JP2021152027A - ヘテロ環式化合物のバイオコンジュゲート - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、合衆国法典第35編(すなわち米国特許法)の第119条に基づいて、「Bioconjugates Of Heterocyclic Compounds(ヘテロ環式化合物のバイオコンジュゲート)」という表題の、2015年4月6日に出願された米国仮出願第62/143,790号の優先権を主張する。この仮出願はその全体が参照することにより本書に援用される。
式中、XおよびYが窒素を共有結合し得る多官能基リンカーであり、Zがトレーサー分子であり、Aが下記式の構造の縮合環系で、
式中、E、F、GおよびHが、C、N、O、SおよびPからなる群から独立して選択され、n=3-100であり、Bが酸素を1個有し、1個以上の水酸基を有する5員ヘテロ環であり、Cが、下記式の構造を有する原子団で、
式中、JがSおよびNからなる群から選択され、LがC1-C5のアルキル基であり、ただしJが硫黄であり、LがC1-C5アルキル基である場合、硫黄が正に荷電しており、m=0またが1であり、KがH、NH2、または下記式の構造を有する原子団で、
XおよびYが窒素を共有結合することができる多官能基リンカーであり、Zがトレーサー分子である。
したがって、本発明の目的は、感度が改善され、反応速度が増加された、均質系イムノアッセイ法に適したハプテン-ビオチンまたは他のトレーサーコンジュゲートを提供することである。
1.DMF/ジオキサン/水の2:2:1混合物に酸を溶解する。
2.3当量のジイソプロピルエチルアミンおよび1.3当量のTSTUを添加する。
3.-OSuエステルの形成が完了した後、1.5当量のアミンを加える。
4.反応が完了した後、溶媒を除去し、粗生成物を単離する。
上記化合物は、スキーム1に示される合成スキームを用いて合成される。
4-((((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(6-((E)-((Z)-7-((5-(5-((3aS,6R,6aR)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-6-イル)ペンタナミド)ペンチル)イミノ)ヘプチリデン)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル)(メチル)アミノ)ブタン酸
上記化合物は、スキーム2に示す合成スキームを用いて製造する。
(S)-4-((((2S,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル)チオ)-2-((E)-((Z)-7-((5-(5-(3aR,6S,6aS)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-6-イル)ペンチル)イミノ)ヘプチリデン)アミノ)ブタン酸
上記化合物は、スキーム3に示される合成スキームを用いて製造される。
4-((((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(6-(6-(5-((3aR,6S,6aS)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-6-イル)ペンタンアミド)ヘキサンアミド)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル)(メチル)アミノ)ブタン酸
上記化合物は、スキーム4に示される合成スキームを用いて製造される。
(S)-4-((((2S,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル)チオ)-2-(6-(5-((3aS,6R,6aR)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-6-イル)ペンタンアミド)ヘキサンアミド)ブタン酸
上記合成スキームを用いて上記化合物を製造する。
(2R)-4-((((2R,3R,4S,5S)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル)チオ)-2-(6-(((2R,3S,4S)-6-(((2R,3S,4S,6R)-6-(((2R,3S,4S,6R)-6-((3R,5R,9S,10S,12R,13S,14S,17R)-12,14-ジヒドロキシ-10,13-ジメチル-17-(5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-3-イル)ヘキサデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-4-ヒドロキシ-2-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-3-イル)オキシ)-4-ヒドロキシ-2-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-3-イル)オキシ)-4-ヒドロキシ-2-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-3-イル)オキシ)ヘキサンアミド)ブタン酸
500mgのBOC-アミノカプロン酸を100mlの三口フラスコに添加し、次いで1.5倍のTSTU、1滴のトリエチルアミンおよび10mlのDMFを添加した。反応が完了した6時間後、エーテルを加えて生成物を沈殿させた。得られた50mgの生成物および20mgのaza-SAMを3mlの無水DMFに溶解した。反応を、薄層クロマトグラフィー(TLC)Rf=0.5でモニターして、aza-SAMが完全に反応したかどうかを調べた。次いで、過剰のBOC-アミノカプロン酸を除去した後、生成物を分離し、3mlのDMFに溶解し、ジクロロメタンを含むトリフルオロ酢酸を滴下方式で添加した。ジエチルエーテルを加えて生成物を沈殿させた。BOCフラグメントを高次真空乾燥機で除去した。生成物をDMFに完全に溶解して透明な溶液を得た。グルタルアルデヒドDMFをゆっくりと滴加し、窒素下、25℃で数時間、次いで68℃で数時間撹拌しながら反応させた。TLCは、aza-SAM反応が完了したことを示した。減圧下での蒸留でDMFを除去し、淡黄色油状液体を得た。エーテルを加えて3回洗浄して白色固体を得、それを6mlの水で完全に溶解し、2mlのHRPを添加し、暗所下で、4℃で3日間反応させた。再びTLCを用いて反応をモニターし、いくつかの遊離aza-SAMの存在を示した。余分なazaSAMを、0.01mMのPBS(pH7.4)溶液中、4℃で透析(MW 2000)によって除去した。透析緩衝液を2日間で4回交換した。1mlの溶液に凍結乾燥し、0-4℃で保存した。
200mgのビオチンおよび296mgのTSTUを100mlの一口フラスコに加え、50mlの無水DMFを加えて溶解し、5mgのトリエチルアミンを加えて窒素下で反応させ、攪拌して30℃で3時間加熱した。次に、TLCヨウ素発色法でビオチン反応が完了したことを示した。4gのカダベリン(NH2(CH2)5NH2)のDMF溶液を加え、一晩攪拌した。翌日、D-ビオチン.セレンの量を測定することにより反応をモニターした。完了後、溶媒を減圧下で除去した。カラムクロマトグラフィーにより淡黄色固体が得られ、DMFを50ml加えて完全に溶解させた後、グルタルアルデヒドを5g加え、60℃に保ち反応溶液の色が濃くなった。ニンヒドリン測色によりアミノが反応を完了したことが示された。溶媒を減圧下で除去し、過剰のアルデヒドをジエチルエーテルで洗い流して茶色の固体生成物を得た。過剰量の上記生成物および90mgのaza-SAMをDMFに溶解して3日間反応させた。aza-SAMがその反応を完了するまで、絶えずビオチンカダベリンアルデヒドを補給した。反応完了後、溶媒の大部分を減圧下で除去し、ジエチルエーテルを添加して固体を沈殿させ、アセトンで洗浄し、水切りし、クロマトグラフィー精製して50mgの生成物を得た。
200mgのビオチンおよび296mのTSTUgを100mlの一口フラスコに加え、無水DMFを50ml加えて溶解し、トリエチルアミンを5mg加えて窒素下で反応させ、撹拌し、30℃で数時間加熱した。次に、TLCヨウ素発色法でビオチン反応が完了したことを示した。4gのカダベリン((NH2(CH2)5NH2=1,5-ジアミノペンタン)のDMF溶液を添加し、一晩攪拌し、D-ビオチン.Seの量を測定することにより反応をモニターした。完了後、溶媒を減圧下で除去した。カラムクロマトグラフィーで淡黄色固体が得られ、DMFを50ml加えて完全に溶解させた後、グルタルアルデヒドを5g加え、60℃に保ち、反応液の色が濃くなった。ニンヒドリン比色分析によりアミノが反応を完了したことが示された。溶媒を減圧下で除去し、過剰のアルデヒドをジエチルエーテルで洗い流して茶色の固体生成物を得た。過剰の前記生成物と75mgのSAHをDMFに溶解して3日間反応させた。SAHが反応を完了するまで、ビオチンカダベリンアルデヒドを絶えず補充した。反応完了後、溶媒の大部分を減圧下で除去し、ジエチルエーテルを添加して固体を沈殿させ、アセトンで洗浄し、水切りし、クロマトグラフィー精製して50mgの生成物を得た。
60mgのビオチンおよび45mgのTSTUを50mlの一口フラスコに加え、無水DMFを30ml加えて溶解し、窒素下で反応させ、数時間撹拌し、加熱した。次に、TLCヨウ素発色法でビオチン反応が完了したことを示した。DMF-アミノカプロン酸溶液を添加し、一晩攪拌した。翌日、D-ビオチンセレンの量を測定することにより反応をモニターした。完了後、溶媒を減圧下で除去した。酢酸エチルおよびメタノールで洗浄し、25mlの無水DMFおよびTSTUを加え、数時間攪拌した後、さらなる反応のために10mgのaza-SAMのDMF溶液を添加した。TLCがaza-SAM反応の完了を示されたとき、溶媒を除去し、ジエチルエーテル、アセトンおよび少量のメタノールで洗浄した。クロマトグラフィー分離および回転蒸発の後、粘着性固体物質が得られた。塩化水素ガスを含むメタノールを加えた後、エーテルを加え、白色固体を残し、0℃で保存した。
実施例4と同じ手順を用いて、上記コンジュゲートを調製する。
実施例4と同じ手順を用いて、上記コンジュゲートを調製する。
-ジゴキシンを6-ブロモカプロン酸を介してSAHのNH2に結合させる(Dig-6C-SAH)
Arthus BiosystemsのCat#IK00201、IK00201s、IK00202、IK00202s、IK00301、IK00301s、IK00302、IK00302sに使用される競合ELISA(cELISA)フォーマットのようなイムノアッセイにおいて、上記のバイオコンジュゲートの大部分は、(SAMまたはSAM類似体のバイオコンジュゲートの場合)SAM抗原と競合して特異的抗SAM抗体に結合し、(SAHバイオコンジュゲートの場合)SAH抗原と競合して特異的抗SAH抗体に結合することができることが検証されている。この結果は、バイオコンジュゲートがビオチンまたはジゴキシン(またはジゴキシゲニン)にコンジュゲートされる前と同様な小分子(SAM、SAM類似体、SAH)の抗原特性を保存することを示している。
96-ウェルマイクロタイタープレートにヤギ抗マウスIgGを1μg/mlでプレコートした。BSA(ウシ血清アルブミン)で適切にブロッキングした後、マウス抗SAM抗体クローン118-6および84-3の希釈系列(1mg/mlのストックから1:2000-1:64000)をプレートに添加した。125ng/ml、250ng/mlおよび500ng/mlの、異なる量のBio-12CN-aza-SAMをそれぞれSAM抗原と競合するために使用した。標準曲線に使用した遊離抗原投与量は、0-2000nMの範囲であった。結果を図3および図4に示す。使用したバイオコンジュゲートおよび抗体の量が異なると、わずかに異なる標準曲線が得られ、標準的に0-2μM以内で線形的に良好である。SAMを測定する際にどの条件がより良い感度、再現性および回収率をもたらすかを決定するために、さらなる試験を実施する必要がある。
ウサギ抗マウスIgG-XL665およびSA-ユーロピウム(Eu3+)クリプテートは、Cisbio Bioassaysから購入した。100mMのpH7.0のPB、プロテアーゼフリーの0.1%のBSA、100mMのKF、0.1%Tween 20を含む緩衝液の中に、下記成分を注意深く最適化する:Bio-12C-aza-SAM、SA-Eu3+クリプテート、マウス抗SAM抗体118-6、およびウサギ抗マウスIgG-XL665。競合HTRFアッセイにおいて、SAM標準は、0-2000nMの範囲で使用される。Optiplates-96マイクロプレートを用いて、100μl/ウェルの最終容量で試験を行う。すべてのアッセイ成分を合わせ、室温で1時間インキュベートする。HTRFアッセイのため、アッセイプレートをBMG LABTECH CLARIOstarマイクロプレートリーダーで読み取る。時間分解蛍光を、各励起パルスの後に50μsの遅延で測定される。665nmでFRET発光シグナル(Aカウント)を測定し、620nmでEu(K)発光シグナル(Bカウント)を測定する。Bカウントは、バックグラウンドの吸光度の内部コントロールおよびインジケータとして、すべてのアッセイウェルについて同じでなければならない。蛍光シグナルを同時に測定し、その比((Aカウント-10,000)/Bカウント)を報告する。この比は、665nmと620nmの両方の信号が同様に影響を受けるため、吸光度の影響を最小限に抑える。SAM標準品の比および濃度は、標準曲線をプロットするために使用される。サンプルからのSAMの量が多いほど、Aカウントが小さくなり、したがって比が低くなる。
100mM、pH7.0のPB,プロテアーゼなしの0.1%BSA、100mMのKF、0.1%Tween 20を含む緩衝液中の以下の成分:d2-6C-aza-SAM、ヤギ抗マウスIgG-Eu3+クリプテート、マウス抗SAM抗体84-3のそれぞれの用量を最適化する。競合HTRFアッセイにおいて、SAM標準品は、0-2000nMの範囲で使用される。Optiplates-96マイクロプレートを用いて100μl/ウェルの最終容量で試験を行う。すべてのアッセイ成分を合わせ、室温で1時間インキュベートする。HTRFアッセイのため、アッセイプレートをBMG LABTECH CLARIOstarマイクロプレートリーダーで読み取る。時間分解蛍光は、各励起パルスの後に50μsの遅延で測定される。665nmでFRET発光シグナル(Aカウント)を測定し、620nmでEu(K)発光シグナル(Bカウント)を測定する。Bカウントは、バックグラウンドの吸光度の内部コントロールおよびインジケータとして、すべてのアッセイウェルについて同じでなければならない。 蛍光シグナルを同時に測定し、その比((Aカウント-10,000)/Bカウント)を報告する。この比は、665nmと620nmの両方の信号が同様に影響を受けるため、吸光度の影響を最小限に抑える。SAM標準品の比および濃度は、標準曲線をプロットするために使用される。サンプルからのSAMの量が多いほど、Aカウントが小さくなり、したがってこの比が低くなる。
ウサギ抗マウスIgG-XL665およびユーロピウム(Eu3+)クリプテートは、Cisbio Bioassaysから購入した。マウス抗ジゴキシン又は抗ジゴキシゲニン抗体(抗Dig抗体,PerkinElmer)をEu3+クリプテートに標識する。100mMのpH7.0のPB、0.1%のプロテアーゼフリーBSA、100mMのKF、0.1%のTween 20を含む緩衝液の中に、下記成分を注意深く最適化する:Dig-6C-SAH、抗Dig抗体-Eu3+クリプテート、マウス抗SAH抗体301-3、およびウサギ抗マウスIgG-XL665。Optiplates-96マイクロプレートを用いて100μl/ウェルの最終容量で試験を行う。すべてのアッセイ成分を合わせ、室温で1時間インキュベートする。HTRFアッセイのため、アッセイプレートをBMG LABTECH CLARIOstarマイクロプレートリーダーで読み取る。時間分解蛍光は、各励起パルスの後に50μsの遅延で測定される。665nmでFRET発光シグナル(Aカウント)を測定し、620nmでEu(K)発光シグナル(Bカウント)を測定する。Bカウントは、バックグラウンドの吸光度の内部コントロールおよびインジケータとして、すべてのアッセイウェルについて同じでなければならない。蛍光シグナルを同時に測定し、その比((Aカウント-10,000)/ Bカウント)を報告する。この比は、665nmと620nmの両方の信号が同様に影響を受けるため、吸光度の影響を最小限に抑える。SAH標準品の比および濃度は、標準曲線をプロットするために使用される。サンプルからのSAHの量が多いほど、Aカウントが小さくなり、したがってこの比が低くなる。
生物複合体がd2-6C-aza-SAMの代わりにd2-12CN-SAHであることを除いて、実施例21と同様の手順を用いる。
マウス抗SAM抗体118-6を、蛍光抗体標識キット(Thermo-Fisher)を用いてAlexa Fluor 610-xにコンジュゲートさせた。100mMのpH7.0のPB、プロテアーゼフリーの0.1%のBSA、100mMのKF、0.1%のTween20を含む緩衝液で、バイオコンジュゲートのルシフェラーゼに対するモル比、マウス抗SAM抗体のAlexa Fluor 610-xに対するモル比、Luciferase-6C-aza-SAM(ドナーLuc-SAM)、マウス抗SAM抗体、及び試料または標準からの競合的SAMの作用濃度を最適化する。BRETアッセイでは、SAM標準物は、0-2000nMの範囲で試験される。Optiplates-96マイクロプレートを用いて100μl/ウェルの最終容量で試験を行う。上記の3つのアッセイ成分および基質ルシフェラーゼを合わせ、室温で15-30分間インキュベートする。アッセイプレートを、BRETアッセイ用のBMG LABTECH CLARIOstarマイクロプレートリーダーで読み取る。時間分解蛍光は、各励起パルスの後に50μsの遅延で測定される。630nmでBRETの発光シグナル、550nmでルシフェリンの発光シグナルを測定する。BRET指数(FL-Ab/Luc-SAM)の適切なモル比を求める。適切なLuc-SAM(モル比Luc:SAMを1:20)およびFL-Ab(モル比FL:Abを4-8:1)結合体で結合させた抗体の量は、BRET指数と直線関係にあり、BRET指数およびSAM標準の濃度を使用して標準曲線をプロットする。サンプルからのSAMが多いほど、BRET指数は低くなる。
バイオコンジュゲートがルシフェラーゼ-6C-aza-SAMの代わりにルシフェラーゼ-13CN-aza-SAMであることを除いて、実施例24と同様の手順を用いる。
バイオコンジュゲートがルシフェラーゼ-6C-aza-SAMの代わりにルシフェラーゼ-aza-SAMであることを除いて、実施例24と同様の手順を用いる。
バイオコンジュゲートがルシフェラーゼ-6C-aza-SAMの代わりにルシフェラーゼ-aza-SAMであること、及び、抗SAM抗体の代わりに抗SAH抗体、SAM標準の代わりにSAH標準を使用することを除いて、実施例24と同様の手順を用いる。
バイオコンジュゲートがルシフェラーゼ-6C-aza-SAMの代わりにルシフェラーゼ-6C-SAHであること、及び、抗SAM抗体の代わりに抗SAH抗体、SAM標準の代わりにSAH標準を使用することを除いて、実施例24と同様の手順を用いる。
バイオコンジュゲートがルシフェラーゼ-6C-aza-SAMの代わりにルシフェラーゼ-SAHであること、及び、抗SAM抗体の代わりに抗SAH抗体、SAM標準の代わりにSAH標準を使用することを除いて、実施例24と同様の手順を用いる。
Claims (13)
- 下記式を有する化合物で、
式中、XおよびYが窒素を共有結合し得る多官能基リンカーであり、Zがトレーサー分子であり、Aが、下記構造の縮合環系で、
式中、E、F、GおよびHが、C、N、O、SおよびPからなる群から独立して選択され、
n=3-100であり;
Bが1個の酸素を有し、1個以上のヒドロキシル基を有する5員ヘテロ環であり;Cが、下記構造式を有する部分であり、
式中、JがSおよびNからなる群から選択され、LがC1-C5アルキル基であり、ただしJが硫黄であり、LがC1-C5アルキル基である場合、硫黄が正に荷電しており、m=0または1であり、KがH、NH2、または、所望により下記構造の官能基であり、
式中、XおよびYが窒素を共有結合し得る多官能基リンカーであり、Zがトレーサー分子である、化合物。 - 以下からなる群から選択された化合物:
(2R)-4-((((2R,3R,4S,5S)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロ-フラン-2-イル)メチル)チオ)-2-(6-(((2R,3S,4S)-6-(((2R,3S,4S)-6-(((2R,3S,4S,6R)-6-((3R,5R,9S,10S,12R,13S,14S,17R)-12,14-ジヒドロキシ-10,13-ジメチル-17-(5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-3-イル)ヘキサデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル)-4-ヒドロキシ-2-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-3-イル)オキシ)-4-ヒドロキシ-2-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-3-イル)オキシ)-4-ヒドロキシ-2-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-3-イル)オキシ)ヘキサンアミド)ブタン酸,
(S)-4-((((2S,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル)チオ)-2-(6-(5-((3aS,6R,6aR)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-6-イル)ペンタンアミド)ヘキサンアミド)ブタン酸、
4-((((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(6-((E)-((Z)-7-((5-(5-((3aS,6R,6aR)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-6-イル)ペンタンアミド)ペンチル)イミノ)ヘプチリデン)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル)(メチル)アミノ)ブタン酸、
(S)-4-((((2S,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル)チオ)-2-((E)-((Z)-7-((5-(5-((3aR,6S,6aS)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-6-イル)ペンタンアミド)ペンチル)イミノ)ヘプチリデン)アミノ)ブタン酸、
4-((((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(6-(6-(5-((3aR,6S,6aS)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-6-イル)ペンタンアミド)ヘキサンアミド)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル)(メチル)アミノ)ブタン酸、
- 請求項1に記載の化合物を用いたイムノアッセイ。
- SAMまたはSAHを検出するための方法であって、以下のステップ:反応混合物中で、SAHまたはSAMを含む疑いのある試料を、SAMまたはSAHに結合する抗体または請求項1の式の化合物を含む標識コンジュゲートと混合するステップ;前記SAMまたはSAHおよび前記抗体を含む複合体の存在または非存在を検出するステップ;を含む、前記複合体の量または存在が前記試料中のSAMまたはSAHの存在を示す方法。
- 請求項7に記載の方法であって、
(a)以下の成分:
(i)SAM、SAM類似体またはSAHのバイオコンジュゲート;
(ii)(i)のバイオコンジュゲートの中のトレーサーと特異的に結合するリガンドを有する、ドナーとするユーロピウム、テルビウムクリプテートまたは他のフルオロフォア;
(iii)励起スペクトルがドナーの放出スペクトルと重複し、SAMまたはSAHの特異的な抗体で標識された、アクセプター蛍光色素
を準備するステップ;
(b)前記SAMまたはSAHを含む生物学的液体を添加するステップ;そして
(c)ドナーの蛍光およびアクセプターからの蛍光を分光測定するステップ;
を更に含む方法。 - 請求項7に記載の方法であって、さらに以下のステップ:
(a)以下の成分:
(i)SAMまたはSAHの特異的な抗体で標識された、ドナーとする、ユーロピウム、テルビウムクリプテートまたは他のフルオロフォア;
(ii)励起スペクトルがドナーの放出スペクトルと重複する蛍光色素を含む、SAM、SAM類似体またはSAHのバイオコンジュゲート;
を準備するステップ;
(b)前記SAMまたはSAHを含む生物学的液体を添加するステップ;そして
(c)ドナーの蛍光およびアクセプターからの蛍光を分光測定するステップ;
を含む方法。 - 請求項7に記載の方法であって、さらに以下のステップ:
(a)以下の成分:
(i)ルシフェラーゼに標識された、SAM、SAM類似体またはSAHのバイオコンジュゲート;
(ii)対応する基質またはルシフェリン;
(iii)SAMまたはSAHの特異的な抗体で標識されたアクセプター蛍光色素で、その励起スペクトルが、(i)とアクセプター色素の混合物への(ii)の添加による発光と重なり合う、アクセプター蛍光色素;
を準備するステップ;
(b)前記SAMまたはSAHを含む生物学的液体を添加するステップ;そして
(c)ドナーの蛍光およびアクセプターからの蛍光を分光測定するステップ;
を含む方法。 - アクセプター色素に結合した、請求項1に記載の化合物。
- ルシフェラーゼドナーに結合した、請求項1に記載の化合物。
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