JP2021525277A - マンノースを標的としたナノ製剤とその調製および適用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、医薬品の分野に属し、具体的にはマンノースによって修飾された標的ナノ製剤、ナノ製剤を調製するための組成物、標的化要素、標的担体、および調製された標的薬剤およびその調製方法と適用に関する。標的機能を備えた前記ナノ製剤は、標的リガンドであるマンノースおよびその誘導体、ナノ製剤と主薬で構成され、前記標的物質はスペーサー材料と接続してから前記ナノ製剤の材料と接続してナノ製剤になる。前記標的ナノ製剤は、優れたマンノース受容体標的化を有し、標的細胞上のマンノース受容体に効率的に結合することができ、調製方法は汎用性があり、さまざまな標的ナノ製剤を合成することができ、精製と特性評価を容易にすることができる。

Description

優先権出願
この出願は、２０１８年５月２５日に提出された中国発明特許出願２０１８１０５１１３６８．２「マンノースによって修飾された標的ナノ製剤」の優先権を主張し、該優先権発明特許は、引用によって本書に組み込まれる。
技術分野
本発明は医薬品の分野に関し、具体的にはマンノースによって修飾された標的ナノ製剤、ナノ製剤を調製するための組成物、標的化要素、標的担体、および調製された標的薬剤およびその調製方法と適用に関する。
近年、薬物受容体を介した標的薬物送達システムが広く研究されており、標的薬物送達システムは、特定の標的化性を改善し、体内での薬物の広範な分布と深刻な副作用を克服することができる。その中で、レクチン受容体は、細胞膜の表面に分布する糖タンパク質、糖脂質、または糖複合体の一種であり、糖基の一部を特異的に認識して結合することができる。マンノース受容体は最も重要な高効率エンドサイトーシスレクチン受容体であり、その機能には内因性分子の除去、抗原提示の促進、細胞の活性化の調節と輸送が含まれる。また、腫瘍の免疫回避と転移に密接に関連しており、主にマクロファージ、樹状細胞、腫瘍細胞で発現され、マンノースグリコシル分子を特異的に認識することができる。最も潜在力のある標的グループとして、マンノシルは、非毒性、非免疫原性、良好な生体適合性および生分解性などの多くの利点を有し、薬物送達システムのグリコシル化修飾に広く使用することができる。
リポソームとナノ粒子は、最も経典的なナノ標的薬物送達担体であり、それらの標的化性の基礎は、さまざまな器官の粒子径の取り込み状況に応じて肺および他のリンパ組織および器官において選択的凝集しており、それによって様々な臓器における抗腫瘍薬の治療効果を改善する。その調製は簡単で、放出制御、免疫原性がなく、治療効果を高めるという特徴がある。ただし、リポソームとナノ粒子がエンドサイトーシスに依存して標的化を達成した後、標的化輸送中の安定性と病変の局所の取り込み効率は依然として比較的低く、それらの標的化をさらに改善する必要がある。そのため、生物薬剤学、材料科学、ナノテクノロジーの継続的な発展に伴い、ナノ粒子標的化性の改善と新しい標的担体の開発が徐々に抗腫瘍分野の研究のホットスポットになり、この段階でさまざまな種類の標的薬物送達タイプが出現している。
薬物標的担体としてリポソームを例にとると、その標的効果の原理によれば、より成熟した研究は現在、物理的標的化および分子標的化リポソームに分けることができる。それらの中で、物理的標的化リポソームには、ｐＨ感受性リポソーム（ＰＬＰ）、光感受性リポソーム、磁性リポソーム、および熱感受性リポソームが含まれる。例として光感受性リポソームを取り上げると、Ｙａｎｇらは光感受性細胞透過性ペプチドｐｃＣＰＰとアスパラギン酸−グリシン−アルギニン残基（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、ＮＧＲ）含有の短いペプチドを使用してリポソームの表面に連結し、ｐｃＣＰＰ−ＮＧＲ−ＬＰを構築した、この感光性リポソームは、細胞の取り込みを促進し、ｃ−ｍｙｃｃ遺伝子を効果的にサイレンシングし、ヒト線維肉腫の成長を遅らせることができる。しかし、上記の異なる形態のリポソームは、ある程度標的化効果を高めるが、それでも欠点がある、ｐＨ感受性リポソームは、肝臓や脾臓に蓄積するリポソームの毒性の問題を解決できない。感光性および磁性リポソームの生物学的放出の可能性および長期保存安定性は、依然として緊急に解決する必要がある。感熱性リポソームは腫瘍細胞を直接殺すことができるが、加熱時間が長すぎると正常な組織損傷を引き起こす可能性もある。分子標的リポソームはまた、標的薬物送達および体内の標的器官の吸収が不十分であるという問題を抱えている。
要約すると、標的薬の研究開発において、早急に解決すべき問題は、輸送中に破壊されないようにナノ担体を安定に保つことである。通常のナノ粒子またはリポソームは、能動的な標的化を持っていないため（受動的な標的化を持つものもある）、内皮系によって容易に除去され、利用率が低下され、不必要な毒性および副作用を引き起こす可能性がある。また、薬剤が標的細胞に到達した後、より効果的なリガンドを介してその有効性を発揮し、より迅速かつ直接的に細胞に入るということは研究の鍵である。
本発明の目的の１つは、ナノ製剤を提供し、マンノースおよびその誘導体によって修飾し、ナノ製剤の標的化を高めることである。
本発明の第２の目的は、上記の標的ナノ製剤の適用を提供することである。
本発明は、マンノースおよびその誘導体によって修飾された標的ナノ製剤を提供し、それが標的リガンドであるマンノースおよびその誘導体、ナノ製剤と主薬で構成され、ワクチン送達、腫瘍標的療法、 動脈硬化症および様々な炎症性疾患の治療に使用することができる。
具体的には、本発明によって提供される標的ナノ製剤であって、マンノース誘導体はマンノシド、マンノサミン、マンナンなどの１種または数種である。
具体的には、本発明によって提供される標的ナノ製剤であって、マンノース誘導体はメチル−Ｄ−マンノシド、１−αホルミルメチル−マンノピラノシド、４−アミノフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−マンノピラノシド、マンノース−６−リン酸、カルバモイル−Ｄ−マンノース、マンノサミン、マンナンの１種または数種である。
具体的には、本発明によって提供される標的ナノ製剤は、リポソーム、エマルジョン、ナノゲル、コアシェルナノ粒子、ＨＤＬナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、ポリマーミセルの１種または数種である。
具体的には、本発明によって提供される標的ナノ製剤であって、前記主薬は、小分子薬、タンパク質ポリペプチド薬、または遺伝子薬物の１種または数種である。
具体的には、本発明によって提供する標的ナノ製剤であって、前記主薬の小分子薬は、腫瘍標的療法、動脈硬化療法、およびさまざまな炎症性疾患に使用されるナノ製剤にカプセル化できる機能的な小分子である。例えば、抗腫瘍薬タキサン類（パクリタキセル、ドセタキセル、セファロマンニン、７−エピタキセル）、カンプトテシン類（カンプトテシン、ＳＮ３８、イリノテカン、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシンなど）、ビンブラスチン（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンフルニンなど）、ドキソルビシン、ファルモルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アンホテリシン、メタミン プテリン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ミトキサントロンまたはその誘導体、ゲフィチニブ、ノスカピン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、カルムスチン、ケルセチンなど。
前記主薬はタンパク質ポリペプチド類薬物はインターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６など）、さまざまな成長因子（線維芽細胞成長因子、肝臓成長因子、血管内皮成長因子、造血成長因子など）、インターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα、ＴＮＦβなど）、インテグリン、モノクローナル抗体、酵素、インスリンなどである。前記主薬成分の遺伝子薬物はＤＮＡ、プラスミド、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡなどである。標的ナノ製剤を免疫治療に使用するとき、前記主薬は免疫療法に使用されることに加えて、免疫効果を高めるために、免疫アジュバントをカプセル化することができる。
具体的には、本発明によって提供する標的ナノ製剤であって、前記標的リガンドであるマンノースおよびその誘導体の含有量は０．０５％−４０％である。
好ましくは、本発明によって提供する標的ナノ製剤であって、前記標的リガンドマンノースおよびその誘導体の含有量は１％−１０％である。
好ましくは、本発明によって提供する標的ナノ製剤であって、前記標的リガンドマンノースの含有量は２％〜５％である。
具体的には、本発明によって提供する標的ナノ製剤であって、前記標的リガンドマンノースおよびその誘導体の修飾方法は次のとおりである：ナノ製剤を調製した後、マンノースとその誘導体をナノ製剤の表面に吸着または結合させ、または、ナノ製剤を調製する前にマンノースとその誘導体をナノ製剤の調製用担体材料と結合させる。
具体的には、本発明によって提供する前記マンノースおよびその誘導体は、溶媒揮発法、高圧均質化法またはマイクロエマルジョン法によってナノ製剤の表面に吸着する。
具体的には、本発明によって提供する標的ナノ製剤であって、ナノ製剤を修飾するマンノースおよびその誘導体は、１個のマンノースおよびその誘導体および／または２〜１０個のマンノースおよびその誘導体から構成される。
具体的には、本発明によって提供する標的ナノ製剤であって、マンノースおよびその誘導体は、溶媒揮発法、高圧均質化法またはマイクロエマルジョン法によってナノ製剤の表面に吸着する。
具体的には、本発明によって提供する標的ナノ製剤であって、マンノースおよびその誘導体とナノ製剤またはナノ製剤の調製用担体材料とは、直接結合またはスペーサーを介して結合する。
具体的には、本発明によって提供する標的ナノ製剤であって、マンノースおよびその誘導体とナノ製剤またはナノ製剤の調製用担体材料とは、スペーサーを介して結合され、前記スペーサーは、グルタルアルデヒド、エチレンジアミン、マロン酸、短鎖アルキル鎖（−ＣＨ２−ＣＨ２−など）、ＰＥＧ、アミノ酸、ジペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ステアロイル、パルミトイルなどの１種または数種である。具体的には、スペーサーＰＥＧは、分子量が１００〜５０００で、両端または少なくとも一端にヒドロキシル基がアミノ化されているＰＥＧである。好ましくは、スペーサーＰＥＧの分子量は１００―２０００で、スペーサーアミノ酸はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、セリン、スレオニン、チロシンである。ジペプチド、オリゴペプチド、ペプチド両端のアミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、セリン、スレオニン、チロシンから選択される、中間アミノ酸は、２０種の任意のアミノ酸から選択される（ＲＧＤなど）。
具体的には、本発明によって提供する標的ナノ製剤であって、ナノ製剤の調製に使用される材料は、ミセル、エマルジョン、ナノゲル、コアシェルナノ粒子、ＨＤＬナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム、ポリマーミセルなどの調製のための活性アミノ基および／またはヒドロキシル基を有する製薬上許容される担体材料である。具体的には、担体材料は脂質、ポリ乳酸−ヒドロキシル基酢酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、キトサン、ゼラチン、ポロキサマー、ステアリルアルコールなどの１種または数種である。具体的には、リポソーム、コアシェルナノ粒子の調製に使用される脂質材料は、コレステロール、卵黄レシチン、大豆レシチン、セファリン、スフィンゴミエリン、ＰＣ（ホスファチジルコリン）、ＥＰＧ（レシチンアシルグリセロール）、ＳＰＧ（大豆ホスファチジルグリセロール）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン アルカリ（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジリノレイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（塩化物塩）（ＤＯＴＡＰ）などの１種または数種である。固体脂質ナノ粒子の調製に使用される固体脂質材料は、ステアリン酸、コレステロール、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、トリステアリン酸グリセリル、トリステアリン酸グリセリル、ラウリン酸グリセリル、ステアリン酸パルミチルグリセリル、ベヘン酸 モノグリセリド、ベヘン酸ジグリセリド、ベヘン酸トリグリセリド、グリセリルトリミリステート、グリセリルクエン酸塩、ステアリルアルコール、パルミチン酸、ミリスチン酸、トリメチル酸、ラウリン酸の１種または数種である。
本発明の第３の目的は、特定の標的薬物送達担体を調製するための材料組成物を提供することであり、その組成物を使用して、高度に標的化された薬物送達担体を調製することができる。
上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決策は以下のとおりである。
標的化機能を有するナノ製剤を調製するための組成物であって、前記組成物は、標的化材料およびナノ製剤基礎材料を含み、前記標的化材料は、マンノースおよび／またはマンノース誘導体である。
さらに、前記マンノース誘導体は、マンノシドおよび／またはマンノサミンおよび／またはマンナンである。
さらに、前記マンノース誘導体はメチル−Ｄ−マンノシド、１−αホルミルメチル−マンノピラノシド、４−アミノフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−マンノピラノシド、マンノース−６−ホスフェート、カルバモイル−Ｄ−マンノースである。
さらに、前記組成物中の前記標的物質の重量パーセントは、０．０５−４０％である。
さらに、前記組成物中の前記標的物質の重量パーセントは、１−１０％である。
さらに、前記組成物は、前記標的物質、前記ナノ製剤基礎材料、前記標的物質と前記ナノ製剤基礎材料との間に距離を作り出すスペーサー材料から構成され、前記スペーサー材料は、グルタルアルデヒド、エチレンジアミン、マロン酸、短鎖アルキル鎖、ＰＥＧ、アミノ酸、ジペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ステアロイル、パルミトイルの１種または数種である。
具体的には、前記スペーサーは、グルタルアルデヒド、エチレンジアミン、マロン酸、短鎖アルキル鎖（−ＣＨ２−ＣＨ２−など）、ＰＥＧ、アミノ酸、ジペプチド、オリゴペプチド、ペプチドなどの１種または数種である。具体的には、スペーサーはアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、セリン、スレオニン、チロシン。ジペプチド、オリゴペプチド、ペプチド両端のアミノ酸はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、セリン、スレオニン、チロシンのアミノ酸から構成される。中間アミノ酸は任意２０種のアミノ酸から選択される（ＲＧＤなど）。
さらに、前記ナノ製剤基礎材料は、リポソーム、エマルジョン、ナノゲル、コアシェルナノ粒子、ＨＤＬナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、ポリマーミセルの調製に使用される材料の組成物である。
具体的には、前記ナノ製剤基礎材料は、ナノ製剤の調製に使用される材料の組成物であり、『現代医薬品調製技術』で言及されているナノ調製材料であってもよい。
具体的には、前記ナノ製剤基礎材料は、脂質、ポリ乳酸−ヒドロキシル基酢酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、キトサン、ゼラチン、ポロキサマー、ステアリルアルコールの１種または数種である。
具体的には、リポソーム、コアシェルナノ粒子の調製に使用される脂質材料は、コレステロール、卵黄レシチン、大豆レシチン、セファリン、スフィンゴミエリン、ＰＣ（ホスファチジルコリン）、ＥＰＧ（レシチンアシルグリセロール）、ＳＰＧ（大豆ホスファチジルグリセロール）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン アルカリ（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジリノレイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（塩化物塩）（ＤＯＴＡＰ）の１種または数種である。
具体的には、固体脂質ナノ粒子の調製に使用される固体脂質材料は、ステアリン酸、コレステロール、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、トリステアリン酸グリセリル、トリステアリン酸グリセリル、ラウリン酸グリセリル、ステアリン酸パルミチルグリセリル、ベヘン酸 モノグリセリド、ベヘン酸ジグリセリド、ベヘン酸トリグリセリド、グリセリルトリミリステート、グリセリルクエン酸塩、ステアリルアルコール、パルミチン酸、ミリスチン酸、トリメチル酸、ラウリン酸の１種または数種である。
さらに、前記スペーサー材料はＰＥＧｎ，であり、ここで、ｎ＝１００−５０００。
好ましくは、前記ｎは２００、４００、１０００または２０００である。
さらに、重量部で以下の成分で構成される：マンノース１部、ＰＥＧ ０．５−５６部、コレステロール２−１１部。
好ましくは、重量部で以下の成分で構成される：マンノース１部、ＰＥＧ １０−２５部、コレステロール４−８部。
さらに、モル質量で以下の成分で構成される：マンノース１部、ＰＥＧ １−５部、コレステロール１−５部。
好ましくは、モル質量で以下の成分で構成される：マンノース１部、ＰＥＧ １−３部、コレステロール１−３部。
本発明の第４の目的は、さまざまな薬用成分を標的細胞に送達することができ、強力な標的化を有する標的担体および標的薬物を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決策は以下のとおりである。
前記組成物によって調製された薬物を運ぶための標的担体。
さらに、前記薬物は小分子薬および／または蛋白ペプチド類薬物および／または遺伝子薬物である。
小分子薬は、腫瘍標的療法、動脈硬化療法、およびさまざまな炎症性疾患のためのナノ製剤にカプセル化できる機能的な小分子である。
いくつかの実施形態において、特定の腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡは、標的化ナノ製剤担体にカプセル化されて体細胞に導入し、宿主細胞の発現系を介して抗原タンパク質を合成し、宿主免疫系を誘導して腫瘍抗原に対する免疫応答を生成して腫瘍の予防と治療の機能を実現することができ、また、ｍＲＮＡをロードした標的ナノ製剤はより優れた腫瘍標的化を持ち、腫瘍の治療に有益である。同様に、抗腫瘍化学および生物学的薬剤、ならびに動脈硬化症および炎症性疾患の治療のための薬剤もまた、より正確な標的治療を達成するために、標的ナノ調製担体にカプセル化することができる。
具体的には、前記小分子薬は、ＰＴＸ、ＤＯＸ、ケルセチンを含むがこれらに限定されない、前記蛋白ペプチド類薬物は、アルブミンを含むがこれらに限定されない、前記遺伝子薬物は、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含むがこれらに限定されない。
具体的には、前記小分子薬は、腫瘍標的療法、動脈硬化療法、およびさまざまな炎症性疾患のためのナノ製剤にカプセル化できる機能的な小分子である。例えば、抗腫瘍薬タキサン類（パクリタキセル、ドセタキセル、セファロマンニン、７−エピタキセル）、カンプトテシン類（カンプトテシン、ＳＮ３８、イリノテカン、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシンなど）、ビンブラスチン類（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンフルニン等）、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アンホテリシン、メトトレキサート、シタラビン、５−フルオロウラシル、ミトキサントロンまたはその誘導体、ゲフィチニブ、ノスカピン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、カルムスチン、ケルセチンなど、前記主薬成分のタンパク質ポリペプチド類薬剤はインターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６など）、さまざまな成長因子（線維芽細胞成長因子、肝臓成長因子、血管内皮成長因子、造血成長因子など）、インターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα、ＴＮＦβなど）、インテグリン、モノクローナル抗体、酵素、インスリンなどである。
前記主薬成分の遺伝子薬物はＤＮＡ、プラスミド、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡなどである。標的ナノ製剤を免疫治療に使用するとき、前記主薬は免疫療法に使用されることに加えて、免疫効果を高めるために、免疫アジュバントをカプセル化することができる。
前記標的担体によってカプセル化された薬物。
さらに、前記薬物は小分子薬および／またはタンパク質ペプチド類薬物および／または遺伝子薬物である。
具体的には、前記小分子薬は、ＰＴＸ、ＤＯＸ、ケルセチンを含むがこれらに限定されない、前記タンパク質ペプチド類薬物は、アルブミンを含むがこれらに限定されない、前記遺伝子薬物はｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含むがこれらに限定されない。
さらに、前記薬物は、任意の薬学的に許容される錠剤形態であってもよい。
具体的には、薬学的に許容される前記錠剤形態は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含み、前記の調製プロセスの適切なステップで添加される。本発明で使用される「薬学的に許容される」という用語は、合理的な医学的判断の範囲内で、患者組織との接触に過度の毒性および刺激性、アレルギーまたは合理的な利益／リスク比に見合った他の問題と合併症がなく、意図された目的に効果的に使用されるそのような化合物、原材料、組成物および／または錠剤形態を指す。
医薬製剤は、経口（経口または舌下を含む）、直腸、鼻、局所（経口、舌下または経皮を含む）、膣または非経口（皮下、皮下、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内、静脈内または皮下注射または注入を含む）などの任意の適切な経路による投与に適している。このような製剤は、例えば、活性成分を担体または賦形剤と混合することなど、薬局の分野における任意の既知の方法に従って調製することができる。好ましくは、経口投与、局所投与または注射投与である。水性または非水性液体中の溶液または懸濁液、カプセルまたは錠剤、粉末または顆粒、食用発泡製剤または発泡製剤など、経口投与に適した医薬製剤は、個別の単位で提供される。
本発明の第５の目的は、産業化の標的担体の調製に使用される標的担体の調製方法を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決策は以下のとおりである。
標的担体を調製するための方法は、ナノ製剤基礎材料をナノ薬物送達担体に調製し、次に標的物質を前記ナノ薬物送達担体の表面に付着させることである。
標的物質を前記ナノ薬物担体の表面に付着させる方法は以下のとおりである：溶媒揮発法、薄膜分散法、超音波分散法、注入法、逆蒸発法、高圧均質化法、およびマイクロエマルジョン法を含むがこれに限定されない方法によってナノ薬物担体を調製した後、標的物質溶液をそれと混合して標的物質をその表面に付着させる。上記のナノ薬物担体の調製方法は、『現代医薬品調製技術』を参照することができる。
具体的には、溶媒揮発法はミクロスフェアを調製する方法であり、その調製手順は以下のとおりである：まず、適切な濃度のポリマー溶液を調製し、次に連続相でポリマー溶液を乳化し、溶媒を徐々に揮発させ、ミクロスフェア製剤を得る、そして、標的物質を該ミクロスフェア製剤に添加し、標的物質をミクロスフェア調製物の表面に吸着させる。
高圧均質化法では、材料は高圧下で均質化バルブを通過し、非常に高い流量で排出され、コリジョンリングに衝突させ、材料はキャビテーション、衝撃、せん断効果によって超微細化および分散乳化され、ナノ粒子を形成する。 この期間中、材料の表面積が増加し、標的物質を追加した後、前記標的物質材料が表面に付着することができる。
薄膜蒸発法は、リン脂質を有機溶媒に溶解し、減圧下で有機溶媒を蒸発させてフラスコの内壁に薄膜を形成した後、水またはＰＢＳ溶液を加えて繰り返し攪拌し、薄膜を洗浄して均質化、超音波処理を行い、ナノ粒子製剤を得る、その中に標的物質を添加した後、前記標的物質がその表面に付着することができる。
本発明の第６の目的は、標的担体の標的化を著しく改善できる標的担体の標的化を改善する方法を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決策は以下のとおりである。
前記標的担体の標的化を改善する方法であって、以下のステップを含む。
Ａ標的化要素の合成
前記標的物質と前記スペーサー材料を標的化要素に合成する。
Ｂ標的担体の調製
ナノ製剤基礎材料をナノ製剤に調製し、ステップＡによって得られた標的化要素を前記ナノ薬物送達担体と接続して標的担体を得るか、先に前記スペーサー材料とナノ製剤基礎材料を合成し、そして前記標的物質をさらに接続して標的担体を得る。
さらに、前記標的化要素と前記ナノ薬物送達担体との距離は０．２―１００nmである。
好ましくは、前記標的化要素と前記ナノ薬物送達担体との距離は０．３―１０nmである。
本発明の第７の目的は、目的地に薬物を効率的に送達することができる薬物送達方法を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決策は以下のとおりである。
薬用成分を標的細胞に送達するための方法は、薬用成分を標的担体に入れてそれらを送達することである。
さらに、前記標的細胞は、マンノース受容体を含む細胞である。
さらに、前記標的細胞には、マクロファージ、樹枝状細胞および腫瘍細胞を含むがこれらに限定されない。
本発明の第８の目的は、強力な標的化を有する薬物担体を調製するために使用することができる標的化要素を有する組成物を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決策は以下のとおりである。
標的化要素を有する組成物は、標的物質とスペーサー材料で構成され、前記標的物質はマンノースおよび／またはマンノース誘導体である。
さらに、前記マンノース誘導体はマンノシドおよび／またはマンノサミンおよび／またはマンナンである。
さらに、前記マンノース誘導体はメチル−Ｄ−マンノシド、１−αホルミルメチル−マンノピラノシド、４−アミノフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−マンノピラノシド、マンノース−６−ホスフェート、カルバモイル−Ｄ−マンノースである。
さらに、前記スペーサー材料は、グルタルアルデヒド、エチレンジアミン、マロン酸、短鎖アルキル鎖、ＰＥＧ、アミノ酸、ジペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ステアロイル、パルミトイルの１種または数種である。
具体的には、前記スペーサーはグルタルアルデヒド、エチレンジアミン、マロン酸、短鎖アルキル鎖（−ＣＨ２−ＣＨ２−など）、ＰＥＧ、アミノ酸、ジペプチド、オリゴペプチド、ペプチドなどの１種または数種である。具体的には、スペーサーアミノ酸はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、セリン、スレオニン、チロシン。ジペプチド、オリゴペプチド、ペプチド両端のアミノ酸はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、セリン、スレオニン、チロシンから選択され、中間アミノ酸は任意の２０種のアミノ酸（ＲＧＤなど）から選択される。
さらに、前記スペーサー材料と前記標的物質とのモル比は１０−１：１である。
好ましくは、前記スペーサー材料と前記標的物質とのモル比は５：１である。
さらに、マンノースとＰＥＧ１００とのモル比は１：１である。
本発明の第９の目的は、強力な標的化を有する薬物担体を調製するために使用することができる標的化要素を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決策は以下のとおりである。
前記組成物を利用して調製された標的化要素。
さらに、前記標的化要素は式１に示すようである。ここで、Ｒ１は−Ｃ５Ｈ８Ｏ２、−Ｃ２Ｈ７Ｎ２、−Ｃ３Ｈ３Ｏ４、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ、−Ｃ２Ｈ３Ｏ２ＮＲ’または−Ｃ２Ｈ３ＯＮＲ’、−Ｃ４Ｈ５Ｏ３Ｎ２Ｒ１’Ｒ２’または−Ｃ４Ｈ５Ｏ２Ｎ２Ｒ１’Ｒ２’、−Ｃ３ｎ＋１Ｈ３ｎ＋２Ｏｎ＋２Ｎｎ＋１Ｒ１’Ｒ２’または−Ｃ３ｎ＋１Ｈ３ｎ＋２Ｏｎ＋１Ｎｎ＋１Ｒ１’Ｒ２’、−Ｃ１８Ｈ３５Ｏ、Ｃ１６Ｈ３１Ｏ、−Ｈ 、−ＣＨＯ、−Ｃ６Ｈ４ＮＨ２、−Ｃ６Ｈ４ＮＯ２、−ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２Ｃ６ＣＣＨＣＯ２ＣＨ３であり、前記Ｒ１’とＲ２’のいずれかも任意の天然アナミン酸側鎖Ｒ’グループ、Ｒ２は− ＣＨ３または−ＰＯ３Ｈ２、Ｒ３は−Ｈ，Ｒ４は−Ｈ，Ｒ５は−Ｈまたは−ＮＨＣＯＣＨ３である。
Figure 2021525277
 さらに、Ｒ１はポリエチレングリコールであり、その構造式は次のとおりである。
Figure 2021525277
 、ここで、ｎ＝１〜５０００、対応する分子量は４０＊ｎである。
本発明の第１０の目的は、薬物を標的細胞に運ぶことができる標的担体を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決策は以下のとおりである。
前記標的化要素を含む標的担体。
さらに、標的化要素とナノ調製物を接続することによって形成され、前記ナノ製剤はリポソーム、エマルジョン、ナノゲル、コアシェルナノ粒子、ＨＤＬナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、ポリマーミセルである。
具体的には、前記ナノ製剤の材料は『現代医薬品調製技術』で言及しているナノ製剤材料である。
具体的には、前記ナノ製剤の材料は脂質、ポリ乳酸−ヒドロキシル基酢酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、キトサン、ゼラチン、ポロキサマー、ステアリルアルコールの１種または数種である。
具体的には、リポソーム、コアシェルナノ粒子の調製に使用される脂質材料は、コレステロール、卵黄レシチン、大豆レシチン、セファリン、スフィンゴミエリン、ＰＣ（ホスファチジルコリン）、ＥＰＧ（レシチンアシルグリセロール）、ＳＰＧ（大豆ホスファチジルグリセロール）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン アルカリ（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジリノレイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（塩化物塩）（ＤＯＴＡＰ）の１種または数種である。
具体的には、固体脂質ナノ粒子の調製に使用される固体脂質材料はステアリン酸、コレステロール、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、トリステアリン酸グリセリル、トリステアリン酸グリセリル、ラウリン酸グリセリル、ステアリン酸パルミチルグリセリル、ベヘン酸 モノグリセリド、ベヘン酸ジグリセリド、ベヘン酸トリグリセリド、グリセリルトリミリステート、グリセリルクエン酸塩、ステアリルアルコール、パルミチン酸、ミリスチン酸、トリメチル酸、ラウリン酸の１種または数種である。
さらに、前記１個の標的担体には１−１０００００個の前記標的化要素が接続される。
好ましくは、前記１個の標的担体には１−１０００個の前記標的化要素が接続される。
さらに、前記標的化要素のヘッドと前記ナノ製剤との距離は０．２―１００nm。
さらに、前記標的化要素のヘッドと前記ナノ製剤との距離は０．３―１０nm。
さらに、前記ヘッドはマンノシドおよび／またはマンノサミンおよび／またはマンナンである。
本発明の第１１の目的は、標的化要素をナノ製剤に接続する方法を提供することであり、この方法は、汎用性があり、さまざまな標的ナノ製剤を合成でき、精製と特性評価を容易にすることができる。
上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決策は以下のとおりである。
前記標的化要素をナノ製剤に接続する方法であって、前記標的物質をスペーサー材料と接続した後に前記ナノ製剤の材料と接続してナノ製剤を調製することを特徴とする。
前記標的化要素をナノ製剤に接続する方法であって、前記標的物質とスペーサー材料を接続し、次に前記ナノ製剤の材料と接続してナノ製剤を形成することを特徴とする。
さらに、具体的には以下のステップを含む。
１）ジエチレングリコール、ｐ−トルエンスルホニルクロリドとトリエチルアミンをＤＣＭに溶解し、室温で反応させ、カラムクロマトグラフィーによって分離して化合物１を得る。
２）化合物１、ペンタアセチル化マンノースとその誘導体、三フッ化ホウ素エーテルを取ってＤＣＭに溶解し、室温で反応させ、カラムクロマトグラフィーによって分離して化合物２を得る。
３）化合物２とアジ化ナトリウムを取ってＤＭＦに溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって分離して固体化合物３を得る。
４）化合物３を取ってメトキシドナトリウムのメタノール溶液に溶解し、室温で反応させ、濃縮して化合物４を得る。
５）コレステロール、ブロモプロピンと水素ナトリウムをエーテルとＤＭＦの混合溶液に溶解し、室温で反応させ、シリカゲルカラムクロマグラフィーによって分離して固体化合物５を得る。
６）化合物４、化合物５とヨウ化第一銅をＤＭＦに溶解し、室温で２４ｈ反応させ、シリカゲルカラムクロマグラフィーによって標的担体固体化合物６を得る。
いくつかの実施形態において、ジエチレングリコール、ｐ−トルエンスルホニルクロリドとトリエチルアミンを取ってＤＣＭ二溶解し、室温で２４ｈ反応させ、カラムクロマトグラフィーによって分離して生成物ＴｏｓＯＣ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４ＯＨ（化合物１）を得る。化合物１ペンタアセチル化マンノースとその誘導体、三フッ化ホウ素エーテル（ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ）を取ってＤＣＭに溶解し、室温で２４ｈ反応させ、カラムクロマトグラフィーによって分離して生成物Ａｃｏ−Ｍ−ＯＣ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４ＯＴｏｓ （化合物２）を得る、Ｍはマンノースおよびその誘導体である。化合物２とアジ化ナトリウムを取ってＤＭＦに溶解し、６０℃で２４ｈ反応させ、、シリカゲルカラムクロマグラフィーによって固体生成物Ａｃｏ−Ｍ−ＯＣ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４Ｎ３（化合物３）を得る。化合物３を取ってメトキシドナトリウムのメタノール溶液に溶解し、室温で３ｈ反応させ、濃縮した生成物Ｍ−ＯＣ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４Ｎ３（化合物４）を得る。コレステロール、ブロモプロピンと水素ナトリウムを取ってエーテルとＤＭＦの混合溶液に溶解し、室温で２４ｈ反応させ、シリカゲルカラムクロマグラフィーによって固体生成物Ｃｈｏｌ−ＣＨ２ＣＣＨ（化合物５）を得る。化合物４、化合物５とヨウ化第一銅を取ってＤＭＦに溶解し、室温で２４ｈ反応させ、シリカゲルカラムクロマグラフィーによって固体生成物Ｍ−ＰＥＧｎ−Ｃｈｏｌ（化合物６）を得る。
本発明の第１２の目的は、特許請求項に記載の標的担体の薬物送達能力を高める方法を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決策は以下のとおりである。
特許請求項に記載の標的担体の薬物送達能力を改善するための方法は、送達のために薬物を標的担体にカプセル化されることである。
さらに、前記薬物は小分子薬および／またはタンパク質ペプチド類薬物および／または遺伝子薬物である。
具体的には、前記小分子薬は、腫瘍標的療法、動脈硬化療法、およびさまざまな炎症性疾患のためのナノ製剤にカプセル化できる機能的な小分子である。
いくつかの実施形態において、特定の腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡは、標的化ナノ製剤担体にカプセル化されて体細胞に導入し、宿主細胞の発現系を介して抗原タンパク質を合成し、宿主免疫系を誘導して腫瘍抗原に対する免疫応答を生成して腫瘍の予防と治療の機能を実現することができ、また、ｍＲＮＡをロードした標的ナノ製剤はより優れた腫瘍標的化を持ち、腫瘍の治療に有益である。同様に、抗腫瘍化学および生物学的薬剤、ならびに動脈硬化症および炎症性疾患の治療のための薬剤もまた、より正確な標的治療を達成するために、標的ナノ調製担体にカプセル化することができる。
具体的には、前記小分子薬は、ＰＴＸ、ＤＯＸ、ケルセチンを含むがこれらに限定されない、前記タンパク質ペプチド類薬物はアルブミンを含むがこれに限定されない、前記遺伝子薬物はｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含むがこれらに限定されない。
具体的には、前記小分子薬は腫瘍標的療法、動脈硬化療法、およびさまざまな炎症性疾患のためのナノ製剤にカプセル化できる機能的な小分子である。例えば、抗腫瘍薬タキサン類（（パクリタキセル、ドセタキセル、セファロマンニン、７−エピタキセル）、カンプトテシン類（カンプトテシン、ＳＮ３８、イリノテカン、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシンなど）、ビンブラスチン類（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンフルニンなど）、ドキソルビシン、ファルモルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アンホテリシン、メタミン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ミトキサントロンまたはその誘導体、ゲフィチニブ、ノスカピン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、カルムスチン、ケルセチンなどである。前記主薬成分のタンパク質ペプチド類薬物はインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６など）、さまざまな成長因子（さまざまな成長因子（線維芽細胞成長因子、肝臓成長因子、血管内皮成長因子、造血成長因子など）、インターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα、ＴＮＦβなど）、インテグリン、モノクローナル抗体、酵素、インスリンなどである。前記主要な約成分の遺伝子薬物はＤＮＡ、プラスミド、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡなどである。標的ナノ製剤を免疫治療に使用するとき、前記主薬は免疫療法に使用されることに加えて、免疫効果を高めるために、免疫アジュバントをカプセル化することができる。
さらに、前記薬物は、任意の薬学的に許容される錠剤形態であってもよい。
具体的には、薬学的に許容される前記錠剤形態は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含み、前記の調製プロセスの適切なステップで添加される。本発明で使用される「薬学的に許容される」という用語は、合理的な医学的判断の範囲内で、患者組織との接触に過度の毒性および刺激性、アレルギーまたは合理的な利益／リスク比に見合った他の問題と合併症がなく、意図された目的に効果的に使用されるそのような化合物、原材料、組成物および／または錠剤形態を指す。
医薬製剤は、経口（経口または舌下を含む）、直腸、鼻、局所（経口、舌下または経皮を含む）、膣または非経口（皮下、皮下、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内、静脈内または皮下注射または注入を含む）などの任意の適切な経路による投与に適している。このような製剤は、例えば、活性成分を担体または賦形剤と混合することなど、薬局の分野における任意の既知の方法に従って調製することができる。好ましくは、経口投与、局所投与または注射投与である。水性または非水性液体中の溶液または懸濁液、カプセルまたは錠剤、粉末または顆粒、食用発泡製剤または発泡製剤など、経口投与に適した医薬製剤は、個別の単位で提供される。
さらに、前記標的担体は、薬物をマンノース受容体標的を含む標的細胞に送達することができる。
本発明の第１３の目的は、前記標的担体を含む複合体を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決策は以下のとおりである。
前記複合体は前記標的担体と受容体が形成された複合体である。
さらに、前記標的担体を薬物を運んでいる。
さらに、前記受容体はマンノース受容体である。
本発明の第１４の目的は、トランスフェクション試薬のトランスフェクション効率を改善する方法を提供することであり、該方法は、トランスフェクション試薬のトランスフェクション効率を顕著に高めることができる。
上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決策は以下のとおりである。
トランスフェクション試薬のトランスフェクション効率を高める方法では、高いトランスフェクション効率を有するトランスフェクション試薬を調製するために標的化要素をトランスフェクション試薬を調製するための担体に接続することである。
トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）は、外来ＤＮＡの取り込みにより真核細胞が新しい遺伝子マーカーを獲得する過程である。ＤＮＡトランスフェクション技術の発展は、現代の分子生物学に大きな影響を与えた。遺伝子トランスフェクション技術は、導入遺伝子と遺伝子発現を研究するための重要なツールであるだけでなく、遺伝子治療の重要なステップでもある。理想的な遺伝子トランスフェクション試薬は、トランスフェクション効率が高く、安全性が高く、細胞毒性が低く、方法が簡単で時間が節約し、コストが低いなどの特性を備えている必要がある。
本発明の第１５の目的は、前記標的化要素の適用を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明の技術的解決策は以下のとおりである。
前記標的化要素は標的油相として使用される。
前記標的化要素は標的水相として使用される。
具体的には、同様の互換性の原則に従う。水に溶けにくいものは油相に属し、水に溶けやすいものは水相に属する。 簡単にすれば、物質は水と混和し、透明な溶液になるものは、水相に属し、層状または濁ったものは油相に属する。
本発明の有益な効果は以下のとおりである。
１）本発明によって提供される前記標的ナノ製剤、ナノ製剤の組成物、標的化要素、標的担体、標的薬物は、比較的良いマンノース受容体の標的化性を有し、標的細胞上のマンノース受容体と効率的に結合することができる。
２）本発明によって提供される前記標的化要素、標的担体の調製は、コストが低く、合成しやすく、汎用性があり、さまざまな標的ナノ製剤を合成でき、精製および特性評価を容易にすることができる。
３）本発明によって提供される前記スペーサー材料は、前記標的物質と前記ナノ製剤基礎材料との間に一定の距離を作り出すことができ、それによって前記標的物質を標的ナノ製剤の表面に露出させ、さらに高効率のマンノース受容体標的能力を有する。
４）調製された標的ナノ製剤は、良好な外形を表し、小さくて球形に近い、良好な血清安定性、低い細胞毒性を示し、薬物（化学的および生物学的薬物）の標的薬物送達システムに適用でき、 トランスフェクション効率は市販のＬｉｐｏ３Ｋよりも大幅に高く、トランスフェクション試薬として化学研究および商業活動に使用することができる。
マンノース−ＰＥＧ１００−Ｃｈｏｌ核磁気検証結果 処方１リポソームの粒径図 処方１リポソームのポテンシャル図 処方１リポソームのＴＥＭ図 リポソームのトランスフェクション結果 蛍光顕微鏡で観察されたＤＣ細胞におけるＧＦＰの発現状況 トランスフェクション効率についての分析ヒストグラム マンノース−ＰＥＧ１０００−Ｃｈｏｌの安定性分析 ４℃で保管する場合のマンノース−ＰＥＧ１０００−Ｃｈｏｌのトランスフェクション効率 血清における−ＰＥＧ１０００−Ｃｈｏｌの安定性分析 フローサイトメトリーを使用したＤＣ細胞に対するマンノース−ＰＥＧ１０００−ＣｈｏｌとＬｉｐｏ ３Ｋの毒性の検査 フローサイトメトリーを使用したＤＣ細胞に対するマンノース−ＰＥＧ１０００−ＣｈｏｌとＬｉｐｏ ３Ｋの毒性の検査データ統計分析ヒストグラム ＤＣ２．４細胞が取り込む標的ナノ粒子の研究 蛍光顕微鏡で観察されたＢＭＤＣｓ細胞におけるｍＲＮＡ標的リポソーム複合体の取り込み状況 蛍光顕微鏡で観察されたＢＭＤＣｓ細胞におけるｍＲＮＡ標的リポソーム複合体の取り込み状況のデータ分析 マンノースポリエチレングリコール４００コレステロールで調製されたリポソームにｍＲＮＡをロードして調製されたワクチンのｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍効果に関する研究 マンノースポリエチレングリコール４００コレステロールで調製されたリポソームにｍＲＮＡをロードして調製されたワクチンのｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍研究のマウス体重監視 マンノースポリエチレングリコール４００コレステロールで調製されたリポソームにｍＲＮＡをロードして調製されたワクチンのｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍研究のマウスの２８日目の腫瘍体積 ｍ／ＭＰ４００−ＬＰＸの各グループにおけるｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍効果 ｍ／ＭＰ４００−ＬＰＸ免疫後のマウスの生存期間 ｍＲＮＡを運ぶ異なるリガンド鎖長の標的リポソーム複合体に対するＤＣ２．４細胞の取り込み状況。 ｍＲＮＡを運ぶ異なるリガンド鎖長の標的リポソーム複合体に対するＤＣ２．４細胞の取り込み状況のデータ分析 異なるリガンド鎖長の標的リポソーム複合体に対するＤＣ２．４細胞のトランスフェクション効果 異なるリガンド鎖長の標的リポソーム複合体に対するＤＣ２．４細胞のトランスフェクション効果のデータ分析 異なるリガンド鎖長の標的リポソーム複合体に対するＢＭＤＣｓ細胞のトランスフェクション効果 異なるリガンド鎖長の標的リポソーム複合体に対するＢＭＤＣｓ細胞のトランスフェクション効果のデータ分析 異なるリガンド鎖長の標的リポソーム複合体のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍効果 異なるリガンド鎖長の標的リポソーム複合体のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍研究のマウス体重監視 異なるリガンド鎖長の標的リポソーム複合体のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍研究のマウスの２８日目の腫瘍体積 異なるリガンド鎖長の標的リポソーム複合体のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍効果のデータ分析 異なるリガンド鎖長の標的リポソーム複合体の免疫後のマウスの生存期間。
すべての実施例は、本発明をよりよく説明するためのものであるが、本発明の内容は、この実施例に限定されない。 したがって、当業者は前述の発明の内容に基づいて実施形態に対して実施する本質的ではない改善と調整は、依然として本発明の保護範囲に属する。
実施形態１
既存のナノ製剤の欠点に対し、マンノースおよびその誘導体によって修飾された標的化性を有するナノ製剤を設計する。
この実施形態において、ナノ製剤は標的リガンドマンノースおよびその誘導体、ナノ製剤と主薬で構成される。
この実施形態において、標的リガンドはマンノースである。
他の実施形態において、標的リガンドはマンノース誘導体か、上記マンノシド、マンノサミン、マンナンなどの１種または数種である。具体的には、マンノース誘導体はメチル−Ｄ−マンノシド、１−αホルミルメチル−マンノピラノシド、４−アミノフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−マンノピラノシド、マンノース−６−ホスフェート、カルバモイル−Ｄ−マンノース、マンノサミン、マンナンなどの１種または数種である。
この実施形態において、ナノ製剤はリポソーム、ＨＤＬナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、ポリマーミセルである。
他の実施形態において、ナノ製剤はエマルジョン、ナノゲル、コアシェルナノ粒子などの１種または数種である。
この実施形態において、ナノ製剤にカプセル化された主薬は小分子薬、タンパク質ペプチド類薬物または遺伝子薬物などの１種または数種である。
この実施形態において、１個のマンノースおよびその誘導体および／または２−１０個のマンノースおよびその誘導体によってナノ製剤を修飾する。
この実施形態において、ナノ製剤を調製する前に、標的リガンドマンノースとその誘導体はナノ製剤の調製用担体材料と結合する。
他の実施形態において、標的リガンドマンノースとその誘導体は、ナノ製剤を調製した後にマンノースおよびその誘導体をナノ製剤の表面に吸着または結合することができる。
この実施形態において、マンノースおよびその誘導体は、スペーサーＰＥＧを介してナノ製剤またはナノ製剤の調製用担体材料に結合する。
他の実施形態において、マンノースおよびその誘導体は、直接または他のスペーサーを介してナノ製剤またはナノ製剤の調製用担体材料に結合する。前記スペーサーは、前記グルタルアルデヒド、エチレンジアミン、マロン酸、短鎖アルキル鎖（−ＣＨ２−ＣＨ２−など）、ＰＥＧ、アミノ酸、ジペプチド、オリゴペプチド、ペプチドなどの１種または数種であってもよい。具体的には、スペーサーアミノ酸はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、セリン、スレオニン、チロシン、ジペプチド、オリゴペプチドであり、ペプチド両端のアミノ酸はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、セリン、スレオニン、チロシンから選択されたアミノ酸によって構成され、中間アミノ酸は任意の２０種のアミノ酸（ＲＧＤなど）から選択される。
この実施形態において、ＰＥＧは修飾されていない両端ともヒドロキシ基である一般的なＰＥＧか、少なくとも一端はアミノ化されたＰＥＧであってもよい、ＰＥＧの一端はＤＳＰＥ、コレステロール、パルミチン酸に接続する。
他の実施形態において、ＰＥＧの一端はその他の活性のある前述のアミノ基またはヒドロキシ基を有し、薬学的に許容できるリポソーム、ＨＤＬナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、ポリマーミセルなどの調製用担体物質に接続することができる。具体的には、前記担体物質はポリ乳酸−ヒドロキシル基酢酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、キトサン、ゼラチン、ポロキサマー、ステアリルアルコール卵黄レシチン、大豆レシチン、セファリン、スフィンゴミエリン、ＰＣ（ホスファチジルコリン）、ＥＰＧ（レシチンアシルグリセロール）、ＳＰＧ（大豆ホスファチジルグリセロール）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン アルカリ（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジリノレイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（塩化物塩）（ＤＯＴＡＰ）、ステアリン酸、コレステロール、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、トリステアリン酸グリセリル、トリステアリン酸グリセリル、ラウリン酸グリセリル、ステアリン酸パルミチルグリセリル、ベヘン酸 モノグリセリド、ベヘン酸ジグリセリド、ベヘン酸トリグリセリド、グリセリルトリミリステート、グリセリルクエン酸塩、ステアリルアルコール、ミリスチン酸、トリメチル酸、ラウリン酸などの１種または数種から選択される。
この実施形態において、調製されたナノ製剤は、静脈内注射または皮下注射によって体内に送達される。
他の実施形態において、調製されたナノ製剤はまた、腹腔内注射または筋肉内注射によって体内に送達することができる。
実施例に含まれるｍＲＮＡは、分子クローニング実験ガイド（第３版、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら）に記載されている条件などの従来の条件に従って購入するか、製造元が推奨する条件に従って実施して得られる。
以下は、具体的な実施例である。
実施例１ 担体材料の合成
マンノース−ＰＥＧｎ−Ｃｈｏｌ：マンノース−ＰＥＧ１００−Ｃｈｏｌ合成を例にとると、この合成経路に従って、長さの異なる他のＰＥＧも合成できる。ジエチレングリコール、ｐ−トルエンスルホニルクロリドとトリエチルアミンを取り、ＤＣＭに溶解し、室温で２４ｈ反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して生成物ＴｏｓＯＣ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４ＯＨ（化合物１）を得る。化合物１ペンタアセチル化マンノース和三フッ化ホウ素エーテル（ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ）を取り、ＤＣＭに溶解し、室温で２４ｈ反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して生成物Ａｃｏ−Ｍａｎｎｏｓｅ−ＯＣ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４ＯＴｏｓ （化合物２）を得る。化合物２とアジ化ナトリウムを取り、ＤＭＦに溶解し、６０℃で２４ｈ反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して固体生成物Ａｃｏ−Ｍａｎｎｏｓｅ−ＯＣ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４Ｎ３（化合物３）を得る。化合物３をメトキシドナトリウムのメタノール溶液に溶解させ、室温で３ｈ反応させ、濃縮して生成物Ｍａｎｎｏｓｅ−ＯＣ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４Ｎ３（化合物４）を得る。コレステロール、ブロモプロピンおよび水素ナトリウムを取ってエーテルとＤＭＦの混合溶液に溶解し、室温で２４ｈ反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して固体生成物Ｃｈｏｌ−ＣＨ２ＣＣＨ（化合物５）を得る。化合物４、化合物５およびヨウ化第一銅を取ってＤＭＦに溶解し、室温で２４ｈ反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して固体生成物Ｍａｎｎｏｓｅ−Ｃｈｏｌ（化合物６）を得る、合成経路は反応式Ｉに示す（マンノース−ＰＥＧ１０００−Ｃｈｏｌの合成経路は反応式IIに示す）。添付図１の各特徴的水素プロトンの化学シフトδ（ｐｐｍ）を分析する：５．３０−５．４２ ｐｐｍ（１個）それぞれコレステロール中＝ＣＨ−水素のシフト、７．９２ｐｐｍ（１個）はＮ−ＣＨ＝Ｃ中の水素のシフトである、これらの特徴的なピークの存在は、化合物４が化合物５のプラグメントに接続されていることを示し、１Ｈ−ＮＭＲ核磁気結果によると、マンノース−ＰＥＧ１００−Ｃｈｏｌが正常に結合されていることがわかる。
マンノース−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２００−ＮＨ２は直接購入できる、５ｍｇマンノースを秤量し、５ｍｌのエタノールを加えて溶解させる。５ｍｇ ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２を秤量し、５ｍｌのクロロホルム−エタノールの混合溶媒（９：１，Ｖ／Ｖ）に溶解させ、窒素保護条件下で、０．５ｍｌマンノースのエタノール溶液を滴下し、十分に撹拌した後、１００μｌのトリエチルアミンを加え、４０℃下で１２ｈ撹拌して反応させる。反応が完了した後、有機溶媒を減圧下で回転蒸発により除去し、脱イオン水を加えて再溶解し、透析して未反応のマンノースを除去し、凍結乾燥して生成物のマンノース−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥを得る。
マンノース−ＰＥＧ２０００−パルミチン酸の合成：ＦｍｏｃＮＨ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨを水に溶解し、ＥＤＣ・ＨＣｌ和ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳを加え、室温で１０分間撹拌し、２−アミノエチル−α−Ｄ−ピランマンノシドを水に溶解した後、上記の反応系に加え、室温で４８時間反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して生成物（化合物１）を得る。化合物１をＤＣＭに溶解し、１−オクタンジオールを加え、数時間反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して生成物（化合物２）を得る。化合物２とパルミチン酸をエーテルとＤＭＦの混合溶剤に加え、室温で数時間反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して固体生成物のマンノース−ＰＥＧ２０００−パルミチン酸を得る、その構造式は以下のとおりである。
Figure 2021525277
Figure 2021525277
Figure 2021525277
実施例２ リポソームの調製
処方の組成
Figure 2021525277
 注：処方１〜処方５の主薬はＧＦＰ−ｍＲＮＡである。
調製方法１：上記の処方に従って異なる配合比のリン脂質（主薬がＰＴＸの場合、リン脂質と一緒に添加）を秤量し、丸底フラスコに入れ、クロロホルム／エタノール＝１：１（ｖ／ｖ）を加えて溶解した後、減圧下で回転蒸発させて有機溶媒を除去し、フラスコの内壁に薄膜が形成し、ＰＢＳ７．４緩衝溶液を加えて薄膜を水和し、１００Ｗ超音波で３ｍｉｎ処理し、リポソームを得る。得られたリポソームの特性評価を行い、その結果は図２−４に示す。
調製方法２（処方８）：上記の処方に従って異なる配合比のリン脂質を秤量し、クロロホルム／エーテルを加えて溶解させ、さらにフルブミンの水溶液を加え、超音波で処理して乳濁液を得る、回転蒸発させて有機溶媒を除去し、そしてＰＢＳ７．４緩衝液を加えてリポソームを水和させる。
実施例３ 固体脂質ナノ粒子の調製
固体脂質ナノ粒子は、脂質を骨格材料として調製されたナノ構造の担体であり、生理学的適合性、細胞親和性、および標的化性の特徴を有する。この実施例において、マンノースによって修飾された脂質を加えることにより、固体脂質ナノ粒子の標的化性を改善する。
処方の組成
Figure 2021525277
 調製方法：処方量の薬物、脂質材料を正確に秤量してエタノールに溶解し、恒温水浴で油相になるよう撹拌する。処方量の表面活性剤を精製水に溶解させ、恒温水浴で加熱して水相に形成する。撹拌条件下で、油相を水相に注入し、恒温で撹拌して乳化濃縮し、乳化液が一定の体積に濃縮した後、それを恒温４℃の冷水に注ぎ、攪拌して固化させ、０．４５μｍのろ過膜を通過させて得られる。
実施例４ ＨＤＬナノ粒子の調製
ＨＤＬは、組成、密度、粒子径が不均一なリポタンパク質の１種である。 ＨＤＬで最も豊富なアポリポタンパク質はＡｐｏＡ−Ｉであり、その疎水性の内部コアは体内でコレステロールを輸送する。組換え高密度リポタンパク質は、内因的に単離された、またはインビトロで合成されたＡｐｏＡ−Ｉをリン脂質、コレステロールなどと体外で再結合することによって形成され、生化学的特性および機能において内因性ＨＤＬに類似している。高密度リポタンパク質には、高い安全性、高効率の運搬能力（コアの埋め込み、親油性薬物の埋め込み、および組換え高密度リポタンパク質コアの３つの方法で運搬できる。表面嵌入、 リン脂質単層への親油性薬物の挿入、タンパク質結合および）、標的化性などの優れた特性を持つ。この実施例において、調製されたＨＤＬ Ｎａｉｎｅ粒子にマンノースリガンドを添加して、ナノ粒子の標的化特性をさらに改善する。
処方の組成
Figure 2021525277
 調製方法：リポソームの調製方法と同様であり、リポソームの調製に適したすべての方法は、ＨＤＬナノ粒子の調製に使用される。
調製方法１：上記の処方に従って異なる配合比のリン脂質を秤量し（脂溶性主薬ＤＯＸを同時に添加）、丸底フラスコに注入し、クロロホルムを添加して溶解し、減圧下で回転蒸発により有機溶媒を除去し、フラスコの内壁に薄膜を形成する、 ＰＢＳ７．４緩衝液を添加して薄膜を水和し、１００Ｗで３ｍｉｎ超音波処理してリポソームを得る。処方量のＡｐｏＡ−Ｉを秤量し、ゆっくりとリポソーム懸濁液に加え、４℃で２４ｈ培養した後、透析して得る。
調製方法２：上記の処方に従って異なる配合比でリン脂質を秤量し、丸底フラスコに加え、クロロホルムを加えて溶解し、減圧下で回転蒸発により有機溶媒を除去し、フラスコの内壁に薄膜を形成し、ＰＬＧＡ ／ ＰＴＸナノ粒子混合懸濁液を加え、１００Ｗで３分間超音波処理してリポソームを得る。処方量のＡｐｏＡ−Ｉを秤量し、ゆっくりとリポソーム懸濁液に加え、４℃で２４ｈ培養した後、透析して得る。
実施例５ ポリマーミセルの調製
処方の組成
Figure 2021525277
 調製方法：担体材料と主薬を取ってクロロホルムに溶解し（エタノール、エタノールとクロロホルムの混合溶媒など、溶解状況に応じて他の溶媒を選択できる）、減圧下で回転蒸発により有機溶媒を除去し、フラスコの内壁に薄膜を形成し、ＰＢＳ７．４緩衝液を加えて膜を水和させて得られる。
実施例６ 標的ナノ粒子の取り込み試験
トランスフェクションの１２時間前に、平皿中のＲａｗ２６４．７細胞を吹き分け、培養液を再懸濁し、カウントし、１ｍＬの細胞懸濁液を１０×１０４個／ｍＬの密度で２４ウェルプレートの各ウェルに挿入し、培養箱の中で約１２時間培養しておく。培地を廃棄し、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）を各ウェルに加え、３７℃で約１２時間培養して、マクロファージを刺激する。培地を廃棄し、最終濃度２５ｎｇ／ｍＬのさまざまな製剤（処方１と処方３）を各ウェルに加え、３７℃の暗所で約２時間培養し、マクロファージによるさまざまな製剤の取り込みを観察する。培養時間になると、培地を廃棄し、冷たいＰＢＳで２回洗浄する。ＰＢＳで２４ウェルプレート中の細胞を収集し、ＰＢＳで細胞（１２００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）を１回洗浄し、最後にフローサイトメーターに入れて結果を分析する。結果を図５に示す。左から順に、Ｃｏｎｔｒｏｌ、処方３、処方１である。これにより、標的リガンドマンノース−ＰＥＧ１０００−Ｃｈｏｌを添加した後、細胞のトランスフェクション効率を大幅に向上させることができるとわかる。
実施例７ 材料
Figure 2021525277
 この実施例の脂質材料は、コレステロール、卵黄レシチン、大豆レシチン、セファリン、スフィンゴミエリン、ＰＣ（ホスファチジルコリン）、ＥＰＧ（レシチンアシルグリセロール）、ＳＰＧ（大豆ホスファチジルグリセロール）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン アルカリ（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジリノレイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（塩化物塩）（ＤＯＴＡＰ）の１種または数種である。
この実施例において、前記スペーサー材料のアミノ酸はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、セリン、スレオニン、チロシンの１種または数種である。ペプチドはジペプチド、オリゴペプチド、ペプチドであり、ペプチドの両端のアミノ酸はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、セリン、スレオニン、チロシンから選択されたアミノ酸で構成される。中間アミノ酸は任意の２０種のアミノ酸（ＲＧＤなど）から選択される。
実施例８ 標的担体の調製
実施例７に記載のナノ製剤基礎材料をナノ薬物送達担体に調製し、次に実施例７に記載の標的物質を調製された前記ナノ薬物送達担体の表面に付着させて標的担体を得る。
実施例９ 標的化要素の調製
実施例７の標的物質とスペーサー材料を合成し、ここではマンノースとＰＥＧｎとの合成を例に取る。
ジエチレングリコール、ｐ−トルエンスルホニルクロリドとトリエチルアミンを取ってＤＣＭに溶解し、室温で２４ｈ反応させ、カラムクロマトグラフィーによって分離して生成物ＴｏｓＯＣ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４ＯＨ（化合物１）を得る。化合物１ペンタアセチル化マンノースおよびその誘導体と三フッ化ホウ素エーテル（ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ）ＤＣＭに溶解し、室温で２４ｈ反応させ、カラムクロマトグラフィーによって分離して生成物Ａｃｏ−Ｍ−ＯＣ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４ＯＴｏｓ （化合物２）を得る。Ｍはマンノースおよびその誘導体である。
実施例１０ 標的担体の調製
実施例９の標的化要素とナノ製剤基礎材料をさらに合成し、ここで、マンノース、ＰＥＧｎとコレステロールの合成を例に取る。
実施例２によって得られた化合物とアジ化ナトリウムをＤＭＦに溶解し、６０℃で２４ｈ反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して固体生成物Ａｃｏ−Ｍ−ＯＣ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４Ｎ３（化合物３）を得る。化合物３をメトキシドナトリウムのメタノール溶液に溶解し、室温で３ｈ反応させ、濃縮して生成物Ｍ−ＯＣ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４Ｎ３（化合物４）を得る。コレステロール、ブロモプロピンと水素ナトリウムをエーテルとＤＭＦ混合液に溶解し、室温で２４ｈ反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって固体生成物Ｃｈｏｌ−ＣＨ２ＣＣＨ（化合物５）を得る。化合物４、化合物５とヨウ化第一銅をＤＭＦに溶解し、室温で２４ｈ反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して固体生成物Ｍ−ＰＥＧｎ−Ｃｈｏｌ（化合物６）を得る。
実施例１１ 標的担体の標的化性を改善
実施例８の標的担体を改善する方法：Ａ．実施例７の標的物質とスペーサー材料を標的化要素に合成する、Ｂ．実施例７のナノ製剤基礎材料をナノ製剤に調製し、次にステップＡで得られた標的化要素を実施例８のナノ薬物送達担体に接続する。
実施例１２ 標的担体の合成
マンノース−ＰＥＧｎ−Ｃｈｏｌ：マンノース−ＰＥＧ１００−Ｃｈｏｌの合成を例に取る、異なる長さの他のＰＥＧも、この合成経路に従って合成される。ジエチレングリコール、ｐ−トルエンスルホニルクロリドおよびトリエチルアミンを取り、ＤＣＭに溶解し、室温で２４ｈ反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して生成物ＴｏｓＯＣ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４ＯＨ（式Ｉ）を得る。式Ｉの化合物ペンタアセチル化マンノースと三フッ化ホウ素エーテル（ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ）を取り、ＤＣＭに溶解し、室温で２４ｈ反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して生成物Ａｃｏ−Ｍａｎｎｏｓｅ−ＯＣ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４ＯＴｏｓ （式II）を得る。式IIの化合物とアジ化ナトリウムを取り、ＤＭＦに溶解し、６０℃で２４ｈ反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して固体生成物Ａｃｏ−Ｍａｎｎｏｓｅ−ＯＣ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４Ｎ３（式III）を得る。式IIIの化合物をメトキシドナトリウムのメタノール溶液に溶解し、室温で３ｈ反応させ、濃縮して生成物Ｍａｎｎｏｓｅ−ＯＣ２Ｈ４ＯＣ２Ｈ４Ｎ３（式IV）を得る。コレステロール、ブロモプロピンおよび水素ナトリウムをエーテルとＤＭＦの混合溶液に溶解し、室温で２４ｈ反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して固体生成物Ｃｈｏｌ−ＣＨ２ＣＣＨ（式V）を得る。式IVの化合物、式Vの化合物とヨウ化第一銅をＤＭＦに溶解し，室温で２４ｈ反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して固体生成物Ｍａｎｎｏｓｅ−Ｃｈｏｌ（式VI）を得る。図１の各特徴的な水素プロトンの化学シフトδ（ｐｐｍ）を分析しする：５．３０−５．４２ｐｐｍ（１個）はそれぞれコレステロール中＝ＣＨ−水素のシフトである、７．９２ｐｐｍ（１個）はＮ−ＣＨ＝Ｃ中の水素のシフトであり、これらの特徴的なピークの存在は、化合物式ＩＶが化合物式Ｖのフラグメントに接続されていることを示し、１Ｈ−ＮＭＲ核磁気の結果によると、図１に示すように、マンノース−ＰＥＧ１００−Ｃｈｏｌが正常に結合されていることがわかりる。合成経路は次のとおりである。
Figure 2021525277
 マンノース−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２００−ＮＨ２は直接購入できる、５ｍｇマンノースを秤量し、５ｍｌのエタノールを加えて溶解させる。５ｍｇ ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２を秤量し、５ｍｌのクロロホルム−エタノールの混合溶媒（９：１，Ｖ／Ｖ）に溶解させ、窒素保護条件下で、０．５ｍｌマンノースのエタノール溶液を滴下し、十分に撹拌した後、１００μｌのトリエチルアミンを加え、４０℃下で１２ｈ撹拌して反応させる。反応が完了した後、有機溶媒を減圧下で回転蒸発により除去し、脱イオン水を加えて再溶解し、透析して未反応のマンノースを除去し、凍結乾燥して生成物のマンノース−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥを得る。
マンノース−ＰＥＧ２０００−パルミチン酸の合成：ＦｍｏｃＮＨ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨを水に溶解し、ＥＤＣ・ＨＣｌとｓｕｌｆｏ−ＮＨＳを加え、室温で１０分間撹拌し、２−アミノエチル−α−Ｄ−ピランマンノシドを水に溶解した後、上記の反応系に加え、室温で４８時間反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して生成物（化合物１）を得る。化合物１をＤＣＭに溶解し、１−オクタンジオールを加え、数時間反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して生成物（化合物２）を得る。化合物２とパルミチン酸をエーテルとＤＭＦの混合溶剤に加え、室温で数時間反応させ、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離して固体生成物のマンノース−ＰＥＧ２０００−パルミチン酸を得る、その構造式は以下のとおりである。
Figure 2021525277
実施例１３ 標的薬物の調製
薬物を実施例８で調製された標的担体にカプセル化される。
本実施例において、薬物は小分子薬物および／またはタンパク質ペプチド類薬物および／または遺伝子薬物である。
前記小分子薬は、抗腫瘍薬タキサン類（パクリタキセル、ドセタキセル、セファロマンニン、７−エピタキセル）、カンプトテシン類（カンプトテシン、ＳＮ３８、イリノテカン、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン等）、ビンブラスチン類（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンフルニン等）、ドキソルビシン、ファルモルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アンホテリシン、メタミン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ミトキサントロンまたはその誘導体、ゲフィチニブ、ノスカピン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、カルムスチン、ケルセチン等。
前記主薬成分タンパク質ペプチド類薬物はインターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６など）、さまざまな成長因子（線維芽細胞成長因子、肝臓成長因子、血管内皮成長因子、造血成長因子など）、インターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα、ＴＮＦβなど）、インテグリン、モノクローナル抗体、酵素、インスリンなどである。
前記主薬成分の遺伝子薬物はＤＮＡ、プラスミド、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡなどである。標的ナノ製剤を免疫治療に使用するとき、前記主薬成分は免疫療法に使用されることに加えて、免疫効果を高めるために、免疫アジュバントをカプセル化することができる。
実施例１４ 標的薬物の調製
Figure 2021525277
 注：処方１〜処方５の主薬はＧＦＰ−ｍＲＮＡである（ｔｒｉｌｉｎｋ会社から購入され、Ｌｏｔ番号ＷＯＴＬ６６４７）
調製方法：１：上記の処方に従って異なる重量比のリン脂質を秤量し（主薬がＰＴＸの場合、リン脂質と一緒に添加する）、丸底フラスコに入れ、クロロホルム／エタノール＝１：１（ｖ／ｖ）を添加して溶解し、減圧下で回転蒸発により有機溶媒を除去し、フラスコの内壁に薄膜を形成し、ＰＢＳ７．４緩衝液を加えて薄膜を水和させ、１００Ｗ超音波で３ｍｉｎ処理し、リポソームを得る。ｐＧＦＰをカプセル化する場合、ブランクリポソームとｐＧＦＰを室温で培養して得られる。マンノース−ＰＥＧ１０００−Ｃｈｏｌから得られたナノ粒子は、ＭＰ１０００−ＬＰＸとして記録できる。得られたリポソームの特性を評価し、リポソームの粒子径が１３２．９３±４．９３ｎｍ、ｚｅｔａ電位が３７．９３±２．９５ｍＶであることを示す。また、リポソームが明らかな脂質膜構造を有し、形状が球形に近いことが観察された（図２−４）。
調製方法２（処方８）：上記の処方に従って異なる配合比でリン脂質を秤量し、クロロホルム／エーテルを加えて溶解し、次にアルブミンの水溶液を加え、超音波で処理してエマルジョンを取得し、回転蒸発して有機溶媒を除去し、次にＰＢＳ７．４緩衝液を加えてリポソームを再水和する。
実施例１５ 標的薬物の調製
固体脂質ナノ粒子は、脂質を骨格材料として調製されたナノ構造の担体であり、生理学的適合性、細胞親和性、および標的化性の特徴を有する。この実施例において、マンノースによって修飾された脂質を加えると、固体脂質ナノ粒子の標的化性を改善する。
Figure 2021525277
 調製方法：処方量の薬物、脂質材料を正確に秤量してエタノールに溶解し、恒温水浴で油相になるよう撹拌する。処方量の表面活性剤を精製水に溶解させ、恒温水浴で加熱して水相に形成する。撹拌条件下で、油相を水相に注入し、恒温で撹拌して乳化濃縮し、乳化液が一定の体積に濃縮した後、それを恒温４℃の冷水に注ぎ、攪拌して固化させ、０．４５μｍのろ過膜を通過させて得られる。
実施例１６ 標的薬物の調製
ＨＤＬは、組成、密度、粒子径が不均一なリポタンパク質の１種である。ＨＤＬで最も豊富なアポリポタンパク質はＡｐｏＡ−Ｉであり、その疎水性の内部コアは体内でコレステロールを輸送する。組換え高密度リポタンパク質は、内因的に単離された、またはインビトロで合成されたＡｐｏＡ−Ｉをリン脂質、コレステロールなどと体外で再結合することによって形成され、生化学的特性および機能において内因性ＨＤＬに類似している。高密度リポタンパク質には、高い安全性、高効率の運搬能力（コアの埋め込み、親油性薬物の埋め込み、および組換え高密度リポタンパク質コアの３つの方法で運搬できる。表面嵌入、リン脂質単層への親油性薬物の挿入、タンパク質結合および）、標的化性などの優れた特性を持つ。この実施例において、調製されたＨＤＬナノ粒子にマンノースリガンドを添加して、ナノ粒子の標的化特性をさらに改善する。
Figure 2021525277
 調製方法：リポソームの調製方法と同様である、リポソームの調製に適したすべての方法をＨＤＬナノ粒子の調製に使用することができる。
調製方法１：上記の処方に従って異なる配合比のリン脂質を秤量し（脂溶性主薬ＤＯＸを同時に添加）、丸底フラスコに注入し、クロロホルムを添加して溶解し、減圧下で回転蒸発により有機溶媒を除去し、フラスコの内壁に薄膜を形成する、ＰＢＳ７．４緩衝液を添加して薄膜を水和し、１００Ｗで３ｍｉｎ超音波処理してリポソームを得る。処方量のＡｐｏＡ−Ｉを秤量し、ゆっくりとリポソーム懸濁液に加え、４℃で２４ｈ培養した後、透析して得る。
調製方法２：上記の処方に従って異なる配合比でリン脂質を秤量し、丸底フラスコに加え、クロロホルムを加えて溶解し、減圧下で回転蒸発により有機溶媒を除去し、フラスコの内壁に薄膜を形成し、ＰＬＧＡ／ＰＴＸナノ粒子混合懸濁液を加え、１００Ｗで３分間超音波処理してリポソームを得る。処方量のＡｐｏＡ−Ｉを秤量し、ゆっくりとリポソーム懸濁液に加え、４℃で２４ｈ培養した後、透析して得る。
実施例１７ 標的薬物の調製
Figure 2021525277
 調製方法：担体材料と主薬をクロロホルムに溶解し（エタノール、エタノールとクロロホルムの混合溶媒など、溶解に応じて他の溶媒を選択できる）、減圧下で回転蒸発により有機溶媒を除去し、フラスコ内壁に薄膜を形成する。ＰＢＳ７．４緩衝液を加えて薄膜を水和して得られる。
実施例１８ 標的ナノ粒子の取り込み試験
トランスフェクションの１２時間前に、平皿中のＲａｗ２６４．７細胞を吹き分け、培養液を再懸濁し、カウントし、１ｍＬの細胞懸濁液を１０×１０４個／ｍＬの密度で２４ウェルプレートの各ウェルに挿入し、培養箱の中で約１２時間培養しておく。培地を廃棄し、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）を各ウェルに加え、３７℃で約１２時間培養して、マクロファージを刺激する。培地を廃棄し、最終濃度２５ｎｇ／ｍＬのさまざまな製剤（処方１と処方３）を各ウェルに加え、３７℃の暗所で約２時間培養し、マクロファージによるさまざまな製剤の取り込みを観察する。培養時間になると、培地を廃棄し、冷たいＰＢＳで２回洗浄する。ＰＢＳで２４ウェルプレート中の細胞を収集し、ＰＢＳで細胞（１２００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）を１回洗浄し、最後にフローサイトメーターに入れて結果を分析する。結果を図５に示す。左から順に、Ｃｏｎｔｒｏｌ、処方３、処方１である。これにより、標的リガンドマンノース−ＰＥＧ１０００−Ｃｈｏｌを添加した後、細胞のトランスフェクション効率を大幅に向上させることができるとわかる。
実施例１９ ナノ標的製剤のトランスフェクション効率
ＤＣ２．４細胞と調製されたナノ標的製剤を２４ウェルプレートで共培養し、ナノ標的製剤のＮ／Ｐ比を５にする。フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰ陽性ＤＣ２．４細胞のトランスフェクション効率と平均蛍光強度（ＭＦＩ）を検出する。つまり、ＤＣ２．４細胞は、前方散乱（ＦＳＣ）と側方散乱（ＳＳＣ）によってキャプチャされる。生き残ったＤＣ２．４細胞は領域１（Ｒ１）に示され、ＧＦＰ陽性細胞は領域２（Ｒ２）に示される。トランスフェクション効率はＲ２に自動的に表示される。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、ＧＦＰ陽性細胞でＧＦＰを発現するＭＦＩを取得する。ＭＦＩを計算するには、未処理のＤＣ２．４細胞のバックグラウンド値を差し引く必要がある。主薬ｍＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏトランスフェクション動態をさらに理解するために、ＤＣ２．４細胞でのマンノース−ＰＥＧ１０００−Ｃｈｏｌのトランスフェクション効率も１２−７２ｈで確認された。
図６−７に示すように、マンノース−ＰＥＧ１０００−Ｃｈｏｌグループは最もＧＦＰ陽性細胞を誘導し、その割合は５２％も高く、他のどのグループよりも有意に高かった。マンノース−ＰＥＧ１０００−Ｃｈｏｌのトランスフェクション効率は５２．０９±４．８５％と計算され、市販のトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏ ３Ｋ（１１．４７±２．３１％）をはるかに上回っている。
実施例２０ 安定性試験
マンノース−ＰＥＧ１０００−Ｃｈｏｌによって修飾された標的製剤の安定性を研究し、その安定性を粒子径、ｚｅｔａ電位、およびトランスフェクション効率によって決定される。その結果、マンノース−ＰＥＧ１０００−Ｃｈｏｌによって修飾されたナノ製剤を４℃で保存した場合、マンノース−ＰＥＧ１０００−Ｃｈｏｌによって修飾されたナノ製剤の粒子径はわずかに減少したが、ｚｅｔａ電位は低下しなかった（図８）、４℃で３日間保存した場合、トランスフェクション効率は約５０％である（図９）、具体的には、下表をご参照ください。また、血清中では、マンノース−ＰＥＧ１０００−Ｃｈｏｌで培養したｍＲＮＡは解離していなかった（図１０）。同様に、マンノース−ＰＥＧ１００−Ｃｈｏｌおよびマンノース−ＰＥＧ２０００−Ｃｈｏｌによって修飾されたナノ標的製剤も良好な安定性を示している。
マンノース−ＰＥＧ１０００−Ｃｈｏｌによって修飾されたナノ標的製剤のトランスフェクション安定性試験結果
Figure 2021525277
実施例２１ 細胞毒性試験
指定された処方で２４時間培養した後、フローサイトメトリーを使用して細胞毒性分析を行った。その結果を図１１−１２に示す。対照群、マンノース−ＰＥＧ１０００−Ｃｈｏｌ群およびＬｉｐｏ ３Ｋ群の生細胞率は、それぞれ８６．７±３．６％、８６．７±１．７％および９０．１±１．２％でした。アポトーシスの初期および後期には大きな違いはなく、全体的は良好で、明らかな細胞毒性がないことが分かった。詳細については、次の表を参照してください。
Figure 2021525277
実施例２２ ＤＣ２．４の標的ナノ粒子の取り込み試験
トランスフェクションの１２時間前に、平皿中のＤＣ２．４細胞を吹き分け、培養液を再懸濁し、カウントし、１ｍＬの細胞懸濁液を１０×１０４個／ｍＬの密度で２４ウェルプレートの各ウェルに挿入し、培養箱の中で約１２時間培養しておく。培地を廃棄し、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）を各ウェルに加え、３７℃と４℃で約１２時間培養して、ＤＣ２．４細胞を刺激する。培地を廃棄し、最終濃度２５ｎｇ／ｍＬのさまざまな製剤（ＬＰＸとＭＰ１０００−ＬＰＸ ３）を各ウェルに加え、３７℃と４℃の暗所で約２時間培養し、異なる温度と製剤の場合のＤＣ２．４細胞の取り込み状況を観察する。培養時間になると、培地を廃棄し、冷たいＰＢＳで２回洗浄する。ＰＢＳで２４ウェルプレート中の細胞を収集し、ＰＢＳで細胞（１２００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）を１回洗浄し、最後にフローサイトメーターに入れて結果を分析する。
結果を図１３に示す。通常のｍＲＮＡリポソーム複合体かｍＲＮＡ標的リポソーム複合体かを問わず、取り込み温度を３７℃から４℃に下げると、取り込みが減少する、これは、ＤＣ２．４細胞によるｍＲＮＡリポソーム複合体の取り込みがエネルギー依存性があることを示す、つまり、温度が下がると取り込みが減少することを示唆している。３７℃でのデータを比較すると、ＤＣ２．４細胞はｍＲＮＡ標的リポソーム複合体をより多く取り込むことができ、マンノースを添加した場合と添加しない場合の取り込みデータを比較すると、マンノースを添加した後、細胞による通常のｍＲＮＡリポソーム複合体の取り込みが有意な変化がなく、マンノースを添加した後、細胞による標的リポソーム複合体の取り込みが有意に低下されている、これはＤＣ２．４細胞がマンノース受容体を介したため、ｍＲＮＡリポソーム複合体をより多く取り込んでいることを示す。その詳細を下表に示す。
Figure 2021525277
 [実施例２２]
実施例２２ ＢＭＤＣｓ細胞の標的ナノ粒子の取り込み研究
トランスフェクションの１２時間前に、平皿中のＢＭＤＣｓ細胞を吹き分け、培養液を再懸濁し、カウントし、１ｍＬの細胞懸濁液を１０×１０４個／ｍＬの密度で２４ウェルプレートの各ウェルに挿入し、培養箱の中で約１２時間培養しておく。培地を廃棄し、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）を各ウェルに加え、３７℃と４℃でそれぞれ約１２時間培養して、ＢＭＤＣｓを刺激する。培地を廃棄し、培地を廃棄し、３７℃で培養した細胞を対照群、サイトカラシンＤ群、フィリピン群、ワートマニン群とクロルプロマジン群に分け、各群に最終濃度２５ｎｇ／ｍＬのＭＰ１０００−ＬＰＸを加える。ＭＰ１０００−ＬＰＸを４℃で培養した細胞に添加し、上記の各群を３７℃および４℃で暗所で約２時間培養し、さまざまな温度およびさまざまな薬剤作用下でのＢＭＤＣ細胞の取り込み状況を確認する。培養時点に達した後、培地を廃棄し、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで細胞を２４ウェルプレートに収集し、次に細胞をＰＢＳで１回洗浄し（１２００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）、最後にフローサイトメーターに入れて結果を分析する。
図１４−１５に示すように、摂取温度が３７℃から４℃に低下すると、取り込みが減少し、これは、ＢＭＤＣｓによるｍＲＮＡリポソーム複合体の取り込みがエネルギー依存性があることを示す、つまり、温度が下がると取り込みが減少することを示唆している。このデータＤＣ２．４の結果と一致している。取り込みデータをエンドサイトーシス阻害剤が添加されているかどうかと比較すると、サイトカラシンＤとフィリピンを添加した後、細胞によるｍＲＮＡ標的リポソーム複合体の取り込みに有意な変化がないが、ワートマニンとクロルプロマジンを添加した後、標的リポソーム複合体の取り込みは大幅に減少し、ＢＭＤＣｓによるｍＲＮＡ標的リポソーム複合体の取り込みはエネルギー依存性があるだけでなく、ピノサイトーシス（ワートマニン）およびクラスリン（クロルプロマジン）を介したエンドサイトーシスの影響も受けることを示す。関連する結果の詳細を以下の表に示す。
Figure 2021525277
実施例２３ ＭＰ４００−ＬＰＸ ｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍結果
実施例７および実施例９の方法に従って、ＭＰ４００−ＬＰＸおよびメトキシポリエチレングリコール４００コレステロール（ｍＰ４００−ＬＰＸ）を合成し、これは、主成分Ｅ６／Ｅ７−ｍＲＮＡ、マンノース標的Ｅ６／Ｅ７−ｍＲＮＡを形成するリポソーム複合体を含む。０日目、３日目、１０日目、１７日目に、マウスに３０ｕｇの複合体を注射した。結果を図１６〜２０に示す。対照群および無関係のｍＲＮＡ群と比較して、マンノース標的のＥ６／Ｅ７−ｍＲＮＡリポソーム複合体治療群のマウスの腫瘍増殖データは大幅に減少した。メトキシポリエチレングリコール４００コレステロールの対照材料と比較して、ｍＲＮＡをロードしたマンノースポリエチレングリコール４００コレステロールで調製されたワクチンを使用したマウスの生存期間が延長され、１匹のマウスの腫瘍は完全に消失し、標的製剤によって調製されたワクチンは良好な免疫療法効果を示している。
実施例２４ ＤＣ２．４細胞によるＭＰ４００−ＬＰＸの取り込み
トランスフェクションの１２時間前に、平皿中のＤＣ２．４とＢＭＤＣｓ細胞を吹き分け、培養液を再懸濁し、カウントし、１ｍＬの細胞懸濁液を１０×１０４個／ｍＬの密度で２４ウェルプレートの各ウェルに挿入し、培養箱の中で約１２時間培養しておく。培地を廃棄し、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）を各ウェルに加え、３７℃で約１２時間培養して、ＤＣ２．４とＢＭＤＣｓ細胞を刺激する。培地を廃棄し、各ウェルを６つの群に分け、Ｃｙ５−Ｈ−ｍＲＮＡをロードしたさまざまな製剤（対照、ＬＰＸ、ＭＰ１００−ＬＰＸ、ＭＰ４００−ＬＰＸ、ＭＰ１０００−ＬＰＸおよびＭＰ２０００−ＬＰＸ）を最終濃度２５ｎｇ／ｍＬで中央のＤＣ２．４細胞に加える。３７℃で暗所で約２時間培養し、さまざまな製剤条件でのＤＣ２．４細胞の取り込み状況を確認する。同時に、ＧＦＰ−ｍＲＮＡをロードした異なる製剤（ＬＰＸ、ＭＰ１００−ＬＰＸ、ＭＰ４００−ＬＰＸ、ＭＰ１０００−ＬＰＸ、ＭＰ２０００−ＬＰＸおよびＬｉｐｏ ３Ｋ）を最終濃度２５ｎｇ／ｍＬでＤＣ２．４およびＢＭＤＣｓ細胞に添加し、暗所で３７℃で約２時間培養し、さまざまな製剤でのＤＣ２．４およびＢＭＤＣ細胞のトランスフェクション効果を確認する。培養時点に達した後、培地を廃棄し、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで細胞を２４ウェルプレートに収集し、次に細胞をＰＢＳで１回洗浄し（１２００ ｒｐｍ、５ ｍｉｎ）、最後にフローサイトメーターに入れて結果を分析する。
結果を図２１−２２に示す、ＤＣ２．４細胞は、ＭＰ４００−ＬＰＸを最もよく取り込んでいる。ｍＲＮＡを運ぶ異なるリガンド鎖長の標的リポソーム複合体に対するＤＣ２．４細胞の取り込み効率は約１００％であるが、ＤＣ２．４細胞による各製剤の取り込みは異なり、これは特に細胞内蛍光強度に反映される、 ＭＰ１００−ＬＰＸはＬＰＸと比較して細胞内蓄積を大幅に増加し、ＭＰ４００−ＬＰＸはＭＰ１００−ＬＰＸと比較して細胞内蓄積を大幅に増加し、ＭＰ１０００−ＬＰＸはＭＰ４００−ＬＰＸと比較して細胞内蓄積を大幅に減少した、細胞内のＭＰ１０００−ＬＰＸとＭＰ２０００−ＬＰＸの蓄積度は類似している。ＭＰ４００−ＬＰＸとＬＰＸ、ＭＰ１００−ＬＰＸ，ＭＰ１０００−ＬＰＸとＭＰ２０００−ＬＰＸなどの他の製剤と比較して、細胞内の蓄積は大幅に増加した。上記の結果により、ＤＣ２．４細胞によるｍＲＮＡを運ぶ異なるリガンド鎖長を有する標的リポソーム複合体の取り込みがリガンドの鎖長によって影響を受けることを示唆し、ＤＣ２．４細胞がより多く取り込むことを可能にする適切な鎖長または鎖長の範囲があることがわかる。
図２３−２６に示すように、ＤＣ２．４細胞はＭＰ４００−ＬＰＸのトランスフェクションに最適である。ＤＣ２．４細胞はｍＲＮＡを運ぶ異なるリガンド鎖長を有する標的リポソーム複合体のトランスフェクション効率は異なり、具体的にはＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージが異なる、ＭＰ４００−ＬＰＸはＬＰＸと、ＭＰ１００−ＬＰＸ、ＭＰ１０００−ＬＰＸはＭＰ２０００−ＬＰＸと比較して、ＧＦＰ陽性細胞が有意に増加し、ＭＰ２０００−ＬＰＸは、他の製剤と比較してＧＦＰ陽性細胞が有意に減少した。ＢＭＤＣのトランスフェクション結果は基本的にＤＣ２．４と似ているが、ＤＣ２．４とは異なり、ＢＭＤＣのトランスフェクション結果は基本的にＤＣ２．４と似ているが、ＤＣ２．４とは異なり、ＭＰ２０００−ＬＰＸのトランスフェクション効率は、他の製剤と同様に、Ｌｉｐｏ ３Ｋよりも大幅に高くなっている。ＢＭＤＣｓは初代細胞であり、このトランスフェクション結果は、標的製剤が良好な応用の見通しを持っていることを示す。
実施例２５ ｍＲＮＡを運ぶ異なるリガンド鎖長標的リポソーム複合体のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍実験
実施例７および実施例９の方法に従って、ＭＰ１００−ＬＰＸ、ＭＰ４００−ＬＰＸ、ＭＰ１０００−ＬＰＸおよびＭＰ２０００−ＬＰＸを合成し、主成分Ｅ６／Ｅ７−ｍＲＮＡ、マンノース標的を形成するＥ６／Ｅ７−ｍＲＮＡリポソーム複合体を含む。０日目、３日目、１０日目、および１７日目に、マウスに３０ｕｇの複合体を注射し、その結果を図２７〜３１に示し、ＭＰ４００−ＬＰＸが最も効果的である。他の鎖長の標的比と比較して、ポリエチレングリコール４００のマンノースコレステロール標的リガンドは、インビボで最高の抗腫瘍効果を示している。具体的には、マウスの腫瘍治癒率が最も高く、最大６０％に達している、また、未治癒のマウスの腫瘍の成長率が低く、担癌マウスの生存期間を延ばすことができる。
最後に、上記の実施形態は、本発明の技術的解決策を説明するためにのみ使用され、それらを限定するものではない。本発明は、好ましい実施形態を参照して詳細に説明されてきたが、当業者は、本発明の技術的解決策の目的および範囲から逸脱することのない修正または同等の置換は、本発明の特許請求の範囲によって含まれることを理解すべきである。

Claims (66)

  1. マンノースとその誘導体によって修飾された標的ナノ製剤であり、標的リガンドであるマンノースおよびその誘導体、ナノ製剤と主薬で構成され、ワクチン送達、腫瘍標的療法、 動脈硬化症および様々な炎症性疾患の治療に使用されることを特徴とする。
  2. マンノース誘導体は、マンノシド、マンノサミン、マンナンなどの１種または数種であることを特徴とする請求項１に記載の標的ナノ製剤。
  3. 前記ナノ製剤は、リポソーム、エマルジョン、ナノゲル、コアシェルナノ粒子、ＨＤＬナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、ポリマーミセルの１種または数種であることを特徴とする請求項１に記載のナノ製剤。
  4. 主薬は小分子薬、タンパク質ポリペプチド薬、または遺伝子薬物の１種または数種であることを特徴とする請求項１に記載の標的ナノ製剤。
  5. 前記標的リガンドであるマンノースおよびその誘導体の含有量は０．０５％−４０％であることを特徴とする請求項１に記載の標的ナノ製剤。
  6. 前記標的リガンドであるマンノースおよびその誘導体の含有量１％−１０％であることを特徴とする請求項１に記載の標的ナノ製剤。
  7. 前記標的リガンドであるマンノースおよびその誘導体の含有量は２％−５％であることを特徴とする請求項１に記載の標的ナノ製剤。
  8. 前記標的リガンドであるマンノースおよびその誘導体の修飾方法では、ナノ製剤を調製した後、マンノースとその誘導体をナノ製剤の表面に吸着または結合させ、または、ナノ製剤を調製する前にマンノースとその誘導体をナノ製剤の調製用担体材料と結合させることを特徴とする請求項１に記載の標的ナノ製剤。
  9. 前記マンノースおよびその誘導体は、溶媒揮発法、高圧均質化法またはマイクロエマルジョン法によってナノ製剤の表面に吸着させることを特徴とする請求項８に記載の標的ナノ製剤。
  10. ナノ製剤を修飾するマンノースおよびその誘導体は、１個のマンノースおよびその誘導体または２〜１０個のマンノースおよびその誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の標的ナノ製剤。
  11. 前記マンノースおよびその誘導体とナノ製剤またはナノ製剤の調製用担体材料は、直接結合またはスペーサーを介して結合することを特徴とする請求項８に記載の標的ナノ製剤。
  12. 前記スペーサーは、グルタルアルデヒド、エチレンジアミン、マロン酸、ＰＥＧ、アミノ酸、ジペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ステアロイル、パルミトイルの１種または数種であることを特徴とする請求項１１に記載の標的ナノ製剤。
  13. ナノ製剤の調製に使用される材料は、活性アミノ基またはヒドロキシル基の少なくとも１種であり、薬学的に許容できるミセル、エマルジョン、ナノゲル、コアシェルナノ粒子、ＨＤＬナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム、ポリマーミセルなどの調製用担体材料で薬学的に許容できるナノ製薬の調製方法によって調製されることを特徴とする請求項１−１２に記載の標的ナノ製剤。
  14. 標的機能を備えたナノ製剤の調製に使用される組成物であり、前記組成物は標的物質とナノ製剤基礎材料を備え、前記標的物質はマンノースおよび／またはマンノース誘導体であることを特徴とする。
  15. 前記マンノース誘導体は、マンノシドおよび／またはマンノサミンおよび／またはマンナンであることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記マンノース誘導体は、メチル−Ｄ−マンノシド、１−αホルミルメチル−マンノピラノシド、４−アミノフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−マンノピラノシド、マンノース−６−リン酸、カルバモイル−Ｄ−マンノースであることとを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記組成物中の標的物質の重量パーセントは、０．０５−４０％であることを特徴とする請求項１４または１５または１６に記載の組合物。
  18. 前記組成物中の前記標的物質の重量パーセントは、１−１０％であることを特徴とする請求項１４または１５または１６に記載の組成物。
  19. 前記組成物は、前記標的物質、前記ナノ製剤基礎材料、および標的物質とナノ製剤基礎材料との間に距離を作り出すスペーサー材料から構成され、前記スペーサー材料は、グルタルアルデヒド、エチレンジアミン、マロン酸、短鎖アルキル鎖、ＰＥＧ、アミノ酸、ジペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ステアロイルおよびパルミトイルの１種または数種であることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
  20. 前記ナノ製剤基礎材料は、リポソーム、エマルジョン、ナノゲル、コアシェルナノ粒子、ＨＤＬナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、およびポリマーミセルを調製するための材料の組成物であることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
  21. 前記スペーサー材料はＰＥＧｎであり、ｎ＝１００−５０００であることを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
  22. 前記ｎは１００、２００、３００、４００、５００、６００、８００、９００、１０００または２０００であることを特徴とする請求項２１に記載の組成物。
  23. 請求項１９に記載の組成物であって、重量部で次の成分からなることを特徴とする：マンノース１部、ＰＥＧ ０．５〜５６部、コレステロール２〜１１部。
  24. 請求項１９に記載の組成物であって、重量部で次の成分からなることを特徴とする：マンノース１部、ＰＥＧ １０〜２５部、コレステロール４〜８部。
  25. 請求項１４に記載の組成物で調製された薬物送達のための標的担体。
  26. 前記薬物は小分子薬および／またはタンパク質ペプチド薬および／または遺伝子薬物であることを特徴とする請求項２５に記載の標的担体。
  27. 前記小分子薬は、タキサン類、カンプトテシン類、ヴィンブラスティン類、アドリアマイシン、ファルモルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アンフォテリシン、メトトレキサート、シタラビン、５−フルオロウラシル、ミトキサントロンまたはその誘導体、ゲフィティニブ、ノスカピン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、カルムスティンとケルセチンの１種または数種であることを特徴とする請求項２６に記載の標的担体。
  28. 前記タンパク質ペプチド薬はインターロイキン、成長因子、インターフェロン、インテグリン、モノクローナル抗体、酵素およびインスリンであることを特徴とする請求項２６に記載の標的担体。
  29. 前記インターロイキンには、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６を含むがこれらに限定されない、前記成長因子には、線維芽細胞成長因子、肝臓成長因子、血管内皮成長因子、造血成長因子を含むがこれらに限定されない、前記インターフェロンにはＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγを含むがこれらに限定されない、前記腫瘍壊死因子にはＴＮＦα、ＴＮＦβを含むがこれらに限定されないことを特徴とする請求項１８に記載の標的担体。
  30. 前記遺伝子薬物は、ＤＮＡ、プラスミド、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡの１種または数種であることを特徴とする請求項２６に記載の標的担体。
  31. 請求項２５に記載の標的担体によってカプセル化された薬物。
  32. 前記ナノ製剤基礎材料をナノ薬物送達担体に調製し、そして前記標的物質を前記ナノ薬物送達担体の表面に付着させることを特徴とする請求項３１に記載の標的担体の調製方法。
  33. 請求項２５に記載の標的担体の標的化性を改善するための方法であって、その特徴は以下のとおりである。
    Ａ標的化要素の合成
    前記標的物質と前記スペーサー材料を標的化要素に合成する。
    Ｂ標的担体の調製
    ナノ製剤基礎材料をナノ薬物送達担体に調製し、次のステップＡで得られた標的化要素と前記ナノ薬物送達担体を接続して標的担体を得る、または前記スペーサー材料とナノ製剤基礎材料を合成し、そして前記標的物質と接続して標的担体を得る。
  34. 前記標的物質は具体的にはマンノースとその誘導体であり、前記スペーサー材料は具体的にはＰＥＧであることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
  35. 前記標的物質と前記ナノ薬物送達担体との距離は０．２−１００nmであることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
  36. 前記標的化要素と前記ナノ薬物送達担体との距離は０．３−１０nmであることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
  37. 薬用成分を標的細胞に送達するための方法であって、薬用成分を請求項２５に記載の標的担体に入れて送達することを特徴とする。
  38. 前記標的細胞はマンノース受容体を含む細胞であることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
  39. 前記標的細胞には、マクロファージ、樹状細胞、および腫瘍細胞が含まれるが、これらに限定されないことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
  40. 標的化要素を調製するための組成物であって、前記組成物は標的物質とスペーサー材料から構成され、前記標的物質はマンノースおよび／またはマンノース誘導体であることを特徴とする。
  41. 前記マンノース誘導体は、マンノシドおよび／またはマンノサミンおよび／またはマンナンであることを特徴とする請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記マンノース誘導体は、メチル−Ｄ−マンノシド、１−αホルミルメチル−マンノピラノシド、４−アミノフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド グリコシド、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−マンノピラノシド、マンノース−６−ホスフェート、カルバモイル−Ｄ−マンノースのいずれか１種または数種であることを特徴とする請求項４０に記載の組成物。
  43. 前記スペーサー材料は、グルタルアルデヒド、エチレンジアミン、マロン酸、短鎖アルキル鎖、ＰＥＧ、アミノ酸、ジペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ステアロイル、パルミトイルの１種または数種であることを特徴とする請求項４０に記載の組成物。
  44. 前記スペーサー材料と前記標的物質とのモル比は１−１０：１であることを特徴とする請求項４０に記載の組成物。
  45. 前記スペーサー材料と前記標的物質とのモル比は５：１であることを特徴とする請求項４４に記載の組成物。
  46. マンノースとＰＥＧとのモル比は１：５であることを特徴とする請求項４０に記載の組成物。
  47. マンノースとＰＥＧとのモル比は１：１であることを特徴とする請求項４６に記載の組成物。
  48. 請求項４０に記載の組成物で調製された標的化要素である。
  49. 前記標的化要素は式１に示すようであることを特徴とする請求項４８に記載の標的化要素、ここで、Ｒ１は−Ｃ５Ｈ８Ｏ２、−Ｃ２Ｈ７Ｎ２、−Ｃ３Ｈ３Ｏ４、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ、−Ｃ２Ｈ３Ｏ２ＮＲ’または−Ｃ２Ｈ３ＯＮＲ’、−Ｃ４Ｈ５Ｏ３Ｎ２Ｒ１’Ｒ２’または−Ｃ４Ｈ５Ｏ２Ｎ２Ｒ１’Ｒ２’、−Ｃ３ｎ＋１Ｈ３ｎ＋２Ｏｎ＋２Ｎｎ＋１Ｒ１’Ｒ２’または−Ｃ３ｎ＋１Ｈ３ｎ＋２Ｏｎ＋１Ｎｎ＋１Ｒ１’Ｒ２’、−Ｃ１８Ｈ３５Ｏ、Ｃ１６Ｈ３１Ｏ、−Ｈ 、−ＣＨＯ、−Ｃ６Ｈ４ＮＨ２、− Ｃ６Ｈ４ＮＯ２、−ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２Ｃ６ＣＣＨＣＯ２ＣＨ３であり、前記Ｒ１’とＲ２’は、任意の天然アミノ酸側鎖Ｒ’グループであり、Ｒ２は− ＣＨ３または−ＰＯ３Ｈ２、Ｒ３は−Ｈ、Ｒ４は−Ｈ、Ｒ５は−Ｈまたは−ＮＨＣＯＣＨ３である。
    Figure 2021525277
  50. Ｒ１はポリエチレングリコールで、その構造は
    Figure 2021525277
     である、ここで、ｎ＝１〜５０００、対応する分子量は４０＊ｎである。
  51. 請求項４８に記載の標的化要素を含む標的担体。
  52. 標的化要素とナノ製剤で接続され、前記ナノ製剤は、リポソーム、エマルジョン、ナノゲル、コアシェルナノ粒子、ＨＤＬナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、ポリマーミセルであることを特徴とする請求項５１に記載の標的担体。
  53. １個の標的担体に１〜１０００００個の前記標的化要素を接続していることを特徴とする請求項５１に記載の標的担体。
  54. 前記１個の標的担体に２０〜１０００個の前記標的化要素を接続していることを特徴とする請求項５３に記載の標的担体。
  55. 前記標的化要素のターゲットヘッドと前記ナノ製剤との距離は０．２−１００nmであることを特徴とする請求項５２に記載の標的担体。
  56. 前記標的化要素のターゲットヘッドと前記ナノ製剤との距離は０．３−１０nmであることを特徴とする請求項５５に記載の標的担体。
  57. 前記ターゲットヘッドはマンノシドおよび／またはマンノサミンおよび／またはマンナンであることを特徴とする請求項５５または５６に記載の標的担体。
  58. 前記標的物質とスペーサー材料を接続した後、ナノ製剤の材料と接続してナノ製剤を形成することを特徴とする請求項４８に記載の標的化要素をナノ製剤に接続する方法。
  59. 請求項４８に記載の標的化要素をナノ製剤に接続する方法であって、以下の手順を含むことを特徴とする。
    １）ジエチレングリコール、ｐ−トルエンスルホニルクロリドおよびトリエチルアミンをＤＣＭに溶解し、室温で反応させ、カラムクロマトグラフィーによって分離して化合物１を得る。
    ２）化合物１とペンタアセチル化マンノースおよびその誘導体と三フッ化ホウ素エーテルをＤＣＭに溶解し、室温で反応させ、カラムクロマトグラフィーによって分離して化合物２を得る。
    ３）化合物２とアジドナトリウムをＤＭＦに溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって分離して固体化合物３を得る。
    ４）化合物３をメトキシドナトリウムのメタノール溶液に溶解し、室温で反応させ、濃縮して化合物４を得る。
    ５）コレステロール、ブロモプロピン、水素ナトリウムをエーテルとＤＭＦの混合溶液に溶解し、室温で反応させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって分離して固体化合物５を得る。
    ６）化合物４、化合物５およびヨウ化第一銅をＤＭＦに溶解し、室温で２４時間反応させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって標的担体固体化合物６を得る。
  60. 薬物を標的担体にカプセル化されて送達することを特徴とする請求項５１に記載標的担体の薬物送達能力を改善する方法。
  61. 前記薬物は小分子薬および／またはタンパク質ペプチド薬および／または遺伝子薬物であることを特徴とする請求項６０に記載の方法。
  62. 前記標的担体は薬物をマンノース受容体標的を含む標的細胞に送達できることを特徴とする請求項６０に記載の方法。
  63. 請求項５１に記載の標的担体を含む複合体であって、前記複合体は前記標的担体と受容体によって形成された複合体であり、前記標的担体は薬物を運び、前記受容体はマンノース受容体であることを特徴とする。
  64. トランスフェクション試薬のトランスフェクション効率を改善するための方法であって、高いトランスフェクション効率を有するトランスフェクション試薬を調製するために請求項４０に記載の標的化要素の組成物をトランスフェクション試薬を調製するための担体に接続することを特徴とする。
  65. 請求項４８に記載の標的化要素を標的油相として使用される。
  66. 請求項４８に記載の標的化要素を標的水相として使用される。
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