JP2012510804A - 血小板の産生方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書において、用語「血小板」は、血餅形成を引き起こす一次止血の細胞機構に関与する細胞に由来する無核細胞質体を意味する。
γ=f(k)6Q/ab2
上式において、γはずり速度(s-1)、Qは流速(mL/s)、aはスリット幅(cm)、bはスリット高さ(cm)、f(k)は系の物理的パラメーターの関数である。例えば、Maastricht Instrumentation社のフローチャンバーを用いた場合((Legendre et al.、2006)に記載)、>100s-1のずり速度に対して、f(k)は1.03である。したがって、ずり速度は流速とチャンバーのスリット高さとを調節することによって調整することができる。
本発明は、成熟巨核球の懸濁液を、ヴォン・ヴィレブランド因子でコートされた固相(solid phase)上において、少なくとも600s-1のずり速度で流動させるステップを含む、生体外での血小板産生方法に関する。
他の目的では、本発明は前述の方法により得られる血小板に関する。
図1A、図1Bは、高ずり速度で流動させた場合における血小板前駆体形成阻害剤の影響、および接着性表面の定量化を示す図である。IMDMに懸濁した細胞をVWF上で1800s-1、10分間灌流し、その後、IMDMのみを10分間灌流した。接着により大きく細胞の形状が変化し、血小板前駆体が形成された。パネルA(図3A)は、未変形のMK(ステージ1)と比較した、血小板前駆体放出および血小板放出の前のずり条件下での2ステージのMK変形を示す。初期の変形は、細胞質の伸長を特徴とし(ステージ2)、ステージ3は、細胞極または細胞両端での細胞骨格の再編成を伴うMKの後期の変形(連続的な「数珠玉」状の長くて薄いフィラメント)を含み、その後、細胞が薄い領域に切断される。さらに流動させると、長い細胞質の糸とまだ結合している血小板、または一対の血小板および円形の血小板が産生された。パネルB(図3B)に定量化を示す。(a)MKの形状変化を、(1)移動しているMK、(2)球形を失った初期変形MK、(3)後期変形MKおよび血小板前駆体の伸長、(4)血小板前駆体の断片化および血小板の形成、の4つのカテゴリーに分類した。図1Bのパネルb〜fは10視野において測定された細胞総数に対する各カテゴリーの細胞の、還流時間に応じた分布である。阻害剤非存在下で、VWF上で灌流した臍帯血MK(図1Bのb)または骨髄MK(図1Bのc)の変形の分布。GPIb‐VWF相互作用阻害剤であるグリコカリシン遮断抗体(図1Bのd)、または抗VWF MoAb(図1Bのe)の存在下で、VWF上で灌流した臍帯血MKにより、MKのVWF上への接触および以降のステップが主に抑制されて、血小板前駆体の形成が消失することが示唆された。αIIbβ3のVWFとの相互作用を遮断するアブシキシマブ(Abciximab)は、血小板前駆体および血小板の形成を阻害した(図1Bのf)。15回の実験の代表を示す。バーは10μmを示す。
パネルA(図3A):血小板前駆体形成および血小板形成を示す、抗チューブリン抗体を用いた間接的免疫蛍光標識。VWFでコートされた表面上において、1800s-1のずり速度で流動させたMKを固定して、ファロイジン(左のパネル)および抗チューブリン抗体(右のパネル)で染色した。画像は共焦点顕微鏡で分析した。アクチンとチューブリンの共局在は見られない。
パネルB(図3B):血小板を分離中のMKは、血小板サイズの膨張した先端を有する長くて薄い血小板前駆体を伸ばしている。血小板前駆体のシャフト全体およびその末端は、チューブリンで標識されている。2つの離れた細胞断片は、ダンベル状の血小板前駆体の輪郭を描き中心が狭くなっているが、血小板サイズの断片は円形の標識パターンを示すという、特徴的なチューブリン標識を示す。
パネルC(図3C):血小板前駆体に対する微小管阻害剤の影響。血小板前駆体伸長の破たんは、チューブリンの崩壊によって特徴付けられる。
パネルB(図5B):HUVEC単層は刺激非存在下においてもMKの接着を支持したが(上のパネル)、血小板前駆体の形成はHUVEC活性化後に見られた(下のパネル)。
パネルC(図5C):フィブリノーゲン、フィブロネクチン、およびコラーゲンで示されるように、非VWF表面上でのMKの変形および血小板前駆体形成は、ずり条件において最小となった。
≪タンパク質≫
VWFは、フランス分留生物工学研究所(Laboratoire francais du fractionnement et des biotechnologies)(フランス、リール)からの贈与である。フィブリノーゲンは、Hyphen BioMed社(フランス、ヌーヴィル シュル オワーズ)から入手した。ヒトVWFおよびフィブリノーゲンは、精製し、それぞれ混入フィブロネクチンならびにフィブリノーゲンおよびVWFを除去した(Legendre et al.、2006)。ウマ腱コラーゲンは、Nycomed社(ドイツ、ミュンヘン)から入手し、ヒトフィブロネクチンはVWR社(フランス、フォントネー スー ボワ)から入手した。野生型組換えVWF(rVWF)および変異(V1316M 2B型)組換えVWFは、他に記載のようにして得た(Ajzenberg et al.、2000)。
リストセチン存在下でVWFのGPIbαへの結合を遮断するモノクローナル抗体(MoAb)713は、JP Grima博士(仏国立医学研究所(INSERM)ユニット770、フランス、ル クルムラン‐ビセートル)から善意で贈与されたものである(Ajzenberg et al.、2000)。VWF結合部位を含むGPIbα細胞外ドメインであるポリクローナル抗グリコカリシン抗体は、MC Berndt博士(モナッシュ大学、オーストラリア、メルボルン)からの善意で贈与されたものである(Cramer et al.、1991)。フィコエリトリン(PE)複合化抗CD62P(P‐セレクチン)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)複合化抗CD41a(αIIb)、抗CD42b(GPIbα)、および非免疫抗体は、Beckman Coulter社(フランス、ヴィルパント)から入手した。抗αチューブリンMoAbおよび抗βチューブリンMoAbは、Amersham社(フランス、オルセー)から入手した。抗β3インテグリンP37MoAbは、Gonzalez‐Rodriguez博士(CSIC、スペイン、マドリード)から贈与されたものである(Calvete et al.、1991)。抗αIIbβ3Fab(C7E3)アブシキシマブ(レオプロ(登録商標))は、Lilly社(フランス、シュレンヌ)から入手した。
本研究で使用されるヒトMKは、臍帯血または骨髄から単離した前駆細胞から培養した。ヒト骨髄試料(臀部の手術時に回収)、および臍帯血試料は、当研究所の倫理委員会(Institute Ethic Committee)(パリ国立大学病院(Assistance Publique des Hopitaux de
Paris))に従ったインフォームド・コンセントおよびヘルシンキ宣言に基づいて得た。ヒト臍帯血および骨髄のCD34+細胞は、前述の通り(Fichelson et al.、1999)、免疫磁気法(StemCell Technologies社、フランス、グルノーブル)により分離した。15%のBIT9500血清代替物(StemCell Technologies社)および20nmol/LのTPOペプチドアゴニストAF13948(Genosys‐Sigma社、フランス、サン カンタン ファラヴィエ)を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)(Gibco‐Invitrogen社、フランス、セルジー ポントワーズ)中で細胞を培養した。10ng/mLの幹細胞因子(SCF)(Amgen社、フランス、ヌイイ シュル セーヌ)を、培養の初日に一回添加した。TPO存在下で10〜16日間培養したMKは、完全に成熟しており血小板生合成に対応していた(Patel et al.、2005a)。細胞のGPIbおよびαIIbβ3の発現(60〜70%のポジティブ細胞)は、フローサイトメトリーにより示した。ずり実験のためには、細胞を10〜16日目で使用した。
事前の2週間薬物を摂取していない健康な個人から血液を得た。15%(v/v)のクエン酸デキストロース(ACD)(pH5.8)中に血液を採取した。アピラーゼ(1U/mL)(Sigma社)およびACD(40mLにつき1mL)の存在下で、単離した多血小板血漿(PRP)から洗浄血小板を調製した(Ajzenberg et al.、2000)。すなわち、洗浄後、0.15%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むHepes緩衝液(pH7.5)(Hepes(N‐[2‐ヒドロキシエチル]ピペラジン‐N’‐[エタンスルホン酸])(10mmol/L)、NaCl(136mmol/L)、KCl(2.7mmol/L)、およびMgCl2(2mmol/L))に血小板を懸濁した。血小板は、電子パーティクルカウンタ(モデルZ1、Coulter Electronics社、フランス、マルジャンシー)で測定し、1mLあたり1.5×108個の血小板の濃度に調整した。
野生型C57BL/6Jマウスは、6〜8週齢で使用した。動物の世話および手順は、研究所のガイドラインに従った。巨核球はフラッシュした骨髄から拡張および分離した。すなわち、免疫磁気的に分離したLin-細胞を、TPOペプチド存在下で適切な巨核球分化培地中で培養した。培養6日後、成熟巨核球を小型化フローチャンバーに導入し(Conant et al.、2009)、高ずり速度で、固定化マウス組換えVWF上で灌流した(Marx et al.、2008)。
灌流試験は、Maastricht Instrumentation社のすでに確立されたフローチャンバーを用いて実施した(Legendre et al.、2006)。フローチャンバーは、プレキシグラスブロックに彫られた、高さ0.05mm、長さ29mm、幅5mmの矩形の空洞からなる。チャンバーの底面には、トリス緩衝生理食塩水(TBS)(Tris‐HCl(25mmol/L、pH7.4)、NaCl(150mmol/L))中に希釈されたVWF(20μg/mL)で4℃で一晩コートしたカバースリップを敷いた。一部の実験では、その他の精製タンパク質(フィブロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲン、または2B型‐rVWF)を試験した。IMDM(2mL)に0.8〜1×106細胞/mLで懸濁したMKを、エクステンションセット(Steritex、Codan社、ドイツ、レンスアーン)を有するチャンバーに接続した5mLガラス気密性マイクロシリンジ(Examine、伊藤製作所、日本、富士)中に吸引した。1800s-1のずり速度を生じる225μL/分のフロー速度を電気ポンプで負荷した。細胞を10分間灌流した後、同じずり速度でIMDMで10分間灌流した。すべての実験は、Minitub加熱システム(Minitub Abfull und Labortechnik社、ドイツ、ティーフェンバッハ)を用いて維持した37℃において行った。一部の実験では、灌流前に10分間、細胞またはカバースリップを抗体とともに予備インキュベーションを行った。灌流完了後、カバースリップを氷冷メタノールで5分間固定し、滅菌水で洗浄して乾燥し、染色した。トロンビン活性化を含む追加試験のため、チェンバー出口で溶出液を回収した。
灌流チャンバーを倒立顕微鏡(Axiovert 135、Zeiss社、ドイツ)のステージに設置した。CCDカメラ(ソニー、日本、東京)を使用して、20倍ホフマンモジュレーションコントラスト対物レンズを用いて細胞を可視化した。ビデオタイマー(VTG、日本、東京)に接続したデジタル画像レコーダー(Replay Software、Microvision Instruments社、フランス)を用いて連続記録を行った。画像フレームは、HistolabまたはVideomet定量化ソフトウエア(Microvision Instruments社)を用いて分析した。
溶出細胞懸濁液を回収し、EDTA(0.5mmol/L)存在下において、1800rpmで12分間遠心分離し、ペレットをIMDMに再懸濁した。一定分量をトロンビン非存在下またはトロンビン存在下(5U/mL)において、37℃で10分間インキュベートした。FITC‐抗CD62PおよびPE‐抗CD41a(それぞれ5μL)、または非免疫複合化コントロール抗体とともに懸濁細胞(100μL)を室温で20分間インキュベートした後、300μLのPBSを添加した。その後、細胞をFACSortフローサイトメーター(Becton‐Dickinson社、ル・ポン ド クレ)を用いて、未刺激の洗浄血小板を用いた別の実験で決定した直角散乱光(SSC)と前方散乱光(FSC)のプロットに関する特徴的なプロファイルにより同定された血小板領域に対する設定で10000事象を獲得して分析した。
未活性化細胞およびトロンビン活性化細胞の一定分量(150μL)を、静置条件で30分間インキュベートしたフィブリノーゲンコートガラスLab‐Tekチャンバースライド(Nunc社、ニューヨーク州、ロチェスター)に添加した。未接着細胞を除去し、スライドをPBSで三回洗浄した後、PBS中の2%パラフォルムアルデヒド(Carlo Erba社、フランス、ヴァル ド ルイユ)で30分間固定し、4℃で保存した。免疫蛍光染色のために、PBS中の0.1%Triton X‐100で5分間細胞を透過処理し、その後、抗β3 P37 MoAb(PBS中に10μg/mL)とともに30分間インキュベートし、洗浄して、AlexaFluor 488(Molecular Probes社、オレゴン州、ユージーン)と複合化した20μg/mLの二次抗体とともにインキュベートした。ネガティブコントロールには、マウス腹水から精製したIgGを同じタンパク質濃度で用いた。アクチン染色のために、透過処理した細胞を、3%BSAを含むPBS中の50μLのAlexaFluor 546 ファロイジン(30nmol/L)(Molecular Probes社)とともに室温で30分間インキュベートした。その後、カバースリップを二回洗浄し、TOTO3およびVectashield(Vector Laboratories社、英国、ピーターバラ)を含むマウント溶液中にマウントした。AlexaFluor488/AlexaFluor546染色は、Leica社のTCS SP2 AOBS共焦点顕微鏡で分析した。
溶出細胞懸濁液を、種々のマトリックスを通過させた後、灌流チャンバーの出口でグルタルアルデヒド固定液(リン酸緩衝液中(pH7.4)に最終濃度1.5%)中に直接回収し、その後、前述の通りに電子顕微鏡用に処理した(Cramer et al.、1997)。一部の試料は前述のように最初にトロンビンで活性化し、さらに電子顕微鏡用に処理した。Jeol 10‐11(日本電子株式会社、日本、東京)電子顕微鏡で検査を行った。
統計解析には、スチューデントt検定を用い、0.05未満のP値を有意と見なした。エラーバーは、標準誤差(SEM)を示す。
≪MKとVWFとの動的相互作用≫
臍帯血成熟MKは、精製VWFでコートした表面を様々なずり速度で灌流した。1800s-1で、MKはVWFと一過的に相互作用を確立し、VWF上を回転するMKの速度が低下し、最終的にMKから血小板を分離させる顕著な形態変化を次第に引き起こす。血小板形成の種々のステップを図1Aに示す。このプロセスは、おおよそ球状のMKから始まり、その後、細胞周辺部が変形し、接着MK上に偽足が出現する(ステージ2)。その後、細胞体の後方および/または前方で、流動方向に沿って構築された細胞質の伸長が起こる(ステージ3)。特徴的な数珠玉状の外観を有する中間的な膨張が現れ始める。21μm/分の速度(静置条件で報告されている(Patel et al.、2005b)25倍の速さ)で、急速に伸長が起こった。興味深いことに、これら伸長部の先端だけではなく膨張部の間、特に薄い狭窄部においても断片化が起き、種々の大きさの断片が放出され、ほとんどの場合、それぞれの数珠玉は互いに繋がったままであるが主要な細胞体を欠いていた(図1A)。最終的に、これらの断片は、血小板の大きさである、より小さな粒子にさらに分解され、後期時点において明確に視認された(図1A)。高ずり速度条件下では、15〜20分以内に血小板前駆体の断片化が急速に起こった。臍帯血由来MKまた骨髄由来MKを用いて、同様の結果が得られた。対照的に、流動の無い状態または低いずり速度(1000s-1未満)で流動させた状態は、MKがVWFと接触している20分間において、血小板前駆体および血小板の放出は見られなかった。9日以下培養した未成熟MKをずり速度にさらしても、移動および断片化しなかった。
ずり速度にさらされる間の形態変化を定量化するため、4つの細胞カテゴリー、すなわち、(1)移動MK、(2)球形を失った初期の変形MK、(3)血小板前駆体を伸長している後期の変形MK、および(4)血小板前駆体の断片化および血小板の放出を定義した。(図1B、パネルa)。伸長細胞ならびに血小板前駆体および血小板の集団が徐々に増え、20分で27.6±4.9%の細胞に達した。この増加は、移動細胞が5分で28.2±6.5%から20分で3.6±1.6%に減少し、初期の変形MKが減少したことを反映していた(図1B、パネルb)。高ずり速度にさらされた骨髄MKの分布を計測すると、臍帯血MKで記載された結果と同様の結果が得られた(図1B、パネルc)。MKの移動および血小板前駆体形成と血小板の放出とを含むその後のステップは、グリコカリシンに対する抗体またはVWFのGPIb結合ドメインに対する抗体の存在下で完全に消失し(図1B、パネルdおよびパネルe)、VWFとGPIbとの相互作用の重大な重要性が実証された。αIIbβ3阻害剤であるアブシキシマブの存在下では、血小板前駆体以外の細胞集団(未変形MKおよび初期の変形MK)は時間に対して一定のままであったが、血小板前駆体の伸長が大きく減少して血小板形成がほぼ完全に消失した(図1B、パネルf)。この非効率的な血小板前駆体形成は、VWF表面との緩い接触によるものであった(未掲載データ)。
成熟MKに付与されたずり応力により、VWF上で細胞を20分間静置条件でインキュベートしたコントロールと比較して特異的な形態変化が誘導されたが、MKの形態はVWFと接触する以前の細胞の形態に対しては変化しないままであった(図2)。対照的に、MKの灌流の20分後に予備固定して染色したVWFコートカバースリップでは、MKがその先端部に長い糸状仮足を伸ばして、シャフトに沿って数珠玉状の血小板様スパイク、およびより大きな細胞質断片が形成されることが示された(図2)。血小板前駆体の伸長には、α1チューブリンおよびβ1チューブリンで染色される重複微小管がスライドすることが必要とされる(Patel et al.、2005b)。発明者らはMKの伸長部が、アクチンと異なった領域において抗チューブリン抗体により染色されることを見出しており、これらの伸長部が、Italianoらの研究(Italiano et al、2003;Italiano et al.、1999;Patel et al.、2005a;Patel et al.、2005b)により血小板前駆体形成MKにおいて確認されたものと同様の染色を示すことが確認された。すなわち、チューブリン標識は、伸長したMKでは血小板前駆体のシャフトに沿っており、球状のMK、血小板前駆体、および血小板ではリング状のパターンを示した(図3B)。ずり惹起血小板前駆体形成における微小管の重要性は、微小管集合の阻害剤であり流動条件においてMKの伸長および血小板前駆体形成を完全に阻害するノコダゾールとの予備インキュベーションにより確認された(未掲載データ)。ノコダゾールが細胞懸濁液中にあらかじめ形成された血小板に対して作用しないことを実証するため、伸長後に微小管阻害剤を添加した。すなわち、リアルタイムで可視化された効果により、プロセスが起きた後にノコダゾールを添加した場合、ノコダゾールはずり惹起伸長を戻すことができることが示された。逆戻りの特異性は、チューブリン染色により確認された。興味深いことに、25分でノコダゾールを添加した後、血小板前駆体および血小板においてチューブリンがもはや構築されないことが確認され、伸長プロセスはテザーとは異なることが示唆された(図3C)。実際、膜テザーは、流動の影響下において小さく局在化した接着接触部から伸びる動的な構造であり、VWFとGPIbとの相互作用により誘導されるものであるが、チューブリン染色を示さない(Dopheide et al.、2002)。
接着性タンパク質が血小板前駆体形成の制御、具体的には静置条件でMKをVWF上にプレーティングした16時間後に起こる血小板前駆体形成に関与していることが近年実証された(Balduini et al.、2008)。図5Aに示すように、同様の結果が得られた。対照的に、高ずり速度存在下では、20分以内に、70%の臍帯血MKおよび80%の骨髄MKが血小板前駆体を形成しており、このプロセスが非常に迅速に起こった。この効果は、ずり速度の程度(600〜2400s-1)と細胞濃度(0.5〜2×106/mL)とに依存していた。内皮細胞は、低い割合で絶えず放出され炎症状態で増加する高分子量のVWF多量体を含んでいる(Rondaij et al.、2006)。したがって、内皮細胞マトリックスから放出されるVWFがMKの接着と血小板前駆体形成とを支持するかについて評価した。MKは未刺激HUVEC上を回転して接着したが、血小板前駆体形成は刺激したHUVEC上で起こった(図5B)。血小板形成は、内皮細胞の下にありこれら内皮細胞が除去された際に存在する内皮細胞マトリックス上でも起きた。さらに、変異型の2B型rVWFでコートされた表面上で灌流したMKからの血小板前駆体形成について試験した。明確に定義された突然変異であり、軽度の血小板減少症と巨大血小板とを示し血小板GPIbへのVWFの結合が促進されることを特徴とするV1316M置換を選択した(Ajzenberg et al.、2000;Miura et al.、2000)。2B型rVWF上でのMK移動の平均速度(4.6±0.3μm/s)が、野生型(wt)rVWFの移動の平均速度(33.6±2.5μm/s、p<0.0001)より非常に低いことが分かった。高ずり速度にさらされたMKによる血小板形成のすべてのステップが、2B‐rVWFにおいてwt‐rVWFより遅く、血小板産生が減少し血小板前駆体の蓄積が増大した(未掲載データ)。最終的に、血小板前駆体形成の制御における接着性表面の特異性をさらに立証するため、高ずり速度において、フィブリノーゲン、コラーゲン、またはフィブロネクチン上で灌流したMKによる血小板前駆体形成の程度について調べた。これらの表面においては、血小板前駆体は形成されず、唯一の変化はフィブリノーゲン上での軽度の初期のMK変形であった(図5C)。
αIIbβ3インテグリンを介した血小板のフィブリノーゲンへの接着は活性化なしで起こり、トロンビンによるこの受容体の活性化により強化される。MKに剪断力を与えることにより産生した血小板が、構造的および機能的に血液血小板と同様であることを確認するため、フロースルー中で回収した細胞を、フィブリノーゲンへの静置接着アッセイ(Mazharian et al.、2007)で単離血液血小板と比較した。トロンビン非存在下で細胞はフィブリノーゲンとしっかりと接着し、ずり惹起血小板および血小板前駆体においてαIIbβ3が機能的であることが実証された。非活性化成分は、アクチンの拡散した染色およびαIIbβ3の膜への局在化を示した。トロンビンによる活性化により、有核成分と無核成分の両方においてアクチンフィラメントが再構築され、葉状仮足および糸状仮足の形成が示され、インテグリン膜が染色された(図6)。MKに剪断力を与えることにより産生したこれらMK由来血小板は、別のアッセイでずり速度にさらさないで調製した洗浄血液血小板と同様の細胞骨格構成を示した(図6)。
マウス成熟巨核球に対し、マウスVWF上で高ずり速度の剪断力を与えると、効率的に血小板が形成された。一連の実験において、6〜8匹の動物から骨髄由来細胞を抽出することにより、少なくとも6〜8×106個の成熟巨核球が産生された。これらの細胞を1800s-1のずり速度に90分間さらし、血小板サイズに相当する小さな成分に完全に変換した。マウス血小板を共焦点免疫蛍光法により特徴づけることにより、血小板サイズの成分における特異的なチューブリンのリングが明らかになった。これら血小板のアゴニストに応答した凝集特性は、血小板凝集計で標準手法により証明される。
この実験は、上述のように高ずり応力により産生されたドナーマウスの血小板を注入することにより、血小板減少レシピエントマウスの出血表現型をレスキューすることを目的とする。
結論として、流動状態での成熟MKのVWFとの相互作用がヒト/マウス血小板前駆体形成を促進するという発見により、毛細血管や細動脈で起こっているうであろう血小板形成の理解において大きな進展が示された。血小板産生が減少した疾患の探索は、巨核球からの血小板分離をさらに理解する上で大いに役に立つであろう。最後に、発明者らの結果により、診断目的または治療目的ための血小板産生方法が提供される。
Claims (8)
- ヴォン・ヴィレブランド因子(VWF)でコートされた固相上において、或いは、GPIbと結合するVWF断片、その変異体またはその類似体でコートされた固相上において、少なくとも600s-1のずり速度で成熟巨核球懸濁液を流動させるステップを含む、生体外での血小板産生方法。
- 前記VWF断片、その変異体またはその類似体が、VWFの52/48kDaトリプシン断片、黄色ブドウ球菌V‐8プロテアーゼ消化VWF、治療用途のVWF濃縮物、および2N型ヴォン・ヴィレブランド病の原因であるVWF変異体からなる群から選択される、請求項1に記載の血小板産生方法。
- 請求項1または請求項2の血小板産生方法により得られる血小板。
- 治療に使用される、請求項3に記載の血小板。
- 血小板数減少性疾患の治療に使用される、請求項3または4に記載の血小板。
- 前記血小板数減少性疾患が、自己免疫性血小板減少症、産生低下と関連した血小板減少症、および破壊増加と関連した血小板減少症からなる群から選択される、請求項5に記載の血小板。
- 血小板機能を標準化するために請求項3に記載の血小板を使用するステップを含む、血小板疾患の診断方法。
- VWFでコートされた固相、あるいはGPIbと結合するVWF断片または変異体もしくは類似体でコートされた固相を含むフローチャンバーを含む、血小板産生装置。
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