JP2021183956A - Composition for gel, gel, and precast gel - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、(メタ)アクリルアミド系モノマーと特定の架橋剤を含むゲル用組成物、上記組成物から得られるゲル、上記ゲルからなるプレキャストゲルに関する。 The present invention relates to a gel composition containing a (meth) acrylamide-based monomer and a specific cross-linking agent, a gel obtained from the above composition, and a precast gel comprising the above gel.
ポリアクリルアミド電気泳動法(PAGE)は、酵素や蛋白質などの生体由来物質やこれらを人為的に合成した物質について、分子量や等電点の測定や同定、精製を行う際に多用される分析・実験手法である(非特許文献1)。PAGEは、ゲル内部を荷電サンプル物質が移動する速度がサンプル物質の分子量や等電点に依存するという現象を用いており、サンプル物質は架橋ポリアクリルアミド分子鎖相互の網目構造内の間隙(いわゆるポア)を通過することによってゲル内を移動する。サンプル物質の移動速度は、分子量が同一ならば、ゲルの緩衝性、すなわちゲルに含まれる電解質や緩衝剤によって変動し、SDSが付加されたサンプル物質のSDS−PAGEでは、分子量によって変動する。また、PAGEが普及するにしたがって、PAGEの分解能や効率化、作業性向上が求められるようになっている。そこで、有利なPAGEのための材料や装置が提案されてきた(特許文献1、特許文献2、特許文献3、特許文献4)。
Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) is an analysis / experiment that is often used to measure, identify, and purify biological substances such as enzymes and proteins, and substances that are artificially synthesized from them. This is a method (Non-Patent Document 1). PAGE uses the phenomenon that the speed at which a charged sample substance moves inside the gel depends on the molecular weight and isoelectric point of the sample substance, and the sample substance is a gap (so-called pore) in the network structure between crosslinked polyacrylamide molecular chains. ) Moves through the gel. If the molecular weight is the same, the moving speed of the sample substance varies depending on the buffering property of the gel, that is, the electrolyte and the buffering agent contained in the gel, and in SDS-PAGE of the sample substance to which SDS is added, it varies depending on the molecular weight. Further, as PAGE becomes widespread, it is required to improve the resolution, efficiency, and workability of PAGE. Therefore, materials and devices for advantageous PAGE have been proposed (
その一方で、PAGE自体の問題点も指摘されている。ポリアクリルアミドゲルは、特に大きな分子量、例えば分子量が100kDa以上の物質に対する分離能は低い。これは、ゲル内に存在する、架橋ポリアクリルアミド分子鎖相互の間隙の三次元的な大きさ(架橋ポリアクリルアミド分子鎖でできた網目の大きさ。いわゆるポアサイズ)が比較的小型であることに起因すると考えられる。アクリルアミドの濃度を低くしてポアサイズの拡大を試みても、高分子量のサンプル物質に対するポリアクリルアミドゲルの分離能はそれほど変化しない(非特許文献2)。主に核酸(DNA、RNA)の分離に用いられているアガロースゲルの場合には、ポアサイズが大きすぎて高分子量の蛋白質の分離には適さない。アクリルアミドの架橋度を上げてポアサイズを小さくすると、ゲルの透明性と形状安定性、保水性が損なわれ、電気泳動ゲルとして機能しなくなる(非特許文献3)。 On the other hand, the problems of PAGE itself have been pointed out. Polyacrylamide gel has a particularly low resolution for substances having a particularly large molecular weight, for example, a substance having a molecular weight of 100 kDa or more. This is because the three-dimensional size of the gap between the cross-linked polyacrylamide molecular chains (the size of the mesh formed by the cross-linked polyacrylamide molecular chains, so-called pore size) existing in the gel is relatively small. It is thought that. Even if an attempt is made to increase the pore size by lowering the concentration of acrylamide, the separating ability of polyacrylamide gel for a high molecular weight sample substance does not change so much (Non-Patent Document 2). In the case of agarose gel, which is mainly used for separating nucleic acids (DNA, RNA), the pore size is too large to be suitable for separating high molecular weight proteins. When the degree of cross-linking of acrylamide is increased and the pore size is reduced, the transparency, shape stability, and water retention of the gel are impaired, and the gel does not function as an electrophoresis gel (Non-Patent Document 3).
これまでに、ポリアクリルアミド自体の立体的構造を改変する様々な試みがなされている。これらの中で、ポリアクリルアミドゲルの架橋剤として最も多用されているN,N’−メチレンビスアクリルアミド(BIS)に替えて他の架橋剤でポリアクリルアミドを架橋した例としては、2−アクリルエチルメタクリルアミドを用いる例(特許文献5)、2−アクリルエチルメタクリルアミドなどの非対称型のアクリルアミド誘導体を用いる例(特許文献6)、ペンタメチレンビスアクリルアミドを用いる例(特許文献7)などが知られている。しかしながら、高分子量の物質に対しても高い分離能を示し、かつ、保存安定性や機械的強度、取扱性に優れる電気泳動ゲルを与えることのできる、ポリアクリルアミドを主体とするゲル材料は、未だ得られていない。 So far, various attempts have been made to modify the three-dimensional structure of polyacrylamide itself. Among these, 2-acrylic ethylmethacrylate is an example of cross-linking polyacrylamide with another cross-linking agent instead of N, N'-methylenebisacrylamide (BIS), which is most often used as a cross-linking agent for polyacrylamide gel. Examples of using amide (Patent Document 5), an example of using an asymmetric acrylamide derivative such as 2-acrylic ethyl methacrylate (Patent Document 6), an example of using pentamethylenebisacrylamide (Patent Document 7), and the like are known. .. However, a gel material mainly composed of polyacrylamide, which exhibits high resolution even for high molecular weight substances and can provide an electrophoresis gel having excellent storage stability, mechanical strength, and handleability, is still available. Not obtained.
本発明者は、これまでに見出されていない、より機能性に優れるPAGEを可能とするゲル材料を求めた。すなわち、本発明者は、高分子量の物質に対しても高い分離能を示し、かつ、保存安定性や機械的強度、取扱性に優れる電気泳動ゲルを与えることのできる、ポリアクリルアミドを主体とするゲル材料の設計を試みた。 The present inventor has sought a gel material that enables a more functional PAGE that has not been found so far. That is, the present inventor mainly uses polyacrylamide, which exhibits high separability even for high molecular weight substances and can provide an electrophoresis gel having excellent storage stability, mechanical strength, and handleability. I tried to design a gel material.
その結果、(メタ)アクリルアミド系モノマーを特定の架橋剤の存在下で重合して得られる架橋ポリ(メタ)アクリルアミドを含むゲルが、高分子量化合物に対する分離能、機械的強度、取扱性のいずれもが優れるPAGE用ゲルとして有効であることを見出した。すなわち本発明は以下のものである。 As a result, the gel containing crosslinked poly (meth) acrylamide obtained by polymerizing a (meth) acrylamide-based monomer in the presence of a specific crosslinking agent has all of separability, mechanical strength, and handleability for high molecular weight compounds. Was found to be effective as an excellent gel for PAGE. That is, the present invention is as follows.
(発明1)置換基を有するか又は有さない(メタ)アクリルアミドから選ばれる少なくとも1種以上の(メタ)アクリルアミド系モノマーと、以下の式(1)で表される分子量が182以上1500以下の架橋剤を含む、ゲル用組成物。 (Invention 1) At least one (meth) acrylamide-based monomer selected from (meth) acrylamide having or not having a substituent and a molecular weight represented by the following formula (1) of 182 or more and 1500 or less. A composition for a gel containing a cross-linking agent.
(Bは炭素数が1以上4以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。R1及びR2は水素原子(H)またはメチル基(CH3)を表す。l,m,nはそれぞれ1,2,3から選ばれ、l,m,nは互いに異なっていてもよく、l,m,nのうちの2つが同一でもよく、l,m,nの全てが同一でもよく、1≦l+m+nである。p,q,rは0≦p,0≦q,0≦r,0≦p+q+rである。)
(発明2)上記架橋剤が以下の化合物CL−1及び/又はCL−2から選ばれる少なくとも1以上である、発明1のゲル用組成物。
(B represents a linear or branched alkylene group having 1 or more and 4 or less carbon atoms. R1 and R2 represent a hydrogen atom (H) or a methyl group (CH 3 ). L, m and n represent 1, 2 and 1, respectively. It is selected from 3, and l, m, and n may be different from each other, two of l, m, and n may be the same, and all of l, m, and n may be the same, and 1 ≦ l + m + n. p, q, r are 0 ≦ p, 0 ≦ q, 0 ≦ r, 0 ≦ p + q + r.)
(Invention 2) The gel composition of
(発明3)置換基を有するか又は有さない(メタ)アクリルアミドから選ばれる少なくとも1種以上の(メタ)アクリルアミド系モノマーに由来する繰り返し単位と、以下の式(1)で表される分子量が182以上1500以下の架橋剤に由来する単位とを有する、架橋(メタ)アクリルアミドを含む、ゲル。 (Invention 3) A repeating unit derived from at least one (meth) acrylamide-based monomer selected from (meth) acrylamide having or not having a substituent and a molecular weight represented by the following formula (1) are present. A gel comprising crosslinked (meth) acrylamide having a unit derived from a crosslinking agent of 182 or more and 1500 or less.
(Bは炭素数が1以上4以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。R1及びR2は水素原子(H)またはメチル基(CH3)を表す。l,m,nはそれぞれ1,2,3から選ばれ、l,m,nは互いに異なっていてもよく、l,m,nのうちの2つが同一でもよく、l,m,nの全てが同一でもよく、1≦l+m+nである。p,q,rは0≦p,0≦q,0≦r,0≦p+q+rである。)
(発明4)上記架橋剤が以下の化合物CL−1及び/又はCL−2から選ばれる少なくとも1以上である、発明3のゲル。
(B represents a linear or branched alkylene group having 1 or more and 4 or less carbon atoms. R1 and R2 represent a hydrogen atom (H) or a methyl group (CH 3 ). L, m and n represent 1, 2 and 1, respectively. It is selected from 3, and l, m, and n may be different from each other, two of l, m, and n may be the same, and all of l, m, and n may be the same, and 1 ≦ l + m + n. p, q, r are 0 ≦ p, 0 ≦ q, 0 ≦ r, 0 ≦ p + q + r.)
(Invention 4) The gel of
(発明5)置換基を有するか又は有さない(メタ)アクリルアミドから選ばれる少なくとも1種以上の(メタ)アクリルアミド系モノマーに由来する繰り返し単位と、以下の式(1)で表される分子量が182以上1500以下の架橋剤に由来する単位とを有する、架橋(メタ)アクリルアミドを含む、ゲル からなるプレキャストゲル。 (Invention 5) A repeating unit derived from at least one (meth) acrylamide-based monomer selected from (meth) acrylamide having or not having a substituent and a molecular weight represented by the following formula (1) are present. A precast gel comprising a cross-linked (meth) acrylamide, having a unit derived from a cross-linking agent of 182 or more and 1500 or less.
(Bは炭素数が1以上4以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。R1及びR2は水素原子(H)またはメチル基(CH3)を表す。l,m,nはそれぞれ1,2,3から選ばれ、l,m,nは互いに異なっていてもよく、l,m,nのうちの2つが同一でもよく、l,m,nの全てが同一でもよく、1≦l+m+nである。p,q,rは0≦p,0≦q,0≦r,0≦p+q+rである。)
(発明6)上記架橋剤が以下の化合物CL−1及び/又はCL−2から選ばれる少なくとも1以上である、請求項5に記載のプレキャストゲル。
(B represents a linear or branched alkylene group having 1 or more and 4 or less carbon atoms. R1 and R2 represent a hydrogen atom (H) or a methyl group (CH 3 ). L, m and n represent 1, 2 and 1, respectively. It is selected from 3, and l, m, and n may be different from each other, two of l, m, and n may be the same, and all of l, m, and n may be the same, and 1 ≦ l + m + n. p, q, r are 0 ≦ p, 0 ≦ q, 0 ≦ r, 0 ≦ p + q + r.)
(Invention 6) The precast gel according to
本発明のゲル用組成物を用いて製造された架橋(メタ)アクリルアミドを含む電気泳動ゲルは、高分子量化合物に対する分離能、機械的強度、取扱性のいずれもが優れる。 The electrophoresis gel containing crosslinked (meth) acrylamide produced by using the gel composition of the present invention is excellent in separability, mechanical strength, and handleability for high-molecular-weight compounds.
[ゲル用組成物] 本発明のゲル用組成物は、(メタ)アクリルアミド系モノマーと、特定の架橋剤を含む。 [Gel Composition] The gel composition of the present invention contains a (meth) acrylamide-based monomer and a specific cross-linking agent.
[(メタ)アクリルアミド系モノマー] 本発明において「(メタ)アクリルアミド」はメタアクリルアミド(メタクリルアミド)とアクリルアミドとの両方を意味する。上記(メタ)アクリルアミド系モノマーは、置換基を有する(メタ)アクリルアミドと置換基を有さない(メタ)アクリルアミドの両方を意味する。このような(メタ)アクリルアミド系モノマーとしては、(メタ)アクリルアミド、N−メチル(メタ)アクリルアミド、N−エチル(メタ)アクリルアミド、N−イソプロピル(メタ)アクリルアミド、N,N′−ジメチル(メタ)アクリルアミド、N,N′−ジエチル(メタ)アクリルアミド、N−(ヒドロキシメチル)(メタ)アクリルアミド、ジアセトン(メタ)アクリルアミド、N′−アクリロイルアミノプロパノール等を使用することができる。本発明で用いる(メタ)アクリルアミド系モノマーは、上記(メタ)アクリルアミド類から選ばれる1種以上を用いることができる。上記(メタ)アクリルアミド系モノマーとして好ましい化合物はアクリルアミドである。本発明では、好ましくは、アクリルアミドを主成分とする(メタ)アクリルアミド系モノマーを用いる。この場合、上記(メタ)アクリルアミド系モノマーを、その総量に対して70重量%以上、好ましくは80重量%以上、さらに好ましくは90重量%以上のアクリルアミドと、残余の割合のアクリルアミド以外の(メタ)アクリルアミド類で構成する。本発明では、さらに好ましくは、アクリルアミドからなる(メタ)アクリルアミド系モノマーを使用する。 [(Meta) Acrylamide Monomer] In the present invention, "(meth) acrylamide" means both metaacrylamide (methacrylamide) and acrylamide. The (meth) acrylamide-based monomer means both (meth) acrylamide having a substituent and (meth) acrylamide having no substituent. Examples of such (meth) acrylamide-based monomers include (meth) acrylamide, N-methyl (meth) acrylamide, N-ethyl (meth) acrylamide, N-isopropyl (meth) acrylamide, and N, N'-dimethyl (meth). Acrylamide, N, N'-diethyl (meth) acrylamide, N- (hydroxymethyl) (meth) acrylamide, diacetone (meth) acrylamide, N'-acrylloylaminopropanol and the like can be used. As the (meth) acrylamide-based monomer used in the present invention, one or more selected from the above (meth) acrylamides can be used. The preferred compound as the (meth) acrylamide-based monomer is acrylamide. In the present invention, a (meth) acrylamide-based monomer containing acrylamide as a main component is preferably used. In this case, the above (meth) acrylamide-based monomer is 70% by weight or more, preferably 80% by weight or more, more preferably 90% by weight or more of acrylamide with respect to the total amount thereof, and (meth) other than acrylamide in the residual ratio. It is composed of acrylamides. In the present invention, a (meth) acrylamide-based monomer composed of acrylamide is more preferably used.
[架橋剤] 上記架橋剤は、以下の式(1)で表され、182以上1500以下、好ましくは200以上1000以下、さらに好ましくは200以上700以下の分子量を有する。 [Crosslinking agent] The cross-linking agent is represented by the following formula (1) and has a molecular weight of 182 or more and 1500 or less, preferably 200 or more and 1000 or less, and more preferably 200 or more and 700 or less.
式(1),(2)における基:B,R1,R2と数:l,m,n,p,q,rは以下のように定義される。Bは炭素数が1以上4以下の直鎖または分岐アルキレン基を表す。R1及びR2は水素原子(H)またはメチル基(CH3)を表す。l,m,nはそれぞれ1,2,3から選ばれ、l,m,nは互いに異なっていてもよく、l,m,nのうちの2つが同一でもよく、l,m,nの全てが同一でもよく、1≦l+m+nである。p,q,rは0≦p,0≦q,0≦r,0≦p+q+rである。好ましいp,q,rは0≦p,0≦q,0≦rであって、さらに1≦p+q+rである。
上記基Aは、好ましくは以下の式(3−1),(3−2),(3ー3)で表される。
The groups: B, R1, R2 and the numbers: l, m, n, p, q, r in the equations (1) and (2) are defined as follows. B represents a linear or branched alkylene group having 1 or more and 4 or less carbon atoms. R1 and R2 represent a hydrogen atom (H) or a methyl group (CH 3 ). l, m, n may be selected from 1, 2, 3 respectively, l, m, n may be different from each other, two of l, m, n may be the same, and all of l, m, n may be the same. May be the same, and 1 ≦ l + m + n. p, q, r are 0 ≦ p, 0 ≦ q, 0 ≦ r, 0 ≦ p + q + r. Preferred p, q, r are 0 ≦ p, 0 ≦ q, 0 ≦ r, and further 1 ≦ p + q + r.
The group A is preferably represented by the following formulas (3-1), (3-2) and (3-3).
式(3−1),(3−2),(3−3)中の基Bの定義は上述の通りである。式(3−1),(3−2),(3−3)で、繰り返し数sは、0≦sであり、式(3−1),(3−2),(3−3)で表される基Aを有する上記架橋剤の分子量が182以上1500以下、好ましくは200以上1000以下、さらに好ましくは200以上700以下の分子量を有するような値であれば、制限されない。本発明で用いる架橋剤として、以下の化合物:CL−1、CL−2が最も好ましい。
The definition of the group B in the formulas (3-1), (3-2), and (3-3) is as described above. In equations (3-1), (3-2) and (3-3), the number of repetitions s is 0 ≦ s, and in equations (3-1), (3-2) and (3-3). It is not limited as long as the molecular weight of the cross-linking agent having the group A represented is 182 or more and 1500 or less, preferably 200 or more and 1000 or less, and more preferably 200 or more and 700 or less. As the cross-linking agent used in the present invention, the following compounds: CL-1 and CL-2 are most preferable.
本発明では、上記架橋剤の2種以上を併用することができる。本発明のゲル組成物には、上記架橋剤に加えて例えばBISのような公知の架橋剤を追加することもできる。また、本発明のゲル用組成物の性能を損なわない限り、ゲルに通常用いられる添加剤を制限なく配合することができる。例えば、ゲルの強度や弾力性を調節するために、アガロースなどの増粘多糖類、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリメチルビニルエーテルなどの水溶性ポリマーを添加することができる。 In the present invention, two or more of the above-mentioned cross-linking agents can be used in combination. In addition to the above-mentioned cross-linking agent, a known cross-linking agent such as BIS can be added to the gel composition of the present invention. Further, as long as the performance of the gel composition of the present invention is not impaired, additives usually used for gels can be blended without limitation. For example, thickening polysaccharides such as agarose, and water-soluble polymers such as polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, and polymethyl vinyl ether can be added to adjust the strength and elasticity of the gel.
本発明のゲル用組成物において、上記(メタ)アクリルアミド系モノマーと上記架橋剤との合計に対する上記架橋剤の割合は、通常1重量%以上30重量%以下、好ましくは2重量%以上25重量%以下、さらに好ましくは3重量%以上20重量%以下とする。 In the composition for gel of the present invention, the ratio of the cross-linking agent to the total of the (meth) acrylamide-based monomer and the cross-linking agent is usually 1% by weight or more and 30% by weight or less, preferably 2% by weight or more and 25% by weight or less. Hereinafter, it is more preferably 3% by weight or more and 20% by weight or less.
本発明のゲル用組成物は、ゲル作製を容易にするために、高濃度の水溶液の形態をとることができる。このような水溶液状のゲル用組成物は一般に「ストック溶液」と呼ばれる。本発明のゲル用組成物をストック溶液として製造する場合には、(メタ)アクリルアミド系モノマーと上記架橋剤とを、これらの合計量がストック溶液の全量に対して、通常は10重量%以上60重量%以下、好ましくは10重量%以上50重量%以下、さらに好ましくは10重量%以上40重量%以下となるように、水に溶解する。この場合、本発明のゲル用組成物の一形態である上記ストック溶液は、ゲル製造直前に希釈される。ゲル製造直前の本発明のゲル組成物における(メタ)アクリルアミド系モノマーと上記架橋剤との合計量は、通常は1重量%以上40重量%以下、好ましくは2重量%以上30重量%以下、さらに好ましくは4重量%以上25重量%以下の範囲にある。 The gel composition of the present invention can take the form of a high-concentration aqueous solution in order to facilitate gel preparation. Such an aqueous gel composition is generally referred to as a "stock solution". When the composition for gel of the present invention is produced as a stock solution, the total amount of the (meth) acrylamide-based monomer and the above-mentioned cross-linking agent is usually 10% by weight or more with respect to the total amount of the stock solution. It is dissolved in water so as to be 10% by weight or less, preferably 10% by weight or more and 50% by weight or less, and more preferably 10% by weight or more and 40% by weight or less. In this case, the stock solution, which is one form of the gel composition of the present invention, is diluted immediately before gel production. The total amount of the (meth) acrylamide-based monomer and the above-mentioned cross-linking agent in the gel composition of the present invention immediately before gel production is usually 1% by weight or more and 40% by weight or less, preferably 2% by weight or more and 30% by weight or less, and further. It is preferably in the range of 4% by weight or more and 25% by weight or less.
本発明のゲル用組成物には、ゲル製造時に重合開始試薬を配合する。上記重合開始試薬としては、一般に重合開始剤,重合促進剤,触媒,ラジカル安定化剤などと呼ばれるゲル製造用試薬を制限なく使用することができる。典型的には、過硫酸アンモニウム(APS)とN,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)からなる重合開始剤が用いられる。リボフラビンなどの光重合開始剤を用いることもできる。上記重合開始試薬の濃度は常法に従う。 The gel composition of the present invention contains a polymerization initiation reagent at the time of gel production. As the polymerization initiator, a gel production reagent generally called a polymerization initiator, a polymerization accelerator, a catalyst, a radical stabilizer, or the like can be used without limitation. Typically, a polymerization initiator consisting of ammonium persulfate (APS) and N, N, N', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) is used. A photopolymerization initiator such as riboflavin can also be used. The concentration of the polymerization initiation reagent follows a conventional method.
さらに本発明のゲル用組成物には、ゲルの使用形態に応じて公知の添加剤、例えば、中性緩衝剤などを配合することができる。 Further, a known additive such as a neutral buffer can be added to the gel composition of the present invention depending on the usage mode of the gel.
[架橋(メタ)アクリルアミドを含むゲル]本発明のゲルは、上記(メタ)アクリルアミド系モノマーを上記架橋剤と上記重合開始剤の存在下に水中で重合させて得られたものである。上記ゲルは、上記(メタ)アクリルアミド系モノマーに由来する繰り返し単位と、上記架橋剤に由来する単位とを有する、架橋(メタ)アクリルアミドを含み、上記架橋(メタ)アクリルアミドの分子鎖がマトリックスの水中に適度な間隙(ポア)を形成するように三次元の網のように分散している。 [Gel containing cross-linked (meth) acrylamide] The gel of the present invention is obtained by polymerizing the (meth) acrylamide-based monomer in water in the presence of the cross-linking agent and the polymerization initiator. The gel contains cross-linked (meth) acrylamide having a repeating unit derived from the (meth) acrylamide-based monomer and a unit derived from the cross-linking agent, and the molecular chain of the cross-linked (meth) acrylamide is in water of a matrix. It is dispersed like a three-dimensional net so as to form an appropriate gap (pore).
上記式(1),(2),(3−1),(3−2),(3−3)、化合物 (CL−1),(CL−2)が示すように、本発明で用いる架橋剤は末端基の構造が同一であって対称性が高く、親水性の鎖状構造:Aを有する。このような構造によって、本発明のゲルでは(メタ)アクリルアミド分子鎖に架橋点が均一に生じ、上記架橋剤に由来する分子鎖が凝集することなく分布すると考えられる。すなわち、本発明のゲルでは、架橋(メタ)アクリルアミド分子鎖でできた目(ポアサイズ)の大きな網がゲル内に均一に分散していると考えられる。本発明のゲルのポアサイズは従来のアクリルアミドゲルに比べて大きくかつ均一で、高分子量物質に対する優れた分離能を発揮する。ゲルを構成する上記架橋(メタ)アクリルアミドの全体構造を一般式や標準化された指標で定義することは困難であるが、本発明のゲルは、これを構成する架橋(メタ)アクリルアミドの全体構造の点で、従来のゲルとは異なるものである。 As shown by the above formulas (1), (2), (3-1), (3-2), (3-3), compounds (CL-1) and (CL-2), the crosslinking used in the present invention. The agent has the same terminal group structure, high symmetry, and a hydrophilic chain structure: A. It is considered that such a structure uniformly causes cross-linking points in the (meth) acrylamide molecular chain in the gel of the present invention, and the molecular chains derived from the cross-linking agent are distributed without agglomeration. That is, in the gel of the present invention, it is considered that a large mesh (pore size) formed of crosslinked (meth) acrylamide molecular chains is uniformly dispersed in the gel. The pore size of the gel of the present invention is larger and more uniform than that of a conventional acrylamide gel, and exhibits excellent separation ability for high molecular weight substances. Although it is difficult to define the overall structure of the crosslinked (meth) acrylamide constituting the gel by a general formula or a standardized index, the gel of the present invention has the overall structure of the crosslinked (meth) acrylamide constituting the gel. In that respect, it differs from conventional gels.
本発明のゲルは、特に高分子量の物質を対象としたPAGEに有効である。本発明のゲルは、公知の電気泳動(PAGE)に用いる装置に制限なく使用することができる。 The gel of the present invention is particularly effective for PAGE targeting high molecular weight substances. The gel of the present invention can be used without limitation in a known apparatus used for electrophoresis (PAGE).
本発明のゲルとともに電気泳動槽に注入される緩衝液、pH調整剤、比重調整剤、界面活性剤は制限されない。これらは泳動させる物質や、泳動方法に応じて適宜選択される。例えば、DNAや蛋白質の混合物からなるサンプルから特定分子量画分を分離する場合には、アミン化合物や双性イオン化合物の組み合わせを含む緩衝液が使用される。この場合には界面活性剤やキレート化合物を添加してもよい。例えば、トリス−ほう酸−EDTA緩衝液(TBE)、トリス−リン酸−EDTA緩衝液(TPE)などのPAGE用緩衝液を使用することができる。 The buffer solution, pH adjuster, specific gravity adjuster, and surfactant injected into the electrophoresis tank together with the gel of the present invention are not limited. These are appropriately selected depending on the substance to be migrated and the migration method. For example, when separating a specific molecular weight fraction from a sample consisting of a mixture of DNA and protein, a buffer solution containing a combination of an amine compound and a zwitterion compound is used. In this case, a surfactant or a chelate compound may be added. For example, PAGE buffers such as Tris-boric acid-EDTA buffer (TBE) and Tris-phosphate-EDTA buffer (TPE) can be used.
[プレキャストゲル] 本発明のゲルは、各種電気泳動装置に応じて予め成形されたプレキャストゲルとして使用することができる。本発明のプレキャストゲルの濃度や形状は、分離対象や分析目的、電気泳動装置の種類に応じて、様々に調整することができる。本発明のプレキャストゲルを量産タイプとすれば、各種電気泳動装置を用いた分離・分析精度の均一化、再現性の向上、作業コストの低減が期待できる。 [Precast gel] The gel of the present invention can be used as a precast gel preformed according to various electrophoresis devices. The concentration and shape of the precast gel of the present invention can be variously adjusted according to the separation target, the purpose of analysis, and the type of the electrophoresis apparatus. If the precast gel of the present invention is a mass-produced type, it can be expected that the separation / analysis accuracy will be uniform, the reproducibility will be improved, and the work cost will be reduced by using various electrophoresis devices.
[材料・装置] 以下の材料と装置、条件を用いた。*は比較用の材料である。 [Materials / Equipment] The following materials, equipment, and conditions were used. * Is a material for comparison.
(ゲル作成用材料)
・アクリルアミド
・架橋剤:CL−1(分子量328)(表1に示す化合物)
・架橋剤:CL−2(分子量282)(表1に示す化合物)
・架橋剤*:BIS(N,N’−メチレンビスアクリルアミド,分子量154)(表1に示す化合物)
・中性ゲル緩衝液:アトー社製EzGelAce,WSE−7310
・重合開始剤:0.05%APS及び0.05%TEMED
(電気泳動用薬剤、装置)
・ゲル作成用泳動プレートの厚み:1mm
・泳動用緩衝液:25mMトリス−192mMグリシン−0.1%SDS
・泳動装置:アトー社製 ラピダス・ミニスラブ電気泳動槽 AE−6530
・電気泳動用電源:アトー社製 PowerStation GhibliI WSE−3100
・泳動条件:300V定電圧、通電時間35分
(分子量マーカー)
・アトー社製 EzProteinLadder WSE−7020
・アトー社製 EzStandard AE−1440
・Thermo Fisher Scientific 社製 HiMarkTM Unstained Protein Standard LC5688
・アトー社製 EzApply AE−1430 により調製したニワトリ筋抽出液
・HeLa細胞抽出液
(染色剤)
・アトー社製 EzStain AQua AE−1340
(DNA泳動用)
・アトー社製DNAラダーマーカー EzDNA Ladder WSE−7030
・DNA断片Φ174/HincII
・DNA断片λ/HindIII
・泳動用緩衝液:25mMトリス−144mMグリシンバッファー
・泳動条件:20mA定電流
・アトー社製 蛍光試薬EzFluoroStain DNA WSE−7130
(等電点・二次元目泳動用)
・HeLa細胞抽出液
・泳動装置:アトー社製 等電点電気泳動装置 DiscRun Ace WSE−1510
・アトー社製 5〜20%濃度勾配ゲル E−D520L
(染色剤)
・アトー社製 EzStain AQua AE−1340
(泳動ゲル撮影装置)
・アトー社製 撮影装置LuminoGraphIII WSE−6300
(Material for gel making)
Acrylamide, cross-linking agent: CL-1 (molecular weight 328) (compounds shown in Table 1)
Crosslinking agent: CL-2 (molecular weight 282) (compounds shown in Table 1)
Crosslinker *: BIS (N, N'-methylenebisacrylamide, molecular weight 154) (compounds shown in Table 1)
-Neutral gel buffer: EzGelAce, WSE-7310 manufactured by Atto Co., Ltd.
-Polymerization initiator: 0.05% APS and 0.05% TEMED
(Drugs and devices for electrophoresis)
・ Thickness of migration plate for gel preparation: 1 mm
-Buffer for migration: 25 mM Tris-192 mM glycine-0.1% SDS
-Etrophoresis device: Rapidus mini-slab electrophoresis tank AE-6530 manufactured by Atto Co., Ltd.
-Power supply for electrophoresis: PowerStation GhibliI WSE-3100 manufactured by Atto Co., Ltd.
・ Migration conditions: 300V constant voltage, energization time 35 minutes (molecular weight marker)
・ EzProteinLadder WSE-7020 manufactured by Atto Co., Ltd.
・ EzStandard AE-1440 manufactured by Atto Co., Ltd.
-Thermo Fisher Scientific HiMark TM United Protein Standard LC5688 manufactured by Thermo Fisher Scientific.
・ Chicken muscle extract ・ HeLa cell extract (staining agent) prepared by EzApply AE-1430 manufactured by Atto Co., Ltd.
・ EzStain AQua AE-1340 manufactured by Atto Co., Ltd.
(For DNA migration)
・ DNA ladder marker made by Atto EzDNA Ladder WSE-7030
・ DNA fragment Φ174 / HincII
・ DNA fragment λ / HindIII
・ Buffer solution for migration: 25 mM Tris-144 mM glycine buffer ・ Migration conditions: 20 mA constant current ・ Fluorescent reagent EzFluoroStain DNA WSE-7130 manufactured by Atto Co., Ltd.
(For isoelectric point / two-dimensional electrophoresis)
-HeLa cell extract-Etrophoresis device: Isoelectric focusing device manufactured by Atto Co., Ltd. DiscRun Ace WSE-1510
・ Ato 5-20% concentration gradient gel E-D520L
(Dyeing agent)
・ EzStain AQua AE-1340 manufactured by Atto Co., Ltd.
(Etrophoresis gel imaging device)
・ LuminoGraphIII WSE-6300, an imaging device manufactured by Atto Co., Ltd.
[相対移動度Rf(%)] 電気泳動後のゲルのスキャナー画像をアトー社製CS Analyzer で解析した。相対移動度Rf(%)を以下の式で求めた。
Rf(%)=(ゲル上端から各バンドまでの距離)÷(ゲル上端から泳動先端までの距離)×100
[ゲル用組成物(ストック溶液)の製造] 上記材料を表2に示すように配合し、ストック溶液としてゲル用組成物(ストック溶液)を製造した。表2に示す、本発明のゲル用組成物(ストック溶液)(実施例1〜4)と比較用のゲル用組成物(ストック溶液)(比較例1,2)が得られた。表2で、「濃度Ts」は、ストック溶液全量に対するモノマーと架橋剤との合計量の割合を示す。表2で、「濃度C」は、モノマーと架橋剤との合計量に対する架橋剤の割合を示す。表2で、「M/CL(モル比)」はストック溶液に含まれるモノマーと架橋剤の量比(モノマーのモル数÷架橋剤のモル数)を表す。
[Relative mobility Rf (%)] The scanner image of the gel after electrophoresis was analyzed by CS Analyzer manufactured by Ato. The relative mobility Rf (%) was calculated by the following formula.
Rf (%) = (distance from the top of the gel to each band) ÷ (distance from the top of the gel to the tip of the electrophoresis) x 100
[Production of composition for gel (stock solution)] The above materials were blended as shown in Table 2 to produce a composition for gel (stock solution) as a stock solution. The gel composition (stock solution) (Examples 1 to 4) of the present invention and the gel composition (stock solution) for comparison (Comparative Examples 1 and 2) shown in Table 2 were obtained. In Table 2, "concentration Ts" indicates the ratio of the total amount of the monomer and the cross-linking agent to the total amount of the stock solution. In Table 2, "concentration C" indicates the ratio of the cross-linking agent to the total amount of the monomer and the cross-linking agent. In Table 2, "M / CL (molar ratio)" represents the amount ratio of the monomer and the cross-linking agent contained in the stock solution (the number of moles of the monomer / the number of moles of the cross-linking agent).
[ゲル用組成物(重合直前)の製造] 表2に示すストック溶液S1,S3,S1*に、上述の中性ゲル緩衝液、重合開始剤を添加して重合直前のゲル用組成物を作製した。表3に示す重合直前のゲル用組成物(実施例5,実施例6,比較例3)が得られた。表3において、「濃度Tmc」は、重合直前のゲル用組成物に含まれるモノマーと架橋剤との合計量の割合を示す。表3において、「濃度C」はモノマーと架橋剤との合計量に対する架橋剤の割合を示し、ストック溶液の濃度Cが維持されている。 [Production of composition for gel (immediately before polymerization)] The above-mentioned neutral gel buffer solution and polymerization initiator are added to the stock solutions S1, S3, S1 * shown in Table 2 to prepare a composition for gel immediately before polymerization. bottom. The gel composition immediately before polymerization shown in Table 3 (Example 5, Example 6, Comparative Example 3) was obtained. In Table 3, "concentration Tmc" indicates the ratio of the total amount of the monomer and the cross-linking agent contained in the gel composition immediately before polymerization. In Table 3, "concentration C" indicates the ratio of the cross-linking agent to the total amount of the monomer and the cross-linking agent, and the concentration C of the stock solution is maintained.
[ゲルの製造] 得られた重合直前のゲル用組成物のモノマーを架橋剤の存在下に重合(ゲル化)した。表3に示す、本発明のゲル(実施例5、実施例6)と比較用のゲル(比較例3)が得られた。表3において、「濃度Tp」は、得られたゲルに含まれる架橋ポリアクリルアミドの割合を示し、上記濃度Tmcが維持されている。表3において、「濃度c」はモノマーと架橋剤との合計量に対する架橋剤の割合を示し、ストック溶液の濃度Cが維持されている。 [Production of gel] The monomer of the obtained composition for gel immediately before polymerization was polymerized (gelled) in the presence of a cross-linking agent. The gels of the present invention (Examples 5 and 6) and the gels for comparison (Comparative Example 3) shown in Table 3 were obtained. In Table 3, "concentration Tp" indicates the ratio of crosslinked polyacrylamide contained in the obtained gel, and the above concentration Tmc is maintained. In Table 3, "concentration c" indicates the ratio of the cross-linking agent to the total amount of the monomer and the cross-linking agent, and the concentration C of the stock solution is maintained.
[電気泳動] 得られたゲル、上記装置、材料、条件を用いて、上記分子量マーカーを電気泳動した。マーカーの分子量に対する相対移動度(Rf)を表3に示す。表3の濃度Tpはゲル全量に対するモノマーと架橋剤との合計量の割合を示す。表3の濃度Cはモノマーと架橋剤との合計量に対する架橋剤の割合であり、ストック溶液(表1)に記載した濃度Cに等しい。ストック溶液に含まれるモノマーと架橋剤のモル比はゲル組成物でも維持される(モノマー:架橋剤(モル)=81:1)。図1に、実施例5、実施例6、比較例3のRf値をグラフで示した。 [Electrophoresis] The molecular weight marker was electrophoresed using the obtained gel, the above-mentioned device, material, and conditions. Table 3 shows the relative mobility (Rf) of the marker with respect to the molecular weight. The concentration Tp in Table 3 shows the ratio of the total amount of the monomer and the cross-linking agent to the total amount of the gel. The concentration C in Table 3 is the ratio of the cross-linking agent to the total amount of the monomer and the cross-linking agent, and is equal to the concentration C shown in the stock solution (Table 1). The molar ratio of the monomer to the cross-linking agent contained in the stock solution is maintained in the gel composition (monomer: cross-linking agent (molar) = 81: 1). FIG. 1 is a graph showing the Rf values of Example 5, Example 6, and Comparative Example 3.
[分離能] 表3と図1に示されるように、分子量100kDa以上の泳動物質に対するRf値は、実施例5、実施例6の値の方が比較例3の値よりも大きい。特に実施例5では分子量140kDa以上の泳動物質に対する分離能が高いことが理解できる。 [Separation ability] As shown in Table 3 and FIG. 1, the Rf values for the electrophoretic substance having a molecular weight of 100 kDa or more are larger in the values of Examples 5 and 6 than those of Comparative Example 3. In particular, in Example 5, it can be understood that the separation ability for a running substance having a molecular weight of 140 kDa or more is high.
同じゲルのニワトリ筋抽出液サンプルレーンの泳動パターンを画像解析ソフトで解析した。図2に、245kDa付近(ミオシンバンド)のプロファイルを示す。図2(a)は解析に使用したレーンの泳動パターンであり、レーン1*は比較例3、レーン2は実施例5、レーン3は実施例6のゲルを示す。図2(b)に示されるように、実施例5(架橋剤CL−1を使用)と実施例6(架橋剤CL−2を使用)のいずれもが、比較例3(架橋剤BISを使用)よりもピーク幅が狭くシャープである。すなわち、実施例5と実施例6では泳動バンドがより明瞭である。このことから、本発明のゲルを用いたPAGEでは高分子量サンプルを精密に分離できることが分かる。
The migration pattern of the chicken muscle extract sample lane of the same gel was analyzed with image analysis software. FIG. 2 shows a profile near 245 kDa (myosin band). FIG. 2A shows the migration pattern of the lanes used in the analysis, in which
[引張強度(M/CL:81,Tp:6%)の測定] 実施例5、実施例6、比較例3のゲルから縦40mm×横30mmの試験片を切り出し、引張強度を測定した。TAインスツルメンツ社製動的粘弾性試験機RSA−G2を用いた。試験は移動速度:1mm/分で行った。3サンプルの測定値の平均値を求めた。表3に、得られた引張破壊応力(kPa)と引張破壊歪み(%)を表3に示す。表3に示すように、比較例のゲルは実施例に比べて引張強度が劣る。 [Measurement of tensile strength (M / CL: 81, Tp: 6%)] A test piece having a length of 40 mm and a width of 30 mm was cut out from the gels of Example 5, Example 6 and Comparative Example 3, and the tensile strength was measured. A dynamic viscoelasticity tester RSA-G2 manufactured by TA Instruments was used. The test was carried out at a moving speed of 1 mm / min. The average value of the measured values of the three samples was calculated. Table 3 shows the obtained tensile fracture stress (kPa) and tensile fracture strain (%). As shown in Table 3, the gel of the comparative example is inferior in tensile strength as compared with the example.
さらに、実施例5、実施例6、比較例3のゲルの硬度を測定した。アスカー社製ゴム硬度計を使用した。表3にそれぞれのゲルの最大針押圧力(mN)を示す。表3に示すように、比較例のゲルは実施例のゲルに比べて硬い。 Further, the hardness of the gels of Example 5, Example 6 and Comparative Example 3 was measured. A rubber hardness tester manufactured by Asker was used. Table 3 shows the maximum needle pressing pressure (mN) of each gel. As shown in Table 3, the gel of the comparative example is harder than the gel of the example.
これらの結果から、架橋剤としてCL−1あるいはCL−2を用いた架橋ポリアクリルアミドを含む本発明のゲルは、従来の架橋剤としてBISを用いた架橋ポリアクリルアミドを含むゲルよりも、引張力に対して強靭で高弾性であることが分かる。このような本発明のゲルは、保存、輸送、使用の際の破損のリスクが低く、品質安定性と取扱性に優れると言える。ゆえに本発明のゲルは、電気泳動用プレキャストゲルとして適している。 From these results, the gel of the present invention containing cross-linked polyacrylamide using CL-1 or CL-2 as a cross-linking agent has a higher tensile strength than the gel containing cross-linked polyacrylamide using BIS as a conventional cross-linking agent. On the other hand, it can be seen that it is tough and highly elastic. It can be said that such a gel of the present invention has a low risk of breakage during storage, transportation, and use, and is excellent in quality stability and handleability. Therefore, the gel of the present invention is suitable as a precast gel for electrophoresis.
[引張強度(M/CL:81,Tp:5%〜10%)の測定] 実施例5、実施例6、比較例3のゲル作製方法に従い、架橋剤濃度(M/CL)を81に維持して架橋ポリアクリルアミド濃度(Tp)が異なるゲルを作製した。得られたゲルについて、上記方法に従い引張破壊応力と引張破壊歪みを測定した。結果を表4と表5に示す。表4の実施例8(Tp:6%)は、表3に示す実施例5と同じものである。表5の比較例5(Tp:6%)は、表3に示す比較例3と同じものである。表4,表5に示されるように、ゲルに含まれる架橋ポリアクリルアミドの濃度(Tp)の高低に関わらず、実施例7〜10のゲルは比較例4〜7のゲルに比べて引張強度が優れる。 [Measurement of tensile strength (M / CL: 81, Tp: 5% to 10%)] The cross-linking agent concentration (M / CL) was maintained at 81 according to the gel preparation methods of Example 5, Example 6 and Comparative Example 3. Then, gels having different crosslinked polyacrylamide concentrations (Tp) were prepared. For the obtained gel, the tensile fracture stress and the tensile fracture strain were measured according to the above method. The results are shown in Tables 4 and 5. Example 8 (Tp: 6%) in Table 4 is the same as Example 5 shown in Table 3. Comparative Example 5 (Tp: 6%) in Table 5 is the same as Comparative Example 3 shown in Table 3. As shown in Tables 4 and 5, the gels of Examples 7 to 10 have higher tensile strength than the gels of Comparative Examples 4 to 7, regardless of the concentration (Tp) of the crosslinked polyacrylamide contained in the gel. Excellent.
[引張強度(M/CL:63,Tp:5%〜10%)] 表2に示すストック溶液S2,S4,S2*を用いて、上述のゲルと同様の方法で、架橋剤濃度(M/CL)を63に変更して架橋ポリアクリルアミド濃度(Tp)が異なるゲルを作製した。得られたゲルについて、上記方法に従い引張破壊応力と引張破壊歪みを測定した。結果を表6と表7に示す。表6,表7に示されるように、架橋剤濃度(M/CL)が63の場合でも、ゲルに含まれる架橋ポリアクリルアミドの濃度(Tp)の高低に関わらず、実施例11〜14のゲルは比較例8〜11に比べて引張強度が優れる。このような結果からも、本発明のゲルがプレキャストゲルとして有効であると言える。 [Tensile strength (M / CL: 63, Tp: 5% to 10%)] Using the stock solutions S2, S4, S2 * shown in Table 2, the cross-linking agent concentration (M / CL) was changed to 63 to prepare gels having different crosslinked polyacrylamide concentrations (Tp). For the obtained gel, the tensile fracture stress and the tensile fracture strain were measured according to the above method. The results are shown in Tables 6 and 7. As shown in Tables 6 and 7, even when the cross-linking agent concentration (M / CL) is 63, the gel of Examples 11 to 14 is produced regardless of the concentration (Tp) of cross-linked polyacrylamide contained in the gel. Is superior in tensile strength as compared with Comparative Examples 8 to 11. From these results, it can be said that the gel of the present invention is effective as a precast gel.
[ゲルの機械的強度] このように、架橋剤としてCL−1あるいはCL−2を用いた架橋ポリアクリルアミドを含む本発明のゲルは、従来の架橋剤としてBISを用いた架橋ポリアクリルアミドを含むゲルよりも、強靭で高弾性であることが分かる。このような本発明のゲルは、使用中の破損のリスクが低く、取扱性に優れると言える。この結果も、本発明のゲルがプレキャストゲルとして有効であることを示している。 [Mechanical Strength of Gel] As described above, the gel of the present invention containing cross-linked polyacrylamide using CL-1 or CL-2 as a cross-linking agent is a gel containing cross-linked polyacrylamide using BIS as a conventional cross-linking agent. It turns out that it is tougher and more elastic than that. It can be said that such a gel of the present invention has a low risk of breakage during use and is excellent in handleability. This result also shows that the gel of the present invention is effective as a precast gel.
[保存安定性(4℃)] 実施例5と比較例3で作製したゲルを4℃で長期保存した場合の引張破壊応力(kPa)と引張破壊歪み(%)を表8に示す。表8に示すように、4℃で180日間保存した状態でも本発明のゲルは比較例のゲルに比べて優れた引張強度を示す。この結果も、本発明のゲルがプレキャストゲルとして有効であることを示している。 [Storage stability (4 ° C.)] Table 8 shows the tensile fracture stress (kPa) and the tensile fracture strain (%) when the gels produced in Example 5 and Comparative Example 3 were stored for a long period of time at 4 ° C. As shown in Table 8, the gel of the present invention exhibits superior tensile strength as compared with the gel of the comparative example even when stored at 4 ° C. for 180 days. This result also shows that the gel of the present invention is effective as a precast gel.
[保存安定性(37℃)] 実施例5と比較例3で作製したゲルを37℃に加温した状態で保存した場合の引張破壊応力(kPa)と引張破壊歪み(%)を表9に示す。表9に示すように、37℃に加温した状態で14日保存した時点で、実施例5で製造したゲルの引張強度は維持されているか、あるいは、むしろ向上している。これに対して、比較例3で製造したゲルの引張強度は低下傾向にある。この結果も、本発明のゲルがプレキャストゲルとして有効であることを示している。 [Storage stability (37 ° C.)] Table 9 shows the tensile fracture stress (kPa) and tensile fracture strain (%) when the gels prepared in Example 5 and Comparative Example 3 were stored in a state of being heated to 37 ° C. show. As shown in Table 9, the tensile strength of the gel produced in Example 5 is maintained or rather improved when it is stored at 37 ° C. for 14 days. On the other hand, the tensile strength of the gel produced in Comparative Example 3 tends to decrease. This result also shows that the gel of the present invention is effective as a precast gel.
[保存安定性の評価] 37℃で1日保存したゲルが受ける熱履歴は、4℃で約1ヶ月保存した場合に相当すると言われている。すると、本発明のゲルは4℃程度の低温下であれば、1年以上の間、機械的強度を損なうことなく保存することができると言える。このような本発明のゲルは、プレキャストゲルとして、使用前に長期保存することができる。 [Evaluation of storage stability] It is said that the heat history received by a gel stored at 37 ° C for one day corresponds to the case where it is stored at 4 ° C for about one month. Then, it can be said that the gel of the present invention can be stored at a low temperature of about 4 ° C. for one year or more without impairing the mechanical strength. Such a gel of the present invention can be stored for a long time as a precast gel before use.
[DNA分離能] ストック溶液S1、S1*を用いて、上述の手順に従い、濃度Tpが7.5%、M/CL(モル比)が81のゲル(実施例15,比較例12)を作製した。得られたゲルと、上記DNA泳動用材料、装置を用いてPAGEを行なった。図3に、泳動後のゲルを示す。図3(a)は実施例15のゲルを示す。図3(b)は比較例12のゲルを示す。図4に、泳動後のゲルから算出したRfを示す。図3、図4から、塩基対数(bp)が500前後のDNAマーカーのRfは実施例15の方が大きいことがわかる。このことから本発明のゲルはDNAのPAGEにも有効であり、かつ、より大型のDNA断片に対する分離能に優れると言える。 [DNA Separability] Using stock solutions S1 and S1 *, gels (Example 15, Comparative Example 12) having a concentration Tp of 7.5% and an M / CL (molar ratio) of 81 were prepared according to the above procedure. bottom. PAGE was performed using the obtained gel, the above-mentioned material for DNA migration, and an apparatus. FIG. 3 shows the gel after migration. FIG. 3A shows the gel of Example 15. FIG. 3B shows the gel of Comparative Example 12. FIG. 4 shows Rf calculated from the gel after migration. From FIGS. 3 and 4, it can be seen that the Rf of the DNA marker having a base pair number (bp) of around 500 is larger in Example 15. From this, it can be said that the gel of the present invention is also effective for DNA PAGE and has excellent separation ability for larger DNA fragments.
[二次元電気泳動] ストック溶液S2、S2*を用いて、濃度Tpが4%、M/CL(モル比)が63のゲル(実施例16,比較例13)を製造した。得られたゲルと上記等電点泳動用材料、装置を用いて、常法に従いO’Farrellの二次元電気泳動を行った。図5に結果を示す。図5(a)は実施例16、図5(b)は比較例13の結果を示す。矢印は泳動方向を表す。図5から、実施例16のゲルでは高分子領域に対応するより多くのスポットが出現していることが分かる。また実施例16のゲルのスポットはより集束した形状を示している。このことから、本発明のゲルは二次元電気泳動の分離精度をさらに向上すると期待される。 [Two-dimensional electrophoresis] Using stock solutions S2 and S2 *, gels having a concentration Tp of 4% and an M / CL (molar ratio) of 63 (Example 16 and Comparative Example 13) were produced. Using the obtained gel, the above-mentioned material for isoelectric point electrophoresis, and the apparatus, two-dimensional electrophoresis of O'Farrell was performed according to a conventional method. The results are shown in FIG. FIG. 5A shows the results of Example 16, and FIG. 5B shows the results of Comparative Example 13. The arrow indicates the migration direction. From FIG. 5, it can be seen that more spots corresponding to the polymer region appear in the gel of Example 16. The gel spots of Example 16 show a more focused shape. From this, it is expected that the gel of the present invention will further improve the separation accuracy of two-dimensional electrophoresis.
本発明のゲル用組成物を用いて製造したゲルはPAGEに有用であり、鮮明な泳動パターンを示す。本発明のゲル用組成物を用いて製造したゲルは、特に高分子量のたんぱく質やDNAなどの分離能に優れる。さらに、本発明のゲル用組成物を用いて製造したゲルは、濃度に関わらず強靭で弾力性に優れ、作業時の破損が起こりにくい。しかも、本発明のゲル用組成物を用いて製造したゲルは長期保存安定性にも優れる。したがって、本発明のゲルはプレキャストゲルとして有用である。本発明のゲル用組成物を用いて製造したゲルは、従来のPAGE用架橋ポリアクリルアミドゲルに比べて格段に性能が向上している。本発明のゲル用組成物、ゲル、プレキャストゲルを使用することによって、PAGEの利用範囲の拡大、PAGEを用いた分析精度の向上、PAGEの作業性向上、PAGEの作業効率化とコスト低減が可能となる。 The gel produced using the gel composition of the present invention is useful for PAGE and shows a clear migration pattern. The gel produced by using the gel composition of the present invention is particularly excellent in the ability to separate high molecular weight proteins and DNA. Further, the gel produced by using the gel composition of the present invention is tough and has excellent elasticity regardless of the concentration, and is less likely to be damaged during work. Moreover, the gel produced by using the gel composition of the present invention is also excellent in long-term storage stability. Therefore, the gel of the present invention is useful as a precast gel. The gel produced by using the gel composition of the present invention has significantly improved performance as compared with the conventional crosslinked polyacrylamide gel for PAGE. By using the gel composition, gel, and precast gel of the present invention, it is possible to expand the range of use of PAGE, improve the analysis accuracy using PAGE, improve the workability of PAGE, and improve the work efficiency and cost of PAGE. Will be.
1 比較例3のレーン
2 実施例5のレーン
3 実施例6のレーン
4 実施例16のスポットの例
5 比較例13のスポットの例
1 Lane of Comparative Example 3 Lane of Example 5 Lane of Example 6 Lane of Example 6 Example of spot of Example 16 Example of spot of Comparative Example 13
Claims (6)
The gel according to claim 3, wherein the cross-linking agent is at least one selected from the following compounds CL-1 and / or CL-2.
からなるプレキャストゲル。
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- 2020-05-22 JP JP2020089955A patent/JP7228199B2/en active Active
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