を、血小板を産生するのに十分な条件下で分化させるステップを含み、血小板、巨核球、もしくは巨核球前駆細胞またはそれらの組合せのうち１つは、治療剤を含む、方法が提供される。
一部の実施形態において、巨核球は、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋である。一部の実施形態において、血小板は、活性化状態での、ＣＤ６１＋、ＤＲＡＱ−、カルセインＡＭ＋、ＣＤ４２ａ＋、およびＣＤ６２Ｐ＋のうちの１つまたは複数であり得る。血小板は、ＧＰＶＩを発現していなくてもよい。
血小板、巨核球、または巨核球前駆細胞は、例えば、受容体が媒介する負荷、受動的な負荷、または共有結合によるコンジュゲーションによって、治療剤が負荷されていてもよい。受動的な負荷は、治療剤を、血小板、巨核球、または巨核球前駆細胞を含む細胞懸濁物とインキュベートすることを含み得る。共有結合によるコンジュゲーションは、膜タンパク質とスルフヒドリル反応性架橋剤とのチオール化、アルキン反応性アジ化物、高親和性結合剤、および膜に結合したエピトープへの抗体のドッキングを含んでもよい。共有結合によるコンジュゲーションは、治療剤中に存在するアミンを、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）と反応させることを含んでいてもよい。
治療剤は、ケモカイン、サイトカイン、増殖因子、ポリペプチド、抗血管形成剤、ポリヌクレオチド、または小分子であってもよい。抗血管形成剤は、ドキソルビシン、ビンクリスチン、イリノテカン、またはパクリタキセルであってもよい。アテゾリズマブ、イピリムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、またはトラスツズマブであってもよい。小分子は、アリピプラゾール、エソメプラゾール、またはロスバスタチンであってもよい。増殖因子は、血小板由来増殖因子アイソフォーム（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢおよび−ＢＢ）、形質転換増殖因子−ｂ（ＴＧＦ−ｂ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、骨形成タンパク質２、−４もしくは−６（ＢＭＰ−２、−４、−６）、フォン・ヴィルブランド因子、ケラチノサイト増殖因子、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、上皮増殖因子、または毛髪増殖因子であってもよい。サイトカインは、インターロイキン１−ベータ、インターロイキン２、またはインターロイキン１２であってもよい。
一部の態様において、治療剤を含む、ＩＰＳＣｃ由来細胞、例えばｐｒｅＭＫ、ＭＫ、血小板前駆体、プレ血小板または血小板が提供される。一部の実施形態では、このような細胞は、治療剤が負荷されていてもよいし、または治療剤とコンジュゲートしていてもよい。一部の実施形態では、このような細胞は、治療剤を発現するように遺伝子操作されていてもよい。また、治療剤を含む、ＩＰＳＣｃ由来細胞、例えばｐｒｅＭＫ、ＭＫ、血小板前駆体、プレ血小板または血小板を含む組成物も提供される。一部の実施形態では、治療剤を含む、ＩＰＳＣｃ由来細胞、例えばｐｒｅＭＫ、ＭＫ、血小板前駆体、プレ血小板または血小板を含む治療有効量の組成物を投与することを含む、被験体を処置する方法がある。
本開示を、以下の詳細な説明において、例示的な実施形態の非限定的な例として記載されている複数の図を参照して記載し、ここで、同様の参照番号はいくつかの図の表示全体を通して同様の部分を表す。
図１は、ｉＰＳＣ株からの巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）、巨核球（ＭＫ）、および血小板（ＰＬＴ）のスケーラブルな分化に関する全体的な概略図を示す。 図２は、２Ｄでの多能性幹細胞から巨核球への例示的な定方向分化プロトコール、細胞培養プレートまたはフラスコなどのマトリクス依存性系を示す図である。 図３は、撹拌槽中での自己凝集性ｉＰＳＣ由来スフェロイドを使用する定方向分化の例示的な３Ｄマトリクス非依存性方法の概略図である。 図４は、３Ｄマトリクス依存性方法である充填層バイオリアクター戦略を使用した、ｉＰＳＣの巨核球前駆細胞への例示的な定方向分化プロトコールを示す概略図である。本明細書に記載の実施形態では、ＰＴＦＥ製のラミニン５２１がコーティングされたラシヒリングを、充填層を構成するためのマクロキャリアとして使用する。 図５は、ｈｉＰＳＣから巨核球および血小板へのｉＰＳＣ定方向分化のプロセスを示す。細胞には、分化のｐｒｅ−ＭＫ、ＭＫ、およびＰＬＴステージにおける小分子、生物製剤、ヌクレオチド、および他のタイプの薬物分子を負荷することができる。 図６は、一部の実施形態では治療作用のための、抗体の共有結合による連結によって血小板を改変するためのプロセスの概略図である。 図７は、生物学的薬物の産生、それに続くｈｉＰＳＣから巨核球および血小板への定方向分化のための、導入遺伝子を発現させるためのｉＰＳＣ遺伝子操作のプロセスを示す。ｈｉＰＳＣへの導入遺伝子送達のためのウイルス形質導入および他の方法は、ｐｒｅ−ＭＫ、ＭＫ、およびＰＬＴにおける効率的な転写および翻訳を伴う薬物として使用することができる生物製剤の安定な発現をもたらすために使用することができる。 図８Ａ〜８Ｃは、様々な増殖培地を使用した、組換えビトロネクチンでの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の増大を示す。図８Ａは、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中でのｉＰＳＣ成長を示す。図８Ｂは、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地中でのｉＰＳＣ成長を示す。図８Ｃは、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ ＸＦ培地中でのｉＰＳＣ成長を示す。 図９Ａ〜９Ｃは、様々な増殖培地を使用して組換えビトロネクチンで増大したｉＰＳＣでの、多能性マーカーであるＴｒａ−１−６０、ＳＳＥＡ５、および分化マーカーであるＳＳＥＡ１の発現を評価するフローサイトメトリーデータを示す。図９Ａは、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中で増大したｉＰＳＣからの多能性マーカーデータを示す。図９Ｂは、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地中で増大したｉＰＳＣからの多能性マーカーデータを示す。図９Ｃは、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ ＸＦ培地中で増大したｉＰＳＣからの多能性マーカーデータを示す。 図１０Ａ〜１０Ｃは、高効率の単一細胞継代技術の結果を示す。図１０Ａは、細胞２×１０４個／ｃｍ２の標準化したプレーティング密度を使用した高効率の単一細胞継代技術の成長再現性を示すグラフである。Ｐ２、Ｐ４、およびＰ５は、継代２、継代４、および継代５を意味する。図１０Ｂは、極低温での凍結後に解凍した細胞の画像であり、一様の未分化の形態を示す。図１０Ｃは、高効率の単一細胞継代技術を使用して調製された多能性細胞のＳＳＥＡ−５およびＴＲＡ−１−６０細胞表面マーカーの＞９９％の共発現を実証するＦＡＣＳ分析である。 図１１Ａ〜１１Ｃは、３Ｄ撹拌槽（マトリクス不含）における自己凝集性スフェロイド培養物中のｉＰＳＣの増大を示す。図１１Ａは、培養物中の経時的なｉＰＳＣスフェロイドの顕微鏡画像を示す。図１１Ｂは、ｉＰＳＣスフェロイド培養物における経時的な細胞密度の増加を示す。図１１Ｃは、３Ｄ培養物中の経時的な平均ｉＰＳＣスフェロイドサイズを示す。 図１２Ａおよび図１２Ｂは、３Ｄ撹拌槽（マトリクス不含）における自己凝集性スフェロイド培養物中の増大したｉＰＳＣでの、多能性マーカーであるＴｒａ−１−６０、ＳＳＥＡ５、および分化マーカーであるＳＳＥＡ１の発現を評価するフローサイトメトリーデータを示す。図１２Ａは、３Ｄ撹拌槽における単回の７日の増大後のｉＰＳＣの多能性マーカーデータを示す。図１２Ｂは、３Ｄ撹拌槽における４回の連続した６〜７日間にわたる増大後のｉＰＳＣの多能性データを示す。 図１３Ａおよび図１３Ｂは、多能性因子であるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇについて免疫染色し、核色素を用いて対比染色したｉＰＳＣを示す。図１３Ａは、ビトロネクチンで成長したｉＰＳＣの２Ｄコロニーの一部を示す。図１３Ｂは、３Ｄ撹拌条件（マトリクス不含）において成長したｉＰＳＣのスフェロイドを示す。 図１４は、３Ｄ撹拌槽における４回の連続した６〜７日間にわたる増大で成長させたｉＰＳＣから伝播した中期染色体の核型解析を示し、４回の３Ｄ継代後の正常な核型を実証する。 図１５は、２Ｄ培養容器中、ＩＶ型コラーゲンマトリクスにおける造血性内皮への、６日間のｉＰＳＣのステージ１分化にわたって生じる形態学的変化を示す。スケールバーは、１００μｍを表す。 図１６Ａおよび図１６Ｂは、ｉＰＳＣ由来細胞の代表的なステージ１分化データを示す。図１６Ａは、分化の６日目におけるｉＰＳＣ由来細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。造血性内皮細胞は、ＣＤ３１およびＣＤ３４の細胞表面発現を介して同定される。図１６Ｂは、４１の独立したｉＰＳＣ定方向分化にわたるステージ１（６日目）分化効率の平均および範囲を示す。 図１７Ａ〜１７Ｃは、ｉＰＳＣ分化培養からの代表的なステージ２データを示す。図１７Ａは、６＋６日目のステージ２培養物を示し、造血性内皮（ＨＥ）単層が背景にあり、巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）が単層から懸濁物中に放出されている（矢印で示される）。図１７Ｂは、ステージ２懸濁細胞のフローサイトメトリー分析を示し、ＣＤ４３＋造血前駆細胞が同定される。図１７Ｃは、ＣＤ４３＋造血細胞のフローサイトメトリー分析を示し、ＣＤ４３＋ＣＤ４１＋ＣＤ１４−巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）が同定される。混入しているＣＤ４３＋ＣＤ１４＋骨髄系前駆細胞もこの分析で同定される。 図１７Ａ〜１７Ｃは、ｉＰＳＣ分化培養からの代表的なステージ２データを示す。図１７Ａは、６＋６日目のステージ２培養物を示し、造血性内皮（ＨＥ）単層が背景にあり、巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）が単層から懸濁物中に放出されている（矢印で示される）。図１７Ｂは、ステージ２懸濁細胞のフローサイトメトリー分析を示し、ＣＤ４３＋造血前駆細胞が同定される。図１７Ｃは、ＣＤ４３＋造血細胞のフローサイトメトリー分析を示し、ＣＤ４３＋ＣＤ４１＋ＣＤ１４−巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）が同定される。混入しているＣＤ４３＋ＣＤ１４＋骨髄系前駆細胞もこの分析で同定される。 図１８Ａおよび図１８Ｂは、ステージ２懸濁細胞の平均組成特徴を示す。図１８Ａは、１０日間のステージ２にわたり放出されたｐｒｅＭＫの平均の毎日の純度（すなわち生存可能な懸濁細胞の％ＣＤ４１＋ＣＤ４３＋ＣＤ１４−）を示す。図１８Ｂは、１０日間のステージ２にわたる混入している骨髄系前駆細胞（すなわち生存可能な懸濁細胞の％ＣＤ４３＋ＣＤ１４＋）の中央値、四分位数、および範囲を示す。全ての培養を、２Ｄ容器中、ＩＶ型コラーゲンマトリクスにおいてｉＰＳＣを用いて開始させた。データは、４１の独立した分化を表す。 図１９Ａおよび図１９Ｂは、放出されたｐｒｅＭＫの収量を示す。図１９Ａは、ｉＰＳＣを用いて開始したステージ２定方向分化培養の間の６ウェル等価物（すなわち培地２ｍｌ、表面積９．５ｃｍ２）当たりの放出されたｐｒｅＭＫ（すなわち生存ＣＤ４１＋ＣＤ４３＋ＣＤ１４−）の平均の毎日の収量を示す。図１９Ｂは、ｉＰＳＣを用いて開始したステージ２定方向分化培養の６＋４日目から６＋８日目の間の、６ウェル等価物（すなわち培地２ｍｌ、表面積９．５ｃｍ２）当たりの放出されたｐｒｅＭＫ（すなわち生存可能なＣＤ４１＋ＣＤ４３＋ＣＤ１４−）の累積収量を示す。各ドットは、２Ｄ培養容器中、ＩＶ型コラーゲンマトリクスにおける独立したｉＰＳＣ定方向分化培養を表す。 図２０Ａ〜２０Ｄは、ステージ３におけるＭＫ分化および血小板前駆体産生を示す。図２０Ａは、ステージ３の１日目におけるｉＰＳＣ由来巨核球前駆細胞を示す（上のパネル：高倍率；下のパネル：低倍率）。図２０Ｂは、ステージ３の２日目における成熟中の巨核球を示す（上のパネル：高倍率；下のパネル：低倍率）。図２０Ｃは、ステージ３の４日目における成熟巨核球を示す（上のパネル：高倍率；下のパネル：低倍率）。図２０Ｄは、４日間のステージ３培養後の成熟ｉＰＳＣ由来ＭＫからの自発的な血小板前駆体形成を例示する。矢印は、血小板前駆体を示す。５０μｍのスケールバーは全ての図面に適用される。 図２１Ａ〜２１Ｃは、ｉＰＳＣから開始した３日目のステージ３培養からの代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図２１Ａは、ステージ３細胞のＣＤ６１＋（巨核球）画分を同定する。図２１Ｂは、ＣＤ６１＋巨核球細胞のフローサイトメトリー分析を示し、ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ＋成熟ＭＫを同定する。アポトーシス性ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ−細胞もこの分析で同定することができる。図２１Ｃは、代表的なステージ３培養のサブセット内訳を示す。非ＭＫは、ＣＤ６１−であり、未成熟ＭＫは、ＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ−ＣＤ４２ｂ−であり、アポトーシス性ＭＫは、ＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ−であり、成熟ＭＫは、ＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ＋である。 図２２Ａおよび図２２Ｂは、ｉＰＳＣの自己凝集性スフェロイドを用いて開始したステージ０およびステージ１分化を示す。図２２Ａは、−１日目の単一細胞に解離させたｉＰＳＣから始まり、０日目の自己凝集したｉＰＳＣスフェロイド、３日目の部分的に分化したスフェロイド、および６日目の造血性内皮細胞を含有する完全に分化したスフェロイドの一連の顕微鏡写真を示す。図２２Ｂは、この手法を使用した成功したＣＤ３１＋ＣＤ３４＋造血性内皮分化を示す６日目のフローサイトメトリーデータを示す。 図２３Ａおよび２３Ｂは、単一細胞ｉＰＳＣ継代手法を使用して増大および回収した培養物が、６ウェルの超低接着性プレートで本発明者らの３Ｄ懸濁物分化方法を使用して、３Ｄスフェロイドに自己凝集し、ｐｒｅＭＫ＋細胞に効果的に分化できたことを示す。図２３Ａは、凝集し（Ｄ０）、造血性内皮に分化した（Ｄ６）単一細胞の増大培養物の画像を示す。図２３Ｂは、従前のＥＤＴＡ継代ｉＰＳＣ培養物（Ｈ）と比較した、単一細胞継代ｉＰＳＣ（ＳＣ）を用いたステージ２中のｐｒｅＭＫ＋産生を示す。 図２４Ａ〜２４Ｄは、ｉＰＳＣの自己凝集性スフェロイドを用いて開始した定方向分化におけるステージ２を記載する。図２４Ａは、スフェロイドから懸濁物中に放出されたｐｒｅＭＫ（矢印で示される）を用いた定方向分化のステージ２中の６＋４日目における自己凝集したｉＰＳＣ由来スフェロイドを示す。「ＨＥ」は、造血性内皮単層を指す。図２４Ｂは、ｐｒｅＭＫマーカーであるＣＤ４１およびＣＤ４３について染色した、回収された懸濁細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図２４Ｃおよび２４Ｄは、従前の２Ｄデータを、２つの異なる３Ｄ系である、オービタルシェーカー上の超低接着性容器、およびスピナーフラスコからのデータと比較する。図２４Ｃは、ステージ２における経時的なｐｒｅＭＫ純度を示す。図２４Ｄは、ステージ２における経時的なｐｒｅＭＫ収量を示す。 図２４Ａ〜２４Ｄは、ｉＰＳＣの自己凝集性スフェロイドを用いて開始した定方向分化におけるステージ２を記載する。図２４Ａは、スフェロイドから懸濁物中に放出されたｐｒｅＭＫ（矢印で示される）を用いた定方向分化のステージ２中の６＋４日目における自己凝集したｉＰＳＣ由来スフェロイドを示す。「ＨＥ」は、造血性内皮単層を指す。図２４Ｂは、ｐｒｅＭＫマーカーであるＣＤ４１およびＣＤ４３について染色した、回収された懸濁細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図２４Ｃおよび２４Ｄは、従前の２Ｄデータを、２つの異なる３Ｄ系である、オービタルシェーカー上の超低接着性容器、およびスピナーフラスコからのデータと比較する。図２４Ｃは、ステージ２における経時的なｐｒｅＭＫ純度を示す。図２４Ｄは、ステージ２における経時的なｐｒｅＭＫ収量を示す。 図２５Ａ〜２５Ｃは、ｉＰＳＣの自己凝集性スフェロイドから開始した３Ｄマトリクス非依存性培養からのステージ３ＭＫ分化を示す。図２５Ａは、３日目のステージ３培養からの代表的なフローサイトメトリー分析を示し、ステージ３細胞のＣＤ６１＋（巨核球）画分が同定され、続いてＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ＋成熟ＭＫが同定される。アポトーシス性ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ−細胞もこの分析で同定することができる。図２５Ｂは、代表的なステージ３培養のサブセット内訳を示す。非ＭＫは、ＣＤ６１−であり、未成熟ＭＫは、ＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ−ＣＤ４２ｂ−であり、アポトーシス性ＭＫは、ＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ−であり、成熟ＭＫは、ＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ＋である。図２５Ｃは、３日目のステージ３培養内の成熟ＭＫ画分を、２Ｄ（マトリクス依存性）手法と３Ｄ（マトリクス非依存性）手法との間でどのように比較するかを示す。 図２５Ａ〜２５Ｃは、ｉＰＳＣの自己凝集性スフェロイドから開始した３Ｄマトリクス非依存性培養からのステージ３ＭＫ分化を示す。図２５Ａは、３日目のステージ３培養からの代表的なフローサイトメトリー分析を示し、ステージ３細胞のＣＤ６１＋（巨核球）画分が同定され、続いてＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ＋成熟ＭＫが同定される。アポトーシス性ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ−細胞もこの分析で同定することができる。図２５Ｂは、代表的なステージ３培養のサブセット内訳を示す。非ＭＫは、ＣＤ６１−であり、未成熟ＭＫは、ＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ−ＣＤ４２ｂ−であり、アポトーシス性ＭＫは、ＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ−であり、成熟ＭＫは、ＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ＋である。図２５Ｃは、３日目のステージ３培養内の成熟ＭＫ画分を、２Ｄ（マトリクス依存性）手法と３Ｄ（マトリクス非依存性）手法との間でどのように比較するかを示す。 図２６は、３Ｄ自己凝集性スフェロイド分化培養から回収された成熟ＭＫの血小板前駆体伸長を示す。血小板前駆体伸長の例は、矢印で示される。 図２７Ａ〜２７Ｄは、２つの関連する３Ｄ分化プラットフォームにおいて可溶性ラミニン５２１を添加したときの増加したｐｒｅＭＫ収量を示す。図２７Ａは、撹拌なしの超低接着性Ｕ底９６ウェルプレートにおけるＳｔｅｍＦｌｅｘ中でのｉＰＳＣ凝集中（−１日目）の、ラミニン５２１添加有りまたは無しのステージ２の６＋６日目におけるウェル当たりのｐｒｅＭＫ数を示す。図２７Ｂは、撹拌なしの超低接着性Ｕ底９６ウェルプレートにおける、ステージ１からステージ２（６日目）に移行する間のラミニン５２１添加有りまたは無しのステージ２の６＋６日目におけるウェル当たりのｐｒｅＭＫ数を示す。図２７Ｃは、オービタルシェーカー上の超低接着性６ウェルプレートにおける、ＳｔｅｍＦｌｅｘ中でのｉＰＳＣ凝集の間（−１日目）またはステージ１からステージ２（６日目）に移行する間の、ラミニン５２１添加有りまたは無しのステージ２の６＋６日目における１ｍｌ当たりのｐｒｅＭＫ数を示す。図２７Ｄは、撹拌なしの超低接着性Ｕ底９６ウェルプレートにおける、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ中の単一の細胞継代ｉＰＳＣ凝集（−１日目）の間におけるラミニン５２１添加有りまたは無しのステージ２の６＋５日目における１ｍｌ当たりのｐｒｅＭＫ数を示す。 図２８Ａ〜２８Ｄは、ステージ１の培地因子であるＢＭＰ４、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦＡの添加の順番およびタイミングを調整するために実行した実験を示す。図２８Ａは、実験Ａで試験したステージ１の条件の概略図である。図２８Ｂは、パネルＡに記載される培養の６＋４日目に観察されたステージ２のｐｒｅｍＫの収量を示す。図２８Ｃは、実験Ｂで試験したステージ１の条件の概略図である。図２８Ｄは、パネルＣに記載される培養で観察されたステージ２のｐｒｅＭＫ収量を示す。この図におけるデータは、分化のステージ１が、分化のステージ２に移行する前にＢＭＰ４を単独で２４時間、続いてｂＦＧＦおよびＶＥＧＦＡを５日間使用して効果的に進行できることを示唆する。 図２８Ａ〜２８Ｄは、ステージ１の培地因子であるＢＭＰ４、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦＡの添加の順番およびタイミングを調整するために実行した実験を示す。図２８Ａは、実験Ａで試験したステージ１の条件の概略図である。図２８Ｂは、パネルＡに記載される培養の６＋４日目に観察されたステージ２のｐｒｅｍＫの収量を示す。図２８Ｃは、実験Ｂで試験したステージ１の条件の概略図である。図２８Ｄは、パネルＣに記載される培養で観察されたステージ２のｐｒｅＭＫ収量を示す。この図におけるデータは、分化のステージ１が、分化のステージ２に移行する前にＢＭＰ４を単独で２４時間、続いてｂＦＧＦおよびＶＥＧＦＡを５日間使用して効果的に進行できることを示唆する。 図２９Ａ〜２９Ｃは、ラミニン５２１での６日目のステージＩ培養物の免疫蛍光顕微鏡画像を示す。図２９Ａは、ＷＮＴアゴニストを伴わない対照培養物を示す。図２９Ｂは、ステージ１の最初の４８時間にわたって０．６μＭのＷＮＴアゴニストＣＨＩＲ９８０１４を分化培養物に添加した培養物を示す。図２９Ｃは、ステージ１の最初の４８時間にわたって６μＭのＷＮＴアゴニストＣＨＩＲ９９０２１を分化培養物に添加した培養物を示す。 図３０Ａおよび３０Ｂは、ラミニン５２１での６＋４日目のステージ２培養物の免疫蛍光顕微鏡画像を示す。図２７Ａは、ＷＮＴアゴニストを伴わない対照培養物を示す。図２７Ｂは、ステージ１の最初の４８時間に０．６μＭのＷＮＴアゴニストＣＨＩＲ９８０１４を添加した培養物を示す。 図３１は、３日目および６日目におけるラミニン５２１がコーティングされたラシヒリングでのｉＰＳＣのステージ１分化を示す。スケールバーは、５００μｍを表す。 図３２は、６＋０日目（１００μｍのスケールバー）および６＋４日目（５００μｍのスケールバー）におけるラミニン５２１がコーティングされたラシヒリングでのｉＰＳＣのステージ２分化を示す。 図３３Ａ〜３３Ｃは、ラシヒリング支持体で効率的に進行するｉＰＳＣ分化のステージからのフローサイトメトリーデータを示す。図３３Ａは、６日目のステージ１を示し、造血性内皮のマーカーであるＣＤ３１およびＣＤ３４についてのフローサイトメトリー染色を伴う。図３３Ｂは、６＋２日目のステージ２を示し、巨核球前駆細胞マーカーであるＣＤ４３およびＣＤ４１についてのフローサイトメトリー染色を伴う。図３３Ｃは、６＋３＋３日目のステージ３を示し、ＣＤ６１およびＣＤ４２ｂについてのフローサイトメトリー染色を伴う。 図３４Ａ〜３４Ｄは、免疫染色したｉＰＳＣ由来巨核球を示す。図３４Ａは、巨核球特異的タンパク質β１−チューブリンについて免疫染色した巨核球を示す顕微鏡写真である。図３４Ｂは、核酸染色によって可視化した巨核球の核を示す顕微鏡写真である。図３４Ｃは、図３４Ａおよび３４Ｂのマージされた画像を示す顕微鏡写真である。図３４Ｄは、免疫染色した巨核球の位相差画像である。各図につき、スケールバーは２５μｍを表す。 図３５Ａ〜３５Ｆは、免疫染色したｉＰＳＣ由来巨核球を示す。図３５Ａは、α顆粒特異的タンパク質である血小板因子４（ＰＦ４）について免疫染色したｉＰＳＣ由来巨核球を示す顕微鏡写真である。図３５Ｂは、免疫染色した核を有するｉＰＳＣ由来巨核球を示す顕微鏡写真である。図３５Ｃは、α顆粒特異的タンパク質であるフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）について免疫染色したｉＰＳＣ由来巨核球を示す顕微鏡写真である。図３５Ｄは、巨核球特異的細胞表面マーカーであるＣＤ６１について免疫染色したｉＰＳＣ由来巨核球を示す顕微鏡写真である。図３５Ｅは、図３５Ａ、３５Ｂ、および３５Ｃの重ねられた画像を示す顕微鏡写真である。図３５Ｆは、図３５Ａ、３５Ｂ、および３５Ｄの重ねられた画像を示す顕微鏡写真である。各図につき、スケールバーは２５μｍを表す。 図３６Ａ〜３６Ｆは、免疫染色したｉＰＳＣ由来巨核球を示す。図３６Ａは、高密度顆粒特異的タンパク質であるＬＡＭＰ１について免疫染色したｉＰＳＣ由来巨核球を示す顕微鏡写真である。図３６Ｂは、免疫染色した核を有するｉＰＳＣ由来巨核球を示す顕微鏡写真である。図３６Ｃは、高密度顆粒特異的タンパク質であるセロトニンについて免疫染色したｉＰＳＣ由来巨核球を示す顕微鏡写真である。図３６Ｄは、巨核球特異的細胞表面マーカーであるＣＤ６１について免疫染色したｉＰＳＣ由来巨核球を示す顕微鏡写真である。図３６Ｅは、図３６Ａ、３６Ｂ、および３６Ｃの重ねられた画像を示す顕微鏡写真である。図３６Ｆは、図３６Ａ、３６Ｂ、および３６Ｄの重ねられた画像を示す顕微鏡写真である。各図につき、スケールバーは２５μｍを表す。 図３７Ａ〜３７Ｄは、ｉＰＳＣ由来巨核球を示す電子顕微鏡画像である。図３７Ａは、微小粒子を産生するｉＰＳＣ由来巨核球を示す電子顕微鏡画像である（例えば矢印を参照）。図３７Ｂは、ｉＰＳＣ由来巨核球および多小胞体を示す電子顕微鏡画像である（矢印；挿入図において拡大されている）。図３７Ｃは、多形核、グリコーゲン顆粒、アルファ顆粒、および陥入膜系を特徴とするｉＰＳＣ由来巨核球を示す電子顕微鏡画像である。図３７Ｄは、ｉＰＳＣ由来巨核球の小胞体およびミトコンドリアを示す電子顕微鏡画像である。 図３８Ａおよび図３８Ｂは、ｉＰＳＣから巨核球への定方向分化の過程で生じる特徴的な遺伝子発現の変化を例示する。全ての発現分析について、ｉＰＳＣにおける発現を１に設定し、全ての他の発現値は相対的に表される。図３８Ａは、ｉＰＳＣ、６日目の細胞（ステージ１の最後）、６＋４および６＋５日目（ステージ２）、ならびに６＋５＋１日目から６＋５＋４日目まで（ステージ３）における、多能性関連遺伝子であるＯｃｔ４の相対的な遺伝子発現を例示する。図３８Ｂは、ｉＰＳＣ、６日目の細胞（ステージ１の最後）、６＋４および６＋５日目（ステージ２）、ならびに６＋５＋１日目から６＋５＋４日目まで（ステージ３）における、巨核球成熟化にとって重要な転写因子であるＮＦＥ２の相対的な遺伝子発現を例示する。 図３９は、分化の間下方制御されるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＺＦＰ４２、分化の間上方制御されるＺＦＰＭ１、ＮＦＥ２、ＲＵＮＸ１、ＭＥＩＳ１、およびＧＡＴＡ１、ならびに実質的に一貫したレベルで残存するＰＢＸ１およびＭＹＣを示すヒートマップである。 図４０Ａ〜４０Ｃは、ｉＰＳＣ由来巨核球のサイズ分布を提供する。図４０Ａは、ｉＰＳＣ−ＭＫのサイズ測定値を収集し、他の供給源からのＭＫと比較するために利用したｉＰＳＣ由来巨核球のβ１−チューブリン染色の代表的な例を示す。図４０Ｂは、中央値、四分位数、および範囲を含めたｉＰＳＣ由来巨核球のサイズ分布を示す。図４０Ｃは、ｉＰＳＣ由来ＭＫのサイズ分布データを種々の骨髄供給源に由来する巨核球と比較したものである。 図４１Ａおよび図４１Ｂは、ｉＰＳＣ由来巨核球に対する倍数性測定値を提供する。図４１Ａは、ｉＰＳＣ由来巨核球に実行されたＤＮＡ倍数性測定値の代表的な例を示す。図４１Ｂは、ｉＰＳＣ−ＭＫのＤＮＡ倍数性測定値を他の供給源に由来するＭＫと比較したものである。 図４２は、本開示の方法により得られた巨核球のｈｉＰＳＣ−ＭＫ溶解物およびある特定の対照における様々な因子の存在または非存在および濃度範囲の比較を提供する。「＊」は、巨核球または血小板においてこれまでに記載されていなかったｈｉＰＳＣ−ＭＫにおいて測定されたタンパク質を意味し、「￥」は、炎症性サイトカインを意味する。 図４３Ａおよび図４３Ｂは、ｈｉＰＳＣ血小板産生を示す。図４３Ａは、無核細胞および有核細胞のフローサイトメトリー分析を示す（上、左）。有核細胞は、多数のＣＤ４１＋ＣＤ４２＋巨核球（上、右）を含有した。ＣＤ４１＋、ＣＤ４２＋、およびカルセインＡＭについて陽性の無核細胞をフローサイトメトリーを使用して評価し、血小板をサイズ（１〜５ミクロン）によってゲーティングした。図４３Ｂは、本明細書に記載される定方向分化プロトコールのステージ３の間のウェル当たりのＣＤ４１＋ＣＤ４２＋カルセインＡＭ＋血小板サイズの粒子の累積収量を示すグラフである。 図４４Ａおよび図４４Ｂは、休止した、および活性化された血小板を示す。図４４Ａは、電子顕微鏡法によって評価された巨核球培養物から回収された血小板の画像を含む。図４４Ｂは、Ｆ−アクチン染色によって解明されたように、β１−チューブリンのコイルおよびＣＤ６１発現が、休止血小板の特徴的な特色であること、および葉状仮足および糸状偽足が、活性化された血小板に特徴的であることを示す顕微鏡写真を含む。 図４５は、ヒトｉＰＳＣ由来血小板の免疫表現型検査の特徴付けの完全なパネルである。一番右上のパネルは、細胞の前方散乱対側方散乱プロファイルを示す。次いでこれらの細胞は、複数のパラメーターについて評価する前に、ゲノム材料と血小板表面マーカーであるＣＤ６１（上の右のパネル）の欠如を示すＤＲＡＱ−でゲーティングする（上の中央のパネル）。ゲーティングされた細胞を前方散乱対側方散乱パラメーターについて再評価した（左の下のパネル）。これらもカルセインＡＭで染色して、生存率を評価した（下の２番目のパネル）。ゲーティングされた細胞はさらにＣＤ４２ａ発現についても調査し（３番目の下のパネル）、共通の血小板表面マーカーについてさらに調査した。これらを活性化のインジケーターであるＣＤ６２Ｐについても染色したところ（下の右のパネル）、これらの血小板が休止状態である証拠が得られた。 図４６Ａ〜４６Ｃは、ヒト全血由来のものと比べた、ｈｉＰＳＣ血小板集団における糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）の相対的な欠如を示す。図４６Ａは、ｈｉＰＳＣ血小板とドナー由来ヒト血小板との間の類似のサイズ（ＦＳＣ）および粒度（ＳＳＣ）の特徴を解明するＦＳＣ対ＳＳＣパラメーターを示す。図４６Ｂは、ｈｉＰＳＣ血小板とドナー由来ヒト血小板の両方におけるＣＤ６１発現のアバンダンスを示す。図４６Ｃは、ＣＤ６１＋ｈｉＰＳＣ血小板集団が、その細胞表面においてほとんどＧＰＶＩを欠いているが、ドナー由来ヒト血小板は、ほぼ例外なくＧＰＶＩ陽性であることを実証する。 図４７は、組換えヒト組織因子で処置した場合の経時的な水性緩衝液中のヒトｉＰＳＣ由来血小板および血漿中の一次血小板によるトロンビン生成のグラフである。 図４８Ａおよび図４８Ｂは、マウス精巣挙筋の細動脈における血餅形成のためのレーザー傷害モデルを使用して、ヒトｉＰＳＣ由来血小板が血栓に取り込まれることを実証するｉｎ ｖｉｖｏの顕微鏡写真である。図４８Ａは、レーザー傷害が行われた後の、および傷害部位近傍への血小板の近位輸注による、血栓に取り込まれたヒトドナー血小板（点線の囲み内の暗く丸い領域で示される）を示す。図４８Ｂは、同一なレーザー傷害モデルを使用した、血栓に取り込まれたヒトｉＰＳＣ由来血小板（点線の囲み内の暗く丸い領域）を示す。 図４９Ａ〜４９Ｉは、洗浄したドナー由来ヒト血小板への抗体の負荷を示す。図４９Ａは、この図のゲーティング戦略を定義するアイソタイプ抗体のシグナルを示す。図４９Ｂは、ＣＤ６１について排他的に染色された場合、洗浄したドナー由来ヒト血小板はほとんど例外なくＣＤ６１＋であることを示す。図４９Ｃは、血小板懸濁物中での共インキュベーション後におけるヒトＩｇＧ抗体にコンジュゲートしたＣＤ６１およびＣｙ５．５の両方の発現を示す。図４９Ｄは、ＩｇＧが負荷されたドナー由来ヒト血小板の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）での洗浄、遠心分離、および再懸濁後における、抗体が負荷されたドナー由来ヒト血小板におけるヒトＩｇＧ抗体にコンジュゲートしたＣＤ６１およびＣｙ５．５の共発現を示す。図４９Ｅは、抗体と血小板懸濁物との共インキュベーションによって負荷されたヒトＩｇＧ Ｃｙ５．５有りおよび無しの血小板ペレットの写真である。Ｃｙ５．５色素は、肉眼で見える。図４９Ｆは、洗浄したヒト血小板に取り込まれたヒトＩｇＧ Ｃｙ５．５の用量依存性の増加を示す。図４９Ｇは、図４９Ｆに示される蛍光シグナルの相乗平均をプロットした線グラフである。図４９Ｈは、血小板溶解物からのヒトＩｇＧ Ｃｙ５．５シグナルのマイクロプレートリーダー測定による、さらに、遊離のＣｙ５．５色素から作成した標準曲線から計算された、ドナー由来ヒト血小板中に封入されたヒトＩｇＧの定量化を示す。図４９Ｉは、ＦＤＡ承認抗体薬物であるアテゾリズマブのＤｙｌｉｇｈｔ−４９８コンジュゲートバージョンを使用した、ドナー由来ヒト血小板の抗体の負荷における類似の用量依存性漸増を示す。 図４９Ａ〜４９Ｉは、洗浄したドナー由来ヒト血小板への抗体の負荷を示す。図４９Ａは、この図のゲーティング戦略を定義するアイソタイプ抗体のシグナルを示す。図４９Ｂは、ＣＤ６１について排他的に染色された場合、洗浄したドナー由来ヒト血小板はほとんど例外なくＣＤ６１＋であることを示す。図４９Ｃは、血小板懸濁物中での共インキュベーション後におけるヒトＩｇＧ抗体にコンジュゲートしたＣＤ６１およびＣｙ５．５の両方の発現を示す。図４９Ｄは、ＩｇＧが負荷されたドナー由来ヒト血小板の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）での洗浄、遠心分離、および再懸濁後における、抗体が負荷されたドナー由来ヒト血小板におけるヒトＩｇＧ抗体にコンジュゲートしたＣＤ６１およびＣｙ５．５の共発現を示す。図４９Ｅは、抗体と血小板懸濁物との共インキュベーションによって負荷されたヒトＩｇＧ Ｃｙ５．５有りおよび無しの血小板ペレットの写真である。Ｃｙ５．５色素は、肉眼で見える。図４９Ｆは、洗浄したヒト血小板に取り込まれたヒトＩｇＧ Ｃｙ５．５の用量依存性の増加を示す。図４９Ｇは、図４９Ｆに示される蛍光シグナルの相乗平均をプロットした線グラフである。図４９Ｈは、血小板溶解物からのヒトＩｇＧ Ｃｙ５．５シグナルのマイクロプレートリーダー測定による、さらに、遊離のＣｙ５．５色素から作成した標準曲線から計算された、ドナー由来ヒト血小板中に封入されたヒトＩｇＧの定量化を示す。図４９Ｉは、ＦＤＡ承認抗体薬物であるアテゾリズマブのＤｙｌｉｇｈｔ−４９８コンジュゲートバージョンを使用した、ドナー由来ヒト血小板の抗体の負荷における類似の用量依存性漸増を示す。 図５０Ａおよび図５０Ｂは、洗浄したヒトＰＬＴへのアテゾリズマブの直接の負荷を実証する。図５０Ａは、適切な対照（ＩｇＧのみ）に加えてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗ヒトＩｇＧでのアテゾリズマブの取り込みを可視化した代表的な顕微鏡写真を含む。図５０Ｂは、ヒトドナー血小板における細胞内のアテゾリズマブおよびヒトドナー血小板へのアテゾリズマブの内在化を実証するための、より高い倍率で捕獲された顕微鏡写真を含む。 図５１Ａおよび図５１Ｂは、ヒトｉＰＳＣ由来血小板におけるイピリムマブの受動的な負荷を実証する。図５１Ａは、血小板懸濁物を含む反応容器中のイピリムマブの量を増加させた抗体シグナルの用量依存性の増加を示すフローサイトメトリーヒストグラムプロットである。図５１Ｂは、ＣＤ６１（表面マーカー）および血小板因子４、または顆粒マーカーであるＰＦ４についての抗体染色で観察されたヒトｉＰＳＣ由来血小板中およびその上の両方のイピリムマブを示す免疫蛍光顕微鏡写真である。 図５２Ａ〜５２Ｆは、ＣＤ３４＋動員末梢血液由来血小板における受動的な薬物負荷を記載する。図５２Ａは、前方散乱（サイズ）対側方散乱（粒度）によってプロットされた事象としての細胞を表示するフローサイトメトリードットプロットである。図５２Ｂは、ＣＤ３４＋動員末梢血液由来血小板のうちおよそ９０％のＣＤ６１＋細胞集団を示すフローサイトメトリードットプロットである。図５２Ｃは、ＣＤ３４＋動員末梢血液由来血小板に結合したＣｙ５．５コンジュゲートイピリムマブにおける用量依存性の増加を示すフローサイトメトリーヒストグラムプロットである。図５２Ｄは、血小板懸濁物に添加されたイピリムマブのピコグラム（ｐｇ）（血小板当たりの）によってプロットされた、Ｃｙ５．５コンジュゲートイピリムマブにおける用量依存性の増加の平均蛍光強度（相乗平均として計算した）をプロットした線グラフである。図５２Ｅは、ＣＤ３４＋動員末梢血液由来血小板に結合したイピリムマブの定量化である棒グラフである。図５２Ｆは、ＣＤ６１＋およびＰＦ４（血小板因子４）＋血小板におけるイピリムマブの分布を示す顕微鏡写真を含む。 図５３Ａ〜５３Ｄは、トロンビン活性化のときの血小板によるアテゾリズマブの取り込みおよび放出を示す。図５３Ａおよび図５３Ｂは、血小板による、アテゾリズマブまたはイピリムマブのトロンビンを使用した活性化のときの取り込み／放出を示すフローサイトメトリー分析のヒストグラムである。図５３Ｃは、休止血小板のアテゾリズマブ（２５μｇ／ｍｌ）の代表的な顕微鏡写真である。図５３Ｄは、アテゾリズマブが負荷され、活性化された血小板の代表的な顕微鏡写真である。 図５４Ａ〜５４Ｅは、洗浄されたヒト血小板におけるヒトＩｇＧ１の共有結合によるコンジュゲーションを例示する。図５４Ａは、第一アミンを反応性スルフヒドリルに変換することによって血小板の膜上の表面タンパク質を改変する例を提供する。図５４Ｂは、マレイミドをタンパク質に連結する例を提供する。図５４Ｃは、マレイミドが連結されたタンパク質を、スルフヒドリル基が露出した血小板と反応させてチオエーテル結合を形成する例を提供する。図５４Ｄは、固定した濃度での、ただし増加する用量のトラウト試薬に曝露して表面をより反応性にした血小板に対して反応した、洗浄したドナー由来ヒト血小板調製物へのＩｇＧコンジュゲーションの増加を示すフローサイトメトリーヒストグラムプロットである。図５４Ｅは、ＩｇＧへのマレイミド（ＳＭＣＣ）連結の非存在下における、したがって血小板膜上の反応性スルフヒドリルへの抗体の親和性を低くした、洗浄したドナー由来ヒト血小板への固定した量のＩｇＧコンジュゲーションを示すフローサイトメトリーヒストグラムである。 図５４Ａ〜５４Ｅは、洗浄されたヒト血小板におけるヒトＩｇＧ１の共有結合によるコンジュゲーションを例示する。図５４Ａは、第一アミンを反応性スルフヒドリルに変換することによって血小板の膜上の表面タンパク質を改変する例を提供する。図５４Ｂは、マレイミドをタンパク質に連結する例を提供する。図５４Ｃは、マレイミドが連結されたタンパク質を、スルフヒドリル基が露出した血小板と反応させてチオエーテル結合を形成する例を提供する。図５４Ｄは、固定した濃度での、ただし増加する用量のトラウト試薬に曝露して表面をより反応性にした血小板に対して反応した、洗浄したドナー由来ヒト血小板調製物へのＩｇＧコンジュゲーションの増加を示すフローサイトメトリーヒストグラムプロットである。図５４Ｅは、ＩｇＧへのマレイミド（ＳＭＣＣ）連結の非存在下における、したがって血小板膜上の反応性スルフヒドリルへの抗体の親和性を低くした、洗浄したドナー由来ヒト血小板への固定した量のＩｇＧコンジュゲーションを示すフローサイトメトリーヒストグラムである。 図５５Ａ〜５５Ｃは、分子、この実施例では抗体薬物であるイピリムマブをヒトｉＰＳＣ由来血小板にコンジュゲートするための、図５３で概説した共有結合によるコンジュゲーション戦略を、１回の反復適用で使用する例を提供する。図５５Ａは、ヒトｉＰＳＣ由来血小板が、＞８９％のＣＤ６１＋であることを示し、それらが血小板特異的表面マーカーを発現していることが確認される。図５５Ｂは、イピリムマブがＳＭＣＣ（マレイミド）と反応し、共有結合による連結を容易にするために血小板をトラウト試薬で処理すると起こる効率的な共有結合によるコンジュゲーションを示すフローサイトメトリーヒストグラムプロットである（赤色のトレース）。図５５Ｃは、ヒト休止ｉＰＳＣ由来血小板におけるＣＤ６１およびＰＦ４に対するイピリムマブの染色パターンを示す顕微鏡写真である。 図５６Ａ〜５６Ｃは、巨核球の受動的な負荷を実証する。図５６Ａは、ｄｙｌｉｇｈｔ４８８で標識されたアテゾリズマブ（すなわち、抗ＰＤＬ１）の存在下でインキュベートしたｉＰＳＣ由来巨核球および血小板を示す。成熟巨核球を実証するために、細胞をＣＤ６１で逆に標識した。図５６Ｂは、巨核球および血小板におけるＤｙｌｉｇｈｔ４８８アテゾリズマブの細胞内局在を示す。図５６Ｃはさらに、血小板因子−４色素のアルファ顆粒への細胞内局在を実証する。 図５７Ａ〜５７Ｄは、ヒトｉＰＳＣ由来巨核球前駆体における生物学的薬物負荷を実証する。図５７Ａは、この集団におけるＣＤ６１染色を示し、ｐｒｅＭＫとしてそれを陽性に同定することができる。図５７Ｂは、アルファ顆粒を染色するフィブリノーゲンの取り込みを示す。図５７Ｃは、イピリムマブの取り込みを検出する二次抗体からのシグナルを示す。図５７Ｄは、観察されたイピリムマブの取り込みを伴う表面（ＣＤ６１）染色と顆粒（フィブリノーゲン）染色の両方が共局在した細胞を実証する、マージされた画像である。 図５８Ａ〜５８Ｄは、イピリムマブの巨核球前駆体への共有結合によるコンジュゲーションを実証する。図５８Ａは、フローサイトメトリーによって巨核球前駆体としてそれを同定する、ステージ２の最後における細胞のＣＤ４１発現を示す。図５８Ｂは、フローサイトメトリーによって巨核球前駆体としてそれをさらに特徴付ける、ＣＤ４３＋ＣＤ４１＋細胞を示す。図５８Ｃは、検出（二次）抗体を含む未処理条件におけるフローサイトメトリードットプロットである。図５８Ｄは、対照と比べたイピリムマブの頑強な発現を示すフローサイトメトリードットプロットである。 図５９Ａ〜５９Ｄは、イピリムマブのヒトｉＰＳＣ由来巨核球への共有結合によるコンジュゲーションを実証する。図５９Ａは、巨核球を同定するためのゲーティング戦略の一部としてのＣＤ６１の頑強な発現を実証するフローサイトメトリードットプロットである。図５９Ｂは、巨核球を同定するためのゲーティング戦略をさらに改良した、これらの培養におけるＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋集団を示すフローサイトメトリードットプロットである。図５９Ｃは、検出（二次）抗体を含む未処理条件におけるフローサイトメトリードットプロットである。図５９Ｄは、対照とは対照的なイピリムマブの効率的な負荷を実証するフローサイトメトリードットプロットである。 図６０Ａおよび図６０Ｂは、洗浄したドナー由来ヒト血小板への小分子化学療法薬であるドキソルビシンの効率的な負荷を示す。図６０Ａは、複数の洗浄ステップ後の洗浄された血小板におけるドキソルビシンの保持を示すフローサイトメトリーヒストグラムプロットである。図６０Ｂは、オービタルシェーカーにおける室温での一定撹拌を使用したミニ透析カセットにおける様々なタイムポイントでの共インキュベーション後に血小板において検出されたドキソルビシンを示すフローサイトメトリーヒストグラムプロットである。 図６１は、模擬の形質導入されたｐｒｅＭＫ、およびＺｓＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質の発現を駆動するＥＦ１アルファプロモーターをコードする核酸分子を含むレンチウイルスベクターで形質導入されたｐｒｅＭＫを示す顕微鏡写真を含む。 図６２Ａ〜６２Ｃは、レンチウイルスの形質導入を介して巨核球前駆体（premegakaryoctyes）に導入された遺伝学的改変の保持を示す。図６２Ａは、模擬の形質導入された巨核球前駆体由来の血小板細胞、およびポリブレンと共にＺｓＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質の発現を駆動するＥＦ１アルファプロモーターをコードするレンチウイルスベクター（レンチ（＋）ポリ）で形質導入された巨核球前駆体由来の血小板の明視野および蛍光顕微鏡写真を含む。図６２Ｂは、模擬の形質導入された巨核球、およびポリブレンと共にＺｓＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質の発現を駆動するＥＦ１アルファプロモーターをコードするレンチウイルスベクターで形質導入された巨核球から得られたＣＤ６１＋血小板を示すフローサイトメトリーデータを含む。図６２Ｃは、模擬形質導入対照とは対照的に、レンチウイルス形質導入条件において検出されたＺｓＧｒｅｅｎシグナルをさらに例示するフローサイトメトリーヒストグラムプロットである。 図６２Ａ〜６２Ｃは、レンチウイルスの形質導入を介して巨核球前駆体（premegakaryoctyes）に導入された遺伝学的改変の保持を示す。図６２Ａは、模擬の形質導入された巨核球前駆体由来の血小板細胞、およびポリブレンと共にＺｓＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質の発現を駆動するＥＦ１アルファプロモーターをコードするレンチウイルスベクター（レンチ（＋）ポリ）で形質導入された巨核球前駆体由来の血小板の明視野および蛍光顕微鏡写真を含む。図６２Ｂは、模擬の形質導入された巨核球、およびポリブレンと共にＺｓＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質の発現を駆動するＥＦ１アルファプロモーターをコードするレンチウイルスベクターで形質導入された巨核球から得られたＣＤ６１＋血小板を示すフローサイトメトリーデータを含む。図６２Ｃは、模擬形質導入対照とは対照的に、レンチウイルス形質導入条件において検出されたＺｓＧｒｅｅｎシグナルをさらに例示するフローサイトメトリーヒストグラムプロットである。 図６３Ａ〜６３Ｄは、血小板産生のためのバイオリアクターを記載する。図６３Ａは、血小板バイオリアクターの画像である。図６３Ｂは、血小板バイオリアクターの断面図である。図６３Ｃは、血小板バイオリアクターの上面図である。図６３Ｄは、血小板バイオリアクターの概略図である。 図６４は、多孔質膜（点線）によって分離された上のチャネルおよび下のチャネルを有する、血小板産生のためのバイオリアクターの側面概略図である。第１のチャネルにおける多孔質膜上に捕獲された巨核球は、せん断応力に供され、血小板（暗色の丸）を下のチャネルに放出する突起を伸ばす。直線の矢印は、流体の流れを示す。 図６５は、多孔質膜上に捕獲されているときの血小板前駆体の産生を例示する、生理学的なせん断下におけるＭＫの顕微鏡画像である。
上で識別されている図は、本開示の実施形態を記載するものであるが、考察に記載の通り他の実施形態も意図されている。本開示は、例示的な実施形態を代表として示し、限定するものではない。当業者は、本開示の実施形態の原理の範囲および主旨内に入る多数の他の改変および実施形態を考案することができる。
定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する当業者に一般に理解される意味を有する。以下の参考文献により、本開示において使用される用語の多くの一般的な定義が当業者に提供される：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２ｎｄ ｅｄ． １９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．， １９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｒ． Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ （１９９１）；およびＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ、Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、特に指定のない限り、以下の当該用語に与えられた意味を有する。
「作用物質」、「治療剤」、「治療用組成物」、「薬物」、または「治療物質」という用語は、同義的に使用することができ、あらゆる小分子化合物、抗体、核酸分子、もしくはポリペプチド、またはそれらの断片を含むことを意味する。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の一部を指し、インタクトな抗体の抗原性決定可変領域を指す。
「変更」または「変化」とは、増大または低減を意味する。変化は、わずか１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％である、または４０％、５０％、６０％である、またはさらには、７０％、７５％、８０％、９０％、または１００％もの大きさであり得る。
「生物学的試料」は、任意の組織、細胞、流体、または生物体から引き出された他の材料を意味する。
「捕捉試薬」は、核酸分子またはポリペプチドを選択または単離するための当該核酸分子またはポリペプチドに特異的に結合する試薬を意味する。
「細胞組成物」とは、単離された細胞を１つまたは複数含む任意の組成物を意味する。
「細胞生存」とは、細胞生存度を意味する。
本明細書で使用される場合、「臨床グレード」は、ヒトにおける臨床使用を許可する現行の医薬品の製造管理及び品質管理規則（ＧＭＰ）を使用して引き出されたまたは得られた細胞または細胞株を指すものとする。ＧＭＰは、医薬品産業において最終製品が予め設定された仕様を満たすことを確実にするために使用される品質保証システムである。ＧＭＰは、最終製品の製造および試験のどちらにも及ぶ。ＧＭＰでは、原料のトレーサビリティだけでなく、生産が、有効化された標準操作手順（ＳＯＰ）に従ったものであることも要求される。
「検出可能なレベル」とは、分析物の量が、そのような分析を行うために常套的に使用される方法を使用して検出するために十分であることを意味する。
「検出する」は、検出しようとする被験体物の存在、不在または量を同定することを指す。
「共有結合によるコンジュゲーション」という用語は、コンジュゲートしようとする分子上の特異的な化学基と反応する化学的なリンカーを使用することを指す。一部の実施形態では、治療用組成物の別の分子または化合物への共有結合によるコンジュゲーションは、治療用組成物上のアミンを、リンカーであるスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）と反応させることによって達成される。
「検出可能な標識」とは、目的の分子に連結した場合に、当該分子を分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、または化学的手段によって検出可能なものにする組成物を意味する。例えば、有用な標識としては、放射性同位元素、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが挙げられる。
「疾患」とは、細胞、組織、または器官の正常機能に損傷を与えるまたは干渉する任意の状態または障害を意味する。疾患の例としては、脳卒中、心筋梗塞などの虚血性傷害、または組織損傷、末梢血管疾患、創傷、熱傷、骨折、鈍的外傷、関節炎、および炎症性疾患を引き起こす任意の他の虚血性事象を含めた、細胞数または生物学的機能の低減をもたらす任意の疾患または傷害が挙げられる。
「有効量」とは、意図された効果を生じさせるために必要な作用物質の量を意味する。
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。この一部は、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含有することが好ましい。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチドまたはアミノ酸を含有し得る。
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、材料が、ネイティブな状態で見いだされた場合に通常付随する構成成分を種々の程度に含まないことを指す。「単離する」は、元々の供給源または周囲のものからある程度分離されていることを示す。「純度」は、単離よりも高い程度に分離されていることを示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、いかなる不純物も当該タンパク質の生物学的性質に実質的に影響を及ぼさないまたは他の有害な結果を引き起こさないように十分に他の材料を含まない。すなわち、本開示の核酸またはペプチドは、当該核酸またはペプチドが細胞性材料、ウイルス材料、または組換えＤＮＡ技法によって作製された場合は培養培地、または化学的に合成された場合は化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まなければ、精製されている。純度および均質性は、一般には、分析化学技法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。「精製された」という用語は電気泳動ゲルにおいて、核酸またはタンパク質により基本的に１つのバンドが生じることを示すことができる。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化に供すことができるタンパク質に関しては、異なる修飾により異なる単離されたタンパク質を生じさせることができ、それを別々に精製することができる。
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本開示の核酸分子が由来する生物体の天然に存在するゲノム内で当該遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸（例えば、ＤＮＡ）を意味する。したがって、この用語は、例えば、ベクター内；自律複製プラスミドもしくはウイルス内；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に組み入れられる組換えＤＮＡ；または他の配列とは独立した別の分子として存在するもの（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生じるｃＤＮＡまたはゲノムまたはｃＤＮＡ断片）を含む。さらに、この用語は、ＤＮＡ分子から転写されるＲＮＡ分子、ならびに追加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを包含する。
「単離されたポリペプチド」は、天然ではそれに付随する構成成分から分離されている本開示のポリペプチドを意味する。一般には、ポリペプチドは、重量で少なくとも６０％が、天然に付随するタンパク質および天然に存在する有機分子を含まなければ、単離されている。調製物は、本開示のポリペプチドが重量で少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９９％であることが好ましい。本開示の単離されたポリペプチドは、例えば、天然の供給源の抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって、またはタンパク質の化学的合成によって得ることができる。純度は、任意の妥当な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、またはＨＰＬＣ分析によって測定することができる。
「造血性内皮細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、分化して、造血細胞型または内皮細胞型をもたらすことが可能な細胞を指し、これは、必要に応じて多能性幹細胞由来であってもよい。造血性内皮細胞は、通常、細胞外マトリクスタンパク質および／または他の造血性内皮細胞に対して接着性であり、マーカーであるＣＤ３１およびＣＤ３４の発現によって特徴付けることができる。
「マーカー」は、発現レベルにおける変更、または特徴もしくは条件に関連する活性を有するあらゆるタンパク質または他のエピトープを意味する。
「巨核球」（ＭＫ）という用語は、本明細書で使用される場合、血小板前駆体および／または血小板を生じさせる性質を有する、大きい（例えば、直径≧１０μｍ）倍数体の造血細胞を指す。成熟巨核球の１つの形態学的な特徴は、大きい多形核の発達である。成熟巨核球は、増殖を停止し得るが、核内***を通じてＤＮＡ含有量が増加し続け、並行して細胞サイズが増加し続ける。
「巨核球前駆細胞」（ｐｒｅＭＫ）という用語は、本明細書で使用される場合、巨核球系列に拘束されており、成熟巨核球の前駆体である単核造血細胞を指す。巨核球前駆細胞は、通常、（これだけに限定されないが）骨髄および他の造血場所において見いだされるが、多能性幹細胞からも、それら自体も多能性幹細胞から引き出された造血性内皮細胞のさらなる分化によってなどで生成され得る。
「微小粒子」という用語は、巨核球または他の細胞から脱落される非常に小さな（＜１ミクロン）リン脂質小胞を指す。微小粒子は、ＲＮＡなどの遺伝子材料を含有し得、それらの親細胞の細胞外マーカーを発現し得る。巨核球由来微小粒子および血小板由来微小粒子は、止血および炎症を含めた多数の経路において役割を有し得る。
「受動的な薬物負荷」は、細胞のコンジュゲーションまたは機械的もしくは化学的な破壊もしくは改変を伴わない、細胞（例えば、血小板またはその前駆体）による治療用組成物の取り込みを意味する。例えば、リポソーム送達系が、受動的な薬物負荷に使用することができる。
「血小板」という用語は、１〜３ミクロンの直径を有し、核を有さないがＲＮＡを含有する細胞を指す。血小板は、内部にアルファおよび高密度顆粒を含有し、これらはそれぞれＰ−セレクチンおよびセロトニンのような因子を含有する。血小板はまた、開放小管系(open canalicular system)も有し、これは、細胞外材料の細胞への輸送および顆粒から細胞外環境への材料の放出のための経路であるチャネルを指す。これらは、血液凝固に関与することによって止血の調節において主に機能するが、炎症における役割を有することも示されている。
「プレ血小板」という用語は、直径が３〜１０ミクロンであり、核を有さないがＲＮＡは有する細胞を指す。プレ血小板は、他の点では形態学的かつ超微細構造的に血小板と類似しており、細胞骨格再構成によってばらばらになって、個々の血小板を形成する巨核球によって産生される中間細胞期を構成する。
「血小板前駆体」という用語は、巨核球からの細胞質ゾル伸長または巨核球からちょうど放出されたものを指す。血小板前駆体は、細胞骨格再構成によってばらばらになって、個々のプレ血小板および血小板を形成する。
「多能性幹細胞」という用語は、多能性幹細胞を引き出す方法にかかわらず、胚性幹細胞、胚由来幹細胞、および人工多能性幹細胞、ならびに体の３つ全ての胚葉に由来する細胞を形成する能力を有する他の幹細胞を含む。多能性幹細胞は、機能的には以下の特徴の１つまたは複数を有し得る幹細胞と定義される：（ａ）免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植した場合に奇形腫を誘導することができる；（ｂ）３つ全ての胚葉の細胞型に分化することができる（例えば、外胚葉系の細胞型、中胚葉系の細胞型、および内胚葉系の細胞型に分化することができる）；または（ｃ）胚性幹細胞の１つまたは複数のマーカーを発現する（例えば、Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３表面抗原、ＳＳＥＡ−４表面抗原、ＳＳＥＡ−５表面抗原、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１などを発現する）。
「人工多能性幹細胞」（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣ）という用語は、再プログラミング因子の組合せを発現させることによる体細胞の再プログラミングによって生成される多能性幹細胞の一種を指す。ｉＰＳＣは、胎児体細胞、出生後体細胞、新生児体細胞、若年体細胞、または成人体細胞を使用して生成することができる。体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするために使用することができる因子としては、例えば、Ｏｃｔ４（時にはＯｃｔ３／４と称される）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４の組合せが挙げられる。他の実施形態では、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするために使用することができる因子として、例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８の組合せが挙げられる。ある特定の実施形態では、体細胞を再プログラミングするために、少なくとも２種、３種、または４種の再プログラミング因子を体細胞において発現させる。
本明細書で使用される場合、「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」、「予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）処置」などという用語は、障害または状態を有さないが、そのリスクがあるまたはそれにかかりやすい被験体において障害または状態が発生する確率を低減することを指す。
「低減する」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％の負の変化を意味する。
「細胞死を低減すること」とは、細胞が死滅する傾向または確率を低減することを意味する。細胞死は、アポトーシス性、壊死性、または任意の他の手段によるものであり得る。
「低減したレベル」とは、試料中の分析物の量が対応する対照試料中の分析物の量よりも少ないことを意味する。
「参照」とは、標準または対照条件を意味する。
「特異的に結合する」は、本開示のポリペプチドを認識し、それと結合するが、試料中の、例えば天然に本開示のポリペプチドを含む生体試料中の他の分子を実質的に認識したり結合したりしない化合物または抗体を意味する。
「被験体」または「患者」という用語は、処置、観察、または実験の被験体物である動物を指す。単に例として、被験体は、これだけに限定されないが、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウシ、ウマ科の動物、イヌ科の動物、ヒツジ、またはネコ科の動物を含めた哺乳動物を含むが、これだけに限定されない。
「処置する」、「処置すること」、「処置」などの用語は、本明細書で使用される場合、障害および／またはそれに関連する症状を低減または好転させることを指す。除外されることはないが、障害または状態の処置は、その障害、状態またはそれに関連する症状が完全に排除されることを必要としないことが理解されよう。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに与えられた意味を有し、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る；「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は、同様に、米国特許法において与えられた意味を有し、この用語は、無制限のものであり、記載されている基本的なまたは新規の特徴が、記載されているよりも多くのものが存在することによって変化しない限りは、記載されているよりも多くのものが存在することが許容されるが、先行技術の実施形態は除外される。
特に明記されていないかまたは文脈から明白でない限り、本明細書で使用される場合、「または（ｏｒ）」という用語は、包括的なものと理解される。特に明記されていないかまたは文脈から明白でない限り、本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という用語は、単数または複数であることが理解される。
特に明記されていないかまたは文脈から明白でない限り、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当技術分野における通常の許容度の範囲内、例えば、平均の２標準偏差以内に入ると理解される。約は、明示された値の１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、０．５％以内、０．１％以内、０．０５％以内、または０．０１％以内と理解することができる。別段文脈から明らかでない限り、本明細書に提示される全ての数値は約という用語で修飾される。
本明細書における変数のあらゆる定義における化学基の一覧の列挙は、その変数が単一の基または列挙された基の組合せであるという定義を含む。本明細書における変数または態様についてのある実施形態の列挙は、その実施形態が単一の実施形態または任意の他の実施形態もしくはその一部との組合せであるという定義を含む。
本明細書に提示される任意の組成物または方法を本明細書に提示される他の組成物および方法のいずれか１つまたは複数と組み合わせることができる。
本開示は、幹細胞、例えば多能性幹細胞、例えば、臨床グレードのヒト人工多能性幹細胞から、巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）、巨核球（ＭＫ）、血小板前駆体、プレ血小板または血小板を産生するための組成物および方法を対象とする。本方法は、造血性内皮細胞からの、ｐｒｅＭＫ、ＭＫ、血小板前駆体、プレ血小板または血小板の継続的な産生を可能にする。本方法によって得られたｐｒｅＭＫ、ＭＫ、血小板前駆体、プレ血小板および血小板は、以下：それらのサイズ範囲、倍数性プロファイル、バイオマーカーの発現、遺伝子発現、顆粒組成、ならびに増殖因子、サイトカインおよびケモカインの組成またはそれらの組合せのうちの１つまたは複数によって区別することができる。本開示はさらに、薬物送達のための、このようなｐｒｅＭＫ、ＭＫ、血小板前駆体、プレ血小板および血小板の組成物およびその使用方法を対象とする。
血餅形成（凝固因子）および組織修復（サイトカイン、ケモカイン、および増殖因子）を促進する複数のタンパク質が天然に封じ込められている分泌顆粒の存在は、巨核球および血小板に特有である。巨核球および血小板顆粒のエキソサイトーシスは、血栓症、免疫系のモジュレーション、および組織再生において重要な役割を果たす。骨髄の傷害または血管損傷の部位における接触−活性化において、巨核球および血小板は、それらの分泌顆粒の内容物を選択的に放出して、局所的な治療応答を開始させることができる。血小板はまた、天然にがんの部位にも蓄積すると予想され、その場合、血小板は腫瘍（決して癒えない創傷）に選択的に接着することで、それらを免疫系から隠し、血管新生および腫瘍転移に寄与するそれらの顆粒を介して、ＶＥＧＦなどの血管新生促進因子、およびＴＧＦ−βなどの抗炎症性サイトカインに寄与する。
巨核球および血小板は、凝血因子、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および薬物の発現に特異的に適用できる「デザイナー細胞」を産生するために、分子（例えば、それらの顆粒内の）を発現するように負荷または遺伝子操作することができる。これらの改変された細胞は、程度の差はあるが、アゴニストに対して感受性および応答性を有し、通常細胞の機能不全を引き起こしたり、または凝血を減じたりする条件下でも凝固時間を改善または抑制するように操作することができる。同様に、分子は、その表面上に直接コンジュゲートされていてもよいし、または分泌顆粒にパッケージングされていてもよく、これは、細胞特異性を改善することにより、組織を標的化し、分子を治療標的に運んで、その特異性を改善することができる。一部の実施形態では、血小板全体の代わりに、血小板膜でコーティングされたナノ粒子を使用してもよい。
本開示は、臨床使用のためのｃＧＭＰ条件下で多数の巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板を製造するための、ならびに治療標的の標的化および選択的な放出のために、これらの細胞型において薬物を発現および／または負荷するための方法および系を提供する。
本開示の態様は、機能的な巨核球および血小板の迅速な生成を可能にする、スケーラブルなｃＧＭＰに準拠した幹細胞ベースのプロセスに関する。本開示の一部の態様において、ｃＧＭＰに準拠したヒトＰＳＣ株は、巨核球（直近の細胞前駆体）レベルまたは血小板レベルにおいて特異的な薬物を条件的に発現するように操作することができる。例えば、本開示のプロセスに従って生成した巨核球および血小板は、正常な巨核球または血小板産生の一部としての分泌顆粒に薬物をパッケージングするように方向付けられてもよい。結果として、得られた「デザイナー」改変巨核球および血小板は、所望の薬物を含有することができ、これは、正常な循環を介して傷害または疾患の標的化された部位に送達でき、それにより、これらの因子の体への血管内輸血による直接の全身性曝露を回避し、微小凝集／血餅形成および免疫原性の非特異的なリスクを低減する。
本開示の態様は、薬物送達のためのビヒクルとして、ｉＰＳＣに由来する本開示の巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板または血小板を含む組成物を対象とする。
本開示の一部の態様によれば、多能性幹細胞（例えば、臨床グレードｈｉＰＳＣなど）から、本巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板または血小板を産生するための方法が開示される。これらの方法は、１週間まで、またはそれより長く延長した時間枠にわたり、造血性内皮細胞からの巨核球前駆細胞の継続的な産生を可能にし、その後、成熟巨核球に分化させることができる。これらのｉＰＳＣ由来巨核球は、それらのサイズ範囲、倍数性プロファイル、バイオマーカーの発現、ならびに増殖因子、サイトカインおよびケモカインの組成またはそれらの組合せによって区別することができる。
一部の実施形態では、ＭＫおよび血小板は、これだけに限定されないが、胚性幹細胞（ＥＳＣ）（例えばヒト胚性幹細胞）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（例えばヒト人工多能性幹細胞）などの多能性幹細胞から引き出すことができる。ＥＳＣは、胚盤胞と称される初期の着床前胚の内部細胞塊から引き出された多能性幹細胞である。ｉＰＳＣは、特定の転写因子の時限発現を誘導することによって成体細胞から生成することができる多能性幹細胞の一種である。ｉＰＳＣは、培養で無制限に増大させ、維持し、ＭＫおよび血小板を産生するように操作することができる。
一部の実施形態では、ＭＫおよび血小板はまた、これだけに限定されないが、ＣＤ３４＋臍帯血幹細胞（ＵＣＢ細胞）（例えばヒトＣＤ３４＋臍帯血幹細胞）、ＣＤ３４＋動員末梢血細胞（ＭＰＢ細胞）（例えばＣＤ３４＋ヒト動員末梢血液）、またはＣＤ３４＋骨髄細胞などの造血幹細胞から引き出すことができる。ＵＣＢ細胞は、出産後に胎盤や付着臍帯に残る血液から引き出された多分化能幹細胞である。ＭＰＢ細胞は、Ｇ−ＣＳＦまたは類似の作用物質の投与によって幹細胞が血流に動員された志願者から引き出された多分化能幹細胞である。
一部の実施形態では、ＭＫおよび血小板は、これだけに限定されないが、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（例えば、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡｄＭＳＣ））または他の供給源由来の間葉系肝細胞などの他の幹細胞型から引き出すことができる。
ＡｄＭＳＣは、白色脂肪組織から引き出され、白色脂肪組織は、胚発生の間に中胚葉から引き出され、すべての哺乳動物種に存在し、全身に位置する。ＡＳＣは、それらの広い利用可能性ならびに骨、軟骨、筋肉、および脂肪を含めた中胚葉の他の組織型に分化する能力に起因して、多種多様な適用に役立つことができる。
本開示では、幹細胞培養は、胚性線維芽細胞のフィーダー細胞および／または動物血清とは独立して維持することができる。本方法では、一部の実施形態では、無血清、フィーダー細胞不含の代替物を利用することができる。
本開示は、幹細胞から、巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）および巨核球（ＭＫ）を産生するための方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、巨核球産生のための方法であって、低接着性または非接着性条件下で、撹拌下で多能性幹細胞を増大させるステップであって、増大した多能性幹細胞が自己凝集性スフェロイドを形成する、ステップ；第１の培養培地中で、多能性細胞を造血性内皮細胞に分化させるステップ；第２の培養培地中で、造血性内皮細胞を巨核球前駆細胞に分化させるステップを含む、方法を提供する。多能性細胞を造血性内皮細胞に分化させるステップは、マトリクス上、接着性条件下で行うことができる。一部の実施形態では、多能性細胞を造血性内皮細胞に分化させるステップは、造血性内皮細胞が自己凝集できるように、低接着性または非接着性条件下で行われる。
一部の実施形態では、本開示は、巨核球産生のための方法であって、第１の培養培地中で、多能性細胞を造血性内皮細胞に分化させるステップ；および第２の培養培地中で、造血性内皮細胞を巨核球前駆細胞に分化させるステップを含み、多能性細胞を分化させるステップおよび造血性内皮細胞を分化させるステップの少なくとも１つは、マトリクスがコーティングされた３次元構造上で行われる、方法を提供する。３次元構造は、マイクロキャリアまたはマイクロキャリアであり得る。
一部の実施形態では、本開示は、巨核球産生のための方法であって、第１の培養培地中で、多能性細胞を造血性内皮細胞に分化させるステップ；および第２の培養培地中で、造血性内皮細胞を巨核球前駆細胞に分化させるステップを含み、多能性細胞を分化させるステップおよび造血性内皮細胞を分化させるステップの少なくとも１つは、細胞が自己凝集できるように、低接着性または非接着性条件下で行われる、方法を提供する。
本開示は、さらに、ＭＫから血小板を産生するための方法を提供する。
産生方法
図１は、１つまたは複数の多能性幹細胞からの、巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）、巨核球（ＭＫ）、および血小板（ＰＬＴ）のスケーラブルな分化に関する全体的な概略図を示す。しかし、注目すべきことに、本プロセスは多能性幹細胞に関連して記載されているが、様々な実施形態では、多能性幹細胞は、他のタイプの幹細胞で置換されてもよいし、またはそれが補充されてもよい。一部の実施形態では、２次元（２Ｄ）培養は、図２で示されるように、前駆体、巨核球、および血小板を生成するのに使用される。本明細書で開示された他の実施形態は、図３で示されるような、所望の細胞を産生するための３次元培養を利用するプロセスを記載する。
ステージ０：ヒト人工多能性幹細胞の増大および分化の準備
マトリクス依存性増大培養
マトリクス依存性増大培養に関しては、臨床グレード多能性幹細胞（ＰＳＣ）を、多能性幹細胞培養培地中で、支持用マトリクス上でフィーダー細胞を伴わずに培養することによってコロニーとして増大させることができる。支持用マトリクスは、細胞の付着を可能にする２次元表面または３次元構造であってもよい。一部の実施形態では、臨床グレードヒト人工多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよいが、他のタイプの多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞、または他の幹細胞を使用することもできる。
一部の実施形態では、支持用マトリクスは、非限定的な例として、組織培養用に処理したプラスチック、組換えビトロネクチン、組換えラミニン、マトリゲル、Ｇｅｌｔｒｅｘ、または前述のものの任意の組合せであってもよい。一部の実施形態では、多能性幹細胞培養培地は、例えば、これだけに限定されないが、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、または当技術分野で公知の多能性細胞の維持および成長を支持することが可能な他の培地であってもよい。一部の実施形態では、細胞は、コンフルエンシーに達するまで培養することができる。一部の実施形態では、細胞は、３０％から９０％までの％コンフルエンシーに達するまで培養することができる。一部の実施形態では、細胞は、最大６０％、最大６５％、最大７０％、最大７５％のコンフルエンシーに達するまで培養される。例えば、細胞は、約７０％のコンフルエンシーに達するまで培養される。所定の最大パーセントのコンフルエンシーに達したら、細胞は回収される。一部の実施形態では、細胞は、０．１ｍＭから５ｍＭまでのＥＤＴＡまたは同様のキレート剤もしくは試薬を使用して解離させることにより、凝集塊として回収することができる。例えば、細胞は、約０．５ｍＭのＥＤＴＡを使用して回収することができる。一部の実施形態では、細胞は、例えば、タンパク質分解酵素、コラーゲン分解酵素、またはそれらの組合せを用いて解離させることにより、単一の細胞として回収することができる。例えば、細胞は、例えば、組換えトリプシン、例えばＴｒｙｐＬＥ（商標）、またはＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて解離させることにより、単一の細胞として回収することができる。ＰＳＣの維持／増大のために、回収された細胞は、多能性幹細胞培養培地中に再懸濁させることができる。
高効率の単一細胞継代技術は、未分化ｈｉＰＳＣ培養物の所定スケールの増大を支持するために使用することができる。同じ方法論が、ｐｒｅ−ＭＫの製造をもたらす細胞のバンキングおよび所定スケールのｈｉＰＳＣシードトレインにも意図される。この手法は、全体的な製造能力のための迅速な増大、ｐｒｅ−ＭＫを産生する能力を有する未分化の多能性培養物、ならびにｃＧＭＰ製造および臨床上の登録に適合する系での回収量および培養性能の均一性を提供する。簡単に述べると、単一細胞であるｉＰＳＣの懸濁物は、１つまたは複数の細胞解離酵素（例えば、ＴｒｙｐＬＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）など）を使用し、続いて規定の密度でフィーダー不含の培養培地（例えば、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ｈＰＳＣ ＸＦ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）にプレーティングすることにより生成される。一部の実施形態では、培養培地はさらに、例えばＲＯＣＫ阻害剤および１種または複数の増殖因子などを補充してもよい。一部の実施形態では、培養物は、細胞５×１０３個／ｃｍ２から細胞５×１０４個／ｃｍ２の間の密度で、３日または４日の培養間隔でプレーティングされる。例えば、一部の実施形態では、培養物は、細胞約５×１０３個／ｃｍ２、細胞約１×１０４個／ｃｍ２、細胞約２×１０４個／ｃｍ２、細胞約３×１０４個／ｃｍ２、細胞約４×１０４個／ｃｍ２、または細胞約５×１０４個／ｃｍ２の密度で、３日または４日の培養間隔でプレーティングされるか、または細胞２×１０４個／ｃｍ２の密度で、３日の培養間隔でプレーティングされる。一部の実施形態では、培養物は、細胞約１×１０４個／ｃｍ２の密度で、４日の培養間隔でプレーティングされるか、または細胞約２×１０４個／ｃｍ２の密度で、３日の培養間隔でプレーティングされる。一部の実施形態では、未処理表面への細胞の付着は、ヒト血清によって媒介され得る。一部の実施形態では、プレーティング後１８〜２２時間に、培養に、補充なしのフィーダー不含の培養培地を供給してもよい。培養物を３または４日の間隔で継代し、複数回の継代にわたり予測可能で一貫した回収量を達成することができる。
マトリクス非依存性３Ｄ増大培養
図３および４は、３Ｄマトリクスを使用したｐｒｅＭＫ細胞の定方向分化の概略図を提示する。マトリクス非依存性３Ｄ増大培養に関して、臨床グレードＰＳＣは、自己凝集性スフェロイドとして増大させることができる。一部の実施形態では、これは、１ｍｌ当たり約１０万から約１５０万個の密度で単一細胞を播種することによって達成することができる。例えば、一部の実施形態では、単一細胞は、１ｍｌ当たり５０万個で播種することができる。
細胞は、多能性幹細胞培養培地中、低接着性または非接着性条件で、ゆっくり撹拌すること、または穏やかに振とうすることによる連続的な運動に供することができる。一部の実施形態では、フィーダー不含の無血清培地を使用することができる。多能性幹細胞培養培地は、例えば、これだけに限定されないが、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、または当技術分野で公知の多能性細胞の維持および成長を支持することが可能な他の同様の培地であってもよい。一部の実施形態では、培養培地は、ＲＯＣＫ阻害剤（例えばＨ１１５２）が補充されてもよい。一部の実施形態では、培地は、上皮増殖因子ファミリーメンバー、例えば、ヘレグリン−ベータ−１を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ヘレグリン−ベータ−１培地は、２４時間未満（例えば、１８〜２２時間）で使用される。一部の実施形態では、ＰＳＣスフェロイドは、全体的な細胞密度が約３００万個から細胞約１０００万個／ｍｌに達するまで、および／または約１５０から約３５０μｍのスフェロイドサイズ中央値が達成されるまで、およそ５〜７日間にわたり培養される。一部の実施形態では、ＰＳＣスフェロイドは、全体的な細胞密度が細胞５００万個／ｍｌに達するまで培養される。一部の実施形態では、ＰＳＣスフェロイドは、細胞が約２５０μｍのスフェロイドサイズ中央値を達成するまで培養される。培養ステップは、３、４、５、６、７、または８日間続けてもよい。適用可能な場合、ＰＳＣは、タンパク質分解酵素、コラーゲン分解酵素、またはそれらの組合せを用いて解離させることにより、単一の細胞として回収することができる。例えば、細胞は、これだけに限定されないが、トリプシン、組換えトリプシン、例えばＴｒｙｐＬＥ（商標）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、または当技術分野で公知の同様の試薬を用いて解離させることにより、単一の細胞として回収することができる。一部の実施形態では、単一細胞は、別の３Ｄ増大培養および／または定方向分化培養を開始させるのに使用される。
分化の準備
一部の実施形態では、分化の準備をするために、ＰＳＣ凝集体は、マトリクス依存性２Ｄ培養物からＰＳＣコロニーを部分的に解離させることによって、マトリクス非依存性３Ｄ培養物からＰＳＣスフェロイドを部分的に解離させることによって、または当技術分野で公知のあらゆる方法によって生成した単一のＰＳＣの自己凝集によって生成することができる。一部の実施形態では、分化を開始させる前に、これらの凝集体は、多能性幹細胞培養培地、例えば、これだけに限定されないが、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、またはＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）中で生成することができる。一部の実施形態では、培地は、ＲＯＣＫ阻害剤、例えば、これだけに限定されないが、Ｙ２７６３２、Ｈ１１５２、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。一部の実施形態では、培地は、可溶性ラミニン、例えば、組換えラミニン５２１を含んでいてもよい。一部の実施形態では、培地は、上皮増殖因子ファミリーメンバー、例えば、ヘレグリン−ベータ−１を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ヘレグリン−ベータ−１培地は、２４時間未満（例えば、１８〜２２時間）で使用される。一部の実施形態では、分化を開始させる前に、細胞は、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２で０から７２時間の間培養することができる。
マトリクス依存性分化培養に関して、凝集体は、表面に付着させることができる。一部の実施形態では、付着ステップは、約２４時間にわたり進行させることができるが、１時間から２４時間の間のあらゆる時間またはそれより長い時間を使用してもよい。一部の実施形態では、表面は、コラーゲン、ラミニン、または他のあらゆる細胞外マトリクスタンパク質で予めコーティングされていてもよい。一部の実施形態では、表面をコーティングするのに、ヒトＩＶ型コラーゲンを使用することができる。一部の実施形態では、マトリクスでコーティングされた表面は、２Ｄ（例えば、プラスチックディッシュまたはフラスコの底部）であってもよい。一部の実施形態では、マトリクスでコーティングされた表面は、３Ｄ（例えば、平滑な、またはきめのある球状マイクロキャリア、またはマクロキャリア、例えばラシヒリング）であってもよい。次いで３Ｄマトリクスでコーティングされた表面上の細胞は、連続的な運動を伴って、または伴わないで培養することができる。例えば、細胞は、超低接着性の静置条件下で、ローラーボトル、スピナーフラスコ、撹拌槽バイオリアクター、垂直ホイールバイオリアクター、充填層バイオリアクター、または流動層系で培養することができる。
マトリクス非依存性分化培養に関して、凝集体は、低接着性の容器、例えば、これだけに限定されないが、オービタルシェーカー上のプレートまたはフラスコ、スピナーフラスコ、ローラーボトル、垂直ホイールバイオリアクター、または撹拌槽バイオリアクター）中で、ゆっくり撹拌すること、または穏やかに振とうすることによる連続的な運動に供することができる。細胞は、０から７２時間後、例えば約２４時間後に、分化のステージ１に移行することができる。
ステージ１．造血性内皮細胞の生成
ステージ１において、調製されたＰＳＣ凝集体は、造血性内皮細胞に分化させることができる。簡単に述べると、多能性幹細胞培養培地の一部または全てを取り出し、ステージ１分化培地と置き換える。一部の実施形態では、ステージ１分化培地は、基本培地として、例えば、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの１種または複数の増殖因子が補充された、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）−ＡＣＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０９８５５）を含む、動物構成成分不含の培地（ＡＣＦ）であってもよい。一部の実施形態では、基本培地は、それぞれ１から２００ｎｇ／ｍｌの間の、ＢＭＰ４（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＶＥＧＦ（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）のうちの１つまたは複数が補充されている。一部の実施形態では、ステージ１の培地は、ＷＮＴアゴニスト（例えばＣＨＩＲ９８０１４またはＣＨＩＲ９９０２１）、ラミニン（例えば組換えラミニン５２１）、またはそれらの任意の組合せがさらに補充されていてもよい。一部の実施形態では、細胞は、低酸素条件（例えば、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２）で２日から６日の間、続いて正常酸素下（３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２）で２日から６日の間、インキュベートすることができる。一部の実施形態では、ＢＭＰ４は、最初の６〜４８時間にわたり（例えば、２４時間）添加されてもよく、ステージ１の残りではなくてもよい（図２８）。一部の実施形態では、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦは、ステージ１の最初の６〜４８時間（例えば、２４時間）はなくてもよく、その後に添加されてもよい（図２８）。一部の実施形態では、毎日の完全培地交換は、使用済みの培地の除去と新鮮なステージ１の培地での置き換えによって、ステージ１にわたり実行してもよい。一部の実施形態では、部分的な培地交換は、使用済みの培地の１０〜９９％を除去し、等体積の新鮮なステージ１の培地で置き換えることによって実行してもよい。一部の実施形態では、追加の体積の新鮮な培地を添加してもよく、この場合、培養物の総体積を増大させるという正味の影響が伴う。一部の実施形態では、新鮮なステージ１の培地の置き換えまたは添加の代わりに、具体的な培地構成成分が培養物にスパイクされる。
２Ｄマトリクス依存性培養では、２日目までに、コロニーの形態が、散在する伸長した細胞集塊に変化する（図１５）。５〜６日目までに、造血性内皮細胞のコンフルエントな接着層が観察され、付着細胞層内にいくつかの３次元構造を伴う（図２、図１５）。マトリクス非依存性３Ｄ培養では、ステージ１は、マトリクス非依存性３Ｄ培養で進行でき、そこで自己凝集したスフェロイドは、低接着性容器中で、例えば、これだけに限定されないが、オービタルシェーカー上のプレートまたはフラスコ、スピナーフラスコ、ローラーボトル、垂直ホイールバイオリアクター、または撹拌槽バイオリアクター中で、ゆっくり撹拌すること、または穏やかに振とうすることによる連続的な運動に供することができる。マトリクス非依存性３Ｄ培養では、スフェロイドは、ステージ１が進行するにつれて、より大きく、より濃く、さらに、より不均一に成長する（図１５）。ステージ１分化の開始のおよそ６日後、造血性内皮への分化が完了する。一部の実施形態では、造血性内皮細胞のコンフルエントな接着層が観察され、付着細胞層内にいくつかの３次元構造が伴う場合、分化は完了とみなすことができる。一部の実施形態では、分化は、造血性内皮のマーカー、例えばＣＤ３１およびＣＤ３４の発現によって評価することができる。一部の実施形態では、造血性内皮細胞はまた、ＣＤ３０９およびＣＤ１４４、またはＣＤ３０９、ＣＤ１４４、ＣＤ１４０ａおよびＣＤ２３５ａを発現していてもよい。
ステージ２．造血性内皮細胞から剥離された巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）の生成
一部の実施形態では、巨核球前駆細胞（ステージ２）分化の開始は、４日から８日のステージ１の後に実行することができる。簡単に述べると、ステージ１の培地の一部または全てを取り出し、体積のステージ２の培地、例えば、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）ＡＰＥＬ（商標）２基本培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０５２７５）などと置き換える。このようなステージ２の培地は、それぞれ１および２００ｎｇ／ｍｌの、幹細胞因子（ＳＣＦ）（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、およびヘパリン（例えば、５単位／ｍｌ）のうちの１つまたは複数が補充されていてもよい。一部の実施形態では、ステージ２の培地は、ＵＭ１７１、ＵＭ７２９、ＳＲ−１、ＳＵ６６５６、ラミニン（例えば組換えラミニン５２１）、またはそれらの任意の組合せがさらに補充されていてもよい。
次いで細胞は、少なくとも３日間から最大１２日間またはそれより長く、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２でインキュベートされる。例えば、細胞は、３、４、５、６、７、８，９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７日間インキュベートすることができる。一部の実施形態では、毎日の部分的な培地交換は、使用済みの培地の１０〜９９％を取り出し、等体積の新鮮なステージ２の培地で置き換えることによって実行することができる。一部の実施形態では、追加の体積の新鮮な培地を添加してもよく、この場合、培養物の総体積を増加させるという正味の影響が伴う。一部の実施形態では、新鮮なステージ１の培地の置き換えまたは添加の代わりに、具体的な培地構成成分を培養物にスパイクすることができる。
ステージ２の開始後１〜２日以内に、接着性造血性内皮細胞内に小さな丸い屈折性の細胞が出現し、最終的に上清に放出される（図１７Ａ、図２４Ａ）。これらの放出された細胞は、ＣＤ４３およびＣＤ４１の細胞表面発現ならびにＣＤ１４の発現の欠失によって定義されるｐｒｅＭＫを含有し得る（図１７Ｂ、１７Ｃ、２４Ｂ）。２Ｄ培養では、付着細胞層の上部に出現する浮遊し弱く付着したステージ２細胞は、定期的に、穏やかに濯ぎ培地を収集することによって回収することができる。３Ｄ培養では、放出されたステージ２細胞は、凝集体を容器の底部に沈降させる方式で（例えば、撹拌を中断することによって）回収することができる。次いで放出された懸濁細胞に伴う培地を収集することができる。放出された細胞を回収するための他の例示的な方法としては、例えば、凝集体と放出された単一細胞との間のサイズおよび密度の差を利用することを挙げることができる。その後、培地半分の取換えは、濯いだ付着細胞層または３Ｄ凝集体の上部に新鮮なステージ２の培地の元の体積の半分を添加することによって開始させることができる。一部の実施形態では、半分以外の割合が培地交換に使用される。培地中に収集された細胞のアリコートを、フローサイトメトリーによる生存細胞の数え上げおよびバイオマーカー分析のために取り出すことができる。次いで細胞の残りは、遠心分離、対向遠心による水簸（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）、音波による分離（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、または他のあらゆる関連技術によって濃縮することができる。濃縮後、培地の取換えは、付着細胞層または３Ｄ凝集体に元の体積の半分の馴化培地を添加し戻すことによって完了させることができる。一部の実施形態では、追加の体積の新鮮な培地を添加してもよく、この場合、培養物の総体積を増大させるという正味の影響が伴う。一部の実施形態では、新鮮なステージ２の培地の置き換えまたは添加の代わりに、具体的な培地構成成分を培養物にスパイクしてもよい。上清の残りを廃棄し、ｐｒｅＭＫを含有する細胞ペレットは、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ １０凍結保存培地中、−１８０℃で貯蔵してもよいし、またはステージ３に直接移行させてもよい。一部の実施形態では、ｐｒｅＭＫを含有する細胞は、２日から７日の期間にわたり（例えば３日間）収集してもよく、追加で、別々の容器においてステージ２培地または他の培地中で培養してもよい。最後の回収が完了したら、ｐｒｅＭＫを含有する細胞を一緒にプールし、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ １０凍結保存培地（例えばＣｒｙｏｓｔｏｒ １０）中、−１８０℃で貯蔵するか、またはステージ３に直接移行させてもよい。
ステージ３．巨核球前駆細胞からの成熟巨核球（ＭＫ）の生成
一部の実施形態では、成熟巨核球の分化は、上述の通りに生成したＰＳＣ由来ｐｒｅＭＫを使用して開始させることができる。新鮮な、または解凍した巨核球前駆細胞は、例えば、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）−ＡＣＦを含むステージ３培地中の、非接着性表面上に播種することができる。非接着性表面は、大多数の細胞がこのような表面に張り付いたりまたはくっついたりせず、その代わりに大部分が懸濁物中に留まることが意図された表面を指す。例えば、このような表面は、表面への細胞の接着を防止または最小化するために、「超低粘着性プラスチック」製であってもよく、または細胞外マトリクスタンパク質でコーティングされていないものでもよい。一部の実施形態において、ステージ３の培地は、それぞれ０から２００ｎｇ／ｍｌの、ＴＰＯ（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−９（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、ヘパリン（例えば、５単位／ｍｌ）、およびＲＯＣＫ阻害剤（例えば、５μＭのＹ２７６３２）のうちの１つまたは複数が補充されていてもよい。一部の実施形態では、ステージ３の培地はまた、ＵＭ１７１、ＵＭ７２９、ＳＲ−１、ＳＵ６６５６、またはそれらの任意の組合せが補充されていてもよい。
次いで細胞は、３７℃から４０℃の間（例えば、３９℃）で、５から２０％の間のＣＯ２（例えば、７％〜１０％）、および５から２０％の間のＯ２で、最大５日間インキュベートすることができる。一部の実施形態では、毎日の部分的な培地交換は、使用済みの培地の１０〜９５％を取り出し、等体積の新鮮なステージ３の培地で置き換えることで実行される。一部の実施形態では、非接着性表面は、超低接着性プレートまたはフラスコである。一部の実施形態では、非接着性表面は、気体透過性膜（例えばＧ−Ｒｅｘ（登録商標））である。一部の実施形態では、非接着性表面は、穏やかな撹拌を伴う細胞培養バッグまたは容器である。いずれの場合も、ｐｒｅＭＫ（ステージ２培養物から新たに回収したもの、または凍結保存ストックから解凍したもののいずれか）は、１ｍｌ当たり１０万〜１０００万の密度でステージ３培地中に懸濁させ、容器に導入される。例えば、ｐｒｅＭＫは、１ｍｌ当たり１００万から１５０万個、１ｍｌ当たり１００万から２００万個、１ｍｌ当たり１００万から３００万個、１ｍｌ当たり１００万から４００万個、１ｍｌ当たり２００万から５００万個、１ｍｌ当たり２００万から６００万個、１ｍｌ当たり３００万から７００万個、１ｍｌ当たり３００万から８００万個、１ｍｌ当たり５００万から９００万個、または１ｍｌ当たり８００万から１０００万個の密度であってもよい。一部の実施形態では、ｐｒｅＭＫは、１ｍｌ当たり１０万から１５０万個、１ｍｌ当たり２０万から１５０万個、１ｍｌ当たり３０万から１５０万個、１ｍｌ当たり４０万から１５０万個、１ｍｌ当たり５０万から１５０万個、１ｍｌ当たり６０万から１５０万個、１ｍｌ当たり７０万から１５０万個、１ｍｌ当たり８０万から１５０万個、または１ｍｌ当たり９０万から１５０万個の密度であってもよい。細胞を合計１〜５日間（例えば、３日間）培養して、成熟ＭＫへの分化を可能にする。一部の実施形態では、毎日の半分の培地交換は、使用済みの培地の１０〜９５％を取り出し、等体積の新鮮なステージ３の培地で置き換えることで実行される。ステージ３培養の最後に、得られた細胞はサイズおよび倍数性が増大しており、成熟巨核球を示す多くの特色を示す（例えば、図３４から４２に示され、後述される通りである）。
一部の実施形態では、ステージ３の間に、巨核球前駆細胞は、数日以内に成熟ＭＫに分化する。一部の実施形態では、初期の均一な小さく丸い屈折性の細胞（図２０Ａ）は、２〜４日目にサイズおよび倍数性が増大し始める（図２０Ｂ、２０Ｃ）。同時に、血小板前駆体を産生するＭＫは、容易に観察することができる（図２０Ｄ）。ステージ３の３〜４日に、成熟ＭＫマーカーであるＣＤ４２ａおよびＣＤ４２ｂを共発現するＣＤ６１＋（巨核球系列）細胞の割合が劇的に増大し、９０％を超えるレベルに達し得る（図２１Ｂ）。一部の実施形態では、ステージ３培養物中の成熟ＭＫは、ステージ３の最後の１〜２４時間（例えば、５時間）にわたりヘパリンおよびＲＯＣＫ阻害剤の濃度を調整することによって、血小板前駆体を産生するように誘導することができる。この作用は、血小板前駆体を形成する能力の読み出しとして利用することができ、および／または血小板産生のために設計された血小板バイオリアクターまたは他の系の環境において血小板生成を同調および増大させるために利用することができる。例えば、一部の実施形態では、ステージ３分化は、例えばその内容が参照によりその全体として本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１８／２１３５４に記載されているミリフルイディクス（ｍｉｌｌｉｆｌｕｉｄｉｃ）バイオリアクターで実行される。
ステージ４．成熟巨核球からの血小板およびプレ血小板産生
ステージ３の後、血小板は、成熟ＭＫによって培養培地に産生される。これらの血小板は、回収し、定量化し、フローサイトメトリー、電子顕微鏡法、および蛍光顕微鏡法によって評価することができ、それにより、その真正な血小板としての正体が確認される（図４４Ａおよび４４Ｂ）。一部の実施形態では、血小板は、４〜５日後に放出される。
血小板およびプレ血小板は、ＭＫを何回か繰り返してせん断応力に供することによって、ｉＰＳＣ由来巨核球から産生される。一部の実施形態では、これは、成熟巨核球をミリフルイディクスバイオリアクターに播種することによって達成することができる。（図６３Ａ〜６５）。好適なバイオリアクターの様々な非限定的な実施形態は、ＵＳ９，７９５，９６５；ＵＳ２０１７／０１８３６１６；ＵＳ２０１８／０３３４６５２；ＷＯ２０１８１６５３０８に記載されており、それらの全体は参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、この例において、公知のサイズを有する較正ビーズを使用したフローサイトメトリーによって決定される場合、血小板は、直径が２〜５μｍ（例えば、直径が３μｍ）であり、プレ血小板は、直径が５μｍより大きい（図４３Ａ）。これらの血小板は、ゲノム物質を検出するＤＮＡインターカレート色素であるＤＲＡＱについて陰性染色され、血小板特異的表面受容体であるＣＤ６１について陽性染色されることが観察されており、ＤＲＡＱ−ＣＤ６１＋ゲート内で様々な程度の生存細胞（カルセインＡＭ）およびＣＤ４２ａ発現を有する。ヒトｉＰＳＣ由来血小板由来のＤＲＡＱ−ＣＤ６１＋細胞も血小板活性化のマーカーであるＣＤ６２ｐについて陰性染色されることから、それらが培養物から回収されるとき適切に休止した静止状態であることが示唆される（図４５）。何回か繰り返して、ｉＰＳＣ由来巨核球から分化したＰＬＴは、抗体染色およびそれに続くフローサイトメトリーによりヒトドナー血小板に関して評価した場合、コラーゲンに結合する受容体であるＧＰＶＩを欠如している（図４６Ｃ）。加えて、ｉＰＳＣ由来巨核球から分化したＰＬＴは、組織因子によって刺激される場合、トロンビンの生成において効率的であり、トロンビン生成アッセイにおいて末梢血液の血漿からの血小板で観察されているものに比べて、ラグタイムは低減し、より多くの量のトロンビンが得られる（図４７）。トロンビン生成は、標準的な方法によって検出できるトロンビン基質の蛍光原性分子への酵素による変換によって定量化される。グラフは、ｈｉＰＳＣ由来血小板試料における、トロンビンの急速な生成、加えてシグナルの急速な減少を示す。この作用は、９０分の過程にわたり末梢血液から単離された血小板から観察されたトロンビン生成と全く対照的である。
本明細書に記載されるヒトｉＰＳＣ由来血小板は、より短い時間枠にわたり、そのＧＰＶＩ発現の欠如およびより多くのトロンビン生成に関して、一次ヒトドナー由来血小板と区別される（図４６Ｃ〜４７）。それらは、精巣挙筋の細動脈における血栓形成のマウスｉｎ ｖｉｖｏレーザー傷害モデルにおいて、ヒトドナー由来血小板と同様にふるまい、それにおいて、傷害を受けた血管中の近位部位への輸注の後に、本明細書に記載されるドナー血小板（図４８Ａ）およびヒトｉＰＳＣ由来血小板（図４８Ｂ）の両方が、発達中の血栓に取り込まれる。このデータは、培養物から回収された場合、その静止を阻害しないヒトｉＰＳＣ由来血小板の固有な特色、およびｉｎ ｖｉｖｏにおいて血栓に寄与するその能力を実証する（図４８Ｂ）。これらのデータは、一次血小板とヒトｉＰＳＣ由来血小板との間で、止血および血栓症に関する血小板の機能性の同様の読み出しを実証する。
血小板を産生するための追加の方法は、本明細書において予期される。例えば、血小板は、その内容が参照によりその全体として本明細書に組み込まれるＵＳ９，７６３，９８４で開示された方法を使用して産生することができる。簡単に述べると、ステージ３の巨核球は、以下のうちの１つまたは複数：トロンボポエチン、または幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−１１、少なくとも１つのＲＯＣＫ阻害剤、およびヘパリンから選択される少なくとも１つの試薬を含む造血細胞増大培地と接触させてもよい。一部の実施形態では、ステージ３のものと同様の培養培地および増殖因子を使用することができる。本方法によって産生された血小板は、治療剤と共に負荷してもよいし、または目的の作用物質を含むように遺伝子改変してもよい。
３Ｄ系
充填層バイオリアクター
一部の実施形態では、３Ｄのスケーラブルな充填層バイオリアクターは、ｐｒｅＭＫ、巨核球、血小板、または巨核球および血小板のうちの１つまたは複数の産生のために使用することができる。一部の実施形態では、充填層バイオリアクターは、ステージ１およびステージ２培養に使用することができる（図４）。例えば、充填層リアクターは、ＰＳＣの造血性内皮細胞への分化、続いてｐｒｅＭＫの産生に使用することができる。充填層リアクターキャリアは、マイクロサイズまたはマクロサイズのいずれであってもよく、生体適合性プラスチック、金属、ガラス、または天然材料、例えばアルギネートから形成することができる。一部の実施形態では、キャリアは、ＰＴＦＥから、ラシヒリングの形状に、例えば１ｍｍのラシヒリングに形成される。一部の実施形態では、キャリアは、上述したマトリクスでコーティングされていてもよい。一部の実施形態では、キャリアは、ラミニン、例えば組換えヒトタンパク質であるラミニン５２１でコーティングされていてもよい。一部の実施形態では、多能性細胞は、凝集塊としてキャリア上に播種することができる。一部の実施形態では、培地は、毎日の培地交換で、取り出して、ステージ１の培地で置き換えることができる。一部の実施形態では、ステージ１の間、多能性細胞は、充填層リアクター中のキャリアの内部に成長領域を示し得る。一部の実施形態では、初期における多能性細胞の造血性内皮への分化（すなわち定方向分化のステージ１）、加えて、ｐｒｅＭＫのさらなる分化および放出（すなわち定方向分化のステージ２）は、同じ容器で行うことができる。例えば、充填層バイオリアクターは、多能性細胞、例えばｉＰＳＣが播種された、ラミニン−５２１でコーティングされたマクロキャリアを含んでいてもよい。次いで充填層は、培地の連続流に曝露されてもよく、それにより造血性内皮へのステージ１分化が可能になる。培地は、充填層に浸透させた後、馴化チャンバーに循環させることができ、そこで新鮮な培地構成成分が添加され、酸素／ＣＯ２濃度は、スパージングまたは他の手段を介して調整されてもよく、その後、培地は、細胞に再循環することができる。
ステージ１の完了時に、培地は、ステージ２の分化および産生ならびにｐｒｅＭＫの放出が可能になるように切り換えることができる。適切なサイズおよび形状にしたキャリア、例えば１ｍｍのラシヒリングは、放出された細胞の充填層を通る浸透および収集および凍結貯蔵のためのリアクターからの浸透を可能にするのに十分な培地の流れおよびチャネル幅を可能にし得る。一部の実施形態では、この設計は、細胞が受けるせん断力を減少させることができ、その灌流に基づく設計のために効率的な培地使用を可能にすることができ、それらが放出される場合、ｐｒｅＭＫの連続的な収集を可能にすることができる。
撹拌槽バイオリアクターにおける自己凝集性スフェロイド
一部の実施形態では、ある特定のプロセスステップは、スケーラブルな３Ｄ解決策を使用して行ってもよく、このステップは、撹拌または振とうされた容器中で懸濁した自己凝集性スフェロイドを使用して分化を実行することを含み得る（図３）。一部の実施形態では、このような容器は、表面上の特異的および非特異的な細胞固定を阻害することで、細胞を懸濁状態にするために、親水性または中性電荷を有するコーティングで表面コーティングされた低接着性表面または非接着性表面を含んでいてもよい。多能性細胞は、単一細胞に解離し、多能性幹細胞培養培地、例えば、これだけに限定されないが、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、またはＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）中に再懸濁することができる。一部の実施形態では、維持培地は、ＲＯＣＫ阻害剤、例えば、これだけに限定されないが、Ｙ２７６３２、Ｈ１１５２、またはそれらの組合せなどが補充されてもよい。一部の実施形態では、培地は、上皮増殖因子ファミリーメンバー、例えば、ヘレグリン−ベータ−１を含んでいてもよい。一部の実施形態では、培地は、可溶性ラミニン、例えば、組換えラミニン５２１を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ヘレグリン−ベータ−１の使用は、２４時間未満（例えば、１８〜２２時間）に制限される。次いで多能性細胞は、低接着性または非接着性容器中でインキュベートし、標準的な培養条件（例えば、３７Ｃ、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２）で撹拌に供されてもよい。撹拌を提供するための一部の実施形態において、インキュベーション容器は、一定撹拌で、オービタルシェーカー、またはシェーカーフラスコまたはスピナーフラスコ上に設置されていてもよいし、または制御撹拌槽バイオリアクターを使用してもよい。２４時間以内に、多能性細胞が自己凝集して、直径およそ５０〜１５０ｕｍのスフェロイドを形成することができる。撹拌を中断すると、スフェロイドは、容器の底部に沈降することができる。
次いで、培地をステージ１分化培地と部分的または完全に交換して、造血性内皮への分化を促進することができ、撹拌は、低酸素条件（例えば、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２）でのインキュベーションを伴い再開することができる。部分的または完全な培地交換は、定期的に（例えば、毎日）実行することができ、その期間中、スフェロイドはより大きく成長し、特徴的な構造および形状を発達させることができる。例えば、図２２Ａで示されるように、スフェロイドは、合計６日間（３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２で４日間、続いて３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２で２日間）培養することができる。図２９Ａで示されるように、６日目に、スフェロイドは、より大きく、より濃くなり、さらに不規則な表面を有する。
ステージ２に移行するために、撹拌を中断してもよく、スフェロイドを容器の底部に沈降させてもよい。次いで、培地をステージ２分化培地と部分的または完全に交換して、分化とそれに続くｐｒｅＭＫを含有する懸濁細胞の放出を促進することができる。その後定期的に（例えば、毎日）、懸濁細胞を収集してもよいし、部分的な培地交換を実行してもよい。放出されたステージ２細胞は、撹拌を中断し、凝集体を容器の底部に沈降させ、放出された懸濁細胞に伴う培地を収集することによって回収することができる。その後、培地半分の取換えは、付着細胞層または３Ｄ凝集体の上部に新鮮なステージ２の培地の元の体積の半分を添加することによって開始させることができる。培地中に収集された細胞のアリコートを、フローサイトメトリーによる生存細胞の数え上げおよびバイオマーカー分析のために取り出すことができる。次いで細胞の残りは、遠心分離、対向遠心による水簸、音波による分離、または他の関連技術によって濃縮することができる。濃縮後、半分の培地の取換えは、付着細胞層または３Ｄ凝集体に元の体積の半分の馴化培地を添加し戻すことによって完了させることができる。一部の実施形態では、追加の体積の新鮮な培地を添加してもよく、この場合、培養物の総体積を増大させるという正味の影響が伴う。一部の実施形態では、新鮮なステージ２の培地の置き換えまたは添加の代わりに、具体的な培地構成成分を培養物にスパイクしてもよい。上清の残りを廃棄してもよく、ｐｒｅＭＫを含有する細胞ペレットは、貯蔵してもよいし、またはステージ３に直接移行させてもよい。一部の実施形態では、ｐｒｅＭＫを含有する細胞は、２日から７日の期間にわたり（例えば３日間）収集してもよく、追加で、別々の容器においてステージ２培地または他の培地中で培養してもよい。最後の回収が完了したら、ｐｒｅＭＫを含有する細胞を一緒にプールし、貯蔵するかまたはステージ３に直接移行させてもよい。一部の実施形態では、ｐｒｅＭＫは、貯蔵のために凍結保存してもよい。例えば、ｐｒｅＭＫは、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ １０凍結保存培地中、−１８０℃で貯蔵してもよい。
ステージ３の静置培養に移行させると、３Ｄ自己凝集性スフェロイド培養物からのｐｒｅＭＫは、２Ｄ培養系からのｐｒｅＭＫと同様のＭＫ純度を生じさせることができる。さらに、３Ｄ自己凝集性スフェロイド培養物から生成したステージ３分化培養は、その真正な巨核球としての正体と一致して、サイズが劇的に増大し、血小板前駆体を生成することが可能な細胞を含有し得る。
ステージ５．ｐｒｅＭＫ、ＭＫ、プレ血小板、および血小板中の薬物負荷
図５〜７を参照して、定義された細胞型（例えば、ステージ２からの巨核球前駆細胞、ステージ３からの成熟巨核球、ステージ４からのプレ血小板、およびステージ４からの血小板）は、治療用組成物を保持または発現するように改変することができる。一部の実施形態では、これらの細胞型は、治療用組成物の封入および／または表面コンジュゲーション（他の方法のなかでも）の目的のために回収される。一部の実施形態では、治療用組成物は、小分子、生物製剤、核酸、または後述するものを含めた他のあらゆる形態の治療物質を含む。細胞型のいずれかに、またはその上に負荷された目的の治療剤は、（これだけに限定されないが）がん、血液病、肝疾患、肺疾患などの様々な適応症に使用することができる。
一部の実施形態では、治療用組成物を細胞懸濁物と共にインキュベートすることによって、標的細胞に治療用組成物を負荷することができる。一部の実施形態では、治療物質は、細胞によって能動的に取り込まれるが（例えば、受容体依存性の取り込み）、他の実施形態では、治療物質は、細胞によって受動的に取り込まれる（例えば血小板の開放小管系内への埋め込みによる、および／または受動拡散による、例えば受容体非依存性のエンドサイトーシス）。一部の実施形態では、本発明の方法は、治療用組成物の効率的な取り込みのために細胞の物理的または化学的な変形を必要としない。細胞によって取り込まれる治療剤は、細胞内に、例えば細胞の分泌顆粒中に貯蔵される。
一部の実施形態では、治療用組成物は、細胞（すなわち、巨核球前駆細胞、成熟巨核球、プレ血小板、および血小板）の表面にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、コンジュゲーションは、当業者公知の技術を使用する細胞表面の機能化を必要とする。一部の実施形態では、治療用組成物は、細胞表面または細胞表面上の官能基と結合できる、またはそれ以外の方法でそれらと相互作用できる反応性部分を含むことになる。
一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、治療用ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの産生、それに続くｉＰＳＣから巨核球および血小板への定方向分化のための導入遺伝子を発現させるように遺伝子操作されていてもよい。ｉＰＳＣへの導入遺伝子送達のためのウイルス形質導入および他の方法は、ｐｒｅ−ＭＫ、ＭＫ、およびＰＬＴにおける効率的な転写および翻訳を伴う薬物として使用することができる生物製剤の安定な発現をもたらすために使用することができる。
巨核球および血小板
一部の実施形態では、本開示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＳＣ細胞または細胞株から引き出された巨核球前駆細胞、巨核球、プレ血小板、血小板前駆体または血小板を提供する。本開示の態様によると、ＰＳＣ細胞または細胞株から引き出された巨核球前駆細胞、巨核球、プレ血小板、血小板前駆体または血小板は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，７６３，９８４号の方法または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２１３５４号に開示されているバイオリアクターを使用して産生される。
一部の実施形態では、本開示は、巨核球または巨核球前駆細胞を含む単離された細胞の集団を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、巨核球または巨核球前駆細胞を含有する組成物を提供する。本開示の一部の実施形態では、巨核球、巨核球前駆細胞またはそれらの産物を含む組成物が開示される。
本開示の一部の実施形態によると、巨核球、巨核球前駆細胞またはそれらの産物は、形状、サイズおよび／または表現型が均質である。本開示の巨核球、巨核球前駆細胞またはそれらの産物は、バイオマーカーの発現、サイズ、倍数性、数および純度に、対応するヒト細胞における変動性とは特徴的に異なる変動性を含み得ることが理解されるべきである。一部の実施形態では、そのような変動性を有意に低下させることができる。一部の実施形態では、細胞集団を、天然に存在する細胞の変動性よりも低いまたは高い所望の変動性を有するように創出することができる。
一部の実施形態では、巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）は、マーカーであるＣＤ４３およびＣＤ４１の発現、およびＣＤ１４の欠如（すなわち、ＣＤ１４−、ＣＤ４１＋、ＣＤ４３＋）を特徴とする。ＣＤ４２ｂの追加的な発現により、巨核球前駆細胞が成熟巨核球への最終的な成熟化の過程にあることが示され得る。ある特定の実施形態では、分化培養下で生成した巨核球前駆細胞は非接着性であり、培養培地中を自由に浮遊し得る。
一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ４２ａ＋、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ４１＋、ＣＤ６１＋、ＧＰＶＩ＋、およびＤＮＡ＋のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ４２ａ＋、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ４１＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ４２ａ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ４２ａ＋、ＣＤ４１＋、およびＤＮＡ＋のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ４１＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ４２ａ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋のうちのうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ４２ａ＋、ＣＤ４１＋、およびＤＮＡ＋のうちのうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、巨核球は、ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＣＤ４２ｂ＋ＧＰＶＩ＋である。一部の実施形態では、巨核球は、ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ＋ＧＰＶＩ＋である。
一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ６１＋およびＤＮＡ＋であり、直径が約１０〜５０μｍである。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される巨核球の平均サイズは、１０μｍから２０μｍの間、１１μｍから１９μｍの間、１２μｍから１８μｍの間、１３μｍから１７μｍの間、１４μｍから１６μｍの間、１４μｍから１５μｍの間である。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される巨核球の平均サイズは、１４．５μｍである。一部の実施形態では、本巨核球の直径は、約１０〜２０μｍである。一部の実施形態では、本巨核球の直径は、約１０〜３０μｍである。一部の実施形態では、本巨核球の直径は、約１０〜４０μｍである。一部の実施形態では、本巨核球の直径は、約１０〜５０μｍである。一部の実施形態では、本巨核球の直径は、約２０〜４０μｍである。一部の実施形態では、本巨核球の直径は、約２５〜４０μｍである。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生された本巨核球は、２Ｎ−１６Ｎの倍数性を有する。一部の実施形態では、本巨核球は、少なくとも４Ｎ、８Ｎ、または１６Ｎの倍数性を有する。一部の実施形態では、本巨核球は、４Ｎ〜１６Ｎの倍数性を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生された本巨核球は、ステージ３培養の７２時間において、４Ｎより高次のＤＮＡを有するＣＤ６１＋細胞が１６％＋／−１１．４％である。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生された巨核球集団の少なくとも５０％は、ＣＤ６１＋およびＤＮＡ＋であり、２Ｎから１６Ｎの倍数性を有する。例えば、代表的なｉＰＳＣ分化培養物からの巨核球（すなわちベータ−１−チューブリン陽性ステージ３細胞）は、約９μｍから約２７μｍのサイズ範囲を有し、中央値は１５μｍである（図４０Ｂ）。この平均サイズは、様々な骨髄供給源からの「正常な」巨核球と同様に匹敵する（図４０Ｃ）。
一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも５０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも５５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも６５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも６０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも７０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも７５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも８０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも８５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９８％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。
一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも５０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも５５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも６５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも６０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも７０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも７５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも８０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも８５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９８％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。
一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも５０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも５５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも６５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも６０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも７０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも７５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも８０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも８５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９８％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。
一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、倍数性が４Ｎまたはそれよりも大きい巨核球を少なくとも５０％含有する。一部の実施形態では、少なくとも５０％の巨核球の倍数性が４Ｎ〜１６Ｎである。一部の実施形態では、少なくとも６０％の巨核球の倍数性が４Ｎ〜１６Ｎである。一部の実施形態では、少なくとも７０％の巨核球の倍数性が４Ｎ〜１６Ｎである。一部の実施形態では、少なくとも８０％の巨核球の倍数性が４Ｎ〜１６Ｎである。一部の実施形態では、少なくとも９０％の巨核球の倍数性が４Ｎ〜１６Ｎである。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、平均倍数性が４Ｎである巨核球を含有する。
一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、本開示の巨核球から生成された血小板前駆体、プレ血小板または血小板を含有する。一部の実施形態では、血小板前駆体、プレ血小板または血小板は、ＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ−細胞である。一部の実施形態では、巨核球は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｈｉＰＳＣ細胞または細胞株の分化によって産生される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される巨核球は、以下の１つまたは複数を含む：（ａ）免疫蛍光顕微鏡によるＭＫ顆粒の含有量：アルファ顆粒についてはＰＦ４およびＶＦＷ、高密度顆粒についてはＬＡＭＰ−１およびセロトニン；（ｂ）遺伝子発現データ：Ｏｃｔ４−、Ｎａｎｏｇ−、Ｓｏｘ２−、Ｚｆｐ４２−、Ｚｆｐｍ１＋、Ｎｆｅ２＋、Ｒｕｎｘ１＋、Ｍｅｉｓ１＋、Ｇａｔａ１＋；（ｃ）低フィブリノーゲン、セロトニン、およびＬＤＬを有する／フィブリノーゲン、セロトニン、およびＬＤＬを有さない、ならびに（ｄ）血漿と一緒にインキュベートすると、フィブリノーゲン、セロトニン、およびＬＤＬを取り込むことができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される巨核球は、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、および関連因子の特徴的な発現プロファイルを有する（図４２）。一部の実施形態では、本開示は、血小板由来増殖因子アイソフォームＰＤＧＦ−ＡＡまたはＰＤＧＦ−ＢＢ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、造血成長因子であるＦｌｔ３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−８、もしくはＩＬ−１６）、ＣＸＣケモカインファミリーメンバーであるＣＸＣＬ１（ＧＲＯアルファ）もしくはＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるｓＣＤ４０ＬもしくはＴＲＡＩＬ、またはＣＣケモカインファミリーメンバーであるＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＣＬ２１（６ＣＫｉｎｅ）もしくはＣＣＬ２４（エオタキシン−２）などの因子を含み得る本巨核球を含む組成物または医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本巨核球の溶解物を含む組成物または医薬組成物を提供する。そのような溶解物は、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、ｐｒｅＭＫまたはＭＫの膜を、その完全性を損なうウイルス、酵素的、または浸透圧機構によって破壊することによって調製することができる。溶解物は、一部の実施形態では、特定の適用の必要性に応じて、追加的な作用物質を含み得る、または異なる組成物（液体、ペーストなど）として調製することができる。一部の実施形態では、そのような組成物は、血小板由来増殖因子アイソフォームＰＤＧＦ−ＡＡまたはＰＤＧＦ−ＢＢ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、造血成長因子であるＦｌｔ３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−８、またはＩＬ−１６）、ＣＸＣケモカインファミリーメンバーであるＣＸＣＬ１（ＧＲＯアルファ）もしくはＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるｓＣＤ４０ＬもしくはＴＲＡＩＬ、またはＣＣケモカインファミリーメンバーであるＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＣＬ２１（６ＣＫｉｎｅ）もしくはＣＣＬ２４（エオタキシン−２）などの因子を含み得る。
一部の実施形態では、本血小板は、ＣＤ６１＋、ＤＲＡＱ−、カルセインＡＭ＋、ＣＤ４２ａ＋、およびＣＤ６２Ｐ−（休止状態で）のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本血小板は、ＣＤ６１＋、ＤＲＡＱ−、カルセインＡＭ＋、およびＣＤ６２Ｐ−である。一部の実施形態では、本血小板は、ＣＤ６１＋、ＤＲＡＱ−、カルセインＡＭ＋、ＣＤ４２ａ＋、およびＣＤ６２Ｐ＋（活性化状態で）のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本血小板は、ＣＤ６１＋、ＤＲＡＱ−、カルセインＡＭ＋、およびＣＤ６２Ｐ＋である。一部の実施形態では、本血小板は、細胞表面上でＧＰＶＩを発現しないという点でドナー血小板とは異なるが、それでもなお、ＣＤ６１＋、ＤＲＡＱ−、カルセインＡＭ＋、ＣＤ４２ａ＋、ならびにＣＤ６２Ｐ−（休止状態で）の１つまたは複数、および／またはＣＤ６１＋、ＤＲＡＱ−、カルセインＡＭ＋、ＣＤ４２ａ＋、ならびにＣＤ６２Ｐ＋（活性化状態で）のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本血小板は、細胞表面上でＧＰＶＩを発現しないという点でドナー血小板とは異なるが、それでもなお、ＣＤ６１＋、ＤＲＡＱ−、カルセインＡＭ＋、ＣＤ４２ａ＋、およびＣＤ６２Ｐ−（休止状態で）、ならびに／またはＣＤ６１＋、ＤＲＡＱ−、カルセインＡＭ＋、ＣＤ４２ａ＋、およびＣＤ６２Ｐ＋（活性化状態で）である。一部の実施形態では、本血小板は、細胞表面上でＧＰＶＩを発現しないという点でドナー血小板とは異なるが、それでもなおＣＤ６１およびＣＤ６２Ｐ＋である。一部の実施形態では、本血小板は、約１μｍの直径を有する。一部の実施形態では、本血小板は、約２μｍの直径を有する。一部の実施形態では、本血小板は、約３μｍの直径を有する。一部の実施形態では、本血小板は、約４μｍの直径を有する。一部の実施形態では、本血小板は、約５μｍの直径を有する。一部の実施形態では、本血小板前駆体は、５μｍであるかまたはより大きい。一部の実施形態では、本血小板は、分泌顆粒、開放小管系、および高密度の管系を含有する（図４４Ａ）。一部の実施形態では、本血小板は、特徴的なβ１−チューブリンリングを含有する（図４４Ｂ）。一部の実施形態では、本血小板は、ガラス表面上で活性化し、糸状偽足および葉状仮足を示す（図４４Ｂ）。一部の実施形態では、本血小板は、凝血促進剤による刺激を受けると、より短い時間枠でトロンビンを優先的に生成する点でドナー血小板とは異なる（図４７）。一部の実施形態では、本血小板は、マウスの傷害を受けた精巣挙筋の細動脈における血栓への取り込みに関して、ドナー血小板と同様にふるまう（図４８）。
一部の態様では、ＣＤ６１＋、ＤＲＡＱ−、カルセインＡＭ＋、ＣＤ４２ａ＋、およびＣＤ６２Ｐ−（休止状態で）のうちの１つまたは複数である血小板を含む組成物が提供される。一部の実施形態では、本血小板は、ＣＤ６１＋、ＤＲＡＱ−、カルセインＡＭ＋、ＣＤ４２ａ＋、およびＣＤ６２Ｐ＋（活性化状態で）のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、組成物は、ＧＰＶＩを発現しない血小板を含む。
薬物送達ビヒクルとしての巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板および血小板
血小板は、血流を循環し、体内のあらゆる器官と接触することから、用途が多く、カスタマイズ可能であり、標的化可能な薬物送達系の一部として役立つ可能性が血小板にもたらされる。さらに、血小板は、その免疫調節および血管新生機能のために、腫瘍によって能動的に補充されて、免疫回避に役立ち、その成長と転移を支持する。本開示の一部の態様によれば、ｅｘ ｖｉｖｏの本明細書に記載されるＰＳＣ由来巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、治療用組成物、例えば薬物、小分子、生物製剤（例えばタンパク質）または同様の治療剤を送達するためのビヒクルとして使用することができる。このタイプの薬物送達の利益としては、これだけに限定されないが、薬物の透過性または保持により課せられた制限のために標的化が従来困難な組織に分子を送達する能力；標的化組織への薬物の局在化および濃縮；治療標的における選択的な放出まで巨核球／プレ血小板／血小板分泌顆粒中に薬物を隠すことによる、患者を全身処置する必要性の低減；および不要な毒性または免疫原性の回避が挙げられる。一部の実施形態では、このタイプの薬物送達はまた、所望の治療結果を達成して、全身毒性を減少させるのに必要な投薬量を低くすることができる。
「治療用組成物」、「薬物」、「治療物質」、および「作用物質」という用語は、同義的に使用され、あらゆる小分子化合物、抗体、核酸分子、ポリペプチド、または他のあらゆる生物製剤またはそれらの断片を指す。一部の実施形態では、治療用組成物は、目的の標的と結合する作用物質、目的の標的に対する抗体、目的の標的のアゴニストもしくはアンタゴニスト、目的の標的のペプチドミメティクス、目的の標的に対して向けられた小型ＲＮＡまたは目的の標的の模倣物などであり得る。一部の実施形態では、治療用組成物は、目的の標的の発現および／または活性をモジュレートすることができる。
一部の実施形態では、治療用組成物は、ポリペプチドまたは小分子である。例えば、ポリペプチドは、アテゾリズマブ、完全ヒト化モノクローナル抗体であってもよい。追加のポリペプチドは、イピリムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、またはトラスツズマブであってもよい。小分子の例としては、これだけに限定されないが、アリピプラゾール、エソメプラゾール、またはロスバスタチンが挙げられる。
一部の実施形態では、治療用組成物は、がんを処置する、阻害する、および／または防止するのに好適な抗血管形成剤または化学療法剤を含む。抗血管形成剤の例としては、これだけに限定されないが、ドキソルビシン、ＤＮＡ傷害剤が挙げられる。追加の例としては、ビンクリスチン、イリノテカン、およびパクリタキセルが挙げられる。
一部の実施形態では、治療用組成物は、これだけに限定されないが、ＶＷＦ、ケラチノサイト増殖因子、凝血因子（例えばＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ）、上皮増殖因子、または毛髪増殖因子などの増殖因子を含む。ＦＶＩＩａは、出血の制御が不可能な患者において利益であることが示されている活性化凝固因子である。この作用を達成するために、ＦＶＩＩａは、コスト的に影響を及ぼす高い濃度で全身投与され、一部の患者では血栓性合併症を引き起こすことが示されている。本開示のプロセスに従って生成した、ＦＶＩＩａが過剰に供給された巨核球前駆細胞、巨核球、プレ血小板、または血小板は、傷害後の短い期間で止血および生存を著しく改善することができる。第ＶＩＩＩ因子は、血液凝固に参加するものであり、これは、第ＩＸａ因子のための補因子であり、Ｃａ２＋およびリン脂質の存在下で、第Ｘ因子を活性化第Ｘａ因子に変換する複合体を形成する。ヒトにおいて、第ＶＩＩＩ因子は、Ｆ８遺伝子によってコードされる。この遺伝子がないと、Ｘ連鎖劣性の凝血障害である血友病Ａになる。傷害に応答して、凝血因子ＶＩＩＩは活性化され、フォン・ヴィルブランド因子から分離されて、ＦＶＩＩＩａになる。第ＩＸ因子は、凝血系におけるセリンプロテアーゼである。このタンパク質の欠乏は、血友病Ｂの原因となる。第ＩＸ因子は、不活性な前駆体である酵素原として産生される。これがプロセシングされてシグナルペプチドが除去され、グリコシル化され、次いで第ＸＩａ因子（接触経路の）または第ＶＩＩａ因子（組織因子経路の）によって切断されて、鎖がジスルフィド架橋で連結されている２本鎖の形態が生じる。Ｃａ２＋、膜リン脂質、および第ＶＩＩＩ因子の補因子の存在下で第ＩＸａ因子に活性化されると、これは第Ｘ因子中の１つのアルギニン−イソロイシン結合を加水分解して、第Ｘａ因子を形成する。
一部の実施形態では、治療用組成物は、ケモカインまたは増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子アイソフォーム（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢおよび−ＢＢ）、形質転換増殖因子−ｂ（ＴＧＦ−ｂ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、ならびに骨形成タンパク質２、−４および−６（ＢＭＰ−２、−４、−６）である。
一部の実施形態では、治療用組成物は、タンパク質である。一部の実施形態では、タンパク質は、サイトカイン、例えば、インターロイキン１−ベータ、インターロイキン２、またはインターロイキン１２などである。一部の実施形態では、タンパク質は、抗体タンパク質である。一部の実施形態では、抗体は、アテゾリズマブまたはイピリムマブである。
血小板前駆体、プレ血小板および血小板は、それらが巨核球から獲得した分泌顆粒中に生物活性因子を貯蔵する。一部の実施形態では、本開示の血小板前駆体、プレ血小板および血小板は、治療用組成物を貯蔵するか、またはそれ以外の方法で保持するように改変されていてもよい。
一部の実施形態では、血小板は、その表面上にタンパク質を発現するように操作されてもよいし、またはそれ以外の方法でその表面上にタンパク質でタグ付けされてもよいし、または様々な抗体または分子を発現するように操作されてもよいし、またはそれらの分泌顆粒に様々な抗体または分子を「取り込む」ように培養されてもよい。このような操作された血小板は、治療用組成物を輸送し、所望の組織（または治療標的）に方向付けるのに使用することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作は、ＰＳＣレベルで、または巨核球前駆細胞レベルで行うことができ、発現を条件的に制御して、巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板で発現されるようにする。
本開示の一部の態様は、標的化適用のための所望の特徴を発現する改変された巨核球、血小板前駆体、プレ血小板または血小板に関する。これらのツールは、市販のための実施を妨げてきた欠点（コストが高いこと、時間がかかること、および製品の規模を調整できないこと）を生じることなく、個別化医療手法が約束する特殊化された結果をもたらすのに利用することができる。個々のドナーから特注ｈＰＳＣ株を生成するというより、治療用製品の製造に最適化されたｃＧＭＰに準拠したｈＰＳＣ株を利用するプラットフォームを開発することが優先される。次いで、標的化された治療剤およびレシピエントのためのデザイナー製品が生成されるように、ｈＰＳＣ株の遺伝学的対照を適用することができる。
一部の実施形態では、改変された巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、目的のタンパク質（ポリペプチド、ペプチドを含む）を発現する。一部の実施形態では、改変された巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、高レベルの目的のタンパク質（ポリペプチド、またはペプチドを含む）を発現する。一部の実施形態では、本巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、目的のタンパク質（ポリペプチドまたはペプチドを含む）の発現を低減するかまたはその発現を抑制するように遺伝子改変されている。一部の実施形態では、本巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、目的のタンパク質（ポリペプチドまたはペプチドを含む）を発現するかまたは過剰発現するように、目的のタンパク質（ポリペプチドまたはペプチドを含む）の発現を低減するかまたはその発現を抑制するように、または前述のものの任意の組合せのために、遺伝子改変されている。例えば、一部の実施形態では、改変された巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、それらの顆粒中で、高レベルの凝固因子、例えば第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、またはＶＷＦを発現し、それによって全身性の過剰凝血のリスクを生じることなく傷害部位で血餅形成を強化する。一部の実施形態では、改変された巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、外傷に標的化され、重度の外傷性傷害後の最初の「一刻を争う時間」の間における血小板輸血の有効性を増加させる。操作された本巨核球前駆細胞、巨核球、プレ血小板、または血小板の別の可能性のある適用は、胎児および新生児の同種免疫性血小板減少（ＦＮＡＩＴ）の処置における適用である。この状態では、母親が発現しないヒト血小板抗原（ＨＰＡ）を発現する胎児血小板が母親の免疫系によって標的化されることで、胎児の血小板減少症および重篤な潜在的な合併症（胎児の頭蓋内出血を含む）を引き起こす。一部の実施形態では、この状態は、単一の塩基対の変更により操作された本巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板を使用して処置され、そのようにしてＨＰＡ陰性の女性による出産後にＨＰＡ（陰性）血小板または微小粒子がＨＰＡ陽性の子供に投与され、それによりＨＰＡに付随するクリアランスが防止される。
一部の実施形態では、改変された巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、増殖因子を送達する。一部の実施形態では、増殖因子が負荷された、または増殖因子を発現する、改変された巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、細胞培養、組織再生、創傷治癒、機能性化粧品、および止血用絆創膏のために使用される。
一部の実施形態では、本巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、免疫チェックポイント阻害薬、例えば、これだけに限定されないが、抗ＰＤＬ１、抗ＰＤ１、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＤ２０および抗ＣＴＬＡ４、または抗ＣＣＲ４、もしくは抗ＰＩ３Ｋのような抗がん薬を送達するように改変されている。一部の実施形態では、本巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、サイトカイン、例えば、これだけに限定されないが、インターロイキン１ベータ、インターロイキン２またはインターロイキン１２を送達するように改変されている。
ｉＰＳＣ由来巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板または血小板への治療用組成物の負荷
図５および図６を参照すれば、一部の実施形態では、本開示に従って、ｉＰＳＣ由来巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板または血小板に、またはその上に、治療用組成物を負荷することができる。
一部の実施形態では、図５で示されるように、本巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板に、治療用組成物を負荷することができる。例えば、水溶液中で小分子を細胞と共インキュベートすることによって、これらの細胞に小分子を負荷することができる（図５）。一部の実施形態では、治療用組成物は、溶液または透析カセット中に、１〜２００μＭの濃度（例えば、１００μＭ）で、１０５から１０７個の細胞、例えば１０６個の細胞を含む細胞懸濁物と共に存在する。治療用組成物と細胞懸濁物との組合せは、室温で、または３７℃で、３０分間から２４時間、例えば４時間インキュベートされる。一部の実施形態では、細胞懸濁物中で細胞に治療用組成物を負荷することは、透析カセット（すなわち、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ透析デバイス）中で、一定撹拌により促進され、それにより血小板が負荷プロセス中に「静止状態」のままでいることを可能にする。
一部の実施形態では、治療剤組成物、例えば上述したものなどは、ｉＰＳＣ由来血小板、巨核球、巨核球前駆細胞、およびプレ血小板に、受動的な負荷（「スポンジ負荷」としても公知）によって負荷することができる。一部の実施形態では、受動的な負荷は、１から５時間にわたり、例えば２時間にわたり、室温または３７℃で、水性緩衝液中のＭＫ、ＭＫ前駆細胞、プレ血小板、および／または血小板の細胞懸濁物に、治療用組成物を添加することによって達成される。一部の実施形態では、細胞懸濁物を２から１０倍、例えば５倍希釈することによって、細胞懸濁物から過量の治療物質を洗い落とす。次いで希釈した細胞懸濁物を遠心分離し、上清を除去し、治療物質が負荷された細胞懸濁物を新鮮な培地に再懸濁する。
理論にとらわれずに言えば、本巨核球前駆細胞、巨核球、プレ血小板、または血小板を治療用組成物と共にインキュベートすることは、細胞の分泌顆粒（例えばアルファ顆粒、高密度顆粒）への治療用組成物の捕捉を引き起こす。一部の実施形態では、治療用組成物が負荷された本巨核球前駆細胞、巨核球、プレ血小板、または血小板は、炎症部位、血管の傷害、組織再生、リンパ脈管新生（lymphoangiogenesis）、がんの発達、進行および転移などの標的部位に治療用組成物を局所的に送達するのに使用することができる。
図６を参照すれば、ｉＰＳＣ由来血小板、巨核球、巨核球前駆細胞、およびプレ血小板はまた、他の細胞器官、細胞内区画、および細胞構造のなかでも特に細胞膜への治療用組成物の共有結合によるコンジュゲーションによって、治療用組成物が負荷されてもよい。共有結合によるコンジュゲーションは、（これだけに限定されないが）膜タンパク質とスルフヒドリル反応性架橋剤とのチオール化（図５４）、アルキン反応性アジ化物、ビオチンとアビジン（およびアビジン類似体）を含めた高親和性結合剤、膜に結合したエピトープへの抗体のドッキング、および他の方法などの様々なバイオコンジュゲーション技術を使用して達成することができる。一部の実施形態では、治療用組成物の共有結合によるコンジュゲーションは、治療剤中のアミノ酸に存在するアミンを、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（図５４Ｂ）と、１から４時間、例えば２時間（図５４Ｂ）反応させることによって達成される。一部の実施形態では、血小板（および他の細胞型）は、トラウト試薬（Ｓｉｇｍａ）としても公知の２−イミノチオランを使用した第一アミンからの変換によって、反応性チオール基で機能化される（図５４Ａ）。一部の実施形態では、細胞の膜への治療用組成物の化学的コンジュゲーションを完了させるために、ＳＭＣＣと反応した治療剤と、トラウト試薬で処理した細胞懸濁物とが共インキュベートされる（図５４Ｃ）。
治療用組成物を発現させるためのｉＰＳＣ由来巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板または血小板の遺伝子操作
図７を参照すれば、本開示の一部の態様では、ｉＰＳＣ由来巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板または血小板は、目的のタンパク質（目的のポリペプチドまたはペプチドを含む）を発現するように改変することができる。このような改変は、幹細胞レベルで、または本開示の血小板生成プロセス中の他のあらゆるレベルで行うことができる。例えば、本開示は、操作されたｈＰＳＣ細胞または細胞株から分化した、改変された巨核球または巨核球前駆細胞であって、改変された巨核球または巨核球前駆細胞は、目的のタンパク質（目的のポリペプチドまたはペプチドを含む）を発現する、巨核球または巨核球前駆細胞を提供する。一部の実施形態では、改変された巨核球または巨核球前駆細胞由来の血小板前駆体、プレ血小板または血小板はまた、目的のタンパク質も発現することができ、標的部位に目的のタンパク質を送達するのに使用することができる。
本開示の一部の態様では、ＰＳＣ由来巨核球は、少なくとも１つの目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を発現するように操作される。本開示のさらに他の態様では、ＰＳＣは、少なくとも１つの目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を発現するように操作され、少なくとも１つの目的のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質を発現する巨核球、または少なくとも１つの目的のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質を含むプレ血小板または血小板は、米国特許第９，７６３，９８４号の方法、または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２１３５４号で開示されたバイオリアクターを使用して産生することができ、これらは、この参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本開示の一部の態様では、ＰＳＣ由来巨核球は、目的のＤＮＡまたはＲＮＡを含むように操作される。本開示のさらに他の態様では、ＰＳＣは、目的のＤＮＡまたはＲＮＡを含むように操作される。一部の実施形態では、目的のＤＮＡまたはＲＮＡを含む改変された巨核球または巨核球前駆細胞由来のプレ血小板または血小板は、目的のＤＮＡまたはＲＮＡを送達することができる。
一部の実施形態は、少なくとも１つの目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を発現するように操作された、操作されたＰＳＣを含む組成物または単離された集団に関する。一部の実施形態では、タンパク質は、サイトカイン、ケモカインまたは増殖因子である。一部の実施形態は、少なくとも１つの目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を発現するように操作された巨核球を含む組成物または単離された集団に関する。一部の実施形態では、タンパク質は、サイトカイン、ケモカインまたは増殖因子である。一部の実施形態は、少なくとも１つの目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を発現するように操作された巨核球からｅｘ ｖｉｖｏで産生された血小板を含む組成物に関する。一部の実施形態では、タンパク質は、サイトカイン、ケモカインまたは増殖因子である。少なくとも１つの目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する改変された巨核球によって産生されたプレ血小板または血小板は、少なくとも１つの目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を目的の部位に送達するための送達ビヒクルとして使用することができる。一部の実施形態では、タンパク質は、サイトカイン、ケモカインまたは増殖因子である。
一部の実施形態は、目的のＤＮＡまたはＲＮＡを含むように操作された、操作されたＰＳＣを含む組成物または単離された集団に関する。一部の実施形態は、目的のＤＮＡまたはＲＮＡを含むように操作された巨核球を含む組成物または単離された集団に関する。一部の実施形態は、目的のＤＮＡまたはＲＮＡを含むように操作された巨核球からｅｘ ｖｉｖｏで産生された血小板を含む組成物に関する。目的のＤＮＡまたはＲＮＡを含む改変された巨核球によって産生された血小板前駆体、プレ血小板または血小板は、目的の標的部位に目的のＤＮＡまたはＲＮＡを送達するための送達ビヒクルとして使用することができる。
少なくとも１つの目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を発現するか、または目的のＤＮＡまたはＲＮＡを含む改変された巨核球（またはその生成物）は、様々な疾患の処置のために使用することができることが理解されるものとする。
本開示の一部の態様では、目的のＤＮＡまたはＲＮＡまたは目的のタンパク質をコードするＲＮＡまたはＤＮＡは、熟練した技術者が組み込むおよび／または発現させることを望むあらゆる遺伝子であり得る。一部の実施形態では、少なくとも１つの目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも１つの目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸分子（すなわち目的の遺伝子）を、巨核球または前駆細胞、例えばｉＰＳＣ細胞に送達することによって、巨核球中で発現させることができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸分子は、発現ベクター内に含有されていてもよい。一部の実施形態では、ベクターは、１つまたは複数の合成ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸、ペプチド核酸など）またはヌクレオシド連結（例えば、ホスホロチオエート連結）を含む。ベクターは、一本鎖、二本鎖であってもよいし、または一本鎖と二本鎖の両方を有する領域を含有していてもよい。例示的なベクターとしては、これだけに限定されないが、プラスミド、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純疱疹ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターが挙げられる。一部の実施形態では、目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸分子は、巨核球特異的なプロモーターを使用して発現させることもできる。一部の実施形態では、ベクターは、治療用ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、ｍＲＮＡをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、プロモーターを含む治療用遺伝子の核酸配列、またはその断片を含む。目的の核酸分子を含むベクターは、これだけに限定されないが、形質導入、トランスフェクション、感染、および電気穿孔などの当技術分野で公知のあらゆる方法を介して、細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、巨核球前駆細胞、または巨核球）に送達することができる。
巨核球および血小板中に封入された治療剤の標的化送達
一部の実施形態では、本開示の巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板に、ｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞性薬物製品を輸血するときに循環から遮蔽されると予想される治療剤が負荷される。血小板は、天然にがん病変、固形腫瘍、および循環腫瘍細胞に導かれ、これは、一部の例では、露出したコラーゲンおよび他の細胞外マトリクス構成成分との受容体相互作用によるものであり、他の例では、血小板活性化のときに露出した表面である受容体によるものである。血小板は、これらの相互作用の結果として腫瘍細胞に応答して凝集することが公知である（これは、腫瘍細胞により誘発される血小板凝集としても公知である）。血小板は、これらの相互作用によって「活性化」され、受動的な薬物負荷によって、またはｉＰＳＣ、巨核球前駆細胞、巨核球、および「デザイナー」血小板を産生する他のあらゆる細胞の遺伝学的改変によってこれらの細胞に負荷された小分子および生物学的治療剤を含むその分泌顆粒の内容物を分泌することになる。これらはまた、微小胞を産生するエキソサイトーシスプロセスの一部としてそれらの膜を脱ぎ捨てることになる。一部の実施形態では、原形質膜に小分子および生物学的薬物が共有結合でコンジュゲートした血小板は、微小胞形成中に安定して結合したままになると予想され、腫瘍細胞により誘発される血小板凝集の結果として、がんに選択的に送達される。一部の実施形態では、遺伝子改変されたヒトｉＰＳＣ、巨核球前駆細胞、または巨核球は、表面受容体からの膜アンカードメイン、一部の例においてＣＤ３およびＤＡＦに融合した組換え生物学的薬物を発現し、それを細胞表面に特異的に送達するように操作することができる。原形質膜に固定された組換え生物学的薬物はまた、血小板活性化の結果として微小胞に取り込ませることによって、疾患病理の部位に送達することもできる。原形質膜に固定された組換え生物学的薬物はまた、標的化薬物送達の別の例において、酵素、一部の例では、固形腫瘍、がん病変、または血管損傷もしくは血管新生部位などの疾患病理の部位において豊富なマトリクスメタロプロテアーゼが、組換え生物学的薬物を切断することが可能になるように、プロテアーゼ切断部位を含んでいてもよい。
本開示の実施は、別段の指定がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を採用することができ、これらは十分に当業者の範囲内である。このような技術は、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)などの文献において詳細に説明されている。これらの技術は、本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本開示を作製および実施することにおいて検討することができる。特定の実施形態に特に有用な技術を以下の節で論じることとする。
使用方法
上記で論じられたように、一部の実施形態では、本開示の巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、このような治療用組成物の標的化送達のための治療用組成物を含むように改変することができる。特定には、本開示の巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、それらの顆粒の表面上またはその中のいずれかに（例えば受動的な吸収または共有結合によるコンジュゲーションによって）治療用組成物が負荷されてもよいし、または治療用組成物を発現するように遺伝子操作されていてもよい。
一部の実施形態では、本開示の巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、薬物送達のための他のナノ粒子材料と組み合わせて使用することができる。例えば、一部の実施形態では、本開示の巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板の膜は、治療用組成物との相互作用および治療用組成物の輸送に適合する１つまたは複数の材料を含む薬物送達系のための外部シェルとして使用することができる。例えば、外部シェルである血小板膜は、がん細胞と相互作用することが可能な血小板タンパク質を含み得る。一部の実施形態では、このような薬物送達ビヒクルは、本開示の巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板を溶解させること、および溶解させた細胞の外膜に治療用組成物を含む薬物送達系を充填することによって調製することができる。
一部の実施形態では、本開示の巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、ヒト増殖因子などの増殖因子の供給源であってもよい。一部の実施形態では、このような増殖因子は、細胞培養、組織再生、創傷治癒、骨再生、機能性化粧品、および止血用絆創膏のために使用することができる。一部の実施形態では、本開示の巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、もしくは血小板またはそれらの溶解物もしくはそれらの組成物は、細胞培養で使用することができる。一部の実施形態では、本開示の巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、もしくは血小板またはそれらの溶解物もしくはそれらの組成物は、機能性化粧品として使用することができる。
例えば、血小板は、巨核球から獲得する生物活性因子を分泌顆粒中に貯蔵する。内容物としては、血小板由来増殖因子アイソフォーム（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢおよび−ＢＢ）、形質転換増殖因子−ｂ（ＴＧＦ−ｂ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）および骨形成タンパク質２、骨形成タンパク質４および骨形成タンパク質６（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６）などの種々のケモカインおよび増殖因子が挙げられる。ヒト血小板溶解物により、ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞の増大が劇的に増加し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける骨髄再生が改善され、放射線試験における動物の生存率が上昇する。一部の実施形態では、本開示は、本巨核球から生成された血小板前駆体、プレ血小板または血小板の溶解物を含む組成物または医薬組成物を提供し、そのような組成物は、血小板由来増殖因子アイソフォームＰＤＧＦ−ＡＡまたはＰＤＧＦ−ＢＢ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、造血成長因子であるＦｌｔ３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−８、もしくはＩＬ−１６）、ＣＸＣケモカインファミリーメンバーであるＣＸＣＬ１（ＧＲＯアルファ）もしくはＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるｓＣＤ４０ＬもしくはＴＲＡＩＬ、またはＣＣケモカインファミリーメンバーであるＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＣＬ２１（６ＣＫｉｎｅ）もしくはＣＣＬ２４（エオタキシン−２）などの因子を含み得る。
投与
本開示の態様は、本開示の実施形態による本巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板を含む医薬組成物に関する。一部の実施形態では、医薬組成物は、本開示の実施形態による本巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板を、薬学的に許容されるキャリアと共に含む。例えば、キャリアは、希釈剤、アジュバント、保存剤、抗酸化剤、可溶化剤、乳化剤、緩衝液、水、水溶液、油、賦形剤、補助剤もしくはビヒクルまたはそれらの組合せであってもよい。好適な薬学的キャリアは、"Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa.); Gennaro, A. R., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (Lippincott, Williams and Wilkins); Liberman, et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y.; and Kibbe, et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association, Washingtonに記載されている。一部の実施形態では、キャリアは、静脈内投与に適したものでもよい。
本開示の態様は、それを必要とする被験体を処置する方法であって、本巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法に関する。
本開示の実施形態による本巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板を含む組成物の好適な用量および投薬レジメンの、それを必要とする被験体への投与は、被験体の年齢、性別、体重、全身の医学的状態、および組成物を投与するための具体的な状態に基づいて決定することができる。
本開示の実施形態による巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、あらゆる方法によって投与することができる。一部の実施形態では、本巨核球前駆細胞、巨核球、血小板前駆体、プレ血小板、または血小板は、直接注射、例えば静脈注射によって投与することができる。注射のための医薬調製物は、当業界で公知の通りに調製および送達することができる。
医薬組成物
本開示は、被験体における疾患または感染を処置または防止するための方法を特色とする。本発明はまた、創傷を処置するための方法も特色とする。本方法は、治療剤を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来血小板を含む組成物の治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む。実施形態において、組成物は、医薬組成物で使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤、例えば滅菌水、食塩水溶液、緩衝食塩水溶液、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、エタノール、またはそれらの組合せを含む。このような溶液の、滅菌性、ｐＨ、等張性、および安定性を確実にする調製は、当業界において確立されたプロトコールに従って行われる。一般的に、キャリアまたは賦形剤は、アレルギー作用および他の望ましくない作用を最小化し、特定の投与経路、例えば、皮下、筋肉内、鼻腔内などに適するように選択される。
本明細書において予期される医薬組成物の投与は、これだけに限定されないが、輸注、輸血などの従来の技術を使用して、または非経口で行うことができる。一部の実施形態では、非経口投与は、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、腫瘍内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下および胸骨内に輸注または注射することを含む。
キット
本開示は、本開示の巨核球または分化細胞を含むキットを提供する。一実施形態では、キットは、単離された巨核球を含む組成物を含む。特定の実施形態では、本開示は、本開示の巨核球またはその前駆体を分化させる、培養する、かつ／または単離するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、血小板を産生するためのキットを提供する。
一部の実施形態では、キットは、細胞組成物を含有する滅菌容器を含み、そのような容器は、箱、アンプル、ビン、バイアル、管、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当技術分野で公知の他の適切な容器形態であってよい。そのような容器は、プラスチック、ガラス、積層紙、金属箔、または医薬の保持に適した他の材料製のものであってよい。
所望であれば、キットは、巨核球を生成するための指示と共に提供される。指示は、一般に、巨核球またはその前駆体の分化、培養、および／または単離に必要な条件および因子に関する情報を含む。一部の実施形態では、血小板を産生させるための指示を含める。指示は、容器（存在する場合）に直接印刷されていてもよく、容器に貼られたラベルとして印刷されていてもよく、容器中にまたは容器と一緒に供給される別のシート、小冊子、カード、もしくはフォルダとして印刷されていてもよい。
本開示の実施では、別段の指定のない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法を使用し、これらは、当業者の能力の範囲内に十分に入る。そのような技法は、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ， １９８９）；”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” （Ｇａｉｔ， １９８４）；”Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” （Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， １９８７）；”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” ”Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” （Ｗｅｉｒ， １９９６）；”Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ” （Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ， １９８７）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” （Ａｕｓｕｂｅｌ， １９８７）；”ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”， （Ｍｕｌｌｉｓ， １９９４）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” （Ｃｏｌｉｇａｎ， １９９１）などの文献において十分に説明されている。これらの技法は、本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本開示の作製および実施において検討することができる。特定の実施形態に特に有用な技法を以下の節において考察する。
以下の実施例は、本開示のアッセイ、スクリーニング、および治療方法をどのように作製し、使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが自身の開示であると考える範囲を限定するものではない。
（実施例１）
臨床グレードｈｉＰＳＣの増大
分化の前に、ｈｉＰＳＣの増大は、適切なサイズにしたマスターおよび作業用細胞バンクでの使用のために多数の細胞を産生すること、加えて、臨床的な産生に適切なスケールで分化を開始させるために十分な細胞数を生成することを必要とする。臨床グレードｈｉＰＳＣ細胞株を、ＮＩＮＤＳ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ）／ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）におけるＮＩＮＤＳ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄａｔａ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＮＨＣＤＲ）保管所から得た。この細胞株（ＮＩＮＤＳ ＩＤ：ＬｉＰＳＣ−Ｇｒ１．１）は、雄ＣＤ３４＋臍帯血（Ｌｏｎｚａ）から引き出されたものであり、組換えビトロネクチン（ＶＴＮ）に加えてｃＧＭＰ適合性試薬、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ、またはＳｔｅｍＦｌｅｘを使用した２Ｄ培養で維持および増大させることができる（図８Ａ〜８Ｃ）。全ての３つの成長条件で特徴的なコロニー成長および多能性マーカーの維持が観察された（図８Ａ〜８Ｃ、図９Ａ〜９Ｃ）。
高効率の単一細胞継代技術はまた、未分化ｈｉＰＳＣ培養物の所定スケールの増大を支持するためにも開発された。同じ方法論が、臨床用の製造のための大規模の分化をもたらす細胞のバンキングおよび所定スケールのｈｉＰＳＣシードトレインのためにも意図される。この手法は、全体的な製造能力のための迅速な増大、ｐｒｅ−ＭＫを産生する能力を有する未分化の多能性培養物、ならびにｃＧＭＰ製造および臨床上の登録に適合する系での回収量および培養性能の均一性を提供する。この実施例において、ＬｉＰＳＣ−Ｇｒ１．１培養物を、ＴｒｙｐＬＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して単一細胞懸濁物に解離し、続いて、０．５μＭのＨ１１５２（Ｔｏｃｒｉｓ）および１０ｎｇ／ｍＬのヘレグリンβ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有するＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ｈＰＳＣ ＸＦ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）中、規定の密度でプレーティングした。培養を、細胞１×１０４個／ｃｍ２の密度で、４日の培養間隔でプレーティングし、さらに、細胞２×１０４個／ｃｍ２の密度で、３日の培養間隔でプレーティングした。未処理ＴＣ−フラスコへの細胞の付着は、０．５％ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）によって媒介された。プレーティングの１８〜２２時間後の翌日に、培養物に、補充なしのＮｕｒｔｒｉＳｔｅｍ ｈＰＳＣ ＸＦを供給した。培養物を３または４日の間隔で継代し、複数回の継代にわたり予測可能で一貫した回収量を達成した（図１０Ａ）。また単一細胞継代様式は、１０％ＤＭＳＯ（ＢｌｏｏｄＳｔｏｒ１００、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中での効率的な凍結保存も支え、培養物は、高い解凍生存率（＞８５％）およびプレーティング効率（プレーティングの１日後に数えた場合、＞１００％の付着細胞／生存細胞／増殖細胞）を示した（図１０Ｂ）。解凍した培養物は、多能性細胞のＳＳＥＡ−５およびＴＲＡ−１−６０細胞表面マーカーの＞９９％の共発現を示し（図１０Ｃ）、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇについて陽性染色され（図１３Ａ）、自発的な分化の欠如が確認された。
大規模増大を可能にするために、ＬｉＰＳＣ−Ｇｒ１．１細胞を、ＴｒｙｐＬＥを使用して単一細胞として２Ｄ培養物から回収し、撹拌されている３Ｄ容器で、この場合、３００ｍｌのＤａｓＢＯＸ ｍｉｎｉバイオリアクター系で自己凝集させた。最初の２４時間、細胞にＲＯＣＫ阻害剤、例えばＹ２７６３２を添加して、撹拌槽中で、初期の凝集の間、６〜７日間にわたり細胞生存を促進させた。その期間内に、得られたスフェロイドはその直径を５０から２５０ミクロンに増大させ、全体的な細胞密度は最大４０倍に増大した（図１１Ａ〜１１Ｃ）。この方式で成長したｈｉＰＳＣは、繰り返して継代されて、少なくとも連続４回の増大にわたりその多能性を維持し（図１２Ａ〜１２Ｂ、図１３Ｂ）、正常な核型を維持することができた（図１４）。
（実施例２）
２Ｄ培養容器におけるＩＶ型コラーゲンマトリクスを使用したｐｒｅＭＫおよびＭＫへのｈｉＰＳＣの定方向分化
ＬｉＰＳＣ−Ｇｒ１．１ ｈｉＰＳＣ株を、多能性幹細胞の巨核球への分化の時間経過を示す図２の概略図で要約した２Ｄマトリクス依存性定方向分化プロトコールを使用して巨核球に分化させた。時系列の概略図には、分化の各ステージ（ステージ０、１、２、３）が示され、時系列の上に、対応する細胞型および細胞マーカーが示され、時系列の下に、培地組成、マトリクス、温度および気体条件が示される。
ＰＳＣは、０．５ｍＭのＥＤＴＡを用いて回収し、小さい凝集塊として４．２ｕｇ／ｃｍ２のヒトＩＶ型コラーゲン上にプレーティングすると、６日間のステージ１分化の過程にわたり特徴的な一連の形態学的変化を示す（図１５）。ステージ１の最後に、代表的なウェルを、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して単一細胞として回収し、フローサイトメトリーによって造血性内皮のマーカーであるＣＤ３１およびＣＤ３４について評価する（図１６Ａ）。複数の独立したｉＰＳＣ分化（ｎ＝４１）にわたり、平均の６日目の分化効率が、およそ４０％のＣＤ３１＋（範囲：約２０〜６０％）およびおよそ３０％のＣＤ３１＋ＣＤ３４＋（範囲：約１５％〜４５％）であることが決定された（図１６Ｂ）。
ステージ２開始後の２〜３日以内に（すなわち６＋２日目から６＋３日目）、接着性造血性内皮細胞内に小さな丸い屈折性の細胞が出現し、最終的に接着性造血性内皮単層の上の上清に放出される（図１７Ａ）。これらの放出された細胞は、ＣＤ４３およびＣＤ４１の細胞表面発現ならびにＣＤ１４の発現の欠失によって定義されるｐｒｅＭＫを含有する（図１７Ｂ、１７Ｃ）。これらの付着細胞層の上部に出現する浮遊し弱く付着したステージ２細胞を、毎日、穏やかに濯ぎ培地をコニカルチューブに収集することによって回収し、ＣＤ４３、ＣＤ４１、およびＣＤ１４の発現について毎日分析する。放出された細胞の純度は、ステージ２の最初の数日は低く、その後プラトーになり、６＋６日目までに、平均ピークのｐｒｅＭＫ純度は、５０〜６０％である（図１８Ａ）。ＣＤ１４＋骨髄性細胞は、ステージ２の最初の６〜７日間はｉＰＳＣ定方向分化培養の主要な汚染物質ではないが、その後いくらかの変動がある（図１８Ｂ）。ｐｒｅＭＫ産生の動態は、平均して６＋６日目および６＋７日目にピークに達し、その後減少する（図１９Ａ）。複数の独立したｉＰＳＣ分化（ｎ＝４１）にわたり、平均の累積的なｐｒｅＭＫ（ＣＤ４３＋ＣＤ４１＋ＣＤ１４−）収量は、ウェル当たりおよそ１００万個（範囲：１０万から３３０万個）と決定された（図１９Ｂ）。
これらの培養物由来のｐｒｅＭＫがステージ３の条件に移行すると、それらは、数日以内に成熟ＭＫに分化する。２〜４日目までに、初期の均一な小さく丸い屈折性の細胞（図２０Ａ）のサイズが増大し始める（図２０Ｂおよび図２０Ｃ）。同時に、血小板前駆体を産生するＭＫを容易に観察することができる（図２０Ｃおよび図２０Ｄ）。ステージ３の３〜４日までに、成熟ＭＫマーカーであるＣＤ４２ａおよびＣＤ４２ｂを共発現するＣＤ６１＋（巨核球系列）細胞の割合をＦＡＣＳによって決定し（図２１Ａおよび図２１Ｂ）、成熟ＭＫ（ＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ＋細胞）の純度は、培養物中の全ての有核細胞の７０〜９０％もの高いレベルに達し得る（図２１Ｃ）。
（実施例３）
マトリクス非依存性３Ｄ培養での定方向分化
巨核球および血小板の臨床生産に必要な収量を可能にするために、小規模組織培養プラスチックウェア（２Ｄマトリクス依存性）から３Ｄのスケーラブルな解決策に分化プロセス全体を移行させることが重要である。スケーラブルな３Ｄ解決策の例は、撹拌または振とうされている超低接着性容器中で懸濁される自己凝集性スフェロイドを使用して分化を実行することを含む（図３）。この実施例において、ＬｉＰＳＣ−Ｇｒ１．１ ｈｉＰＳＣをＴｒｙｐＬＥを使用して単一細胞に解離し、Ｈ１１５２または他のＲＯＣＫ阻害剤を加えた多能性維持培地（例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ、ＳｔｅｍＦｌｅｘ、他の同様の培地、またはそれらの組合せ）中に細胞５０万〜１００万個／ｍｌで再懸濁し、９０ｒｐｍのオービタルシェーカー上の６ウェルの超低接着性プレート中で、または一定撹拌を伴うスピナーフラスコ（１２５ｍｌのスピナーフラスコにおいて５０ｍｌ体積で９０ｒｐｍ）中で、３７Ｃ、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２でインキュベートした。いずれの系でも２４時間以内に、ｈｉＰＳＣは自己凝集して、直径およそ５０〜１５０ｕｍのスフェロイドを形成した（図２２Ａ、異なる容器での同様の実施例については、図２３Ａおよび図１１Ａも参照されたい）。次いで撹拌を中断し、スフェロイドを容器の底部に沈降させた（およそ５分間）。次いで、培地の５０％〜１００％をステージ１分化培地と交換して、造血性内皮への分化を促進し、撹拌を低酸素条件（３７Ｃ、５％ＣＯ２、５％Ｏ２）でのインキュベーションを伴い再開した。培地交換を同様に合計６日間にわたり（３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２で４日間、続いて３７Ｃ、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２で２日間）毎日実行し、その期間中、スフェロイドはより大きく成長し、６日目に特徴的な構造および形状を生じた（図２２Ａ）。６日目におけるこれらのスフェロイドの試料を解離し、フローサイトメトリーによって評価したところ、細胞の約４４％が、造血性内皮のマーカーであるＣＤ３１およびＣＤ３４を発現することが見出され（図２２Ｂ）、純度は、２Ｄマトリクス依存性培養物と好都合に匹敵していた（図１６Ｂ）。ステージ２に移行するために、撹拌を中断し、スフェロイドを容器の底部に沈降させた（およそ５分間）。次いで培地の５０〜１００％をステージ２分化培地と交換して、懸濁細胞の分化および放出を促進させた（図２４Ａ）。その後毎日、懸濁細胞を収集し、部分的な培地交換を実行した。これを行うために、撹拌を中断し、造血性内皮スフェロイドを容器の底部に沈降させた（およそ５分間）。培地（懸濁細胞と共に）のおよそ８０％を収集し、遠心分離した。新鮮なステージ２分化培地の作業体積の半分を、十分な体積の馴化培地（すなわち遠心分離後の上清）と共にスフェロイドに添加し、元の作業体積を回復させた。次いで残りの上清を捨て、細胞ペレットの一部をＦＡＣＳ分析のために使用し（図２４Ｂ）、残りを凍結保存するか、または成熟ＭＫへの成熟のためにステージ３に移行させた。懸濁細胞のフローサイトメトリー分析から、オービタルシェーカー上の６ウェルの超低接着性プレート中で分化した自己凝集したスフェロイドと、５０ｍｌのスピナーフラスコ中で分化させた自己凝集したスフェロイドとが、同様のｐｒｅＭＫ産生動態、経時的な純度および収量の両方を示したことが解明された。２ＤのＩＶ型コラーゲン分化培養と比較して、これらの３Ｄ培養物は、より高い純度で、ステージ２の初期において、より多くのｐｒｅＭＫを産生した（図２４Ｃ、２４Ｄ）。
単一細胞継代で増大させ回収した培養物（図１０Ａ〜１０Ｃ）はまた、３Ｄスフェロイドに凝集し、記載した通りの６ウェル懸濁物分化方法を使用してｐｒｅ−ＭＫ細胞に効果的に分化することができた（図２３Ａ）。ｐｒｅ−ＭＫ収量は、従前の６ウェルプレート培養と同等であり、ＣＤ４１／ＣＤ４３の共染色によって評価されたように純度も同様であった（図２３Ｂ）。これらのデータから、単一細胞継代条件においてｈｉＰＳＣ自己再生を有効に制御し、安定な増大およびスケーラビリティーを支持しながら、ｐｒｅ−ＭＫ細胞への分化能を保持することが実証される。
ステージ３の静置培養に移行させると、３Ｄ自己凝集性スフェロイド培養物からのｐｒｅＭＫは、２Ｄ培養系からのｐｒｅＭＫと同様のＭＫ純度を生じた（図２５Ａ〜２５Ｃ）。さらに、３Ｄ自己凝集性スフェロイド培養物から生成したステージ３分化培養は、真正な巨核球としてのその正体と一致して、サイズが劇的に増大し、血小板前駆体を生成することが可能な細胞を含有していた（図２６）。
（実施例４）
ｉＰＳＣ凝集中またはステージ１から２の移行における可溶性ラミニン５２１の添加は２つの異なる３Ｄ分化様式でステージ２のｐｒｅＭＫ収量を改善する
分化を開始させる前の２４時間（−１日目）における初期のｉＰＳＣ凝集ステップ中の、またはステージ１からステージ２（６日目）に移行するときのラミニン５２１の添加は、２つの異なる３Ｄ分化様式でｐｒｅＭＫ収量を増大させた。可溶性組換えラミニン５２１含有または不含のＳｔｅｍＦｌｅｘおよびＲＯＣＫ阻害剤であるＨ１１５２（対照培地）を含有する９６ウェルのＵ底超低接着性プレートのウェル当たり、５０００個の単一細胞の解離したｉＰＳＣを播種した。２４時間後、培地をステージ１の培地で置き換え、培地交換を６日間実行した。次いで培地を、可溶性ラミニン５２１含有または不含のステージ２の培地と交換した。２４時間後、追加で最大６日間にわたり、半分の培地交換を毎日実行した。ステージ２におけるｐｒｅＭＫ収量を比較することにより、分化プロセスの−１日目または６日目におけるラミニン５２１の添加は、ラミニン５２１添加無しの対照培養物と比較してｐｒｅＭＫ収量を増大させたことが解明された（図２７Ａ、２７Ｂ）。ラミニン５２１の作用が撹拌した３Ｄ培養物でも観察できるかどうかを決定するために、ｉＰＳＣを単一細胞として解離し、１５０万個の細胞を、可溶性組換えラミニン５２１含有または不含のＳｔｅｍＦｌｅｘおよびＲＯＣＫ阻害剤であるＨ１１５２（対照培地）を含有する６ウェルの超低接着性プレートの各ウェルに播種し、オービタルシェーカー上に設置した。２４時間後、培地をステージ１の培地で置き換え、培地交換を６日間実行した。次いで培地を、可溶性ラミニン５２１含有または不含のステージ２の培地と交換した。２４時間後、追加で最大６日間にわたり、半分の培地交換を毎日実行した。ステージ２におけるｐｒｅＭＫ収量を比較することにより、分化プロセスの−１日目または６日目におけるラミニン５２１の添加は、ラミニン５２１添加無しの対照培養物と比較してｐｒｅＭＫ収量を増大させたことが解明された（図２７Ｃ）。実施例１に記載される高効率単一細胞継代技術から引き出されたｉＰＳＣを、オービタルシェーカー上の６ウェルプレートで、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ中で同様に自己凝集させた場合、ラミニン５２１作用が増幅した（図２７Ｄ）。
（実施例５）
ステージ１の間における増殖因子添加の順番およびタイミングの調整は分化効率を増大し、全体的な増殖因子の使用量を減少させる
分化のステージ１の間に起こる初期の特定化事象は、複雑であり、細胞シグナル伝達事象の固有の順番およびタイミングを必要とする。それゆえに、ステージ１の培地因子であるＢＭＰ４、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦＡの添加の順番およびタイミングを調整することは、ステージ１の全体にわたり３つ全ての増殖因子が含まれる標準的な完全Ｓｔ１培地条件と比較して、分化プロセスの効率を改善し、増殖因子の使用量を低減することができる。最初の実験（実験Ａ）（図２８Ａ）は、添加の順番およびタイミングを試験した。最初の２４時間にわたりＢＭＰ４単独を添加し、続いて次の２４時間にわたりＶＥＧＦＡおよびｂＦＧＦ（ＢＭＰ４不含）を添加し、続いて４日間の完全Ｓｔ１培地とした場合、ステージ２で産生されたｐｒｅＭＫの数は、ステージ１にわたり完全Ｓｔ１培地を受けた対照培養物より著しく多かった（図２８Ｂ）。４８時間にわたり同じ順番を実行することは、同じ作用を有さなかった。第２の実験（実験Ｂ）（図２８Ｃ）は、この系においてＢＭＰ４は２４時間を過ぎるとなくてもよいが、ＦＧＦ２およびＶＥＧＦＡは、分化を効果的に進行するために重要であることを実証した（図２８Ｄ）。この実施例は、分化のステージ１が、分化のステージ２に移行する前にＢＭＰ４を単独で２４時間、続いてｂＦＧＦおよびＶＥＧＦＡを５日間使用して効果的に進行できることを実証する。
（実施例６）
ＷＮＴモジュレーターはステージ１およびステージ２の分化効率に影響を与えることができる
ＷＮＴシグナル伝達は、発生中において重要である。ＧＳＫ３キナーゼ阻害剤であるＣＨＩＲ９８０１４およびＣＨＩＲ９９０２１は、ＷＮＴアゴニストとして作用する。分化の最初の４８時間のみ、本明細書に記載されるステージ１分化条件を、０．６μＭのＣＨＩＲ９８０１４または６μＭのＣＨＩＲ９９０２１で強化したところ、ＣＤ３１およびＣＤ３４の免疫蛍光染色によって決定した場合、ステージ１の分化効率における劇的な増大が６日目に観察された（図２９Ａ〜２９Ｃ）。次いで対照およびＣＨＩＲ９８０１４培養をステージ２に移行させ、そこでｐｒｅＭＫの産生および放出を、ＣＤ４１およびＣＤ４３の免疫蛍光染色によって追跡した。ＣＤ４１＋細胞の数の視覚的な推定から、最初の４８時間におけるＷＮＴモジュレーターにより生じたより高いステージ１効率は、ステージ２の間のより高い産出に対応し得ることが示唆される（図３０Ａ〜３０Ｂ）。それゆえに、ＷＮＴモジュレーターの短期間の添加は、後続の分化ステージにわたり分化効率に影響を与える可能性がある。
（実施例７）
ラミニン５２１でコーティングされたマクロキャリアを用いた充填層バイオリアクター
ここで、１ｍｍのラシヒリングの形状のラミニン５２１でコーティングされたＰＴＦＥマクロキャリアは、ｉＰＳＣの分化のための支持体を提供できること、およびこのマクロキャリア材料は、図４に示される概略図で例示されるような充填層バイオリアクターでの使用に適すると予想されることを実証する証拠を提供する。まずＰＴＦＥリングを、ロッカー上で、４℃で、１．２５ｕｇ／ｍｌのラミニン−５２１と共に一晩インキュベートした。使用前に、ＰＴＦＥリングを、６ウェルプレート中で、ＲＯＣＫ阻害剤であるＨ１１５２を加えたＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地で平衡化した。多能性ｉＰＳＣを０．５ｍＭのＥＤＴＡを使用して回収し、Ｈ１１５２を加えたＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地に再懸濁し、ＰＴＦＥリング上に凝集塊として播種した。１０分毎に、プレートを、オービタルシェーカー上で、７５ｒｐｍで３０秒回した。１時間後、プレートを７５ｒｐｍで一晩連続的に振とうした。２４時間後、培地の９０％を取り出し、ステージ１の培地で置き換え、培地交換を毎日行った。ステージ１中、ｉＰＳＣは、ラシヒリングの内部上に成長領域を示し（図３１）、成長領域は、２Ｄ培養物で見られたものと類似した形態学的特徴を生じた（図２２）。これらの細胞のフローサイトメトリー分析は、高い割合の造血性内皮細胞を示し、ＣＤ３１を発現する細胞は約８０％であり、これらの細胞の半分より多くが、ＣＤ３４＋について二重に陽性であった（図３３Ａ）。ステージ２の培地に切り換え、毎日の半分の培地交換を開始させたところ、全体的に平坦なコロニーから３Ｄスフェロイド型の構造に形態が変化したが、特筆すべきことに、それでもなおこれらの構造はリング形状のマクロキャリアの内部上のラミニン５２１コーティングに付着していた（図３２）。ステージ２の間に放出された細胞は、６＋２日目もの早期でも高いｐｒｅＭＫ含量を有しており、細胞の約７５％がＣＤ４３およびＣＤ４１を共発現し（図３３Ｂ）、純度は２Ｄマトリクス依存性培養に有利に匹敵する程度であった（図１８Ａ）。６＋３日目に放出された細胞を収集し、超低接着性プレート中で、ステージ３培地中で追加の３日間培養したところ、これらの細胞の約８０％が、ＣＤ６１およびＣＤ４２ｂを共発現したことから（図３３Ｃ）、効率的なＭＫ分化が起こったことが示される。このようなマクロキャリアは、ｉＰＳＣの造血性内皮への初期の分化（すなわち定方向分化のステージ１）、加えてｐｒｅＭＫのさらなる分化および放出（すなわち定方向分化のステージ２）を同じ容器で行うことができる充填層バイオリアクターのための材料としての使用に適する（図４）。この設計において、充填層バイオリアクターは、新たに多能性ｉＰＳＣを播種したラミニン−５２１でコーティングされたマクロキャリアを用いて構成される。次いで充填層は、培地の連続流に曝露されてもよく、それにより造血性内皮へのステージ１分化が可能になる。培地は、充填層に浸透させた後、馴化チャンバーに循環させることになり、そこで新鮮な培地構成成分が添加され、酸素／ＣＯ２濃度がスパージングまたは他の手段を介して調整されることになり、その後、培地は細胞に再循環されることになる。ステージ１の完了時に、培地は、ステージ２の分化および産生ならびにｐｒｅＭＫの放出が可能になるように切り替えることになる。適切なサイズおよび形状にしたマクロキャリア支持体、例えば１ｍｍのラシヒリングは、放出された細胞の充填層を通る浸透および収集および凍結貯蔵のためのリアクターからの浸透を可能にするのに十分な培地の流れおよびチャネル幅を可能にすると予想される。この設計は、細胞が受けるせん断力を減少させ、その灌流に基づく設計のために、効率的な培地使用を可能にし、それらが放出される場合、ｐｒｅＭＫの連続的な収集を可能にする。
（実施例８）
ｉＰＳＣ由来巨核球の詳細な特徴付け
本明細書に記載される方法を使用して生成した巨核球は、免疫蛍光顕微鏡法によって画像化した場合、ＭＫ特異的タンパク質であるベータ−１−チューブリン（図３４）、加えてアルファ顆粒に関連するタンパク質（ＰＦ４およびＶＷＦ、図３５Ａ〜３５Ｆ）および高密度顆粒に関連するタンパク質（ＬＡＭＰ１およびセロトニン、図３６Ａ〜３６Ｆ）などに関する機能的な成熟ＭＫに関連する多くの特色を実証する。ｉＰＳＣ由来ＭＫの電子顕微鏡画像から、多小胞体、グリコーゲン顆粒、および陥入膜系を含む特徴的な超微細構造的特色が明らかになる（図３７Ａ〜３７Ｄ）。遺伝子発現分析により、多能性遺伝子、例えばＯＣＴ４の下方制御（図３８Ａ）および巨核球系列遺伝子、例えばＮＦＥ２の上方制御（図３８Ｂ）が明らかになった。同様の分析を関連遺伝子のパネル上で実行したところ、この分析の結果は、多能性幹細胞シグネチャーの喪失および巨核球シグネチャーの獲得と一致する（図３９）。
骨髄ＣＤ３４＋、末梢血ＣＤ３４＋、または臍帯血ＣＤ３４＋細胞由来の初代巨核球（天然産物）と比較したところ、ｉＰＳＣ由来ＭＫは、ＣＤ３４＋骨髄幹細胞、末梢血幹細胞、または臍帯血幹細胞由来の初代巨核球（天然産物）（図４０Ｃ、図４１Ｂ）と類似の平均サイズを有していたが（図４０Ａ〜４０Ｃ）、それより低い特徴的な倍数性分布を有していた（図４１Ａ〜４１Ｂ）ことが見出された。ｉＰＳＣ由来巨核球はまた、これまでに巨核球において報告されていない複数の因子の存在を含む、ヒト血小板中に存在するものに類似した因子の特徴的な増殖因子、サイトカイン、およびケモカイン発現プロファイルも有していた（図４２）。データを準備するために、細胞を−８０℃で一晩凍結し、次いで３７℃で解凍することによって、１×ＰＢＳ中２５００万個／ｍＬのｈｉＰＳＣ−ＭＫを溶解させた。この凍結／解凍サイクルを４回繰り返した。得られた懸濁物を、０．２２μｍのシリンジフィルターを使用して濾過した。溶解物を、増殖因子、サイトカイン、およびケモカインの選択パネルについて多重化レーザービーズ技術（Ｅｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して試験した。データをバックグラウンド（ＰＢＳ、ｈｉＰＳＣ−ＭＫと同様に処理したもの）について補正し、次いで市販のヒト血小板溶解物（ＨＰＬ）、新鮮なＭＫ分化培地（分化の最終ステージで使用したもの）、および馴化培地、すなわち溶解の前にｈｉＰＳＣ−ＭＫから取り出されたＭＫ分化培地と比較した。ｈｉＰＳＣ−ＭＫとＨＰＬとの間には強力な重複が観察されたが、以前に巨核球または血小板において記載されていないタンパク質もいくつかｈｉＰＳＣ−ＭＫにおいて測定された（図４２）。
本明細書に記載される結果は、臨床グレードヒトｉＰＳＣ由来巨核球を生成するための頑強なプロセスを実証する。ヒトｉＰＳＣ由来巨核球は、さらなる特徴付けまたはヒト血小板の生成などの下流での適用における使用のために単離および濃縮することができる。
（実施例９）
ヒトｉＰＳＣ由来血小板の詳細な特徴付け
血小板は、この出願書類に記載される培養方法および回収技術を使用してヒトｉＰＳＣ由来成熟ＭＫから生成される。血小板は、静置培養で収集してもよいし（図４３Ａ、４３Ｂ）、または定方向分化プロセスのステージ３最高点で成熟ＭＫをミリフルイディクスバイオリアクターに供給することによって産生してもよい（ＵＳ９，７９５，９６５；ＵＳ２０１７／０１８３６１６；ＵＳ２０１８／０３３４６５２；ＷＯ２０１８１６５３０８での言及を参照）。定方向分化プロセスから引き出された血小板は、ＤＮＡインターカレート色素について陰性染色され、２〜５μｍのサイズ分布の範囲内である；またプレ血小板も、この培養において５μｍおよびそれより大きい直径で観察される（図４３Ａ）。ヒトｉＰＳＣ由来血小板は、明確なβ１−チューブリンリング、および活性化マーカーであるＣＤ６２ｐの非存在を示す顕微鏡写真によって示されるように、休止表現型を有する（図４４Ｂおよび４５Ａ）。これらは、糸状偽足および葉状仮足の形成および拡散を示す細胞骨格の変化を明らかにするガラス拡散技術を使用して実験的に活性化することができる（図４４Ａおよび４４Ｂ）。
ヒトｉＰＳＣ由来血小板は、これらを初代ドナー由来ヒト血小板と区別するいくつかの特色を有する。これらは、ヒト血小板上で豊富に発現される表面受容体である糖タンパク質ＶＩを欠如している（図４６Ａ〜４６Ｃ）。これらはまた、血漿中の血小板より多くの量でトロンビンも生成し、凝固カスケードの主要な開始因子である組換えヒト組織因子に曝露された後では、より短い時間枠にわたりトロンビンを生成する（図４７）。これらの差にもかかわらず、ヒトｉＰＳＣ由来血小板は、レーザーによって誘発された傷害のマウスモデルの一部としての精巣挙筋の細動脈で形成される血栓への取り込みを含む機能性の全ての指標（図４３Ａ〜４３Ｂ、４４Ａ〜４４Ｂ、４５、４６Ａ〜４６Ｃ、および４７）を保持する（図４８Ａ〜４８Ｃ）。
（実施例１０）
ヒトｉＰＳＣ由来血小板は受動的な薬物負荷によって組換え生物学的薬物を取り込む
本明細書に記載される方法によって産生された血小板は、末梢血液全体から抽出される血小板に加えて、ヒトＣＤ３４＋動員末梢血細胞源から分化した血小板にも類似した特徴を有する。
図６の線画は、様々な方法によって、ｐｒｅＭＫ、ＭＫ、およびＰＬＴ中およびその上への、本明細書ではあらゆる生物製剤、小分子、または治療用粒子の他の形態を指す薬物の負荷を可能にする概略を提供する。一部の形態では、ミリフルイディクスバイオリアクター（ＵＳ９，７９５，９６５；ＵＳ２０１７／０１８３６１６；ＵＳ２０１８／０３３４６５２；ＷＯ２０１８１６５３０８での言及を参照）が、ＭＫからのＰＬＴ産生を誘導するのに使用される。図７の線画は、幹細胞、一部の形態ではｉＰＳ、ＥＳ、造血幹細胞などの遺伝子改変されたバージョンの、ゲノムに組み込まれる遺伝子材料のレンチウイルスによる形質導入による産生の概略を提供する。一部の実施形態では、遺伝子材料を幹細胞に組み込むことは、様々なヌクレアーゼベースの手法、相同組換え、または他のウイルスおよび非ウイルス方法を使用することによって達成される。ゲノムへの遺伝子材料の組み込みは、造血性内皮、ｐｒｅＭＫ、およびＭＫで発生させることができる。
一例において、ヒトＩｇＧを、洗浄したドナー由来ヒト血小板に、および／またはその上に負荷した。ヒトＩｇＧを、ＮＨＳ−エステルであるＣｙ５．５フルオロフォアに、製造元の説明書に従って、８倍過量のモル濃度でコンジュゲートした。コンジュゲートした調製物を４０ｋの分子量カットオフ（ｍｗｃｏ）のｚｅｂａ脱塩カラムに通過させ、ｐｉｅｒｃｅ ６６０キットによって定量化した。調製物をさらなる使用まで４セルシウス度で維持した。薬物負荷実験のために、Ｃｙ５．５コンジュゲートヒトＩｇＧを室温にし、１５，０００ｒｃｆで１分間遠心分離して、凝集体を除去した。次いで抗体を、１×１０ｅ７個の血小板に、３７セルシウス度で１時間にわたり１ｍＬの反応体積で添加した。ＰＧＥ１を１ｕｇ／ｍｌの最終濃度で添加して、血小板活性化を阻害し、細胞を１２５０ｒｃｆでブレーキをかけずに１７分間遠心分離した。ＣＤ６１発現でゲーティングされた血小板の調製では（図４９Ａおよび図４９Ｂ）、この洗浄ステップを二度目に実行し、洗浄後の相対的な薬物取り込みを評価した（図４９Ｃおよび４９Ｄ）。薬物取り込みを細胞ペレット中で可視化した（図４９Ｅ）。ヒトＩｇＧの用量滴定を実行したところ、フローサイトメトリーにより、投入濃度の増大が検出可能なヒトＩｇＧにおける付随する増大をもたらすことが示される（図４９Ｆ）。平均蛍光強度をヒトＩｇＧ投薬量の関数としてプロットし（図４９Ｇ）、洗浄された血小板に保持されたヒトＩｇＧの量を定量化した（図４９Ｈ）。
ヒトドナー血小板は、後続の実験において、最大２００μｇの濃度の標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）を取り込むことが可能であった（図４９Ｉ）。２００μｇは、アテゾリズマブの治療用量を表す。この実験は、取り込みの最大用量を決定するために設計された。しかし、血小板は、取り込みのプラトーまたは最大用量を示さなかった。取り込みが抗体特異的ではないことを実証するために、ヒトＩｇＧを、ＣＦ５５（Ｂｉｏｔｉｕｍ）で製造元の指示通りに標識した。分析中のさらなる取り込みを防止するために、蛍光強度測定の前に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した。ヒトＩｇＧの取り込みを、蛍光強度を測定することによって用量依存的に観察した。これらの結果は、許容される最大濃度を表さない。固定の後、血小板調製物の一部を洗浄し、遠心分離によってポリ−ｌ−リシンでコーティングされたガラスカバースリップに接着させた。次いで血小板を、ＰＢＳ中の０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘで透過性にし、免疫蛍光ブロッキング緩衝液（ＩＦＢＢ）（５０ｍｌのＰＢＳ中５ｍｌのヤギ血清、１％ＢＳＡ）で一晩ブロックした。アテゾリズマブを、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗ヒト二次ＩｇＧとのインキュベーションによって可視化した。アテゾリズマブまたは二次抗体単独に曝露された試料中のバックグラウンドの蛍光をモニタリングした。追加の特異性のために、細胞をＣＤ６１−ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で標識した。カバースリップを、Ａｑｕａ−Ｐｏｌｙ／Ｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してスライドガラスにマウントした。画像獲得のためのＺｅｎ Ｂｌａｃｋソフトウェアを備えたＺｅｉｓｓ Ｍｅｔａ ８８０共焦点走査顕微鏡を使用して、試料を画像化した（図５０Ａ）。画像の処理および分析を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｆｉｊｉ／ＮＩＨ）を使用して完了させた。図５０Ｂは、高倍率の二重標識された血小板であり、血小板内における細胞内局在が実証される。
本明細書に記載される方法を使用して産生されたヒトｉＰＳＣ由来血小板に、抗ＣＴＬＡ４抗体薬物であるイピリムマブを、水性緩衝液中での共インキュベーションによって負荷した。イピリムマブを様々な濃度で負荷したところ、封入された用量における用量依存性の増大を明らかにするフローサイトメトリーヒストグラムプロットが得られた。イピリムマブを、ＮＨＳ−エステルであるＣｙ５．５フルオロフォアに、製造元の説明書に従って、８倍過量のモル濃度でコンジュゲートした。コンジュゲートした調製物を４０ｋの分子量カットオフ（ｍｗｃｏ）のｚｅｂａ脱塩カラムに通過させ、ｐｉｅｒｃｅ ６６０キットによって定量化した。調製物をさらなる使用まで４セルシウス度で維持した。薬物負荷実験のために、Ｃｙ５．５コンジュゲートイピリムマブを室温にし、１５，０００ｒｃｆで１分間遠心分離して、凝集体を除去した。イピリムマブを、１ｅ６個のヒトｉＰＳＣ由来血小板に、１００マイクロリットルの体積で添加した。一例において、１試料当たり１、１０、３０、および６０μｇのイピリムマブを添加し、３７℃で１時間インキュベートし、洗浄し、遠心分離して、非特異的に結合した薬物を除去した。ヒトｉＰＳＣ由来血小板へのイピリムマブ封入における用量依存性の増大を示すフローサイトメトリーベースのヒストグラムプロットを作成した（図５１Ａ）。別の実験で、Ｃｙ５．５にコンジュゲートされなかったイピリムマブを、同じ技術を使用して、ヒトｉＰＳＣ由来血小板に１００μｇ／ｍｌの最終濃度で負荷し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、免疫蛍光画像化実験のためにポリ−ｌ−リシンでコーティングされたカバースリップ上に遠心分離した。次いで血小板を、ＰＢＳ中の０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘで透過性にし、免疫蛍光ブロッキング緩衝液（ＩＦＢＢ）（５０ｍｌのＰＢＳ中５ｍｌのヤギ血清、１％ＢＳＡ）で一晩ブロックした。血小板を顆粒（ＰＦ４）で染色し、表面（ＣＤ６１）マーカーおよび薬物シグナルが、細胞内の小斑点であることが見出された。得られた顕微鏡写真は、ＰＦ４染色によって描写されるように、細胞表面上および選択されたアルファ顆粒内へのイピリムマブ局在化の証拠を含むＣＤ６１＋ヒトｉＰＳＣ由来血小板へのイピリムマブの負荷を実証する（図５１Ｂ）。
血小板への組換えタンパク質の負荷のさらなる例を、本明細書に記載される方法を使用して、フルオロフォアＣｙ５．５にコンジュゲートしたイピリムマブを使用して、ＣＤ３４＋由来の材料で実行した。ＣＤ３４＋由来血小板を、サイズおよび粒度（図５２Ａ）およびＣＤ６１発現（図５２Ｂ）について分析して、血小板の表現型を確認した。イピリムマブを、３７セルシウス度で１時間、様々な濃度で、血小板調製物と共にインキュベートしたところ、６００μｇ／ｍｌのイピリムマブで確立された最大のシグナルは見られなかった（図５２Ｃ）。測定値を、反応容器中の血小板当たりのイピリムマブのｐｇに変換したところ、およそ１００〜３００ｐｇ／血小板の投入比率が、フローサイトメトリーによって最大のシグナルを見るのに十分であり（図５２Ｄ）、血小板当たりの保持されたイピリムマブの最終濃度が、処置用量に応じて、１から６ｐｇ／血小板の間であることが見出された（図５２Ｅ）。固定の後、血小板調製物の一部を洗浄し、遠心分離によってポリ−ｌ−リシンでコーティングされたガラスカバースリップに接着させた。次いで血小板を、ＰＢＳ中の０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘで透過性にし、免疫蛍光ブロッキング緩衝液（ＩＦＢＢ）（５０ｍｌのＰＢＳ中５ｍｌのヤギ血清、１％ＢＳＡ）で一晩ブロックした。血小板を顆粒（ＰＦ４）で染色し、表面（ＣＤ６１）マーカーおよび薬物シグナルが、細胞内の小斑点であることが見出された（図５２Ｆ）。
ドナー由来ヒト血小板がアテゾリズマブ（図５３Ａ）またはイピリムマブ（図５３Ｂ）を取り込み、機能的なままでいるかどうかを決定するために、血小板を、１５μｇのＤｙｌｉｇｈｔ−４８８標識抗体と共に３０分インキュベートした。次いで同一な試料を、３０分のインキュベーションの最後の１０分間、ヒトトロンビン（１単位／ｍｌ）に曝露した。分析中のさらなる取り込みを防止するために、細胞を４％パラホルムアルデヒドで即座に固定し、ＦＡＣＳによって平均蛍光強度を分析し、薬物単独が負荷された（コンジュゲートしていない）試料と比較した。図５３Ａおよび５３Ｂで観察されるように、血小板の活性化は、標識された薬物のヒストグラムの左へのシフト（薬物単独により近い）で見られるように、蛍光強度を低減させた。図５３Ｃは、蛍光ＰＤＬ１が負荷された休止血小板である（１３Ａにおけるものと同様）。図５３Ｄは、ＰＤＬ１が負荷された活性化血小板であるが、ガラス活性化されたとき、それはもはや蛍光ＰＤＬ１を含有していない。これらのデータは、トロンビンでの血小板活性化が、抗体の放出を引き起こすことを示唆し、薬物負荷された血小板が機能的なままであり、アゴニスト刺激での放出が可能であることを実証する。
（実施例１１）
ヒトｉＰＳＣ由来血小板における組換えタンパク質の共有結合によるコンジュゲーション
細胞膜上への組換えタンパク質の共有結合による連結を創出するための多くの戦略がある（図６）。本明細書に記載されるｉＰＳＣ由来血小板の場合、２−イミノチオラン（トラウト試薬、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃２６１０１）を、様々な濃度で、１ｅ６個の血小板と、５００ｕｌの緩衝液中、３７セルシウス度で１時間インキュベートして、第一アミンをスルフヒドリルに変換した（図５４Ａに描写される）。それと同時に、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃２２３６０）を、ヒトＩｇＧと共に４Ｃで２時間インキュベートした（図５４Ｂに描写される）。次いでトラウト試薬で処置した血小板を、ＳＭＣＣリンカーで連結されたＩｇＧと共に３７セルシウス度で１時間インキュベートした（図５４Ｃ）。（ＳＭＣＣ無しのＩｇＧに対して）ＳＭＣＣリンカーで連結されたＩｇＧの固定濃度を用いて、トラウトの用量滴定を洗浄されたドナー血小板で実行した。フローサイトメトリーによれば、シグナルは、ＳＭＣＣリンカーで連結されたＩｇＧで、トラウト試薬の用量が増大するにつれてより顕著に大きくなり、最大効率は、０．４ｍｇ／ｍｌのトラウト試薬で観察された（図５４Ｄ）。ＳＭＣＣリンカーがないと、ＩｇＧシグナルは、フローサイトメトリーによれば増大しなかったことから（図５４Ｅ）、洗浄された血小板の表面へのＩｇＧのコンジュゲーションを促進することにおいて、コンジュゲーション反応は効率的であったことが示唆される。
次いで図５４Ａ〜５４Ｃに記載されるプロトコールを、抗ＣＴＬＡ４の市販の抗体であるイピリムマブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ ＃Ａ２００１）を使用して、ヒトｉＰＳＣ由来血小板に使用した。イピリムマブコンジュゲート血小板は、ＣＤ６１発現を保持し（図５５Ａ）、ＣＤ６２ｐ発現によって評価した場合、その手順によって活性化されなかった（データ示さず）。トラウト試薬で処置した血小板を用い、ＳＭＣＣリンカーで連結されたイピリムマブ（図５５Ｂ、矢印によって示される）を使用したフローサイトメトリーによれば（ＣＤ６１発現でゲーティングした）、イピリムマブは最大の存在量で観察された。同じ細胞を４％ＰＦＡ中で固定し、ポリ−ｌ−リシンでコーティングされたカバースリップ上に固定し、その後、本明細書に記載される方法を使用してＣＤ６１およびＰＦ４について染色した。イピリムマブは、大部分が細胞表面上にコンジュゲートされていることが観察された（図５５Ｃ）。
（実施例１２）
ヒトｉＰＳＣ由来ｐｒｅＭＫおよびＭＫへの組換え薬物である生物製剤の受動的な負荷
人工多能性幹細胞を、本明細書に記載される方法を使用して成熟巨核球に分化させた。細胞を、Ｄｙｌｉｇｈｔ ４８８標識アテゾリズマブと共に３０分間インキュベートし、４％パラホルムアルデヒドで固定し、調製されたポリ−ｌ−リシンでコーティングされたガラスカバースリップ上に遠心分離した。培養物内の成熟巨核球を確認するために、細胞を追加でＣＤ６１について染色した。ＣＤ６１を、予めコンジュゲートしたＣＤ６１−ＡＰＣ抗体を使用して可視化した。試料を洗浄し、Ａｑｕａ−ｐｏｌｙ／ｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてガラスカバースリップ上にマウントした。Ｚｅｉｓｓ Ｍｅｔａ ８８０共焦点走査顕微鏡を使用して画像を捕獲し、Ｆｉｊｉ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析した（図５６Ａ〜５６Ｃ）。これらのデータは、本開示の巨核球およびその生成された静止血小板が、アテゾリズマブを取り込むことが可能であることを示唆する。アテゾリズマブは、アルファ顆粒染色ＰＦ４と共局在化することが実証され（図５６Ｃ）、さらに細胞表面上にあることも示される。これは、受動的な負荷（細胞膜への共有結合によるコンジュゲーションとは対照的に）は、血小板を産生するＭＫにおけるアルファ顆粒の局在化を容易にすることができ、血小板分化のときに顆粒中に保持され得るという証拠を提供する。
１ｍｌ中の１ｅ６個の細胞および１００ｕｇのイピリムマブを使用して、巨核球前駆細胞、すなわちｐｒｅＭＫに、抗ＣＴＬＡ４抗体であるイピリムマブのコンジュゲートしていないバージョンを負荷した。ｐｒｅＭＫを、ポリ−ｌ−リシンでコーティングされたカバースリップに固定し、フィブリノーゲン（アルファ顆粒染色）およびＣＤ６１（表面マーカー）で染色した（図５７）。イピリムマブは、ＣＤ６１とフィブリノーゲンの両方と共局在化することが観察されたことから、ｐｒｅＭＫに、抗体薬物を負荷することができ、ＭＫおよび血小板への分化プロセスにわたり顆粒中に薬物を潜在的に保持できることが示唆される。
（実施例１３）
ヒトｉＰＳＣ由来ｐｒｅＭＫおよびＭＫへの組換え薬物である生物製剤の共有結合によるコンジュゲーション
ヒトｉＰＳＣ由来の巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）および成熟巨核球（ＭＫ）の細胞膜に組換え薬物である生物製剤をコンジュゲートする能力が本明細書において実証される。ｐｒｅＭＫをステージ２培養物から回収し、ＣＤ４１およびＣＤ４３共発現について免疫表現型を決定した（図５８Ａおよび５８Ｂ）。ｉＰＳＣ由来ｐｒｅＭＫを、５００ｕｌの緩衝液中の１ｅ６個の細胞を用いて、０．４ｍｇ／ｍｌのトラウト試薬で３７℃で１時間処理して、第一アミンをスルフヒドリルに変換した。同時に、ＳＭＣＣを、イピリムマブと共に４℃で２時間インキュベートした。次いでトラウト試薬で処置したｐｒｅＭＫを、１００μｇ／ｍｌのＳＭＣＣリンカーで連結したイピリムマブと共に３７℃で１時間インキュベートした。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートしたヒトＩｇＧに対する二次抗体を使用して、コンジュゲートしたイピリムマブを検出した。薬物処置の非存在下で、ＣＤ４１とＣＤ４３について二重陽性の細胞において検出可能な薬物はみられなかった（図５８Ｃ）。薬物処置した試料について、全ての観察可能なＣＤ４１とＣＤ４３について二重陽性のｐｒｅＭＫは、検出可能なイピリムマブを有していた（図５８Ｄ）。成熟巨核球を、ヒトｉＰＳＣからの定方向分化プロトコールのステージ３で回収し、ＣＤ６１（図５９Ａ）およびＣＤ４２ａ（図５９Ｂ）についての免疫表現型を決定した。ＭＫを、５００μｌの緩衝液中の１ｅ６個の細胞を用いて、０．４ｍｇ／ｍｌのトラウト試薬で３７℃で１時間処理して、第一アミンをスルフヒドリルに変換した。同時に、ＳＭＣＣを、イピリムマブと共に４℃で２時間インキュベートした。ＳＭＣＣリンカーで連結したイピリムマブを、トラウト処置したＭＫと３７℃で１時間反応させた。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートしたヒトＩｇＧに対する二次抗体を使用して、コンジュゲートしたイピリムマブを検出した。薬物処置の非存在下で、ＣＤ６１とＣＤ４２ａについて二重陽性の細胞において検出可能な薬物はみられなかった（図５９Ｃ）。薬物処置した試料について、全ての観察可能なＣＤ６１とＣＤ４２ａについて二重陽性のＭＫは、検出可能なイピリムマブを有していた（図５９Ｄ）。
このデータは、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）および成熟巨核球（ＭＫ）への、組換えタンパク質である生物学的薬物の共有結合によるコンジュゲーションを実証する。
（実施例１４）
受動拡散による洗浄したヒト血小板の小分子の負荷
ヒトｉＰＳＣからの血小板生成物における小分子の負荷および保持を実証するために、洗浄したヒト血小板を、ＤＮＡインターカレート化学療法剤である塩酸ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ１５１５）と共インキュベートした。ゲノム物質は、典型的には、血小板調製物との共インキュベーションおよび受動拡散による細胞への侵入の結果として細胞内にこの薬物を隔離すると予想されるが、血小板は、無核細胞型であるため、このようなゲノム物質を含有しない。１００μＭのドキソルビシンを、１ｍｌの緩衝液中の１ｅ７個の血小板の調製物と共に使用し、透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃８８４００）中で、オービタルシェーカーでの一定撹拌下で、周囲温度で３０、１２０、２４０、および１４４０分インキュベートした。ドキソルビシンは、フローサイトメトリーによって検出することができる固有の蛍光特性を有し（Ｅｘ ４２７ｎｍ／Ｅｍ ５８５ｎｍ）、血小板調製物に対して複数の洗浄ステップを実行することができ、非特異的に結合した分子がなくなった後でもなお薬物カーゴは保持されると予想されることが見出された（図６０Ａ）。洗浄された血小板へのドキソルビシン封入に必要な最小および最大時間を理解するために、動態研究が採用された。サンプリングした血小板における検出可能なドキソルビシン発現を見るには、３０分で十分であり、シグナルは、１４４０分後に保持されていたことが観察された（図６０Ｂ）。このデータは、小分子薬物が効率的に血小板中に捕獲され得ることを示唆する。
（実施例１５）
遺伝子改変された巨核球前駆体からの血小板の生成
治療的導入遺伝子を発現する血小板は、傷害、病気、および疾患の処置における著しい進歩を表すものになると予想される。導入遺伝子を発現する血小板を生成するために、巨核球前駆体を、レポータータンパク質をコードする核酸カセットを含むレンチウイルスベクターで形質導入した。具体的には、このカセットは、ＥＦ１アルファプロモーターおよびＺｓＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質をコードしていた。レンチウイルスベクターでの感染の４２時間後、形質導入された巨核球前駆体では蛍光が検出されたが、形質導入されていない（模擬）対照では検出されなかったことから（図６１）、巨核球前駆体がうまく形質導入されたことが示される。
導入遺伝子を有する巨核球前駆体を本明細書に記載される方法に従って培養して、血小板を産生した。図６２Ａを参照すると、形質導入された巨核球前駆体から引き出されたＣＤ６１＋細胞（すなわち、血小板）は、レポータータンパク質の発現を示したが、それに対して模擬の形質導入された巨核球前駆体から引き出されたＣＤ６１細胞では蛍光を視認できなかったことから、核酸カセットが形質導入された巨核球前駆体からうまく受け継がれたことが示される。蛍光シグナルが血小板によって生じたことを検証するために、模擬およびレンチウイルスにより形質導入された巨核球から引き出された血小板を、ＣＤ６１ゲーティング戦略を使用してソートした（図６２Ｂ）。図６２Ｃに示される蛍光ヒストグラムは、ＣＤ６１＋血小板において蛍光シグナルが検出されたことを実証する。
（実施例１６）
バイオリアクター系を使用した血小板の製造
治療剤の負荷または遺伝学的改変に好適なバイオリアクターおよび条件を使用して、血小板を産生した。血小板を産生するために、巨核球を血小板バイオリアクターに播種した（図６３Ａ）。バイオリアクターは、多孔質膜（５μｍの孔）によって分離された２つの連続するチャネル（図６３Ｂ、６３Ｃ）からなっていた（図６４）。巨核球は、多孔質膜上に高効率で固定され（フローサイトメトリー分析によって実証されるように、＞９９％の保持）、チャネル中を流動する培地は、巨核球上に生理的に適切なせん断力を与える（図６４）。第１のチャネルおよび第２のチャネルにおける流速を独立して調整することで、膜上に巨核球が選択的に捕獲されるように、さらに、捕獲された巨核球上に第２のチャネルに沿って生理学的なせん断速度が作り出されるように構成されたチャネル間に差をもたらし、血小板が産生されるようする。
多孔質膜上に固定された巨核球は、突起を第２のチャンバーに伸ばし、それにより巨核球は血小板を放出し（図６４および６５）、それにより第２のチャネルに血小板が放出される。（図６４）。バイオリアクターは、血小板形成中における生理学的な条件（例えば、骨髄環境のせん断力）を再現するため、バイオリアクターで産生された血小板は機能的であり、ヒト血小板の代用物を提供する。本明細書に記載されるバイオリアクター方法を使用して産生された血小板は、輸注および薬物送達に使用することができる。
他の実施形態
前述の説明から、様々な使用および条件にそれを適合させるために、本明細書に記載される開示に変形および改変をなすことができることは明らかであろう。このような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内である。特定には、本開示の方法および組成物において有用な様々な変形は、２０１９年１月５日に出願された共同所有されたＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１２４３７、加えて、ＵＳ９，７６３，９８４、ＵＳ９，７９５，９６５；ＵＳ２０１７／０１８３６１６；ＵＳ２０１８／０３３４６５２；ＷＯ２０１８１６５３０８に記載されており、これらは全て、この参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書における変数のいずれの定義における要素の一覧の列挙にも、その変数の定義が、列挙されている要素のあらゆる単一の要素または組合せ（または副組合せ）として含まれる。本明細書におけるある実施形態の列挙には、その実施形態が、あらゆる単一の実施形態または任意の他の実施形態もしくはその一部との組合せとして含まれる。
本明細書において言及される特許および刊行物は全て、それぞれ独立した特許および刊行物が具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じく参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (62)

  1. 治療剤を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来細胞を産生するための方法であって、
    第１の培養培地中で、前記多能性細胞を造血性内皮細胞に分化させるステップ；
    第２の培養培地中で、前記造血性内皮細胞を巨核球前駆細胞に分化させるステップ；
    前記巨核球前駆細胞を成熟巨核球に分化させるステップ；
    前記成熟巨核球を、血小板を産生するのに十分な条件下で分化させるステップ；および
    前記血小板、前記巨核球、前記巨核球前駆細胞、またはそれらの組合せのうち１つに、治療剤を負荷するステップ
    を含む、方法。
  2. 低接着性または非接着性条件下で、撹拌下で多能性幹細胞を増大させるステップをさらに含み、ここで増大した多能性幹細胞が自己凝集する、請求項１に記載の方法。
  3. 自己凝集した前記多能性幹細胞が、スフェロイドを形成する、請求項２に記載の方法。
  4. 前記多能性細胞を造血性内皮細胞に分化させるステップが、マトリクス上、接着性条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
  5. 前記マトリクスが、ラミニンを含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記マトリクスが、２次元表面に付着している、請求項４または５に記載の方法。
  7. 前記マトリクスが、３次元構造に付着している、請求項４または５に記載の方法。
  8. 前記多能性細胞を分化させるステップおよび前記造血性内皮細胞を分化させるステップの少なくとも１つが、マトリクスがコーティングされた３次元構造上で行われる、請求項１に記載の方法。
  9. 前記３次元構造が、マイクロキャリアである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記３次元構造が、マイクロキャリアである、請求項８に記載の方法。
  11. 前記第１の培養培地が、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記第１の培養培地が、ＷＮＴモジュレーターをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記第２の培養培地が、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびヘパリンのうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
  14. 前記人工多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
  15. 増大した前記多能性幹細胞を回収し、解離させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  16. 前記巨核球前駆細胞を巨核球に分化させるステップの前に、培養培地中で非接着性表面上に前記巨核球前駆細胞を播種するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  17. 第３の培養培地中で前記巨核球前駆細胞を巨核球に分化させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  18. 前記第３の培養培地が、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）およびヘパリンのうちの１つまたは複数を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記成熟巨核球を、血小板を産生するのに十分な条件下で分化させるステップが、前記成熟巨核球を多孔質膜上に播種することを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記巨核球をせん断力に晒すステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記巨核球が、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋である、請求項１に記載の方法。
  22. 前記血小板が、活性化状態での、ＣＤ６１＋、ＤＲＡＱ−、カルセインＡＭ＋、ＣＤ４２ａ＋、およびＣＤ６２Ｐ＋のうちの１つまたは複数である、請求項１に記載の方法。
  23. 前記血小板が、ＧＰＶＩを発現しない、請求項１に記載の方法。
  24. 前記血小板または前記巨核球に治療剤を負荷するステップが、受容体が媒介する負荷、受動的な負荷、または共有結合によるコンジュゲーションを含む、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 負荷が、受動的な負荷を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 受動的な負荷が、前記治療剤を、前記血小板、前記巨核球、または前記巨核球前駆細胞を含む細胞懸濁物とインキュベートすることを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記治療剤が、リポソーム内に含有されている、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記血小板または前記巨核球に治療剤を負荷するステップが、共有結合によるコンジュゲーションを含む、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
  29. 共有結合によるコンジュゲーションが、膜タンパク質とスルフヒドリル反応性架橋剤とのチオール化、アルキン反応性アジ化物、高親和性結合剤、および膜に結合したエピトープへの抗体のドッキングを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記高親和性結合剤が、ビオチンおよびアビジンを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記高親和性結合剤が、アビジン類似体を含む、請求項２９に記載の方法。
  32. 共有結合によるコンジュゲーションが、前記治療剤中に存在するアミンを、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）と反応させることを含む、請求項２８に記載の方法。
  33. 前記治療剤が、ケモカイン、サイトカイン、増殖因子、ポリペプチド、抗血管形成剤、ポリヌクレオチド、または小分子である、請求項１または２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記抗血管形成剤が、ドキソルビシン、ビンクリスチン、イリノテカン、またはパクリタキセルである、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ポリペプチドが、アテゾリズマブ、イピリムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、またはトラスツズマブである、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記小分子が、アリピプラゾール、エソメプラゾール、またはロスバスタチンである、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記増殖因子が、血小板由来増殖因子アイソフォーム（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢおよび−ＢＢ）、形質転換増殖因子−ｂ（ＴＧＦ−ｂ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、骨形成タンパク質２、−４もしくは−６（ＢＭＰ−２、−４、−６）、フォン・ヴィルブランド因子、ケラチノサイト増殖因子、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、上皮増殖因子、または毛髪増殖因子である、請求項３３に記載の方法。
  38. 前記サイトカインが、インターロイキン１−ベータ、インターロイキン２、またはインターロイキン１２である、請求項３３に記載の方法。
  39. 請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法によって産生された、巨核球前駆細胞、巨核球、または血小板を含む組成物。
  40. 前記巨核球が、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋である、請求項３９に記載の組成物。
  41. 請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法によって産生された、巨核球前駆細胞、巨核球、または血小板の溶解物を含む組成物。
  42. 前記巨核球が、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋である、請求項４１に記載の組成物。
  43. 前記血小板が、ＣＤ６１＋、ＤＲＡＱ、カルセインＡＭ＋、ＣＤ４２ａ＋、およびＣＤ６２Ｐ−のうちの１つまたは複数である、請求項４１に記載の組成物。
  44. 前記血小板が、ＧＰＶＩ−である、請求項４１に記載の組成物。
  45. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項３９から４５のいずれか一項に記載の組成物。
  46. 治療剤を含むｉＰＳＣ由来血小板または巨核球を含む細胞。
  47. 前記血小板が、休止状態の場合における、ＣＤ６１＋、ＤＲＡＱ−、カルセインＡＭ＋、ＣＤ４２ａ＋、およびＣＤ６２Ｐ−のうちの１つまたは複数である、請求項４６に記載の細胞。
  48. 前記血小板が、活性化状態での、ＣＤ６１＋、ＤＲＡＱ−、カルセインＡＭ＋、ＣＤ４２ａ＋、およびＣＤ６２Ｐ＋のうちの１つまたは複数である、請求項４６から４７のいずれか一項に記載の細胞。
  49. 前記血小板が、ＧＰＶＩを発現しない、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の細胞。
  50. 受容体が媒介する負荷、受動的な負荷、または共有結合によるコンジュゲーションによって、前記血小板に前記治療剤が負荷される、請求項４６から４９のいずれか一項に記載の細胞。
  51. 前記血小板が、前記治療剤と共有結合でコンジュゲートされている、請求項４６から４９のいずれか一項に記載の細胞。
  52. 前記血小板が、前記治療剤を発現するように遺伝子操作されている、請求項４６から４９のいずれか一項に記載の細胞。
  53. 前記治療剤が、ケモカイン、サイトカイン、増殖因子、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子である、請求項４６に記載の細胞。
  54. 抗血管形成剤が、ドキソルビシン、ビンクリスチン、イリノテカン、またはパクリタキセルである、請求項５３に記載の細胞。
  55. 前記ポリペプチドが、アテゾリズマブ、イピリムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、またはトラスツズマブである、請求項５３に記載の細胞。
  56. 前記小分子が、アリピプラゾール、エソメプラゾール、またはロスバスタチンである、請求項５３に記載の細胞。
  57. 前記増殖因子が、血小板由来増殖因子アイソフォーム（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢおよび−ＢＢ）、形質転換増殖因子−ｂ（ＴＧＦ−ｂ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、骨形成タンパク質２、−４もしくは−６（ＢＭＰ−２、−４、−６）、フォン・ヴィルブランド因子、ケラチノサイト増殖因子、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、上皮増殖因子、または毛髪増殖因子である、請求項５３に記載の細胞。
  58. 前記サイトカインが、インターロイキン１−ベータ、インターロイキン２、またはインターロイキン１２である、請求項５３に記載の細胞。
  59. 処置を必要とする被験体を処置する方法であって、治療有効量の請求項３９から５９のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  60. 前記被験体が、ヒトである、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記投与が、静脈内である、請求項５９から６１のいずれか一項に記載の方法。
  62. 治療剤を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来細胞を産生するための方法であって、
    治療剤を含む細胞を提供するステップであって、前記細胞は、血小板に分化することができる、ステップ；
    細胞を、治療剤を含む血小板に分化させるステップ
    を含む、方法。
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