JP2021137015A - 治療用タンパク質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
酵素3−ケトステロイドレダクターゼはHSD17β7遺伝子によりコードされ、またコレステロールの生合成において3−ケトステロイドレダクターゼとして機能する(Marijanovic et al.,Mol Endocrinol.2003 Sep;17(9):1715−25)。NCBIリファレンスアミノ酸(NP_057455)及びmRNA配列(NM_016371.3)については図2(配列番号1)及び図3(配列番号2)をそれぞれ参照のこと。
グルタミンシンセターゼ遺伝子がコードする酵素グルタミンシンセターゼは、グルタメート及びアンモニアからのグルタミンの合成を触媒する(Eisenberg et al.,Biochimica et Biophysica Acta,2000,Vol 1477,122-145)。別の形でスプライスしたトランスクリプトバリアントがこの遺伝子について幾つか発見されている。NCBIリファレンスアミノ酸NP_002056.2及びmRNA配列NM_002065.6については図4(配列番号3)及びFIG.5(配列番号4)をそれぞれ参照のこと。
酵素DHFRはDHFR遺伝子によりコードされ、ジヒドロ葉酸をテトラヒドロ葉酸、プリンのデノボ合成に必要なメチル基シャトル、チミジル酸及び特定のアミノ酸に変換する。別の形でスプライスしたトランスクリプトバリアントがこの遺伝子について幾つか発見されている。NCBIレファレンスアミノ酸(NP_000782.1)及びmRNA配列(NM_000791.3)については図6(配列番号5)及び図7(配列番号6)をそれぞれ参照のこと。
抗生物質耐性遺伝子は、哺乳動物の細胞培養において一般的に使用されるポジティブ選択マーカーである(例えば、Antibody Expression and Production,Editor Mohamed Al−Rubeai,Springer Netherlands,Springer Science Business Media B.V.,ISBN 978−94−007−1256−0;Cell Line Development,Mohamed Al−Rubeai August 11,2009 Springer Science&Business Mediaを参照のこと)。抗生物質耐性遺伝子の例には、以下に限定するものではないが、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸に耐性を付与する遺伝子が含まれる。細胞選択における使用に適した抗生物質耐性遺伝子及び対応する阻害剤は当業者ならばわかる。
本発明の治療用タンパク質は宿主細胞から生産できる。宿主細胞とは、本明細書に記載のポリペプチド及びコンストラクトをその対応する核酸から発現させるのに必要な細胞成分、例えばオルガネラを含む媒体のことである。核酸は、当該分野で公知の慣用の技法(例えば、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈澱法、直接マイクロインジェクション、感染等)により宿主細胞に導入可能な核酸ベクターに含め得る。核酸ベクターの選択は、使用する宿主細胞に依存する部分がある。概して、好ましい宿主細胞は原核生物(例えば、細菌)又は真核生物(例えば、哺乳動物)由来である。
本発明の治療用タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、当該分野で公知の多様な方法で用意し得る。これらの方法には、以下に限定するものではないが、オリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)変異誘発及びPCR変異誘発が含まれる。本発明の治療用タンパク質をコードする核酸分子は標準的な技法、例えば遺伝子合成を用いて得られる。あるいは、野生型の治療用タンパク質をコードする核酸分子を、当該分野における標準的な技法、例えばQuikChange(商標)変異誘発を用いて特定のアミノ酸置換基を含むように変異させ得る。核酸分子は、ヌクオチドシンセサイザ又はPCR技法を用いて合成できる。
本発明の治療用タンパク質の生産に使用する宿主細胞は、当該分野で公知であり且つ選択した宿主細胞の培養に適した培地で増殖させ得る。哺乳動物宿主細胞に適した培地の例には、基礎培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、Expi293(商標)Expression Medium、ウシ胎仔血清(FBS)補充DMEM及びRPMI−1640が含まれる。細菌宿主細胞に適した培地の例には、選択剤、例えばアンピシリン等の必要なものを補充したルリアブロス(LB)が含まれる。宿主細胞を適切な温度、例えば約20〜約39℃、例えば25〜約37℃、好ましくは37℃、CO2レベル、例えば5〜10%(好ましくは8%)で培養する。培地のpHは通常、約6.8〜7.4、例えば7.0であり、主に宿主生物に依存する。誘導性プロモーターを本発明の発現ベクターで使用するならば、タンパク質の発現は、このプロモーターの活性化に適した条件下で誘導される。治療用タンパク質を生産するための慣用の細胞培養条件は当該分野で公知であり、例えばButler,Cell Culture and Upstream Processing,Taylor&Francis;1st edition(May 25,2007)を参照のこと。
本発明は、本明細書に記載の1種以上の治療用タンパク質を含む医薬組成物を特徴とする。治療有効量の治療用タンパク質に加えて、本発明の医薬組成物は1種以上の医薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含有し得て、これらは当業者に公知の方法で調合できる。
本明細書に記載の方法で作製し得る治療用タンパク質には、対象とする全ての組み換え治療用タンパク質又はそのバイオシミラーが含まれ、以下に限定するものではないが、抗体(例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体)、融合タンパク質(例えば、Fc融合)、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、組み換えタンパク質スキャフォールド、酵素、増殖因子、ホルモン、ホルモン放出因子、インターフェロン、インターロイキン及び血栓溶解剤が含まれる。治療用タンパク質には、グリコシル化(例えば、少なくとも1つのオリゴ糖鎖を有するタンパク質)及び非グリコシル化タンパク質の両方が含まれる。
以下の実施例により本発明について更に説明するが、実施例は限定であると解釈されるべきではない。本願を通して引用される全ての参考文献、特許及び公開済みの特許出願の内容は参照により本願に援用される。
以下の実施例では、治療用タンパク質、例えば抗体を製造する方法について説明し、この方法は対象である治療用タンパク質のコレステロール栄養要求性及びグルタミン栄養要求性細胞における発現を含む。望ましくも、この方法では、対象である遺伝子の増幅及びコピー数の増加、コレステロール(水溶液中では著しく不溶であり取扱いが極めて困難である)の不在下での生産が可能である。例示的な方法を更に図1で略説する。
以下の実施例では、十分な生存及び増殖を示す細胞の尺度としての細胞生存率を求めるためのトリパンブルーアッセイについて説明する。
生細胞の割合(%)=[1.00−(青色細胞数÷総細胞数)]×100
以下の実施例では、治療用タンパク質、例えば抗体を製造する方法について説明し、この方法は、対象である治療用タンパク質のコレステロール及びグルタミン栄養要求性細胞における発現を、追加の第3の選択メカニズム、例えばネオマイシン耐性遺伝子(例えば、選択にG418を使用)と共に含む。望ましくも、この方法では、対象である遺伝子の増幅及びコピー数の増加、コレステロール(水溶液中では著しく不溶であり取扱いが極めて困難である)の不在下での生産が可能であり、それでいて例えば低生産性を含めた、3−KSR細胞培養選択系に関わる予期せぬ製造上の難題を克服できる。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕治療用タンパク質の製造方法であって、
コレステロール栄養要求性でかつグルタミン栄養要求性の細胞を培養する工程、
前記細胞に、前記細胞におけるコレステロール生合成を回復させることができるタンパク質をコードする核酸(i)と、前記細胞におけるグルタミン生合成を回復させることができるタンパク質をコードする核酸(ii)と、治療用タンパク質をコードする核酸(iii)とをトランスフェクトする工程、
前記細胞を前記治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、
前記治療用タンパク質を単離及び/又は精製する工程、
を含むことを特徴とする方法。
〔2〕前記治療用タンパク質が、抗体である、前記〔1〕に記載の方法。
〔3〕前記トランスフェクション工程において、前記細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸(iii)をトランスフェクトする、前記〔1〕に記載の方法。
〔4〕核酸(i)が、3−ケトステロイドレダクターゼをコードする、前記〔1〕に記載の方法。
〔5〕核酸(ii)が、グルタミンシンセターゼをコードする、前記〔1〕に記載の方法。
〔6〕第1発現ベクターが、核酸(i)及び(iii)を含み、第2発現ベクターが、核酸(ii)を含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔7〕第1発現ベクターが、核酸(i)を含み、第2発現ベクターが、核酸(ii)及び(iii)を含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔8〕前記第1発現ベクターのトランスフェクションが、前記第2発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる、前記〔7〕に記載の方法。
〔9〕前記第1発現ベクターのトランスフェクションが、前記第2発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる、前記〔7〕に記載の方法。
〔10〕前記細胞を、外来的に導入したコレステロールの不在下で、例えば、核酸(i)のトランスフェクション後に培養する、前記〔1〕〜〔9〕のいずれか1項に記載の方法。
〔11〕前記細胞を、外来的に導入したグルタミンの不在下で、例えば、核酸(ii)のトランスフェクション後に培養する前記〔1〕〜〔10〕のいずれか1項に記載の方法。
〔12〕前記細胞を、グルタミンシンセターゼ阻害剤、例えば、メチオニンスルホキシイミンの存在下で、例えば、核酸(ii)のトランスフェクション中及び/又はトランスフェクション後に培養する、前記〔1〕に記載の方法。
〔13〕前記細胞を、3−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で、例えば、核酸(i)のトランスフェクションの間及び/又はトランスフェクションの後に、培養する、前記〔1〕に記載の方法。
〔14〕前記細胞が、NS0細胞である、前記〔1〕〜〔13〕のいずれか1項に記載の方法。
〔15〕前記タンパク質が、アダリムマブ、インフィリキシマブ、パリビズマブ、セツキシマブ、ナタリズマブ、エクリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オファツマブ、カナキヌマブ、ベリムマブ、アリロクマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、エボロクマブ、ブリナツモマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ブレンツキシマブ、イピリムマブ、デノスマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、アレファセプト、エンタネルセプト、アバタセプト、ベラタセプト、アフリベルセプト、ziv−アフリベルセプト、リロナセプト、ロミプロスチム、アポセプト、トレバナニブ、ブリシビモド及びデュラグルチドから成る群から選択される、前記〔1〕〜〔14〕のいずれか1項に記載の方法。
〔16〕治療用タンパク質の製造方法であって、
コレステロール栄養要求性細胞を培養する工程、
前記細胞に、前記細胞におけるコレステロール生合成を回復させることができるタンパク質をコードする核酸(i)と、1種以上の選択マーカーを発現するタンパク質をコードする核酸(ii)と、治療用タンパク質をコードする核酸(iii)とをトランスフェクトする工程、
前記細胞を前記治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、
前記治療用タンパク質を単離及び/又は精製する工程、
を含むことを特徴とする方法。
〔17〕前記治療用タンパク質が、抗体である、前記〔16〕に記載の方法。
〔18〕前記トランスフェクション工程において、前記細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸(iii)をトランスフェクトする、前記〔16〕に記載の方法。
〔19〕核酸(i)が、3−ケトステロイドレダクターゼをコードする、前記〔16〕に記載の方法。
〔20〕核酸(ii)が、グルタミンシンセターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)又は1種以上の抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸をコードする、前記〔16〕に記載の方法。
〔21〕第1発現ベクターが、核酸(i)及び(iii)を含み、第2発現ベクターが核酸(ii)を含む、前記〔16〕に記載の方法。
〔22〕第1発現ベクターが、核酸(i)を含み、第2発現ベクターが核酸(ii)及び(iii)を含む、前記〔16〕に記載の方法。
〔23〕前記第1発現ベクターのトランスフェクションが、前記第2発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる、前記〔22〕に記載の方法。
〔24〕前記第1発現ベクターのトランスフェクションが、前記第2発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる、前記〔22〕に記載の方法。
〔25〕前記細胞を、外来的に導入したコレステロールの不在下で、例えば、核酸(i)のトランスフェクション後に培養する、前記〔16〕に記載の方法。
〔26〕前記細胞を、外来的に導入したグルタミンの不在下で、例えば、核酸(ii)のトランスフェクション後に培養する、前記〔16〕に記載の方法。
〔27〕前記細胞を、3−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で、例えば、核酸(i)のトランスフェクションの間及び/又はトランスフェクションの後に培養する、前記〔16〕に記載の方法。
〔28〕前記細胞が、NS0細胞である、前記〔16〕に記載の方法。
〔29〕前記タンパク質が、アダリムマブ、インフィリキシマブ、パリビズマブ、セツキシマブ、ナタリズマブ、エクリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オファツマブ、カナキヌマブ、ベリムマブ、アリロクマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、エボロクマブ、ブリナツモマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ブレンツキシマブ、イピリムマブ、デノスマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、アレファセプト、エンタネルセプト、アバタセプト、ベラタセプト、アフリベルセプト、ziv−アフリベルセプト、リロナセプト、ロミプロスチム、アポセプト、トレバナニブ、ブリシビモド及びデュラグルチドから成る群から選択される、前記〔16〕に記載の方法。
〔30〕治療用タンパク質の製造方法であって、
コレステロール栄養要求性細胞を培養する工程、
前記細胞に、前記細胞におけるコレステロール生合成を回復させることができるタンパク質をコードする核酸(i)と、
第1選択マーカーを発現するタンパク質をコードする核酸(ii)と、
第2選択マーカーを発現するタンパク質をコードする核酸(iii)と、
治療用タンパク質をコードする核酸(iv)と、
をトランスフェクトする工程、
前記細胞を前記治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、
前記治療用タンパク質を単離及び/又は精製する工程、
を含むことを特徴とする方法。
〔31〕前記治療用タンパク質が、抗体である、前記〔30〕に記載の方法。
〔32〕前記トランスフェクション工程において、前記細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸(iv)をトランスフェクトする、前記〔30〕に記載の方法。
〔33〕核酸(i)が、3−ケトステロイドレダクターゼをコードする、前記〔30〕に記載の方法。
〔34〕核酸(ii)が、グルタミンシンセターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)又は1種以上の抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸をコードする、前記〔30〕に記載の方法。
〔35〕核酸(iii)が、グルタミンシンセターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)又は1種以上の抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸をコードする、前記〔30〕に記載の方法。
〔36〕前記細胞を、外来的に導入したコレステロールの不在下で、例えば、核酸(i)のトランスフェクション後で培養する、前記〔30〕に記載の方法。
〔37〕前記細胞を、外来的に導入したグルタミンの不在下で、例えば、核酸(ii)のトランスフェクション後で培養する、前記〔30〕に記載の方法。
〔38〕前記細胞を、3−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で、例えば、核酸(i)のトランスフェクション中及び/又はトランスフェクション後で培養する、前記〔30〕に記載の方法。
〔39〕前記細胞が、NS0細胞である、前記〔30〕に記載の方法。
〔40〕前記タンパク質が、アダリムマブ、インフィリキシマブ、パリビズマブ、セツキシマブ、ナタリズマブ、エクリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オファツマブ、カナキヌマブ、ベリムマブ、アリロクマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、エボロクマブ、ブリナツモマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ブレンツキシマブ、イピリムマブ、デノスマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、アレファセプト、エンタネルセプト、アバタセプト、ベラタセプト、アフリベルセプト、ziv−アフリベルセプト、リロナセプト、ロミプロスチム、アポセプト、トレバナニブ、ブリシビモド及びデュラグルチドから成る群から選択される、前記〔30〕に記載の方法。
〔41〕核酸(ii)が、グルタミンシンセターゼをコードし、核酸(iii)が、1種以上の抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸をコードする、前記〔30〕に記載の方法。
〔42〕核酸(ii)が、グルタミンシンセターゼをコードし、核酸(iii)が、ネオマイシン抗生物質耐性遺伝子をコードする、前記〔30〕に記載の方法。
Claims (42)
- 治療用タンパク質の製造方法であって、
コレステロール栄養要求性でかつグルタミン栄養要求性の細胞を培養する工程、
前記細胞に、前記細胞におけるコレステロール生合成を回復させることができるタンパク質をコードする核酸(i)と、前記細胞におけるグルタミン生合成を回復させることができるタンパク質をコードする核酸(ii)と、治療用タンパク質をコードする核酸(iii)とをトランスフェクトする工程、
前記細胞を前記治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、
前記治療用タンパク質を単離及び/又は精製する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記治療用タンパク質が、抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記トランスフェクション工程において、前記細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸(iii)をトランスフェクトする、請求項1に記載の方法。
- 核酸(i)が、3−ケトステロイドレダクターゼをコードする、請求項1に記載の方法。
- 核酸(ii)が、グルタミンシンセターゼをコードする、請求項1に記載の方法。
- 第1発現ベクターが、核酸(i)及び(iii)を含み、第2発現ベクターが、核酸(ii)を含む、請求項1に記載の方法。
- 第1発現ベクターが、核酸(i)を含み、第2発現ベクターが、核酸(ii)及び(iii)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1発現ベクターのトランスフェクションが、前記第2発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる、請求項7に記載の方法。
- 前記第1発現ベクターのトランスフェクションが、前記第2発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる、請求項7に記載の方法。
- 前記細胞を、外来的に導入したコレステロールの不在下で、例えば、核酸(i)のトランスフェクション後に培養する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞を、外来的に導入したグルタミンの不在下で、例えば、核酸(ii)のトランスフェクション後に培養する請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞を、グルタミンシンセターゼ阻害剤、例えば、メチオニンスルホキシイミンの存在下で、例えば、核酸(ii)のトランスフェクション中及び/又はトランスフェクション後に培養する、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞を、3−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で、例えば、核酸(i)のトランスフェクションの間及び/又はトランスフェクションの後に、培養する、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、NS0細胞である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、アダリムマブ、インフィリキシマブ、パリビズマブ、セツキシマブ、ナタリズマブ、エクリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オファツマブ、カナキヌマブ、ベリムマブ、アリロクマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、エボロクマブ、ブリナツモマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ブレンツキシマブ、イピリムマブ、デノスマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、アレファセプト、エンタネルセプト、アバタセプト、ベラタセプト、アフリベルセプト、ziv−アフリベルセプト、リロナセプト、ロミプロスチム、アポセプト、トレバナニブ、ブリシビモド及びデュラグルチドから成る群から選択される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 治療用タンパク質の製造方法であって、
コレステロール栄養要求性細胞を培養する工程、
前記細胞に、前記細胞におけるコレステロール生合成を回復させることができるタンパク質をコードする核酸(i)と、1種以上の選択マーカーを発現するタンパク質をコードする核酸(ii)と、治療用タンパク質をコードする核酸(iii)とをトランスフェクトする工程、
前記細胞を前記治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、
前記治療用タンパク質を単離及び/又は精製する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記治療用タンパク質が、抗体である、請求項16に記載の方法。
- 前記トランスフェクション工程において、前記細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸(iii)をトランスフェクトする、請求項16に記載の方法。
- 核酸(i)が、3−ケトステロイドレダクターゼをコードする、請求項16に記載の方法。
- 核酸(ii)が、グルタミンシンセターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)又は1種以上の抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸をコードする、請求項16に記載の方法。
- 第1発現ベクターが、核酸(i)及び(iii)を含み、第2発現ベクターが核酸(ii)を含む、請求項16に記載の方法。
- 第1発現ベクターが、核酸(i)を含み、第2発現ベクターが核酸(ii)及び(iii)を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記第1発現ベクターのトランスフェクションが、前記第2発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる、請求項22に記載の方法。
- 前記第1発現ベクターのトランスフェクションが、前記第2発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞を、外来的に導入したコレステロールの不在下で、例えば、核酸(i)のトランスフェクション後に培養する、請求項16に記載の方法。
- 前記細胞を、外来的に導入したグルタミンの不在下で、例えば、核酸(ii)のトランスフェクション後に培養する、請求項16に記載の方法。
- 前記細胞を、3−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で、例えば、核酸(i)のトランスフェクションの間及び/又はトランスフェクションの後に培養する、請求項16に記載の方法。
- 前記細胞が、NS0細胞である、請求項16に記載の方法。
- 前記タンパク質が、アダリムマブ、インフィリキシマブ、パリビズマブ、セツキシマブ、ナタリズマブ、エクリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オファツマブ、カナキヌマブ、ベリムマブ、アリロクマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、エボロクマブ、ブリナツモマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ブレンツキシマブ、イピリムマブ、デノスマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、アレファセプト、エンタネルセプト、アバタセプト、ベラタセプト、アフリベルセプト、ziv−アフリベルセプト、リロナセプト、ロミプロスチム、アポセプト、トレバナニブ、ブリシビモド及びデュラグルチドから成る群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 治療用タンパク質の製造方法であって、
コレステロール栄養要求性細胞を培養する工程、
前記細胞に、前記細胞におけるコレステロール生合成を回復させることができるタンパク質をコードする核酸(i)と、
第1選択マーカーを発現するタンパク質をコードする核酸(ii)と、
第2選択マーカーを発現するタンパク質をコードする核酸(iii)と、
治療用タンパク質をコードする核酸(iv)と、
をトランスフェクトする工程、
前記細胞を前記治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、
前記治療用タンパク質を単離及び/又は精製する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記治療用タンパク質が、抗体である、請求項30に記載の方法。
- 前記トランスフェクション工程において、前記細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸(iv)をトランスフェクトする、請求項30に記載の方法。
- 核酸(i)が、3−ケトステロイドレダクターゼをコードする、請求項30に記載の方法。
- 核酸(ii)が、グルタミンシンセターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)又は1種以上の抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸をコードする、請求項30に記載の方法。
- 核酸(iii)が、グルタミンシンセターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)又は1種以上の抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸をコードする、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞を、外来的に導入したコレステロールの不在下で、例えば、核酸(i)のトランスフェクション後で培養する、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞を、外来的に導入したグルタミンの不在下で、例えば、核酸(ii)のトランスフェクション後で培養する、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞を、3−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で、例えば、核酸(i)のトランスフェクション中及び/又はトランスフェクション後で培養する、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞が、NS0細胞である、請求項30に記載の方法。
- 前記タンパク質が、アダリムマブ、インフィリキシマブ、パリビズマブ、セツキシマブ、ナタリズマブ、エクリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オファツマブ、カナキヌマブ、ベリムマブ、アリロクマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、エボロクマブ、ブリナツモマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ブレンツキシマブ、イピリムマブ、デノスマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、アレファセプト、エンタネルセプト、アバタセプト、ベラタセプト、アフリベルセプト、ziv−アフリベルセプト、リロナセプト、ロミプロスチム、アポセプト、トレバナニブ、ブリシビモド及びデュラグルチドから成る群から選択される、請求項30に記載の方法。
- 核酸(ii)が、グルタミンシンセターゼをコードし、核酸(iii)が、1種以上の抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸をコードする、請求項30に記載の方法。
- 核酸(ii)が、グルタミンシンセターゼをコードし、核酸(iii)が、ネオマイシン抗生物質耐性遺伝子をコードする、請求項30に記載の方法。
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