JP2021503941A - 核酸、当該核酸を含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 - Google Patents
核酸、当該核酸を含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
5’−UGCUAUGCCUCAUCUUCUZ−3’(配列番号1)、
5’−Z’AGAAGAUGAGGCAUAGCA−3’(配列番号2)、
ただし、ZはAであり、Z’はUであり、
前記ヌクレオチド配列Aに、位置がZに対応するヌクレオチドZAが含まれ、前記ヌクレオチド配列Bに、位置がZ’に対応するヌクレオチドZ’Bが含まれ、前記Z’Bは、前記アンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドである。
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許及び特許出願が特別にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれる。
本開示において、HBV遺伝子とは、DNA配列がGenbank登録番号NC_003977.1に示される遺伝子を指す。
本開示は、B型肝炎ウイルス遺伝子発現を抑制できるsiRNAを提供する。
本開示のsiRNAは、基本的な構造単位としてヌクレオチド基を含み、前記ヌクレオチド基がリン酸基、リボース基及び塩基を含むことは、当業者に公知であるので、ここでは説明を省略する。
5’−UGCUAUGCCUCAUCUUCUZ−3’(配列番号1)、
5’−Z’AGAAGAUGAGGCAUAGCA−3’(配列番号2)、
ただし、ZはAであり、Z’はUであり、
前記ヌクレオチド配列Aに、位置がZに対応するヌクレオチドZAが含まれ、前記ヌクレオチド配列Bに、位置がZ’に対応するヌクレオチドZ’Bが含まれ、前記Z’Bは、前記アンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドである。
5’−UGCUAUGCCUCAUCUUCUZA−3’(配列番号3)、
5’−Z’BAGAAGAUGAGGCAUAGCA−3’(配列番号4)
ここで、前記Z’Bは、アンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドであり、ZAは、A、U、G又はCから選択され、Z’Bは、ZAと相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、ZAはAであり、Z’BはUである。
5’−UGCUAUGCCUCAUCUUCUZA−3’(配列番号3)、
5’−Z’BAGAAGAUGAGGCAUAGCAGC−3’(配列番号5)
或いは、前記siRNAのセンス鎖は、配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含み、前記siRNAのアンチセンス鎖は、配列番号6に示されるヌクレオチド配列を含み、
5’−UGCUAUGCCUCAUCUUCUZA−3’(配列番号3)、
5’−Z’BAGAAGAUGAGGCAUAGCAUU−3’(配列番号6)
ただし、前記Z’Bは、アンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドであり、ZAは、A、U、G又はCから選択され、Z’Bは、ZAと相補的なヌクレオチドである。
siHBVS1
センス鎖:5’−UGCUAUGCCUCAUCUUCUZ−3’(配列番号1)
アンチセンス鎖:5’−Z’AGAAGAUGAGGCAUAGCAGC−3’(配列番号7)
siHBVS2
センス鎖:5’−UGCUAUGCCUCAUCUUCUZ−3’(配列番号1)
アンチセンス鎖:5’−Z’AGAAGAUGAGGCAUAGCAUU−3’(配列番号8)。
或いは、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Aの第5、7、8及び9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、また、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Bの第2、6、14及び16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Aの第7、8及び9位のヌクレオチドが−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、また、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Bの第2、6、14及び16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。
或いは、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Aの第5、7、8及び9位のグリコシル基が2’−フルオロリボース基であり、siRNAのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドのグリコシル基が2’−メトキシリボース基であり、また、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Bの第2、6、14及び16位のグリコシル基が2’−フルオロリボース基であり、siRNAのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドのグリコシル基が2’−メトキシリボース基であり、
或いは、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Aの第7、8及び9位のグリコシル基が2’−フルオロリボース基であり、siRNAのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドのグリコシル基が2’−メトキシリボース基であり、また、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Bの第2、6、14及び16位のグリコシル基が2’−フルオロリボース基であり、siRNAのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドのグリコシル基が2’−メトキシリボース基である。
siHBVS3
センス鎖:5’−UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号9)
アンチセンス鎖:5’−UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm−3’(配列番号10)
siHBVS4
センス鎖:5’−UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号9)
アンチセンス鎖:5’−UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm−3’(配列番号11)
siHBVS5
センス鎖:5’−UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号12)
アンチセンス鎖:5’−UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm−3’(配列番号13)
siHBVS6
センス鎖:5’−UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号12)
アンチセンス鎖:5’−UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm−3’(配列番号14)
ただし、大文字C、G、U、Aはヌクレオチドの塩基組成を表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表す。
前記センス鎖の5’末端(末端端部)から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の3’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の3’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間。
siHBVS7
センス鎖:5’−UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号15)
アンチセンス鎖:5’−UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm−3’(配列番号16)
siHBVS8
センス鎖:5’−UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号15)
アンチセンス鎖:5’−UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm−3’(配列番号17)
siHBVS9
センス鎖:5’−UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号18)
アンチセンス鎖:5’−UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm−3’(配列番号19)
siHBVS10
センス鎖:5’−UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号18)
アンチセンス鎖:5’−UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm−3’(配列番号20)
ただし、大文字C、G、U、Aはヌクレオチドの塩基組成を表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字sは、当該文字の左右2個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表す。
siHBVS11
センス鎖:5’−UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号9)
アンチセンス鎖:5’−P1−UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm−3’(配列番号21)
siHBVS12
センス鎖:5’−UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号9)
アンチセンス鎖:5’−P1−UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm−3’(配列番号22)
siHBVS13
センス鎖:5’−UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号12)
アンチセンス鎖:5’−P1−UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm−3’(配列番号23)
siHBVS14
センス鎖:5’−UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号12)
アンチセンス鎖:5’−P1−UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm−3’(配列番号24)
siHBVS15
センス鎖:5’−UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号15)
アンチセンス鎖:5’−P1−UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm−3’(配列番号25)
siHBVS16
センス鎖:5’−UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号15)
アンチセンス鎖:5’−P1−UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm−3’(配列番号26)
siHBVS17
センス鎖:5’−UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号18)
アンチセンス鎖:5’−P1−UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm−3’(配列番号27)
siHBVS18
センス鎖:5’−UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号18)
アンチセンス鎖:5’−P1−UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm−3’(配列番号28)
ただし、大文字C、G、U、Aはヌクレオチドの塩基組成を表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字sは、当該文字の左右2個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、大文字P1は、当該文字の右側に隣接する1つのヌクレオチドが5’−リン酸ヌクレオチド又は5’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表す。
本開示は、活性成分として上述したsiRNAと、薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。
X101及びX102はそれぞれ独立してO、S、N−A又はC−Aであり、Aは水素又はC1−C20炭化水素鎖であり、
Y及びZはそれぞれ独立してC=O、C=S、S=O、CH−OH又はSO2であり、
R101、R102、R103、R104、R105、R106及びR107はそれぞれ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基であり、
xは1〜10の整数であり、
nが1〜3の整数であり、mが0〜20の整数であり、pが0又は1であり、ここで、m=p=0である場合、R102は水素であり、
n又はmの少なくとも1つが2である場合、R103と式(201)における窒素とが、式(202)又は式(203)に示される構造を形成する。
前記PEG化脂質は、1,2−ジパルミトアミド−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)]−2000(1,2−dipalmitoyl−sn−glycero−3−phosphatidylethanolamine−N−[methoxy(polyethylene glycol)]−2000)である。
1つの態様において、本開示は、上記のsiRNA及び当該siRNAに結合される複合基を含む第1種のsiRNA複合体を提供する。
kは1〜3の整数であり、
LAは、式(302)に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記LAは、その両端でそれぞれ1つの前記標的基及び前記LC部にエーテル結合により結合される。
lは0〜3の整数であり、
*は、リンカーにおいてエーテル結合により標的基に結合される部位を表し、
#は、リンカーにおいてリン酸エステル結合によりsiRNAに結合される部位を表す。
いくつかの実施形態において、前記siRNA複合体は、式(308)に示される構造を有する第2種のsiRNA複合体である。
n1は、1〜3から選択される整数であり、n3は、0〜4から選択される整数であり、
m1、m2及びm3は独立して、2〜10から選択される整数であり、
R10、R11、R12、R13、R14及びR15は、それぞれ独立して、Hであり、又はC1−C10アルキル基、C1−C10ハロゲン化アルキル基及びC1−C10アルコキシ基からなる群から選択され、
R3は式A59に示される構造の基である。
R’はC1−C10のアルキル基であり、
Raは、式A27〜A45の基からなる群から選択される1つである。
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
任意の合理的な合成経路により本開示の第2種のsiRNA複合体を調製してもよい。
R4は、Nuに示されるsiRNAに結合できる部分である。いくつかの実施形態において、R4は、共有結合によりNuに示されるsiRNAに結合することができる部分である。いくつかの実施形態において、R4は、反応を経てリン酸ジエステル結合によりNuに示されるsiRNAの任意の官能基に複合されることができる部分であり、
各S1は、独立してM1において全ての活性ヒドロキシ基がYCOO−基で置換された基であり、各Yは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される1つである。
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。いくつかの実施形態において、q1は1又は2である。いくつかの実施形態において、q2は1〜5の整数である。いくつかの実施形態において、R4は、式(B9)又は(B10)に示される構造を含む。いくつかの実施形態において、R4は、式(B11)又は(B12)に示される構造を含む。
(1)式(321)の化合物(式(321)の化合物は、R4に、保護されたヒドロキシ基ORkを含む第1の官能基、及び式(C1’)又は(C3’)に示される構造を有する第2の官能基が含まれる化合物である)におけるヒドロキシ保護基Rkを除去し、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、脱保護された生成物をヌクレオシドモノマーと接触させ、複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを得ること、
(2)当該複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、3’−5’に向かってホスホルアミダイト固相合成方法によりsiRNAのセンス鎖を合成すること、
(3)ホスホルアミダイト固相合成方法により、siRNAのアンチセンス鎖を合成すること、
(4)siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離してアニールし、本開示のsiRNA複合体を得ることを含む。
R6は、式(321)におけるR4を提供する基である。いくつかの実施形態において、R6は、式(A61)に示される構造を有する。
いくつかの実施形態において、本開示は、siRNA、当該siRNAを含む薬物組成物、第1種のsiRNA複合体及び第2種のsiRNA複合体の、前記B型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び/又は予防のための薬物の調製への使用を提供する。
本開示は、本開示のsiRNA、薬物組成物、第1種のsiRNA複合体及び第2種のsiRNA複合体の少なくとも1種の有効量を含むキットを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるsiRNA、組成物又はsiRNA複合体は、体内でより高い安定性、より低い毒性及び/又はより高い活性を有することができる。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるsiRNA、siRNA組成物又はsiRNA複合体は、体内で少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%のHBV遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるsiRNA、siRNA組成物又はsiRNA複合体は、体内で少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%の肝内HBV遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるsiRNA、siRNA組成物又はsiRNA複合体は、体内で少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%の動物モデルにおける肝内HBV遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるsiRNA、siRNA組成物又はsiRNA複合体は、体内で少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%のHBV表面抗原発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるsiRNA、組成物又はsiRNA複合体は、明らかなオフターゲット効果を示していない。オフターゲット効果は、例えば、標的遺伝子でない遺伝子の正常発現の抑制であってもよい。オフターゲット遺伝子発現の結合/抑制がオンターゲット遺伝子効果に比べて50%、40%、30%、20%又は10%を下回る場合、当該オフターゲット効果が顕著ではないと考えられている。
HBVトランスジェニックマウスC57BL/6−HBV:品種名:B6−Tg HBV/Vst(1.28copy、genotype A)、北京維通達生物技術有限公司から購入する。実験前にCOI>104のマウスを選択した(以下、単に1.28copyマウスということもある)。
AAV−HBV低濃度トランスジェニックマウス:文献の方法(董小岩ら、Chin J Biotech 2010,May 25,26(5):679−686)によりAAV−HBVモデルを作製した。rAAV8−1.3HBV、D型(ayw)ウイルス(北京五加和分子医学研究所有限公司から購入、1×1012ウイルスゲノム(v.g.)/mL、ロット番号2016123011)を無菌PBSで1×1011v.g./mLに希釈し、1匹のマウスあたり100μLの希釈後のrAAV8−1.3HBVを注射した(即ち、1匹のマウスあたり1×1010v.g.を注射した)。以下、AAV−HBV低濃度モデルマウスということもあり、又は単にAAV−HBVという。
本調製例では、複合体1(以下、L10−siHB1M1SVP複合体ともいう)及び複合体2(以下、L10−siHB2M1SVP複合体ともいう)を合成したが、複合体15(以下、L10−siHB1M1SPともいう)及び複合体16(以下、L10−siHB1M1SPsともいう)を合成することを意図した。前記複合体は、L−9複合分子がそれぞれ番号siHB1M1SVP、siHB2M1SVP、siHB1M1SP又はsiHB1M1SPsのsiRNAと複合した後に形成された複合体である。当該複合体に複合されたsiRNAの配列は、表1に示される。
以下の方法に従い、L−10化合物を合成した。
100.0gのGAL−1(N−アセチル−D−ガラクトサミン塩酸塩、CAS番号:1772−03−8、寧波弘翔生化公司から購入、463.8mmol)を1000mlの無水ピリジンに溶解させ、氷水浴下で540mlの酢酸無水物(Enox社から購入、5565.6mmol)を加え、室温で1.5時間攪拌反応した。反応液を10Lの氷水に注入し、減圧吸引濾過し、ケーキを2Lの氷水で洗浄した後、完全に溶解するまでアセトニトリル/トルエン混合溶剤(アセトニトリル:トルエンの体積比=1:1)を加え、溶剤を蒸発乾固し、130.0gの白色固形製品GAL−2を得た。
工程(1−1−1a)で得られたGAL−2(35.1g、90.0mmol)を213mlの無水1,2−ジクロロエタンに溶解させ、氷水浴下で、窒素保護条件で、24.0gのTMSOTf(CAS番号:27607−77−8、マックリン社から購入、108.0mmol)を加え、室温で一晩反応させた。
工程(1−1−1b)で得られたGAL−3(26.9g、81.7mmol)を136mlの無水1,2−ジクロロエタンに溶解させ、乾燥した4Å分子篩粉30gを加え、9.0gの5−ヘキセン−1−オール(CAS番号:821−41−0、Adamas−beta社から購入、89.9mmol)を加え、室温で30分間攪拌し、氷浴下で窒素保護下で9.08gのTMSOTf(40.9mmol)を加え、室温で一晩攪拌反応させた。4Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に300mlのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、500mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて10分間攪拌し洗浄し、有機相を分離し、水相を300mlのジクロロエタンで1回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ300mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び300mlの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、41.3gの黄色水飴状製品GAL−4を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
工程(1−1−1c)に記載された方法により得られたGAL−4(14.9g、34.7mmol)を77mlのジクロロメタンと77mlのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ103mlの脱イオン水及び29.7gの過ヨウ素酸ナトリウム(CAS番号:7790−28−5、Aladdin社から購入、138.8mmol)を加え、氷水浴下で10分間攪拌し、塩化ルテニウム(III)(CAS番号:14898−67−0、Energy社から購入、238mg、1.145mmol)を加え、室温で一晩反応させた。反応液に300mlの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてpHを約7.5に調整し、有機相を分離して捨て、水相をジクロロメタンで1回あたり200mlで3回抽出し、有機相を捨てた。水相を固形クエン酸でpHを約3に調節し、ジクロロメタンで1回あたり200mlで3回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、6.85gの白色泡状固形製品GAL−5を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO) δ 12.01 (br,1H),7.83 (d,J = 9.2 Hz,1H),5.21 (d,J = 3.2 Hz,1H),4.96 (dd,J = 11.2,3.2 Hz,1H),4.49 (d,J = 8.4 Hz,1H),4.07 − 3.95 (m,3H),3.92 − 3.85 (m,1H),3.74 − 3.67 (m,1H),3.48 − 3.39 (m,1H),2.20 (t,J = 6.8 Hz,2H),2.11 (s,3H),2.00 (s,3H),1.90 (s,3H),1.77 (s,3H),1.55 − 1.45 (m,4H).
複合体1〜2、15〜16のセンス鎖配列が同じであるので、その調製方法も同じであった。
(1−3A)複合体1〜2のアンチセンス鎖の調製
固相ホスホルアミダイト法により、汎用の固相担体(UnyLinkerTM loaded NittoPhase(登録商標)HL Solid Supports、Kinovate Life Sciences社)を出発として循環させ、複合体1及び複合体2のアンチセンス鎖ASを合成した。固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩条件は、センス鎖の合成と同じであった。
以下の方法に従い、VP−U−2分子を合成した。
複合体15のアンチセンス鎖と複合体1のアンチセンス鎖の区別は、5’−末端の1番目のヌクレオチド修飾が異なることのみにあった。固相ホスホルアミダイト法によりアンチセンス鎖を調製する場合、最後に結合されたヌクレオシドモノマーが2’−メトキシ修飾ウラシルヌクレオシドモノマー(Um)であり、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の4つの反応を行ってCPR−Iモノマー(蘇州吉瑪、番号Cat#13〜2601−XX)をアンチセンス鎖の5’末端に結合し、5’−リン酸エステル修飾を形成した。
CPR−Iモノマーを結合した場合、上記酸化反応条件の代わりに硫化反応条件を用いたこと以外、複合体15のアンチセンス鎖と同じ合成プロセスを採用した。5’−チオリン酸エステル修飾を有する複合体16のアンチセンス鎖を製造できると予期した。
複合体1に対して、S鎖とAS鎖をそれぞれ注射用水に溶解させ、40mg/mLの溶液を得、等モル比で混合し、50℃で15min加熱し、室温で冷却した後、これらを水素結合により二本鎖構造を形成させた。超純水(Milli−Q超純水装置で自作、抵抗率18.2MΩ*cm(25℃))を用いて複合体を濃度が0.2mg/mLになるまで希釈した後、液体クロマトグラフィー質量分析計(LC−MS、Liquid Chromatography−Mass Spectrometry、Waters社から購入、型番:LCT Premier)により分子量を検出した。実測値が理論値と一致しており、合成された複合体1が、L−9複合分子を含む目的設計の二本鎖核酸配列であることが示された。
1)前記siRNAが、それぞれ表1に示される複合体3〜14及び比較複合体2に対応する配列であり、2)目的配列に未修飾ヌクレオチドが含まれる場合、切断と脱保護条件で、アンモニア水により処理した後、一本鎖核酸の量に対して、0.4ml/μmolのN−メチルピロリドンにより製品を溶解させた後、0.3ml/μmolのトリエチルアミン及び0.6ml/μmolのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボースにおける2’−TBDMS保護を除去したこと以外、調製例1と同じ方法により、表題複合体を製造できると予期した。
(3−1)P−10化合物の合成
以下の方法に従い、P−10化合物を合成した。
40mlのN,N−ジメチルホルムアミドに上記(1−1−1)に記載された方法により得られたGAL−5(13.43g、30.0mmol)、4−アミノ酸tert−ブチルエステル塩酸塩(5.87g、30.0mmol)、O−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(13.65g、36.0mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(11.63g、90.0mmol)を加え、均一に溶解させた後に室温で5時間攪拌反応させた。反応液に300mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで1回あたり200mlで3回抽出し、有機相をあわせ、200mlの飽和食塩水で1回洗浄し、有機相を分離し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、完全に乾燥するまで溶剤を減圧留去して30.3gの油状物粗製品GAL5−C4−1を得、そのまま次の反応を行った。
工程(3−1−1)で得られたGAL5−C4−1粗製品(30.3g、30mmol)を180mlギ酸に溶解させ、室温で16時間攪拌反応させた。完全に乾燥するまで溶剤を蒸発させ、カラムクロマトグラフィーにより精製し(200〜300メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン:メタノール=100:18〜100:20で勾配溶出した)、反応溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計14.84gの目的生成物GAL5−C4−2を得た。
工程(1−1−4)に記載された方法により得られたM−18−Tr(2.02g、4.69mmol)と工程(3−1−2)で得られたGAL5−C4−2(8.24g、15.48mmol、2バッチの生成物をあわせたもの)を混合して47mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにN−メチルモルホリン(3.13g、30.96mmol)を加え、最後に4−(4,6−ジメトキシトリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリン塩酸塩(DMTMM、4.28g、15.48mmol)を加え、室温で2h攪拌反応させた。20mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、10mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、10mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:5〜100:7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して計8.27gの純粋なP−6を得た。
上記(3−1−3)で得られたP−6(6.82g、3.456mmol)を69mlのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸(13.367g、103.67mmol)を加え、室温で2h反応させた。100mlのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、さらに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しpH=7〜8になるように調節し、水相をジクロロメタンで1回あたり30mlで6回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。200〜300メッシュの順相シリカゲルで精製し、10wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=100:30〜100:40で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計4.82gのP−7を得た。MS m/z:C78H127N10O33,[M+H]+、理論値:1732.91、実測値:1735.73。
P−8(490mg、0.231mmol)、コハク酸無水物(69mg、0.693mmol)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、68mg、0.554mmol)を混合して2.3mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、149mg、1.155mmol)を加え、25℃で21h攪拌反応させた。50mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、さらに100mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩を加えて反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、80gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:18〜100:20で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計200mgの純粋なP−9複合分子を得た。MS m/z:C106H153N10O41,[M−DMTr]+、理論値:1921.05、実測値:1920.97。
L−9複合分子の代わりにP−9複合分子を用い、固相担体に結合されたP−9複合分子を得たこと以外、調製例1における工程(1−1−9)と同じ方法により、P−10を調製した。
出発としてL−10化合物の代わりにP−10化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例1における工程(1−2)、(1−3A)、(1−4)と同じ方法により、複合体17を調製した。構造が式(404)に示されるP10−siHB2M1SVP複合体を得ることができると予期した。
(4−1)R−5化合物の合成
以下の方法に従い、R−5化合物を合成した。
工程(1−1−1b)に記載された方法により得られたGAL−3(26.4g、80.2mmol)を134mlの無水1,2−ジクロロエタンに溶解させ、60gの4Å分子篩粉を加え、さらに7−オクテン−1−オール(11.3g、88.2mmol)を加え、室温で10分間攪拌反応させ、氷浴下で窒素保護下でトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル(8.9g、40.1mmol)を加え、室温で24時間攪拌反応させた。4Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に500mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて洗浄し、有機相を分離し、水相を100mlのジクロロメタンで1回抽出し、有機相をあわせ、250mlの飽和食塩水で1回洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、完全に乾燥するまで溶剤を減圧留去して33.3gの黄色水飴状製品GAL−C7−1を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
工程(4−1−1)で得られたGAL−C7−1(33.3g、72.8mmol)を160mlのジクロロメタンと160mlのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ216mlの水及び固形過ヨウ素酸ナトリウム(62.3g、291.2mmol)を加え、氷水浴下で10分間攪拌し、触媒である塩化ルテニウム(III)(498mg、2.4mmol)を加えて自然に室温まで昇温し23時間攪拌反応させた。反応液に200mlの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてpHを7.5に調節し、有機相を分離し、水相をジクロロメタンで3回抽出し、有機相を捨て、水相を固形クエン酸でpHを約3に調節し、ジクロロメタンで1回あたり200mlで3回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後でカラムクロマトグラフィー(200〜300メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン:メタノール=100:18〜100:20で勾配溶出した)により精製して22.4gの白色泡状固形製品GAL−C7−2を得た。MS m/z:C21H32NO11,[M+H]+、理論値:476.50、実測値:475.94。
工程(1−1−4)に記載された方法により得られたM−18−Tr(2.02g、4.69mmol)とGAL−C7−2(7.36g、15.48mmol)を混合して47mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにN−メチルモルホリン(3.13g、30.96mmol)を加え、最後に4−(4,6−ジメトキシトリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリン塩酸塩(DMTMM、4.28g、15.48mmol)を加え、室温で2h攪拌反応させた。200mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、100mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、100mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:5〜100:7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して7.82gの純粋なR−1を得た。
R−1(6.23g、3.456mmol)を69mlのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸(13.367g、103.67mmol)を加え、室温で2h反応させた。100mlのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しpH=7〜8になるように調節し、水相をジクロロメタンで1回あたり30mlで6回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。200〜300メッシュの順相シリカゲルを用いて、10wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=100:30〜100:40で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して4.49gの純粋なR−2を得た。
R−2(2.391g、1.532mmol)とA−1(2.342g、4.596mmol)を混合して16mlのジクロロメタンに溶解させ、3−ジエトキシホスホリル−1,2,3−ベンゾオキサゾール4(3H)−オン(DEPBT)(1.375g、4.596mmol)を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン(1.188g、9.191mmol)を加え、25℃で2h攪拌反応させた。10mlの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出し、10mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで2回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、120gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt%トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:N,N−ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.5〜1:1:1:0.6で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して2.642gの純粋なR−3を得た。
R−3(795mg、0.4074mmol)、コハク酸無水物(82mg、0.8148mmol)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、100mg、0.8148mmol)を混合して4mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、100mg、0.8148mmol)を加え、25℃で18h攪拌反応させた。5mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり5mlで3回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、30gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:18〜100:20で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して505mgの純粋なR−4複合分子を得た。
L−9複合分子の代わりにR−4複合分子を用い、固相担体に結合されたR−4複合分子を得たこと以外、調製例1における工程(1−1−9)と同じ方法により、R−5を調製した。
出発としてL−10化合物の代わりにR−5化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例1における工程(1−2)、(1−3A)、(1−4)と同じ方法により、複合体18を調製した。構造が式(407)に示されるR5−siHB2M1SVP複合体を得ることができると予期した。
以下のプロセス経路により、LA−5化合物を合成できると予期した。
(6−1)LB−5化合物の合成
以下の方法に従い、LB−5化合物を合成した。
工程(1−1−6)に記載された方法により得られたL−8(5.0g、3.386mmol)、アジピン酸無水物(870mg、6.772mmol)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、827mg、6.772mmol)を混合して130mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、2.2g、16.931mmol)を加え、25℃で4h攪拌反応させた。70mlのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで4回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、120gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:メタノール=1:1:1:0.2〜1:1:1:1で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して4.267gの純粋なLB−1を得た。
工程(6−1−1)に記載された方法により得られたLB−1(4.697g、2.753mmol、2バッチの生成物をあわせたもの)、3−アミノ−1,2−プロパンジオール(313mg、3.442mmol)、4−(4,6−ジメトキシトリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリン塩酸塩(DMTMM、953mg、3.442mmol)及びN−メチルモルホリン(700mg、6.884mmol)を順に30mlのアセトニトリルと3mlのメタノールの混合液に加え、室温で一晩攪拌反応させた。完全に乾燥するまで溶剤を蒸発させ、カラムクロマトグラフィー(200〜300メッシュの順相シリカゲルをジクロロメタン:メタノール=1:0.07〜1:0.5で勾配溶出した)により精製し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、3.27gの目的生成物LB−2を得た。
LB−2(2.27g、1.353mmol)を14mlの無水ピリジンで溶解させた。さらに4,4’−ビスメトキシトリチルクロリド(688mg、2.03mmol)を加えて室温で一晩攪拌反応させた。150mlのメタノールを加えてクエンチングし、完全に乾燥するまで溶剤を蒸発させた。カラムクロマトグラフィー(200〜300メッシュの順相シリカゲルをジクロロメタン:メタノール=1:0.05〜1:0.2で勾配溶出した)により精製し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、1.647gの目的生成物LB−3を得た。
LB−3(822mg、0.415mmol)、コハク酸無水物(83g、0.83mmol)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、102mg、0.83mmol)を混合して4mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにDIPEA(270mg、2.075mmol)を加え、25℃で一晩攪拌反応させた。0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を3回洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり2mlで3回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、5wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、石油エーテルでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:5〜100:20で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して787mgの純粋なLB−4複合分子を得た。
L−9複合分子の代わりにLB−4複合分子を用い、固相担体に結合されたLB−4複合分子を得たこと以外、調製例1における工程(1−1−9)と同じ方法により、LB−5を調製した。
出発としてL−10化合物の代わりにLB−5化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例1における工程(1−2)、(1−3A)、(1−4)と同じ方法により、複合体20を調製した。構造が式(413)に示されるLB5−siHB2M1SVP複合体を得ることができると予期した。
以下のプロセス経路により、V−8化合物を合成できると予期した。
(8−1)W−8化合物の合成
以下の方法に従い、W−8化合物を合成した。
W−0(2.024g、10mmol)を25mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにトリエチルアミン(4.048g、40mmol)を加え、氷水浴で0℃程度まで冷却し、トリフルオロ酢酸エチル(5.683g、40mmol)を加え、室温で22h反応させた。溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで18h発泡乾燥させ、5.835gの固形粗製品W−1を得た。
W−1粗製品(5.835g、10mmol)を50mlのジクロロメタンに溶解させ、反応液にTrCl(3.345g、12mmol)及びトリエチルアミン(1.518g、15mmol)を加え、室温で20h攪拌反応させた。20mlの飽和炭酸水素ナトリウムで反応液を2回洗浄し、20mlの飽和食塩水で1回洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で有機溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、8.012gの固形粗製品W−2を得た。処理されることなく、次の脱保護反応を行った。
W−2粗製品(8.012g、10mmol)を100mlのメタノールに溶解させ、さらに100mlのメチルアミン水溶液(40wt%)を加え、50℃で23h攪拌反応させた。不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固し、200mlの体積比1:1のDCM−メタノール混合溶剤を加え、50mlの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり50mlで3回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール:アンモニア水(25wt%)=1:1:0.05〜1:1:0.25で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて3.062gの純粋なW−3を得た。
W−3(0.675g、1.517mmol)とGAL−C7−2(2.60g、5.46mmol)を混合して47mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(1.57g、12.14mmol)を加え、最後に3−ジエトキシホスホリル−1,2,3−ベンゾオキサゾール4(3H)−オン(DEPBT、1.816g、6.04mmol)を加え、室温で2.5h攪拌反応させた。100mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、80mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、80mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:5〜100:7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して1.610gの純粋なW−4を得た。
W−4(1.61g、0.886mmol)を125mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジクロロ酢酸(3.5ml、42.43mmol)を加え、室温で1h反応させた。150mlのピリジンを加えて反応液を中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。200〜300メッシュの順相シリカゲルを用いて、10wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=100:30〜100:40で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.26gの純粋なW−5を得た。
W−5(1.25g、0.793mmol)と工程(1−1−7a)に記載された方法により得られたA−1(1.21g、2.38mmol)を混合して12mlのジクロロメタンに溶解させ、3−ジエトキシホスホリル−1,2,3−ベンゾオキサゾール4(3H)−オン(DEPBT、0.712g、2.38mmol)を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン(0.615g、4.76mmol)を加え、25℃で3h攪拌反応させた。80mlの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出し、有機相をあわせ、10mlの飽和食塩水で洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、185gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt%トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:N,N−ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.1〜1:1:1:0.7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.57gの純粋なW−6を得た。
W−6(1.238g、0.63mmol)、コハク酸無水物(0.189g、1.89mmol)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、0.231g、1.89mmol)を混合して7mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにDIEA(0.407g、3.15mmol)を加え、25℃で24h攪拌反応させた。5mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり5mlで3回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、30gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:18〜100:20で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.033gの純粋なW−7複合分子を得た。MS m/z:C101H146N7O38,[M−DMTr]+、理論値:1763.92、実測値:1763.21。
L−9複合分子の代わりにW−7複合分子を用い、固相担体に結合されたW−7複合分子を得たこと以外、調製例1における工程(1−1−9)と同じ方法により、W−8を調製した。
出発としてL−10化合物の代わりにW−8化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例1における工程(1−2)、(1−3A)、(1−4)と同じ方法により、複合体22を調製した。構造が式(415)に示されるW8−siHB2M1SVP複合体を得ることができると予期した。
以下のプロセス経路により、X−8化合物を合成できると予期した。
(10〜1)Z−5化合物の合成
以下の方法に従い、Z−5化合物を合成した。
工程(8−1−3)に記載された方法により得られたW−3(1.50g、3.37mmol)と工程(3−1−2)に記載された方法により得られたGAL5−C4−2(7.18g、13.48mmol)を混合して34mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(3.48g、26.96mmol)を加え、最後に3−ジエトキシホスホリル−1,2,3−ベンゾオキサゾール4(3H)−オン(DEPBT、4.04g、13.48mmol)を加え、室温で4.5h攪拌反応させた。100mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、80mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、80mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、200〜300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=30:1〜15:1で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して3.97gの純粋なZ−1を得た。MS m/z:C98H143N10O33,[M+H]+、理論値:1987.98、実測値:1987.90。
Z−1(3.97g、2.00mmol)を250mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジクロロ酢酸(10.941g、84.85mmol)を加え、室温で1h反応させた。ピリジンを加えて反応液を中性に中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。220gの200〜300メッシュの順相シリカゲルをカラムに入れ、10%ピリジンでシリカゲルの酸性を中和し、1‰ピリジンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=10:1〜2:1で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して3.49gの純粋なZ−2を得た。MS m/z:C79H129N10O33,[M+H]+、理論値:1746.94、実測値:1746.90。
Z−2(3.49g、2.0mmol)と工程(1−1−7a)に記載された方法により得られたA−1(3.06g、6.0mmol)を混合して30mlのジクロロメタンに溶解させ、3−ジエトキシホスホリル−1,2,3−ベンゾオキサゾール4(3H)−オン(DEPBT、1.80g、6.0mmol)を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン(1.55g、12.0mmol)を加え、25℃で3h攪拌反応させた。100mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を1回あたり30mlで2回洗浄し、水相を10ジクロロメタンで抽出し、有機相をあわせ、50mlの飽和食塩水で洗浄し、有機相をあわせ無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、200gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1wt%トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=25:1〜15:1で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して2.2gの純粋なZ−3を得た。MS m/z:C103H151N10O38,[M+H]+、理論値:2136.02、実測値:2136.20。
Z−3(2.10g、0.983mmol)をDIEA(0.635g、4.915mmol)を含む14.8mlのジクロロメタンに溶解させ、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、240mg、1.966mmol)を加え攪拌して清澄させた後、コハク酸無水物(197mg、1.966mmol)を加え、25℃で18h攪拌反応させた。50mlのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、80mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり50mlで2回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、188gの200〜300メッシュの順相シリカゲルを用い、1wt%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1wt‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=10:1〜3:1で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.95gの純粋なZ−4複合分子を得た。MS m/z:C107H155N10O41,[M+H]+、理論値:1935.07、実測値:1935.29。
L−9複合分子の代わりにZ−4複合分子を用い、固相担体に結合されたZ−4複合分子を得たこと以外、調製例1における工程(1−1−9)と同じ方法により、Z−5を調製した。
出発としてL−10化合物の代わりにZ−5化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例1における工程(1−2)、(1−3A)、(1−4)と同じ方法により、複合体24を調製した。構造が式(422)に示されるZ5−siHB2M1SVP複合体を得ることができると予期した。
本調製例では、複合体25、26及び比較複合体1、3(以下、それぞれFIN−siHB1M1SVP、FIN−siHB2M1SVP及びFIN−NC、FIN−siHB3M1SVP複合体ともいう)を合成した。当該複合体に複合されたsiRNAの配列は、表1に示される。
Rajeevら、ChemBioChem 2015,16,903−908に記載された調製方法を参照し、以下のプロセス経路により、FIN−2複合分子を合成した。
2.93gのPRO−6(L−ヒドロキシプロリン、CAS番号:51−35−4、Energy社から購入、22.4mmol)を22.5mlの1,4−dioxane(1,4−ジオキサン、CAS番号:123−91−1)に溶解させ、34mlの10%(w/w)Na2CO3の水溶液を加え、懸濁液状態にし、6.95gのFmoc−Cl(クロロギ酸−9−フルオレニルメチル、CAS番号:28920−43−6、Energy社から購入、26.8mmol)を34mlの1,4−dioxaneに溶解させ、氷浴下で上記懸濁液中に加え、自然に室温まで昇温し一晩反応させた。反応液を150mlの氷水に注入し、メチルtert−ブチルエーテルで1回あたり100mlで3回抽出し、有機相を捨て、水相を濃HClでpH≦5になるように調節し、100mlの酢酸エチルで2回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固して7.83gの白色泡状固形製品PRO−7を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO−d6) δ 7.91 (t,J = 7.2 Hz,2H),7.67 (d,J = 7.5 Hz,2H),7.48 − 7.39 (m,2H),7.38 − 7.27 (m,2H),5.17 (s,1H),4.27 (s,2H),4.23 − 4.11 (m,2H),3.55 − 3.41 (m,3H),2.31 − 2.10 (m,1H),2.08 − 1.88 (m,1H). HRMS (ESI) m/z 理論値 C20H19NO5 [M−H]−352.1190、実測値352.1033.
7.83gのPRO−7(22.2mmol)を80mlのTHF(CAS番号:109−99−9)に溶解させ、油浴で65℃に加熱し、還流状態で36.6mlの2mol/LのBH3−Me2SのTHF溶液(CAS番号13292−87−0、J&K Scientific社から購入、73.2mmol)を加え、3時間還流反応を続けた。反応液を流出させ、メタノールで残りの固体を溶解させ、攪拌下で反応液に気体がなくなるまでメタノールを加えてから30分間攪拌し続け、溶剤を減圧留去した後、石油エーテルで3回精製して7.1gの白色固形生成物PRO−8を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO−d6) δ 7.91 (t,J = 6.7 Hz,2H),7.67 (d,J = 7.2 Hz,2H),7.49 − 7.39 (m,2H),7.38 − 7.26 (m,2H),5.18 (dd,J = 6.1,3.8 Hz,1H),4.28 (s,2H),4.23 − 4.13 (m,2H),3.55 − 3.38 (m,2H),2.32 − 2.11 (m,1H),2.08 − 1.89 (m,1H). HRMS (ESI) m/z 理論値 C20H21NO4 [M+Na]+362.1368、実測値362.1012.
7.1gのPRO−8(21mmol)を100mlのピリジンに溶解させ、14.2gのDMTr−Cl(4,4’−ビスメトキシトリチルクロリド、42mmol)を加え、室温で5時間攪拌反応させた。溶剤を減圧留去し、粗製品を酢酸エチルで溶解した後に塩類不純物を濾過除去し、溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラムで精製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからDCMで粗製品を溶解させ負荷し、1%(v/v)ピリジンを含むDCMでDMTr−Clを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、8.2gの白色固形生成物PRO−9を得た。HRMS (ESI) m/z 理論値 C41H39NO6 [M+Na]+664.2675、実測値664.2348,C18 RP−HPLC(ロット番号JJS160324−1)純度94.20%。
8.2gのPRO−9(12.8mmol)を64mlのDMF(N,N−ジメチルホルムアミド)に溶解させ、40mlのピペリジン(384mmol)を加え、室温で30分間攪拌反応させた。反応液を300mlの氷水に注入し、酢酸エチルで1回あたり150mlで3回抽出し、有機相をあわせ、200mlの飽和食塩水で洗浄した後、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラムで精製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからDCMで粗製品を溶解させ負荷し、1%(v/v)ピリジンを含むDCMでFmocを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、4.65gの白色固形生成物PRO−10を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO−d6) δ 7.40 (d,J = 7.2 Hz,2H),7.35 − 7.18 (m,7H),6.93 − 6.84 (m,4H),4.56 (d,J = 3.9 Hz,1H),4.12 (s,1H),3.74 (s,6H),3.46 − 3.37 (m,1H),2.88 (ddd,J = 18.5,10.0,5.5 Hz,2H),2.75 (dd,J = 8.7,5.8 Hz,1H),2.62 (dd,J = 11.0,2.7 Hz,1H),1.74 − 1.65 (m,1H),1.40 (ddd,J = 12.9,8.5,5.9 Hz,1H),HRMS (ESI) m/z 理論値 C26H29NO4 [M+Na]+442.1994、実測値442.1999,C18 RP−HPLC(ロット番号JJS160329−1)純度97.07%。
核酸固相合成方法により、工程(11−1−3)で得られたFIN−2複合分子を3回循環させることにより、汎用の固相担体(UnyLinkerTM loaded NittoPhase(登録商標)HL Solid Supports)に結合し、複合基(FIN_FIN_FIN)のRNAセンス鎖の3’末端への結合を実現した。
1)工程(11−2)で得られた化合物を出発としてセンス鎖を合成し、2)複合siRNAが表1に示される複合体25、26及び比較複合体1、3に対応する配列を有し、3)比較複合体1については、目的配列に未修飾ヌクレオチドが含まれるので、切断と脱保護条件で、アンモニア水により処理した後、一本鎖核酸の量に対して、0.4ml/μmolのN−メチルピロリドンにより製品を溶解させた後、0.3ml/μmolのトリエチルアミン及び0.6ml/μmolのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボースにおける2’−TBDMS保護を除去したこと以外、調製例1における工程(1−2)、(1−3A)、(1−4)と同じ方法により、表題複合体を調製した。
本実験例に用いられるHEK293A細胞は、北京大学分子医学研究所核酸技術実験室により提供され、20%のウシ胎児血清(FBS、Hyclone社)及び0.2体積%のペニシリン−ストレプトマイシン(Penicillin−Streptomycin、Gibco、Invitrogen社)を含むDMEM完全培地(Hyclone社)で細胞を培養し、37℃で5%CO2/95%空気含有インキュベーターにおいて培養した。
psiCHECKTM−2(PromegaTM)プラスミドにより、被験複合体におけるアンチセンス鎖の21個のヌクレオチド配列の全てと完全に相補的な目的配列を含むオンターゲットプラスミドを構築した。目的配列をpsiCHECKTM−2プラスミドのXho I/Not I部位にクローニングした。
96ウェルプレートに、LipofectamineTM 2000(Invitrogen社)の使用説明書により、それぞれsiRNA複合体及び上記プラスミドをコトランスフェクションした。プラスミドをウェルあたり10ngずつトランスフェクションし、0.2μLのLipofectamineTM 2000を用いた。複合体の最終濃度(siRNAの濃度として算出される)が順に0.1nM、0.05nM及び0.01nMであった。各群では、複合体処理しないものを対照とした。1群あたり3個の複製ウェルがあった。
24時間コトランスフェクションした後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット(Dual luciferase reporter gene assay kit、Promega社、cat.E2940)を用い、使用説明書によりHEK293A細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。ホタルルシフェラーゼタンパク質レベルに対するウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レベルで標準化した。結果を図1に示した。
本実験例では、複合体2の体外psiCHECK系におけるIC50及びオフターゲット効果を調べた。
psiCHECKTM−2(PromegaTM)プラスミドにより4つの組換えプラスミドを構築した。そのうち、GSCMは、オンターゲットプラスミドを表し、PSCM、GSSM、PSSMは、オフターゲットプラスミドを表す。
(1)GSCMは、複合体2におけるアンチセンス鎖の21個のヌクレオチド配列の全てと完全に相補的な目的配列を含む。
(2)PSCMは、複合体2におけるアンチセンス鎖の21個のヌクレオチド配列の全てと完全に一致している目的配列を含む。
(3)GSSMは、被験siRNAにおいてアンチセンス鎖の5’端から1〜8位のヌクレオチド配列と完全に相補的であり、残りの部分が被験siRNAにおいてアンチセンス鎖の5’端から9〜21位のヌクレオチド配列に対応し、その配列が全く相補的ではない、即ち、被験siRNAにおいてアンチセンス鎖の5’端から9〜21位のいずれかのヌクレオチドがG、C、A又はUである場合、目的配列における対応する位置のヌクレオチドがそれぞれT、A、C又はGである目的配列を含む。
(4)PSSMは、被験siRNAにおいてセンス鎖の5’端から1〜8位のヌクレオチド配列と完全に相補的であり、残部が被験siRNAにおいてセンス鎖の5’端から9〜19位のヌクレオチド配列に対応し、その配列が全く相補的ではない、即ち、被験siRNAにおいてセンス鎖の5’端から9〜19位のいずれかのヌクレオチドがG、C、A又はUである場合、目的配列における対応する位置のヌクレオチドがそれぞれT、A、C又はGである目的配列を含む。GSSMの標的配列の長さに等しくするために、目的配列の3’末端に順にヌクレオチドC、Cを加えた。
96ウェルプレートに、LipofectamineTM 2000(Invitrogen社)の使用説明書により、それぞれ複合体及び上記各プラスミドをコトランスフェクションした。プラスミドをウェルあたり10ngずつトランスフェクションし、0.2μLのLipofectamineTM 2000を用いた。siRNA複合体の最終濃度(siRNAの量として)が0.1nMから、0.0001nMに倍加希釈し、プラスミドごとに11群のsiRNA濃度が対応し、1群あたり3個の複製ウェルがあった。
HEK293A細胞を24時間培養した後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット(Dual luciferase reporter gene assay kit、Promega社、cat.E2940)を用い、使用説明書により細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。各特定の濃度の複合体試験群では、複合体未処理群を対照とした。ホタルルシフェラーゼタンパク質レベル(Fir)に対するウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レベル(Ren)で標準化した。siRNAの異なる濃度で測定された活性結果から、Graphpad 5.0ソフトウェアlog(inhibitor) vs. response−Variable slope機能により用量−効果曲線をフィッティングし、用量−効果曲線から以下の算出方法により被験siRNAのGSCMを標的したIC50値を算出した。
Yは、残存mRNAの発現レベルであり、
Xは、トランスフェクションsiRNAの濃度の対数値であり、
Botは、定常期の最低のY値であり、
Topは、定常期の最高のY値であり、
LogIC50は、Yが最低と最高との間の半分にある場合のX値であり、HillSlopeは、曲線の傾きであった。結果を図2に示した。
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製:複合体1及び複合体2(それぞれsiRNA濃度が20μMの0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供され、1群あたり6μl)をそれぞれ27.2μLのクエン酸ナトリウム水溶液(pH5.0)、4.08μLの脱イオン水及び2.72μLのトリトソーム(Xenotech社から購入、番号R0610LT、ロット番号1610069、最終濃度0.2mU/μL)と均一に混合した。37℃で恒温培養した。それぞれ0h、5min、15min、30min、1h、2h、4h、8hに5μlの試料を取り出し、それぞれ15μLの9M尿素に加えて変性させた後、4μlの6×試料負荷緩衝液(Solarbio社、番号20160830)を加え、直ちに−80℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。0時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
複合体1、複合体2(それぞれsiRNA濃度が20μMの0.9%塩化ナトリウム水溶液として提供され、1群あたり12μl)及び比較配列1(20μM、12μl)をそれぞれ108μLの90%ヒト血漿(Human plasma、PBSで希釈)と均一に混合した。37℃で恒温培養した。それぞれ0、2、4、6、8、24、48、72時間で10μLのサンプルを取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、−80℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、上記冷凍保存サンプルをそれぞれ1×PBS(pH7.4)で5倍希釈した後、各サンプルを10μLずつとって使用に備えた。同時に、等モル量のsiRNA(2μM、2μl)又はsiRNA複合体(siRNA濃度が2μM、2μl)をとり、8μlの1×PBS(pH7.4)と均一に混合し、ヒト血漿処理されていない10μLのサンプルとして調製し、Conと記した。
比較配列1:
センス鎖:CCUUGAGGCAUACUUCAAA(配列番号46)
アンチセンス鎖:UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU(配列番号47)
他の実験において、実験例2−2と同じ方法により複合体4のサル血漿(Monkey plasma、鴻泉生物から購入、HQ70082、PBSで希釈)における安定性を検出した。結果を図5に示した。
Claims (77)
- センス鎖とアンチセンス鎖を含むsiRNAであって、前記siRNAの各ヌクレオチドがそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Iを含み、アンチセンス鎖はヌクレオチド配列IIを含み、前記ヌクレオチド配列Iと前記ヌクレオチド配列IIとが、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Iは、ヌクレオチド配列Aを含み、前記ヌクレオチド配列Aは、配列番号1に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、且つヌクレオチド差異が3つ以下であり、前記ヌクレオチド配列IIは、ヌクレオチド配列Bを含み、前記ヌクレオチド配列Bは、配列番号2に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、且つヌクレオチド差異が3つ以下であり、
5’−UGCUAUGCCUCAUCUUCUZ−3’(配列番号1)、
5’−Z’AGAAGAUGAGGCAUAGCA−3’(配列番号2)
ただし、ZはAであり、Z’はUであり、
前記ヌクレオチド配列Aに、位置がZに対応するヌクレオチドZAが含まれ、前記ヌクレオチド配列Bに、位置がZ’に対応するヌクレオチドZ’Bが含まれ、前記Z’Bが、前記アンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドであるsiRNA。 - 前記ヌクレオチド配列Aと配列番号1に示されるヌクレオチド配列との間に1つ以下のヌクレオチド差異があり、及び/又は前記ヌクレオチド配列Bと配列番号2に示されるヌクレオチド配列との間に1つ以下のヌクレオチド差異がある、請求項1に記載のsiRNA。
- 前記ヌクレオチド配列Bと配列番号2に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Z’Bの位置での差異を含み、Z’Bが、A、C又はGから選択される、請求項1又は2に記載のsiRNA。
- ZAがZ’Bと相補的なヌクレオチドである、請求項3に記載のsiRNA。
- 前記ヌクレオチド配列Iと前記ヌクレオチド配列IIが、基本的に逆相補、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に逆相補的であるとは、2つのヌクレオチド配列間に3つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記実質的に逆相補的であるとは、2つのヌクレオチド配列間に1つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、2つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項1〜4のいずれか1項に記載のsiRNA。
- ヌクレオチド配列Aが配列番号3に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列Bが、配列番号4に示されるヌクレオチド配列であり、
5’−UGCUAUGCCUCAUCUUCUZA−3’(配列番号3)、
5’−Z’BAGAAGAUGAGGCAUAGCA−3’(配列番号4)
ただし、前記Z’Bはアンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドであり、ZAはA、U、G又はCから選択され、Z’BはZAと相補的なヌクレオチドである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のsiRNA。 - ZAがAであり、Z’BがUである、請求項6に記載のsiRNA。
- 前記ヌクレオチド配列Iがヌクレオチド配列IIIをさらに含み、前記ヌクレオチド配列IIがヌクレオチド配列IVをさらに含み、ヌクレオチド配列IIIとヌクレオチド配列IVの長さがそれぞれ独立して1〜4ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列IIIがヌクレオチド配列Aの5’末端に結合され、ヌクレオチド配列IVがヌクレオチド配列Bの3’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列IIIと前記ヌクレオチド配列IVは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記実質的に逆相補的であるとは、2つのヌクレオチド配列間に1つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、2つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項1〜7のいずれか1項に記載のsiRNA。
- 前記ヌクレオチド配列IIIとIVは、長さがいずれも1ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列IIIの塩基がGであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列IIIとIVは、長さがいずれも2ヌクレオチドであり、5’末端から3’末端に向かって、ヌクレオチド配列IIIの塩基組成がAGであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列IIIとIVは、長さがいずれも3ヌクレオチドであり、5’末端から3’末端に向かって、ヌクレオチド配列IIIの塩基組成がAAGであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列IIIとIVは、長さがいずれも4ヌクレオチドであり、5’末端から3’末端に向かって、ヌクレオチド配列IIIの塩基組成がCAAGである、請求項8に記載のsiRNA。 - 前記ヌクレオチド配列IIがヌクレオチド配列Vをさらに含み、ヌクレオチド配列Vは、長さが1〜3ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の3’末端に結合され、アンチセンス鎖の3’オーバーハング末端を構成する、請求項1〜9に記載のsiRNA。
- 前記ヌクレオチド配列Vの長さが2ヌクレオチドである、請求項10に記載のsiRNA。
- 前記ヌクレオチド配列Vが、連続した2個のチミンデオキシリボヌクレオチド又は連続した2個のウラシルリボヌクレオチドであり、或いは、前記ヌクレオチド配列Vが、標的mRNAの対応する位置のヌクレオチドと相補的である、請求項10又は11に記載のsiRNA。
- 前記siRNAのセンス鎖が配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号5に示されるヌクレオチド配列を含み、
5’−UGCUAUGCCUCAUCUUCUZA−3’(配列番号3)、
5’−Z’BAGAAGAUGAGGCAUAGCAGC−3’(配列番号5)
或いは、前記siRNAのセンス鎖が配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号6に示されるヌクレオチド配列を含み、
5’−UGCUAUGCCUCAUCUUCUZA−3’(配列番号3)、
5’−Z’BAGAAGAUGAGGCAUAGCAUU−3’(配列番号6)
ただし、前記Z’Bはアンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドであり、ZAはA、U、G又はCから選択され、Z’BがZAと相補的なヌクレオチドである、請求項1〜12のいずれか1項に記載のsiRNA。 - siHBVS1
センス鎖:5’−UGCUAUGCCUCAUCUUCUZ−3’(配列番号1)
アンチセンス鎖:5’−Z’AGAAGAUGAGGCAUAGCAGC−3’(配列番号7)、又は
siHBVS2
センス鎖:5’−UGCUAUGCCUCAUCUUCUZ−3’(配列番号1)
アンチセンス鎖:5’−Z’AGAAGAUGAGGCAUAGCAUU−3’(配列番号8)であって、
ただし、ZはAであり、Z’はUである、請求項1〜13のいずれか1項に記載のsiRNA。 - 前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の少なくとも1つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、及び/又は少なくとも1つのリン酸エステル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である、請求項1〜14のいずれか1項に記載のsiRNA。
- 前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドが独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項1〜15のいずれか1項に記載のsiRNA。
- 前記フルオロ修飾ヌクレオチドがヌクレオチド配列Aとヌクレオチド配列Bに位置し、5’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Aの第7、8、9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、5’末端から3’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Bの第2、6、14、16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項16に記載のsiRNA。
- 5’末端から3’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Aの第7、8、9位又は5、7、8、9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、5’末端から3’末端に向かって、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列Bの第2、6、14、16位又は第2、6、8、9、14、16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項17に記載のsiRNA。
- 各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の2’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される1つである、請求項16〜18のいずれか1項に記載のsiRNA。
- ヌクレオチドのリボース基の2’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチドは、2’−アルコキシ修飾ヌクレオチド、2’−置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、2’−アルキル修飾ヌクレオチド、2’−置換アルキル修飾ヌクレオチド、2’−アミノ修飾ヌクレオチド、2’−置換アミノ修飾ヌクレオチド、2’−デオキシヌクレオチドから選択される1つであり、ヌクレオチドアナログはイソヌクレオチド、LNA、ENA、cET、UNA及びGNAから選択される1つである、請求項19に記載のsiRNA。
- 各非フルオロ修飾ヌクレオチドがいずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドが、リボース基の2’−ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す、請求項20に記載のsiRNA。
- 5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Aの第5、7、8及び9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Bの第2、6、8、9、14及び16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Aの第5、7、8及び9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Bの第2、6、14及び16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Aの第7、8及び9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Bの第2、6、14及び16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである、請求項21に記載のsiRNA。 - 前記siRNAがsiHBVS3、siHBVS4、siHBVS5又はsiHBVS6である、請求項22に記載のsiRNA:
siHBVS3
センス鎖:5’−UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号9)
アンチセンス鎖:5’−UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm−3’(配列番号10)
siHBVS4
センス鎖:5’−UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号9)
アンチセンス鎖:5’−UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm−3’(配列番号11)
siHBVS5
センス鎖:5’−UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号12)
アンチセンス鎖:5’−UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm−3’(配列番号13)、又は
siHBVS6
センス鎖:5’−UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号12)
アンチセンス鎖:5’−UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm−3’(配列番号14)
ただし、大文字C、G、U、Aはヌクレオチドの塩基組成を表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表す。 - 前記修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも1つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である、請求項1〜23のいずれか1項に記載のsiRNA。
- 前記修飾基を有するリン酸エステル基が、式(1)に示される構造を有するチオリン酸エステル基である、請求項1〜24のいずれか1項に記載のsiRNA:
- 前記siRNAにおいて、チオリン酸エステル基が、
前記センス鎖の5’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の3’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の3’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも1つに結合されて存在する、請求項1〜25のいずれか1項に記載のsiRNA。 - 前記siRNAがsiHBVS7、siHBVS8、siHBVS9又はsiHBVS10である、請求項1〜26のいずれか1項に記載のsiRNA:
siHBVS7
センス鎖:5’−UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号15)
アンチセンス鎖:5’−UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm−3’(配列番号16)
siHBVS8
センス鎖:5’−UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号15)
アンチセンス鎖:5’−UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm−3’(配列番号17)
siHBVS9
センス鎖:5’−UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号18)
アンチセンス鎖:5’−UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm−3’(配列番号19)
siHBVS10
センス鎖:5’−UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号18)
アンチセンス鎖:5’−UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm−3’(配列番号20)
ただし、大文字C、G、U、Aはヌクレオチドの塩基組成を表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字sは、当該文字の左右2個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表す。 - 前記アンチセンス鎖の5’末端のヌクレオチドが5’−リン酸ヌクレオチド又は5’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである、請求項1〜27のいずれか1項に記載のsiRNA。
- 前記5’−リン酸ヌクレオチドが、式(2)に示される構造を有するヌクレオチドであり、前記5’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが、構造が式(3)〜式(6)のいずれか1つに示されるヌクレオチドから選択され、
- 前記siRNAがsiHBVS11、siHBVS12、siHBVS13、siHBVS14、siHBVS15、siHBVS16、siHBVS17又はsiHBVS18である、請求項1〜29のいずれか1項に記載のsiRNA:
siHBVS11
センス鎖:5’−UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号9)
アンチセンス鎖:5’−P1−UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm−3’(配列番号21)
siHBVS12
センス鎖:5’−UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号9)
アンチセンス鎖:5’−P1−UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm−3’(配列番号22)
siHBVS13
センス鎖:5’−UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号12)
アンチセンス鎖:5’−P1−UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm−3’(配列番号23)
siHBVS14
センス鎖:5’−UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号12)
アンチセンス鎖:5’−P1−UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm−3’(配列番号24)
siHBVS15
センス鎖:5’−UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号15)
アンチセンス鎖:5’−P1−UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm−3’(配列番号25)
siHBVS16
センス鎖:5’−UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号15)
アンチセンス鎖:5’−P1−UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm−3’(配列番号26)
siHBVS17
センス鎖:5’−UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号18)
アンチセンス鎖:5’−P1−UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm−3’(配列番号27)
siHBVS18
センス鎖:5’−UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm−3’(配列番号18)
アンチセンス鎖:5’−P1−UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm−3’(配列番号28)
ただし、大文字C、G、U、Aはヌクレオチドの塩基組成を表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字sは、当該文字の左右2個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、大文字P1は、当該文字の右側に隣接する1つのヌクレオチドが5’−リン酸ヌクレオチド又は5’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表す。 - 請求項1〜30のいずれか1項に記載のsiRNA及び薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする薬物組成物。
- 前記siRNAと薬学的に許容可能な担体との重量比が1:(1〜500)である、請求項31に記載の薬物組成物。
- 前記siRNAと薬学的に許容可能な担体との重量比が1:(1〜50)である、請求項31又は32に記載のsiRNA。
- 前記薬学的に許容可能な担体が、有機アミン、補助脂質及びPEG化脂質を含み、前記有機アミンが、式(201)に示される化合物及び/又はその薬学的に許容できる塩である、請求項31〜33のいずれか1項に記載の薬物組成物:
X101とX102はそれぞれ独立してO、S、N−A又はC−Aであり、Aは水素又はC1−C20炭化水素鎖であり、
YとZはそれぞれ独立してC=O、C=S、S=O、CH−OH又はSO2であり、
R101、R102、R103、R104、R105、R106及びR107はそれぞれ独立して、
水素と、
環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基と、
環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基と、
置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基と、
置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基と、
置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基と、から選択され、
xは1〜10の整数であり、
nは1〜3の整数であり、mは0〜20の整数であり、pは0又は1であり、m=p=0である場合、R102は水素であり、
n又はmの少なくとも1つが2である場合、R103と式(201)における窒素は、式(202)又は式(203)に示される構造を形成し、
- 前記有機アミンが、式(214)に示される有機アミン及び/又は式(215)に示される有機アミンであり、
前記PEG化脂質は1,2−ジパルミトアミド−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)]−2000である、請求項34に記載の薬物組成物。 - 前記有機アミン、前記補助脂質及び前記PEG化脂質のモル比が(19.7〜80):(19.7〜80):(0.3〜50)である、請求項34又は35に記載の薬物組成物。
- 前記有機アミン、前記補助脂質及び前記PEG化脂質のモル比が(50〜70):(20〜40):(3〜20)である、請求項36に記載の薬物組成物。
- 請求項1〜30のいずれか1項に記載のsiRNA及び当該siRNAに複合して結合される複合基を含むsiRNA複合体。
- 前記複合基が薬学的に許容できる標的基とリンカーを含み、前記siRNA、前記リンカー及び前記標的基が順に共有結合又は非共有結合的に結合される、請求項38に記載のsiRNA複合体。
- 前記siRNA、前記リンカー及び前記標的基が順に共有結合的に結合されている、請求項39に記載のsiRNA複合体。
- 前記リンカーが式(301)に示される構造を有する、請求項39又は40に記載のsiRNA複合体:
LAは、式(302)に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記LAは、その両端でそれぞれ1つの前記標的基及び前記LC部にエーテル結合により結合され、
- 前記リンカーが前記siRNAのセンス鎖の5’又は3’末端に結合される、請求項39〜41のいずれか1項に記載のsiRNA複合体。
- 式(305)に示される構造を有し、
- 前記リンカーが式(306)に示される構造を有し、
*は、前記リンカーにおける、エーテル結合により前記標的基に結合される部位を表し、
#は、前記リンカーにおける、リン酸エステル結合により前記siRNAに結合される部位を表す、請求項39又は40に記載のsiRNA複合体。 - 前記リンカーが前記siRNAのセンス鎖の3’末端に結合される、請求項47に記載のsiRNA複合体。
- 式(307)に示される構造を有し、
- 式(308)に示される構造を有する、請求項38に記載のsiRNA複合体:
n1は、1〜3から選択される整数であり、n3は、0〜4から選択される整数であり、
m1、m2及びm3は独立して、2〜10から選択される整数であり、
R10、R11、R12、R13、R14及びR15がそれぞれ独立して、Hであり、又はC1−C10アルキル基、C1−C10ハロゲン化アルキル基及びC1−C10アルコキシ基からなる群から選択され、
R3は式A59に示される構造の基であり、
R2は、長さ1〜20の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2−C10アルケニレン基、C2−C10アルキニレン基、C6−C10アリーレン基、C3−C18ヘテロシクリレン基及びC5−C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択される1又は複数で任意に置換され、R2は、C1−C10アルキル基、C6−C10アリール基、C5−C10ヘテロアリール基、C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC1−C10アルキル基、−OC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−OH、−OC1−C10ハロゲン化アルキル基、−SC1−C10アルキル基、−SC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−SH、−SC1−C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−OH、−SH、−NH2、−C1−C10アルキル−NH2、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−NH(C1−C10アルキル基)、シアノ基、ニトロ基、−CO2H、−C(O)O(C1−C10アルキル基)、−CON(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−CONH(C1−C10アルキル基)、−CONH2、−NHC(O)(C1−C10アルキル基)、−NHC(O)(フェニル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(フェニル基)、−C(O)C1−C10アルキル基、−C(O)C1−C10アルキルフェニル基、−C(O)C1−C10ハロアルキル基、−OC(O)C1−C10アルキル基、−SO2(C1−C10アルキル基)、−SO2(フェニル基)、−SO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)、−SO2NH2、−SO2NH(C1−C10アルキル基)、−SO2NH(フェニル基)、−NHSO2(C1−C10アルキル基)、−NHSO2(フェニル基)及び−NHSO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有してもよく、
各L1は、長さ1〜70の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子が、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2−C10アルケニレン基、C2−C10アルキニレン基、C6−C10アリーレン基、C3−C18ヘテロシクリレン基及びC5−C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択される1又は複数で任意に置換され、L1は、C1−C10アルキル基、C6−C10アリール基、C5−C10ヘテロアリール基、C1−C10ハロゲン化アルキル基、−OC1−C10アルキル基、−OC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−OH、−OC1−C10ハロゲン化アルキル基、−SC1−C10アルキル基、−SC1−C10アルキルフェニル基、−C1−C10アルキル−SH、−SC1−C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−OH、−SH、−NH2、−C1−C10アルキル−NH2、−N(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−NH(C1−C10アルキル基)、シアノ基、ニトロ基、−CO2H、−C(O)O(C1−C10アルキル基)、−CON(C1−C10アルキル基)(C1−C10アルキル基)、−CONH(C1−C10アルキル基)、−CONH2、−NHC(O)(C1−C10アルキル基)、−NHC(O)(フェニル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(C1−C10アルキル基)、−N(C1−C10アルキル)C(O)(フェニル基)、−C(O)C1−C10アルキル基、−C(O)C1−C10アルキルフェニル基、−C(O)C1−C10ハロアルキル基、−OC(O)C1−C10アルキル基、−SO2(C1−C10アルキル基)、−SO2(フェニル基)、−SO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)、−SO2NH2、−SO2NH(C1−C10アルキル基)、−SO2NH(フェニル基)、−NHSO2(C1−C10アルキル基)、−NHSO2(フェニル基)及び−NHSO2(C1−C10ハロゲン化アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有してもよく、
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、
M1は標的基を表す。 - 各L1が式A1〜A26の基から独立して選択される1又は複数の結合の組合せである、請求項47に記載のsiRNA複合体:
R’はC1−C10のアルキル基であり、
Raは、式A27〜A45の基又はその任意の組合せからなる群から選択され、
- L1が、A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13から選択される1又は複数の結合の組合せである、請求項47又は48に記載のsiRNA複合体。
- L1が、A1、A4、A8、A10及びA11から選択される少なくとも2つの結合の組合せである、請求項49に記載のsiRNA複合体。
- L1が、A1、A8、A10から選択される少なくとも2つの結合の組合せである、請求項50に記載のsiRNA複合体。
- L1の長さが3〜25個の原子である、請求項47〜51のいずれか1項に記載のsiRNA複合体。
- L1の長さが4〜15個の原子である、請求項52に記載のsiRNA複合体。
- j1は2〜10の整数であり、j2は2〜10の整数であり、R’がC1−C4のアルキル基であり、Raは、A27、A28、A29、A30及びA31の1つであり、RbがC1−C5のアルキル基である、請求項48〜53のいずれか1項に記載のsiRNA複合体。
- j1は3〜5の整数であり、j2は3〜5の整数であり、R’がメチル基、エチル基及びイソプロピル基の1つであり、RaがA27又はA28であり、Rbは、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の1つである、請求項54に記載のsiRNA複合体。
- n1は1〜2の整数であり、n3は0〜1の整数である、請求項47〜55のいずれか1項に記載のsiRNA複合体。
- n1+n3=2〜3である、請求項47〜56のいずれか1項に記載のsiRNA複合体。
- m1、m2及びm3がそれぞれ独立して2〜5の整数である、請求項47〜57のいずれか1項に記載のsiRNA複合体。
- m1=m2=m3である、請求項58に記載のsiRNA複合体。
- 各前記標的基が独立して哺乳動物の肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体と親和性のあるリガンドである、請求項39〜42、44〜45及び47〜59のいずれか1項に記載のsiRNA複合体。
- 各前記標的基が独立してアシアロ糖タンパク質又は糖である、請求項60に記載のsiRNA複合体。
- 各前記標的基が、D−マンノピラノース、L−マンノピラノース、D−アラビノース、D−キシロフラノース、L−キシロフラノース、D−グルコース、L−グルコース、D−ガラクトース、L−ガラクトース、α−D−マンノフラノース、β−D−マンノフラノース、α−D−マンノピラノース、β−D−マンノピラノース、α−D−グルコピラノース、β−D−グルコピラノース、α−D−グルコフラノース、β−D−グルコフラノース、α−D−フルクトフラノース、α−D−フルクトピラノース、α−D−ガラクトピラノース、β−D−ガラクトピラノース、α−D−ガラクトフラノース、β−D−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、N−アセチルガラクトサミン、N−トリフルオロアセチルガラクトサミン、N−プロピオニルガラクトサミン、N−n−ブチリルガラクトサミン、N−イソブチリルガラクトサミン、2−アミノ−3−O−[(R)−1−カルボキシエチル]−2−デオキシ−β−D−グルコピラノース、2−デオキシ−2−メチルアミノ−L−グルコピラノース、4,6−ジデオキシ−4−ホルムアミド−2,3−ジ−O−メチル−D−マンノピラノース、2−デオキシ−2−スルホアミノ−D−グルコピラノース、N−グリコリル−α−ノイラミン酸、5−チオ−β−D−グルコピラノース、メチル2,3,4−トリス−O−アセチル−1−チオ−6−O−トリチル−α−D−グルコピラノシド、4−チオ−β−D−ガラクトピラノース、エチル3,4,6,7−テトラ−O−アセチル−2−デオキシ−1,5−ジチオ−α−D−グルコヘプトピラノシド、2,5−アンヒドロ−D−アロニトリル、リボース、D−リボース、D−4−チオリボース、L−リボース、L−4−チオリボースから独立して選択される1つである、請求項61に記載のsiRNA複合体。
- 前記標的基の少なくとも1つ又は各々がガラクトース又はN−アセチルガラクトサミンである、請求項62に記載のsiRNA複合体。
- R10、R11、R12、R13、R14及びR15が独立してH、メチル基又はエチル基である、請求項47〜63のいずれか1項に記載のsiRNA複合体。
- R2には、窒素含有骨格上のNに結合される結合部位及びR3におけるPに結合される結合部位がともに含まれる、請求項47〜64のいずれか1項に記載のsiRNA複合体。
- R2上の前記窒素含有骨格中のNに結合される部位がNとアミド結合を形成し、前記R3におけるPに結合される部位がPとリン酸エステル結合を形成する、請求項65に記載のsiRNA複合体。
- R2がB5、B6、B5’又はB6’から選択され、
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、q2は1〜10の整数である、請求項66に記載のsiRNA複合体。 - q2が1〜5の整数である、請求項67に記載のsiRNA複合体。
- 式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)又は(422)に示される構造を有する、請求項47〜68のいずれか1項に記載のsiRNA複合体:
- 式A59におけるPが、siRNAのセンス鎖又はアンチセンス鎖の端部に結合されており、前記端部とは、前記センス鎖又はアンチセンス鎖においてその一端から前の4個のヌクレオチドを指す、請求項47〜69のいずれか1項に記載のsiRNA複合体。
- 式A59におけるPが前記siRNAのセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に結合される、請求項70に記載のsiRNA複合体。
- 式A59におけるPが前記siRNAのセンス鎖の3’末端に結合される、請求項71に記載のsiRNA複合体。
- 式A59におけるPが、リン酸ジエステル結合を形成することにより前記siRNAにおけるヌクレオチドの2’位、3’位又は5’位に結合される、請求項47〜72のいずれか1項に記載のsiRNA複合体。
- 請求項1〜30のいずれか1項に記載のsiRNA、請求項31〜37のいずれか1項に記載の薬物組成物及び/又は請求項38〜73のいずれか1項に記載のsiRNA複合体の、B型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び/又は予防のための薬物の調製への使用。
- 前記B型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患は、慢性肝疾患、炎症、線維性疾患及び過形成性疾患から選択される、請求項74に記載の使用。
- 請求項1〜30のいずれか1項に記載のsiRNA、請求項31〜37のいずれか1項に記載の薬物組成物及び/又は請求項38〜73のいずれか1項に記載のsiRNA複合体の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、B型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び/又は予防方法。
- 請求項1〜30のいずれか1項に記載のsiRNA、請求項31〜37のいずれか1項に記載の薬物組成物及び/又は請求項38〜73のいずれか1項に記載のsiRNA複合体を含む、キット。
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