JP2021527427A - 強化されたhATファミリーのトランスポゾンが介在する遺伝子導入ならびに関連する組成物、システム、及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
相互参照
本出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる2018年6月21日に出願された米国仮特許出願第62/688,278号の利益も主張する。
[背景技術]
[発明の概要]
本明細書に記述されている刊行物、特許及び特許出願はすべて、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、具体的に且つ個別に参照によって組み込まれるように指示されたかのようなことと同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。参照によって組み込まれる用語が本明細書で定義される用語と矛盾する範囲内では、本明細書が支配する。
[図面の簡単な説明]
[図2]例示的なTcBuster IR/DR配列1(それぞれ出現順に配列番号3〜4)及び配列2(それぞれ出現順に配列番号5〜6)のヌクレオチド配列比較を示す図である。
[図3]Aは例示的なTcBusterトランスポゾンTn−8(puro−mCherryカセットを含有する;図1に示す)及び野生型TcBusterトランスポザーゼまたはV596A変異型トランスポザーゼ(V596A置換を含有する)による形質移入の2週間後のHEK−293T細胞の代表的な明視野画像及び蛍光画像を示す。形質移入された細胞を、形質移入の2日後に1μg/mLのピューロマイシンと共に6ウェルプレートに入れ、コロニーの定量のために形質移入の2週間後に固定し、クリスタルバイオレットで染色した。Bは形質移入の2週間後の6ウェルプレートにおける形質移入された細胞コロニーの代表的な写真を示す。Cは形質移入の2週間後の各形質移入条件ごとのコロニーの定量を示すグラフである。
[図4]ACサブファミリーにおけるいくつかのトランスポザーゼに対比させたTcBusterトランスポザーゼのアミノ酸配列の配列比較を示し、アミノ酸保存の領域のみが示されている(それぞれ、出現順に配列番号89〜194)。
[図5]Busterサブファミリーにおける多数の他のトランスポザーゼメンバーに対比させたTcBusterトランスポザーゼのアミノ酸配列の配列比較を示す図である(それぞれ、出現順に配列番号195〜203)。特定の例示的なアミノ酸置換をタンパク質配列の上に示し、併せて、配列比較の上に示す比率はTcBuster配列に置換されていると考えられるアミノ酸を含有する他のBusterサブファミリーメンバーの比率であり、下に示す比率はその位置で標準的なTcBusterアミノ酸を含有する他のBusterサブファミリーメンバーの比率である。
[図6]TcBusterトランスポザーゼ変異型を調べるのに使用された例示的な発現ベクターpcDNA−DEST40のベクターマップを示す。
[図7]例示的なトランスポザーゼ変異型と共にTcBusterトランスポゾンTn−8(図1に示す)で形質移入したHEK−293T細胞におけるmCherry陽性細胞の比率によって測定される、例示的なTcBusterトランスポザーゼ変異型の転位効率を定量化するグラフである。
[図8]任意のリンカーによって連結されたDNA配列特異的結合ドメインとTcBusterトランスポザーゼ配列とを含有する1つの例示的な融合トランスポザーゼを示す。
[図9]タグを含有する例示的なトランスポザーゼと共にTcBusterトランスポゾンTn−8(図1に示す)で形質移入したHEK−293T細胞におけるmCherry陽性細胞の割合によって測定したときの、異なるタグを含有する例示的なTcBusterトランスポザーゼの転位効率を定量化するグラフである。
[図10]AはGFP陽性細胞の比率によって測定されたときの、ヒトCD3+T細胞における例示的なTcBuster転位システムの転位効率を定量化するグラフである。Bはフローサイトメトリーによる形質移入の2日後及び7日後の形質移入されたT細胞の生存率を定量化するグラフである。データはパルス制御に関連する。
[図11]特定のアミノ酸に注釈が付けられた野生型TcBusterトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す(配列番号1)。
[図12]アミノ酸置換D189A/V377T/E469K(配列番号78)を含有する変異型TcBusterトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す。
[図13]アミノ酸置換D189A/V377T/E469K/I452K(配列番号79)を含有する変異型TcBusterトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す。
[図14]アミノ酸置換D189A/V377T/E469K/N85S(配列番号80)を含有する変異型TcBusterトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す。
[図15]アミノ酸置換D189A/V377T/E469K/A358K(配列番号81)を含有する変異型TcBusterトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す。
[図16]アミノ酸置換D189A/V377T/E469K/K573E/E578L(配列番号13)を含有する変異型TcBusterトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す。
[発明を実施するための形態]
Claims (152)
- 完全長の配列番号1と少なくとも70%同一であり、表1.1の1以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 配列番号1と比べて中性pHで正味の電荷を増加させるアミノ酸置換を含む、請求項1に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 前記中性pHで前記正味の電荷を増加させる前記アミノ酸置換がリシンまたはアルギニンへの置換を含む、請求項2に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 前記中性pHにて前記正味電荷を増加させる前記アミノ酸置換がアスパラギン酸またはグルタミン酸の中性アミノ酸、リシンまたはアルギニンへの置換を含む、請求項2または3に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 表4.1の1以上のアミノ酸置換を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 表4の1以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- DNA結合及びオリゴマー化ドメイン;挿入ドメイン;Zn−BEDドメイン;またはそれらの組み合わせにてアミノ酸置換を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 配列番号1と比べて、触媒ドメイン内または触媒ドメインの近傍にて中性pHで正味電荷を増加させるアミノ酸置換を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 配列番号1と比べて中性pHで正味電荷を増加させるアミノ酸置換を含み、前記1以上のアミノ酸が配列番号1に従って番号付けされる場合、D223、D289またはE589の近傍に位置する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 前記近傍が約80、75、70、60、50、40、30、20、10、または5アミノ酸の距離である、請求項8または9に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 前記近傍が約70〜80アミノ酸の距離である、請求項8または9に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 前記変異型TcBusterトランスポゼースの前記アミノ酸配列が完全長の配列番号1と少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 表2の1以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 表3の1以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換V377T、E469K、及びD189Aをさらに含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換K573E及びE578Lをさらに含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換I452Kをさらに含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換A358Kをさらに含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換V297Kをさらに含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換N85Sをさらに含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換I452F、V377T、E469K、及びD189Aをさらに含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換A358K、V377T、E469K、及びD189Aをさらに含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換V377T、E469K、D189A、K573E及びE578Lをさらに含む、請求項1〜22のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 表1の1以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項1〜23のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 前記変異型TcBusterトランスポザーゼが、アミノ酸配列の配列番号1を有する野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて、上昇した転位効率を有する、請求項1〜24のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 前記変異型TcBusterトランスポザーゼまたは前記野生型TcBusterトランスポザーゼと、レポーターカーゴカセットを含有するTcBusterトランスポゾンとを細胞の集団に導入することと、細胞の前記集団のゲノムにおける前記レポーターカーゴカセットの転位を検出することとを含むアッセイによって前記転位効率が測定される、請求項25に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- TcBusterトランスポザーゼ配列と1以上の追加の核局在化シグナル配列とを含み、前記TcBusterトランスポザーゼ配列が完全長の配列番号1に対して少なくとも70%の同一性を有する、融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が完全長の配列番号1に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する、請求項27に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が配列番号1と比べて中性pHで正味の電荷を増加させる1以上のアミノ酸置換を含む、請求項27または28に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記1以上のアミノ酸置換が、リシンまたはアルギニンによる置換を含む、請求項29に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記1以上のアミノ酸置換がアスパラギン酸またはグルタミン酸の中性アミノ酸、リシンまたはアルギニンによる置換を含む、請求項29または30に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が表4、表4.1、または双方の1以上のアミノ酸置換を含む、請求項27〜31のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列がDNA結合及びオリゴマー化ドメイン;挿入ドメイン;Zn−BEDドメイン;またはそれらの組み合わせにて1以上のアミノ酸置換を含む、請求項27〜32のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が含む表1、表1.1、または双方の1以上のアミノ酸置換を含む、請求項27〜33のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列がアミノ酸配列の配列番号1を有する野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて高い転位効率を有する、請求項27〜34のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列の前記転位効率が、前記融合トランスポザーゼまたは前記野生型TcBusterトランスポザーゼと、レポーターカーゴカセットを含有するTcBusterトランスポゾンとを細胞の集団に導入することと、細胞の前記集団のゲノムにて前記レポーターカーゴカセットの転位を検出することとを含むアッセイによって測定される、請求項35に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が配列番号1と比べて触媒ドメインの内部またはその近傍にて中性pHで正味の電荷を増加させる1以上のアミノ酸置換を含む、請求項27〜36のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が配列番号1と比べて中性pHで正味の電荷を増加させる1以上のアミノ酸置換を含み、その際、前記1以上のアミノ酸置換が配列番号1に従って番号付けされる場合、D223、D289、またはE589の近傍に位置する、請求項27〜37のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記近傍が約80、75、70、60、50、40、30、20、10、または5アミノ酸の距離である、請求項37または38に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記近傍が約70〜80アミノ酸の距離である、請求項37または38に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が表2の1以上のアミノ酸置換を含む、請求項27〜40のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が表3の1以上のアミノ酸置換を含む、請求項27〜41のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換V377T、E469K、及びD189Aを含む、請求項27〜42のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換K573E及びE578Lを含む、請求項27〜43のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換I452Kを含む、請求項27〜44のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換A358Kを含む、請求項27〜45のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換V297Kを含む、請求項27〜46のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換N85Sを含む、請求項27〜47のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換I452F、V377T、E469K、及びD189Aを含む、請求項27〜48のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換A358K、V377T、E469K、及びD189Aを含む、請求項27〜49のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が配列番号1に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換V377T、E469K、D189A、K573E及びE578Lを含む、請求項27〜50のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列が完全長の配列番号1に対して100%の同一性を有する、請求項27〜51のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- TcBusterトランスポザーゼ配列とDNA配列特異的結合ドメインとを含む融合トランスポザーゼであって、前記TcBusterトランスポザーゼ配列が請求項1〜26のいずれか1項に記載の変異型TcBusterのアミノ酸配列を有する、前記融合トランスポザーゼ。
- 前記DNA配列特異的結合ドメインが、TALEドメイン、ジンクフィンガードメイン、AAVのRep DNA結合ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項53に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記DNA配列特異的結合ドメインがTALEドメインを含む、請求項53または54に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記TcBusterトランスポザーゼ配列及びDNA配列特異的結合ドメインがリンカーによって分離される、請求項53〜55のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記リンカーが少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、または少なくとも50のアミノ酸を含む、請求項56に記載の融合トランスポザーゼ。
- 前記リンカーが配列番号9を含む、請求項56または57に記載の融合トランスポザーゼ。
- 完全長の配列番号204または207と少なくとも約80%、85%、90%、95%、または98%同一または相補性である核酸配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項1〜26のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項27〜58のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが前記変異型TcBusterトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼをコードするDNAを含む、請求項59〜61のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが前記変異型TcBusterトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーRNA(mRNA)を含む、請求項59〜62のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが化学的に修飾される、請求項63に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、前記変異型TcBusterトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、請求項59〜64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがDNAベクターに存在する、請求項59〜65のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記DNAベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項66に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがヒト細胞における発現のためにコドンで最適化される、請求項59〜67のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 完全長の配列番号204または207と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、または98%同一または相補性である核酸配列を含む、請求項60〜68のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 完全長の配列番号204または207と少なくとも約80%、85%、90%、95%、または98%同一または相補性である核酸配列を含む、請求項60〜68のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 完全長の配列番号204または207と少なくとも約95%同一または相補性である核酸配列を含む、請求項59〜68のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 完全長の配列番号204または207と100%同一または相補性である核酸配列を含む、請求項59〜68のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜58のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを産生する細胞。
- 請求項59〜72のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞。
- 請求項1〜26のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼと、前記変異型TcBusterトランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンとを細胞に導入することを含む方法。
- 請求項27〜58のいずれか1項に記載の融合トランスポザーゼと、前記融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンとを細胞に導入することを含む方法。
- 前記導入することが前記変異型TcBusterトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと前記細胞を接触させることを含む、請求項75または76に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、前記変異型TcBusterトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼをコードするDNAを含む、請求項77に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが前記変異型TcBusterトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーRNA(mRNA)を含む、請求項77に記載の方法。
- 前記mRNAが化学的に修飾される、請求項79に記載の方法。
- 前記導入することが前記トランスポゾンを含有するDNAベクターと前記細胞を接触させることを含む、請求項75〜80のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項81に記載の方法。
- 前記導入することが、前記トランスポゾンと、前記変異型TcBusterトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼをコードする前記ポリヌクレオチドとの双方を含有するプラスミドベクターと前記細胞を接触させることを含む、請求項77〜82のいずれか1項に記載の方法。
- 前記導入することが、精製タンパク質としての前記変異型TcBusterトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼと前記細胞を接触させることを含む、請求項75〜83のいずれか1項に記載の方法。
- 前記トランスポゾンが2つの逆向き反復配列の間に位置するカーゴカセットを含む、請求項75〜84のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号3に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項85に記載の方法。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号3を含む、請求項85に記載の方法。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列が配列番号4に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項85〜87のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列が配列番号4を含む、請求項85〜87のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号5に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項85に記載の方法。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号5を含む、請求項85に記載の方法。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列が配列番号6に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項85、90または91に記載の方法。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列が配列番号6を含む、請求項85、90または91に記載の方法。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号205に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項85に記載の方法。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号205を含む、請求項85に記載の方法。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列が配列番号206に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項85、94または95に記載の方法。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列が配列番号206を含む、請求項85、94または95に記載の方法。
- 前記カーゴカセットがCMV、EFS、MND、EF1α、CAGCs、PGK、UBC、U6、H1、及びクメートから成る群から選択されるプロモーターを含む、請求項85〜97のいずれか1項に記載の方法。
- 前記カーゴカセットがCMVプロモーターを含む、請求項85〜98のいずれか1項に記載の方法。
- 前記カーゴカセットが順方向で存在する、請求項85〜99のいずれか1項に記載の方法。
- 前記カーゴカセットが逆方向に存在する、請求項85〜99のいずれか1項に記載の方法。
- 前記導入することが、エレクトロポレーション、微量注入、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性ポリマー、デンドリマー、リポソーム、微小発射体衝撃、FuGene、直接音波負荷、細胞圧搾、光学形質移入、プロトプラスト融合、インパレフェクション、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション、またはそれらの任意の組み合わせの助けを借りて細胞に形質移入することを含む、請求項75〜101いずれか1項に記載の方法。
- 前記導入することが前記細胞でエレクトロポレーションを行なうことを含む、請求項75〜102のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、対象から単離された初代細胞である、請求項75〜103のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項104に記載の方法。
- 前記対象が疾患を持つ患者である、請求項104または105に記載の方法。
- 前記対象ががんまたは腫瘍と診断されている、請求項104〜106のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が前記対象の血液から単離される、請求項104〜107のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が初代免疫細胞を含む、請求項75〜108のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が初代白血球を含む、請求項75〜109のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が初代T細胞を含む、請求項75〜110のいずれか1項に記載の方法。
- 前記初代T細胞がガンマデルタT細胞、ヘルパーT細胞、メモリーT細胞、ナチュラルキラーT細胞、エフェクターT細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項111に記載の方法。
- 初代免疫細胞がCD3+細胞を含む、請求項109〜112のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が幹細胞を含む、請求項75〜113のいずれか1項に記載の方法。
- 前記幹細胞が、胚性幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、上皮幹細胞、気管支肺胞幹細胞、乳腺幹細胞、間葉幹細胞、腸幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣細胞、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項114に記載の方法。
- 前記幹細胞が人工多能性幹細胞を含む、請求項114に記載の方法。
- 前記カーゴカセットが導入遺伝子を含む、請求項85〜116のいずれか1項に記載の方法。
- 前記導入遺伝子が、細胞受容体、免疫チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるタンパク質をコードする、請求項117に記載の方法。
- 前記導入遺伝子が、T細胞受容体(TCR)、B細胞受容体(BCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、またはそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される細胞受容体をコードする、請求項117または118に記載の方法。
- 治療方法であって、
(a)トランスポゾンと、前記トランスポゾンを認識する請求項1〜58のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼとを細胞に導入し、それによって遺伝子操作された細胞を生成することと;
(b)治療を必要としている患者に前記遺伝子操作された細胞を投与することとを含む、前記方法。 - 前記遺伝子操作された細胞が前記トランスポゾンによって導入された導入遺伝子を含む、請求項120に記載の方法。
- 前記患者ががんまたは腫瘍と診断されている、請求項120または121に記載の方法。
- 前記投与することが前記遺伝子操作された細胞を前記患者の血管に輸注することを含む、請求項120〜122のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜58のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼと、前記変異型TcBusterトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンとを含む、ゲノム編集のためのシステム。
- 請求項1〜58のいずれか1項に記載の変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと、前記変異型TcBusterトランスポザーゼまたは前記融合体によって認識可能なトランスポゾンとを含む、ゲノム編集のためのシステム。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号204または207と少なくとも80%同一または相補性である核酸配列を含む、請求項125に記載のシステム。
- 前記ポリヌクレオチドが前記変異型TcBusterトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼをコードするDNAを含む、請求項125に記載のシステム。
- 前記ポリヌクレオチドが前記変異型TcBusterトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーRNA(mRNA)を含む、請求項125または127に記載のシステム。
- 前記mRNAが化学的に修飾される、請求項128に記載のシステム。
- 前記トランスポゾンがDNAベクターに存在する、請求項124〜129のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記DNAベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項130に記載のシステム。
- 前記ポリヌクレオチド及び前記トランスポゾンが同じプラスミドに存在する、請求項125〜131のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記トランスポゾンが2つの逆向き反復配列の間に配置されたカーゴカセットを含む、請求項124〜132のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記2つの逆向き反復配列の左の逆向き反復配列が配列番号3に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項133に記載のシステム。
- 前記2つの逆向き反復配列の左の逆向き反復配列が配列番号3を含む、請求項133に記載のシステム。
- 前記2つの逆向き反復配列のうちの右の逆向き反復配列が配列番号4に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項133〜135に記載のシステム。
- 前記2つの逆向き反復配列のうちの右の逆向き反復配列が配列番号4を含む、請求項133〜135のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記2つの逆向き反復配列の左の逆向き反復配列が配列番号5に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項133に記載のシステム。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号5を含む、請求項133に記載のシステム。
- 前記2つの逆向き反復のうち右の逆向き反復配列が配列番号6に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項133、138または139に記載のシステム。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列が配列番号6を含む、請求項133、138または139に記載のシステム。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号205に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項133に記載のシステム。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号205を含む、請求項133に記載のシステム。
- 前記2つの逆向き反復配列のうちの右の逆向き反復配列が配列番号206に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項133、142、または143のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記2つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列が配列番号206を含む、請求項133、142、または143のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記カーゴカセットがCMV、EFS、MND、EF1α、CAGCs、PGK、UBC、U6、H1、及びクメートから成る群から選択されるプロモーターを含む、請求項133〜145のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記カーゴカセットがCMVプロモーターを含む、請求項133〜145のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記カーゴカセットが導入遺伝子を含む、請求項133〜147のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記導入遺伝子が細胞受容体、免疫チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるタンパク質をコードする、請求項148に記載のシステム。
- 前記導入遺伝子がT細胞受容体(TCR)、B細胞受容体(BCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、またはそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される細胞受容体をコードする、請求項148または149に記載のシステム。
- 前記カーゴカセットが順方向に存在する、請求項133〜150いずれか1項に記載のシステム。
- 前記カーゴカセットが逆方向に存在する、請求項133〜150いずれか1項に記載のシステム。
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