JP2021500929A - 組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は中間中胚葉(IM)細胞の製造を包含する。用語「中間中胚葉(IM)」は、本開示との関連においては、運命確定中胚葉から生じた胚体中胚葉細胞であって、後方原始線条から派生して、最終的に尿管および腎臓、並びに生殖腺などの他の組織を含む泌尿生殖器系へと発生し得るものを指して用いられる。中間中胚葉に特徴的または代表的なマーカーの例として、PAX2、OSR1および/またはLHX1が挙げられるが、これらに限定はされない。
50個未満のネフロンを有する;
0.5×104〜8×104個程度の細胞を含む;
1000μm未満(好ましくは250〜350μm程度)の直径を有する;
組織や臓器の一部ではない独立した三次元構造である;および
インビトロで幹細胞の分化を含む方法によって製造される。
本開示のオルガノイドまたは細胞が、治療用組成物を製造するために使用され得る。1つの例では、本明細書で開示されるオルガノイド全体が治療用組成物として提供され得る。別の例では、本開示は、本明細書で開示される腎オルガノイドから製造された細胞組成物を包含する。例えば、本開示のオルガノイドを酵素消化することによって、細胞組成物が作製される。例えば、トリプシンなどのプロテアーゼを単独またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)と組み合わせて用いて、本明細書に記載のオルガノイドを消化することによって、細胞組成物が作製され得る。別の例では、コラゲナーゼIおよび/またはコラゲナーゼII(例えば市販のliberase(商標)(ロシュ社))などのコラゲナーゼで、本明細書に記載のオルガノイドを消化することによって、細胞組成物が作製され得る。1つの例では、1または複数の細胞型を枯渇させるために、前記酵素消化物が部分純化または純化される。例えば、血管細胞および/または内皮細胞が枯渇され得る。別の例では、1または複数の細胞型を濃縮するために、前記酵素消化物が部分純化または純化される。例えば、ネフロン前駆細胞および/または尿管上皮前駆細胞の濃縮組成物を得るために、前記酵素消化物が部分純化または純化される。
本開示の各態様は幹細胞の培養を包含する。用語「幹細胞」は、本開示との関連においては、特定の状況下でより特殊化または分化した表現型に分化する能力または可能性を有し、特定の状況下で実質的に分化せずに増殖する能力を保持する、前駆細胞サブセットを指して用いられる。1つの例では、幹細胞という用語は、通常、自然発生的な母細胞であって、胎児性の細胞および組織の多様化の進行で起こるような、子孫がしばしば様々な方向に分化によって、例えば完全な個性を獲得することによって、特殊化するものを指す。細胞分化は通例多くの細胞***を介して起こる複雑なプロセスである。分化細胞は多分化能細胞に由来し得るが、その多分化能細胞はそれ自体が多分化能細胞などから派生したものである。これらの多分化能細胞は各々が幹細胞と見なされ得るが、各々が生じ得る細胞型の範囲はかなり幅があり得る。分化細胞の中には、発生能がより大きい細胞を生じる能力を有するものもある。そのような能力は天然のものであってもよいし、種々の因子による処置で人為的に誘導したものであってもよい。多くの生物例で、幹細胞は、2種以上の別々の細胞型の子孫を生み出すことができるため「多分化能」であるが、これは「幹細胞性(stem-ness)」に必要なものではない。自己複製が、古典的な幹細胞の定義の、他の一部である。原理的には、自己複製は2つの主要な機構のどちらからによって起こり得る。幹細胞は非対称に***し、一方の娘細胞は幹細胞性状態を保持し、他方の娘細胞は異なる他の特殊な機能および表現型をいくつか発現し得る。あるいは、集団内の幹細胞の一部が、2つの幹細胞に対称的に***することにより、全体として集団内にいくらかの幹細胞を維持し、一方で集団内の他の細胞は分化した子孫のみを生じ得る。
用語「培地(media)」または「培地(medium)」とは、細胞培養と関連して使用されている場合、細胞を取り囲んでいる環境の構成要素を含む。培地は、細胞分化およびオルガノイド形成に十分な条件に寄与し、且つ/またはそれを実現するものと想定される。培地は、固体、液体、気体、または相および物質の混合物であり得る。培地は、細胞成長を持続しない液体培地だけでなく、液体増殖培地も含み得る。培地には、寒天、アガロース、ゼラチン、およびコラーゲンマトリックスなどのゼラチン質の培地も含まれる。例示的な気体培地としては、ペトリ皿または他の固相もしくは半固相上で増殖している細胞が暴露される気相が挙げられる。用語「培地」は、細胞とまだ接触していなくとも、細胞培養での使用が意図される物質を指す。
本開示は腎オルガノイドの製造法を包含する。1つの例では、腎オルガノイドは、中間中胚葉(IM)細胞集団を含む培地を旋回することにより製造される。1つの例では、前記IM細胞は浮遊培養下で旋回される。誤解を避けるため、本開示との関連において、「浮遊培養」とは、単一細胞または小細胞塊が振盪液体培地中で浮遊しながら増殖する、細胞培養を指して用いられる。例えば、前記単一細胞または小細胞塊は浮遊培養下で増殖して腎オルガノイドを形成する。
幹細胞集団を7日間培養することでIM細胞を製造する工程であって、最初の4〜5日間は前記幹細胞を高濃度のWnt/βカテニン作動薬(CHIRなど)中で培養することを含み、残り日数は前記細胞をFGF9および低濃度のWnt/βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で培養することを含む、前記工程;
前記IM細胞を解離する工程;
IM細胞をFGF9を含有する細胞培地中で少なくとも5日間旋回することにより、腎オルガノイドを製造する工程であって、最初の24時間は前記細胞をFGF9、ヘパリン、低濃度のWnt/βカテニン作動薬、およびROCKiを含有する細胞培地中で培養することを含み、その後の3日間または4日間は前記細胞をFGF9、ヘパリン、低濃度のWnt/βカテニン作動薬、PVA、およびMCを含有する細胞培地中で培養することを含む、前記工程、
を含む、腎オルガノイドの製造法を包含する。
驚くべきことに、本発明者らはまた、低濃度のCHIRを含有する培地中で幹細胞を培養し、Wnt/β−カテニンシグナル伝達をより長い期間活性化することが、改善された中間中胚葉の製造において有益であることを確認した。このインビトロ培養法は、腎オルガノイドを製造するために、後方原始線条(PPS)細胞および中間中胚葉(IM)細胞を経由して幹細胞を分化させるための系を提供する。
本開示に包含される腎オルガノイドは様々なスクリーニング用途に使用され得る。1つの例では、腎オルガノイドは毒性のスクリーニングに使用され得る。例えば、腎オルガノイドは腎毒性のスクリーニングに使用され得る。
対象における腎疾患を代表する腎オルガノイドにおいて治療効果を示す候補化合物は、前記対象においても治療効果を示す可能性が高い。従って、1つの例では、これらの腎オルガノイドは、対象における腎疾患の治療または予防に影響する可能性が高い薬剤のセレクションに使用され得る。
1つの例では、本開示は、本明細書で開示される組成物または細胞を用いて製造された、腎臓もしくは他のネフロン含有臓器、オルガノイド、または臓器様構造体などの、「バイオプリントされた」腎構造体を包含する。「バイオプリントされた」または「バイオプリントする」などの用語は、本開示との関連においては、自動化された、コンピューター援用の、三次元プロトタイピング装置(例えば、バイオプリンター)と適合する方法による、正確な三次元細胞積層(例えば、細胞液、細胞含有ゲル、細胞浮遊液、細胞濃縮物、多細胞凝集体(multicellular aggregate)、多細胞体(multicellular body)、バイオインクなど)を利用する方法を指して使用されている。バイオプリンティングに好適な方法の例は国際公開第2012/054195号および国際公開第2013/040087号で開示されている。1つの例では、バイオプリンティングは、ヒドロゲル足場を用いて、ヒト細胞を所望の配置に設置し、ヒト臓器を再現する、臓器プリンティング装置(例えばOrganovo(インベテック社(Invetech))を用いて実施される。
1つの例では、本開示は、スクリーニング用途に使用されるキットまたはアッセイに関する。例えば、本開示は、腎毒性および/または治療効果についての候補化合物のスクリーニングで使用されるキットまたはアッセイを包含する。1つの例では、本明細書に記載の腎オルガノイドが培養下で準備された後、候補化合物が腎オルガノイドと接触させられ、腎毒性および/または治療効果についてスクリーニングされ得る。従って、1つの例では、本開示は、スクリーニングに使用される場合、本明細書で開示される腎オルガノイドを培養下で含む、アッセイを包含する。1つの例では、前記アッセイは腎毒性スクリーニングに使用される。1つの例では、前記アッセイは治療効果スクリーニングに使用される。1つの例では、腎オルガノイドは、培地または培養下の腎オルガノイドを維持するための他の成分と共に提供される。1つの例では、腎オルガノイドは、本開示の方法を実施するための書面での指示書と共に提供される。1つの例では、前記アッセイは本明細書に記載の腎オルガノイドを含む。他の例では、前記アッセイは2個以上の腎オルガノイドを含む。例えば、前記アッセイは10個、20個、30個、またはそれ以上の腎オルガノイドを含み得る。腎オルガノイドは、シングルウェルフォーマットまたは96ウェルプレートなどのマルチウェルフォーマットで提供される。
ヒトES細胞(H9細胞)を、マウス胎仔線維芽細胞(MEF)フィーダー上、10%KOSR(ライフテクノロジーズ社)およびbFGFを添加したDMEM培地中で増殖させた。細胞を80%コンフルエントまで培養した後、TrypLE(ライフテクノロジーズ社)を用いて解離した。分化後、ES細胞をMEFフィーダーの非存在下、MEF馴化培地およびbFGF中で、マトリゲル(コーニング社)表面に馴染ませた。
hPSCまたはhESを、最初の4日間、3.5%のタンパク質不含ハイブリドーマ培地(PFHM)(サーモ・フィッシャー社)を含んだAPEL2培地もしくはTeSR−E6培地(ステムセル・テクノロジーズ社)中、APEL培地(ステムセル・テクノロジーズ社)中、またはE6培地(ステムセル・テクノロジーズ社)中、高濃度のCHIR(7μΜ)に細胞に暴露することで、中間中胚葉に分化させた。2日目に培地を交換した。培養物を、追加で3日間(播種から5〜7日目)、低濃度のCHIR(1μΜ)、並びにFGF9およびヘパリンに暴露した(図1A、実施例1〜3)。これにより中間中胚葉(IM)細胞の混合物が誘導される。
7日目、実施例2の方法を用いて製造したIM細胞を、1mlのEDTA溶液を用いて解離し、1mlのEDTA中、37℃で3分間さらにインキュベートし、IM細胞層を乱さないようにEDTA溶液を吸引除去した(図1A)。また、IM細胞を1.5mlのTrypLE(商標)Selectを用いて37℃で3分間解離し、余剰TrypLETMを15mlファルコンチューブ内で1500RPMの遠心分離で除去した。
腎オルガノイドプロトコル内の分化を最適化するため、hPSCの単層を、固定濃度のCHIR99021(7μΜ)を用いて、種々の期間(3、4、5、および6日間)刺激した後、低濃度のCHIR、並びにFGF9およびヘパリンの存在下で7日目まで培養を続けた(図2C、図2D、および図2E)。18日後、共焦点顕微鏡を用いて、得られた腎オルガノイドの腎構造を評価した(図2C、図2D、および図2E)。3日間だけの古典的Wnt活性化では、腎臓の形態を生じさせることができなかった(図2B、左パネル)。代わりに、存在する上皮性構造は、大きな包嚢性管腔を有する不明確な上皮を示し、ネフロン形成の証拠は示さなかった。7μΜのCHIR99021を用いた4日間または5日間の初期誘導により、内皮細胞および間質性間質細胞(interstitial stromal cell)をそれぞれ示す、周囲のSOX17+集団およびMEISl/2/3+集団の存在を含んで、パターン形成ネフロンを含有する腎オルガノイドが生成された(図2C、図2D、および図2E、中央パネル)。しかし、6日間のWnt活性化では、より大きくNPHS1染色されたより大きな腎オルガノイドが生成されたが、上皮性構造が明らかに損なわれた、拡張されたMEIS1+間質集団が含まれた(図2C、図2D、および図2E、右パネル)。7μΜのCHIR99021による4日間の初期誘導が最適であると確認されたため、さらなる研究ではこれを用いた。
腎オルガノイドは直径およそ250〜300μmの不均一な上皮性構造である。刺激の強い酵素を用いると、細胞表面マーカーが破壊され、後の使用のための細胞識別情報が失われる場合がある。冷活性プロテアーゼ(LiberaseTM、ロシュ社)を用いて穏やかに解離を行うと、単一生細胞が最も多く得られる。5mlセロロジカルピペットを用いて腎オルガノイドを15mlファルコンチューブに移し、定着させた。培地上清を吸引除去した後、オルガノイドペレットを0.1M PBSで3回洗浄した。次に、オルガノイドを500μlの1μg/ml Liberase(商標)溶液で処理し、5分毎に粉砕し続けながら4℃で20分間インキュベートした。20分後、腎オルガノイドの単一細胞への解離が完了し、これを10%FCS含有DMEM培地で2回洗浄することでLiberase(商標)を不活性化し、最終的な細胞ペレットを10%FCS含有DMEM培地に懸濁した。
既存の腎オルガノイド生成法は、手間が掛かり、高額であり、生成されるオルガノイドの品質が低い。本発明者らは、経済的で、簡便で、且つ高速の、浮遊培養下の腎オルガノイド生成法を編み出した。以前の方法とは異なり、最低限の解離および単層の低速旋回、その後の低付着培養プレートにける培養の結果、細胞凝集塊が中間中胚葉(IM)の分化段階(7日目)で形成される。これにより、以前の方法を用いて生成される腎オルガノイドよりもずっと少ない、8,000〜10,000個の腎オルガノイドが形成される。18日間の浮遊培養後、それぞれの腎オルガノイドには、ポドサイトを含有する近位上皮、遠位上皮、および糸球体の形成を含む、初期のパターン形成および分節化の証拠を有する、6〜10個程度のネフロンが含まれる。
スケールアップに対する浮遊培養の評価のために、実施例1および実施例2に記載の通りに、C32 iPS細胞を分化させてIMを生成した。7+0日目からサイズおよび培養下の総細胞数を測定することで、オルガノイドの成長をモニターした(図4Cおよび図4D)。
従来のTranswellオルガノイドは複雑な形態を示し、これが個々のネフロンの3次元構造の研究を制限している。本明細書に記載の方法によって製造された旋回腎マイクロオルガノイドは、はるかに単純であり、且つ含まれるネフロンの数が少ない。
旋回腎オルガノイドをさらに広範囲に特徴付けるために、7+18日目におけるC32由来腎マイクロオルガノイドのシングルセルRNAシーケンス解析を行った。40〜50個程度の腎マイクロオルガノイドおよび1個の標準オルガノイド全体を、同じhPSC株(APEL培地中のCRL1502.C32)を用いて、7+18日目まで培養した。オルガノイドを回収し、PBSで3回洗浄して余分な培地を除去した。オルガノイドを、5分毎に1mlピペットで撹拌しながら、1μg/mlのLiberase(商標)(ロシュ社)液400μlで4℃で20分間処理した。20分以内にオルガノイドは単一細胞(singe cell)に解離した。細胞培地(cell culture medial)(2ml)を添加して、Liberase(商標)を不活性化した。細胞を1300〜1500rpmで3〜5分間遠心分離し、ペレットを形成させた。上清を除去し、ペレットを新鮮なDMEM F12培地に再懸濁し、20μmのセルストレーナーを通過させて塊を除去し、分析まで氷上で保存した。生存率および細胞数を、自動セルカウンター(ライフテクノロジーズ社)でのFACSおよびトリパンブルー色素排除試験によって分析した。細胞は分析まで氷上で保存した。大口径1mlピペットチップを用いて細胞を十分に混合し、約4000個の生細胞をRNAシーケンス解析に使用した。テンエックス・ゲノミクス社(10× Genomics)の技術で開発されたChromium Single Cell 3’ Solutionを使用した。試料の調製はテンエックス・ゲノミクス社のシングルセルプロトコルに従って実施した(詳細は、オンラインでアクセス可能なChromium Single Cell 3’ Reagent Kits v2 User Guideに掲載)。シングルセル浮遊液、ゲルビーズ、パーティショニングオイルを10x Chromium Chipの適切なウェルにロードする。10x Chromium Chipを10x Gasketで固定し、完全なアセンブリを10x Chromium Controllerにロードする。これにより、細胞毎に固有のUMIを含有する油滴でコーティングされたシングルセルの浮遊液が自動的に生成される。この浮遊液は、転写物を増幅するために従来のRT−PCTに採用される。
腎オルガノイド内に存在する細胞型の特性評価を、シングルセルRNAシーケンス(scRNA−seq)を用いて実行した。20〜30個の腎オルガノイドのプールを、冷活性プロテアーゼLiberase(商標)を用いて単一生細胞に解離した。その結果、89.4%の単一細胞が生成され、そのうち88.5%の細胞が生細胞であった(データ未記載)。Cell Ranger(テンエックス・ゲノムクス社)を用いて、細胞当たりのUMI数のマトリックスを作成し、これを、Seurat Rパッケージ(バージョン2.3.1)を使用するさらなる解析のために、インポートした(Satija et al., 2015)。フィルタリングされたデータは、細胞当たりの発現遺伝子の中央値が3759個である、1673個の細胞を示した。Seurat Rパッケージを用いたクラスタリングにより、解像度0.6で7つの異なる細胞クラスターが生成された(図3Aおよび図3B、表1)。差動発現試験を実施して各クラスターのマーカーを同定し、各クラスター内の上位の有意にアップレギュレーションされた遺伝子についての遺伝子オントロジーおよび機能的エンリッチメント解析を、PANTHER遺伝子オントロジー群を用いて実施した(Mi et al., 2013;表1)。
Transwell(商標)フィルター上で培養した標準的な腎オルガノイドは、生成されたオルガノイド組織のサイズのために、培養3週間後に拡散制限に直面する可能性がある(図4A)。この期間後のネフロン分節の免疫蛍光染色によって、ネフロン構造がオルガノイドの縁に空間的に制限されていることが示唆された。対照的に、腎オルガノイドは、構造全体に腎尿細管を含んでいる(図4B)。また、オービタルシェーカーを用いて腎オルガノイドを同時に大量に形成することができ、標準的なオルガノイドプロトコルに伴う手作業による面倒な工程を回避することがでる。その結果、標準的なオルガノイドプロトコルでは60分で30個程度のオルガノイドが生成されるのに対し、5〜10分で8000〜10000個程度の均一サイズの腎オルガノイドを生成することができる。腎オルガノイドは、標準オルガノイド(3000〜5000μm)と比較して、はるかに小さい最終サイズ(250〜300μm)を示す(図4C)。免疫蛍光法によって示されたように、標準オルガノイド内に形成されるネフロンは、腎オルガノイドと比較して、組織の周縁に存在する(図4A)。しかし、これらの構造は、腎オルガノイドよりもはるかに大きい。それぞれのアプローチの効率およびコストを直接比較するために、iPSCレポーター株およびhESCレポーター株を用いて各々生成した標準オルガノイドおよび腎オルガノイドを、総細胞数の定量化のために、7日目から分化プロトコルの複数の時点で、解離させてシングルセル浮遊液にした(図4D)。標準オルガノイドでは、7+7日目以降はオルガノイドあたりの総細胞数に重大変化は見られなかったが、腎オルガノイドでは7+12日目まで総細胞数の増加が続いた。全体として、細胞数は標準オルガノイド条件下では8〜10倍に増加したが、腎オルガノイドの場合は30〜40倍まで増加した。これは、この改変されたプロトコルを使用した場合、細胞収量が3〜4倍に改善されることを表している。
オールトランスレチノイン酸(atRA)の添加が、実施例1〜3に記載の旋回培養法で製造されたオルガノイドの糸球体成熟を促進するかどうかを決定するために、7+0日目以後の培地にatRAを添加した。オールトランスレチノイン酸(2.5μΜ)をC32由来旋回オルガノイドに7+5日目から7+10日目まで添加した(図5)。7+18日目後、免疫蛍光分析によって、atRAの添加は対照群と比較してポドサイト表現型を改善することが示された(図7Aおよび図7B)。この結果を、7+11日目および7+18日目の試料のmRNA発現、qPCR分析で確認したところ、2.5μΜのatRAの添加は、対照と比較して、NPHS1などの糸球体マーカーおよびCUBNのような近位尿細管マーカーの発現を増加させることが示された(図7C)。
インビトロにおける腎臓の薬物毒性の試験に、本明細書に記載の浮遊培養法を使用することの適合性を評価するために、薬物毒性試験を実施した。7+18日目にこの方法で作製されたオルガノイドを回収し、24ウェル低付着プレート内の250μlの培地中、各処理群に無作為に割り付けた。オルガノイドを、様々な濃度の細胞傷害性薬剤アドリアマイシン(0、2.5および5μg/ml)で24時間刺激した。刺激後、培地を除去し、TUNEL染色を用いたアポトーシスの蛍光免疫染色分析用にオルガノイドを2%PFAで固定し、一部のオルガノイドはRNA解析用に溶解させた(図8A〜図8D)。
上記の例示的な方法から得られた腎オルガノイドは、シングルセル転写レベルで、以前に報告された腎オルガノイドプロトコル(Takasato et al., 2016; Takasato et al., 2015)の中に存在するものと同等の、腎臓ネフロン上皮、間質、および内皮細胞成分の、信頼性の高い形成を示す。しかしながら、培養条件を変更することにより、相対的な細胞収量が3〜4倍に改善され、100万個の腎臓細胞あたりの生成コストが1/4倍に少なった。hES3 SOX17mCherry、H9 GAPTrap Luc2、およびiPSC GAPTrap td−Tomato蛍光レポーター株を含む、2つの異なるhESC(H9およびhES3)および3つの異なるiPSC株(iPSC GAPTrap td− Tomato、CRL1502.C32、およびCLR1502.3)を用いて、腎オルガノイド生成の成功を反復できたことから、例示された方法のロバストネスは明らかである。
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Claims (58)
- 50個未満のネフロンを含む、腎オルガノイド。
- 25個未満のネフロンを含む、請求項1に記載の腎オルガノイド。
- 15個未満のネフロンを含む、請求項1に記載の腎オルガノイド。
- 5〜12個のネフロンを含む、請求項1に記載の腎オルガノイド。
- PAX2、SIX1、LHX1、OSR1、WNT11、GATA3、PAX8、EYA1、およびCITED1のうちのいずれか1つもしくは複数を高レベルで発現し、且つ/または、PDGFRA、MEIS2、WT1、および/もしくはC−RETのうちのいずれか1つもしくは複数を低レベルで発現する、細胞を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
- PAX2、SIX1、LHX1、OSR1、WNT11、およびGATA3を高レベルで発現する細胞を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
- NPHS+ポドサイト、LTL+近位尿細管セグメント、ECAD+遠位尿細管セグメント、ECAD+/GATA3+集合管、またはこれらの組み合わせを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
- H9、hES3、iPSC GAPTrap td−Tomato、CRL1502.C32、CLR1502.3、hES3 SOX17mCherry、またはH9 GAPTrap Luc2からなる群から選択される幹細胞由来である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
- 1×104〜5×104個程度の細胞を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
- 1.5×104〜2.5×104個程度の細胞を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
- 250〜500μm程度の直径を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
- 旋回培養下で少なくとも3週間生存する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
- 培養下で少なくとも4週間生存する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
- そのネフロンが、集合管(GATA3+;ECAD+)、初期遠位尿細管(GATA3−;LTL−;ECAD+)、初期遠位尿細管(LTL+;ECAD−)、および糸球体(WT1+)を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
- 腎オルガノイドの発生を促進するのに十分な条件下、細胞培地中で、中間中胚葉(IM)細胞集団を旋回することにより生じる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
- 前記細胞培地が200ng/mlのFGF9を含有する、請求項15に記載の腎オルガノイド。
- 0.5×106〜1.5×106細胞/mlのIMを旋回することによって生じる、請求項15または請求項16に記載の腎オルガノイド。
- 0.8×106〜1.2×106細胞/mlのIMを旋回することにより生じる、請求項15または請求項16に記載の腎オルガノイド。
- 請求項1〜18のいずれか一項に記載の腎オルガノイドまたはその酵素消化物を含む、治療用組成物。
- 治療を必要とする対象に請求項19に記載の組成物を投与することを含む、腎疾患の治療法。
- FGFを含有する細胞培地中で中間中胚葉(IM)細胞集団を旋回することを含む、腎オルガノイドのインビトロ製造法。
- 前記IM細胞を培養液中で少なくとも5日間旋回し、最初の24時間はFGF、ヘパリン、CHIR、およびROCK阻害剤を含む細胞培地中で細胞を旋回することを含み、続く4日間はFGF、ヘパリン、およびCHIRを含む細胞培地中で細胞を培養することを含む、請求項21に記載の方法。
- 残り培養日数が、PVAおよびMCを含有する細胞培地中で細胞を培養することを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞培地が100〜300ng/mlのFGF9を含有する、請求項22に記載の方法。
- 前記最初の24時間がFGF、0.5〜1.5μg/mlのヘパリン、0.5〜1.5μΜのCHIR、および9〜11μΜのROCK阻害剤を含有する細胞培地中で細胞を旋回することを含む、請求項21〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記続く4日間がFGF、0.5〜1.5μg/mlのヘパリン、および0.5〜1.5μΜのCHIRを含有する細胞培地中で細胞を旋回することを含む、請求項21〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記続く4日間がFGF9、ヘパリン、CHIR、MVA、およびPVCを含有する細胞培地中で細胞を培養することを含む、請求項21〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FGFを含有する細胞培地が0.05〜0.2%のMVAおよび0.05〜0.2%のPVCを含有する、請求項27に記載の方法。
- 残り培養日数が、0.05〜0.2%のPVAおよび0.05〜0.2%のMCを含有するが、FGF、ヘパリンCHIR、およびROCK阻害剤は含有しない細胞培地中で細胞を培養することを含む、請求項21〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IM細胞が30〜90rpmで旋回される、請求項21〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IM細胞が18〜24日間旋回される、請求項21〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IM細胞が幹細胞集団を少なくとも7日間培養することによって製造され、最初の4〜5日間が少なくとも6μΜのWnt/βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で幹細胞を培養することを含み、残り培養日数がFGFおよび少なくとも0.5μΜのWnt/βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で細胞を培養することを含む、請求項21〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Wnt/βカテニン作動薬がCHIRであり、前記FGFがFGF9である、請求項32に記載の方法。
- 前記FGFを含有する細胞培地が100〜300ng/mlのFGF9を含有する、請求項32または請求項33に記載の方法。
- 前記FGFを含有する細胞培地が0.5〜1.5μΜのCHIRを含有する、請求項33〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FGFを含有する細胞培地が0.5〜1.5μg/mlのヘパリンをさらに含有する、請求項32〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IM細胞がEDTAまたはトリプシンで解離され、旋回の前にメッシュスクリーンに通される、請求項21〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記幹細胞が多能性幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹(iPS)細胞である、請求項32〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 0.5×106細胞/ml〜1.5×106細胞/mlのIMを含むIM細胞集団を旋回することを含む、請求項21〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項21〜39のいずれか一項に記載の方法によって製造される腎オルガノイド。
- 請求項1〜18のいずれか一項または請求項40に記載の腎オルガノイドを候補化合物と接触させることで、前記候補化合物が腎毒性であるかどうかを判定することを含む、腎毒性について候補化合物をスクリーニングする方法。
- 前記候補化合物が小分子である、請求項41に記載の方法。
- 請求項1〜18のいずれか一項もしくは請求項40に記載の腎オルガノイド、または請求項19に記載の組成物の、腎臓、または腎細胞もしくは腎組織の製造における使用。
- 後方原始線条(PPS)細胞集団をFGFおよび4μΜ未満のWnt/βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で2〜5日間培養することを含む、中間中胚葉(IM)細胞のインビトロ製造法。
- 中間中胚葉(IM)細胞のインビトロ製造法であって、幹細胞集団を少なくとも7日間培養することを含み、最初の4〜5日間が少なくとも6μΜのWnt/βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で幹細胞を培養することを含み、残り培養日数がFGF9および少なくとも0.5μΜのWnt/βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で細胞を培養することを含む、方法。
- 前記FGFを含有する培地が0.5〜3μΜのWnt/βカテニン作動薬を含有する、請求項45に記載の方法。
- 前記培地が0.8〜1.2μΜのWnt/βカテニン作動薬を含有する、請求項45に記載の方法。
- 前記最初の4日間が少なくとも6μΜのWnt/βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で幹細胞を培養することを含む、請求項45〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記最初の4日間が7μΜのWnt/βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で幹細胞を培養することを含む、請求項45〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FGFを含有する細胞培地が100〜300ng/mlのFGF9を含有する、請求項44〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FGFを含有する細胞培地がヘパリンをさらに含有する、請求項44〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞培地が0.5〜2μg/mlのヘパリンを含有する、請求項51に記載の方法。
- 前記幹細胞が多能性幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹(iPS)細胞である、請求項45〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が静脈内投与される、請求項20に記載の方法。
- 前記組成物が腎動脈内注射、腎実質内注射、移植(implantation)、または腎被膜下移植(subcapsular transplantation)で投与される、請求項20に記載の方法。
- 腎臓をバイオプリントする方法であって、
請求項1〜18のいずれか一項または請求項40に記載のオルガノイドからバイオインクを用意すること;
腎臓をバイオプリントすること、
を含む、方法。 - 請求項1〜18のいずれか一項もしくは請求項40に記載のオルガノイド、または請求項19に記載の組成物の、腎臓、または腎細胞もしくは腎組織の製造における使用。
- 請求項21〜39のいずれか一項に記載の方法を用いて腎オルガノイドを製造することを含む、または請求項44〜53に記載の方法を用いてIM細胞を製造することを含む、細胞療法用のネフロン細胞型の生成法。
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