JP2021143224A - タンパク質安定化剤およびタンパク質含有製剤 - Google Patents
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Abstract
Description
別の例として食品分野では、酵素を用いたデンプン等の分解や、パンの劣化防止などの技術が利用されているほか、酵素そのものを食品に配合することが行われている。
さらに酵素の別の応用例としては、洗浄力の増強を目的として、多糖分解酵素、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素などを、衣類用、コンタクトレンズ用等種々の洗浄剤等に配合することが広く行われている。
タンパク質の産業利用に当たっては、その保存安定性がしばしば問題になる。その理由として、タンパク質の機能発現には構成アミノ酸の配列だけではなくその立体配置までが重要になるため、タンパク質は一般的な化合物と比較して容易に変性失活しやすいという特徴を有することが挙げられる。特に、溶液に溶解されているタンパク質は乾燥状態のタンパク質と比較して安定性が低いことが知られている。
タンパク質が変性、失活する要因としては、例えば熱、凍結、光、pH、塩濃度、酸化、容器への非特異的吸着、タンパク質の自己凝集などが挙げられる。
タンパク質が溶解している溶液を安定化させる方法としては、ウシ血清アルブミン(以後、BSAと略称する)を該溶液に添加する方法が一般的に知られている。しかし、該方法によるタンパク質の安定化効果は十分ではない。さらに、狂牛病をはじめとした感染症リスク、天然物ゆえのロット間のバラツキ(低再現性)、長期保管時のBSAの凝集沈殿の発生、等々、安定化効果以外にも種々の問題が存在する。
BSAの代替として、特許文献1はアミノ酸エステルやポリアミンを、特許文献2はホスホリルコリン基を有する共重合体を、非特許文献1はアミノ酸を、非特許文献2はポリエチレングリコールを、含有するタンパク質含有溶液を開示している。
すなわち、本発明は以下の[1]〜[4]を要旨とするものである。
共重合体A:下記の式1で表される単量体a、及び下記の式2で表される単量体bを共重合して得られる共重合体であって、前記単量体a、単量体bの共重合割合がa:b=7:3〜9:1(モル比)であり、かつ重量平均分子量が400,000〜800,000である共重合体。
共重合体B:下記の式1で表される単量体a、及び下記の式2で表される単量体bを共重合して得られる共重合体であって、前記単量体a、単量体bの共重合割合がa:b=2:1〜8:1(モル比)であり、重量平均分子量が1,000,000〜1,500,000である共重合体。
(式1中、R1は水素原子、またはメチル基を表す。)
(式2中、R2は水素原子、またはメチル基を表し、R3は炭素数2〜6のアルキル基を表す。)
[2]前記[1]に記載のタンパク質安定化剤を含有する、タンパク質含有製剤。
[3]前記[1]に記載のタンパク質安定化剤を含有する、コンタクトレンズ用処理液。
[4]前記[1]に記載のタンパク質安定化剤を含有する、臨床検査試薬。
なお、本明細書において、「(メタ)アクリル酸」とは、「アクリル酸又はメタクリル酸」を意味し、他の類似用語についても同様である。
また、本明細書において、好ましい数値範囲(例えば、含有量や重量平均分子量の範囲)を段階的に記載した場合、各下限値及び上限値は、それぞれ独立して組み合わせることができる。例えば、「好ましくは10〜100、より好ましくは20〜90」という記載において、「好ましい下限値:10」と「より好ましい上限値:90」とを組み合わせて「10〜90」とすることができる。
本発明のタンパク質安定化剤は、以下の共重合体A及び共重合体Bを、A:B=40:1〜5:1(重量比)で含む。
共重合体A:下記の式1で表される単量体a、及び下記の式2で表される単量体bを共重合して得られる共重合体であって、前記単量体a、単量体bの共重合割合がa:b=7:3〜9:1(モル比)であり、かつ重量平均分子量が400,000〜800,000である共重合体。
共重合体B:下記の式1で表される単量体a、及び下記の式2で表される単量体bを共重合して得られる共重合体であって、前記単量体a、単量体bの共重合割合がa:b=2:1〜8:1(モル比)であり、重量平均分子量が1,000,000〜1,500,000である共重合体。
本発明の共重合体Aは、式1で表される単量体aと、式2で表される単量体bとの共重合体である。
式1で表される単量体aのR1は水素原子又はメチル基であり、原料入手性の観点からメチル基が好ましい。
式2で表される単量体bのR2は水素原子又はメチル基であり、共重合体の保存安定性の観点からメチル基が好ましい。
またR3は炭素数2〜6のアルキル基である。従って単量体bの具体例としては、(メタ)アクリル酸エチル、(メタ)アクリル酸プロピル、(メタ)アクリル酸ブチル、(メタ)アクリル酸ペンチル、(メタ)アクリル酸ヘキシル等を好ましく挙げることができる。特に、タンパク質を安定化する効果が高いため、単量体bは、式2においてR3が炭素数3〜5のアルキル基である単量体であることが好ましく、中でも(メタ)アクリル酸ブチルがより好ましく、メタクリル酸ブチルが特に好ましい。
なお、本発明の共重合体A及び後述する共重合体Bにおける単量体a、bの共重合割合とは、共重合体中の単量体a由来の構成単位(下記式3)と、単量体b由来の構成単位(下記式4)とのモル比を意味する。また前記共重合体割合は、通常、共重合体を重合する際の単量体a及び単量体bの仕込比に相当する。
なお、共重合体A及び後述する共重合体Bの重量平均分子量は、例えば、EcoSECシステム(東ソー株式会社製)を用いたGPC(ゲルろ過クロマトグラフィー)測定により、ポリエチレングリコール換算で求められる。
本発明の共重合体Bは、式1で表される単量体aと、式2で表される単量体bとの共重合体である。単量体a及びbの構造については、上記共重合体Aにおいて説明したとおりであり、R1、R2及びR3の好適な態様も同様である。ただし、重合に用いる単量体aの種類は、共重合体AとBとで同一であっても、異なっていてもよく、同様に、単量体bの種類は、共重合体AとBとで同一であっても、異なっていてもよい。
上記の単量体a、bの共重合割合は、共重合体A、共重合体Bで同一でも異なっていてもよい。
共重合体A及び共重合体Bの含有量の比(A:B)は、タンパク質安定化効果が良好になることから、A:B=40:1〜5:1(重量比)とすることが好ましく、A:B=35:1〜25:1(重量比)とすることがより好ましい。
本発明では、重量平均分子量がそれぞれ前述の領域となるように制御した2種の共重合体を前述の割合で用いることにより、それぞれを単独で用いた場合と比較して、相乗的に高いタンパク質安定化効果が得られる。この原理の全容は未だ解明されていないものの、共重合体A及び共重合体Bのポリマー分子が絡み合い、タンパク質の安定化に好適なマトリックスを形成しているためと想像される。
本発明における共重合体A、共重合体Bを得るための重合方法としては、溶液重合、塊状重合、乳化重合、懸濁重合等の公知の方法を用いることができ、例えば単量体aおよび単量体bを溶媒中で重合開始剤の存在下で重合させる、ラジカル重合などの方法を採用することができる。
本発明のタンパク質含有製剤は、上記したタンパク質安定化剤を含有する。具体的には、タンパク質含有製剤は、タンパク質を含有する溶液中にタンパク質安定化剤が溶解されているものである。タンパク質含有製剤に含有されるタンパク質は、タンパク質安定化剤によって安定化される。
本発明のタンパク質安定化剤によって安定化可能なタンパク質は特に限定されないが、免疫グロブリン、免疫グロブリン等の抗体、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素、上記各タンパク質の複合体等が挙げられる。
本発明のタンパク質安定化剤は、溶液中でタンパク質と共存することによって、タンパク質の失活を防止し、その活性を長期間維持する。好ましくは、本発明のタンパク質安定化剤が溶解した水溶液中にタンパク質を溶解させて保管する。
該水溶液中にはタンパク質と本発明のタンパク質安定化剤のみが溶解していてもよく、または、タンパク質安定化剤の効果を損なわない範囲で、後述するその他の成分が含まれていてもよい。
該溶液中において、本発明のタンパク質安定化剤の濃度は0.01〜5.0質量%が好ましい。タンパク質安定化効果が良好だからである。
なお、安定化させるタンパク質の水溶液中の好ましい濃度は、対象のタンパク質の種類、及び用途によって大きく異なるため、対象とするタンパク質に合わせてその好適な濃度とすればよい。
また、タンパク質の安定化に好適な温度は−30℃〜40℃であり、特に好ましくは0℃〜30℃である。すなわち、当該温度範囲内で、タンパク質と本発明のタンパク質安定化剤とを溶液中に共存させることにより、タンパク質を長期間安定に保管することができる。
界面活性剤としては例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミドエーテル硫酸塩、N−アシル−N−メチルタウリン酸塩、アルキルザルコシネート、アルキルアミドスルホコハク酸塩、アルキル硫酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩、N−アルキル−N,N−ジメチルオキシド等のアニオン性界面活性剤、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等のノニオン性界面活性剤、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、2−アルキル−N−カルボキシメチル−N−ヒドロキシエチルイミタゾリニウムベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン、アルキルアミノジ酢酸塩等の両性界面活性剤等が挙げられる。
これらの試薬類や化合物等としては例えば、ポリオール、ポリエーテル、安定化対象のタンパク質以外のタンパク質、有機塩類、無機塩類、緩衝液、その他の生化学試薬、防腐剤、増粘剤、有機溶剤等が挙げられる。
ポリエーテルとして例えば、ポリオキシエチレングリコール等が挙げられる。
タンパク質としては例えば、血清アルブミン、ゼラチン、ムチン、カゼイン等が挙げられる。
緩衝液としては例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、各種のグッド緩衝液、グリシン緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液等が挙げられる。
防腐剤としては例えば、アジ化ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、チメロザール、グルコン酸クロルヘキシジン、ポリヘキサメチレンビグアニド等が挙げられる。
増粘剤としては例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリオキシエチレンオキシド-ポリプロピレンオキシドブロック共重合体、無水マレイン酸-メチルビニルエーテル共重合体、(ジメチコン/ビニルジメチコン)クロスポリマー、アラビアガム等が挙げられる。
有機溶剤としては例えば、メタノール、エタノール、n−プロパノール、イソプロパノール、イソアミルアルコール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、グリセロール、フェノール等が挙げられる。
コンタクトレンズ用処理液は、上記したタンパク質安定化剤を含有するものであり、
具体的には、タンパク質を含有する溶液中にタンパク質安定化剤が溶解されているものである。コンタクトレンズ用処理液に含有されるタンパク質は、特に制限されないが、例えばコンタクトレンズの効果的な洗浄を可能とするタンパク質分解酵素などが挙げられる。本発明のコンタクトレンズ用処理液には、一般のコンタクトレンズ用処理液に使用される界面活性剤などの各種添加剤を適宜添加して使用してもよい。
実施例、及び比較例に用いる共重合体の合成のため、表1に示す3種の共重合体、すなわち、上記した共重合体Aである共重合体1、及び上記した共重合体Bである共重合体2、及び3を合成した。
2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(以下MPCと記載)19.4g、ブチルメタクリレート(以下BMAと記載)2.2g(モノマー組成モル比:MPC/BMA=8/2)を重合用ガラス製フラスコに秤量し、これに重合開始剤として2,2’−アゾビスイソブチロニトリル(以下AIBNと記載)86mg、及び重合溶媒として精製水39.2gとエタノール39.2gを加えた。反応容器内を十分に窒素置換した後、60℃で5時間加温することで重合反応を行った。得られた反応液を氷冷し、ジエチルエーテルに滴下することで重合体を沈殿させた。沈殿を濾別し、ジエチルエーテルで洗浄した後、真空乾燥して白色固体の共重合体1を得た。
得られた共重合体1の重量平均分子量は、GPC測定により、ポリエチレングリコール換算で600,000であった。
MPC21.5g、BMA2.9g(モノマー組成モル比:MPC/BMA=7/2)を重合用ガラス製フラスコに秤量し、これに重合開始剤として2,2’−アゾビスイソブチロニトリル(以下AIBNと記載)96mg、及び重合溶媒として精製水37.8gとエタノール37.8gを加えた。反応容器内を十分に窒素置換した後、50℃で7時間加温することで重合反応を行った。得られた反応液を氷冷し、ジエチルエーテルに滴下することで重合体を沈殿させた。沈殿を濾別し、ジエチルエーテルで洗浄した後、真空乾燥して白色固体の共重合体2を得た。
得られた共重合体2の重量平均分子量は、GPC測定により、ポリエチレングリコール換算で1,210,000であった。
MPC21.8g、BMA2.6g(モノマー組成モル比:MPC/BMA=8/2)を重合用ガラス製フラスコに秤量し、これに重合開始剤として2,2’−アゾビスイソブチロニトリル(以下AIBNと記載)96mg、及び重合溶媒として精製水39.3gとエタノール39.3gを加えた。反応容器内を十分に窒素置換した後、50℃で7時間加温することで重合反応を行った。得られた反応液を氷冷し、ジエチルエーテルに滴下することで重合体を沈殿させた。沈殿を濾別し、ジエチルエーテルで洗浄した後、真空乾燥して白色固体の共重合体3を得た。
得られた共重合体3の重量平均分子量は、GPC測定により、ポリエチレングリコール換算で1,240,000であった。
以上合成例1〜3の各共重合体のGPC測定は以下の条件で実施した。
GPCシステム:高速液体クロマトグラフィーシステムCCP&8020シリーズ(東ソー株式会社製)
カラム:Shodex OHpak SB−802.5HQ(昭和電工株式会社製)、及びSB−806HQ(昭和電工株式会社製)を直列に接続
展開溶媒:20mMりん酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)
検出器:示差屈折率検出器、UV検出器(波長210nm)
分子量標準:EasiVial PEG/PEO(Agilent Technologies社製)
流速:0.5mL/分
カラム温度:45℃
サンプル:得られた共重合体を終濃度0.1重量%となるよう展開溶媒で希釈
本発明の共重合体Aである共重合体1、共重合体Bである共重合体2、または3を用いて各実施例、比較例の各タンパク質安定化剤を調製し、これらの各タンパク質安定化剤を用いて各タンパク質含有製剤を調製し、下記の通り、タンパク質安定化効果の評価試験を実施した。
(実施例1−1〜1−4、比較例1−1〜1−4)
本発明の共重合体Aである共重合体1、共重合体Bである共重合体2、または3、及びその他成分を、表2に示す割合で配合してタンパク質含有製剤を調製し、これをプロテアーゼを含有する洗浄液モデルとした。ここで、実例1−1〜1−4における安定化対象タンパク質は当該プロテアーゼである。
この洗浄液モデルを温度40℃、湿度70%RH(強制劣化条件)のインキュベーター内で6ヶ月間保管し、保管直前(開始日)、及び各経過日のプロテアーゼ活性を後述の方法で測定し、下記数式(1)により酵素活性残存率(%)を算出し、また酵素活性残存率の経時変化を指数関数近似し、半減期を算出した。
(1)検体として、洗浄液モデルの一部をサンプリングし、トリス塩酸緩衝液(pH8.5、以下同様)で10倍希釈した。また空試験検体として超純水をトリス塩酸緩衝液で10倍希釈した。
(2)基質液として、Z−Ala−Ala−Leu−pNA(株式会社ペプチド研究所製)を終濃度0.5mg/mLとなるよう、ジメチルホルムアミド溶液に溶解した。
(3)反応停止液として、フェニルメチルスルホニルフルオリドを終濃度20mMとなるよう、エタノールに溶解した。
(4)試験管にトリス塩酸緩衝液2.5mL、基質液0.5mLを加えて37℃で5分間予備加温した。
(5)検体液0.1mLを加えて素早くボルテックスし、37℃で正確に15分間加熱した。
(6)反応停止液0.1mLを加えて素早くボルテックスした。
(7)410nmにおける吸光度を測定した。この値をASとする。
(8)空試験検体を用いて同様に、吸光度を測定した。この値をA0とする。
(9)AS−A0をプロテアーゼ活性値とした。
結果を表3に示す。
表3から明らかな様に、各実施例は各比較例に対し、タンパク質(プロテアーゼ)の安定化効果が顕著に優れていることが分かる。なお、酵素活性残存率が経日により若干増加した値を示す場合があるが、測定誤差であると思われる。
(実施例2−1〜2−3、比較例2−1〜2−3)
本発明の共重合体Aである共重合体1、共重合体Bである共重合体2、または3、及びその他成分を、表4に示す割合で配合してタンパク質含有製剤を調製し、これを酵素標識抗体を含有する臨床検査試薬モデルとした。ここで、実施例2−1〜2−2における安定化対象タンパク質は当該酵素標識抗体である。
この洗浄液モデルを温度25℃(室温条件)のインキュベーター内で16日間保管し、保管直前(開始日)、及び各経過日のペルオキシダーゼ活性を後述の方法で測定し、下記数式(2)により酵素活性残存率(%)を算出し、また酵素活性残存率の経時変化を指数関数近似し、半減期を算出した。
(1)検査試薬モデルから8μLをサンプリングし、96ウェルプレートに移した。
(2)3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン溶液(SeraCare社製、CAT NO.5120−0047)を100μL添加し、室温で正確に7分間反応させた。
(3)1Mの硫酸を50μL加え、反応を停止させた。
(4)マイクロプレートリーダー(SpectraMax M3、Molecular Device社製)を用いて波長450nmにおける吸光度を測定した。
(5)得られた吸光度測定値をペルオキシダーゼ活性値とした。
結果を表5に示す。
以上の実施例により、本発明により、界面活性剤を含有した溶液中でタンパク質を安定に保存するためのタンパク質安定化剤を提供できること、また該タンパク質安定化剤が溶解しているタンパク質含有製剤を提供できることが示された。
Claims (4)
- 以下の共重合体Aおよび共重合体Bを、A:B=40:1〜5:1(重量比)で含むことを特徴とするタンパク質安定化剤。
共重合体A:下記の式1で表される単量体a、及び下記の式2で表される単量体bを共重合して得られる共重合体であって、前記単量体a、単量体bの共重合割合がa:b=7:3〜9:1(モル比)であり、かつ重量平均分子量が400,000〜800,000である共重合体。
共重合体B:下記の式1で表される単量体a、及び下記の式2で表される単量体bを共重合して得られる共重合体であって、前記単量体a、単量体bの共重合割合がa:b=2:1〜8:1(モル比)であり、重量平均分子量が1,000,000〜1,500,000である共重合体。
(式1中、R1は水素原子、またはメチル基を表す。)
(式2中、R2は水素原子、またはメチル基を表し、R3は炭素数2〜6のアルキル基を表す。) - 請求項1に記載のタンパク質安定化剤を含有する、タンパク質含有製剤。
- 請求項1に記載のタンパク質安定化剤を含有する、コンタクトレンズ用処理液
。 - 請求項1に記載のタンパク質安定化剤を含有する、臨床検査試薬。
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