CN106667914B - 靶向脂质体-环二核苷酸的组成、制备方法及其在抗肿瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体为靶向脂质体包裹的环二核苷酸cGAMP的组成、制备方法及其在抗肿瘤中的应用。靶向脂质体由卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇等及其链接靶向分子组成，该靶向脂质体包裹的cGAMP缓释药物可以增强细胞渗透作用，加强免疫反应，有效靶向药物递送，增强抑制多种肿瘤细胞的生长。因此，靶向脂质体包裹的cGAMP可用于制备抗肿瘤靶向缓释药物，在靶向免疫抗肿瘤领域有重要潜在应用。

Description

靶向脂质体-环二核苷酸的组成、制备方法及其在抗肿瘤中的 应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域 具体涉及一种靶向脂质体-环二核苷酸的组成、制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

脂质体(liposomes)是由脂质双分子层所形成的一种超微球形载体制剂，是纳米载药***的典型代表。当两性分子如磷脂分散于水相时，分子的疏水尾部聚集在一起，亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的封闭囊泡( vesicles)。在囊泡内水相和双分子膜内可以包裹多种不同极性的药物。由于脂质体的结构类似生物膜，故又称为人工生物膜。由天然膜成分组成的脂质体，其脂质体膜的双层结构原则上与天然细胞膜一样。另外，脂质体还可以由人工合成的脂质组成，以改善它们的化学性质和生物学性质。

脂质体的大小从几十纳米到几十微米不等，按照结构类型的不同，可以分为单室脂质体(unilamellar vesicles)、多室脂质体(multilamellar large vesicles，MLV)和多囊脂质体(multivescular liposomes，MVL)。其中单室脂质体是由一层双分子层脂质膜形成的囊泡，又分为小单层脂质体(small unilamellar vesicles，SUV)和大单层脂质体(large unilamellar vesicles，LUV)。

脂质体作为一种药物载体，主要有以下四个方面的优点：

（1） 靶向性和淋巴定向性；（2） 缓释作用：缓慢释放，延缓肾***和代谢，从而延长作用时间；（3）降低药物毒性；（4）提高药物稳定性。

脂质体因具有组织相容性、细胞亲和性、靶向性和缓释性等性质，被广泛地用于抗肿瘤药物的研发中。采用聚乙二醇(PEG)及其衍生物进行修饰，减弱脂质体长期储存的聚集，增加再分散性，提高脂质体的稳定性。这主要是由于PEG能产生6nm厚度的立***阻层，从而减弱血浆蛋白的作用和内皮网状***的摄取作用，延长药效。其次PEG能够提高膜表面亲水性，降低脂质体与单核吞噬细胞***的亲合作用。修饰后的脂质体称为长效脂质体或空间稳定脂质体。利用脂质体表面易被修饰获得靶向作用的特点，可以制备出靶向于肿瘤细胞表面上某些特定靶点的分子靶向脂质体，减少肝肾蓄积毒性，提高生物利用度，使脂质体在特定部位发挥药效。脂质体作为药物载体的研发重点主要集中在三个方面：1.包裹抗肿瘤化疗药物，因为脂质体可以有效降低这些化疗药物的副作用，提高药物治疗效果；2.用作蛋白质-多肽疫苗以及DNA疫苗的载体，由于脂质体是一种有效的免疫佐剂，作为疫苗载体可以增强机体的免疫反应；3.用作核酸类药物的载体，以脂质体为载体进行基因治疗可以避免病毒类载体的不良反应。

癌症作为威胁全球人类健康和生命的第二大杀手，其高发生率和高复发率使得抗肿瘤药物的研究成为热点领域。大多数抗肿瘤药物的靶向性不明显，而且会对人体正常组织产生副作用，造成不可逆伤害，影响癌症的治疗。脂质体载药***由于其低毒性和可以进行靶向性等特性受到了广泛关注。目前国内外已经有许多种脂质体药物已经被批准上市或进行临床研究来进行癌症治疗。

分子靶向脂质体是在脂质体表面连接上某种分子配体，该配体能够特异性识别肿瘤细胞表面的某种受体，使脂质体药物能够富集到靶细胞，减少对正常细胞的伤害。适当的靶向配体能够提高药物的生物利用度。按照配体的类型，分子靶向脂质体可分为抗体靶向型脂质体和非抗体靶向型脂质体。

抗体靶向脂质体又称为免疫脂质体(immunoliposomes, ILs)，通常将单克隆抗体或抗体的抗原结合片段(fragment of antigen binding, Fab)共价结合到载药的脂质体表面，依靠抗体与靶细胞表面的抗原或受体的识别作用，将药物运送到特殊部位。作为一种新型药物载体，免疫脂质体具有很多优势，包括对肿瘤靶细胞呈现明显的选择性杀伤作用，且杀伤活性比游离药物、非特异抗体脂质体、单独单抗等更强；在荷瘤动物体内呈特异性分布，肿瘤病灶药物浓度升高，药物毒副作用较小；体内循环半衰期长及运载药物量大等。目前已有多种抗体靶向脂质体处于研究阶段。

由于肿瘤细胞周围微环境的改变，肿瘤细胞表面会过度表达一些受体，而正常细胞表面不表达或低表达这些受体，因此可以在脂质体表面连接这些受体的靶向配体，发挥其特异性识别靶向作用。非抗体靶向型脂质体的常见配体有叶酸、转铁蛋白、多肽和糖类等，本发明专利属于非抗体靶向型脂质体，脂质体链接的靶向配体是叶酸。

在感染的哺乳动物细胞中微生物和病毒DNA能通过刺激干扰素分泌诱导內源强有力的免疫应答。内质网（ER）受体蛋白（STING）对胞质DNA的免疫应答是必需的因素。最近的研究表明，环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）在结合DNA后的活化条件下，内源性地催化cGAMP的合成。cGAMP是一种胞质DNA传感器，它作为第二信使通过STING刺激INF-β的感应，介导TBK1和IRF-3的活化，进而启动INF-β基因的转录。最近报道，重组cGAS在DNA结合条件下催化环化cGMP-AMP二核苷酸GAMP。cGAS结合双链dsDNA的复合物的晶体结构也已被报道，cGAMP结合STING，使转录因子IRF3激活并产生β干扰素。

环二核苷酸合成酶(cGAS)是先天性免疫通路中重要的细胞质DNA感受器。cGAMP作为二级信使分子通过内质网膜上的STING蛋白通路诱导干扰素IFN-β和其他细胞因子的产生，调节下游蛋白质表达，诱导细胞生长停滞和凋亡，产生抗病毒效应。STING通路可以调节免疫原性肿瘤的先天免疫识别，促进干扰素的抗肿瘤作用。IFN-γ在体内通过TRAIL(tumornecrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)发挥抗肿瘤作用，促进肿瘤细胞凋亡。cGAMP是cGAS-cGAMP-STING-IRF3介导的先天免疫反应的关键刺激物，是STING的内源性激活剂，因此，cGAMP具有促进抗肿瘤免疫应答的作用。

STING是内质网的跨膜蛋白，内质网上具有一种ENPP1的水解酶。在细胞质中没有发现ENPP1活性。相反，它被发现在肝细胞中的质膜的基底侧表面上和肝脏的粗糙内质网部分。其催化结构域驻留在内质网空腔中，且需要高浓度钙离子供其活动。ENPP1水解酶可以降解2’3’-cGAMP。实验显示2’3’-cGAMP是良好的重组ENPP1的底物。因此，用脂质体包裹cGAMP可以抑制其与ENPP1水解酶的接触，延长其代谢时间，提高药效。脂质体具有免疫佐剂的作用，可以进行肿瘤细胞靶向，提高药物利用率， 因此，靶向脂质体包含的cGAMP具有制备抗肿瘤药物的优势和潜在应用。

发明内容

本发明的目的在于提供靶向脂质体-环二核苷酸cGAMP的组成、制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。该靶向脂质体包裹的环二核苷酸cGAMP药物，具有靶向递送、增强细胞渗透性、延长药物代谢周期，提高药物利用率。由于脂质体具有免疫佐剂的作用，靶向脂质体-环二核苷酸cGAMP具有更好的免疫抗肿瘤药效。

本发明制备的靶向脂质体-环二核苷酸的组成包括：卵磷脂（lipoid EPCs）、胆固醇（CH）、 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG2000）和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸（DSPE-PEG-Folic Acid）组成的靶向脂质体，该脂质体包裹环二核苷酸cGAMP（或cGAMP的衍生物）。靶向脂质体-环二核苷酸cGAMP（或cGAMP的衍生物）的制备方法包括逆向蒸发法和硫酸铵梯度法。

本发明实验研究表明，靶向脂质体包裹的环二核苷酸cGAMP可以抑制多种肿瘤细胞的生长，具有明显的抗肿瘤作用，抗肿瘤药效明显优于cGAMP单独用药，可用于制备抗肿瘤药物。

本发明还涉及利用靶向脂质体包裹的环二核苷酸cGAMP所制备的抗肿瘤药。所述的肿瘤包括但不限于肺癌、胃癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌等。

本发明所述的靶向脂质体包括但不限于由卵磷脂（lipoid EPCs）、胆固醇（CH）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG2000）和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸（DSPE-PEG-Folic Acid）组成的靶向脂质体。

本发明所述的环二核苷酸，指的是2’3’-cGAMP或 Cyclic [G(2’,5’)pA(3’,5’)p]，但不限于2’3’-cGAMP，包括cGAMP的衍生物。

本发明所用的靶向脂质体包裹的环二核苷酸cGAMP缓释抗肿瘤药物能够延长cGAMP代谢周期，增强抗肿瘤治疗效果，优于单独使用cGAMP抗肿瘤治疗效果。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。

实施例1：靶向脂质体-cGAMP的组成和制备方法

通过逆向蒸发法和硫酸铵梯度法分别制备包裹cGAMP药物的靶向脂质体，并对其进行性质表征。

1、脂质体原料：卵磷脂（lipoid EPCs）、胆固醇（CH）、 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG2000）和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸（DSPE-PEG-FolicAcid），均购买自西安瑞禧生物科技有限公司。

2、脂质体制备方法

（1）逆向蒸发法

（A）磷脂膜材溶解于有机溶剂三氯甲烷中，磷脂膜材比例为：

EPC : CH : DSPE-PEG2000 : DSPE-PEG2000-FA = 10 : 10 : 1 : 0.01 （molarratio）；形成有机相溶液。

（B）cGAMP药物溶解于超纯水中，形成水相溶液。

（C）有机相磷脂溶夜 ：水相cGAMP溶夜=3:1（V ：V），cGAMP : 磷脂膜材总量 =1:10，将药物水溶液加入到磷脂有机相溶液中。

（D）探头超声，功率200W，20分钟（超声5秒，停3秒），形成稳定的W/O型乳剂。

（E）真空旋转蒸发除去有机溶剂（水浴45℃，转速90rpm）。

（F）将所得的脂质体溶液进行水浴超声，减小粒径。

（G）用超滤管（MWCO=3000Da）超滤除去未包封药物。

(2) 硫酸铵梯度法

（A）磷脂膜材溶解于有机溶剂三氯甲烷中，磷脂膜材比例为

EPC : CH : DSPE-PEG2000 : DSPE-PEG2000-FA = 10 : 10 : 1 : 0.01 （molarratio）；

（B）将磷脂溶液旋转蒸发成膜（水浴温度35℃，转速90rpm，真空度0.09Mpa），后旋转蒸发掉有机溶剂；

（C）向磷脂膜中加入120mmol/L的硫酸铵溶液，振摇（120rpm、5分钟）形成空白脂质体溶液。

（D）将空白脂质体溶液在超纯水中透析过夜。

（E）cGAMP溶解于超纯水中，加入到空白脂质体溶液中，65℃孵育20分钟；

（F）水浴超声减小粒径；

（G）用超滤管（MWCO=3000Da）超滤除去未包封药物。

3、靶向脂质体-cGAMP的表征

（1）粒径表征

利用动态光散射 （Dynamic Light Scattering，DLS）测量脂质体的粒径和粒径分布（PDI）。其基本原理为微小粒子悬浮在液体中会无规则地运动（布朗运动），光通过胶体时，粒子会将光散射，在一定角度下可以检测到光信号。大颗粒运动缓慢，散射光斑的强度也将缓慢波动；小粒子运动快速，散射光斑的密度也将快速波动，最后通过光强波动变化和光强相关函数计算出粒径及其分布。PDI表示粒径的均一度，是方差的概念。所制备的脂质体粒径约100 nm左右，PDI=0.426。

（2）Zeta电位

Zeta电位是连续相与附着在分散粒子上的流体稳定层之间的电势差。一般用来评价或预测微粒分散体系的物理稳定性,一般Zeta电位绝对值越高,其粒子间的静电斥力也就越大,物理稳定性也就越好。一般Zeta电位绝对值达到30mV就认为体系比较稳定。本发明制备的脂质体Zeta 电位绝对值为29.5 mV，较为稳定。

（3）包封率

将靶向脂质体与游离cGAMP药物分离，通过紫外分光光度计作标准曲线法,测定游离的cGAMP药物量，计算脂质体包封率：EE(％)=(1一Cf／Ct)×100％。其中：EE—cGAMP脂质体包封率；Cf一游离cGAMP含量；Ct一总cGAMP含量。根据计算，利用逆向蒸发法制备的脂质体包封率在60%左右，利用硫酸铵梯度法制备的脂质体包封率在75%以上。

实施例2：cGAMP的制备

cGAMP （环化-GMP-AMP）按文献方法在结合DNA后的活化条件下，由环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）催化合成。纯度在98％以上。（Li P.W，et al., Immunity, 2013,39(6), 1019-1031.）

实施例3：采用荷瘤鼠模型进行检测脂质体包裹的cGAMP缓释药物的抗肿瘤作用即对动物皮下移植瘤生长的抑制作用。

动物

种属、品系、性别、体重、来源、合格证

BALB/c普通小鼠、C57/BL6普通小鼠，雄性，体重16-18g，6-8周龄， SPF级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：SCXK （沪）2007-0005 ] 。

饲养条件

所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温（23±2）℃下饲养于中国人民解放军军医大学实验动物中心。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为SPF级。

剂量设置

静脉注射小鼠，设置1个剂量组：10 mg/kg

试验对照

阴性对照：生理盐水溶液

阳性对照：cGAMP，剂量10mg/kg

给药方法

给药途径：尾静脉注射给药

给药体积：100 微升/只

给药次数：每天1次，连续21天

每组动物数：10只

肿瘤细胞株

小鼠结直肠癌细胞株CT26，小鼠肺癌Lewis瘤株 LL/2，人卵巢癌细胞株SK-OV-3，人黑色素瘤细胞株A375，人胃癌细胞株MNK-45均购自中国科学院细胞库。

试验主要步骤

1．肿瘤模型鼠的建立与干预

细胞培养，传代，在细胞对数期收集细胞，做成浓度为(1.0×10⁷)每毫升的细胞悬液，小鼠右前肢腋下注射0.2 ml细胞悬液(细胞数目为2.0×10⁶个/只)，10 天左右肿瘤长至直径约5 mm，致瘤成功，随机均分为3组。分别为A：阴性对照组（静脉注射生理盐水组）；B：cGAMP组(静脉注射cGAMP)10mg/kg;C：靶向脂质体-cGAMP组(静脉注射脂质体-cGAMP)10mg/kg。每天给药1次，连续给药21天。21天后，处死小鼠并称瘤体重量，抑瘤率=[1-实验组平均瘤重(B、C组) ／A组平均瘤重)]×100％。

分别制备皮下移植瘤模型：小鼠结直肠癌细胞株CT26，移植到BalB/C普通小鼠；小鼠肺癌Lewis瘤株 LL/2，移植到C57/BL6小鼠，观察抗肿瘤效果。

2．统计分析

数据用x±s表示，利用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-wayANOVA）检验比较各组瘤重差异的显著性，显著性水平a=0.05。

结果

小鼠皮下接种肿瘤细胞后制备成功皮下移植瘤模型，靶向脂质体-cGAMP和cGAMP均可明显抑制肿瘤生长，给药21天后的瘤重均显著低于阴性对照组（P<0.05 ，P<0.01），靶向脂质体-cGAMP优于cGAMP单独用药，表明靶向脂质体-cGAMP具有更优的抗肿瘤作用。具体结果表1-表5：

表1、脂质体-cGAMP对BalB/C小鼠结直肠癌细胞CT26皮下移植瘤的作用

（n=10，mean±SD）

组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）

阴性对照组 2.266±0.244 （g） -

cGAMP组 0.748±0.182 （g）** 67.0

脂质体-cGAMP组 0.428±0.154 （g）** 81.0

注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.

表2、脂质体-cGAMP对C57小鼠肺癌Lewis瘤株 LL-2皮下移植瘤的作用

（n=10，mean±SD）

组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）

阴性对照组 2.640±0.378 （g） -

cGAMP组 0.782±0.245 （g）** 70.4

脂质体-cGAMP组 0.505±0.128 （g）** 80.8

注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.

表3、 脂质体-cGAMP对人黑色素瘤细胞株A375鼠皮下移植瘤的作用

（n=10，mean±SD）

组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）

阴性对照组 2.680±0.368 （g） -

cGAMP组 0.768±0.254 （g）** 71.3

脂质体-cGAMP组 0.498±0.135 （g）** 81.4

注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.

表4、 脂质体-cGAMP对人胃癌细胞株MNK-45鼠皮下移植瘤的作用

（n=10，mean±SD）

组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）

阴性对照组 2.668±0.382 （g） -

cGAMP组 0.786±0.265 （g）** 70.5

脂质体-cGAMP组 0.510±0.128 （g）** 80.8

注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.

表5、 脂质体-cGAMP对人卵巢癌细胞株SK-OV-3鼠皮下移植瘤的作用

（n=10，mean±SD）

组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）

阴性对照组 2.728±0.336 （g） -

cGAMP组 0.769±0.258 （g）** 71.8

脂质体-cGAMP组 0.509±0.156 （g）** 81.3

注：*P<0.05 vs 阴性对照组；**P<0.01 vs 阴性对照组.

实施例3 脂质体-cGAMP的急性毒性研究

实验材料

ICR 小鼠20 只（购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：SCXK （沪）2007-0005 ] ），雌雄各半，体重18～22g，动物以颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水。

脂质体-cGAMP由实施例1制备，用生理盐水配制成浓度为200mg/mL 的溶液。

实验方法

ICR小鼠按体重单次尾静脉注射2g/kg 的脂质体-cGAMP缓释药物，观察给药后小鼠14天内的毒性反应及死亡情况。结果发现，小鼠单次尾静脉注射给药后，小鼠活动正常。给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。

实验结果

上述急性毒性实验结果表明，静脉注射给药最大耐受量MTD 不低于2 g/Kg，说明脂质体-cGAMP药物的急性毒性低。

Claims (3)

1.靶向脂质体-环二核苷酸cGAMP，其特征在于，组成包括：卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇叶酸组成的靶向脂质体，和脂质体包裹的环二核苷酸cGAMP；

靶向脂质体-环二核苷酸cGAMP的制备方法如下：

脂质体膜材溶解于有机溶剂三氯甲烷中，脂质体膜材中各组分摩尔比为卵磷脂：胆固醇：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸-10:10:1:0.01，然后旋转蒸发成膜后真空抽干残留有机溶剂，向脂质体膜材有机溶液中加入120mmol/L的硫酸铵溶液，振摇，形成空白脂质体溶液，空白脂质体溶液在超纯水中透析过夜,cGAMP水溶液加到空白脂质体溶液中，60-65℃孵育，水浴超声，然后用超滤管超滤除去未包封cGAMP；

所述靶向脂质体-环二核苷酸cGAMP的应用对象为肺癌、胃癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌中的至少一种。

2.使用权利要求1所述的靶向脂质体-环二核苷酸cGAMP制备的缓释药物,其特征在于，所述缓释药物为抗肿瘤药物、抗神经退行性疾病药物、抗心脑血管病药物、抗糖尿病药物。

3.根据权利要求2所述的靶向脂质体-环二核苷酸cGAMP制备的缓释药物,其特征在于：它通过不同规格的单位制剂及药学上可接受的载体制备得到抗肿瘤药物，取口服或注射中的一种或多种给药途径进行肿瘤及其直接相关疾病的预防或治疗。