JP2021505654A - B型肝炎ウイルス(HBV)感染の処置のためのcccDNA阻害剤としてのピロロ[2,3−b]ピラジン化合物 - Google Patents
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Abstract
Description
HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞を用意する工程;
検査化合物を、HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞に供試する工程;
感染した幹細胞由来肝細胞様細胞中のHBsAg及びHBeAgに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程;
任意選択で、感染した幹細胞由来肝細胞様細胞中のアルブミンに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程及び検査化合物がアルブミンを阻害することが見出された場合、その化合物を更なる検査から除く工程;
検査化合物がHBsAg及びHBeAgを阻害することが見出された場合、HBV pgRNAに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程;
検査化合物がHBV pgRNAを阻害することが見出された場合、HBV cccDNAに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程;及び
検査化合物がHBV cccDNAを阻害することが見出された場合、HBV cccDNAの阻害剤として検査化合物を選択する工程を含む方法を提供する。
幹細胞(好ましくは、多能性幹細胞、より好ましくは人工多能性幹細胞)を、WO2014/140058に開示される化合物(好ましくは、以下に記載されるような化合物MB-1又はMB-2、又は薬学的に許容されるその塩)で処置して、幹細胞由来肝細胞様細胞を得る工程;及び
このように得られた細胞を、HBV(好ましくは、患者由来HBV、より好ましくは患者由来HBVのGT A、B、C又はD)に感染させて、HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞を得る工程。
ル、アクリジニル、ペリミジニル、フェナントロリニル(例えば、[1,10]フェナントロリニル、[1,7]フェナントロリニル、又は[4,7]フェナントロリニル)、フェナジニル、チアゾリル、イソチアゾリル、フェノチアジニル、オキサゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル(例えば、1,2,4-オキサジアゾリル、1,2,5-オキサジアゾリル(すなわち、フラザニル)、又は1,3,4-オキサジアゾリル)、チアジアゾリル(例えば、1,2,4-チアジアゾリル、1,2,5-チアジアゾリル、又は1,3,4-チアジアゾリル)、フェノキサジニル、ピラゾロ[1,5-a]ピリミジニル(例えば、ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)、1,2-ベンゾイソキサゾール-3-イル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイソキサゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾ[b]チオフェニル(すなわち、ベンゾチエニル)、トリアゾリル(例えば、1H-1,2,3-トリアゾリル、2H-1,2,3-トリアゾリル、1H-1,2,4-トリアゾリル、又は4H-1,2,4-トリアゾリル)、ベンゾトリアゾリル、1H-テトラゾリル、2H-テトラゾリル、トリアジニル(例えば、1,2,3-トリアジニル、1,2,4-トリアジニル、又は1,3,5-トリアジニル)、フロ[2,3-c]ピリジニル、ジヒドロフロピリジニル(例えば、2,3-ジヒドロフロ[2,3-c]ピリジニル又は1,3-ジヒドロフロ[3,4-c]ピリジニル)、イミダゾピリジニル(例えば、イミダゾ[1,2-a]ピリジニル又はイミダゾ[3,2-a]ピリジニル)、キナゾリニル、チエノピリジニル、テトラヒドロチエノピリジニル(例えば、4,5,6,7-テトラヒドロチエノ[3,2-c]ピリジニル)、ジベンゾフラニル、1,3-ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキサニル(例えば、1,3-ベンゾジオキサニル又は1,4-ベンゾジオキサニル)、又はクマリニルを指しうる。別段の指定がない限り、用語「ヘテロアリール」は、好ましくは、5から14員(より好ましくは5から10員)の単環式環又は縮合環系であって、独立にO、S及びNから選択される一つ又は複数(例えば、一、二、三又は四)の環ヘテロ原子を含むものを指し、ここで、一つ又は複数のS環原子(存在する場合)及び/又は一つ又は複数のN環原子(存在する場合)は、任意選択で酸化され、一つ又は複数の炭素環原子は、任意選択で酸化される;さらにより好ましくは、「ヘテロアリール」は、5又は6員の単環式環であって、独立にO、S及びNから選択される一つ又は複数(例えば、一、二又は三)の環ヘテロ原子を含むものを指し、ここで、一つ又は複数のS環原子(存在する場合)及び/又は一つ又は複数のN環原子(存在する場合)は、任意選択で酸化され、一つ又は複数の炭素環原子は、任意選択で酸化される。更に、別段の指定がない限り、特に好ましい「ヘテロアリール」の例には、ピリジニル(例えば、2-ピリジル、3-ピリジル、又は4-ピリジル)、イミダゾリル、チアゾリル、1H-テトラゾリル、2H-テトラゾリル、チエニル(すなわち、チオフェニル)、又はピリミジニルが含まれる。
される一つ又は複数(例えば、一、二、三、又は四)の環ヘテロ原子を含有し、ここで、一つ又は複数のS環原子(存在する場合)及び/又は一つ又は複数のN環原子(存在する場合)は、任意選択で酸化され、一つ又は複数の炭素環原子は、任意選択で酸化される;より好ましくは、「ヘテロシクロアルキル」は、5から7員の飽和単環式環基であって、独立にO、S及びNから選択される一つ又は複数(例えば、一、二又は三)の環ヘテロ原子を含有するものを指し、ここで、一つ又は複数のS環原子(存在する場合)及び/又は一つ又は複数のN環原子(存在する場合)は、任意選択で酸化され、一つ又は複数の炭素環原子は、任意選択で酸化される。更に、別段の指定がない限り、特に好ましい「ヘテロシクロアルキル」の例には、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルフォリニル、ピロリジニル、又はテトラヒドロフラニルが含まれる。
環基を指し、これは、単環式環又は縮合環系(例えば、二縮合環から構成される縮合環系)であり、前記環基は、独立にO、S及びNから選択される一つ又は複数(例えば、一、二、三、又は四)の環ヘテロ原子を含有し、ここで、一つ又は複数のS環原子(存在する場合)及び/又は一つ又は複数のN環原子(存在する場合)は、任意選択で酸化され、一つ又は複数の炭素環原子は、任意選択で酸化され、前記環基は、隣接する環原子間に少なくとも一つの二重結合を含み、隣接する環原子間にいかなる三重結合も含まなく;より好ましくは、「ヘテロシクロアルケニル」は、5から7員の単環式で不飽和の非芳香環基であって、独立にO、S及びNから選択される一つ又は複数(例えば、一、二又は三)の環ヘテロ原子を含有するものを指し、ここで、一つ又は複数のS環原子(存在する場合)及び/又は一つ又は複数のN環原子(存在する場合)は、任意選択で酸化され、一つ又は複数の炭素環原子は、任意選択で酸化され、前記環基は、隣接する環原子間に少なくとも一つの二重結合を含み、隣接する環原子間にいかなる三重結合も含まない。
(エシル酸塩)、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩(イセチオン酸塩)、ベンゼンスルホン酸塩(ベシル酸塩)、p-トルエンスルホン酸塩(トシル酸塩)、2-ナフタレンスルホン酸塩(ナプシル酸塩)、3-フェニルスルホン酸塩、又は樟脳スルホン酸塩(camphorsulfonate salt);グリセロリン酸塩;及び酸性アミノ酸塩、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸塩。式(I)の化合物の好ましい薬学的に許容される塩には、塩酸塩、臭化水素酸塩、メシル酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、及びリン酸塩が含まれる。式(I)の化合物の特に好ましい薬学的に許容される塩は、塩酸塩である。したがって、本明細書に記載される特定の式(I)の化合物いずれか一つを含む、式(I)の化合物が、塩酸塩、臭化水素酸塩、メシル酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩の形態であることが好ましい及び式(I)の化合物が、塩酸塩の形態であることが特に好ましい。
cccDNA阻害剤を発見するための、臨床分離株からの完全なHBV生活環を再現する幹細胞由来肝細胞様細胞における表現型スクリーニング
方法
患者血清精製
CHB個体の血清からのHBVを、OptiPrep(商標) (Axis-Shield社、ノルウェー国)密度勾配を使用して精製した。簡潔に述べると、OptiPrep(商標)保存溶液(60%)をPBSに希釈して50%及び10%とし、次いで、等体積の各溶液をSW41管(BD Biosciences社)に加えた。管を、80°、25rpm、30分に設定したGradient Master 108(商標) (Biocomp社)に設置することにより、直線的に傾斜させた。200マイクロリットル(200μl)の血清を傾斜の上部に重ね、サンプルを4℃にて100,000×gで2時間遠心分離した。上部から分画(500μl)を回収し、各分画についての分割量を、コアプライマー5'-CTGTGCCTTGGGTGGCTTT (順方向)、5'-AAGGAAAGAAGTCAGAAGGCAAAA (逆方向)、56-FAM/AGCTCCAAATTCTTTATAAGGGTCGATGTCCATG/3IABlk_FQ/ (プローブ) (Werle-Lapostolleら、2004)を使用してHBV DNAについて、またHBsAgについて分析した。HBV DNAのピークを含んでいる分画をプールし、すべての感染実験のためのウイルス接種材料として使用した。すべての分画を、使用するまで-80℃で保管した。
凍結保存されたHLCを、製造者の推奨に従って解凍し、播種した。簡潔に述べると、凍結保存された細胞を37℃の水浴において2分間解凍し、クライオバイアルの中身を、37℃のiCell肝細胞培地B (KryoThaw成分A 7.8ml、KryoThaw成分B 4.2ml)を12ml含有する15mlの管に注いだ。管をゆっくりと反転させ(約5回)、次いで、室温にて110×gで10分間遠心分離した。培地を吸引した後、2mlのRT iCell肝細胞培地C (B27補充物、オンコスタチンM 20ng/ml、デキサメタゾン1μM、及びゲンタマイシン25μg/mlを含有するRPMI)を加え、細胞をカウントした。次いで、細胞懸濁液を、Matrigel 0.25mg/mlを含有する培地Cに、100万細胞/mlで希釈した。コラーゲンIでコートされた細胞培養プレートに、40,000細胞/ウェル(384ウェルプレート)又は100,000細胞/ウェル(96ウェルプレート)で細胞を播種し、37℃のインキュベーターにおいて、加湿雰囲気中にて5% CO2で培養した。プレート播種から24時間後に、培養培地を、Matrigel 0.25mg/ml及び1μMのMB-1を含有する培地D (B27補充物、オンコスタチンM 20ng/ml、デキサメタゾン0.1μM、及びゲンタマイシン25μg/mlを含有するRPMI)と交換した。2日毎に新鮮な培地及びMB-1に変えた。
コラーゲンIでコートされた96ウェルプレートにおいて、Matrigel 0.25mg/mlを含有する100μlの培地DにHLCを播種する。翌日(1日目)、細胞に、最終濃度を1% DMSO中に4μMとして化合物ライブラリーを加えた。2日後(3日目)、新鮮な培地及び化合物を補充した。4日目に、Cells-to-Ct lysisキット(Ambion/Thermo Fisher社)を使用して細胞を収穫し、全RNAを逆転写させ、得られるcDNA産物を、微小流体用96.96 Dynamic Array(商標)IFCに載せ、Biomark HDシステム(Fluidigm社)において、肝臓に豊富な32の遺伝子に対してアッセイした。DMSO対照におけるハウスキーピング遺伝子(PPIA)を参考として使用して、デルタCt値から関連性のある遺伝子発現を割り出し、次いで、デルタCt値を倍数変化値に変換した。HLCにおける肝臓に豊富な遺伝子発現を、DMSO対照に比べて3倍以上に増加させた化合物を、用量応答(1、5、10、及び50μM)において更に検査した。二次スクリーンは、96の肝臓に豊富な遺伝子を使用して、上記のとおりに行った。最上位の候補(MB-1)を、HLCを利用するすべての実験に使用した。
ヒト化マウス(uPA/SCIDマウス)から収穫された新鮮な一次ヒト肝細胞(PXB-PHH)-本明細書ではPHHと呼ぶ-を、PhoenixBio社(日本国)から取得した。コラーゲンIでコートされたプレートにおいて、改変肝細胞クローン増殖培地(dHCGM)に、次の細胞密度、すなわち、35,000細胞/ウェル(384ウェル)、70,000細胞/ウェル(96ウェル)、又は400,000細胞/ウェル(24ウェル)で細胞を播種した。dHCGMは、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、20mMのHepes、44mMのNaHCO3、15μg/mlのL-プロリン、0.25μg/mlのインスリン、50nMのデキサメタゾン、5ng/mlのEGF、0.1mMのAsc-2P、2% DMSO、及び10% FBSを含有するDMEM培地である(Ishidaら、2015)。37℃のインキュベーターにおいて、加湿雰囲気中にて5% CO2で細胞を培養した。播種から24時間後、収穫まで2日毎に培養培地を交換した。
1μMのMB-1と共に4日間の成熟後、HLCを、感染多重度(MOI)10〜40で、(CHB個体から精製した)HBVと共に、PEGなしで24時間インキュベートし、翌日、ウイルス接種材料を除去した。PHHにおけるHBV感染は、MOI 40+4% PEGで行った。感染後3日目に、HLC及びPHHにおける化合物処理を開始した。(粉末の)化合物をDMSOに溶解させたが、細胞に加えたDMSOの最終濃度は、1%である。10日目(PHH)又は14日目(HLC)に細胞を収穫するまで、2日毎に新鮮な化合物を補充した。HBVに対する化合物の効果及び細胞毒性を、マルチプレックスアッセイ(HBsAg、HBeAg、アルブミン)、分岐DNA (pgRNA)、又はデジタルPCR (cccDNA)によって測定し、DMSO対照と比較した阻害%として示した。グラフは、Spotfireソフトウェアを使用して作成した。
コラーゲンIでコートされた384ウェルプレートに播種したHLCを、1μMのMB-1で4日間処理した(2日毎に培地及び化合物を補充した)。4日目に、MOI 40で、細胞を(CHB個体の血清から精製した)HBVに24時間かけて感染させ、ウイルス接種材料を除去し、新鮮な培地を加えた。感染後3日目に、1% DMSO中の最終濃度を4μMとして化合物ライブラリーを加え、14日目まで2日毎に新鮮な培地及び化合物を補充した。18日間のHTSアッセイでは終始、37℃のインキュベーターにおいて、加湿雰囲気中にて5% CO2で細胞を培養し、液体の取り扱いはすべて、BSL3**施設においてロボット設備で実施した。感染後14日目に、培養培地を収穫し、マルチプレックスアッセイ用に加工した。各試行において、およそ20,000種の化合物をスクリーニングした。
マルチプレックスアッセイ-一次読取り
HBeAg、アルブミン、及びHBsAgを同時に測定した、Luminexベースの、特別注文のマルチプレックスアッセイを、Radix BioSolutions社(テキサス州Georgetown)が開発した。これは、サンドイッチイムノアッセイであり、各捕捉抗体を、xMAP(商標)Luminex磁気ビーズとカップリングさせた。分析物検出の動的範囲は、HBeAg (1〜316ng/ml)、アルブミン(3.1〜10,000ng/ml)、及びHBsAg (0.1〜100ng/ml)であり、変動係数(coefficient variant) (CV)は、25%以下である。サンプルをFlexMAP 3D (Luminex社)で読み取り、Genedataソフトウェアによって分析した。以下の表から、各分析物に対するマルチプレックスビーズ及び検出抗体が、分析物間で交差反応性でなかったことが示された(平均蛍光強度/MFIとして報告された数)。
xMAP(商標)Luminex磁気ビーズ及び分岐DNA (bDNA)シグナル増幅技術を利用する、ハイブリダイゼーションベースのアッセイである、QuantiGene Singleplex 2.0アッセイ(Affymetrix社)を使用して、感染細胞におけるpgRNAのレベル(96ウェルプレート)を測定した。アッセイは、96ウェルプレートにおいて、製造者の推奨に従って行った。簡潔に述べると、細胞を溶解させ、溶解物をHBVプローブセットパネルと共に、50〜55℃で30分間インキュベートし、次いで、-80℃で保管した。シグナル増幅は、PreAmplifier、Amplifier、及びLabel Probeを順次ハイブリダイズさせることにより実現される。ストレプトアビジンフィコエリトリン(SAPE)基質を加えた後、FlexMap 3D (Luminex社)機器を使用してシグナルを読む。
(384又は96ウェルプレートにおける)HBV感染細胞を、Cells-to-CT溶解試薬によって、製造者の指示(Thermo Scientific社)に従って溶解させた。過剰のRC-DNAを除去するために、サンプルをT5エキソヌクレアーゼ(10U) (New England Biolabs社)によって37℃で1時間消化し、サンプルを80℃で15分間加熱することにより、酵素を失活させた。cccDNAプライマー5'-CTCCCCGTCTGTGCCTTCT (順方向)、5'-GCCCCAAAGCCACCCAAG (逆方向)、及びCGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCC (プローブ) (Werle-Lapostolleら、2004)を合計体積5μl中に含有するデジタルPCRマスターミックス(QuantStudioデジタルPCRキット、Thermo Scientific社)に、DNAサンプル(1.2μl)を加え、AccuFillシステム(AB社)を使用してdPCRアレイに載せた。各サンプルは、4つのサブアレイ/256のスルーホールに載せた。QuantStudio 12K Flex (AB社)においてデジタルPCRアッセイを試行し、Digital Suiteソフトウェア(AB社)によってデータを分析した。
HLC又はPHHを12ウェルプレートフォーマットで播種し、上述のとおりにHBV感染させた。10日目に、細胞から、次のとおりにHIRT抽出物を調製した。簡潔に述べると、500μlのHIRT溶解緩衝液を各ウェルに加え、3つのウェルからの溶解物を合わせて、標準HIRT抽出手順(Caiら、2013)に従いながら無タンパク質HBV DNAを単離した。サザンブロット分析については、0.2μlのQuick-Load 1-kb DNAラダー(New England Biolabs社)、2pgの1×HBVゲノム長(3.2kb) PCR産物(プライマーP1/P2、Guentherら、1995)、及び5μgのHIRT抽出DNAをレーン毎に載せ、1×トリス-酢酸-EDTA緩衝液中1.0% (wt/vol)のアガロースゲルにおける50Vで3.5時間の電気泳動によって分離した。電気泳動後、記載されているとおりに(Caiら、2013)、DNAを脱プリン化し、変性させ、中和し、次いで、TurboBlotterシステム(GE Healthcare社)を使用してHybond XL膜(Amersham社)に移した。DIG Northernスターターキット(Roche社)を製造者の指示に従って使用して、T7プロモーター(HBV T7+順方向プライマー 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTTTTTCACCTCTGCCTAATCATC-3'、HBV逆方向プライマー 5'-CCTCTAGAGCGGCCGCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGT-3')を有する1×HBVゲノム長(3.2kb) PCR産物から転写されたDIG標識された(+)鎖HBV RNAプローブを用い、HBV DNAを検出した。ミトコンドリアDNAは、ミトコンドリアゲノムのND1遺伝子領域に結合するRNAプローブで検出した(Ducluzeauら、1999)。ハイブリダイゼーション、洗浄、及びCDP-Star (Roche社)による検出を、製造者の指示に従って実施した。FUSION Fx (Vilber社)を用いて画像を取得し、FUSION-CAPTソフトウェアを使用する濃度測定によってバンドを定量化した。
Image-iT(商標)固定/透過処理キット(Thermo Fisher社、カタログ番号R37602)を使用して、免疫染色を行った。感染後10日目に、細胞を1mlの固定溶液において室温(RT)で15分間固定し、次いで、2mlの洗浄緩衝液で2〜5分間、3回洗浄した。3% BSA、V分画、脱脂、ニュージーランド起源を含有するD-PBS緩衝液に希釈した一次抗体、引き続いて二次抗体と共に、細胞をそれぞれ室温で1時間インキュベートした。一次抗体:1.25μg/mLの抗HBs mAbであるMAK_M_RF18 (Roche社)、又は0.1μg/mLの抗HBVコア抗体(DAKO社、カタログ番号B0586)。二次抗体:2μg/mlのヤギ抗ウサギIgG (H+L)交差吸着二次抗体であるAlexa Fluor 594 (Thermo Fisher社カタログ番号A-11012)、又はヤギ抗マウスIgG (H+L)交差吸着二次抗体であるAlexa Fluor 488 (Thermo Fisher社カタログ番号A-11001)。2mlの洗浄緩衝液で2〜5分間、3回洗浄した後、細胞を、1μg/mlのHoechst 33342三塩酸塩三水和物(Thermo Fisher社カタログ番号H3570)と共に室温で15分間インキュベートした。免疫染色をAxio Observer倒立顕微鏡(Zeiss社)及びZeiss ZENソフトウェアで分析した。
感染後3日目に、細胞を化合物又は1% DMSOで6時間処理した。RLT緩衝液(QIAGEN社、スイス国、Hombrechtikon)を使用して総RNAを抽出し、サンプルを-80℃で保管した。各生物学的反復実験からの総RNA 10ngを逆転写させ、Ion AmpliSeq(商標)RNAライブラリーキット(Life Technologies社、米国、Carlsbad、カタログ番号4482335)を用い、支給されたプロトコールに従って、cDNA産物を増幅した。プライマーを消化した後、増幅産物にアダプター及びバーコードを連結してから、磁気ビーズ精製した。精製したライブラリーを増幅し、精製し、-20℃で保管した。Agilent High Sensitivity DNAキット(Agilent Technologies社、ドイツ国、Waldbronn)を製造者の手引きに従って使用して、増幅産物サイズ及びDNA濃度を測定した。CAMERA法(Wu及びSmyth、2012)、及びMSigDB (Liberzonら、2011)やREACTOME (Fabregatら、2016)等の公的に入手可能な遺伝子セットを統合する内部で入手可能なデータベース(RONET)における遺伝子セットを用いて、経路解析を行った。CAMERAの結果は、CAMERAによって返された絶対log10変換p値を、+1 (遺伝子セットのプラスの調節)又は-1 (遺伝子セットのマイナスの調節)のいずれかで乗じた値によって規定される、エンリッチメントスコアによって表される。
HLCの成熟を増進した小分子の同定
HBV薬物を発見するための疾患関連アッセイとしてのHLCの潜在的可能性を完全に明示するには、次の判断基準、すなわち、肝細胞類似性、拡張可能性、アッセイ堅牢性(assay robustness)、及び再現性が満たされなくてはならない。HLCが依然として未熟な表現型を呈する、すなわち、成体肝細胞より胎児肝細胞に似ることは、よく知られている(Baxterら、2015;Godoyら、2015;Goldringら、2017)。現用のプロトコールで完全に成熟したHLCを得ることの難しさは、ドナー起源のばらつき(Kajiwaraら、2012;Heslopら、2017)、及び肝臓帯状分布を含む肝臓構造の複雑さの模倣が不十分である培養条件(Goldringら、2017)を始めとして、多くの要素からなる。実際に、肝細胞は、肝臓の門脈中心軸(porto-central axis)に沿ったその位置に応じて、重要な肝臓遺伝子、したがって種々の代謝機能を示差的に発現した(Halpernら、2017;Soto-Gutierrezら、2017;Torreら、2010)。創薬におけるHLCの適用に関する別の肝要な論点は、拡張可能性であり、HTS及び後続の数回反復されるヒット追跡を試行するには、(純度が高く、バッチ間のばらつきが最小限に抑えられた)数十億の細胞が必要である。本発明者らは、民間供給元(CDI社、ウィスコンシン州、Madison)からHLCを選んでおり、本発明者らの最初の取り組みは、生物活性のある約700種の化合物からなる小分子ライブラリーを使用して、その成熟を向上させることであった。製造者の推奨(Luら、2016)に従って細胞を培養し、化合物ライブラリー(4μM)と共にインキュベートした。肝成熟を増進したヒットを同定するために、本発明者らは、32 (1番目のスクリーン)又は96 (2番目のスクリーン)の肝臓に豊富な遺伝子の上向き調節に基づく2段階のスクリーニングカスケードを適用した(図1A及びTable 1 (表2)を参照されたい)。肝臓に豊富な遺伝子のmRNA発現を比較的低い濃度(≦5μM)で増進しうるその能力に基づいて、最上位のヒットであるMB-1を選択した(図6を参照されたい)。ゲノム全体のマイクロアレイ分析では、MB-1によって、HLCにおける肝臓組織シグネチャー、すなわち、約237の肝臓に豊富な遺伝子(Table 2 (表3、表4、表5、表6)を参照されたい)のmRNA発現が、時間及び用量依存的に上向き調節され、137の遺伝子が肝臓において高度に発現されることが示された(特異性閾値:それぞれ、ジニ指数>0.7及び>0.8;ジニ指数の定義については、Zhangら、2017を参照されたい) (図1Bを参照されたい)。特に、SLC10A1 (NTCP、HBV受容体)等のHBV依存性因子、並びにHBVプレゲノムRNA合成及びウイルスDNA複製に不可欠である、転写因子HNF4α、RXRα、及びPPARが挙げられる(Tang及びMcLachlan、2001)。本発明者らは、BioQC解析を使用して、HLCの肝臓組織シグネチャーを他のHBV系(HepG2、HepaRG、及びPHH)の肝臓組織シグネチャーと比較した。BioQCは、150の組織に豊富な遺伝子シグネチャーに対する任意の遺伝子発現データの比較を可能にする、監修された生命情報科学ソフトウェアであり、結果は、log10p (Wilcoxon検定の絶対log10変換p値)の形で、各サンプルについて、各組織シグネチャーのエンリッチメントスコアとして報告される(Zhangら、2017)。ベースラインにおいて、HLCは、HepaRGと同等の肝臓スコアを有し、MB-1処理によって、HLCの肝臓スコアは、HepaRGの肝臓スコアよりも高くまで、かなり増大した(図1Cを参照されたい)。MB-1は、HLCを成体肝細胞へと更に分化させるには十分でなく、これは、単層培養条件、並びに他の未知の要素のせいである可能性がある。HLC及びHepaRGはまた、HepG2より肝臓様の表現型を示した。HepG2細胞株のPHHとの類似性が不十分であることは知られており、HepG2では、肝臓に豊富な遺伝子の多くが、下向き調節されているか、又は完全に「オフ」になっている(Uhlenら、2015)。HLCの肝成熟に対するMB-1の効果は、タンパク質レベルでも観察され、HLCは、より高いレベルの肝細胞特異的AAT1αタンパク質を発現した(図1Dを参照されたい)。
HBV創薬のための疾患関連性アッセイであるとみなされるために、HLCアッセイは、PHHと同等でなくてはならず、384ウェルプレートにおいて小型化することができ、多様なGTの臨床HBVサンプルの検査に供することができることが理想的である。
患者由来HBVを感染させたHLCにおける表現型スクリーニングによって、真のcccDNA阻害剤が発見される見込みが理論上増すことになるが、そのようなHTSに着手することができるようになる前に、厳格な実現性評価が必要である。まず、HLCアッセイ継続期間(14日)は、他の細胞ベースの表現型スクリーニング(1〜3日)よりはるかに長く、そのため、技術的な複雑さ及び潜在的なアッセイ間のばらつきが増す。(384ウェルプレートにおいてMOI 40で)約7,000のHBV感染を行うことにより、HLCアッセイ性能(Z'値)を評価した。Z'値は、アッセイ堅牢性及びシグナル変動性(標準偏差)の両方が考慮されている、アッセイの質の統計的尺度であり、Z'値が0.5を超えるアッセイは、HTSの実施に非常に適するとみなされる(Zhangら、1999)。3種の分析物のZ'値(HBsAg 0.6、HBeAg 0.45、アルブミン0.8) (図11Aを参照されたい)によって、HTSについてHLCアッセイが堅牢であるという高度な信頼が付与される。アッセイの一貫性を保証するために、4人のCHB個体からの(HLCにおける感染率が等しい)血清を、ウイルス接種源として選択した。これらの血清(GT Aが1、GT Bが2、GT Cが1)は、主要なHBV遺伝子型も広くカバーする。次に、cccDNAのレベルは、本質的に低く、dPCRアッセイの処理量が少ないために、一次HTS読取り情報として不適当になった。本発明者らは、cccDNA活性ヒットを、そのより豊富な転写産物(HBsAg、HBeAg、及びpgRNA)によって、後から同定することができると考えた。HBsAg及びHBeAgは、2種の異なるウイルスmRNAから翻訳され、どちらの抗原も、感染細胞から非常に豊富に(HBsAg >> HBeAg)分泌される。HBsAg、HBeAg、及びアルブミンを一次HTS読取り情報として同時に測定するための、マルチプレックスアッセイを開発した。アルブミン阻害は、毒性化合物、及び非特異的分泌阻害剤として潜在的に作用するものについてのカウンタースクリーンとして働いた(図11Bを参照されたい)。第2の読取りでは、cccDNA転写活性の代理としてpgRNA測定を用いており(Larasら、2006)、pgRNAも、HLC中にcccDNAの約80〜100倍の高さで存在し(図2Cを参照されたい)、アッセイ感度を高める。このスクリーニングカスケードの利点は、一次読取り(上清からのマルチプレックスアッセイ)と二次読取り(細胞溶解物からのpgRNA)の両方を、384ウェルプレートにおける同じサンプルから行えることである。HBsAg/HBeAg/pgRNAに対して活性のある化合物は、次いで、dPCRアッセイにおいて検査される。3番目に、PHHにおけるバリデーションによって、HLCヒットの生物学的関連性に信頼を築く。ヒト化uPA/SCIDマウスから単離された新鮮なヒト肝細胞(PXB-PHH、本明細書ではPHHと呼ぶ)を使用して、PHHアッセイが確立されている(Ishidaら、2015)。両方の細胞型において複数回検査される参考化合物を使用して、HLC及びPHHアッセイの再現性を評価し、HLCは、常に、PHHより低いアッセイ変動性を示した(図3Aを参照されたい)。注目すべきことに、HLCにおけるHBsAg及びHBeAgに対する化合物効力が、PHHでは5.5〜7.6倍ずれた。
HLCヒットプロファイリングの効率を上げるために、スクリーニングカスケードをPHHにおいて実施した(図3Bを参照されたい)。HLCヒットのうちの約1,000種をPHHにおいて検査すると、参考化合物を用いての以前の所見(図3Aを参照されたい)と同様に、これらの多くは、PHHにおいても活性を有するが、しかし、効力の約10倍のずれを示した(平均HBsAg及びHBeAg IC50は、HLCでは1.36〜1.46μMであり、PHHでは12.05〜13.5μMである) (図3Dを参照されたい)ことが示された。次に、本発明者らは、HBeAgとHBsAgを同時に阻害する化合物が、pgRNAを阻害する見込みがより高いかどうかを検査し、実際に、70%を超えるそうした化合物が、pgRNAも阻害し(図3Eを参照されたい)、引き続いて、それら化合物を、そのcccDNA活性についても検査した。cccDNAをターゲットとする手法は、少なくとも4通り存在する。i) cccDNA産生の防止(ウイルス侵入、又はウイルス侵入後のRC DNAのcccDNAへの変換を阻止することによる)、ii)細胞内変換経路によるcccDNA増幅の低減、iii)エピジェネティックな機序によるcccDNA転写活性のサイレンシング、及びiv) cccDNAミニ染色体を分解に導く不安定化。1番目の機序は、感染細胞におけるcccDNAプールが確立された後で、感染後3日目で開始してすべての化合物が加えられる本研究では適用できない。2番目の機序は、他のHBV関連ウイルス(アヒルB型肝炎ウイルス、DHBV)において観察されているが、この機序が、ヒトにおけるHBVにおいても見出されるかどうかは不明である。3番目の機序(cccDNAサイレンシング)は、すべてのcccDNA下流産物(pgRNA、HBeAg、HBsAg、及びHBV DNA)を減少させるが、PCRベースの方法(dPCR等)及びサザンブロットアッセイによって測定されるcccDNAコピー数は、おそらく減少させない。本発明者らは、dPCRアッセイを使用して、PHHにおいてcccDNAレベルを低減する、IC50が10μM未満である化合物(cccDNA不安定化剤)を同定し、サザンブロットを使用して、その活性を更に確認した。図3Fに、感染後3日目から開始して加えたとき、cccDNAレベルを34〜49%まで低減させたそうした化合物(化合物7及び参考化合物1)の2つの例を示した。要約すると、これらの結果は、HLCアッセイにおけるHTSによって、PHHにおいて臨床HBV分離株に対して活性を有する真のcccDNA不安定化剤が成功裏に同定されたことの概念実証となる。
表現型発見の主要な課題は、ターゲット同定、及び化合物の安全性評価に影響を及ぼしうる化合物の作用様式(MOA)を理解することである(Moffatら、2017)。ほとんどの場合、この情報は、ヒットトリアージが、型通りに化学構造(化学型)クラスタリング及び化合物効力に基づいているとき、HTS後に入手可能でない。小分子は、いくつかのターゲットに結合する場合があり(多重薬理学)、オフターゲットの安全性リスクが増す(Petersら、2012)。分子ターゲットが存在しない状況では、ヒット系列の潜在的な安全性マイナス材料を同定し、必要ならリスク削減戦略を開発するために、ヒット優先順位決定の一環として、トランスクリプトーム又は表現型レベルでの早期の化合物プロファイリングが、表現型発見に有益となる(Moffatら、2017)。
化合物抗ウイルス活性の評価を始めとする、HBV in vitro研究のほとんどは、細胞培養物由来HBV (たとえば、HepG2.2.15由来ウイルス、GT D)に感染させたヘパトーマ細胞株(HepaRG又はHepG2-NTCP)において行われる。cccDNA不安定化剤の評価を、PHHにおいて患者由来HBV GT Dを用いて行ったため(図3F及び図4A〜図4Bを参照されたい)、本発明者らは、他のGTからの患者由来HBV分離株又は細胞培養物由来ウイルス(HepG2.2.15)に対して検査したとき、化合物効力が同様になるかを問うた。最初の論題に対処するために、(384ウェルプレートにおける)PHHに、4種の臨床HBV分離株(GT A〜D、MOI 40)に感染させた。感染後3日目に、細胞を化合物7又はDMSOで1日おきに、感染後10日目に収穫及び分析するまで処理した。いくつかの所見が注目に値する。まず、GTにまたがる臨床HBV分離株は、HLCにおいて(図2Iを参照されたい)、また他者ら(Mabitら、1996; Sozziら2016)によってより早期に認められているとおり、PHHにおけるその複製能力が様々であった。GT A分離株が非常に堅牢な複製を示し、HBsAg及びHBeAgレベルは、それぞれ約370ng/ml及び約58ng/mlに達し、続いてGT C、D、及びB分離株となった(図5Aを参照されたい)。各分離株について、分泌されたウイルス抗原の量は、そのcccDNAレベルとぴったりと一致し、したがって、GT A分離株が、最も多い量のcccDNA (約11,000コピー/ウェル)を有し、続いてGT C、B、及びDとなった(図5Bを参照されたい)。HBV GT間での分泌HBsAg及びcccDNAの量の明確な差が、その感染率の差に起因しているとすることはできず、4種すべての分離株が、PHHにおいてほとんど同等な細胞内HBsAg及びHBcAg染色を示した(図13を参照されたい)。実際に、HBV複製活性とそのタンパク質発現/分泌の不一致は、特にHBV GT B、C、及びDについて、以前に観察されている(Sozziら、2016)。それにもかかわらず、4種すべてのHBV分離株が、化合物7によって等しく阻害された。興味深いことに、化合物7は、種々のHBVマーカーに対して効力の序列を示し、HBV DNA (IC50 0.020〜0.025μM)に対して非常に強力であり、続いてHBsAg及びHBeAg (IC50 0.24〜0.45μM)、pgRNA (IC50 1.48μM)、最後にcccDNA (IC50 6.2〜7.15μM)となった(図5C〜図5D及びTable 5(表9)を参照されたい)。すなわち、cccDNAの直接の測定は、cccDNA不安定化剤の効力を正確に評価するために重要である。次に、本発明者らは、化合物7の抗ウイルス活性が、ウイルス接種材料供給源によって影響されうるかどうかを評価した。ほとんどのHBV in vitro研究は、ヘパトーマ細胞株(たとえば、HepaRG又はHepG2細胞株)において、HepG2由来HBVをウイルス接種材料として利用して行われる。PHH及びHepaRG (Griponら、2002)を、患者又はHepG2.2.15由来HBV (どちらのウイルスもGT Dであることを留意されたい)に感染させ、感染後3日目で開始して化合物7で処理した。化合物7は、PHH及びHepaRGにおいて、検査したMOI(40及び125)の患者由来HBVに対して等しく活性があったが、両方の細胞型においてHepG2.2.15由来ウイルスに対する効力がはるかに弱かった(Table 6(表10))。
世界中で第7位の死因(Stanawayら、2016)であるにもかかわらず、WHOは、ウイルス性肝炎が「最近まで、健康及び開発優先事項として大いに無視されていた」ことを認めた。実際に、世界中で慢性ウイルス性肝炎が診断されるのは、5%未満であり、ウイルス性肝炎個体の約1%だけしか治療を受けていなかった(WHO、2016)。米国(HBV有病率 約129万症例)においてさえ、HBV感染症が診断されるのは35%未満であり、対象となるCHB患者の45%だけしか治療を受けていなかった(Buckley及びStrom、2017)。介入の拡大なしでは、CHB感染症と共生する人の数は、今後40〜50年間、現在の高いレベルのままであり、2015年〜2030年の間に発生する死亡は、累計2千万になると推定されている(WHO 2016)。したがって、HBVを治癒させる地球規模の戦略が必要である(Revillら、2016; WHO、2016)。宿主染色体へのHBV DNA組込み事象は、感染の早期段階の間に起こりうるため(Masonら、2016)、肝臓内のcccDNA及び組み込まれたHBV DNAを含むHBV根絶であると定義される真の治癒は、実現可能でない場合がある(Lokら、2017)。それよりも、ウイルス学的再発及び肝臓疾患進行のリスクなしに治療を休止することが可能になる機能的治癒が、実現可能な目標であると考えられる(Lokら、2017)。機能的治癒は、有限治療過程を完遂後、血清中のHBsAg及びHBV DNAが継続して検出されず、残存する肝傷害の回復、及びHCCのリスクの軽減に徐々につながることであると定義される。cccDNA転写の完全なサイレンシング、cccDNAの排除、及び肝臓損傷の完全な回復を始めとする、いくつかのレベルの機能的治癒がイメージされる(Lokら、2017)。
一次ヒト肝細胞(PHH)における患者由来HBVに対するピロロ[2,3-b]ピラジン化合物の活性
実施例1において記載した手順に従い、式(I)の種々のピロロ[2,3-b]ピラジン化合物を、疾患関連HBVモデルの理想形である、PHHにおけるHBV(患者由来HBV、GT D)に対するその活性について検査した。
Claims (27)
- B型肝炎ウイルス感染の処置における使用のための、以下の式(I)の化合物:
L1は、-CO-N(RL1)-、-N(RL1)-CO-、-CO-、-N(RL1)-、-C(=O)O-、-O-C(=O)-、-SO-、-SO2-、-SO2-N(RL1)-、及び-N(RL1)-SO2-から選択され;
各RL1は、独立に、水素及びC1〜5アルキルから選択され;
R1は、C1〜12アルキル、C2〜12アルケニル又はC2〜12アルキニルであり、前記アルキル、前記アルケニル又は前記アルキニルが、一つ又は複数のR10基で置換され、更に前記アルキル、前記アルケニル又は前記アルキニルが、任意選択で、一つ又は複数のR11基で置換され;
各R10は、独立に、-OH、-O(C1〜5アルキル)、及び少なくとも一つの酸素環原子を有するヘテロシクリルから選択され;
各R11は、独立に、-O(C1〜5アルキレン)-OH、-O(C1〜5アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-SH、-S(C1〜5アルキル)、-S(C1〜5アルキレン)-SH、-S(C1〜5アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-NH2、-NH(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、ハロゲン、C1〜5ハロアルキル、-O-(C1〜5ハロアルキル)、-CF3、-CN、-CHO、-CO-(C1〜5アルキル)、-COOH、-CO-O-(C1〜5アルキル)、-O-CO-(C1〜5アルキル)、-CO-NH2、-CO-NH(C1〜5アルキル)、-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、カルボシクリル、及びヘテロシクリルから選択され、前記カルボシクリル及び前記ヘテロシクリルが、各々任意選択で一つ又は複数のR12基で置換され;更に同じ炭素原子に結合する任意の二つのR11基が、任意選択で、それらが結合する炭素原子と一緒に、5から8員の炭素環式又は複素環式環を形成してもよく、前記5から8員の炭素環式又は複素環式環が、任意選択で、一つ又は複数のR12基で置換され;
各R12は、独立に、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、及び-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)から選択され;
R2は、水素、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリル、及び-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルから選択され、前記-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリルのカルボシクリル部分及び前記-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルのヘテロシクリル部分が、各々任意選択で一つ又は複数のR12基で置換され;
R3は、水素、C1〜5アルキル、及び-CO(C1〜5アルキル)から選択され;
R4及びR5は、各々独立に、水素、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリル、及び-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルから選択され、前記-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリルのカルボシクリル部分及び前記-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルのヘテロシクリル部分が、各々任意選択で一つ又は複数のR12基で置換される)
又はその薬学的に許容される塩。 - L1が-CO-N(RL1)-である、請求項1に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
- R1がC2〜10アルキルであり、前記アルキルが一つ又は複数のR10基で置換され、更に前記アルキルが任意選択で一つ又は複数のR11基で置換される、請求項1又は2に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
- R1が-C(R13)(R13)-C(R13)(R13)-R10であり、各R13が独立に、水素、メチル、及びエチルから選択され、各R13が任意選択で一つ又は複数のR10基で置換され、各R13が任意選択で一つ又は複数のR11基で更に置換される、請求項1又は2に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
- 各R10が-OHである、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
- 各R11が独立に、-SH、-S(C1〜5アルキル)、-NH2、-NH(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、ハロゲン、C1〜5ハロアルキル、-O-(C1〜5ハロアルキル)、-CF3、及び-CNから選択され;更に同じ炭素原子に結合する任意の二つのR11基が、任意選択で、それらが結合する炭素原子と一緒に、飽和の5又は6員の炭素環式又は複素環式環を形成してもよく、前記飽和の5又は6員の炭素環式又は複素環式環が、任意選択で、一つ又は複数のR12基で置換される、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
- R2及びR3が各々水素である、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
- R4及びR5の一つがカルボシクリル又はヘテロシクリルであり、前記カルボシクリル又は前記ヘテロシクリルが任意選択で一つ又は複数のR12基で置換され、R4及びR5の他方の一つが水素、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリル、及び-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルから選択され、前記-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリルのカルボシクリル部分及び前記-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルのヘテロシクリル部分が、各々任意選択で一つ又は複数のR12基で置換される、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
- R5がシクロプロピルである、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
- R4が水素である、請求項1から9のいずれか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
- 以下の式(II)の化合物である、請求項1に記載の使用のための化合物:
又はその薬学的に許容される塩。 - 以下の式のいずれか一つを有する化合物、又はその薬学的に許容される塩である、請求項1に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
- 以下の式のいずれか一つを有する化合物、又はその薬学的に許容される塩である、請求項1に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
- 以下の式の化合物である、請求項1に記載の使用のための化合物:
- 請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩、及び任意選択で薬学的に許容される添加剤を含む、B型肝炎ウイルス感染の処置における使用のための医薬組成物。
- B型肝炎ウイルス感染の処置におけるcccDNA阻害剤としての使用のための、請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物若しくはその薬学的に許容される塩又は請求項15に記載の医薬組成物。
- B型肝炎ウイルス感染の処置の医薬の調製における、請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の使用。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物若しくはその薬学的に許容される塩、又は請求項15に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、B型肝炎ウイルス感染を処置する方法。
- 前記B型肝炎ウイルス感染が、慢性肝炎Bウイルス感染である、請求項1から14又は16のいずれか一項に記載の使用のための化合物若しくはその薬学的に許容される塩、又は請求項15又は16に記載の使用のための医薬組成物又は請求項17に記載の使用又は請求項18に記載の方法。
- B型肝炎ウイルス再活性化の処置又は抑制における使用のための、請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物若しくはその薬学的に許容される塩、又は請求項15に記載の医薬組成物。
- B型肝炎ウイルス再活性化の処置又は抑制のための医薬の調製における、請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の使用。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物若しくはその薬学的に許容される塩、又は請求項15に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、B型肝炎ウイルス再活性化を処置又は抑制する方法。
- 処置される対象がヒトである、請求項1から14、16、19又は20のいずれか一項に記載の使用のための化合物若しくはその薬学的に許容される塩、又は請求項15、16、19又は20のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物又は請求項17、19又は21のいずれか一項に記載の使用又は請求項18、19又は22のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩のB型肝炎ウイルスcccDNAの阻害剤としてのインビトロ使用。
- B型肝炎ウイルス(HBV)cccDNAの阻害剤を同定する方法であって:
HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞を用意する工程;
検査化合物を、HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞に供試する工程;
感染した幹細胞由来肝細胞様細胞中のHBsAg及びHBeAgに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程;
任意選択で、感染した幹細胞由来肝細胞様細胞中のアルブミンに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程及び検査化合物がアルブミンを阻害することが見出された場合、その化合物を更なる検査から除く工程;
検査化合物がHBsAg及びHBeAgを阻害することが見出された場合、HBV pgRNAに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程;
検査化合物がHBV pgRNAを阻害することが見出された場合、HBV cccDNAに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程;及び
検査化合物がHBV cccDNAを阻害することが見出された場合、HBV cccDNAの阻害剤として検査化合物を選択する工程を含む方法。 - HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞を用意する工程が:
人工多能性幹細胞を、化合物MB-1又はMB-2又は薬学的に許容されるその塩で処置して、
このように得られた細胞を、臨床HBV単離体に感染させて、HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞を得る工程を含む、請求項25に記載の方法。 - 幹細胞由来肝細胞様細胞が、少なくともHBVゲノタイプA、B、C及びDからの臨床HBV単離体に感染される、請求項25又は26に記載の方法。
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