JP2021505654A - Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の処置のためのｃｃｃＤＮＡ阻害剤としてのピロロ［２，３−ｂ］ピラジン化合物 - Google Patents

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の処置のためのｃｃｃＤＮＡ阻害剤としてのピロロ［２，３−ｂ］ピラジン化合物 Download PDF

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Abstract

本発明は、B型肝炎ウイルス(HBV)感染に対する新規治療剤、特にHBV治癒に対して鍵となる障壁であるウイルスの共有結合性閉環状DNA(cccDNA)の阻害剤に関する。したがって、本発明は、HBV感染の処置における使用のための、本明細書に記載及び定義されるような、式(I)のピロロ[2,3-b]ピラジン化合物を提供する。本明細書に提供される化合物は、HBV感染に対して高い効力があり、特に慢性HBV感染及びHBVリバウンドの治療の改善を可能にする。本発明は更に、HBV感染に対する治療剤(特にcccDNA阻害剤)の同定のための、新規スクリーニングアッセイに関し、これは患者由来のHBVに感染後の完全なHBV生活環を再現する肝細胞様細胞で実施される。

Description

本発明は、B型肝炎ウイルス(HBV)感染に対する新規治療剤、特にHBV治癒に対して鍵となるウイルス学的な障壁を代表するウイルスの共有結合性閉環状DNA(cccDNA)の阻害剤に関する。したがって、本発明は、HBV感染の処置における使用のための、本明細書に記載及び定義されるような、式(I)のピロロ[2,3-b]ピラジン化合物を提供する。本明細書に提供される化合物は、HBV感染に対して高い効力があり、特に慢性HBV感染及びHBVリバウンドの治療の改善を可能にする。本発明は更に、HBV感染に対する治療剤(特にcccDNA阻害剤)の同定のための、新規スクリーニングアッセイに関し、これは、患者由来のHBVに感染後の完全なHBV生活環を再現する、肝細胞様細胞で実施される。
慢性肝炎Bウイルス(CHB)感染は、世界中で約24800万人の個体が影響を受け、毎年約686,000人の死亡を引き起こしている(GBD2013;Schweitzerら、2015)。長期研究は、高いウイルス負荷が、肝硬変、肝臓癌(HCC)、及び死亡率の発生率の増加と関連することを示した(Chenら2006;Iloejeら、2006;Iloejeら、2007;Liuら、2016)。したがって、利用可能な治療的処置(curative treatment)なしでは、大多数のCHB感染個体は、肝硬変及び/又は肝臓癌を発生するリスクがある。
現在の標準ケア(SOC)処置は、B型肝炎ウイルス(HBV)DNA複製を効率的に抑制するが、治癒力はなく、その理由は、ウイルスの遺伝的な鋳型、すなわち共有結合性閉環状DNA(cccDNA)を標的としないからであり、これがHBV治癒のウイルス学的な障壁である。cccDNAは、感染した肝細胞の核に存在し、増殖性感染に必要とされる全てのHBV RNA転写物を生じ、CHB感染の自然経過の間のウイルス持続性に関与する(Locarnini及びZoulim、2010)。cccDNAは、SOCでの処置の休止後のウイルスリバウンド、免疫抑制剤での処置後又は肝臓移植後のウイルス再活性化の源である(Nassal、2015;Kumarら、2016)。結果的に、cccDNAを標的とする新規治療が、非常に必要とされる。
しかしながら、cccDNA阻害剤を同定する創薬に取り組むことは難題である。HBVはインビトロでの増殖が不十分であり、cccDNAを発現させるために操作された肝細胞腫細胞株などの代理モデル(Ladnerら、1997;Guoら、2007)は非常に低い効率のcccDNA形成を患い、HBV導入遺伝子(cccDNAではない)が優性な転写鋳型として作用する(Nassal、2015、Zhangら、2016)。cccDNA阻害剤を発見するための、そのようなシステムの使用は、化合物がcccDNA(導入遺伝子ではなく)に作用するかどうかを確認するための、より関連性のあるアッセイにおけるいくつかのカウンタースクリーニングを要する。
さらに、既存のHBVシステムはHBVゲノタイプ(GT)多様性を捕捉しない、その理由は、それらが主に一つのGTに基づいているからである。世界中で、HBVは、約40サブタイプを有する10GTとして存在し;各GTは、地理的分布、伝播様式、及びウイルス学的な特徴の観点から区別される特性を有している。HBV GTは、HBVの病因における重要なパラメータの一つであり、その理由は、それがウイルス性の病因、疾患進行、処置(例えば、インターフェロン-α)への応答、及び肝硬変及びHCCの発生についてのリスク因子に影響するからである(Busterら、2009;Lin及びKao、2017;Rajoriyaら、2017)。
上に説明したように、既存のHBVシステムは、特定のHBV GTの研究室株に主に依存していることから、インビボでHBV GT多様性を捕捉しない。臨床HBV単離体の代わりに研究室株を創薬の取り組みに使用することにより、「現実世界」のHBVに対する化合物の効力を過剰評価することにもつながりかねない。更に、これらのシステムは、ヒト肝細胞に対する類似点が乏しいことが示されているHepG2細胞株などの肝細胞腫細胞株に主に基づいている(Uhlenら、2015)。
したがって、ハイスループットスクリーニング(HTS)に適切であるだけでなく、「現実世界」の病原体(すなわち、様々なGTからの臨床HBV単離体)に対する化合物の効力の範囲を評価することにも受け入れられるHBVアッセイを提供することが非常に望ましい。集合的に、新規cccDNA阻害剤を同定する、改善されたHBVシステムに対する差し迫った必要性がある。そのようなアッセイは、四つの目立った特徴を、理想的には有するべきである、すなわちi)頑健性、ii)自然感染後の完全なウイルス生活環を再現する、iii)臨床HBV単離体に対して化合物をスクリーニングすることにも受け入れられる、及びiv)生理的な細胞タイプ、例えば、初代細胞又は幹細胞での実施。後者は、前臨床の所見のクリニックへの移動可能性(translatability)を増加させる重大なパラメータの一つとして考えられる(Eglen及びReisine、2011;Vincentら、2015)。
しかしながら、実際には、限定的な供給、急速な脱分化、及び初代ヒト肝細胞(PHH)のドナー間の変動性により、それらをHTSプラットフォームとして不適切なものにしている(Frazcekら、2013;Mabitら、1996)。この関連で、人工多能性幹細胞(iPS)は、それらの複数の疾患関連性細胞タイプに分化する能力及びそれらの自己再生の可能性に起因するPHHに関する代理として大きい将来性を保持している(Eglen及びReisine、2011;Shiら、2017;Ursuら、2017)。
HBV cccDNA阻害剤を同定するスクリーニングアッセイは、例えば、Cai Dら、Antiviral Res、2016、132:26-37及びCai Dら、Antimicrob Agents Chemother、2012、56(8):4277-88に記載されている。しかしながら、対応するスクリーニング方法は、cccDNAに対する代理モデルとして組換えHepG2細胞株を使用し;そのようなシステムから同定された任意の化合物が、より関連性のあるシステム、すなわちPHHにおいて臨床HBV単離体のcccDNAを阻害することがバリデートされているかどうかは知られていない。特定のピロロピラジン化合物は、自己免疫性及び炎症性疾患の処置のためのJAK及びSYK阻害剤としてWO2011/144585に記載されている。
本発明の文脈において、新規疾患関連アッセイ、すなわち、四(4)つの主要なGT(A-D)からの臨床HBV単離体を感染させた幹細胞由来肝細胞様細胞(本明細書では、HLCと呼ばれる)又はPHHが開発された。これは、患者由来のHBV感染後の完全なHBV生活環を再現する、初代様細胞で実施される最初のHTSである。このアッセイでは、PHHにおける早期ヒットバリデーションを含む、反復性スクリーニングカスケードにより、自然感染の設定で捕らえにくいHBV cccDNAを標的とする化合物の同定につながった。このアプローチは、iPS由来肝細胞様細胞(HLC)が、HBV治癒に対して鍵となる障壁である、新規のcccDNA阻害剤を発見するためのパラダイム変化を提示することを実証した。
このHBV創薬のためのHLCプラットフォームを成功裏に使用して、約247,000化合物のライブラリーのHTS後に、新規且つ強力なcccDNA阻害剤が発見された。実施例1にも記載されているように、カスタムスクリーニングカスケードを設計して、cccDNAの阻害剤が、その大量の転写産物(HBsAg>>>HBeAg>>pgRNA>cccDNA)によって順次同定することができることを基礎にして、感染細胞中のcccDNAの特有の低いレベル(0.1-1コピー/細胞)に対処した。したがって、マルチプレックスアッセイ(HBsAg、HBeAg、及びアルブミン)を、一次HTS読取りとして使用して、二重HBsAg及びHBeAg阻害剤を同定し、非特異的/毒性化合物(アルブミンが、カウンター毒物スクリーニングである)を除外した。ヒットを、続いてpgRNA(cccDNA転写活性の代理読取り)に対して、また新規のcccDNAベースのデジタルPCRアッセイ(dPCRアッセイ)によって最終的に検査した。このアプローチの利点は、384ウェルプレート(HTSのための共通のプレート形式)中に存在する低量の細胞(約30,000細胞)を使用してcccDNAにおける化合物活性の直接的な評価が可能になることである。dPCRアッセイにおいて活性な化合物は、次に、cccDNA検出についてバリデートされた方法であるが、感受性が低く、dPCRと比較して約15倍量の細胞を必要とする、サザンブロットアッセイで確認される。
このアプローチにより、新規HBV阻害剤、特に新規cccDNA阻害剤が成功裏に同定され、これは、PHHにおける主要なGT(A-D)からの患者由来HBVのcccDNAに対して示されたような、少なくとも部分的なcccDNA分解を誘発する。様々なHBVマーカーに対する化合物の効力の分析は、化合物が、HBsAg及びHBeAgに対して高い効力がありうるが、その効力(HBsAg及びHBeAg IC50)が、必ずしもそのcccDNA IC50と相関するとは限らないことを実証しており、cccDNA阻害剤の効力の正確な評価についてcccDNAの直接的な測定の重要性を強調している。加えて、細胞培養由来HBVに対して及び/又は非PHH細胞において検査したときに化合物の効力が異なりうるとの事実は、インビボでの条件を良く模倣して、それらのクリニックへの移動可能性を増加させる、疾患関連アッセイにおいて検査される化合物の重要性を際立たせる。
WO2011/144585 WO2014/140058 US2015/0197726 US2015/0158840
Cai Dら、Antiviral Res、2016、132:26-37 Cai Dら、Antimicrob Agents Chemother、2012、56(8):4277-88 Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、Pharmaceutical Press、22nd edition
したがって、本発明は、上で考察した必要性に対処する疾患関連性スクリーニングアッセイ、特にHLCにおける臨床単離体を使用して、完全なHBV生活環を再現し、HBV感染に対する強力な治療剤、すなわちHBV cccDNAの阻害剤の同定を可能にする、ハイスループットスクリーニングアッセイを提供するとの課題を解決する。同様に、本発明は、HBV感染の処置のための新規及び/又は改善された治療剤、特に、慢性HBV感染の治療的処置における及びHBV再活性化/リバウンドの処置又は抑制におけるものを含む、cccDNA阻害剤として作用し、故に、HBVに対して高度に有効である化合物を提供するとの課題を解決する。
したがって、本発明は、B型肝炎ウイルス感染の処置における使用のための、以下の式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩を提供する:
式(I)において、L1基は、-CO-N(RL1)-、-N(RL1)-CO-、-CO-、-N(RL1)-、-C(=O)O-、-O-C(=O)-、-SO-、-SO2-、-SO2-N(RL1)-、及び-N(RL1)-SO2-から選択される。
各RL1は独立に、水素及びC1〜5アルキルから選択される。
R1はC1〜12アルキル、C2〜12アルケニル又はC2〜12アルキニルであり、前記アルキル、前記アルケニル又は前記アルキニルは一つ又は複数のR10基で置換され、更に前記アルキル、前記アルケニル又は前記アルキニルは任意選択で一つ又は複数のR11基で置換される。
各R10は、独立に、-OH、-O(C1〜5アルキル)、及び少なくとも一つの酸素環原子を有するヘテロシクリルから選択される。
各R11は、独立に、-O(C1〜5アルキレン)-OH、-O(C1〜5アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-SH、-S(C1〜5アルキル)、-S(C1〜5アルキレン)-SH、-S(C1〜5アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-NH2、-NH(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、ハロゲン、C1〜5ハロアルキル、-O-(C1〜5ハロアルキル)、-CF3、-CN、-CHO、-CO-(C1〜5アルキル)、-COOH、-CO-O-(C1〜5アルキル)、-O-CO-(C1〜5アルキル)、-CO-NH2、-CO-NH(C1〜5アルキル)、-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、カルボシクリル、及びヘテロシクリルから選択され、前記カルボシクリル及び前記ヘテロシクリルは、各々任意選択で一つ又は複数のR12基で置換され;更に(存在する場合)同じ炭素原子に結合する任意の二つのR11基は、任意選択で、それらが結合する炭素原子と一緒に、5から8員の炭素環式又は複素環式環を形成してもよく、前記5から8員の炭素環式又は複素環式環は、任意選択で、一つ又は複数のR12基で置換される。
各R12は独立に、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、及び-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)から選択される。
R2は、水素、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリル、及び-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルから選択され、前記-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリルのカルボシクリル部分及び前記-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルのヘテロシクリル部分は、各々任意選択で一つ又は複数のR12基で置換される。
R3は、水素、C1〜5アルキル、及び-CO(C1〜5アルキル)から選択される。
R4及びR5は、各々独立に、水素、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリル、及び-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルから選択され、前記-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリルのカルボシクリル部分及び前記-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルのヘテロシクリル部分は、各々任意選択で一つ又は複数のR12基で置換される。
本発明は、B型肝炎ウイルス感染の処置における使用のための医薬組成物であって、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩及び任意選択で薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物を更に提供する。
同様に、本発明は、B型肝炎ウイルス感染の処置のための医薬の調製における、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩の使用に関する。
更に、本発明は、B型肝炎ウイルス感染を処置する方法であって、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩(又は式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む、及び任意選択で薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物)を、必要とする対象(例えば、ヒト)に投与する工程を含む方法を提供する。特に、方法は、治療的有効量の式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩の対象への投与を含む。
本発明による化合物は、HBV再活性化/リバウンドの抑制も含む、HBV感染の治療に非常に有利である。特に、本発明は、ウイルスcccDNAの阻害剤、すなわち、HBV cccDNA安定性及び/又はその転写活性を阻害することから、HBV治癒の可能性を提供する治療剤を提供する。更に、本発明の化合物は、実際の臨床条件下で特に有効であると考えられる、その理由は、添付の実施例で、四つの主要なHBVゲノタイプに対する例示的な式(I)の化合物の強力な有効性が実証されたことも確認されているからである。
したがって、本発明は特に、B型肝炎ウイルス(HBV)感染の処置におけるcccDNA阻害剤としての使用のための、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩(又は式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩、及び任意選択で薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物)に関する。同様に、本発明は、HBV cccDNAを阻害することによる、HBV感染の処置における使用のための、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩(又は対応する医薬組成物、すなわち、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩、及び任意選択で薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物)を指す。更に、本発明は更に、HBV cccDNAを不安定化することによる、HBV感染の処置における使用のための、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩(又は対応する医薬組成物)に関する。
本発明に従って処置されるB型肝炎ウイルス感染は、特に限定されない。例えば、それは、任意の一つ又は複数の肝炎Bウイルスゲノタイプ、例えば、HBV/A(すなわち、肝炎BウイルスゲノタイプA)、HBV/B、HBV/C、HBV/D、HBV/E、HBV/F、HBV/G、HBV/H、HBV/I、及び/又はHBV/J、特に任意の一つ又は複数のHBV/A、HBV/B、HBV/C、HBV/D、及び/又はHBV/E、より好ましくは任意の一つ又は複数のHBV/A、HBV/B、HBV/C、及び/又はHBV/Dでの感染(又は、それにより引き起こされる感染症)であってもよい。一方、処置されるHBV感染は、更に、例えば、急性HBV感染又は慢性HBV感染であってもよく、本発明は、特に、慢性HBV感染(任意の一つ又は複数の前述のHBVゲノタイプ、例えば、HBV/A、HBV/B、HBV/C、HBV/D、HBV/E、HBV/F、HBV/G、HBV/H、HBV/I、及び/又はHBV/Jでの慢性感染、又はそれにより引き起こされる慢性感染症を含む)の処置に関する。本発明に従って処置されるHBV感染はまた、劇症性(又は重篤な)HBV感染であってもよい。更に、本発明はまた、免疫不全及び/又はHIV陽性対象における又は免疫抑制された対象(特に対応するヒト対象)におけるHBV感染(特に、任意の前述の特定のタイプのHBV感染を含む)の処置に関する。
HBVでの感染後、特に標準ケア薬(standard of care medication)でのHBV感染の処置後、HBV遺伝鋳型(すなわち、cccDNA)は、対象の体中に依然として持続し、これによりHBV感染の再活性化又は再発に最終的につながる可能性がある。HBV再活性化(又はHBV再発、又はHBVリバウンド)の現象は、医学分野において周知されており、HBV患者にとって重大なリスクを代表している(例えば、Roche Bら、Liver Int、2011、31 Suppl 1:104-10;Mastroianni CMら、World J Gastroenterol、2011、17(34):3881-7;又はVierling JM、Clin Liver Dis、2007、11(4):727-59を参照されたい)。本発明は、ウイルスcccDNAを標的とすることができることから、HBV cccDNAを阻害すること又は不安定化することによってHBV感染を治癒することを可能にできる化合物を提供する。したがって、本発明はまた、本明細書に提供されるcccDNA阻害剤、特に式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩を使用するHBV再活性化(又はHBV再発又はリバウンド)の処置又は抑制に関する。
したがって、本発明はまた、HBV再活性化の処置又は抑制における使用のための、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩(又は対応する医薬組成物、すなわち、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩、及び任意選択で薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物)に関する。同様に、本発明は、HBV再発(又はHBV感染の再発)の処置又は抑制における使用のための、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩(又は対応する医薬組成物)を提供する。本発明は、更に、HBVリバウンド(又はHBV感染のリバウンド)の処置又は抑制における使用のための、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩(又は対応する医薬組成物)を指す。本発明に従うHBV再活性化(又はHBV再発、又はHBVリバウンド)の処置又は抑制には、特に、HBV再活性化(又はHBV再発又はリバウンド)の予防的処置(すなわち、予防)が含まれる。さらに、本発明は、HBV再活性化の処置又は抑制のための、又はHBV再発の処置又は抑制のための、又はHBVリバウンドの処置又は抑制のための、医薬の調製における式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩(又は対応する医薬組成物)の使用を指す。更に、同様に、本発明は、HBV再活性化(又はHBV再発、又はHBVリバウンド)を処置する又は抑制する方法であって、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩(又は対応する医薬組成物)を、必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。
さらに、本発明は、研究におけるB型肝炎ウイルスcccDNAの阻害剤として(すなわち、HBV cccDNA阻害剤として)、特に、HBV cccDNAを阻害する研究ツール化合物としての、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩の使用に関する。したがって、本発明は、HBV cccDNA阻害剤としての式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩のインビトロ使用、特に、HBV cccDNA阻害剤として作用する研究ツール化合物としての式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩のインビトロ使用を指す。同様に、本発明は、HBV cccDNAを阻害する(例えば、HBV cccDNAを不安定化する又はサイレンシングする)方法(特に、インビトロ方法)であって、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩の適用を含む方法に関する。本発明は更に、HBV cccDNAを阻害する方法であって、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩を、検査試料(例えば、生物学的試料)又は検査動物(すなわち、非ヒト検査動物)に適用する工程を含む方法に関する。本発明はまた、試料(例えば、生物学的試料)中のHBV cccDNAを阻害する方法(特に、インビトロ方法)であって、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩を前記試料に適用する工程を含む方法を指す。本発明は更に、HBV cccDNAを阻害する方法であって、検査試料(例えば、生物学的試料)又は検査動物(すなわち、非ヒト検査動物)を、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩と接触させる工程を含む方法を提供する。用語「試料」、「検査試料」及び「生物学的試料」には:細胞、細胞培養物又は細胞若しくは細胞内抽出物;動物(例えば、ヒト)から得られる生検物質、又はその抽出物;又は血液、血清、血漿、唾液、尿、糞便、又は任意の他の体液、又はその抽出物が含まれるが、それに限定されない。用語「インビトロ」が、「生きているヒト又は動物体の外側」の意味で、この特定の文脈において使用されることが理解され、これには、特に、水溶液又は培養培地などの人工的な環境中の細胞、細胞又は細胞内抽出物、及び/又は生物学的分子で実施された実験が含まれる、これは、例えば、フラスコ、試験管、ペトリ皿、マイクロタイタープレート中に提供されてもよい。
本発明はまた、HBV cccDNAの阻害剤を同定する方法であって:
HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞を用意する工程;
検査化合物を、HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞に供試する工程;
感染した幹細胞由来肝細胞様細胞中のHBsAg及びHBeAgに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程;
任意選択で、感染した幹細胞由来肝細胞様細胞中のアルブミンに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程及び検査化合物がアルブミンを阻害することが見出された場合、その化合物を更なる検査から除く工程;
検査化合物がHBsAg及びHBeAgを阻害することが見出された場合、HBV pgRNAに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程;
検査化合物がHBV pgRNAを阻害することが見出された場合、HBV cccDNAに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程;及び
検査化合物がHBV cccDNAを阻害することが見出された場合、HBV cccDNAの阻害剤として検査化合物を選択する工程を含む方法を提供する。
このスクリーニング方法は、HBV cccDNAの阻害剤、特に、HBV cccDNAを不安定化する能力のある化合物(すなわち、HBV cccDNA不安定化剤)の同定を可能にすることに高度に有利であり、完全なHBV生活環を再現し、複数のHBVゲノタイプの臨床HBV単離体を使用し、それによって「現実世界」に見出されるHBVゲノタイプ多様性を良好に捕捉する、生理的なシステムを使用する。この方法で同定される化合物は、式(I)の化合物に関連する本明細書に記載のように、HBV治療に使用することができる。特に、このように同定されるHBV cccDNA阻害剤は、HBV感染(例えば、慢性HBV感染を含む)の処置(又は治癒)又はHBV再活性化(又はHBVリバウンド又は後退)の処置又は抑制に使用することができる。このスクリーニング方法はまだ、HBV cccDNAの阻害剤を同定するインビトロ方法と呼んでもよい。
上記のように、この方法は、HBV(好ましくは、患者由来HBV)に感染した幹細胞由来肝細胞様細胞を用意する工程を含む。肝細胞様細胞は、幹細胞、特に人工幹細胞、より好ましくは人工多能性幹細胞(iPS)に由来する。対応する幹細胞(例えば、人工多能性幹細胞)は、哺乳動物細胞(例えば、マウス細胞)であってもよい、好ましくは、ヒト細胞である(又はヒト細胞から作製された)。したがって、用語「幹細胞由来肝細胞様細胞」は、肝細胞(又は、換言すれば、肝細胞様細胞)に分化/成熟した幹細胞(特に人工多能性幹細胞)を指し、「幹細胞由来肝細胞」又は「幹細胞から得られた肝細胞」又は「幹細胞から得られた肝細胞様細胞」と同義で本明細書に使用される。
HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞は、好ましくは、患者由来HBVに感染し、特に臨床試料から単離されたHBVに感染する。HBV(又は患者由来HBV)は任意のゲノタイプ(GT)であってもよいが、二つ又はそれ以上のセットの幹細胞由来肝細胞様細胞が使用され、ここで、各セットの細胞は異なるHBV GTに感染し、より好ましくは少なくとも四セットの幹細胞由来肝細胞様細胞が使用され、これが、患者由来HBV GTのそれぞれA、B、C及びDに感染することが好ましい。
HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞を用意する工程は、好ましくは、以下を含む(すなわち、好ましくは、以下の工程を実行することによって行われる):
幹細胞(好ましくは、多能性幹細胞、より好ましくは人工多能性幹細胞)を、WO2014/140058に開示される化合物(好ましくは、以下に記載されるような化合物MB-1又はMB-2、又は薬学的に許容されるその塩)で処置して、幹細胞由来肝細胞様細胞を得る工程;及び
このように得られた細胞を、HBV(好ましくは、患者由来HBV、より好ましくは患者由来HBVのGT A、B、C又はD)に感染させて、HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞を得る工程。
上述の「WO2014/140058に開示される化合物」は、WO2014/140058に記載される及び規定されるような式Iのいずれかの化合物であってもよく、この文書に記載される特定の/例示的な化合物のいずれか一つ又はこれらの化合物のいずれか一つの薬学的に許容される塩を含む。対応する化合物はまた、US2015/0197726及びUS2015/0158840に記載される。好ましくは、「WO2014/140058に開示される化合物」は、以下の化合物MB-1からMB-7又は薬学的に許容されるその塩のいずれか一つである:
化合物はまた、上に記載される化合物MB-1、MB-2又はMB-3、又は薬学的に許容されるその塩のいずれか一つの立体異性体、特に鏡像異性体又はジアステレオマーであってもよい。より好ましくは、化合物は、MB-1又はMB-2、又は薬学的に許容されるその塩であり、さらにより好ましくは、MB-1又は薬学的に許容されるその塩である。
したがって、幹細胞(又は人工多能性幹細胞)を、化合物MB-1又はMB-2又は薬学的に許容されるその塩(さらにより好ましくは、化合物MB-1又は薬学的に許容されるその塩)で処置して、幹細胞由来肝細胞様細胞を得ること、及びこのように得られた細胞を、HBV(好ましくは、HBVゲノタイプA、B、C又はDの臨床HBV単離体)に感染させて、HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞を得ることが特に好ましい。
幹細胞由来肝細胞様細胞の別個のセットは、各々個々にHBVの異なるゲノタイプに感染させることが好ましい。好ましくは、細胞のセットは、二つ又はそれ以上のHBVゲノタイプ、より好ましくは三つ又はそれ以上のHBVゲノタイプ、より好ましくは四つ又はそれ以上のHBVゲノタイプ、さらにより好ましくは五つ又はそれ以上のHBVゲノタイプ、及びなおさらにより好ましくは六つ又はそれ以上のHBVゲノタイプに感染させる。HBVゲノタイプは、HBVゲノタイプA、B、C、D、E、F、G、H、I及びJから、好ましくはHBVゲノタイプA、B、C、D、E及びFから選択されてもよい。幹細胞由来肝細胞様細胞の別個のセットが、少なくともHBVゲノタイプA、B、C及びDからの臨床HBV単離体に、並びにさらにより好ましくは少なくともHBVゲノタイプA、B、C、D、E及びFからの臨床HBV単離体に個々に感染させることが特に好ましい。検査化合物は、いくつかの異なるHBV GTを検査するために、各々の様々なセットの幹細胞由来肝細胞様細胞(各セットの細胞はHBVの異なる特定のGTに感染されている)に供試することができる。したがって、細胞が全てのHBVゲノタイプでの感染に受け入れられるであろうが、検査する化合物にとって、一つのセットの細胞が僅かに一つのゲノタイプに感染させることが好ましく、例えば、10の異なる感染実験が、化合物を全ての10のHBVゲノタイプに対して検査するために必要とされるであろう。
方法は、検査化合物をHBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞(好ましくは、少なくとも四セットの幹細胞由来肝細胞様細胞、前記セットの細胞は、患者由来HBVのそれぞれゲノタイプA、B、C、及びDに感染されている)に供試する工程を更に含む。典型的に、複数の検査化合物(例えば、少なくとも約100検査化合物、又は少なくとも約1000検査化合物、又は少なくとも約10,000検査化合物、又は少なくとも約100,000検査化合物)が、感染した幹細胞由来肝細胞様細胞に同時に供試される。原理的には、任意の化合物が、特に小さな分子の化合物(例えば、約900Da以下の分子量、好ましくは約500Da以下の分子量を有する化合物)を含む、検査化合物として用いることができる。
方法は、検査化合物(又は複数の検査化合物)を、HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞に供試する工程後に、工程のカスケードを含み、ここで、(i)HBsAg及びHBeAg、(ii)pgRNA、及び(iii)cccDNAに対するそれぞれの検査化合物の阻害効果(又は阻害活性)は、HBV感染幹細胞由来肝細胞様細胞を使用して決定される(図3B、図14A及び図14Bにも例示される)。これらのHBV感染マーカー/標的に対する検査化合物の阻害効果の逐次決定により、HBsAg及びHBeAgの両方を阻害する検査化合物だけを最初に選択し(一方、HBsAg及びHBeAgを阻害しない任意の検査化合物を、更なる検査から除く)、次にpgRNAも追加的に阻害する検査化合物だけを選択し(一方、pgRNAを阻害しない任意の検査化合物を、更なる検査から除く)、次にcccDNAも阻害する検査化合物だけを選択することが可能になる。HBsAg及びHBeAg、pgRNA、及び/又はcccDNAに対する検査化合物の阻害効果を、例えば、実施例1に記載されるように、決定することができる。特に、ウイルスタンパク質HBsAg及びHBeAgの発現及び/又は分泌に対する検査化合物の効果を、HBsAg及びHBeAgに対する化合物の阻害効果を決定するために評価することができる。更に、例えば、細胞上清又は細胞溶解産物における、HBVプレゲノムRNA(pgRNA)レベルに対する検査化合物の効果を、pgRNAに対する化合物の阻害効果を決定するために評価することができる。cccDNAに対する検査化合物の阻害効果を、例えば、細胞溶解産物におけるcccDNAレベル(cccDNAコピー数)に対する検査化合物の効果を評価することによって同様に決定することができる;これは、例えば、特にデジタルPCRによるPCRベースのアッセイを使用することによって(例えば、実施例1に記載されるように)行うことができる。
方法は、任意選択で、感染した幹細胞由来肝細胞様細胞中のアルブミンに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程及び検査化合物がアルブミンを阻害することが見出された場合、その化合物を更なる検査から除く工程を含んでもよい。この工程は、(例えば、実施例1に記載されるように、マルチプレックスアッセイを使用して)HBsAg及びHBeAgに対する検査化合物の阻害効果を決定する上で考察した工程と同時に行うことができ、非特異的な及び/又は毒性化合物を、更なる検査から除くのに有利であることから、安全及び良好な忍容性のcccDNA阻害剤を同定する/得ることが可能になる。
方法は、検査化合物をPHH(幹細胞由来肝細胞様細胞に関して本明細書に記載されるように、HBVにも感染した)に供試する工程並びに検査化合物の活性を確認するために、(i)HBsAg及びHBeAg、及び/又は(ii)pgRNA、及び/又は(iii)cccDNAに対するその阻害効果を決定する工程を更に含んでもよい。細胞の利用可能性に応じて、PHH検査は、検査化合物が、幹細胞由来肝細胞様細胞中のHBsAg及びHBeAgに対して二重活性を示すことが見出された後、又は幹細胞由来肝細胞様細胞中のpgRNAに対して活性を示すことが見出された後、又は幹細胞由来肝細胞様細胞中のcccDNAに対して活性を示すことが見出された後に開始することができる。したがって、例えば、検査化合物が、幹細胞由来肝細胞様細胞中のHBsAg及びHBeAgに対して二重活性を示すことが見出されるが、PHHでは見出されない場合、その化合物は、更なる検査から除くことができる。
この方法でHBV cccDNAを阻害することが見出された検査化合物は、HBV cccDNAの阻害剤として、特にHBV cccDNA不安定化剤として選択/同定することができる。また、上で記載した方法を使用して、HBV感染に対する、より広い範囲の高度に強力な治療剤を同定することができ、これには、cccDNAの転写を低減、阻害又はサイレンシングするが、必ずしもHBV cccDNAを不安定化(又は、の分解を誘発)しない化合物が含まれる。したがって、検査化合物が(この方法を使用して)HBV pgRNAを阻害することが見出された場合、その化合物を、HBV感染に対する治療剤として選択することができる。要約すると、この方法により、cccDNA不安定化剤だけでなく、潜在的なcccDNAサイレンサーも同定することが可能になる。対応する方法は、HBV感染に対する治療剤を同定する方法と呼んでもよい。
式(I)の化合物は、以下により詳細に記載される:
式(I)において、L1基は、-CO-N(RL1)-、-N(RL1)-CO-、-CO-、-N(RL1)-、-C(=O)O-、-O-C(=O)-、-SO-、-SO2-、-SO2-N(RL1)-、及び-N(RL1)-SO2-から選択される。
好ましくは、L1は、-CO-N(RL1)-、-N(RL1)-CO-、-C(=O)O-、-O-C(=O)-、-SO2-N(RL1)-、及び-N(RL1)-SO2-から選択される。より好ましくは、L1は、-CO-N(RL1)-又は-N(RL1)-CO-であり、 -CO-N(RL1)-基は、その炭素原子を介して式(I)に示されるピロロ[2,3-b]ピラジン部分の環炭素原子に結合し、その窒素原子を介してR1基に結合し、-N(RL1)-CO-基は、その窒素原子を介して式(I)に示されるピロロ[2,3-b]ピラジン部分の環炭素原子に結合し、その炭素原子を介してR1基に結合する。さらにより好ましくは、L1は、-CO-N(RL1)-である。
各RL1は独立に、水素及びC1〜5アルキルから選択される。好ましくは、各RL1は独立に、水素、メチル、及びエチルから選択される。より好ましくは、各RL1は独立に、水素及びメチルから選択される。さらにより好ましくは、各RL1は、水素である。
したがって、L1が-CO-N(RL1)-であることが特に好ましく、式中RL1は、水素又はC1〜5アルキルであり、(より好ましくはRL1は、水素又はメチルであり、さらにより好ましくはRL1は、水素であり)、式(I)の化合物は、以下の構造を有する:
R1はC1〜12アルキル、C2〜12アルケニル又はC2〜12アルキニルであり、前記アルキル、前記アルケニル又は前記アルキニルは一つ又は複数(例えば、一、二又は三)のR10基で置換され、更に前記アルキル、前記アルケニル又は前記アルキニルは任意選択で一つ又は複数(例えば、一、二又は三)のR11基で置換される。
好ましくは、R1はC1〜12アルキルであり、前記アルキルは一つ又は複数(例えば、一、二又は三)のR10基で置換され、更に前記アルキルは任意選択で一つ又は複数(例えば、一、二又は三)のR11基で置換される。より好ましくは、R1はC2〜10アルキルであり、前記アルキルは一つ又は複数のR10基で置換され、更に前記アルキルは任意選択で一つ又は複数のR11基で置換される。さらにより好ましくは、R1は、-C(R13)(R13)-C(R13)(R13)-R10であり、各R13は独立に、水素及びC1〜4アルキルから選択され、但し、全てのR13基中に一緒の炭素原子の総数は8以下であり、各R13は任意選択で一つ又は複数のR10基で置換され、各R13は任意選択で一つ又は複数のR11基で更に置換される。なおさらにより好ましくは、R1は、-C(R13)(R13)-C(R13)(R13)-R10であり、各R13は独立に、水素、メチル、及びエチルから選択され、各R13は、任意選択で一つ又は複数(例えば、一又は二)のR10基で置換され、各R13は、任意選択で一つ又は複数(例えば、一、二又は三)のR11基で更に置換される。特に好ましいR1の例には、-CH(-CH2OH)-CH2-OH、-CH(-CH3)-CH2-OH、-C(-CH3)(-CH3)-C(-CH3)(-CH3)-OH、-(1-(ヒドロキシメチル)シクロペンタン-1-イル)、-CH(-CH2CH3)-CH2-OH、-CH(-CH2CH2OH)-C(-CH3)(-CH3)-OH、又は-C(-CH3)(-CH3)-CH2-OHが含まれるが、それに限定されない。
各R10は、独立に、-OH、-O(C1〜5アルキル)、及び少なくとも一つの酸素環原子を有するヘテロシクリルから選択される。好ましくは、各R10は、独立に、-OH、-O(C1〜5アルキル)、及び少なくとも一つの酸素環原子を有するヘテロシクロアルキルから選択される。より好ましくは、各R10は独立に、-OH及び-O(C1〜5アルキル)から選択され、さらにより好ましくは、各R10は独立に、-OH、-OCH3、及び-OCH2CH3から選択され、なおさらにより好ましくは、各R10は独立に、-OH及び-OCH3から選択される。最も好ましくは、各R10は、-OHである。
上に特定したように、R10は、少なくとも一つの酸素環原子を有するヘテロシクリルであってもよい。R10が少なくとも一つの酸素環原子を有するヘテロシクリルである場合、前記ヘテロシクリルは少なくとも一つの酸素環原子を有するヘテロシクロアルキルであることが好ましい。さらに、前記ヘテロシクリル又は前記ヘテロシクロアルキルが、(少なくとも一つの酸素環原子を含む)5から10環原子を有することが好ましい;より好ましくは、それは単環式であり、5、6又は7環原子、特に5又は6環原子を有する。(前述の5から10環原子、又は5、6又は7環原子、又は5又は6環原子を含む)ヘテロシクリル又はヘテロシクロアルキルの環原子は、好ましくは1酸素環原子及びxの独立に酸素、窒素及び硫黄から選択される更なるヘテロ原子を含み、xは0、1又は2であり、残りの環原子は炭素原子である。そのようなヘテロシクリル又はヘテロシクロアルキル基の例には、特に、テトラヒドロフラニル(例えば、テトラヒドロフラン-2-イル又はテトラヒドロフラン-3-イル)、テトラヒドロピラニル(例えば、テトラヒドロピラン-2-イル、テトラヒドロピラン-3-イル、又はテトラヒドロピラン-4-イル)、又はモルフォリニル(例えば、モルホリン-4-イル)が含まれる。
各R11は、独立に、-O(C1〜5アルキレン)-OH、-O(C1〜5アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-SH、-S(C1〜5アルキル)、-S(C1〜5アルキレン)-SH、-S(C1〜5アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-NH2、-NH(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、ハロゲン、C1〜5ハロアルキル、-O-(C1〜5ハロアルキル)、-CF3、-CN、-CHO、-CO-(C1〜5アルキル)、-COOH、-CO-O-(C1〜5アルキル)、-O-CO-(C1〜5アルキル)、-CO-NH2、-CO-NH(C1〜5アルキル)、-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、カルボシクリル、及びヘテロシクリルから選択され、前記カルボシクリル及び前記ヘテロシクリルは、各々任意選択で一つ又は複数(例えば、一、二又は三)のR12基で置換され;更に(存在する場合)同じ炭素原子に結合する任意の二つのR11基は、任意選択で、それらが結合する炭素原子と一緒に、5から8員の炭素環式又は複素環式環を形成してもよく、前記5から8員の炭素環式又は複素環式環は、任意選択で、一つ又は複数(例えば、一、二又は三)のR12基で置換される。
好ましくは、各R11は独立に、-SH、-S(C1〜5アルキル)、-NH2、-NH(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、ハロゲン、C1〜5ハロアルキル、-O-(C1〜5ハロアルキル)、-CF3、及び-CNから選択され;更に(存在する場合)同じ炭素原子に結合する任意の二つのR11基は、任意選択で、それらが結合する炭素原子と一緒に、5又は6員の炭素環式又は複素環式環を形成してもよく、前記5又は6員の炭素環式又は複素環式環は、任意選択で、一つ又は複数のR12基で置換される。
二つのR11基が同じ炭素原子に結合する場合及びそれらが結合する炭素原子と一緒に、5から8員の炭素環式又は複素環式環(又は、特に、5又は6員の炭素環式又は複素環式環)を形成する場合、前記環は任意選択で一つ又は複数のR12基で置換され、前記環は飽和であることが好ましい。より好ましくは、前記環は飽和の5又は6員の炭素環式又は複素環式環であり、これは、任意選択で、一つ又は複数のR12基で置換される。前述の飽和の5又は6員の複素環式環は、好ましくは、1又は2酸素環原子を含有し、全ての残りの環原子は炭素原子である。対応する炭素環式又は複素環式環の例には、特に、シクロペンチル環、シクロヘキシル環、テトラヒドロフラニル環、又はテトラヒドロピラニル環(各々の前述の環は、任意選択で一つ又は複数のR12基で置換されてもよい)が含まれる。
各R12は独立に、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、及び-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)から選択される。
好ましくは、各R12は独立に、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-OH、-O(C1〜5アルキル)、-SH、-S(C1〜5アルキル)、-NH2、-NH(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、ハロゲン、C1〜5ハロアルキル、-O-(C1〜5ハロアルキル)、-CF3、-CN、-CHO、-CO-(C1〜5アルキル)、-COOH、-CO-O-(C1〜5アルキル)、-O-CO-(C1〜5アルキル)、-CO-NH2、-CO-NH(C1〜5アルキル)、-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、及び-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)から選択される。より好ましくは、各R12は独立に、C1〜5アルキル、-OH、-O(C1〜5アルキル)、-SH、-S(C1〜5アルキル)、-NH2、-NH(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、ハロゲン、C1〜5ハロアルキル、-O-(C1〜5ハロアルキル)、-CF3、及び-CNから選択される。
R2は、水素、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリル、及び-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルから選択され、前記-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリルのカルボシクリル部分及び前記-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルのヘテロシクリル部分は、各々任意選択で一つ又は複数(例えば、一、二又は三)のR12基で置換される。
好ましくは、R2は、水素、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-OH、-O(C1〜5アルキル)、-SH、-S(C1〜5アルキル)、-NH2、-NH(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、ハロゲン、C1〜5ハロアルキル、-O-(C1〜5ハロアルキル)、-CF3、-CN、-CHO、-CO-(C1〜5アルキル)、-COOH、-CO-O-(C1〜5アルキル)、-O-CO-(C1〜5アルキル)、-CO-NH2、-CO-NH(C1〜5アルキル)、-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、及び-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)から選択される。より好ましくは、R2は、水素、C1〜5アルキル、-OH、-O(C1〜5アルキル)、-SH、-S(C1〜5アルキル)、-NH2、-NH(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、ハロゲン、C1〜5ハロアルキル、-O-(C1〜5ハロアルキル)、-CF3、及び-CNから選択される。さらにより好ましくは、R2は、水素である。
R3は、水素、C1〜5アルキル、及び-CO(C1〜5アルキル)から選択される。
好ましくは、R3は、水素又はC1〜5アルキルである。より好ましくは、R3は、水素、メチル又はエチルである。さらにより好ましくは、R3は、水素である。
R4及びR5は、各々独立に、水素、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリル、及び-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルから選択され、前記-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリルのカルボシクリル部分及び前記-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルのヘテロシクリル部分は、各々任意選択で一つ又は複数(例えば、一、二又は三)のR12基で置換される。
好ましくは、R4及びR5の一つは、カルボシクリル又はヘテロシクリルであり、前記カルボシクリル又は前記ヘテロシクリルは、任意選択で一つ又は複数のR12基で置換され、R4及びR5の他方の一つは水素、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリル、及び-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルから選択され、前記-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリルのカルボシクリル部分及び前記-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルのヘテロシクリル部分は、各々任意選択で一つ又は複数のR12基で置換される。より好ましくは、R5はシクロアルキルであり、R4は水素、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリル、及び-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルから選択され、前記-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリルのカルボシクリル部分及び前記-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルのヘテロシクリル部分は、各々任意選択で一つ又は複数のR12基で置換される。さらにより好ましくは、R5は、C3〜7シクロアルキル(例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、又はシクロヘプチル;特にシクロプロピルであり)、R4は、水素、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリル、及び-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルから選択され、前記-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリルのカルボシクリル部分及び前記-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルのヘテロシクリル部分は、各々任意選択で一つ又は複数のR12基で置換され;R4は、より好ましくは、水素、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-OH、-O(C1〜5アルキル)、-SH、-S(C1〜5アルキル)、-NH2、-NH(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、ハロゲン、C1〜5ハロアルキル、-O-(C1〜5ハロアルキル)、-CF3、-CN、-CHO、-CO-(C1〜5アルキル)、-COOH、-CO-O-(C1〜5アルキル)、-O-CO-(C1〜5アルキル)、-CO-NH2、-CO-NH(C1〜5アルキル)、-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、カルボシクリル、及びヘテロシクリルから選択され、前記カルボシクリル及び前記ヘテロシクリルは、各々任意選択で一つ又は複数のR12基で置換され;R4は、さらにより好ましくは、水素、C1〜5アルキル、-OH、-O(C1〜5アルキル)、-SH、-S(C1〜5アルキル)、-NH2、-NH(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、ハロゲン、C1〜5ハロアルキル、-O-(C1〜5ハロアルキル)、-CF3、及び-CNから選択され;R4は、さらにより好ましくは、水素である。さらにより好ましくは、R5はシクロプロピルであり、R4は水素、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-OH、-O(C1〜5アルキル)、-SH、-S(C1〜5アルキル)、-NH2、-NH(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、ハロゲン、C1〜5ハロアルキル、-O-(C1〜5ハロアルキル)、-CF3、-CN、-CHO、-CO-(C1〜5アルキル)、-COOH、-CO-O-(C1〜5アルキル)、-O-CO-(C1〜5アルキル)、-CO-NH2、-CO-NH(C1〜5アルキル)、-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、カルボシクリル、及びヘテロシクリルから選択され、前記カルボシクリル及び前記ヘテロシクリルは、各々任意選択で一つ又は複数のR12基で置換され;R4は、より好ましくは、水素、C1〜5アルキル、-OH、-O(C1〜5アルキル)、-SH、-S(C1〜5アルキル)、-NH2、-NH(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、ハロゲン、C1〜5ハロアルキル、-O-(C1〜5ハロアルキル)、-CF3、及び-CNから選択され;R4は、さらにより好ましくは、水素である。さらにより好ましくは、R5はシクロプロピルであり、R4は水素である。
式(I)の化合物が、以下の式(II)の化合物又は薬学的に許容されるその塩であることが特に好ましい:
特にR1、RL1、R2、R3及びR4を含む、式(II)において構成される基/変数は、式(I)において構成される対応する基/変数について本明細書に記載及び定義されるような、同じ意味を有する(同じ好ましい意味を含む)。
式(I)又は(II)の化合物は、例えば、本明細書の実施例セクションに記載される特定の化合物のいずれか一つの、それぞれの化合物の非塩形態(例えば、遊離塩基/酸形態)において又は薬学的に許容される塩としてのいずれかであってもよい。
特に、式(I)又は(II)の化合物の例は、以下のこれらの化合物のいずれか一つの化合物ならびに薬学的に許容される塩を含む:
式(I)又は(II)の化合物の好ましい例は、特に、以下の化合物ならびに薬学的に許容されるその塩を含む:
特に好ましい例示的な式(I)又は(II)の化合物は、以下の式(本明細書で「化合物7」とも呼ばれる)の化合物又は薬学的に許容されるその塩である:
式(I)の化合物は、合成化学の分野において知られている方法によって調製することができる。例えば、これらの化合物は、WO2011/144585(その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)、特にWO2011/144585の93から101頁及び/又は実施例に記載される合成経路のいずれかに従って又は類似して調製することができる。
以下の定義は、別段具体的に示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲全体に適用される。
用語「炭化水素基」は、炭素原子及び水素原子からなる基を指す。
用語「脂環式」は、環式基に関連して使用され、対応する環式基が非芳香族であることを表す。
本明細書に使用される、用語「アルキル」は、一価の飽和の非環式(すなわち、環式ではない)炭化水素基を指し、これは直鎖状又は分枝状であってもよい。したがって、「アルキル」基は、いかなる炭素間二重結合又はいかなる炭素間三重結合も含まない。「C1〜5アルキル」は、1から5の炭素原子を有するアルキル基を表す。好ましい例示的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル(例えば、n-プロピル又はイソプロピル)、又はブチル(例えば、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、又はtert-ブチル)である。別段の指定がない限り、用語「アルキル」は、好ましくは、C1〜4アルキル、より好ましくはメチル又はエチル、及びさらにより好ましくはメチルを指す。
本明細書に使用される、用語「アルケニル」は、一価の不飽和の非環式炭化水素基を指し、これは、直鎖状又は分枝状であってもよく、一つ又は複数(例えば、一又は二)の炭素間二重結合を含むが、いかなる炭素間三重結合も含まない。用語「C2〜5アルケニル」は、2から5の炭素原子を有するアルケニル基を表す。好ましい例示的なアルケニル基は、エテニル、プロペニル(例えば、プロパ-1-エン-1-イル、プロパ-1-エン-2-イル、又はプロパ-2-エン-1-イル)、ブテニル、ブタジエニル(例えば、ブタ-1,3-ジエン-1-イル又はブタ-1,3-ジエン-2-イル)、ペンテニル、又はペンタジエニル(例えば、イソプレニル)である。別段の指定がない限り、用語「アルケニル」は、好ましくは、C2〜4アルケニルを指す。
本明細書に使用される、用語「アルキニル」は、一価の不飽和の非環式炭化水素基を指し、これは、直鎖状又は分枝状であってもよく、一つ又は複数(例えば、一又は二)の炭素間三重結合及び任意選択で一つ又は複数(例えば、一又は二)の炭素間二重結合を含む。用語「C2〜5アルキニル」は、2から5の炭素原子を有するアルキニル基を表す。好ましい例示的なアルキニル基は、エチニル、プロピニル(例えば、プロパルギル)、又はブチニルである。別段の指定がない限り、用語「アルキニル」は、好ましくは、C2〜4アルキニルを指す。
本明細書に使用される、用語「アルキレン」は、アルカンジイル基、すなわち、二価の飽和の非環式炭化水素基を指し、これは直鎖状又は分枝状であってもよい。「C1〜5アルキレン」は、1から5の炭素原子を有するアルキレン基を表し、用語「C0〜3アルキレン」は、共有結合(選択肢「C0アルキレン」に対応)又はC1〜3アルキレンが存在することを示す。好ましい例示的なアルキレン基は、メチレン(-CH2-)、エチレン(例えば、-CH2-CH2-又は-CH(-CH3)-)、プロピレン(例えば、-CH2-CH2-CH2-、-CH(-CH2-CH3)-、-CH2-CH(-CH3)-、又は-CH(-CH3)-CH2-)、又はブチレン(例えば、-CH2-CH2-CH2-CH2-)である。別段の指定がない限り、用語「アルキレン」は、好ましくは、C1〜4アルキレン(特に、直鎖状C1〜4アルキレンを含む)、より好ましくはメチレン又はエチレン、及びさらにより好ましくはメチレンを指す。
本明細書に使用される、用語「カルボシクリル」(又は「炭素環式環」)は、炭化水素環基を指し、これには、単環式環ならびに架橋環、スピロ環及び/又は縮合環系(これは、例えば、二又は三環から構成されてもよい)が含まれ、前記環基は、飽和、部分的に不飽和(すなわち、不飽和であるが、芳香族ではない)又は芳香族であってもよい。別段の指定がない限り、「カルボシクリル」(又は「炭素環式環」)は、好ましくは、アリール、シクロアルキル又はシクロアルケニルを指す。
本明細書に使用される、用語「ヘテロシクリル」(又は「複素環式環」)は、環基を指し、これには、単環式環ならびに架橋環、スピロ環及び/又は縮合環系(これは、例えば、二又は三環から構成されてもよい)が含まれ、前記環基は、独立にO、S及びNから選択される一つ又は複数(例えば、一、二、三、又は四)の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は炭素原子であり、一つ又は複数のS環原子(存在する場合)及び/又は一つ又は複数のN環原子(存在する場合)は、任意選択で酸化されてもよく、一つ又は複数の炭素環原子は、任意選択で酸化されてもよく(すなわち、オキソ基を形成する)、更に、前記環基は、飽和、部分的に不飽和(すなわち、不飽和であるが、芳香族ではない)又は芳香族であってもよい。例えば、前記環基において構成される各ヘテロ原子含有環は、一又は二つのO原子及び/又は一又は二つのS原子(これは、任意選択で酸化されてもよい)及び/又は一、二、三又は四つのN原子(これは、任意選択で酸化されてもよい)を含有してもよい、但し、対応するヘテロ原子含有環中のヘテロ原子の総数は1から4であり、対応するヘテロ原子含有環中に少なくとも一つの炭素環原子(これは、任意選択で酸化されてもよい)が存在する。別段の指定がない限り、「ヘテロシクリル」(又は「複素環式環」)は、好ましくは、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル又はヘテロシクロアルケニルを指す。
本明細書に使用される、用語「アリール」は、芳香族炭化水素環基を指し、これには、単環式芳香族環ならびに架橋環及び/又は縮合環系であって、少なくとも一つの芳香族環を含有するものが含まれ(例えば、二又は三縮合環から構成される環系であって、少なくとも一つのこれらの縮合環が芳香族である環系;又は二又は三環から構成される架橋環系であって、少なくとも一つのこれらの架橋環が芳香族である架橋環系)、「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、ジアリニル(dialinyl)(すなわち、1,2-ジヒドロナフチル)、テトラリニル(すなわち、1,2,3,4-テトラヒドロナフチル)、インダニル、インデニル(例えば、1H-インデニル)、アントラセニル、フェナントレニル、9H-フルオレニル、又はアズレニルを指しうる。別段の指定がない限り、「アリール」は、好ましくは、6から14環原子、より好ましくは、6から10環原子を有し、さらにより好ましくは、フェニル又はナフチルを指し、及び最も好ましくは、フェニルを指す。
本明細書に使用される、用語「ヘテロアリール」は、芳香族環基を指し、これには、単環式芳香族環ならびに架橋環及び/又は縮合環系であって、少なくとも一つの芳香族環を含有するものが含まれ(例えば、二又は三縮合環から構成される環系であって、少なくとも一つのこれらの縮合環が芳香族である環系;又は二又は三環から構成される架橋環系であって、少なくとも一つのこれらの架橋環が芳香族である架橋環系)、前記芳香環基は、独立にO、S及びNから選択される一つ又は複数(例えば、一、二、三、又は四)の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は炭素原子であり、一つ又は複数のS環原子(存在する場合)及び/又は一つ又は複数のN環原子(存在する場合)は、任意選択で酸化されてもよく、更に、一つ又は複数の炭素環原子は、任意選択で酸化されてもよい(すなわち、オキソ基を形成する)。例えば、前記芳香族環基において構成される各ヘテロ原子含有環は、一又は二つのO原子及び/又は一又は二つのS原子(これは、任意選択で酸化されてもよい)及び/又は一、二、三又は四つのN原子(これは、任意選択で酸化されてもよい)を含有してもよい、但し、対応するヘテロ原子含有環中のヘテロ原子の総数は、1から4であり、対応するヘテロ原子含有環中に少なくとも一つの炭素環原子(これは、任意選択で酸化されてもよい)が存在する。「ヘテロアリール」は、例えば、チエニル(すなわち、チオフェニル)、ベンゾ[b]チエニル、ナフト[2,3-b]チエニル、チアントレニル、フリル(すなわち、フラニル)、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、クロマニル、クロメニル(例えば、2H-1-ベンゾピラニル又は4H-1-ベンゾピラニル)、イソクロメニル(例えば、1H-2-ベンゾピラニル)、クロモニル、キサンテニル、フェノキサチイニル(phenoxathiinyl)、ピロリル(例えば、1H-ピロリル)、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル(すなわち、ピリジニル;例えば、2-ピリジル、3-ピリジル、又は4-ピリジル)、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル(例えば、3H-インドリル)、イソインドリル、インダゾリル、インドリジニル、プリニル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、β-カルボリニル、フェナントリジニ
ル、アクリジニル、ペリミジニル、フェナントロリニル(例えば、[1,10]フェナントロリニル、[1,7]フェナントロリニル、又は[4,7]フェナントロリニル)、フェナジニル、チアゾリル、イソチアゾリル、フェノチアジニル、オキサゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル(例えば、1,2,4-オキサジアゾリル、1,2,5-オキサジアゾリル(すなわち、フラザニル)、又は1,3,4-オキサジアゾリル)、チアジアゾリル(例えば、1,2,4-チアジアゾリル、1,2,5-チアジアゾリル、又は1,3,4-チアジアゾリル)、フェノキサジニル、ピラゾロ[1,5-a]ピリミジニル(例えば、ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)、1,2-ベンゾイソキサゾール-3-イル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイソキサゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾ[b]チオフェニル(すなわち、ベンゾチエニル)、トリアゾリル(例えば、1H-1,2,3-トリアゾリル、2H-1,2,3-トリアゾリル、1H-1,2,4-トリアゾリル、又は4H-1,2,4-トリアゾリル)、ベンゾトリアゾリル、1H-テトラゾリル、2H-テトラゾリル、トリアジニル(例えば、1,2,3-トリアジニル、1,2,4-トリアジニル、又は1,3,5-トリアジニル)、フロ[2,3-c]ピリジニル、ジヒドロフロピリジニル(例えば、2,3-ジヒドロフロ[2,3-c]ピリジニル又は1,3-ジヒドロフロ[3,4-c]ピリジニル)、イミダゾピリジニル(例えば、イミダゾ[1,2-a]ピリジニル又はイミダゾ[3,2-a]ピリジニル)、キナゾリニル、チエノピリジニル、テトラヒドロチエノピリジニル(例えば、4,5,6,7-テトラヒドロチエノ[3,2-c]ピリジニル)、ジベンゾフラニル、1,3-ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキサニル(例えば、1,3-ベンゾジオキサニル又は1,4-ベンゾジオキサニル)、又はクマリニルを指しうる。別段の指定がない限り、用語「ヘテロアリール」は、好ましくは、5から14員(より好ましくは5から10員)の単環式環又は縮合環系であって、独立にO、S及びNから選択される一つ又は複数(例えば、一、二、三又は四)の環ヘテロ原子を含むものを指し、ここで、一つ又は複数のS環原子(存在する場合)及び/又は一つ又は複数のN環原子(存在する場合)は、任意選択で酸化され、一つ又は複数の炭素環原子は、任意選択で酸化される;さらにより好ましくは、「ヘテロアリール」は、5又は6員の単環式環であって、独立にO、S及びNから選択される一つ又は複数(例えば、一、二又は三)の環ヘテロ原子を含むものを指し、ここで、一つ又は複数のS環原子(存在する場合)及び/又は一つ又は複数のN環原子(存在する場合)は、任意選択で酸化され、一つ又は複数の炭素環原子は、任意選択で酸化される。更に、別段の指定がない限り、特に好ましい「ヘテロアリール」の例には、ピリジニル(例えば、2-ピリジル、3-ピリジル、又は4-ピリジル)、イミダゾリル、チアゾリル、1H-テトラゾリル、2H-テトラゾリル、チエニル(すなわち、チオフェニル)、又はピリミジニルが含まれる。
本明細書に使用される、用語「シクロアルキル」は、飽和炭化水素環基を指し、これには、単環式環ならびに架橋環、スピロ環及び/又は縮合環系(これは、例えば、二又は三環;例えば、二又は三縮合環から構成される縮合環系から構成されてもよい)が含まれる。「シクロアルキル」は、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、デカリニル(decalinyl)(すなわち、デカヒドロナフチル)、又はアダマンチルを指しうる。別段の指定がない限り、「シクロアルキル」は、好ましくはC3〜11シクロアルキルを指す、より好ましくはC3〜7シクロアルキルを指す。特に好ましい「シクロアルキル」は、3から7環員を有する単環式の飽和炭化水素環である。更に、別段の指定がない限り、特に好ましい「シクロアルキル」の例には、シクロヘキシル又はシクロプロピル、特にシクロヘキシルが含まれる。
本明細書に使用される、用語「ヘテロシクロアルキル」は、飽和環基を指し、これには、単環式環ならびに架橋環、スピロ環及び/又は縮合環系(これは、例えば、二又は三環;例えば、二又は三縮合環から構成される縮合環系から構成されてもよい)が含まれ、前記環基は、独立にO、S及びNから選択される一つ又は複数(例えば、一、二、三、又は四)の環ヘテロ原子を含有し、残りの環原子は炭素原子であり、一つ又は複数のS環原子(存在する場合)及び/又は一つ又は複数のN環原子(存在する場合)は、任意選択で酸化されてもよく、更に、一つ又は複数の炭素環原子は、任意選択で酸化されてもよい(すなわち、オキソ基を形成する)。例えば、前記飽和環基において構成される各ヘテロ原子含有環は、一又は二つのO原子及び/又は一又は二つのS原子(これは、任意選択で酸化されてもよい)及び/又は一、二、三又は四つのN原子(これは、任意選択で酸化されてもよい)を含有してもよい、但し、対応するヘテロ原子含有環中のヘテロ原子の総数は、1から4であり、対応するヘテロ原子含有環中に少なくとも一つの炭素環原子(これは、任意選択で酸化されてもよい)が存在する。「ヘテロシクロアルキル」は、例えば、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、アゼパニル、ジアゼパニル(例えば、1,4-ジアゼパニル)、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、モルフォリニル(例えば、モルホリン-4-イル)、チオモルフォリニル(例えば、チオモルホリン-4-イル)、オキサゼパニル(oxazepanyl)、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、1,3-ジオキソラニル、テトラヒドロピラニル、1,4-ジオキサニル、オキセパニル、チイラニル、チエタニル、テトラヒドロチオフェニル(すなわち、チオラニル)、1,3-ジチオラニル、チアニル、チエパニル、デカヒドロキノリニル、デカヒドロイソキノリニル、又は2-オキサ-5-アザ-ビシクロ[2.2.1]ヘプタ-5-イルを指しうる。別段の指定がない限り、「ヘテロシクロアルキル」は、好ましくは、3から11員の飽和環基を指し、これは、単環式環又は縮合環系(例えば、二縮合環から構成される縮合環系)であり、前記環基は、独立にO、S及びNから選択
される一つ又は複数(例えば、一、二、三、又は四)の環ヘテロ原子を含有し、ここで、一つ又は複数のS環原子(存在する場合)及び/又は一つ又は複数のN環原子(存在する場合)は、任意選択で酸化され、一つ又は複数の炭素環原子は、任意選択で酸化される;より好ましくは、「ヘテロシクロアルキル」は、5から7員の飽和単環式環基であって、独立にO、S及びNから選択される一つ又は複数(例えば、一、二又は三)の環ヘテロ原子を含有するものを指し、ここで、一つ又は複数のS環原子(存在する場合)及び/又は一つ又は複数のN環原子(存在する場合)は、任意選択で酸化され、一つ又は複数の炭素環原子は、任意選択で酸化される。更に、別段の指定がない限り、特に好ましい「ヘテロシクロアルキル」の例には、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルフォリニル、ピロリジニル、又はテトラヒドロフラニルが含まれる。
本明細書に使用される、用語「シクロアルケニル」は、不飽和脂環式(非芳香族)炭化水素環基を指し、これには、単環式環ならびに架橋環、スピロ環及び/又は縮合環系(これは、例えば、二又は三環;例えば、二又は三縮合環から構成される縮合環系から構成されてもよい)が含まれ、前記炭化水素環基は、一つ又は複数(例えば、一又は二)の炭素間二重結合を含み、いかなる炭素間三重結合も含まない。「シクロアルケニル」は、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプテニル、又はシクロヘプタジエニルを指しうる。別段の指定がない限り、「シクロアルケニル」は、好ましくはC3〜11シクロアルケニルを指す、より好ましくはC3〜7シクロアルケニルを指す。特に好ましい「シクロアルケニル」は、3から7環員を有し、一つ又は複数(例えば、一又は二;好ましくは、一つ)の炭素間二重結合を含有する、単環式の不飽和脂環式炭化水素環である。
本明細書に使用される、用語「ヘテロシクロアルケニル」は、不飽和脂環式(非芳香族)環基を指し、これには、単環式環ならびに架橋環、スピロ環及び/又は縮合環系(これは、例えば、二又は三環;例えば、二又は三縮合環から構成される縮合環系から構成されてもよい)が含まれ、ここで、前記環基は、独立にO、S及びNから選択される一つ又は複数(例えば、一、二、三、又は四)の環ヘテロ原子を含有し、残りの環原子は炭素原子であり、一つ又は複数のS環原子(存在する場合)及び/又は一つ又は複数のN環原子(存在する場合)は、任意選択で酸化されてもよく、一つ又は複数の炭素環原子は、任意選択で酸化されてもよく(すなわち、オキソ基を形成する)、更に、前記環基は、隣接する環原子間に少なくとも一つの二重結合を含み、隣接する環原子間にいかなる三重結合も含まない。例えば、前記不飽和脂環式環基において構成される各ヘテロ原子含有環は、一又は二つのO原子及び/又は一又は二つのS原子(これは、任意選択で酸化されてもよい)及び/又は一、二、三又は四つのN原子(これは、任意選択で酸化されてもよい)を含有してもよい、但し、対応するヘテロ原子含有環中のヘテロ原子の総数は、1から4であり、対応するヘテロ原子含有環中に少なくとも一つの炭素環原子(これは、任意選択で酸化されてもよい)が存在する。「ヘテロシクロアルケニル」は、例えば、イミダゾリニル(例えば、2-イミダゾリニル(すなわち、4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾリル)、3-イミダゾリニル、又は4-イミダゾリニル)、テトラヒドロピリジニル(例えば、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル)、ジヒドロピリジニル(例えば、1,2-ジヒドロピリジニル又は2,3-ジヒドロピリジニル)、ピラニル(例えば、2H-ピラニル又は4H-ピラニル)、チオピラニル(例えば、2H-チオピラニル又は4H-チオピラニル)、ジヒドロピラニル、ジヒドロフラニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロイソインドリル、オクタヒドロキノリニル(例えば、1,2,3,4,4a,5,6,7-オクタヒドロキノリニル)、又はオクタヒドロイソキノリニル(例えば、1,2,3,4,5,6,7,8-オクタヒドロイソキノリニル)を指しうる。別段の指定がない限り、「ヘテロシクロアルケニル」は、好ましくは、3から11員の不飽和脂環式
環基を指し、これは、単環式環又は縮合環系(例えば、二縮合環から構成される縮合環系)であり、前記環基は、独立にO、S及びNから選択される一つ又は複数(例えば、一、二、三、又は四)の環ヘテロ原子を含有し、ここで、一つ又は複数のS環原子(存在する場合)及び/又は一つ又は複数のN環原子(存在する場合)は、任意選択で酸化され、一つ又は複数の炭素環原子は、任意選択で酸化され、前記環基は、隣接する環原子間に少なくとも一つの二重結合を含み、隣接する環原子間にいかなる三重結合も含まなく;より好ましくは、「ヘテロシクロアルケニル」は、5から7員の単環式で不飽和の非芳香環基であって、独立にO、S及びNから選択される一つ又は複数(例えば、一、二又は三)の環ヘテロ原子を含有するものを指し、ここで、一つ又は複数のS環原子(存在する場合)及び/又は一つ又は複数のN環原子(存在する場合)は、任意選択で酸化され、一つ又は複数の炭素環原子は、任意選択で酸化され、前記環基は、隣接する環原子間に少なくとも一つの二重結合を含み、隣接する環原子間にいかなる三重結合も含まない。
本明細書に使用される、用語「ハロゲン」は、フルオロ(-F)、クロロ(-Cl)、ブロモ(-Br)、又はヨード(-I)を指す。
本明細書に使用される、用語「ハロアルキル」は、一つ又は複数(好ましくは、1から6、より好ましくは1から3)のハロゲン原子で置換されたアルキル基を指し、これは独立にフルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードから選択され、好ましくは、全てフルオロ原子である。ハロゲン原子の最大数は、利用可能な結合部位の数によって制限されることから、ハロアルキル基のアルキル部分において構成される炭素原子の数に依存することが理解される。「ハロアルキル」は、例えば、-CF3、-CHF2、-CH2F、-CF2-CH3、-CH2-CF3、-CH2-CHF2、-CH2-CF2-CH3、-CH2-CF2-CF3、又は-CH(CF3)2を指しうる。特に好ましい「ハロアルキル」基は、-CF3である。
本明細書に使用される、用語「任意選択」、「任意選択で」及び「してもよい」は、示された特徴が存在してもよいが、非存在であってもよいことを表す。用語「任意選択」、「任意選択で」及び「してもよい」が使用されるときはいつも、本発明は、両方の可能性(すなわち、対応する特徴が存在する又は代替的に対応する特徴が存在しない)に特異的に関する。例えば、「Xが任意選択でYで置換される」(又は「XがYで置換されてもよい」)の表現は、XがYで置換される又は非置換のいずれかであることを意味する。同様に、組成物の成分が「任意選択」であると示される場合、本発明は、両方の可能性(すなわち、対応する成分が存在する(組成物に含有される)又は対応する成分が組成物に存在しない)に特異的に関する。
様々な基が、本明細書において「任意選択で置換される」と呼ばれる。一般に、これらの基は、一つ又は複数の置換基、例えば、一、二、三又は四置換基を保有しうる。置換基の最大数が、置換される部分に利用可能な結合部位の数によって制限されると理解される。別段の指定がない限り、本明細書に参照される「任意選択で置換される」基は、好ましくは、二以下の置換基を保有し、特に、たった一つの置換基を保有しうる。更に、別段の指定がない限り、任意選択の置換基が、存在しない、すなわち、対応する基が非置換であることが好ましい。
当業者は、本発明の化合物において構成される置換基が、対応する特定の置換基のいくつかの異なる位置を介して、それぞれの化合物の残部に結合してもよいことを認識する。別段の指定がない限り、様々な特定の置換基に対する好ましい結合位置は、本明細書に記載される対応する例示的な化合物に例示されている通りである。
本明細書に使用される、用語「cccDNA阻害剤」又は「HBV cccDNA阻害剤」は、B型肝炎ウイルス(HBV)性の共有結合性閉環状DNA(cccDNA)を、例えば、HBV cccDNAの安定性及び/又は転写活性を阻害することによって、阻害する能力のある化合物を指す。HBV cccDNAを不安定化し、cccDNAの完全又は少なくとも部分的な分解につながるcccDNA阻害剤は、「cccDNA不安定化剤」又は「HBV cccDNA不安定化剤」とも称され得、一方、既存のHBV cccDNAの分解を必然的に誘導することなく、cccDNA転写活性を、(例えば、エピジェネティック機構を介して)、サイレンシングするcccDNA阻害剤は、「cccDNAサイレンサー」又は「HBV cccDNAサイレンサー」とも呼ばれ得る。本発明は、そのような任意のcccDNA阻害剤を包含し、これには、HBV cccDNA不安定化剤及び/又はサイレンサーとして作用する化合物が含まれ、及び特にHBV cccDNA不安定化剤に関する。cccDNAを不安定化する化合物の性能は、例えば、実施例1に記載されるcccDNAアッセイを使用して評価することができる。
本明細書で使用され、別段明示的に示されない限り、又は文脈によって矛盾していない限り、用語「一つ(a)」、「一つ(an)」、及び「その(the)」は、「一つ又は複数」及び「少なくとも一」と互換的に使用される。したがって、例えば、「一つ」の式(I)の化合物を含む組成物は、「一つ又は複数」の式(I)の化合物を含む組成物を指すと解釈することができる。
本明細書に使用される、用語「約」は、好ましくは、示された数値の±10%、より好ましくは示された数値の±5%、及び特に示された正にその数値を指す。用語「約」が範囲のエンドポイントに関連して使用される場合、好ましくは、その示された数値のより低いエンドポイント-10%からその示された数値のより高いエンドポイント+10%の範囲、より好ましくは、より低いエンドポイント-5%からより高いエンドポイント+5%の範囲、及びさらにより好ましくは、より低いエンドポイント及びより高いエンドポイントの正にその数値によって定義される範囲を指す。用語「約」がオープンエンド範囲のエンドポイントに関連して使用される場合、好ましくは、より低いエンドポイント-10%から又はより高いエンドポイント+10%から開始される範囲、より好ましくは、より低いエンドポイント-5%から又はより高いエンドポイント+5%から開始される範囲、及びさらにより好ましくは、対応するエンドポイントの正にその数値によって定義されるオープンエンド範囲を指す。
本明細書に使用される、用語「含む(comprising)」(又は「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含有する(contain)」、「含有する(contains)」、又は「含有する(containing」)」)は、別段明示的に示されない限り又は文脈によって矛盾していない限り、「特に含有する(containing、inter alia)」、すなわち、「更なる任意選択の要素...のうちから含有する(containing、among further optional elements、...)」の意味を有する。それに加えて、この用語には、「から本質的になる(consisting essentially of)」及び「からなる(consisting of)」の狭い意味も含まれる。例えば、用語「B及びCを含むA」は、「特にB及びCを含有するA」の意味を有し、ここで、Aは、更なる任意選択の要素を含有してもよい(例えば、「B、C及びDを含有するA」も包含しうる)が、この用語には、「B及びCから本質的になるA」の意味及び「B及びCからなるA」(すなわち、B及びC以外の他の成分が、Aにおいて構成されない)の意味も含まれる。
本発明の範囲は、例えば、アミノ基などのプロトン化に感受性の孤立電子対を保有する原子の無機又は有機酸でのプロトン化によって、又は酸基(例えば、カルボン酸基)と生理的に許容される陽イオンの塩として形成されうる式(I)の化合物の全ての薬学的に許容される塩形態を包含する。例示的な塩基付加塩は、例えば、以下を含む:アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム又はカリウム塩;アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム又はマグネシウム塩;亜鉛塩;アンモニウム塩;脂肪族アミン塩、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、プロカイン塩、メグルミン塩、エチレンジアミン塩、又はコリン塩;アラルキルアミン塩、例えば、N,N-ジベンジルエチレンジアミン塩、ベンザチン塩、ベネタミン塩;複素環式芳香族アミン塩、例えば、ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩又はイソキノリン塩;四級アンモニウム塩、例えば、テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアンモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩又はテトラブチルアンモニウム塩;及び塩基性アミノ酸塩、例えば、アルギニン塩、リジン塩、又はヒスチジン塩。例示的な酸付加塩は、例えば、以下を含む:無機酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩(例えば、硫酸塩又は硫酸水素塩)、硝酸塩、リン酸塩(例えば、リン酸塩、リン酸水素、又はリン酸二水素塩)、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩、ホウ酸塩、又はチオシアン酸塩;有機酸塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、ペンタン酸塩(pentanoate)、ヘキサン酸塩、ヘプタン酸塩、オクタン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、デカン酸塩、ウンデカン酸塩、オレイン酸塩、ステアリン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、アジピン酸塩、グルコン酸塩、グリコール酸塩、ニコチン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、アスコルビン酸塩、パモ酸塩(エンボン酸塩)、樟脳酸塩(camphorate)、グルコヘプタン酸塩、又はピバレート塩;スルホン酸塩、例えば、メタンスルホン酸塩(メシル酸塩)、エタンスルホン酸塩
(エシル酸塩)、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩(イセチオン酸塩)、ベンゼンスルホン酸塩(ベシル酸塩)、p-トルエンスルホン酸塩(トシル酸塩)、2-ナフタレンスルホン酸塩(ナプシル酸塩)、3-フェニルスルホン酸塩、又は樟脳スルホン酸塩(camphorsulfonate salt);グリセロリン酸塩;及び酸性アミノ酸塩、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸塩。式(I)の化合物の好ましい薬学的に許容される塩には、塩酸塩、臭化水素酸塩、メシル酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、及びリン酸塩が含まれる。式(I)の化合物の特に好ましい薬学的に許容される塩は、塩酸塩である。したがって、本明細書に記載される特定の式(I)の化合物いずれか一つを含む、式(I)の化合物が、塩酸塩、臭化水素酸塩、メシル酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩の形態であることが好ましい及び式(I)の化合物が、塩酸塩の形態であることが特に好ましい。
式(I)の化合物又はそれらの薬学的に許容される塩はまた、溶媒和形態(すなわち、溶媒和物として)で存在しうる。したがって、本発明の範囲はまた、例えば、水との溶媒和物(すなわち、水和物として)又は有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール又はアセトニトリルとの溶媒和物(すなわち、メタノレート、エタノレート又はアセトニトレートとして)を含む、任意の溶媒和形態で式(I)の化合物又はそれらの薬学的に許容される塩を包含する。同様に、本発明は、非晶質形態又は任意の結晶形態を含む、任意の物理形態、特に任意の固体形態で、式(I)の化合物又はそれらの薬学的に許容される塩を包含する。
さらに、式(I)の化合物は、異なる異性体、特に立体異性体(例えば、幾何異性体(又はシス/トランス異性体)、エナンチオマー及びジアステレオマーを含む)又は互変異性体(特に、プロトトロピー互変異性体を含む)の形態で存在しうる。式(I)の化合物のそのような異性体の全ては、混合物又は純粋な若しくは実質的に純粋な形態のいずれかで、本発明の一部として企図される。立体異性体に関して、本発明は、本発明による化合物の単離された光学異性体ならびに任意のそれらの混合物(特に、ラセミ混合物/ラセミ化合物を含む)を包含する。ラセミ化合物は、物理的な方法、例えば、分別再結晶、ジアステレオマー誘導体の分離若しくは結晶化、又はキラルカラムクロマトグラフィーによる分離によって分割することができる。個々の光学異性体は、光学活性な酸との塩形成、続いて結晶化を介して、ラセミ化合物から得ることもできる。本発明は、本明細書に提供される化合物の任意の互変異性体を更に包含する。
本発明の範囲はまた、一つ又は複数の原子が、対応する原子の特定の同位体によって置き換えられた、式(I)の化合物を包含する。例えば、本発明は、一つ又は複数の水素原子(又は、例えば、全ての水素原子)が、重水素原子(すなわち、2H;「D」とも称される)によって置き換えられた、式(I)の化合物を包含する。したがって、本発明はまた、重水素を富化した、式(I)の化合物を包含する。天然に存在する水素は、約99.98mol-%水素-1(1H)及び約0.0156mol-%重水素(2H又はD)を含む同位体混合物である。式(I)の化合物中の一つ又は複数の水素位置における重水素の含有量は、当技術分野において公知である重水素化技術を使用して増加させることができる。例えば、式(I)の化合物の合成において使用される式(I)の化合物又は反応物又は前駆体は、例えば、重水(D2O)を使用するH/D交換反応に供試することができる。更なる適切な重水素化技術は、Atzrodt Jら、Bioorg Med Chem、20(18)、5658-5667、2012; William JSら、Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals、53(11-12)、635-644、2010;又はModvig Aら、J Org Chem、79、5861-5868、2014に記載される。重水素の含有量は、例えば、質量分析又はNMR分光測定を使用して決定することができる。別段具体的に示されない限り、式(I)の化合物が、重水素を富化していないことが好ましい。したがって、式(I)の化合物中の天然に存在する水素原子又は1H水素原子の存在が、好ましい。一般に、式(I)の化合物中の原子が、特定の同位体によって置き換えられないことが好ましい。
本明細書に提供される化合物は、化合物それ自体として投与されてもよい又は医薬として製剤化されてもよい。医薬/医薬組成物は、任意選択で、一つ又は複数の薬学的に許容される添加剤、例えば、担体、賦形剤、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、着色剤、色素(pigment)、安定化剤、保存剤、抗酸化剤、及び/又は溶解促進剤を含んでもよい。
医薬組成物は、一つ又は複数の溶解促進剤、例えば、約200から約5,000Daの範囲の分子量を有するポリ(エチレングリコール)(例えば、PEG200、PEG300、PEG400、又はPEG600)を含む、ポリ(エチレングリコール)、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、非イオン性界面活性剤、チロキサポール、ポリソルベート80、マクロゴール-15-ヒドロキシステアレート(例えば、Kolliphor(登録商標)HS15、CAS 70142-34-6)、リン脂質、レシチン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、シクロデキストリン、α-シクロデキストリン、β-シクロデキストリン、γ-シクロデキストリン、ヒドロキシエチル-β-シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、ヒドロキシエチル-γ-シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル-γ-シクロデキストリン、ジヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、スルホブチルエーテル-β-シクロデキストリン、スルホブチルエーテル-γ-シクロデキストリン、グルコシル-α-シクロデキストリン、グルコシル-β-シクロデキストリン、ジグルコシル-β-シクロデキストリン、マルトシル-α-シクロデキストリン、マルトシル-β-シクロデキストリン、マルトシル-γ-シクロデキストリン、マルトトリオシル-β-シクロデキストリン、マルトトリオシル-γ-シクロデキストリン、ジマルトシル-β-シクロデキストリン、メチル-β-シクロデキストリン、カルボキシアルキルチオエーテル、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ビニル酢酸コポリマー、ビニルピロリドン、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、又はその任意の組合せを含んでもよい。
医薬組成物は、当業者に公知の技術(例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、Pharmaceutical Press、22nd editionに公開された技術)によって製剤化することができる。医薬組成物は、任意の所望の投与経路、好ましくは、経口投与のための剤形として製剤化することができる。経口投与のための剤形は、例えば、コーティングされた及びコーティングされていない錠剤、ソフトゼラチンカプセル剤、ハードゼラチンカプセル剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、溶剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、再構成のための散剤及び顆粒剤、分散性散剤及び顆粒剤、薬用ガム、咀嚼錠剤及び発泡錠剤を含む。
式(I)の化合物又は式(I)の化合物を含む上で記載した医薬組成物は任意の簡便な投与経路によって対象に投与されてもよいが、それらは経口的に(特に摂取/嚥下によって)投与されることが好ましい。
したがって、化合物又は医薬組成物は、例えば、即時、遅延、調節、持続、パルス又は制御放出適用のための、香味又は着色剤を含有してもよい、錠剤、カプセル剤、腔剤、エリキシル剤、溶剤又は懸濁剤の形態で、経口的に投与することができる。
錠剤は、添加剤、例えば、微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム及びグリシン、崩壊剤、例えば、デンプン(好ましくは、トウモロコシ、バレイショ又はタピオカデンプン)、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及び特定の複合シリケート、及び顆粒結合剤、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、スクロース、ゼラチン及びアカシアを含有してもよい。加えて、滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル及びタルクを含めてもよい。類似タイプの固形組成物もゼラチンカプセル剤中の充填剤として用いられてもよい。この関連で、好ましい添加剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、又は高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁剤及び/又はエリキシル剤に関して、剤は、様々な甘味又は香味剤と、発色物質又は染料、乳化及び/又は懸濁化剤と及び賦形剤、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリン、及びその組合せと組合せてもよい。
本発明による化合物又は医薬組成物は、HBV感染の開始の前又は後のいずれか、好ましくは、HBV感染の開始後に、対象/患者に投与されてもよい。さらに、いくつか分割された投与量ならびに時差的な投与量(staggered dosage)が、毎日又は順次投与されてもよい。さらに、医薬組成物又は製剤の投与量は、治療的又は予防的な状況の緊急の要求によって指示されるように比例して増加又は減少してもよい。
本発明の化合物又は医薬組成物の対象/患者(好ましくは、ヒト)への投与は、公知の手順を使用して、対象/患者のHBV感染の治療に有効な投与量及び期間で実行してもよい。治療効果を達成するのに必要な治療化合物の有効量は、患者の疾患又は障害の状態;年齢、性別、及び患者の体重;及び治療化合物の患者のHBV感染を治療する能力などの因子により変動しうる。投与レジメンは、最適な治療上の応答を提供するため調整されうる。例えば、いくつかの分割された用量が、毎日投与され得るか、又は用量は、治療状況の緊急の要求によって示されるように、比例して低減されうる。本発明による式(I)の化合物に関する有効量範囲の限定されることのない例は、一日当たり約1から約5000mg/kg体重である。当業者は、過度の実験をすることなく、関連性のある因子を容易に研究し、化合物の有効量に関して決定を下すことができる。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対して毒性であることなく、特定の患者、組成物、及び投与の様式に対する所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るために変動しうる。特に、選択される投与量レベルは、用いられる具体的な化合物の活性、投与の時間、化合物の***の速度、処置の持続時間、化合物と組合せで使用される他の薬物、化合物又は物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、健康状態及び以前の病歴、並びに医学分野で周知の類似の因子を含む、様々な因子に依存する。当該技術分野における通常の知識を有する医学博士(例えば、医師)は、必要とされる化合物又は医薬組成物の有効量を容易に決定及び処方しうる。例えば、医師は、医薬組成物に用いられる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで開始し、所望の影響が達成されるまで投与量を徐々に増加させてもよい。
特に、投与の容易性及び投与量の均一性のために、化合物を単位剤形に製剤化することが有利である。本明細書に使用される、単位剤形は、処置される対象/患者にとって単位投与量として適した物理的に別々の単位を指す。治療化合物の所定の量を含有する各単位は、要求される薬学的ビヒクルと共同して所望の治療効果を産するために計算される。本発明の単位剤形は、(a)治療化合物の固有の特性及び達成される特定の治療効果、及び(b)患者のHBV感染の処置のための、そのような治療化合物を配合する/製剤化する、当技術分野で特有の制限によって決定され且つ直接的に依存する。
例えば、本発明の化合物又は医薬組成物は、一日当たり一から五回又はそれ以上の範囲の投与量で対象/患者に投与されてもよい。或いは、本発明の化合物又は医薬組成物は、一日一回、二日毎、三日毎から週一回、及び二週毎一回を含むが、限定されない、投与量の範囲で対象/患者に投与されてもよい。本発明の様々な組合せ組成物の投与の頻度が、年齢、病的状態、性別、全体的な健康、及び他の因子を含むが、限定されない、多くの因子に応じて、個体間で変動することは、当業者には容易に明らかとなろう。したがって、本発明は、任意の特定の投与レジメンに限定されるものと解釈すべきではない。任意の患者に投与される正確な投与量及び医薬組成物は、患者についての全ての因子を考慮に入れ、主治医又は獣医師が決定する。
本発明の化合物又は医薬組成物は、例えば、用量(それぞれの式(I)の化合物の非塩形態の用量を参照して)、約1μgから約10,000mg、約20μgから約9,500mg、約40μgから約9,000mg、約75μgから約8,500mg、約150μgから約7,500mg、約200μgから約7,000mg、約3050μgから約6,000mg、約500μgから約5,000mg、約750μgから約4,000mg、約1mgから約3,000mg、約10mgから約2,500mg、約20mgから約2,000mg、約25mgから約1,500mg、約30mgから約1,000mg、約40mgから約900mg、約50mgから約800mg、約60mgから約750mg、約70mgから約600mg、約80mgから約500mg、又はその間の任意の全体的又は部分的な増分の範囲で経口的に投与されてもよい。
上に説明したように、本発明の化合物の治療有効量又は用量は、対象/患者の年齢、性別及び体重、対象/患者の現在の医学的な状態及び処置される対象/患者におけるHBV感染の進行に依存する。当業者は、これらの及び他の因子に応じて適切な投与量を決定することができる。本発明の化合物の適切な用量は、一日当たり約0.01mgから約5,000mg、例えば、約0.1mgから約1,000mg、例えば、約1mgから約500mg、例えば、一日当たり約5mgから約250mgの範囲であってもよい。
用量は、単一の投与量又は複数の投与量、例えば、一日当たり1から4又はそれ以上の回数で投与されてもよい。複数の投与量が使用されるとき、各投与量の量は同じであってもよい又は異なってもよい。例えば、一日当たり1mgの用量が、二回の0.5mg用量として、用量間に約12時間の間隔をおいて投与されうる。一日当たり投与される化合物の量が、非限定的な例では、毎日、隔日、2日毎、3日毎、4日毎、又は5日毎投与されうることが理解される。例えば、隔日投与では、一日当たり5mg用量が、最初に月曜日に開始され、続いて一日当たり5mg用量が水曜日に投与され、二番目に続いて一日当たり5mg用量を金曜日に(以下同様)投与されてもよい。
対象/患者の状態の改善が認められたら、必要に応じて維持量を投与することができる。続いて、投与の投与量又は頻度、又は双方は、疾患の改善が保持されるレベルまで、ウイルス負荷の関数として、低減することができる。一実施形態では、対象/患者は、症状及び/又は感染の任意の再発に際し、長期間の間欠的な処置を必要とする。
本発明の化合物は、単位剤形に製剤化されうる。用語「単位剤形」は、処置を受けている対象/患者に対する単位投与量として適切な物理的に別々の単位を指し、各単位は、任意選択で適切な医薬担体と共同して、所望の治療効果を産するよう算出された活性物質の所定の量を含有する。単位剤形は、単一の一日用量又は複数の一日用量(例えば、一日当たり約1から4回)の一つに対するものであってもよい。複数の一日用量が使用されるとき、単位剤形は各用量に関して同じであってもよい又は異なってもよい。
そのような治療レジメンの毒性及び治療有効性は、任意選択で、細胞培養又は実験動物で決定され、これにはCC50(生存細胞の50%の細胞死を引き起こす化合物の細胞毒性濃度)及びIC50(病原体の50%を阻害する最小濃度)の決定が含まれるが、これらに限定されない。毒性効果と治療効果の間の用量比は、治療指数であり、CC50とIC50の間の比として表現される。高い治療指数を呈する化合物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、任意選択で、ヒト対象/患者に使用するための投与量の範囲を処方するのに使用される。そのような化合物の投与量は、好ましくは、最小毒性のIC50を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、任意選択で、用いられる剤形および利用した投与経路に応じて、この範囲内で変動する。
式(I)の化合物又は式(I)の化合物を含む医薬組成物は、単独療法(例えば、HBV感染に対して任意の更なる治療剤を付随して投与することなく)で投与することができる。しかしながら、式(I)の化合物又は式(I)の化合物を含む医薬組成物はまた、一つ又は複数の更なる治療剤、特に一つ又は複数の更なる抗HBV剤(すなわち、HBV感染に対する一つ又は複数の更なる治療剤)との組合せで投与することができる。
そのような更なる抗HBV剤は、例えば、HBVポリメラーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、ウイルス侵入阻害剤、ウイルス成熟阻害剤、カプシドアセンブリー阻害剤/モジュレーター、TLRアゴニスト、HBVワクチン、免疫調節薬、インターフェロン、又はペグ化インターフェロンであってもよい。逆転写酵素阻害剤(又はHBVポリメラーゼ阻害剤)の例には、特に、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、2',3'-ジデオキシアデノシン(ddA)、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、エムトリシタビン、エンテカビル、アプリシタビン(apricitabine)、アテビラピン(atevirapine)、リバビリン、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、テノホビル(tenofovir)、アデホビル(adefovir)、シドフォビル、エファビレンツ、ネビラピン、デラビルジン、エトラビリン、テルビブジン(telbivudine)、又は前述の剤のいずれか一つの薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグ(例えば、テノホビルアラフェンアミド(tenofovir alafenamide)、テノホビルアラフェンアミドフマル酸塩、テノホビルジソプロキシル、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩、又はアデホビルジピボキシル)が含まれる。カプシドアセンブリー阻害剤/モジュレーターの例には、特に、BAY41-4109又はその薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグが含まれる。TLRアゴニストの例には、特にTLR7アゴニスト又はTLR9アゴニストが含まれ;TLR7アゴニストは、例えば、SM360320(又は9-ベンジル-8-ヒドロキシ-2-(2-メトキシ-エトキシ)アデニン)、AZD8848(又はメチル[3-({[3-(6-アミノ-2-ブトキシ-8-オキソ-7,8-ジヒドロ-9H-プリン-9-イル)プロピル][3-(4-モルフォリニル)プロピル]アミノ}メチル)フェニル]酢酸塩)、又はその薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグであってもよい。インターフェロンの例には、特にインターフェロンアルファ(例えば、インターフェロンアルファ-2a又はインターフェロンアルファ-2b)、インターフェロンガンマ、又はインターフェロンラムダが含まれる。ペグ化インターフェロンの例には、特にペグ化インターフェロンアルファ(例えば、ペグインターフェロンアルファ-2a又はペグインターフェロンアルファ-2b)、ペグ化インターフェロンガンマ、又はペグ化インターフェロンラムダが含まれる。抗HBV剤の更なる例には、限定されないが、AT-61(又は(E)-N-(1-クロロ-3-オキソ-1-フェニル-3-(ピペリジン-1-イル)プロパ-1-エン-2-イル)ベンズアミド)、AT-130(又は(E)-N(1-ブロモ-1-(2-メトキシフェニル)-3-オキソ-3-(ピペリジン-1-イル)プロパ-1-エン-2-イル)-4-ニトロベンズアミド)、又はその薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグが含まれる。
式(I)の化合物が更なる抗HBV剤との組合せに使用される場合、各化合物の用量は、対応する化合物が単独で使用されるときと異なっていてもよく、特に、各化合物のより低い用量が使用されうる。式(I)の化合物と一つ又は複数の更なる抗HBV剤の組合せは、式(I)の化合物及び更なる抗HBV剤(単一の医薬製剤又は別個の医薬製剤いずれかにおいて)の同時の/付随する投与、又は式(I)の化合物及び更なる抗HBV剤の逐次/別個の投与を含んでいてもよい。投与が逐次である場合、本発明による式(I)の化合物又は一つ又は複数の更なる抗HBV剤いずれかが、最初に投与されてもよい。投与が同時である場合、一つ又は複数の更なる抗HBV剤は、式(I)の化合物として(特に固定用量の組合せとして)、同じ医薬組成物/製剤に含めてもよい又はそれらは、二つ又はそれ以上の異なる(別個の)医薬組成物/製剤(又は異なる剤形)中で投与されてもよい。そのような異なる医薬組成物/製剤は、同じ投与経路又は異なる投与経路を介して投与されてもよい(例えば、剤の一つが経口的に投与されてもよい且つ別の一つの剤が非経口的に投与されてもよい)。異なる医薬組成物/製剤の各々の剤形は、意図される投与経路に応じて適切に選ぶことができる。二つ(又はそれ以上の)異なる医薬組成物/製剤(又は異なる剤形)は、同じパッケージング、特に組合せパック(又はコンビニエンスパック)に含めることもできる。したがって、上に説明したように、式(I)の化合物及び一つ又は複数の更なる抗HBV剤は、例えば、固定用量の組合せ(すなわち、同じ医薬組成物中)又は組合せパック(すなわち、同じパッケージングに含められる、別個の医薬組成物中)として提供されてもよい。
したがって、本発明は、HBV感染(本明細書に上で記載された任意の特定のタイプのHBV感染を含む)の処置に使用するための、式(I)の化合物又は薬学的に許容されるその塩、又は前記化合物と薬学的に許容される添加剤の組合せを含む医薬組成物に関し、ここで、化合物又は医薬組成物は、一つ又は複数の更なる抗HBV剤(例えば、上記の一つ又は複数の特定の抗HBV剤、例えば、インターフェロンアルファ(例えば、インターフェロンアルファ-2a又はインターフェロンアルファ-2b)、インターフェロンガンマ、インターフェロンラムダ、ペグ化インターフェロンアルファ(例えば、ペグインターフェロンアルファ-2a又はペグインターフェロンアルファ-2b)、ペグ化インターフェロンガンマ、ペグ化インターフェロンラムダ、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、2',3'-ジデオキシアデノシン(ddA)、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、エムトリシタビン、エンテカビル、アプリシタビン、アテビラピン、リバビリン、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、テノホビル、テノホビルアラフェンアミド、テノホビルアラフェンアミドフマル酸塩、テノホビルジソプロキシル、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩、アデホビル、アデホビルジピボキシル、シドフォビル、エファビレンツ、ネビラピン、デラビルジン、エトラビリン、テルビブジン、BAY41-4109、SM360320、AZD8848、AT-61、AT-130、又は前述の剤のいずれか一つの薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグ)と組合せて投与される。本発明の化合物又は医薬組成物と一つ又は複数の更なる抗HBV剤の併用投与は、例えば、同時の/付随する投与(単一の医薬製剤又は別個の医薬製剤のいずれかにおいて)又は逐次/別個の投与によって成立してもよい。
本発明に従って処置される対象又は患者は、動物(例えば、非ヒト動物)であってもよい。好ましくは、対象/患者は、哺乳動物である。より好ましくは、対象/患者は、ヒト(例えば、男性のヒト又は女性のヒト)又は非ヒト哺乳動物(例えば、マーモット、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、サル、類人猿(ape)、マモセット、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、ギボン、ヒツジ、ウシ、又はブタ)である。最も好ましくは、本発明に従って処置される対象/患者は、ヒトである。対象/患者(好ましくは、ヒト対象)は、更に、例えば、免疫不全の対象、HIV陽性の対象、免疫抑制性の対象、又は臓器移植レシピエントであってもよい。
本明細書に使用される、(疾患又は障害の)「処置(treatment)」又は「処置すること(treating)」の用語は、文脈によって矛盾していない限り、以下を指す、一つ又は複数の症状又は臨床的に関連性のある疾患又は障害の徴候を、治癒すること、軽減すること、低減すること又は予防すること、又は疾患又は障害を、軽減すること、反転させること又は排すること、又は疾患又は障害の発生を、予防すること、又は疾患又は障害の進行を、予防すること、低減すること又は遅延させること。例えば、症状又は臨床的に関連性のあるそれぞれの疾患又は障害の徴候が同定されていない対象又は患者の処置は、予防又は予防的処置であるが、一方、症状又は臨床的に関連性のあるそれぞれの疾患又は障害の徴候が同定されている対象又は患者の「処置」は、例えば、治療的処置又は緩和的処置(palliative treatment)であってもよい。これらの処置の形態の各1つは、本発明の区別される態様と考えられうる。
障害又は疾患の「処置」は、例えば、障害又は疾患の進行の停止(例えば、症状の悪化がない)又は障害又は疾患の進行の遅延(進行の停止が、一過性の性質のもののみの場合)につながりうる。障害又は疾患の「処置」はまた、障害又は疾患を患う対象/患者の部分的な応答(例えば、症状の寛解)又は完全寛解(例えば、症状の消失)につながりうる。したがって、障害又は疾患の「処置」はまた、例えば、障害又は疾患の進行の停止又は障害又は疾患の進行の遅延につながりうる、障害又は疾患の寛解を指しうる。そのような部分的な又は完全寛解は、後に再発する可能性がある。対象/患者が、処置に対する広い範囲の応答(例えば、本明細書に上で記載されるような、例示的な応答)を経験しうることが理解される。障害又は疾患の処置は、特に、障害又は疾患の治療的処置(好ましくは、完全寛解及び最終的に障害又は疾患の治癒につながる)、緩和的処置(症状軽減を含む)、又は予防的処置(予防を含む)を含みうる。
本発明が、一般的な及び/又は好ましい特徴/実施形態の任意の組合せを含む、本明細書に記載される特徴及び実施形態の各及びすべての組合せに特異的に関することが理解される。特に、本発明は、式(I)において構成される様々な基及び変数についての意味(一般的な及び/又は好ましい意味を含む)の各組合せに特異的に関する。
本明細書に記載される任意の方法の全ての工程が、一般的に、別段に示されない限り又は文脈によって矛盾していない限り、任意の適切な順序で実施できることが更に理解される。好ましくは、任意のそのような方法工程が、それらが示される特定の順序で実行される。
本明細書において、特許又は特許出願、科学文献及び製造者のマニュアルを含む幾つかの文書が引用される。本発明の特許性に関連があると考えられないが、これらの文書の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。より具体的には、参照される文書は全て、個々の各文書が参照により組み込まれると具体的且つ個別に示されたかのごとく、同程度まで参照により組み込まれる。
本明細書での任意の以前の公開(又はそれから由来する情報)の参照は、謝辞又は承認又は対応する以前の公開(又はそれから由来する情報)が、本明細書に関する技術分野における技術常識の一部を形成するとの何らかの形の示唆ではなく且つそのように受け取られるべきではない。
本発明は、例証となる以下の図によっても説明される。
成熟スクリーンによって、HLCの成熟を増進する小分子が同定された。(A) HLC成熟スクリーニングカスケードを示す図である。 (B) MB-1で処理後のHLCにおいて全ゲノムトランスクリプトームマイクロアレイを行い、137の肝臓シグネチャー遺伝子(肝臓において特異性ジニ指数>0.8で高度に発現される遺伝子)のmRNA発現を示す図である。レーン1〜3:それぞれ、7日、24時間、及び2時間時点のMB-1 (5μM)。レーン4〜6:それぞれ、7日、24時間、及び2時間時点のMB-1 (0.5μM)。 (C) (MB-1で2時間、24時間、及び7日間処理後の)HLCトランスクリプトームのBioQC肝臓スコア分析をPHH、HepaRG、及びHepG2の分析と比較したグラフである。 (D) MB-1又は1% DMSOで14日間処理した後のHLCにおけるAAT-1αの発現を示す像である。 (E) MB-1で処理したHLCが堅牢なHBV感染を維持することを示すグラフである。(96ウェルプレートにおける) HLCをMB-1 (1μM)又は1% DMSOで4日間処理し、患者由来HBVに感染させた(MOI 10、三連で)。表示した時点において培養培地を収穫し、HBsAgについて分析した。 HLCは、HBVの疾患関連モデルである。(A) HBV生活環の概略図である。 (B〜F) HLC及びPHHにおけるHBV感染の動態を示すグラフである。(96ウェルプレートにおける)細胞にHBVに感染させ(MOI 40、三連で)、14日間培養した。表示した時点において培養培地及び細胞溶解物を収穫し、示したとおりの種々のHBVマーカーについてアッセイした。 図２Ｂ参照。 (G) サザンブロットアッセイによる、HBV感染細胞におけるcccDNAの検出を示す像である。HLC及びPHHに患者由来HBVに感染させ、感染後10日目に、Hirt抽出法によって収穫した。サンプルをT5エキソヌクレアーゼで消化した後、ゲルに載せた。全長3.2kb HBV (+)鎖RNAプローブを、HBV DNA検出に使用した。 (H) HLC及びPHH感染細胞の抗HBs及び抗HBc抗体による免疫染色を示す像である。 (I) HLCが、種々のGTからの臨床HBV分離株の堅牢な感染を維持することを示すグラフである(MOI 40、三連で、384ウェルプレート)。感染後14日目にHBsAg及びHBeAgを測定した。 新規cccDNA阻害剤を発見するためのHLCにおける約247K HTS。(A) HLC及びPHHアッセイの再現性を示すグラフである。細胞を患者由来HBVにMOI 40で感染させた。感染後3日目に、参考化合物を、100μMから開始して3倍希釈で加えた。HLCでは30回、PHHでは62回実験を繰り返しており、各線が、各実験についてのHBsAg又はHBeAg IC50曲線を表す。 (B) (HLCにおける)HTSアッセイ及び(PHHにおける)スクリーニングカスケードの概略図である。 (C) HLC一次ヒットを示すグラフである。マルチプレックス読取りに基づくHLC一次ヒットの積み重ねドットプロットグラフである(40%を超えるアルブミンを阻害した化合物は分析から除外した)。グラフ中の各ドットによって、HBsAg (青色)又はHBeAg (緑色)のいずれかを阻害する化合物を示した。赤色の点で囲まれた枠によって、両方のHBV抗原を60%を超えて阻害する3752種の化合物を強調表示している。 (D) PHHにおけるHLCヒット(n=1027)の効力を示すグラフである。HLCヒットをPHHにおいて検査しており、それらの、HLC及びPHHにおけるHBsAg及びHBeAgに対するIC50値を示す。点線は、各細胞型におけるすべての化合物の平均HBsAg及びHBeAg IC50値を示す。 (E) HLC及びPHHにおけるHLCヒットのHBsAg/HBeAgとpgRNA活性間の相互関係を示すグラフである。HLCヒット(n=244)は、HBsAg及びHBeAg (IC50中央値 それぞれ、1.72μM及び1.55μM)とpgRNA活性(IC50中央値 2.64μM)に対するその効力間の良好な相互関係を示した。PHHでも同様の結果が得られ、127種の化合物によって、それぞれ、11.40μM、10.90μM、及び12.20μMという、HBsAg、HBeAg、及びpgRNA IC50中央値が示された。 (F) PHHにおけるcccDNA不安定化剤の活性の、サザンブロットアッセイによる確認を示す像である。PHHをHBV (GT D)に感染させ、感染後3日目に、2又は6μMの化合物7及び参考化合物1で処理した。感染後10日目に、Hirt抽出物を調製し、サザンブロットによって分析した。各サンプルについて、ミトコンドリアDNA (mtDNA)をローディング対照として使用した。 PHHにおけるcccDNA不安定化剤の分子表現型解析。(A)主成分分析(PCA)を示すグラフである。HBVに感染させてから(又は1% DMSOで処理してから)3日後、PHHを化合物7及び参考化合物1(それぞれ、活性のより低いその異性体も加えた)と共に6時間インキュベートし、次いで収穫した。すべての実験条件を三連で遂行した。示したPCAは、917の経路レポーター遺伝子のAmpliSeq-RNAデータに基づくものである。 (B) cccDNA不安定化剤の経路ヒートマップを示す図である。HBVによって、又は化合物7若しくは参考化合物1のいずれかによって有意(p<0.001)に調節される経路を、ヒートマップとして可視化している。 PHHにおける患者由来HBV GT A〜Dに対する化合物7の抗ウイルス活性。384ウェルプレートに播種したPHHを、患者由来HBV (GT A〜D)に、MOI 40で、三連で感染させた。感染後3日目に、化合物7を、156μMで開始して3倍希釈で加えた。1% DMSOを陰性対照として使用した。2日毎に新鮮な培地及び化合物を補充し、感染後10日目に細胞を収穫した。(A〜B) HBV遺伝子型A〜Dの、培養培地に放出されたHBsAg及びHBeAg並びにcccDNAコピー数/ウェル(384ウェルプレートフォーマット)の、感染後10日目における化合物なしでのベースラインレベルを示すグラフである。 (C) HBsAg、HBeAg、及びHBV DNA読取り情報に基づく、HBV GT A〜Dに対する化合物7の抗ウイルス活性を示すグラフである。アルブミンは、細胞毒性マーカーである。 (D) cccDNA読取り(デジタルPCR)に基づく、HBV GT A〜Dに対する化合物7の抗ウイルス活性を示すグラフである。 HLCにおける96の肝臓に豊富な遺伝子の発現に対するMB-1の効果を示すグラフである。コラーゲンIでコートされた6ウェルプレートに播種したHLCを、1% DMSO中のMB-1 (1、5、若しくは10μM)又は1% DMSOで4日間(それぞれ三連で)処理した。細胞を収穫し、96の肝臓に豊富な遺伝子の発現を、微小流体用RT-qPCR (Fluidigm社)によって分析した。 OptiPrep(商標)勾配による患者血清からのHBV精製を示すグラフである。SW41管(BD Biosciences社)において、OptiPrep(商標)密度勾配(100,000×g 4℃で2時間)を使用して、CHB個体の血清からHBVを精製した。上部から20の分画(500μlずつ)を回収し、各分画の分割量を、HBV DNA及びHBsAgについて分析した。多量のHBV DNA (ウイルス粒子)を含有するピーク分画をプールし、感染実験に使用する。 cccDNA定量化のためのdPCRアッセイの確立。(A) TaqMan-PCRアッセイの検出範囲によって、96及び384ウェルプレートからのcccDNAコピー数の正確な決定が限定されることを示すグラフである。3.2kbの直線化したプラスミドHBVを、TaqMan-PCRによるHBV DNAの相対的定量化のための検量線として使用する。プラスミドを10倍希釈し(2×109コピー/μl〜2×103コピー/μl)、コアプライマー(Werle-Lapostolleら、2004)を使用してHBV DNAを増幅しており、このアッセイのLLOD (約1×103コピー/μl)が、384ウェルプレートにおいて増殖させた細胞中に存在するcccDNAの下方レベルと一部重なる。384ウェルプレートにおけるHLC及びPHHにおけるcccDNAの総量は、約1,200〜12,000コピー/ウェルである(播種された約30Kの細胞の40%の感染率を想定、平均して0.1〜1 cccDNAコピー/細胞が存在する) (Nassal、2015)。 (B) 検査用プライマー及びPCR特異性並びに余分なRC-DNAの除去を示すグラフである。TaqMan-PCR (相対的定量化法)とは対照的に、デジタルPCR (dPCR)は、検量線を必要としない絶対的定量化法である。この方法は、TaqMan-PCRより高感度(約50倍)であり、サンプルあたりより多くの反復実験(アレイ/スルーホール)を検査することにより、アッセイ精度を高めることができる。第1のステップ-検査用プライマー及びPCR特異性。血清由来HBV (RC-DNAを含み、cccDNAを含まない)を、2組のプライマー(HBVコア及びcccDNA領域用)を使用するdPCR用のDNA鋳型として使用した(Werle-Lapostolleら、2004)。QuantStudio 12K Flex Real-Time PCRシステム(AB社)におけるdPCRによってサンプルを増幅し、各サンプルに4つのサブアレイ(256のスルーホール)を使用した。弱いシグナルがcccDNAプライマーで検出され、RC-DNAの非特異的な増幅が示された。第2のステップ-余分なRC-DNAの除去。96ウェルに播種したPHHを、HBVに感染させた。感染後6日目に、細胞溶解物を、Plasmid safe ATP-dependent DNAse (PSAD)、T5エキソヌクレアーゼ、又はT5エキソヌクレアーゼに続いてEcoRIで、37℃にて1時間消化した。QuantStudio 12K Flex Real-Time PCRシステム(AB社)においてcccDNAプライマーを使用するdPCRによってサンプルを増幅し、各サンプルに4つのサブアレイ(256のスルーホール)を使用した。dPCRの前にT5エキソヌクレアーゼで処理することにより、余分なRC-DNAが効率よく除去された。(C) PHHにおける、HBV DNA、HBsAg、HBeAg、及びcccDNAに対するエンテカビル(ETV)及びRoferonの効果を示すグラフである。自然感染細胞におけるcccDNA検出についてdPCRアッセイをバリデートするために、PHHを患者由来HBV(GT D、MOI 40)に感染させ、3日後、表示した濃度のETV及びRoferonで処理した。どちらの化合物もHBV DNAに対して非常に強力であるが、他のウイルスマーカーに対しては効果を示さない。2日毎に新鮮な培地及び化合物を補充した。感染後10日目に、培養培地を収穫し、HBV DNA、HBsAg、及びHBeAgについて測定した。アルブミンを、in vitro毒性マーカーに代替として使用した。細胞を溶解させ、T5エキソヌクレアーゼで処理し、次いで、QuantStudio 12K Flex Real-Time PCRシステム(AB社)におけるdPCRによってcccDNAを測定し、各サンプルに4つのサブアレイ(256のスルーホール)を使用した。 (D) PHHにおける、HBV DNA、HBsAg、及びHBeAgに対するエンテカビル(ETV)及びRoferon (Rof)の効果を示すグラフである。細胞を、感染(患者由来HBV、GT D)後3日目から開始して、表示した濃度の化合物で処理した。2日毎に新鮮な培地及び化合物を補充した。感染後10日目に細胞を収穫し、培養培地からウイルスマーカー及びアルブミンを測定した。 サザンブロットアッセイによる、HBV感染PHH及びHLCにおけるcccDNAの検出を示す像である。24ウェルプレートにおいて増殖させた細胞を、患者由来HBV (GT D)に感染させ、感染後10日目に、Hirt抽出法によって収穫した。(左、PHH) HBV感染細胞において検出された一次バンド(レーン2)がcccDNAであることを立証するために、サンプルを85℃で5分間加熱して、rcDNA及びdslDNAを変性させてssDNAとし(レーン3)、EcoRIで消化してcccDNAをdslDNAに変換し(レーン4)、又はT5エキソヌクレアーゼで消化して、ニック入り/線状DNA断片を除去した(レーン5)。各レーン2〜5は、約100万個の細胞に相当する。全長3.2kb HBV (+)鎖RNAプローブを、HBV DNA検出に使用した。rcDNA:弛緩型環状DNA、dslDNA:二本鎖線状DNA、cccDNA:共有結合性閉環状DNA。 患者由来HBV (GT A)に感染させたHLC及びPHHの免疫染色を示す像である。384ウェルプレートに播種した細胞を、患者由来HBV (GT A、MOI 40)に感染させ、感染後12日目に、固定し、抗HBVコア及び抗HBs抗体で染色した。 一次HTS読取りとしてのマルチプレックスアッセイ。(A) Zスコアの決定を示す像である。384ウェルプレートに播種したHLCを、1% DMSOの存在下で患者由来HBV (MOI 40)に感染させるか(19プレート)、又は参考化合物で処理した(1プレート)。合計20プレート。感染後14日目に、すべてのプレートからの培養培地を、Luminexベースのマルチプレックスアッセイ(Radix BioSolutions社、テキサス州Georgetown)によって、HBsAg、HBeAg、及びアルブミンについて、同時に測定した。GeneDataソフトウェアによってデータ解析を行い、各プレート上の各分析物についての画像を取り込んだ。(384ウェル)プレートのそれぞれを数字で表示した。 (B) 化合物毒性の予測因子としてのアルブミンを示すグラフである。384ウェルプレートに播種したHLCを、患者由来HBV (MOI 40)に感染させ、感染後3日目から開始して385種の化合物で処理した。2日毎に新鮮な培地及び化合物を補充した。感染後14日目に、培養培地を収穫し、マルチプレックスアッセイによってアルブミン阻害について分析し、細胞溶解物を標準のin vitro毒性アッセイ(細胞増殖試薬/WST-1;カタログ番号11 644 807 001、Roche Diagnostics社)によって分析した。それぞれ4つのクワドラントで示された3つのグラフによって、アルブミンが、WST-1によって検出された化合物毒性(クワドラントI)の94.81%を予測しうることが示された。重要なことに、アルブミン阻害を使用して、WST-1によって検出されなかった非特異的阻害剤(192種の化合物、49.87%) (クワドラントII)を除外することができる。 分子表現型解析(ヌクレオシド類似体及びインターフェロン-αによる影響を受けた宿主経路のヒートマップ)を示す図である。感染後3日目に、PHHを、その1×IC90値のヌクレオシド類似体(ETV)又はIFN-αのいずれかで6時間処理した。RLT緩衝液(QIAGEN社)を使用して全RNAを抽出し、逆転写させ、cDNA産物を、Ion AmpliSeq(商標)RNAライブラリーキット(Life Technologies社、米国、Carlsbad、カタログ番号4482335)を使用して増幅した。CAMERA法(Wu及びSmyth、2012)、及びMSigDB (Liberzonら、2011)やREACTOME (Fabregatら、2016)等の公的に入手可能な遺伝子セットを統合する内部で入手可能なデータベース(RONET)における遺伝子セットを使用して、経路解析を行った。CAMERAの結果は、CAMERAによって返された絶対log10変換p値を、+1 (遺伝子セットのプラスの調節)又は-1 (遺伝子セットのマイナスの調節)のいずれかで乗じた値によって規定される、エンリッチメントスコアによって表される。 PHHにおける汎遺伝子型(GT A〜D)のHBV感染を示す像である。細胞を、各HBV分離株/GTにMOI 40で感染させた。10日後、抗HBs及び抗HBc抗体で免疫染色を行った。 (A) cccDNA阻害剤が同定される見込みを高めるためのスクリーニングカスケード基本原理を示す図である。(B) cccDNA阻害剤を同定するためのスクリーニングカスケードの好ましい判定基準を示す図である。 PHHにおけるピロロ[2,3-b]ピラジン化合物の(A) HBeAg及びHBsAg活性、(B)アルブミン活性、(C) pgRNA活性、及び(D) cccDNA活性を示すグラフである(患者由来HBV、GT D)。実施例2を参照されたい。 図１５Ａ参照。 図１５Ａ参照。 PHHにおける患者由来HBV GT A〜Dに対する化合物7の抗ウイルス活性(実施例2を参照されたい)。(A)抗HBs及び抗HBc抗体を使用してのPHH感染細胞の免疫染色を示す像である。 (B〜C)感染後10日目における化合物なしでの、培養培地に放出されたHBsAg及びHBeAgレベル、及びHBV遺伝子型A〜DのcccDNAコピー数/ウェルを示すグラフである。 (D) HBsAg、HBeAg、及びHBV DNA読取り情報に基づく、HBV GT A〜Dに対する化合物7の抗ウイルス活性を示すグラフである。アルブミンは、細胞毒性マーカーである。 (E) cccDNA読取りに基づく、HBV GT A〜Dに対する化合物7の抗ウイルス活性を示すグラフである。 HBV GT A〜Dに対する化合物7の汎GT cccDNA活性を示すグラフである。実施例2)を参照されたい。
ここで、本発明について、以下の実施例を参照して説明するが、実施例は、例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものとは解釈さるべきではない。
(実施例1)
cccDNA阻害剤を発見するための、臨床分離株からの完全なHBV生活環を再現する幹細胞由来肝細胞様細胞における表現型スクリーニング
方法
患者血清精製
CHB個体の血清からのHBVを、OptiPrep(商標) (Axis-Shield社、ノルウェー国)密度勾配を使用して精製した。簡潔に述べると、OptiPrep(商標)保存溶液(60%)をPBSに希釈して50%及び10%とし、次いで、等体積の各溶液をSW41管(BD Biosciences社)に加えた。管を、80°、25rpm、30分に設定したGradient Master 108(商標) (Biocomp社)に設置することにより、直線的に傾斜させた。200マイクロリットル(200μl)の血清を傾斜の上部に重ね、サンプルを4℃にて100,000×gで2時間遠心分離した。上部から分画(500μl)を回収し、各分画についての分割量を、コアプライマー5'-CTGTGCCTTGGGTGGCTTT (順方向)、5'-AAGGAAAGAAGTCAGAAGGCAAAA (逆方向)、56-FAM/AGCTCCAAATTCTTTATAAGGGTCGATGTCCATG/3IABlk_FQ/ (プローブ) (Werle-Lapostolleら、2004)を使用してHBV DNAについて、またHBsAgについて分析した。HBV DNAのピークを含んでいる分画をプールし、すべての感染実験のためのウイルス接種材料として使用した。すべての分画を、使用するまで-80℃で保管した。
iPS由来肝細胞様細胞(HLC)
凍結保存されたHLCを、製造者の推奨に従って解凍し、播種した。簡潔に述べると、凍結保存された細胞を37℃の水浴において2分間解凍し、クライオバイアルの中身を、37℃のiCell肝細胞培地B (KryoThaw成分A 7.8ml、KryoThaw成分B 4.2ml)を12ml含有する15mlの管に注いだ。管をゆっくりと反転させ(約5回)、次いで、室温にて110×gで10分間遠心分離した。培地を吸引した後、2mlのRT iCell肝細胞培地C (B27補充物、オンコスタチンM 20ng/ml、デキサメタゾン1μM、及びゲンタマイシン25μg/mlを含有するRPMI)を加え、細胞をカウントした。次いで、細胞懸濁液を、Matrigel 0.25mg/mlを含有する培地Cに、100万細胞/mlで希釈した。コラーゲンIでコートされた細胞培養プレートに、40,000細胞/ウェル(384ウェルプレート)又は100,000細胞/ウェル(96ウェルプレート)で細胞を播種し、37℃のインキュベーターにおいて、加湿雰囲気中にて5% CO2で培養した。プレート播種から24時間後に、培養培地を、Matrigel 0.25mg/ml及び1μMのMB-1を含有する培地D (B27補充物、オンコスタチンM 20ng/ml、デキサメタゾン0.1μM、及びゲンタマイシン25μg/mlを含有するRPMI)と交換した。2日毎に新鮮な培地及びMB-1に変えた。
HLC成熟スクリーニング
コラーゲンIでコートされた96ウェルプレートにおいて、Matrigel 0.25mg/mlを含有する100μlの培地DにHLCを播種する。翌日(1日目)、細胞に、最終濃度を1% DMSO中に4μMとして化合物ライブラリーを加えた。2日後(3日目)、新鮮な培地及び化合物を補充した。4日目に、Cells-to-Ct lysisキット(Ambion/Thermo Fisher社)を使用して細胞を収穫し、全RNAを逆転写させ、得られるcDNA産物を、微小流体用96.96 Dynamic Array(商標)IFCに載せ、Biomark HDシステム(Fluidigm社)において、肝臓に豊富な32の遺伝子に対してアッセイした。DMSO対照におけるハウスキーピング遺伝子(PPIA)を参考として使用して、デルタCt値から関連性のある遺伝子発現を割り出し、次いで、デルタCt値を倍数変化値に変換した。HLCにおける肝臓に豊富な遺伝子発現を、DMSO対照に比べて3倍以上に増加させた化合物を、用量応答(1、5、10、及び50μM)において更に検査した。二次スクリーンは、96の肝臓に豊富な遺伝子を使用して、上記のとおりに行った。最上位の候補(MB-1)を、HLCを利用するすべての実験に使用した。
PXB-PHH
ヒト化マウス(uPA/SCIDマウス)から収穫された新鮮な一次ヒト肝細胞(PXB-PHH)-本明細書ではPHHと呼ぶ-を、PhoenixBio社(日本国)から取得した。コラーゲンIでコートされたプレートにおいて、改変肝細胞クローン増殖培地(dHCGM)に、次の細胞密度、すなわち、35,000細胞/ウェル(384ウェル)、70,000細胞/ウェル(96ウェル)、又は400,000細胞/ウェル(24ウェル)で細胞を播種した。dHCGMは、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、20mMのHepes、44mMのNaHCO3、15μg/mlのL-プロリン、0.25μg/mlのインスリン、50nMのデキサメタゾン、5ng/mlのEGF、0.1mMのAsc-2P、2% DMSO、及び10% FBSを含有するDMEM培地である(Ishidaら、2015)。37℃のインキュベーターにおいて、加湿雰囲気中にて5% CO2で細胞を培養した。播種から24時間後、収穫まで2日毎に培養培地を交換した。
HBV感染及び化合物処理
1μMのMB-1と共に4日間の成熟後、HLCを、感染多重度(MOI)10〜40で、(CHB個体から精製した)HBVと共に、PEGなしで24時間インキュベートし、翌日、ウイルス接種材料を除去した。PHHにおけるHBV感染は、MOI 40+4% PEGで行った。感染後3日目に、HLC及びPHHにおける化合物処理を開始した。(粉末の)化合物をDMSOに溶解させたが、細胞に加えたDMSOの最終濃度は、1%である。10日目(PHH)又は14日目(HLC)に細胞を収穫するまで、2日毎に新鮮な化合物を補充した。HBVに対する化合物の効果及び細胞毒性を、マルチプレックスアッセイ(HBsAg、HBeAg、アルブミン)、分岐DNA (pgRNA)、又はデジタルPCR (cccDNA)によって測定し、DMSO対照と比較した阻害%として示した。グラフは、Spotfireソフトウェアを使用して作成した。
高処理スクリーニング(HTS)
コラーゲンIでコートされた384ウェルプレートに播種したHLCを、1μMのMB-1で4日間処理した(2日毎に培地及び化合物を補充した)。4日目に、MOI 40で、細胞を(CHB個体の血清から精製した)HBVに24時間かけて感染させ、ウイルス接種材料を除去し、新鮮な培地を加えた。感染後3日目に、1% DMSO中の最終濃度を4μMとして化合物ライブラリーを加え、14日目まで2日毎に新鮮な培地及び化合物を補充した。18日間のHTSアッセイでは終始、37℃のインキュベーターにおいて、加湿雰囲気中にて5% CO2で細胞を培養し、液体の取り扱いはすべて、BSL3**施設においてロボット設備で実施した。感染後14日目に、培養培地を収穫し、マルチプレックスアッセイ用に加工した。各試行において、およそ20,000種の化合物をスクリーニングした。
HTS読取り情報
マルチプレックスアッセイ-一次読取り
HBeAg、アルブミン、及びHBsAgを同時に測定した、Luminexベースの、特別注文のマルチプレックスアッセイを、Radix BioSolutions社(テキサス州Georgetown)が開発した。これは、サンドイッチイムノアッセイであり、各捕捉抗体を、xMAP(商標)Luminex磁気ビーズとカップリングさせた。分析物検出の動的範囲は、HBeAg (1〜316ng/ml)、アルブミン(3.1〜10,000ng/ml)、及びHBsAg (0.1〜100ng/ml)であり、変動係数(coefficient variant) (CV)は、25%以下である。サンプルをFlexMAP 3D (Luminex社)で読み取り、Genedataソフトウェアによって分析した。以下の表から、各分析物に対するマルチプレックスビーズ及び検出抗体が、分析物間で交差反応性でなかったことが示された(平均蛍光強度/MFIとして報告された数)。
pgRNAアッセイ(分岐DNA)-二次読取り
xMAP(商標)Luminex磁気ビーズ及び分岐DNA (bDNA)シグナル増幅技術を利用する、ハイブリダイゼーションベースのアッセイである、QuantiGene Singleplex 2.0アッセイ(Affymetrix社)を使用して、感染細胞におけるpgRNAのレベル(96ウェルプレート)を測定した。アッセイは、96ウェルプレートにおいて、製造者の推奨に従って行った。簡潔に述べると、細胞を溶解させ、溶解物をHBVプローブセットパネルと共に、50〜55℃で30分間インキュベートし、次いで、-80℃で保管した。シグナル増幅は、PreAmplifier、Amplifier、及びLabel Probeを順次ハイブリダイズさせることにより実現される。ストレプトアビジンフィコエリトリン(SAPE)基質を加えた後、FlexMap 3D (Luminex社)機器を使用してシグナルを読む。
cccDNAアッセイ(デジタルPCR)-第3の読取り
(384又は96ウェルプレートにおける)HBV感染細胞を、Cells-to-CT溶解試薬によって、製造者の指示(Thermo Scientific社)に従って溶解させた。過剰のRC-DNAを除去するために、サンプルをT5エキソヌクレアーゼ(10U) (New England Biolabs社)によって37℃で1時間消化し、サンプルを80℃で15分間加熱することにより、酵素を失活させた。cccDNAプライマー5'-CTCCCCGTCTGTGCCTTCT (順方向)、5'-GCCCCAAAGCCACCCAAG (逆方向)、及びCGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCC (プローブ) (Werle-Lapostolleら、2004)を合計体積5μl中に含有するデジタルPCRマスターミックス(QuantStudioデジタルPCRキット、Thermo Scientific社)に、DNAサンプル(1.2μl)を加え、AccuFillシステム(AB社)を使用してdPCRアレイに載せた。各サンプルは、4つのサブアレイ/256のスルーホールに載せた。QuantStudio 12K Flex (AB社)においてデジタルPCRアッセイを試行し、Digital Suiteソフトウェア(AB社)によってデータを分析した。
cccDNAアッセイ(サザンブロット)-確認/第4の読取り
HLC又はPHHを12ウェルプレートフォーマットで播種し、上述のとおりにHBV感染させた。10日目に、細胞から、次のとおりにHIRT抽出物を調製した。簡潔に述べると、500μlのHIRT溶解緩衝液を各ウェルに加え、3つのウェルからの溶解物を合わせて、標準HIRT抽出手順(Caiら、2013)に従いながら無タンパク質HBV DNAを単離した。サザンブロット分析については、0.2μlのQuick-Load 1-kb DNAラダー(New England Biolabs社)、2pgの1×HBVゲノム長(3.2kb) PCR産物(プライマーP1/P2、Guentherら、1995)、及び5μgのHIRT抽出DNAをレーン毎に載せ、1×トリス-酢酸-EDTA緩衝液中1.0% (wt/vol)のアガロースゲルにおける50Vで3.5時間の電気泳動によって分離した。電気泳動後、記載されているとおりに(Caiら、2013)、DNAを脱プリン化し、変性させ、中和し、次いで、TurboBlotterシステム(GE Healthcare社)を使用してHybond XL膜(Amersham社)に移した。DIG Northernスターターキット(Roche社)を製造者の指示に従って使用して、T7プロモーター(HBV T7+順方向プライマー 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTTTTTCACCTCTGCCTAATCATC-3'、HBV逆方向プライマー 5'-CCTCTAGAGCGGCCGCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGT-3')を有する1×HBVゲノム長(3.2kb) PCR産物から転写されたDIG標識された(+)鎖HBV RNAプローブを用い、HBV DNAを検出した。ミトコンドリアDNAは、ミトコンドリアゲノムのND1遺伝子領域に結合するRNAプローブで検出した(Ducluzeauら、1999)。ハイブリダイゼーション、洗浄、及びCDP-Star (Roche社)による検出を、製造者の指示に従って実施した。FUSION Fx (Vilber社)を用いて画像を取得し、FUSION-CAPTソフトウェアを使用する濃度測定によってバンドを定量化した。
免疫染色
Image-iT(商標)固定/透過処理キット(Thermo Fisher社、カタログ番号R37602)を使用して、免疫染色を行った。感染後10日目に、細胞を1mlの固定溶液において室温(RT)で15分間固定し、次いで、2mlの洗浄緩衝液で2〜5分間、3回洗浄した。3% BSA、V分画、脱脂、ニュージーランド起源を含有するD-PBS緩衝液に希釈した一次抗体、引き続いて二次抗体と共に、細胞をそれぞれ室温で1時間インキュベートした。一次抗体:1.25μg/mLの抗HBs mAbであるMAK_M_RF18 (Roche社)、又は0.1μg/mLの抗HBVコア抗体(DAKO社、カタログ番号B0586)。二次抗体:2μg/mlのヤギ抗ウサギIgG (H+L)交差吸着二次抗体であるAlexa Fluor 594 (Thermo Fisher社カタログ番号A-11012)、又はヤギ抗マウスIgG (H+L)交差吸着二次抗体であるAlexa Fluor 488 (Thermo Fisher社カタログ番号A-11001)。2mlの洗浄緩衝液で2〜5分間、3回洗浄した後、細胞を、1μg/mlのHoechst 33342三塩酸塩三水和物(Thermo Fisher社カタログ番号H3570)と共に室温で15分間インキュベートした。免疫染色をAxio Observer倒立顕微鏡(Zeiss社)及びZeiss ZENソフトウェアで分析した。
分子表現型解析
感染後3日目に、細胞を化合物又は1% DMSOで6時間処理した。RLT緩衝液(QIAGEN社、スイス国、Hombrechtikon)を使用して総RNAを抽出し、サンプルを-80℃で保管した。各生物学的反復実験からの総RNA 10ngを逆転写させ、Ion AmpliSeq(商標)RNAライブラリーキット(Life Technologies社、米国、Carlsbad、カタログ番号4482335)を用い、支給されたプロトコールに従って、cDNA産物を増幅した。プライマーを消化した後、増幅産物にアダプター及びバーコードを連結してから、磁気ビーズ精製した。精製したライブラリーを増幅し、精製し、-20℃で保管した。Agilent High Sensitivity DNAキット(Agilent Technologies社、ドイツ国、Waldbronn)を製造者の手引きに従って使用して、増幅産物サイズ及びDNA濃度を測定した。CAMERA法(Wu及びSmyth、2012)、及びMSigDB (Liberzonら、2011)やREACTOME (Fabregatら、2016)等の公的に入手可能な遺伝子セットを統合する内部で入手可能なデータベース(RONET)における遺伝子セットを用いて、経路解析を行った。CAMERAの結果は、CAMERAによって返された絶対log10変換p値を、+1 (遺伝子セットのプラスの調節)又は-1 (遺伝子セットのマイナスの調節)のいずれかで乗じた値によって規定される、エンリッチメントスコアによって表される。
結果
HLCの成熟を増進した小分子の同定
HBV薬物を発見するための疾患関連アッセイとしてのHLCの潜在的可能性を完全に明示するには、次の判断基準、すなわち、肝細胞類似性、拡張可能性、アッセイ堅牢性(assay robustness)、及び再現性が満たされなくてはならない。HLCが依然として未熟な表現型を呈する、すなわち、成体肝細胞より胎児肝細胞に似ることは、よく知られている(Baxterら、2015;Godoyら、2015;Goldringら、2017)。現用のプロトコールで完全に成熟したHLCを得ることの難しさは、ドナー起源のばらつき(Kajiwaraら、2012;Heslopら、2017)、及び肝臓帯状分布を含む肝臓構造の複雑さの模倣が不十分である培養条件(Goldringら、2017)を始めとして、多くの要素からなる。実際に、肝細胞は、肝臓の門脈中心軸(porto-central axis)に沿ったその位置に応じて、重要な肝臓遺伝子、したがって種々の代謝機能を示差的に発現した(Halpernら、2017;Soto-Gutierrezら、2017;Torreら、2010)。創薬におけるHLCの適用に関する別の肝要な論点は、拡張可能性であり、HTS及び後続の数回反復されるヒット追跡を試行するには、(純度が高く、バッチ間のばらつきが最小限に抑えられた)数十億の細胞が必要である。本発明者らは、民間供給元(CDI社、ウィスコンシン州、Madison)からHLCを選んでおり、本発明者らの最初の取り組みは、生物活性のある約700種の化合物からなる小分子ライブラリーを使用して、その成熟を向上させることであった。製造者の推奨(Luら、2016)に従って細胞を培養し、化合物ライブラリー(4μM)と共にインキュベートした。肝成熟を増進したヒットを同定するために、本発明者らは、32 (1番目のスクリーン)又は96 (2番目のスクリーン)の肝臓に豊富な遺伝子の上向き調節に基づく2段階のスクリーニングカスケードを適用した(図1A及びTable 1 (表2)を参照されたい)。肝臓に豊富な遺伝子のmRNA発現を比較的低い濃度(≦5μM)で増進しうるその能力に基づいて、最上位のヒットであるMB-1を選択した(図6を参照されたい)。ゲノム全体のマイクロアレイ分析では、MB-1によって、HLCにおける肝臓組織シグネチャー、すなわち、約237の肝臓に豊富な遺伝子(Table 2 (表3、表4、表5、表6)を参照されたい)のmRNA発現が、時間及び用量依存的に上向き調節され、137の遺伝子が肝臓において高度に発現されることが示された(特異性閾値:それぞれ、ジニ指数>0.7及び>0.8;ジニ指数の定義については、Zhangら、2017を参照されたい) (図1Bを参照されたい)。特に、SLC10A1 (NTCP、HBV受容体)等のHBV依存性因子、並びにHBVプレゲノムRNA合成及びウイルスDNA複製に不可欠である、転写因子HNF4α、RXRα、及びPPARが挙げられる(Tang及びMcLachlan、2001)。本発明者らは、BioQC解析を使用して、HLCの肝臓組織シグネチャーを他のHBV系(HepG2、HepaRG、及びPHH)の肝臓組織シグネチャーと比較した。BioQCは、150の組織に豊富な遺伝子シグネチャーに対する任意の遺伝子発現データの比較を可能にする、監修された生命情報科学ソフトウェアであり、結果は、log10p (Wilcoxon検定の絶対log10変換p値)の形で、各サンプルについて、各組織シグネチャーのエンリッチメントスコアとして報告される(Zhangら、2017)。ベースラインにおいて、HLCは、HepaRGと同等の肝臓スコアを有し、MB-1処理によって、HLCの肝臓スコアは、HepaRGの肝臓スコアよりも高くまで、かなり増大した(図1Cを参照されたい)。MB-1は、HLCを成体肝細胞へと更に分化させるには十分でなく、これは、単層培養条件、並びに他の未知の要素のせいである可能性がある。HLC及びHepaRGはまた、HepG2より肝臓様の表現型を示した。HepG2細胞株のPHHとの類似性が不十分であることは知られており、HepG2では、肝臓に豊富な遺伝子の多くが、下向き調節されているか、又は完全に「オフ」になっている(Uhlenら、2015)。HLCの肝成熟に対するMB-1の効果は、タンパク質レベルでも観察され、HLCは、より高いレベルの肝細胞特異的AAT1αタンパク質を発現した(図1Dを参照されたい)。
次に、本発明者らは、HLCのMB-1処理によって、臨床分離株からの堅牢なHBV感染が可能になったかどうかを問うた。Nycodenz(商標)勾配を使用して、CHB個体の血清からHBV粒子を精製した。このステップによって、過剰のHBsAg空粒子からHBVデーン粒子がうまく分離され(図7を参照されたい)、本研究では終始、すべての感染実験において、CHB患者からの精製HBVを使用した。(96ウェルプレートにおける) HLCをMB-1 (1% DMSO中1μM)又はDMSO(1%)のみで4日間処理し、次いで、感染多重度(MOI)10でHBVに感染させた。DMSO処理HLCはHBV感染を維持せず、MB-1処理HLCだけがHBV感染を維持し、感染後(pi)11日目までにHBsAgのピーク(約16ng/ml)が検出された(図1Eを参照されたい)。比較として、HLCをHepG2.2.15由来ウイルスに同様(10)又はより高い(100)MOIで感染させても、検出可能なHBsAgシグナルは得られず(Table 3 (表7)を参照されたい)、細胞培養物由来HBVを使用しての感染が、融合性の性質で知られている化学物質であるポリエチレングリコール(PEG)の存在下(Pontecorvo、1977)、及び非常に高いMOI(Griponら、2002; Schreiner及びNassal、2017)でしか実現できないであろうという長年にわたる所見確認された。
HBV創薬のための疾患関連アッセイとしてのHLC
HBV創薬のための疾患関連性アッセイであるとみなされるために、HLCアッセイは、PHHと同等でなくてはならず、384ウェルプレートにおいて小型化することができ、多様なGTの臨床HBVサンプルの検査に供することができることが理想的である。
増殖性HBV感染は、HBV生活環における重要なステップを表す種々のウイルスマーカーによって評価することができる(図2Aを参照されたい)。HBVビリオンが肝細胞に侵入した後、ウイルスゲノム(約3.2kb)が核に転位し、cccDNAミニ染色体に変換される(Seeger及びMason、2000)。cccDNAは、4種(3.5、2.4、2.1、及び0.7kb)のウイルスmRNA転写物を産生し、これらが翻訳されて、B型肝炎コア抗原(HBcAg)、B型肝炎e抗原(HBeAg)、及びポリメラーゼタンパク質(3.5kbのプレゲノムRNA/pgRNAから);ウイルスエンベロープタンパク質(2.4及び2.1kbのmRNAから、大型、中型、及び小型、又はHBsAg);及びXタンパク質(0.7kbのmRNAから)となる。3.5kbのpgRNAは、二重の役割を担い、ヌクレオカプシド及びポリメラーゼタンパク質のためのmRNAとして、またビリオンに詰め込まれた弛緩型環状DNA (RC-DNA)を産生するウイルスゲノムを逆転写するための鋳型として働く(Locarnini及びZoulim、2010)。感染細胞はまた、HBsAg及びHBeAgを分泌する。一方で、pgRNA及びcccDNAは、感染細胞内に駐在する(最近の研究によって、pgRNAを含んだHBV粒子が血漿中を循環していることも示された。Wangら、2016)。CHB個体の肝臓におけるcccDNA及びpgRNAのレベルは、ウイルス活性及びHBV感染の段階と相互に関係しており、したがって、組み合わせたマーカーを使用して、HBV cccDNAの存在及び複製活性を評価することができる(Larasら、2006)。しかし、qPCRベースのアッセイによるcccDNAの詳細な検出は、そのレベルが非常に低く(0.1〜1.5コピー/細胞)、細胞中に余分な量のRC-DNAが存在する(≧1,000コピー/細胞)ために、大きな課題となっている(Nassal、2015、Schreiner及びNassal、2017)。qPCRの制限の一部に対処するために、デジタルPCR (dPCR)ベースのcccDNAアッセイが開発された。T5エキソヌクレアーゼによるサンプル処理によって、余分なRC-DNAは効率よく除去されており(Schreiner及びNassal、2017) (図8A〜図8Cを参照されたい)、サザンブロットアッセイを使用して、dPCR活性を確認している(図9を参照されたい)。
本発明者らは、(96ウェルプレートにおける)HLC及びPHHを、同一のウイルス接種材料(MOI 40)に感染させ、14日間のアッセイにかけて、5種のウイルス読取り情報に基づいてHBV感染の動態を追跡した。HLCにおけるすべてのHBVマーカーのレベルが、PHHにおいて観察されたレベルと著しく類似している(図2B〜図2F及びTable 4 (表8)を参照されたい)。早くも感染後2日目に、dPCRによって、非常に低いレベルのcccDNAが検出され、PHHでは6日目(HLCでは10日目)に、約11,000〜13,000のcccDNAコピー/ウェルで定常状態に達した(図2Bを参照されたい)。感染のピーク時(14日目)に、pgRNAのレベルは、HLC及びPHHにおいて、それぞれ、約963,000〜約1,410,000コピー/ウェルに及んだ(図2Cを参照されたい)。HLCとPHHの同等の感染率は、培養培地に放出されたウイルスマーカー(HBV DNA、HBsAg、及びHBeAg) (図2D〜図2F及びTable 4 (表8)を参照されたい)、及びサザンブロットアッセイに基づいても確認され、後者では、両方の細胞型において同等の強度を有するcccDNAバンドが明らかになった(図2Gを参照されたい)。MOI 40で約40%の細胞(約40,000細胞)が通常どおり感染したため(図2H及び図10を参照されたい)、これにより、HLCとPHHが、ほとんど等価な量のcccDNA (約0.3コピー/細胞)及びpgRNA (24〜35コピー/細胞)を産生することが示される。特に、CHB患者の肝臓におけるcccDNA及びpgRNAのコピー数中央値は、疾患段階に応じて、それぞれ、1.5コピー/細胞(0.003〜40コピー/細胞の範囲)及び6.5コピー/細胞(0.01〜8,730コピー/細胞の範囲)である(Larasら、2006)。
本発明者らは更に、HLCが、広範囲の臨床HBV分離株の感染に対応しうることを示した。17のCHB血清(GT A〜D)からの精製HBVを使用して、MOI 40で(384ウェルプレートにおける)HLCを感染させた。17のうち10の分離株が非常に効率よく繁殖し、HBsAg及びHBeAgレベルは、それぞれ、広く2〜150ng/ml及び1〜22ng/mlに及んだ(図2Iを参照されたい)。他者らによって、in vitroで、HBV GTにまたがる複製能力の顕著な差が観察されている(Mabitら、1996;Sozziら、2016)。
新規cccDNA阻害剤を同定するためのHLCにおける最初のHTS
患者由来HBVを感染させたHLCにおける表現型スクリーニングによって、真のcccDNA阻害剤が発見される見込みが理論上増すことになるが、そのようなHTSに着手することができるようになる前に、厳格な実現性評価が必要である。まず、HLCアッセイ継続期間(14日)は、他の細胞ベースの表現型スクリーニング(1〜3日)よりはるかに長く、そのため、技術的な複雑さ及び潜在的なアッセイ間のばらつきが増す。(384ウェルプレートにおいてMOI 40で)約7,000のHBV感染を行うことにより、HLCアッセイ性能(Z'値)を評価した。Z'値は、アッセイ堅牢性及びシグナル変動性(標準偏差)の両方が考慮されている、アッセイの質の統計的尺度であり、Z'値が0.5を超えるアッセイは、HTSの実施に非常に適するとみなされる(Zhangら、1999)。3種の分析物のZ'値(HBsAg 0.6、HBeAg 0.45、アルブミン0.8) (図11Aを参照されたい)によって、HTSについてHLCアッセイが堅牢であるという高度な信頼が付与される。アッセイの一貫性を保証するために、4人のCHB個体からの(HLCにおける感染率が等しい)血清を、ウイルス接種源として選択した。これらの血清(GT Aが1、GT Bが2、GT Cが1)は、主要なHBV遺伝子型も広くカバーする。次に、cccDNAのレベルは、本質的に低く、dPCRアッセイの処理量が少ないために、一次HTS読取り情報として不適当になった。本発明者らは、cccDNA活性ヒットを、そのより豊富な転写産物(HBsAg、HBeAg、及びpgRNA)によって、後から同定することができると考えた。HBsAg及びHBeAgは、2種の異なるウイルスmRNAから翻訳され、どちらの抗原も、感染細胞から非常に豊富に(HBsAg >> HBeAg)分泌される。HBsAg、HBeAg、及びアルブミンを一次HTS読取り情報として同時に測定するための、マルチプレックスアッセイを開発した。アルブミン阻害は、毒性化合物、及び非特異的分泌阻害剤として潜在的に作用するものについてのカウンタースクリーンとして働いた(図11Bを参照されたい)。第2の読取りでは、cccDNA転写活性の代理としてpgRNA測定を用いており(Larasら、2006)、pgRNAも、HLC中にcccDNAの約80〜100倍の高さで存在し(図2Cを参照されたい)、アッセイ感度を高める。このスクリーニングカスケードの利点は、一次読取り(上清からのマルチプレックスアッセイ)と二次読取り(細胞溶解物からのpgRNA)の両方を、384ウェルプレートにおける同じサンプルから行えることである。HBsAg/HBeAg/pgRNAに対して活性のある化合物は、次いで、dPCRアッセイにおいて検査される。3番目に、PHHにおけるバリデーションによって、HLCヒットの生物学的関連性に信頼を築く。ヒト化uPA/SCIDマウスから単離された新鮮なヒト肝細胞(PXB-PHH、本明細書ではPHHと呼ぶ)を使用して、PHHアッセイが確立されている(Ishidaら、2015)。両方の細胞型において複数回検査される参考化合物を使用して、HLC及びPHHアッセイの再現性を評価し、HLCは、常に、PHHより低いアッセイ変動性を示した(図3Aを参照されたい)。注目すべきことに、HLCにおけるHBsAg及びHBeAgに対する化合物効力が、PHHでは5.5〜7.6倍ずれた。
HTSアッセイ及びスクリーニングカスケードの概略図を図3Bに示す。簡潔に述べると、HLCをMB-1で4日間処理し、次いで、患者由来HBVにMOI 40で感染させ、24時間後にウイルス接種材料を除去した。感染後3日目に、細胞に化合物ライブラリー(約247K、4μM)を加え、2日毎に新鮮な培地及び化合物を補充した。感染後14日目に培養培地を収穫し、マルチプレックスアッセイによって分析し、Genedata Screenerソフトウェアでデータ解析を行った。本発明者らは、HBsAg及びHBeAg分泌を60%を超えて阻害し、アルブミン阻害が40%未満の化合物であると定義した、全体としては約1.5%のヒット率に相当する、約3,752の一次ヒットを同定した(図3Cを参照されたい)。12点用量応答におけるヒット確認の後、85%を超えるヒットが、HBsAg及びHBeAgに対して活性を有するままとなり、HLCアッセイの再現性が証明された。
PHHにおけるHLCヒットバリデーションによって新規cccDNA不安定化剤が同定された
HLCヒットプロファイリングの効率を上げるために、スクリーニングカスケードをPHHにおいて実施した(図3Bを参照されたい)。HLCヒットのうちの約1,000種をPHHにおいて検査すると、参考化合物を用いての以前の所見(図3Aを参照されたい)と同様に、これらの多くは、PHHにおいても活性を有するが、しかし、効力の約10倍のずれを示した(平均HBsAg及びHBeAg IC50は、HLCでは1.36〜1.46μMであり、PHHでは12.05〜13.5μMである) (図3Dを参照されたい)ことが示された。次に、本発明者らは、HBeAgとHBsAgを同時に阻害する化合物が、pgRNAを阻害する見込みがより高いかどうかを検査し、実際に、70%を超えるそうした化合物が、pgRNAも阻害し(図3Eを参照されたい)、引き続いて、それら化合物を、そのcccDNA活性についても検査した。cccDNAをターゲットとする手法は、少なくとも4通り存在する。i) cccDNA産生の防止(ウイルス侵入、又はウイルス侵入後のRC DNAのcccDNAへの変換を阻止することによる)、ii)細胞内変換経路によるcccDNA増幅の低減、iii)エピジェネティックな機序によるcccDNA転写活性のサイレンシング、及びiv) cccDNAミニ染色体を分解に導く不安定化。1番目の機序は、感染細胞におけるcccDNAプールが確立された後で、感染後3日目で開始してすべての化合物が加えられる本研究では適用できない。2番目の機序は、他のHBV関連ウイルス(アヒルB型肝炎ウイルス、DHBV)において観察されているが、この機序が、ヒトにおけるHBVにおいても見出されるかどうかは不明である。3番目の機序(cccDNAサイレンシング)は、すべてのcccDNA下流産物(pgRNA、HBeAg、HBsAg、及びHBV DNA)を減少させるが、PCRベースの方法(dPCR等)及びサザンブロットアッセイによって測定されるcccDNAコピー数は、おそらく減少させない。本発明者らは、dPCRアッセイを使用して、PHHにおいてcccDNAレベルを低減する、IC50が10μM未満である化合物(cccDNA不安定化剤)を同定し、サザンブロットを使用して、その活性を更に確認した。図3Fに、感染後3日目から開始して加えたとき、cccDNAレベルを34〜49%まで低減させたそうした化合物(化合物7及び参考化合物1)の2つの例を示した。要約すると、これらの結果は、HLCアッセイにおけるHTSによって、PHHにおいて臨床HBV分離株に対して活性を有する真のcccDNA不安定化剤が成功裏に同定されたことの概念実証となる。
分子プロファイリングによって、cccDNA不安定化剤が宿主経路の幅広い変調を誘導したことが明らかになった
表現型発見の主要な課題は、ターゲット同定、及び化合物の安全性評価に影響を及ぼしうる化合物の作用様式(MOA)を理解することである(Moffatら、2017)。ほとんどの場合、この情報は、ヒットトリアージが、型通りに化学構造(化学型)クラスタリング及び化合物効力に基づいているとき、HTS後に入手可能でない。小分子は、いくつかのターゲットに結合する場合があり(多重薬理学)、オフターゲットの安全性リスクが増す(Petersら、2012)。分子ターゲットが存在しない状況では、ヒット系列の潜在的な安全性マイナス材料を同定し、必要ならリスク削減戦略を開発するために、ヒット優先順位決定の一環として、トランスクリプトーム又は表現型レベルでの早期の化合物プロファイリングが、表現型発見に有益となる(Moffatら、2017)。
本発明者らは、トランスクリプトームプロファイリングアッセイを適用して、異なるクラスのcccDNA不安定化剤が、PHHにおいてどのように細胞経路を変調するかを評価した。分子表現型解析は、154のヒトシグナル伝達及び代謝ネットワークを代表する917の経路レポーター遺伝子のパネルに基づく遺伝子発現アッセイである(Zhangら、2017)。こうした経路レポーター遺伝子は、注釈が付けられた遺伝子-遺伝子相互作用の53%に関与し、そうした相互作用において上流の転写調節因子又は下流の調節ターゲットのいずれかとして働く。化合物処理後のレポーター遺伝子発現の変調から、有害な副作用をもたらすものを含む、目的の種々の生物学的過程に関与する経路を複合的に見ることが可能になる(Zhangら、2017)。本発明者らは、このアッセイにおいて、化合物7及び参考化合物1(活性のより低いその各々の異性体と共に)、並びに対照として、2種の市販のHBV薬であるエンテカビル(ETV、良好な安全性プロファイルを有するヌクレオシド類似体)及びインターフェロン-α(種々の副作用を伴う免疫調節薬)を検査した。PHHをHBV (又はDMSO)に感染させ、3日後、その1×IC90値の各薬物と共に6時間インキュベートした。全細胞RNAを抽出し、各薬物に対するレポーター遺伝子の一次応答を、AmpliSeq-RNA法を使用して測定した。予想されたとおり、ETVは、直接作用型抗ウイルス薬としてのそのMOAと一致して、軽微な変化を誘導した。対照的に、Roferonは、インターフェロン-α及びγシグナル伝達経路、並びにIFNシグナル伝達の下流の経路を強力に誘導した(図12を参照されたい)。図4Aに、化合物7及び参考化合物1の主成分分析(PCA)を示した。両化合物は、2つの完全に異なるPCAプロファイルを示し、参考化合物1は、化合物7よりはるかに著しく、広い応答を誘導した。各系列については、活性化合物と活性のより低いその異性体間にPCA差が観察されたが、HBVの存在は、軽微な影響しか及ぼさなかった。これら化合物の影響を受けた宿主経路のヒートマップを図4Bに示す。参考化合物1は、多面発現効果を示しており、種々の宿主シグナル伝達及び代謝経路を両方の方向に変調(上向き及び下向き調節)し、この化合物が、オフターゲット効果を潜在的に引き起こしうることが示唆された。対照的に、化合物7は、より選択的な応答を誘発し、生体酸化及び異物代謝の上向き調節並びにカスパーゼ調節及びアポトーシスの下向き調節という、2つの経路を著しく変調した。
異なるHBV遺伝子型にまたがるcccDNA不安定化剤の効力
化合物抗ウイルス活性の評価を始めとする、HBV in vitro研究のほとんどは、細胞培養物由来HBV (たとえば、HepG2.2.15由来ウイルス、GT D)に感染させたヘパトーマ細胞株(HepaRG又はHepG2-NTCP)において行われる。cccDNA不安定化剤の評価を、PHHにおいて患者由来HBV GT Dを用いて行ったため(図3F及び図4A〜図4Bを参照されたい)、本発明者らは、他のGTからの患者由来HBV分離株又は細胞培養物由来ウイルス(HepG2.2.15)に対して検査したとき、化合物効力が同様になるかを問うた。最初の論題に対処するために、(384ウェルプレートにおける)PHHに、4種の臨床HBV分離株(GT A〜D、MOI 40)に感染させた。感染後3日目に、細胞を化合物7又はDMSOで1日おきに、感染後10日目に収穫及び分析するまで処理した。いくつかの所見が注目に値する。まず、GTにまたがる臨床HBV分離株は、HLCにおいて(図2Iを参照されたい)、また他者ら(Mabitら、1996; Sozziら2016)によってより早期に認められているとおり、PHHにおけるその複製能力が様々であった。GT A分離株が非常に堅牢な複製を示し、HBsAg及びHBeAgレベルは、それぞれ約370ng/ml及び約58ng/mlに達し、続いてGT C、D、及びB分離株となった(図5Aを参照されたい)。各分離株について、分泌されたウイルス抗原の量は、そのcccDNAレベルとぴったりと一致し、したがって、GT A分離株が、最も多い量のcccDNA (約11,000コピー/ウェル)を有し、続いてGT C、B、及びDとなった(図5Bを参照されたい)。HBV GT間での分泌HBsAg及びcccDNAの量の明確な差が、その感染率の差に起因しているとすることはできず、4種すべての分離株が、PHHにおいてほとんど同等な細胞内HBsAg及びHBcAg染色を示した(図13を参照されたい)。実際に、HBV複製活性とそのタンパク質発現/分泌の不一致は、特にHBV GT B、C、及びDについて、以前に観察されている(Sozziら、2016)。それにもかかわらず、4種すべてのHBV分離株が、化合物7によって等しく阻害された。興味深いことに、化合物7は、種々のHBVマーカーに対して効力の序列を示し、HBV DNA (IC50 0.020〜0.025μM)に対して非常に強力であり、続いてHBsAg及びHBeAg (IC50 0.24〜0.45μM)、pgRNA (IC50 1.48μM)、最後にcccDNA (IC50 6.2〜7.15μM)となった(図5C〜図5D及びTable 5(表9)を参照されたい)。すなわち、cccDNAの直接の測定は、cccDNA不安定化剤の効力を正確に評価するために重要である。次に、本発明者らは、化合物7の抗ウイルス活性が、ウイルス接種材料供給源によって影響されうるかどうかを評価した。ほとんどのHBV in vitro研究は、ヘパトーマ細胞株(たとえば、HepaRG又はHepG2細胞株)において、HepG2由来HBVをウイルス接種材料として利用して行われる。PHH及びHepaRG (Griponら、2002)を、患者又はHepG2.2.15由来HBV (どちらのウイルスもGT Dであることを留意されたい)に感染させ、感染後3日目で開始して化合物7で処理した。化合物7は、PHH及びHepaRGにおいて、検査したMOI(40及び125)の患者由来HBVに対して等しく活性があったが、両方の細胞型においてHepG2.2.15由来ウイルスに対する効力がはるかに弱かった(Table 6(表10))。
全体的に、これらの結果から、HBVに対する化合物効力が、ウイルス接種材料供給源によって影響を受けうることが示唆される。更に、多様な遺伝子型からの多数のHBV分離株を用いた検査を行って、この知見を確認することができる。
考察
世界中で第7位の死因(Stanawayら、2016)であるにもかかわらず、WHOは、ウイルス性肝炎が「最近まで、健康及び開発優先事項として大いに無視されていた」ことを認めた。実際に、世界中で慢性ウイルス性肝炎が診断されるのは、5%未満であり、ウイルス性肝炎個体の約1%だけしか治療を受けていなかった(WHO、2016)。米国(HBV有病率 約129万症例)においてさえ、HBV感染症が診断されるのは35%未満であり、対象となるCHB患者の45%だけしか治療を受けていなかった(Buckley及びStrom、2017)。介入の拡大なしでは、CHB感染症と共生する人の数は、今後40〜50年間、現在の高いレベルのままであり、2015年〜2030年の間に発生する死亡は、累計2千万になると推定されている(WHO 2016)。したがって、HBVを治癒させる地球規模の戦略が必要である(Revillら、2016; WHO、2016)。宿主染色体へのHBV DNA組込み事象は、感染の早期段階の間に起こりうるため(Masonら、2016)、肝臓内のcccDNA及び組み込まれたHBV DNAを含むHBV根絶であると定義される真の治癒は、実現可能でない場合がある(Lokら、2017)。それよりも、ウイルス学的再発及び肝臓疾患進行のリスクなしに治療を休止することが可能になる機能的治癒が、実現可能な目標であると考えられる(Lokら、2017)。機能的治癒は、有限治療過程を完遂後、血清中のHBsAg及びHBV DNAが継続して検出されず、残存する肝傷害の回復、及びHCCのリスクの軽減に徐々につながることであると定義される。cccDNA転写の完全なサイレンシング、cccDNAの排除、及び肝臓損傷の完全な回復を始めとする、いくつかのレベルの機能的治癒がイメージされる(Lokら、2017)。
cccDNAをターゲットとするには、おそらく、cccDNAミニ染色体網の撹乱が必要となる。HBVは、宿主因子を乗っ取って、cccDNAを定着させ、その転写活性調節する。たとえば、新たな感染細胞において、宿主DNA損傷応答系が、(入ってくるビリオンからの)HBV RC-DNAのcccDNAへの変換に関与する(Nassal、2015; Schreiner及びNassal、2017)。cccDNAは、形成されたなら、ヒストン及び非ヒストンタンパク質並びにウイルスタンパク質を動員して、その機能単位であるミニ染色体を定着させる(Guo及びGuo、2015; Levrero、2009; Nassal、2015; Schreiner及びNassal、2017)。cccDNAミニ染色体は、おそらく、その転写活性に関連する相互作用パートナーの組が異なる、2種の異なる形態で存在する場合がある(Newboldら、1995)。考えられるところでは、cccDNA-宿主インタラクトームの化学的撹乱によって、cccDNA不安定性及び/又はその転写活性のサイレンシングがもたらされうるが、しかし、cccDNA安定性及び機能に必要となる決定的な相互作用パートナーは、捕らえどころがなく、cccDNA生物学は、依然として十分に理解されていない。この点で、表現型スクリーニングは、新規cccDNA阻害剤を、ターゲットに囚われない様式で発見する有力な手法となる。しかし、cccDNA創薬の取り組みは、堅牢な感染系の不足によって阻まれている。PHHは、HBVアッセイの理想形としてのその役割にもかかわらず、培養物中で急速に脱分化し(Frazcekら、2013)、ドナー間でHBVに対する感受性に大きなばらつきがある(Mabitら、1996)ために、日常的には使用されていない。ほとんど30年間、HBV実験系は、大部分、導入遺伝子からHBVを発現するように操作されたHepG2細胞株等の非感染系を条件としていた(Sureauら、1986; Sellsら、1987; Ladnerら、1997; Guoら、2007)。自然HBV感染に対応するヘパトーマ細胞株であるHepaRG(Griponら、2002)、及びHBV受容体であるNTCP(Yanら2012)の発見は、新たなツール、すなわち、自然感染に従うウイルス侵入及びcccDNA生物学の研究を可能にするHBV用の感染系となる。HLCを含むiPS技術の急速な進歩(Shiら、2017)によって、腫瘍細胞株より生理的に関連性がある、したがって、ヒト疾患生物学をより良好に再現することが予想される、新規の疾患モデルの開発が可能になった。
創薬における生理学系の使用は、前臨床知見の臨床への移行可能性を高めるための最初のステップの一つであるとみなされる(Eglen及びReisine、2011; Vincentら、2015; Horvathら、2016; Ursuら、2017)。実際に、すべての治療分野において新たな薬物候補の脱落率(attrition rate)が高いために、創薬において使用される前臨床モデルの有効性に関して懸念が生じていた(Vincentら、2015; Horvathら、2016)。たとえば、2008年〜2015年の間、効能不十分による、フェーズII及びIII試験における薬物候補の失敗率は、一貫して50%〜60%の間であった(Arrowsmith及びMiller、2013; Harrison、2016)。二大創薬戦略である、表現型及びターゲットベースのスクリーニングは、多くの場合、目的の分子ターゲットを過剰発現するように操作された、不死化/腫瘍細胞株において型通りに行われる。多数の腫瘍細胞株が、細胞株と患者由来細胞の相互関係が不十分になる程度に、実質的な遺伝子異常及び宿主経路の変更を示す(Uhlenら、2015; Vincentら、2015)。許容されるシグナル対ノイズ比のアッセイを提供することを意図した、分子ターゲットの過剰発現は、生理的条件では発生しない、経路活性化及びシグナル伝達に影響を及ぼす不自然に高いレベルのタンパク質ももたらし、その結果、in vitro活性とin vivo活性間に不一致が生じた(Eglenら、2008)。対照的に、一次細胞における内因性ターゲットは、ヒトにおいて見出されるものとより似通ったレベル及び細胞環境内で発現されることが暗黙のうちに想定される。したがって、一次細胞における化合物の生物活性は、そのin vivo活性についてより予測的になることが予想される(Eglen及びReisine、2011; Vincentら、2015; Horvathら、2016; Ursuら、2017)。
HLCは、次世代のHBV in vitro感染系となりうる可能性を秘めている。しかし、現存するHLCは、依然として未熟であり(Baxterら、2015; Godoyら、2015)、HBVに対する感受性が不十分であった(Shlomaiら、2014; Kanekoら、2016; Samuraiら、2017)。HLCのHBV創薬への見込みを十分に明示するために、HLC成熟が改善される必要がある。HLCの肝成熟を増進する小分子(MB-1)の同定は、この方向における最初の一歩である。MB-1は、「特効薬」ではなく、HLCのさらなる成熟がなお必要であり、それにはおそらく、肝臓構造を厳密に模倣する培養条件を始めとする、いくつかの手法を組み合わせることが必要となる(Goldringら、2017)。肝臓における肝細胞は、その遺伝子発現パターンが非常に不均一であり、肝小葉内のその位置に基づいて明確な勾配を示しており(肝臓帯状分布) (Soto-Gutierrezら、2017; Torreら、2010)、実際のところ、肝臓遺伝子の約50%が帯状分布している(Halpernら、2017)。単層培養物中のHLCが、肝臓に割り当てられた約500の生活機能の一部だけを模倣し、すべてを模倣できないことは、意外ではないといえる(Goldringら、2017)。
HLCは、PEG (ポリエチレングリコール、細胞培養物由来HBVの感染に一般に使用される膜融合剤(fusogenic agent))なしでも、低いMOI (10〜40)で、種々のGTからの臨床分離株の堅牢なHBV感染を維持し、重要なことに、PHHにおいて観察されるものと同等である。創薬において種々のGTからの患者由来HBVを使用することは、いくつかの理由で重要である。HBV GTは、ウイルス病原性、疾患進行、及び治療応答に影響する。特にGT AとC間での、混合GT感染及びGT間組換えは、CHB感染症の間で認められることが増えており、病原性及び治療応答においても役割を担う場合がある(Lin及びKao、2017)。本発明者ら及び他者ら(Mabitら、1996; Sozziら、2016)は、HBV GTが、複製活性及びタンパク質分泌において顕著な差異を示したことを観察しており、そのような差異は、新規MOAの化合物に対するその感受性に影響を及ぼす場合がある。化合物スクリーニングのために1種のHBV GTに唯一依拠することは、HBV GT及びサブタイプ全体では、化合物効力の過大評価につながるおそれがある。加えて、種々の病原体の実験室株は、in vitro条件に即座に適合することが知られ、多くの場合、重要な病態生理学的特徴を損なっている(Bukhら、2002; Fuxら、2005; Horvathら、2016)。
HLCにおいて14日間のHTSアッセイを行うことは、有意義である。目的のターゲットを過剰発現するように操作された腫瘍細胞株ベースのHTSプラットフォームの主な利点は、ほとんどすべての細胞が目的のターゲットを発現するため、均一性及び再現性であり、HTSに必要となる堅牢且つ再現可能なシグナルをもたらす。一方、in vitroでの自然HBV感染の再現性は、PHHにおいてさえ、難易度が高い(Mabitら、1996)。本研究では、HLCアッセイが、0.6 (HBsAg)、0.45 (HBeAg)、及び0.8 (アルブミン)のZ'スコアで、高度に再現可能であることが示された。特に、HTSアッセイについて0.5を超えるZ'値は、iPS由来細胞と関連するもの等の複雑な細胞ベースのアッセイには、高いハードルであるとみなされる(Engle及びVincent、2014)。自然感染という設定で新規cccDNA阻害剤を同定するために、cccDNAに対して活性のある化合物を、そのより豊富な転写産物(HBsAg、HBeAg、及びpgRNA)を介して逐次的に同定できるという前提に基づき、スクリーニングカスケードを設計した。この手法によって、PHHにおいて、サザンブロットアッセイによって確認される、いくつかのcccDNA活性ヒット系列が成功裏に発見された。特に、他者らは、CHB個体の血漿中の循環pgRNA及びHBVコア関連抗原(HBcrAg)が、肝臓におけるcccDNA転写活性の代理読取り情報として使用できるであろうと報告している(Wangら、2016; Chenら、2017)。
種々のHBVマーカーに基づく化合物効力の評価では、いくつかの重要な見通しが得られた。まず、cccDNA不安定化剤(化合物7)は、PHHにおいて、4種の臨床HBV分離株(GT A〜D)に対して等しく効力があったが、種々のHBVマーカーに対して効力の序列を示した(HBV DNA IC50<<HBsAg及びHBeAg及びpgRNA IC50<cccDNA IC50)。効力のこのずれは、HBVマーカーの豊富さ/半減期、アッセイの動的範囲、又はターゲットを阻害する難しさのいずれかを反映する場合がある。実際に、cccDNAは、細胞において非常に安定している(半減期 33〜57日) (Nassal、2015)。対照的に、血液中の、HBV DNAを含んだビリオンは、半減期が短く(約4.4時間) (Murrayら、2006)、これによって、化合物7のHBV DNAに対する効力が他のHBVマーカーより高くなることにある程度説明がつけられる。したがって、cccDNA IC50の測定は、化合物効力を正確に評価するために肝要である。
興味深いことに、化合物7は、HepG2.2.15由来ウイルスに対して効力がはるかに弱かった。化合物7の分子ターゲットは不明であるが、表現型スクリーンによって、宿主因子をターゲットとするヒットがしばしば同定され、化合物7が、cccDNAの維持及び転写活性に必要となる宿主因子をターゲットとしうるという仮説を立てることもできる。実際に、ウイルス侵入後、HBVは、種々の宿主因子を乗っ取って、cccDNAミニ染色体を定着させ、その転写活性を調節する(Nassal、2015)。HepG2.2.15由来HBVに対する化合物7の効力の低下は、両方の型のウイルスのcccDNA維持及び機能に必要となる宿主因子の違いを反映しうるとするのが妥当と思われる。HepG2.2.15由来HBVは、抗生物質選択下で永続的に継代されている組換えHepG2細胞株において生成される。特に、HepG2は、一次肝細胞の模倣が不十分であることが報告されているヒトヘパトーマ細胞株である(Uhlenら、2015、及び本研究、図1C)。この所見は、HBVに特有のものではない。D'Aiutoら、2017は、iPS由来ニューロンと比較した、サル上皮(Vero)細胞におけるHSV-1に対する化合物効力の不一致を報告しており、スクリーニングがVero細胞ベースである場合、ニューロンにおいて活性のあるいくつかの薬物は、同定されないであろうと結論付けている。こうした結果によって、異なる供給源のHBVに対して、すなわち、細胞培養物由来HBVに対してだけでなく、種々のGTの臨床分離株に対しても、化合物活性を検査することの重要性が強調される。
部分的なcccDNA分解を誘発しうる化合物の発見は、刺激的であるが、その分子ターゲット、又はその潜在的なオフターゲット活性を知ることなくしては、厄介でもある。潜在的な安全性マイナス材料の薬理学的評価は、化合物を安全性関連ターゲットのパネルに対してスクリーニングすることにより、型通りに行われる。このようなスクリーニングは、コスト及び処理量のせいで、リード最適化の進んだ段階で少数の重要な化合物において行われるのが普通である。この時点での安全性知見には、すでに最適化された化合物のかなりの修正、又はそれどころか、脱落の根拠のいずれかが欠かせない(Petersら、2012)。実際に、非臨床毒性学は、製薬大手4社からの800を超える前臨床化合物について最も高い脱落要因であり、失敗の40%を占めた(Waringら、2015)。したがって、HTS後のヒット選択の間、及びヒットトゥーリード段階の間に、早くから化合物オフターゲット活性を評価することが望ましい(Petersら、2012; Moffatら、2017)。本研究において示すとおり、トランスクリプトームプロファイリングアッセイは、そのような目的のために、肝細胞だけでなく、他の細胞型、たとえば、心筋細胞においても使用することができ、したがって、in vitro毒性ツールの一環としてのその適用は広がるであろう。
要約すると、本発明者らは、HLCプラットフォームが、HBV治癒のための新規療法の発見をもたらしうる可能性を秘めた、HBV創薬のパラダイム変化に相当することの概念実証を示した。並行して、HBV創薬及び疾患モデリングだけでなく、in vitro毒性学にも有益となる、HLCの肝成熟を向上させるための継続的な取り組みも必要である。創薬の取り組みは、莫大な投資を伴う非常に長い過程である(平均して、ターゲット同定から規制当局の承認までに13.5年かかる) (Paulら、2010)ため、安全性リスク削減のための疾患関連アッセイ及び他のツールの実行を、化合物進捗の早いうちに、且つその間のいつにでも開始して、診療室において後から発見される望ましくない知見等、損害の大きい脱落を防ぐべきである。
(実施例2)
一次ヒト肝細胞(PHH)における患者由来HBVに対するピロロ[2,3-b]ピラジン化合物の活性
実施例1において記載した手順に従い、式(I)の種々のピロロ[2,3-b]ピラジン化合物を、疾患関連HBVモデルの理想形である、PHHにおけるHBV(患者由来HBV、GT D)に対するその活性について検査した。
検査した化合物の構造及びその各々の化合物IDを以下に示す。
PHH (患者由来HBV、GT A-D)において決定した、これらの化合物のHBeAg、HBsAg、アルブミン、pgRNA、及びcccDNAに対する活性を、図15A〜図15D、図16D〜図16E、及び図17、並びに以下のTable 7 (表11)に示す。
上に示すとおり、本発明による化合物1〜9のすべてが、HBsAg及びHBeAgを、10μM未満のIC50値で阻害することがわかった。化合物2、4、7、8、及び9は、pgRNAに対して有利に高い阻害効果を示し(IC50は10μM未満)、化合物7は、cccDNAレベルを低減することにおいて特に強力であった(IC50は10μM未満)。したがって、特に、上で示した化合物1〜9を始めとする、式(I)の化合物は、HBV感染症の治療において使用できることが実証された。HBVに対する特に有利な活性が、化合物2、4、7、8、及び9について、特に化合物7について示された。
化合物7を、PHHにおける患者由来HBV GT A〜Dに対するその活性について更に検査した。簡潔に述べると、384ウェルプレートに播種したPHHを、患者由来HBV (GT A〜D)に、MOI 40で、三連で感染させた。感染後3日目に、化合物7を、156μMで開始して3倍希釈で加えた。1% DMSOを陰性対照として使用した。2日毎に新鮮な培地及び化合物を補充し、感染後10日目に細胞を収穫した。
こうして得た結果は、図16A〜図16E及び図17、並びにTable 5 (表9)に示している。
したがって、化合物7は、4種の主要なHBV遺伝子型A〜Dすべてに対して強力なcccDNA阻害活性を示すことがわかったが、これにより、特に化合物7を始めとする、式(I)の化合物によって、HBV感染症療法の有利な改善が可能になることが更に確認される。
(参考文献)

Claims (27)

  1. B型肝炎ウイルス感染の処置における使用のための、以下の式(I)の化合物:
    (式中:
    L1は、-CO-N(RL1)-、-N(RL1)-CO-、-CO-、-N(RL1)-、-C(=O)O-、-O-C(=O)-、-SO-、-SO2-、-SO2-N(RL1)-、及び-N(RL1)-SO2-から選択され;
    各RL1は、独立に、水素及びC1〜5アルキルから選択され;
    R1は、C1〜12アルキル、C2〜12アルケニル又はC2〜12アルキニルであり、前記アルキル、前記アルケニル又は前記アルキニルが、一つ又は複数のR10基で置換され、更に前記アルキル、前記アルケニル又は前記アルキニルが、任意選択で、一つ又は複数のR11基で置換され;
    各R10は、独立に、-OH、-O(C1〜5アルキル)、及び少なくとも一つの酸素環原子を有するヘテロシクリルから選択され;
    各R11は、独立に、-O(C1〜5アルキレン)-OH、-O(C1〜5アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-SH、-S(C1〜5アルキル)、-S(C1〜5アルキレン)-SH、-S(C1〜5アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-NH2、-NH(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、ハロゲン、C1〜5ハロアルキル、-O-(C1〜5ハロアルキル)、-CF3、-CN、-CHO、-CO-(C1〜5アルキル)、-COOH、-CO-O-(C1〜5アルキル)、-O-CO-(C1〜5アルキル)、-CO-NH2、-CO-NH(C1〜5アルキル)、-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、カルボシクリル、及びヘテロシクリルから選択され、前記カルボシクリル及び前記ヘテロシクリルが、各々任意選択で一つ又は複数のR12基で置換され;更に同じ炭素原子に結合する任意の二つのR11基が、任意選択で、それらが結合する炭素原子と一緒に、5から8員の炭素環式又は複素環式環を形成してもよく、前記5から8員の炭素環式又は複素環式環が、任意選択で、一つ又は複数のR12基で置換され;
    各R12は、独立に、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、及び-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)から選択され;
    R2は、水素、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリル、及び-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルから選択され、前記-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリルのカルボシクリル部分及び前記-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルのヘテロシクリル部分が、各々任意選択で一つ又は複数のR12基で置換され;
    R3は、水素、C1〜5アルキル、及び-CO(C1〜5アルキル)から選択され;
    R4及びR5は、各々独立に、水素、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリル、及び-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルから選択され、前記-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリルのカルボシクリル部分及び前記-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルのヘテロシクリル部分が、各々任意選択で一つ又は複数のR12基で置換される)
    又はその薬学的に許容される塩。
  2. L1が-CO-N(RL1)-である、請求項1に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
  3. R1がC2〜10アルキルであり、前記アルキルが一つ又は複数のR10基で置換され、更に前記アルキルが任意選択で一つ又は複数のR11基で置換される、請求項1又は2に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
  4. R1が-C(R13)(R13)-C(R13)(R13)-R10であり、各R13が独立に、水素、メチル、及びエチルから選択され、各R13が任意選択で一つ又は複数のR10基で置換され、各R13が任意選択で一つ又は複数のR11基で更に置換される、請求項1又は2に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
  5. 各R10が-OHである、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
  6. 各R11が独立に、-SH、-S(C1〜5アルキル)、-NH2、-NH(C1〜5アルキル)、-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、ハロゲン、C1〜5ハロアルキル、-O-(C1〜5ハロアルキル)、-CF3、及び-CNから選択され;更に同じ炭素原子に結合する任意の二つのR11基が、任意選択で、それらが結合する炭素原子と一緒に、飽和の5又は6員の炭素環式又は複素環式環を形成してもよく、前記飽和の5又は6員の炭素環式又は複素環式環が、任意選択で、一つ又は複数のR12基で置換される、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
  7. R2及びR3が各々水素である、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
  8. R4及びR5の一つがカルボシクリル又はヘテロシクリルであり、前記カルボシクリル又は前記ヘテロシクリルが任意選択で一つ又は複数のR12基で置換され、R4及びR5の他方の一つが水素、C1〜5アルキル、C2〜5アルケニル、C2〜5アルキニル、-(C0〜3アルキレン)-OH、-(C0〜3アルキレン)-O(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SH、-(C0〜3アルキレン)-S(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH2、-(C0〜3アルキレン)-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-ハロゲン、-(C0〜3アルキレン)-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-(C1〜5ハロアルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CF3、-(C0〜3アルキレン)-CN、-(C0〜3アルキレン)-CHO、-(C0〜3アルキレン)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-COOH、-(C0〜3アルキレン)-CO-O-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-O-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH2、-(C0〜3アルキレン)-CO-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-CO-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-CO-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH2、-(C0〜3アルキレン)-SO2-NH(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-SO2-N(C1〜5アルキル)(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-NH-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-N(C1〜5アルキル)-SO2-(C1〜5アルキル)、-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリル、及び-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルから選択され、前記-(C0〜3アルキレン)-カルボシクリルのカルボシクリル部分及び前記-(C0〜3アルキレン)-ヘテロシクリルのヘテロシクリル部分が、各々任意選択で一つ又は複数のR12基で置換される、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
  9. R5がシクロプロピルである、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
  10. R4が水素である、請求項1から9のいずれか一項に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
  11. 以下の式(II)の化合物である、請求項1に記載の使用のための化合物:
    (式中R1、RL1、R2、R3及びR4基が、式(I)中と同じ意味を有する);
    又はその薬学的に許容される塩。
  12. 以下の式のいずれか一つを有する化合物、又はその薬学的に許容される塩である、請求項1に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
  13. 以下の式のいずれか一つを有する化合物、又はその薬学的に許容される塩である、請求項1に記載の使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩。
  14. 以下の式の化合物である、請求項1に記載の使用のための化合物:
    又はその薬学的に許容される塩。
  15. 請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩、及び任意選択で薬学的に許容される添加剤を含む、B型肝炎ウイルス感染の処置における使用のための医薬組成物。
  16. B型肝炎ウイルス感染の処置におけるcccDNA阻害剤としての使用のための、請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物若しくはその薬学的に許容される塩又は請求項15に記載の医薬組成物。
  17. B型肝炎ウイルス感染の処置の医薬の調製における、請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の使用。
  18. 請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物若しくはその薬学的に許容される塩、又は請求項15に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、B型肝炎ウイルス感染を処置する方法。
  19. 前記B型肝炎ウイルス感染が、慢性肝炎Bウイルス感染である、請求項1から14又は16のいずれか一項に記載の使用のための化合物若しくはその薬学的に許容される塩、又は請求項15又は16に記載の使用のための医薬組成物又は請求項17に記載の使用又は請求項18に記載の方法。
  20. B型肝炎ウイルス再活性化の処置又は抑制における使用のための、請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物若しくはその薬学的に許容される塩、又は請求項15に記載の医薬組成物。
  21. B型肝炎ウイルス再活性化の処置又は抑制のための医薬の調製における、請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の使用。
  22. 請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物若しくはその薬学的に許容される塩、又は請求項15に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、B型肝炎ウイルス再活性化を処置又は抑制する方法。
  23. 処置される対象がヒトである、請求項1から14、16、19又は20のいずれか一項に記載の使用のための化合物若しくはその薬学的に許容される塩、又は請求項15、16、19又は20のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物又は請求項17、19又は21のいずれか一項に記載の使用又は請求項18、19又は22のいずれか一項に記載の方法。
  24. 請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩のB型肝炎ウイルスcccDNAの阻害剤としてのインビトロ使用。
  25. B型肝炎ウイルス(HBV)cccDNAの阻害剤を同定する方法であって:
    HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞を用意する工程;
    検査化合物を、HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞に供試する工程;
    感染した幹細胞由来肝細胞様細胞中のHBsAg及びHBeAgに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程;
    任意選択で、感染した幹細胞由来肝細胞様細胞中のアルブミンに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程及び検査化合物がアルブミンを阻害することが見出された場合、その化合物を更なる検査から除く工程;
    検査化合物がHBsAg及びHBeAgを阻害することが見出された場合、HBV pgRNAに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程;
    検査化合物がHBV pgRNAを阻害することが見出された場合、HBV cccDNAに対する検査化合物の阻害効果を決定する工程;及び
    検査化合物がHBV cccDNAを阻害することが見出された場合、HBV cccDNAの阻害剤として検査化合物を選択する工程を含む方法。
  26. HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞を用意する工程が:
    人工多能性幹細胞を、化合物MB-1又はMB-2又は薬学的に許容されるその塩で処置して、
    幹細胞由来肝細胞様細胞を得る工程;及び
    このように得られた細胞を、臨床HBV単離体に感染させて、HBVに感染した幹細胞由来肝細胞様細胞を得る工程を含む、請求項25に記載の方法。
  27. 幹細胞由来肝細胞様細胞が、少なくともHBVゲノタイプA、B、C及びDからの臨床HBV単離体に感染される、請求項25又は26に記載の方法。
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