JP2021169445A - カッカリドを含む組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】皮膚美白、シワ改善、保湿、抗菌、脱毛防止または毛髪成長促進効果を示す組成物を提供する。【解決手段】本発明は、カッカリドを含む組成物に関する。また、カッカリドを含む組成物は、皮膚美白、皮膚シワ改善、皮膚保湿、皮膚抗菌、脱毛防止または毛髪成長促進用途のために多様に使用され得る。【選択図】なし
Description
本発明は、カッカリドを含む皮膚美白、シワ改善、保湿、抗菌、脱毛防止または毛髪成長促進用組成物に関する。
葛條花(Puerariae Flos)または葛花は、葛(Pueraria lobata)のつぼみまたは咲き始めた花を称する。その形態は、不均一な長い楕円形または鐘形であり、長さ5〜15mm、幅2〜6mm、厚さ2〜3mmである。ガクは、暗緑色であり、下側が連結され、終端が5本に分岐するが、2本は合わせられたもののように見え、とがっている。外側面は、黄白色の毛で覆われている。拡大鏡で見るとき、花びらは5個であり、らん紫色乃至紫褐色を帯び、ガクに包まれている。雄しべは10個であり、雌しべは、細くて且つ長く、曲がっており、毛がついている形態である(非特許文献1)。
老化は、生命の現象であり、すべての生命体は、生まれてから老化が始まる。衛生と保健環境の改善によって、人間の寿命が過ぎ去った過去より非常に延長され、高齢人口の割合は着実に増加している傾向にある(特許文献1)。また、人間の寿命が延長されるに伴い、生活の質に対する国民認識の変化および健康に対する関心増大によって天然物資源を利用した新しい素材開発研究が活発に進行されている。副作用に対する恐れのある合成新薬に比べて相対的に副作用が殆どない天然物(特に植物資源)に対する期待感が日増しに増加している(非特許文献2)。
上述した老化および寿命延長の背景において、美容は、個人の容貌の不十分な部分を補完して満足感と幸福感を付与し、その結果、美容を通じて社会的相互作用を円滑に維持、発展させることによって、個人の精神健康だけでなく、社会的健康増進に寄与する(非特許文献3)。このような美を追求する人間の本能は、年齢に関係なく、例外がなく、年齢が高まるにつれて容貌に関連した関心が高まっているのが現状である。
このような背景下に、本発明者らは、副作用が少なく、皮膚美白、シワ改善、保湿、抗菌、脱毛防止または毛髪成長促進に効果的な組成物を探すために研究、開発してきた。
食品医薬品安全評価院、大韓薬典外韓薬(生薬)規格集、2013.01.29.
天然物素材活用医薬品開発、生命工学政策研究センター、2010.12.03.
The Effetcs of Middle and Elderly Woman’s Skin Care on Happiness.Youn,Kim,Kor.J.Aesthet.Cosmetol.,8:1−13,2010.
これより、本発明者らは、皮膚美白、シワ改善、保湿、抗菌、脱毛防止または毛髪成長促進効果を示す組成物を探すために努力した結果、カッカリドが、皮膚美白、シワ改善、保湿、抗菌、脱毛防止または毛髪成長促進効果を示すことを確認して、本発明を完成することになった。
したがって、本発明の目的は、カッカリドを有効成分として含む、皮膚美白、シワ改善、保湿、抗菌、脱毛防止または毛髪成長促進用組成物を提供することにある。
前記組成物は、化粧料組成物、薬学的組成物または食品組成物でありうる。
前記組成物は、化粧料組成物、薬学的組成物または食品組成物でありうる。
上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、カッカリド(kakkalide)を含む組成物を提供する。
本発明において、「美白効果」というのは、皮膚のトーンを明るくすると共に、紫外線、ホルモンまたは遺伝に起因するシミ、ソバカス、色素過剰を緩和または改善することをいう。
本発明の一実施例によれば、カッカリドが細胞レベルでメラニンを減少させる効果を示すことを確認した(実験例1)。
したがって、本発明の組成物は、カッカリドを有効成分として含む皮膚美白用組成物でありうる。
本発明において、「シワ改善効果」というのは、皮膚にシワができるのを予防、抑制または阻害したり、すでに生成されたシワを緩和させることをいう。
本発明の一実施例によれば、カッカリドが、人体由来の線維芽細胞においてコラーゲンタイプI(type I collagen)の合成を促進する効果を確認した(実験例2)。
したがって、本発明の組成物は、カッカリドを有効成分として含む皮膚シワ改善用組成物でありうる。
本発明において「保湿」というのは、乾燥した空気と刺激によって、乾燥し、荒くて、角質ができる皮膚に水分を供給し、水分の蒸発を遮断して皮膚の柔軟性を維持し、均一な角質脱落を誘導して、なめらかな表面を維持するようにすることである。
本発明の一実施例によれば、カッカリドが、ヒト角質細胞でのHAS2、HAS3およびAQP3のmRNA発現が増加することを確認することによって、ヒアルロン酸の合成を発現させる効果を確認した(実験例3)。
前記保湿は、例えば、アトピー皮膚炎、乾癬、皮膚乾燥症、湿疹および色素性乾皮症よりなる群から選ばれる1つ以上に関するものでありうるが、これに制限されるものではない。
したがって、本発明の組成物は、カッカリドを有効成分として含む皮膚保湿用組成物でありうる。
本発明において「抗菌効果」というのは、「抗微生物」または「抗フケ菌」と併用して使用できる言葉であり、菌の増殖を抑制したり死滅させることを言い、細菌やかびのような微生物の作用から防御するために行われるすべての機序を意味する。
本発明の一実施例によれば、カッカリドが、フケ原因菌であるピチロスポルムオバーレ(Pityrosporum ovale)に対する抗菌効果を示すことを確認した(実験例4)。
したがって、本発明の組成物は、カッカリドを有効成分として含む抗菌用組成物でありうる。
本発明において「脱毛防止効果」というのは、脱毛の改善を意味し、脱毛の進行速度を遅延させること、髪の毛が抜ける速度または量を減少させること、または髪の太さが薄くなることを防止することでありうる。本発明のカッカリドを利用して遺伝的な原因、ホルモン不均衡、精神的ストレス、大気汚染露出、加工食品等の多様な習慣と環境的影響によって正常に毛髪が存在しなければならない部位に毛髪のない状態を改善し、脱毛が進行されるのを防止し、毛が生えるようにすることができる。
本発明の一実施例によれば、カッカリドが、脱毛進行過程で減少するWnt信号伝達経路(Wnt/β−catenin signal pathway)を活性化させる効果を確認した(実験例5)。また、本発明の一実施例において、カッカリドが、周辺の血管から栄養分の供給を受けて毛髪の形成に核心的な役割をする毛乳頭細胞を増殖させる効果を確認した(実験例6)。
前記脱毛は、例えば、栄養障害性脱毛、内分泌障害性脱毛、血管障害性脱毛、壮年性脱毛、結髪性脱毛、円形脱毛、神経性脱毛、粃糠性脱毛、トリコチロマニー、悪性脱毛、女性型脱毛、男性型脱毛、アンドロゲン性脱毛、休止期脱毛、頭部白癬、全頭脱毛、減毛症、遺伝性単純減毛症、全身脱毛、薬剤性脱毛、機械的脱毛、外傷性脱毛、圧迫性脱毛、生長期脱毛、梅毒性脱毛、脂漏性脱毛、症候性脱毛、瘢痕性脱毛および先天性脱毛よりなる群から選ばれる1つ以上でありうるが、これに制限されるものではない。
また、本発明において「毛髪成長促進効果」というのは、生成された毛髪(髪の毛)の太さが増加したり、長さが成長する速度を促進することを意味する。
本発明の一実施例において、カッカリドが周辺の血管から栄養分の供給を受けて毛髪の形成に核心的な役割をする毛乳頭細胞を増殖させる効果を確認した(実験例6)。
したがって、本発明の組成物は、カッカリドを有効成分として含む脱毛防止または毛髪成長促進用組成物でありうる。
本発明は、上記のような目的を達成するために、下記化学式1で表される化合物を含む組成物を提供する。
前記化合物は、分子式C28H32O15、分子量608.54を有し、CAS No.58274−56−9であり、カッカリド(kakkalide)と命名される。
本発明は、前記化合物の獲得方法を特に限定せず、自然物から抽出および/または精製、当業界に公知となった方法で化学的に合成したり、市販の物質を使用することができる。
本発明の一実施例によれば、本発明のカッカリドは、葛(Pueraria lobata)のつぼみまたは咲き始めた花から抽出されるイソフラボノイド系物質でありうる。
本発明による化粧料組成物、薬学的組成物および食品組成物において、前記カッカリドの含量は、化粧料組成物、薬学的組成物および食品組成物の全体重量に対して0.00001〜10重量%であることが好ましい。
本発明のカッカリドは、水和物、溶媒和物の形態で存在することができる。本発明のカッカリドは、結晶型または無定形の形態で存在することができ、このようなすべての物理的形態は、本発明の範囲に含まれる。
本発明による組成物は、溶液、外用軟膏、クリーム、フォーム、栄養化粧水、柔軟化粧水、パック、柔軟水、乳液、メイクアップベース、エッセンス、石鹸、洗浄剤、入浴剤、サンスクリーンクリーム、サンオイル、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、パッチおよびスプレーよりなる群から選ばれる剤形で製造することができ、好ましくは、化粧水、エッセンス、ローション、クリーム、パック、ジェル、パウダー、ファンデーションまたは洗浄剤でありうるが、これに制限されるものではない。
本発明は、前記化学式1で表されるカッカリドを有効成分として含む、皮膚美白用、皮膚シワ改善用、皮膚保湿用、皮膚抗菌用、脱毛防止または毛髪成長促進用化粧料組成物を提供する。
前記化粧料組成物は、一般皮膚化粧料に配合される化粧学的に許容可能な担体を1種以上追加で含むことができ、通常の成分として、例えば油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート剤、色素、防腐剤、香料等を適切に配合することができるが、これに制限されるものではない。
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、ポリアミドパウダーまたはこれらの混合物が利用され得、特にスプレーである場合には、追加でクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン/ブタンまたはジメチルエーテルのような推進剤を含むことができる。
本発明の剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、溶解化剤、または乳濁化剤が利用され、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、1,3−ブチルグリコールオイルがあり、特に、綿実油、ピーナツ油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ひまし油およびゴマ油、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリールアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラガカント等が利用され得る。
本発明の剤形が石鹸である場合には、担体成分として脂肪酸のアルカリ金属塩、脂肪酸ヘミエステル塩、脂肪酸タンパク質加水分解物、イセチオネート、ラノリン誘導体、脂肪族アルコール、植物性油、グリセロール、糖等が利用され得る。
本発明は、また、前記化学式1で表されるカッカリドを有効成分として含む組成物を個体の皮膚に塗布する段階を含む、皮膚美白、シワ改善、保湿、抗菌、脱毛防止または毛髪成長促進方法を提供する。前記個体は、ヒト、家畜、マウス等を含む哺乳類動物を制限なしに含む。
本発明の一実施例によれば、本発明は、前記化学式1で表されるカッカリドを有効成分として含む皮膚美白用、皮膚シワ改善用、皮膚保湿用、皮膚抗菌用、脱毛防止または毛髪成長促進用薬学的組成物を提供する。
本発明において、「薬学的組成物」という用語は、「医薬部外品」または「医薬品」の意味を含む概念として使用され得る。
本発明の化合物を含む組成物は、経口または非経口の様々な剤形でありうるが、好ましくは、非経口製剤でありうる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を使用して調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、1つ以上の化合物に少なくとも1つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース(sucrose)またはラクトース(lactose)、ゼラチン等を混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルク等のような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が該当するが、頻繁に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール(propyleneglycol)、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステル等が使用され得る。
本発明は、また、前記化学式1で表されるカッカリドを有効成分として含む、皮膚美白用、皮膚シワ改善用、皮膚保湿用、皮膚抗菌用、脱毛防止または毛髪成長促進用外用剤組成物を提供することができる。
前記化学式1の化合物を皮膚外用剤の剤形として使用する場合、追加で脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤およびゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁液剤、安定化剤、発泡剤(foaming agent)、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤およびキレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル(essential oil)、染料、顔料、親水性または親油性活性剤、脂質小胞または皮膚外用剤組成物に通常使用される任意の他の成分のような皮膚科学分野において通常使用される補助剤を含有することができる。また、前記成分は、皮膚科学分野において一般的に使用される量で導入され得る。
前記化学式1の化合物が外用剤組成物として提供される場合、軟膏、パッチ、ゲル、クリームまたは噴霧剤の剤形を有することができるが、これに制限されるものではない。
本発明の外用剤組成物は、特に好ましくは非経口用製剤として利用され得、例えば、外用剤組成物は、ワセリン、ステアリルアルコール等の薬学的に許容される適当な基剤;ポリソルベート、ソルビタンセスキオレート等の薬学的に許容される適当な界面活性剤;グリセリン等の薬剤学的に許容される適当な保湿剤;薬学的に許容される適当な溶剤;および着香剤、着色剤、安定化剤、粘性化剤等を均質に混合する通常の皮膚外用剤組成物の製造方法により製造され得る。
また、本発明は、前記化学式1で表されるカッカリドを有効成分として含む、皮膚美白用、皮膚シワ改善用、皮膚保湿用、皮膚抗菌用、脱毛防止または毛髪成長促進用医薬部外品組成物を提供することができる。
前記化学式1の化合物が医薬部外品組成物として提供される場合、前記医薬部外品組成物は、ヒドロキシシンナム酸、イソアミルアセテートおよびベタインよりなる群から選ばれる1つ以上の化合物またはこれの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むことに加えて、必要に応じて薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。前記薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤は、本発明の効果を害しない限り、制限されず、例えば充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤、潤滑剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等を含むことができる。
本発明の前記医薬部外品組成物は、消毒清潔剤、シャワーフォーム、軟膏液、ウェットティッシュ、コーティング剤等を例示することができ、好ましくは、外用軟膏、ローション等のように半固形製剤として製造され得るが、これに制限されない。前記医薬部外品の製剤化方法、用量、利用方法、構成成分等は、技術分野に公知となった通常の技術から適宜選択され得る。
また、本発明は、前記化学式1で表されるカッカリドを有効成分として含む、皮膚美白用、皮膚シワ改善用、皮膚保湿用、皮膚抗菌用、脱毛防止または毛髪成長促進用食品組成物を提供することができる。
前記化学式1の化合物が食品組成物として提供される場合、前記組成物は、有効成分以外に食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含むことができる。
前記食品補助添加剤は、食品に保存的に添加され得る構成要素を意味し、各剤形の健康機能食品を製造するのに添加されるものであり、当業者が適宜選択して使用することができる。食品補助添加剤の例としては、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル(電解質)、合成風味剤および天然風味剤等の風味剤、着色剤および充填剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤等が含まれるが、その種類がこれに制限されるものではない。
また、前記食品組成物には、健康機能食品が含まれ得る。本発明において健康機能食品とは、食品に物理的、生化学的、生物工学的手法等を利用して当該食品の機能を特定目的に作用、発現するように付加価値を付与した食品群や食品組成が有する生体防御リズム調節、疾病防止と回復等に関する生体調節機能を生体に対して十分に発現するように設計して加工した食品を意味する。一般食品に比べて積極的な健康維持や増進効果を有し、健康補助食品(health supplement food)は、健康補助目的の食品を意味する。場合によって、機能性食品、健康食品、健康補助食品の用語は混用される。
具体的に、前記健康機能食品は、本発明のカッカリドを飲料、茶類、香辛料、ガム、菓子類等の食品素材に添加したり、カプセル化、粉末化、懸濁液等で製造した食品であり、これを摂取する場合、健康上特定の効果をもたらすことを意味するが、一般薬品とは異なって、食品を原料として薬品の長期服用時に発生しうる副作用がないという長所がある。
前記食品には、食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含むことができ、健康機能食品の製造に通常使用される適切な担体、賦形剤および希釈剤をさらに含むことができる。
前記組成物は、食品組成物に通常使用されて、臭い、味、視覚等を向上させることができる追加成分を含むことができる。例えば、ビタミンA、C、D、E、B1、B2、B6、B12、ニアシン(niacin)、ビオチン(biotin)、葉酸(folate)、パントテン酸(panthotenic acid)等を含むことができる。また、亜鉛(Zn)、鉄(Fe)、カルシウム(Ca)、マグネシウム(Mg)、マンガン(Mn)、銅(Cu)、クロム(Cr)等のミネラルを含むことができる。また、ロイシン、トリプトファン、システイン、バリン等のアミノ酸を含むことができる。本発明の健康機能食品が取ることができる形態には制限がなく、通常の意味の食品を全部含むことができ、機能性食品等当業界に知られた用語と混用可能である。
また、本発明の健康機能食品は、当業者の選択によって食品に含まれ得る適切なその他補助成分と公知の添加剤を混合して製造することができる。添加できる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、茶、ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン複合剤等があり、本発明による化学式1で表されるカッカリドを主成分として製造した汁、茶、ジェリーおよびジュース等に添加して製造することができる。また、動物のための飼料に利用される食品も含む。
本発明の組成物は、当業界に公知となった美白成分、シワ改善成分、保湿成分、抗菌成分、脱毛防止または毛髪成長促進成分を追加で含むことができる。追加の成分は、全体組成物の重量に対して0.0001重量%〜10重量%で含まれ得、前記含量の範囲は、皮膚安全性、前記化学式1で表されるカッカリドの剤形化時の容易性等の要件によって調節され得る。
本発明において「有効量」というのは、皮膚美白、皮膚シワ改善、皮膚保湿、皮膚抗菌、脱毛防止または毛髪成長促進効果を十分に示すことができる化合物の量を意味する。
本発明の組成物に含まれる前記化学式1で表されるカッカリドの有効量は、組成物が製品化される形態、前記カッカリドが皮膚に適用される方法および皮膚に留まる時間等によって変わる。例えば、前記組成物が医薬品に製品化される場合には、日常的に皮膚に適用する化粧品に製品化される場合に比べて高い濃度で前記化学式1で表されるカッカリドを含むことができる。したがって、一日投与量は、前記カッカリドの量を基準として0.1〜500mg/kgであり、一日に1〜6回投与され得る。
以上、本明細書に記載された数値は、別途明示されていない限り、均等範囲まで含むものと解すべきである。
本発明によるカッカリドを含む組成物は、皮膚美白、皮膚シワ改善、皮膚保湿、皮膚抗菌、脱毛防止または毛髪成長促進用途のために多様に使用され得る。
以下、本発明を下記実施例により詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
<実験例1:細胞レベルでのメラニン総量の減少効果による美白効果>
メラニン生成阻害を通した美白効果を確認するために、Lotan R.外(Cancer Res.40:3345−3350、1980)に記載された方法によってマウスのメラノーマ細胞(B−16 mouse melanoma cell)の培養液に、抽出物を添加してメラニン総量を測定した。実験時に、まず、マウスのメラノーマ細胞に対して毒性を評価して、毒性のない濃度で美白評価を行った。陰性対照群としては、DMSOを、陽性対照群としては、アルブチン(arbutin)を使用した。
メラニン生成阻害を通した美白効果を確認するために、Lotan R.外(Cancer Res.40:3345−3350、1980)に記載された方法によってマウスのメラノーマ細胞(B−16 mouse melanoma cell)の培養液に、抽出物を添加してメラニン総量を測定した。実験時に、まず、マウスのメラノーマ細胞に対して毒性を評価して、毒性のない濃度で美白評価を行った。陰性対照群としては、DMSOを、陽性対照群としては、アルブチン(arbutin)を使用した。
具体的に、化学式1の最終濃度が1ppm、10ppm、100ppm、または500ppmになるように培地に添加し、Daidzeinも、最終濃度が1ppm、10ppm、100ppm、または500ppmになるように培地に添加した。 アルブチンは最終濃度が100ppmになるように培地に添加した。
上記各培地でメラノーマ細胞を3日間培養した。その後、細胞をトリプシン(trypsin)処理して、培養容器から脱離して遠心分離した後、メラニンを抽出した。脱離した細胞は、水酸化ナトリウム溶液(1N濃度)1mlを加えて10分間沸かしてメラニンを溶かし、分光光度計を利用して、400nmで吸光度を測定して、生成されたメラニンの量を測定した。
前記メラニン量は、単位細胞数当たり(1×106 cell)の吸光度で示す方法で測定し、陰性対照群に対する各実験群のメラニン生成量を相対値で計算し、陰性対照群のメラニン生成量100%から各実験群のメラニン生成量を差し引いた値を阻害率(%)で示した。その結果を下記表1に示し、実験は、それぞれ3回ずつ行って、平均値で示した。
前記表1から分かるように、葛花内他の含有成分であるダイゼイン(daidzein)に比べて化学式1で表されるカッカリドが、低濃度でも優れたメラニン減少効果を示して、皮膚美白用途に使用できることを確認した。
<実験例2:人体由来の線維芽細胞においてコラーゲンタイプI(type I collagen)合成促進効果>
試料をヒト由来線維芽細胞の培養液に添加して細胞レベルでコラーゲンタイプI合成促進効果を確認した。合成されたコラーゲンの測定は、PICP EIA kit(Procollagen Type I C−Peptide Enzyme Immuno Assay KIT)を利用して定量した。コラーゲン合成量を測定するために、各培地に化学式1の最終濃度が0.1ppm、1ppm、または10ppmになるように線維芽細胞の培養培地(DMEM培地)に添加し、Genisteinも、最終濃度が0.1ppm、1ppm、または10ppmになるように線維芽細胞の培養培地(DMEM培地)に添加した。上記各培地で48時間培養した後、培養液を取って、PICP EIAキットで各濃度でコラーゲンタイプI合成程度を分光光度計を利用して450nmで測定した。
試料をヒト由来線維芽細胞の培養液に添加して細胞レベルでコラーゲンタイプI合成促進効果を確認した。合成されたコラーゲンの測定は、PICP EIA kit(Procollagen Type I C−Peptide Enzyme Immuno Assay KIT)を利用して定量した。コラーゲン合成量を測定するために、各培地に化学式1の最終濃度が0.1ppm、1ppm、または10ppmになるように線維芽細胞の培養培地(DMEM培地)に添加し、Genisteinも、最終濃度が0.1ppm、1ppm、または10ppmになるように線維芽細胞の培養培地(DMEM培地)に添加した。上記各培地で48時間培養した後、培養液を取って、PICP EIAキットで各濃度でコラーゲンタイプI合成程度を分光光度計を利用して450nmで測定した。
効果の比較のために、試料を処理しない線維芽細胞の培養培地を陰性対照群とし、TGF−β10ng/mlを陽性対照群として添加した試料に対して同じ方法でコラーゲン合成程度を測定した。コラーゲン生成増加率は、陰性対照群に対する相対的なコラーゲン生成量の割合で計算し、結果を下記表2に示し、実験は、3回ずつ行って、平均値で示した。
前記表2から分かるように、葛花内他の含有成分であるゲニステイン(Genistein)に比べて化学式1で表されるカッカリドのコラーゲン合成効能がさらに優れていることを確認し、これにより、シワ改善用途に使用できることが分かる。
<実験例3:ヒト角質形成細胞でのHAS2、HAS3およびAQP3発現増加試験>
ヒト角質形成細胞(HaCaT)を6−well cell culture plateに各2×105ずつ分注して、10%ウシ胎児血清(fetal bovine serum)を含むDMEM培地で24時間培養した。培養された細胞に10%ウシ血清とカルシウム(Ca2+)が含まれていないDMEM培地に交替した後、化学式1を培地に希釈して24時間処理した。24時間経過後に細胞を回収して、冷却されたリン酸緩衝溶液(PBS)で洗浄し、RNeasy mini kit(Qiagen、Germany)を利用して全体RNAを抽出した。RNAをcDNA Synthesis Kit(PhileKorea、Korea)を利用して逆転写反応を行った。合成されたcDNAは、定量後に、水で希釈して、すべての反応に同一量を使用した。TaqMan(登録商標)Universal Master Mix IIとTaqMan(登録商標)Gene Expression Assays(Thermo Fisher、USA)HAS2、HAS3およびAQP3プライマーを使用した。StepOnePlus(登録商標)Real−time PCR System(Applied Biosystems、USA)を利用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(quantitative real time PCR)を行った。実験結果は、ハウスキーピング遺伝子(housekeeping gene)Glyceraldehyde−3−phosphate dehydrogenase(GAPDH)を基準としてΔΔCt方法で計算して示した。各試料のHAS2、HAS3およびAQP3遺伝子の発現程度は、試料を添加しない陰性対照群のmRNA発現量を1.0を基準として数値化し、その結果を下記表3に示した。陽性対照群としてEGF Recombinant Human Protein(Life Technologies、USA)10ng/mlを使用した。
ヒト角質形成細胞(HaCaT)を6−well cell culture plateに各2×105ずつ分注して、10%ウシ胎児血清(fetal bovine serum)を含むDMEM培地で24時間培養した。培養された細胞に10%ウシ血清とカルシウム(Ca2+)が含まれていないDMEM培地に交替した後、化学式1を培地に希釈して24時間処理した。24時間経過後に細胞を回収して、冷却されたリン酸緩衝溶液(PBS)で洗浄し、RNeasy mini kit(Qiagen、Germany)を利用して全体RNAを抽出した。RNAをcDNA Synthesis Kit(PhileKorea、Korea)を利用して逆転写反応を行った。合成されたcDNAは、定量後に、水で希釈して、すべての反応に同一量を使用した。TaqMan(登録商標)Universal Master Mix IIとTaqMan(登録商標)Gene Expression Assays(Thermo Fisher、USA)HAS2、HAS3およびAQP3プライマーを使用した。StepOnePlus(登録商標)Real−time PCR System(Applied Biosystems、USA)を利用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(quantitative real time PCR)を行った。実験結果は、ハウスキーピング遺伝子(housekeeping gene)Glyceraldehyde−3−phosphate dehydrogenase(GAPDH)を基準としてΔΔCt方法で計算して示した。各試料のHAS2、HAS3およびAQP3遺伝子の発現程度は、試料を添加しない陰性対照群のmRNA発現量を1.0を基準として数値化し、その結果を下記表3に示した。陽性対照群としてEGF Recombinant Human Protein(Life Technologies、USA)10ng/mlを使用した。
前記表3から分かるように、HAS2、HAS3およびAQP3発現が、対照群に比べてさらに高くて、ヒアルロン酸の合成を発現させる効果がさらに優れていることを確認した。
したがって、本発明の化学式1で表されるカッカリドを含む組成物は、皮膚保湿用途に使用できることが分かる。
<実験例4:抗微生物効果(抗フケ菌効果)>
実験方法および検査菌株[最小発育阻止濃度(Minimum Inhibitory Concentration、MIC)測定法]細菌−MHB2、真菌−PDB培地を適用してserial dilution法で実験を行った。各wellに106レベルの菌を接種し、一般細菌3種、真菌2種、ピチロスポルムオバーレを接種して培養した後、試料濃度別の菌体の成長程度を観察して菌の成長を阻止する最小濃度を判定した。
実験方法および検査菌株[最小発育阻止濃度(Minimum Inhibitory Concentration、MIC)測定法]細菌−MHB2、真菌−PDB培地を適用してserial dilution法で実験を行った。各wellに106レベルの菌を接種し、一般細菌3種、真菌2種、ピチロスポルムオバーレを接種して培養した後、試料濃度別の菌体の成長程度を観察して菌の成長を阻止する最小濃度を判定した。
前記表4から分かるように、フケ原因菌であるピチロスポルムオバーレ(Pityrosporum ovale)を対象に優れた抗微生物効果を示す亜鉛ピリチオン(陽性対照群)のように、化学式1も、優れた抗微生物効果を示すことを確認することができる。したがって、本発明の化学式1で表されるカッカリドを含む組成物を抗菌用途に使用できることが分かる。
<実験例5:抽出物のWnt/β−catenin signal pathway活性効果調査>
化学式1のWnt/β−catenin signal pathway活性化に及ぼす影響を調査するために、TOPflash reporter Kit(Millipore、米国)を利用した。ヒト毛乳頭細胞を24ウェルプレートに2×105/ウェルで接種し、24時間の間培養した後、化学式を10ug/mlになるように処理した後、15時間の間追加培養して、デュアルルシフェラーゼアッセイキット(Promega、米国)を使用してファイアフライルシフェラーゼ(firefly luciferase)活性を測定した。
化学式1のWnt/β−catenin signal pathway活性化に及ぼす影響を調査するために、TOPflash reporter Kit(Millipore、米国)を利用した。ヒト毛乳頭細胞を24ウェルプレートに2×105/ウェルで接種し、24時間の間培養した後、化学式を10ug/mlになるように処理した後、15時間の間追加培養して、デュアルルシフェラーゼアッセイキット(Promega、米国)を使用してファイアフライルシフェラーゼ(firefly luciferase)活性を測定した。
ルシフェラーゼ活性を正確に測定するために、それぞれの試料に対して3回実施し、対照群に対する相対的な活性を増加率(%)で計算し、下記表5に示した。対照群は、無処理群である。陽性対照群としては、6−bromoindirubin−3’−oxime(BIO)を使用し、Wnt信号伝達体系でGSK−3を抑制することが知られている物質である。
前記表5から分かるように、Wnt信号伝達経路(Wnt/β−catenin signal pathway)の活性は、対照群に比べて化学式1で表されるカッカリドにおいて効果が優れていることを確認でき、したがって、本発明の化学式1で表されるカッカリドを含む組成物を脱毛防止または毛髪成長促進用途に使用できることを確認することができた。
<実験例6:毛乳頭細胞増殖効果>
実験に下記(1)〜(3)の培地を使用し、
(1)DMEM(10% FBS、1%P/S)
(2)depletion media:5% charcoal stripped FBS containing phenol−red free DMEM media
(3)SF(serum free)media−DMEM(1%P/S)
0〜5日目の間に下記に示したそれぞれ異なる実験を進めて毛乳頭細胞増殖効果を確認した。
0日目:午前10時、seeding(5,000 cell/well)
1日目:午前10時、depletion media change後に、24h培養
2日目:午前10時、試料の処理前にCCK−8測定(初期値の平均:0.586)および試料処理
5日目:午前10時、CCK−8測定(対照群(Control)値の平均が0.556であり、細胞が死なずに、数が初期値を維持するものと判断される)
実験に下記(1)〜(3)の培地を使用し、
(1)DMEM(10% FBS、1%P/S)
(2)depletion media:5% charcoal stripped FBS containing phenol−red free DMEM media
(3)SF(serum free)media−DMEM(1%P/S)
0〜5日目の間に下記に示したそれぞれ異なる実験を進めて毛乳頭細胞増殖効果を確認した。
0日目:午前10時、seeding(5,000 cell/well)
1日目:午前10時、depletion media change後に、24h培養
2日目:午前10時、試料の処理前にCCK−8測定(初期値の平均:0.586)および試料処理
5日目:午前10時、CCK−8測定(対照群(Control)値の平均が0.556であり、細胞が死なずに、数が初期値を維持するものと判断される)
前記表6から分かるように、本発明の化学式1で表されるカッカリドは、対照群に比べて毛乳頭細胞が増殖することを確認することができた。
したがって、本発明の化学式1を含む組成物は、脱毛防止用途に使用できることを確認することができる。
Claims (20)
- 化粧水、エッセンス、ローション、クリーム、パック、ジェル、パウダー、ファンデーションまたは洗浄剤の剤形である、請求項1に記載の化粧料組成物。
- 化粧水、エッセンス、ローション、クリーム、パック、ジェル、パウダー、ファンデーションまたは洗浄剤の剤形である、請求項5に記載の化粧料組成物。
- 化粧水、エッセンス、ローション、クリーム、パック、ジェル、パウダー、ファンデーションまたは洗浄剤の剤形である、請求項9に記載の化粧料組成物。
- 化粧水、エッセンス、ローション、クリーム、パック、ジェル、パウダー、ファンデーションまたは洗浄剤の剤形である、請求項13に記載の化粧料組成物。
- 化粧水、エッセンス、ローション、クリーム、パック、ジェル、パウダー、ファンデーションまたは洗浄剤の剤形である、請求項17に記載の化粧料組成物。
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