JP2021092534A - 抗老化成分のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】皮膚組織中のＧＬＵＴ１の発現量を指標とする、抗老化成分のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】皮膚組織における、ＧＬＵＴ１の発現量を指標として、抗老化成分をスクリーニングする、スクリーニング方法。【選択図】 なし

Description

本発明は、抗老化成分のスクリーニング方法に関する。

肌の老化に関連する物質として、アドバンスド・グリケーション・エンドプロダクツ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ ： 以下、ＡＧＥｓと略すこともある）が知られている。
これは、皮膚組織内に存在するタンパク質や脂質が糖と結びつく糖化によって産生される物質であり、ＡＧＥｓが皮膚組織中で増加すると、肌のくすみが発生したり、肌が硬化したりすることが知られている（例えば、非特許文献１、２）。

一方、皮膚組織中に存在するコラーゲンは、真皮層細胞において産生されるが、その産生量は、加齢と共に減少することも、知られている（例えば、非特許文献３）。

ところで、インボルクリンは、表皮のうち角層を形成する角質細胞に存在するタンパク質であり、コーニファイドエンベロープを形成するタンパク質の１つである。コーニファイドエンベロープは、角層の物理的あるいは化学的な強靭性に寄与していることから、体内（特に、皮膚組織）におけるインボルクリンの発現量を維持することが重要である（例えば、非特許文献４）。

また、オクルーディンは、タイトジャンクションを形成するタンパク質の１つである。タイトジャンクションは、上皮細胞の結合に寄与し、分子の細胞間での移動を制御するものであるから、体内におけるオクルーディンの発現量を維持することが重要である（例えば、非特許文献５）。

Ｈ Ｏｈｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｋｉｎ Ｒｅｓ． ａｎｄ Ｔｅｃｈ．， （２００９）， １５： ４９６−５０２ Ｇｏｍｉ ｅｔ ａｌ．， ＩＦＳＣＣ２０１０， Ｐｏｓｔｅｒ Ｊａｍｅｓ Ｖａｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， （２００６）， １６８（６）： １８６１−１８６８ 北島康雄 皮膚バリア機能とその制御 Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ２２−４，ｐ４２４−４３２，２００７ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｇｈｔ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ＵＶＢ−ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｈａｉｒｌｅｓｓ Ｍｉｃｅ Ｔａｋｕｙａ Ｙａｍａｍｏｔｏ １ ， Ｍａｓｕｍｉ Ｋｕｒａｓａｗａ， Ｔａｋａｏ Ｈａｔｔｏｒｉ， Ｔｅｔｓｕｏ Ｍａｅｄａ， Ｈｉｒｏｙｕｋｉ Ｎａｋａｎｏ， Ｈｉｒｏｙｕｋｉ Ｓａｓａｋｉ，Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ ． ２００８ Ｆｅｂ；３００（２）：６１−８． ｄｏｉ： １０．１００７／ｓ００４０３−００７−０８１７−ｙ． Ｅｐｕｂ ２００７ Ｄｅｃ ７．

したがって、本発明は、抗老化成分のスクリーニング方法を提供することを、課題とする。また、本発明は、抗老化剤、及び抗老化方法を提供することを、さらなる課題とする。

本発明者らは、鋭意研究の結果、皮膚組織、特に表皮層及び真皮層に存在するグルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １：以下、ＧＬＵＴ１と略すこともある）の発現量が、加齢によって減少することを見出した。

したがって、上記課題を解決する、本発明のスクリーニング方法は、皮膚組織における、ＧＬＵＴ１の発現量を指標として、抗老化成分をスクリーニングする、スクリーニング方法である。
本発明により、抗老化成分を、スクリーニングすることができる。

好ましくは、上記ＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分を、前記抗老化成分として選出する。
本発明により、抗老化成分を選出することができる。

好ましくは、上記皮膚組織は、表皮層及び／又は真皮層である。
本発明により、表皮層及び／又は真皮層において有効な抗老化成分を、スクリーニングすることができる。

好ましくは、上記抗老化成分は、上記皮膚組織中のアドバンスド・グリケーション・エンドプロダクツの産生を抑制する成分である。
上記の通り、ＡＧＥｓは、肌の老化の原因のひとつであることが知られている。
本発明によれば、皮膚組織において、アドバンスド・グリケーション・エンドプロダクツの産生を抑制することができる成分を、スクリーニングすることができる。

好ましくは、上記抗老化成分は、上記皮膚組織中のコラーゲン産生を促進する成分である。
上記の通り、加齢と共にコラーゲン産生量が減少することで、肌の老化が進行することが知られている。
本発明によれば、皮膚組織において、コラーゲン産生を促進することができる成分を、スクリーニングすることができる。

また、上記課題を解決する、本発明の抗老化剤は、皮膚組織におけるＧＬＵＴ１の発現量を指標とするスクリーニング方法によりスクリーニングされた抗老化成分を、有効成分として含む。
本発明によれば、抗老化剤を提供することができる。

好ましくは、上記抗老化剤は、アドバンスド・グリケーション・エンドプロダクツの産生を抑制するためのものである。
上記の通り、ＡＧＥｓは老化と密接に関連している。したがって、本発明の抗老化剤は、ＡＧＥｓの産生を抑制する目的で使用するのが好ましい。

好ましくは、上記抗老化剤は、コラーゲンの産生を促進するためのものである。
上記の通り、コラーゲン産生が抑制されると、肌の老化が進むことが知られている。したがって、本発明の抗老化剤は、コラーゲンの産生を促進する目的で使用するのが好ましい。

また、上記課題を解決する、本発明の抗老化方法は、皮膚組織におけるＧＬＵＴ１の発現量を指標とするスクリーニングによりスクリーニングされた抗老化成分を、皮膚組織に適用する、抗老化方法である。
本発明によれば、加齢によって減少した皮膚組織中のＧＬＵＴ１の発現量を増加させ、抗老化することができる。

好ましくは、本発明の抗老化方法は、上記抗老化剤を皮膚に塗布する。
上記抗老化剤は、皮膚組織におけるＧＬＵＴ１発現量を増加させる作用を有するので、皮膚に塗布することにより、高い抗老化効果を得ることができる。

また本発明者らは、皮膚組織におけるＧＬＵＴ１の発現を抑制すると、表皮角化細胞が産生するタンパク質のうち、インボルクリン及びオクルーディンの発現が減少することを見出した。すなわち、表皮角化細胞においてＧＬＵＴ１は、インボルクリン及びオクルーディンの発現に関与していることを明らかにした。
ここで、インボルクリンは、上記の通り、皮膚のバリア機能、肌荒れや肌のきめの細かさに寄与している。
またオクルーディンは、上記の通り、他のタンパク質と共にタイトジャンクションを形成し、表皮では皮膚バリア機能に寄与し、身体の内部ではイオン透過等の制御に寄与している。

そこで、本発明は、インボルクリン又はオクルーディンの発現を促進する成分のスクリーニング方法を提供することを、さらなる課題とする。また、本発明は、インボルクリン又はオクルーディンの発現を促進するための剤、及び、インボルクリン又はオクルーディンの発現を促進するための方法を提供することを、さらなる課題とする。

上記課題を解決する本発明のスクリーニング方法は、皮膚組織におけるＧＬＵＴ１の発現量を指標として、インボルクリン発現促進成分をスクリーニングする、スクリーニング方法である。
本発明によれば、インボルクリンの発現を促進する成分をスクリーニングすることができる。

好ましくは、上記インボルクリン発現促進成分は、皮膚バリア機能向上成分である。
皮膚バリア機能は、乾燥や刺激によって低下することが知られている。また上記の通り、インボルクリンは、皮膚バリア機能に寄与することが知られている。
よって、本発明によれば、インボルクリンの発現を促進し、皮膚バリア機能を向上させる成分をスクリーニングすることができる。

また、上記課題を解決する本発明のインボルクリン発現促進剤は、上記インボルクリン発現促進成分をスクリーニングする方法によりスクリーニングされた成分を、有効成分として配合する。
本発明によれば、インボルクリン発現促進成分を有効成分として配合する剤を提供することができる。

また、上記課題を解決する本発明のインボルクリン発現促進方法は、上記インボルクリン発現促進成分をスクリーニングする方法によりスクリーニングされた成分を、肌に適用する。
好ましくは、本発明のインボルクリン発現促進方法は、上記インボルクリン発現促進剤を肌に塗布する。
本発明によれば、表皮層（特に、角層細胞）におけるインボルクリンの発現を促進することができる。

また、上記課題を解決する本発明のスクリーニング方法は、皮膚組織におけるＧＬＵＴ１の発現量を指標として、オクルーディン発現促進成分をスクリーニングする、スクリーニング方法である。
本発明によれば、オクルーディンの発現を促進する成分をスクリーニングすることができる。

好ましくは、上記オクルーディン発現促進成分は、皮膚バリア機能向上成分である。
上記の通り、オクルーディンは、皮膚バリア機能に寄与することが知られている。
よって、本発明によれば、オクルーディンの発現を促進し、皮膚バリア機能を向上させる成分をスクリーニングすることができる。

また、上記課題を解決する本発明のオクルーディン発現促進剤は、上記オクルーディン発現促進成分をスクリーニングする方法によりスクリーニングされた成分を、有効成分として配合する。
本発明によれば、オクルーディン発現促進成分を有効成分として含む剤を提供することができる。

また、上記課題を解決する本発明のオクルーディン発現促進方法は、上記オクルーディン発現促進成分をスクリーニングする方法によりスクリーニングされた成分を、肌に適用する。
好ましくは、本発明のオクルーディン発現促進方法は、上記オクルーディン発現促進剤を肌に塗布する。
本発明によれば、オクルーディンの発現を促進することができる。

本発明によれば、抗老化成分を、スクリーニングすることができる。
本発明によれば、抗老化剤を得ることができる。
本発明によれば、抗老化方法を提供することができる。

本発明によれば、インボルクリン又はオクルーディンの発現を促進する成分をスクリーニングすることができる。
本発明によれば、インボルクリン又はオクルーディンの発現を促進する剤を得ることができる。
本発明によれば、インボルクリン又はオクルーディンの発現を促進する方法を提供することができる。

本発明によれば、皮膚バリア機能を向上する成分をスクリーニングすることができる。
本発明によれば、皮膚バリア機能を向上する剤を得ることができる。
本発明によれば、皮膚バリア機能を向上する方法を提供することができる。

加齢と共に、皮膚組織においてＧＬＵＴ１の発現量が減少することを示すグラフである。（Ａ）は正常ヒト表皮角化細胞における結果を、（Ｂ）は正常ヒト真皮線維芽細胞における結果をそれぞれ示す。 試験例２において、正常ヒト表皮角化細胞におけるＧＬＵＴ１の発現量を測定した結果を表すグラフである。（Ａ）はユキノシタエキス、（Ｂ）はタイムエキス、（Ｃ）はオトギリソウエキスを使用した実験結果をそれぞれ示す。 試験例３において、正常ヒト真皮線維芽細胞におけるＧＬＵＴ１の発現量を測定した結果を表すグラフである。 正常ヒト表皮層角化細胞のｓｉＲＮＡ法により測定した、ＧＬＵＴ１（ＳＬＣ２Ａ１）遺伝子をノックダウンしていない細胞におけるＧＬＵＴ１のｍＲＮＡ発現量と、ＧＬＵＴ１（ＳＬＣ２Ａ１）遺伝子をノックダウンした細胞におけるＧＬＵＴ１のｍＲＮＡ発現量を比較したグラフである。 ｓｉＲＮＡ法により測定した、ＧＬＵＴ１（ＳＬＣ２Ａ１）遺伝子をノックダウンしていない細胞におけるインボルクリンのｍＲＮＡ発現量と、ＧＬＵＴ１（ＳＬＣ２Ａ１）遺伝子をノックダウンした細胞におけるインボルクリンのｍＲＮＡ発現量を比較したグラフである。 ｓｉＲＮＡ法により測定した、ＧＬＵＴ１（ＳＬＣ２Ａ１）遺伝子をノックダウンしていない細胞におけるオクルーディンのｍＲＮＡ発現量と、ＧＬＵＴ１（ＳＬＣ２Ａ１）遺伝子をノックダウンした細胞におけるオクルーディンのｍＲＮＡ発現量を比較したグラフである。

以下、本発明の好ましい実施形態について説明するが、本発明の技術的範囲は、以下の実施形態に限定されない。

本発明において、「皮膚組織」とは、皮膚を構成する表皮層、真皮層、及び皮下組織を指す。
本発明において、「抗老化」とは、加齢により起こる、肌状態の好ましくない変化（例えばくすみの発生、たるみの発生、肌理の悪化、肌の硬化など）を、加齢する前の状態に近づける、又は、変化を抑制することを指す。
なお、「くすみ」とは、肌が本来持っている透明感や明るさ、つやが失われ、顔全体が本来の肌の色よりも暗く見えることを指す。
「たるみ」とは、皮膚組織の弾力性の低下によって生じる、肌の変形を指す。
「肌理」とは、皮膚の表面の細かい凹凸のことをいい、「肌理の悪化」とは、皮膚表面の凹凸が減少することを指す。
本発明において、「抗老化成分」とは、上記抗老化に効果のある成分のことを指す。

１．スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、ＧＬＵＴ１の発現量を指標として、抗老化成分をスクリーニングする方法である。ここで、スクリーニングとは、抗老化成分又はその候補を探索することを含む。

本発明の好ましい形態では、皮膚組織におけるＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分を、上記抗老化成分として選出する。
本発明者らは、加齢と共に、皮膚組織においてＧＬＵＴ１の発現量が減少することを見出している。
また、後述するように、ＧＬＵＴ１の発現量の減少は、ＡＧＥｓの産生促進や、コラーゲン産生の減少など、肌にとって好ましくない変化を引き起こし、肌の老化を進行させると考えられる。
したがって、本発明により、加齢と共に減少する、皮膚組織におけるＧＬＵＴ１の発現量を増加させることは、抗老化に有効である。

本発明の好ましい形態では、上記皮膚組織は、表皮層及び／又は真皮層である。
表皮層は、皮膚組織のうち、最も外側に存在する層であり、くすみや肌の硬化が発生し、表皮層の状態が悪化すると、最も顕著に見た目の肌状態が悪化する。
また、真皮層では、線維芽細胞がコラーゲン産生を行っており、真皮層の状態が悪化すると、コラーゲン産生が抑制され、肌のたるみにつながる。
したがって、表皮層及び／又は真皮層において、ＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分をスクリーニングすることで、各層の加齢現象を抑制し、抗老化することができる。

本発明において、抗老化成分は、ＡＧＥｓの産生を抑制する成分であってもよい。
皮膚組織においてＧＬＵＴ１の発現量が減少すると、細胞内に糖が取り込まれにくくなる。その結果、細胞外の皮膚組織における糖の量が増加し、表皮層において糖化反応が促進され、ＡＧＥｓの産生が促進されると予想される。
ＡＧＥｓが表皮層において増加すると、肌理の悪化や、くすみの発生、肌の硬化につながるのは、上記の通りである。
したがって、皮膚組織において、ＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分は、ＡＧＥｓの産生を抑制することができ、抗老化に有効である。

本発明において、抗老化成分は、コラーゲン産生を促進する成分であってもよい。
真皮層においてＧＬＵＴ１の発現量が減少すると、コラーゲンを産生する線維芽細胞内に、糖が取り込まれにくくなる（例えば、Ｎ Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， （１９９５） ４４（４） ： ５４３−５４８）。そうすると、真皮層におけるコラーゲンの産生能が低下し、肌のたるみを引き起こすと予想される（例えば、Ｍ Ｃｅｃｈｏｗｓｋａ−Ｐａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， （２００７） ３０５ ： ７９−８５、Ｙ Ｏｇｕｒａ ｅｔ ａｌ．， 生体医工学， （２０１７）， ５５（２）： ９７−１０２）。
したがって、真皮層においてＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分は、コラーゲン産生を促進することができ、抗老化に有効である。

本発明における抗老化成分は、ＡＧＥｓの産生を抑制する効果と、コラーゲンの産生を促進する効果を併せ持つものでもよい。

本発明のスクリーニング方法が被験対象とする物質は、純物質、生物由来の抽出物、又はそれらの混合物等のいずれであってもよい。
生物由来の抽出物が、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。
抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。
具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却した後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。

本発明のスクリーニング方法は、細胞の培養系に被験物質を添加し、細胞におけるＧＬＵＴ１の発現量を測定することを含む。ここで、表皮層における試験では、正常ヒト角化細胞を使用できる。また真皮層における試験では、正常ヒト線維芽細胞を使用できる。
具体的には、被験物質を添加して培養した細胞におけるＧＬＵＴ１の発現量が、被験物質を添加しないで培養した細胞におけるＧＬＵＴ１の発現量と比較して統計的に有意に大きい場合に、前記被験物質は抗老化成分の候補として判定することが可能である。
より具体的には、被験物質を添加しないで培養した細胞におけるＧＬＵＴ１の発現量の１倍より大きい場合に、抗老化成分の候補として選択することが可能である。

ＧＬＵＴ１の発現量は、ｍＲＮＡ測定、免疫組織化学的解析等の常法により測定することができる。
例えば、ＧＬＵＴ１をコードする遺伝子の発現量は、当該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、定量的な検出を行う。
なお、ＧＬＵＴ１をコードする遺伝子配列は、公開されているので、当業者は適宜プライマーを設計することが可能である。
また、抗体についても、市販品が存在するので、これを用いて、細胞における発現量を測定することができる。

本発明は、また、ＧＬＵＴ１の発現量を指標として、皮膚組織におけるインボルクリン発現促進成分をスクリーニングする方法にも関する。
上記皮膚組織は、好ましくは表皮層であり、より好ましくは角層である。
皮膚組織におけるＧＬＵＴ１の発現量が減少すると、皮膚組織におけるインボルクリンの発現量も減少することが、本発明者らによって明らかになった。
よって、ＧＬＵＴ１の発現量を指標とすれば、インボルクリン発現促進成分をスクリーニングすることができる。

上記の通り、インボルクリンは、角層の物理的あるいは化学的な強靭性に寄与するコーニファイドエンベロープを形成するタンパク質のひとつである。
したがって、インボルクリンの発現が促進されると、コーニファイドエンベロープの形成が促進され、角層の強靭性が向上し、肌の防御機能が改善する。肌の防御機能が改善すると、肌状態が改善する。肌の防御機能は、例えば皮膚バリア機能である。
すなわち、インボルクリンの発現が促進されると、肌状態が改善する。
よって、本発明に係るインボルクリン発現促進成分のスクリーニング方法は、好ましくは肌状態改善成分のスクリーニング方法である。具体的には、肌状態改善成分は、皮膚バリア機能向上成分とすることができる。

本発明の好ましい形態では、上記肌状態改善成分が、皮膚バリア機能向上成分である。
本発明によれば、ＧＬＵＴ１の発現量を指標として、皮膚バリア機能を向上させる成分をスクリーニングすることができる。

本発明は、また、ＧＬＵＴ１の発現量を指標として、皮膚組織におけるオクルーディン発現促進成分をスクリーニングする方法にも関する。
上記皮膚組織は、好ましくは表皮である。
皮膚組織におけるＧＬＵＴ１の発現量が減少すると、皮膚組織におけるオクルーディンの発現量も減少することが、本発明者らによって明らかになった。
よって、ＧＬＵＴ１の発現量を指標とすれば、オクルーディン発現促進成分をスクリーニングすることができる。

上記の通り、オクルーディンは、上皮細胞の結合に寄与するタイトジャンクションを形成するタンパク質のひとつである。
したがって、オクルーディンの発現が促進されると、タイトジャンクションの形成が促進され、上皮細胞の結合がより強固になり、肌の防御機能が改善する。肌の防御機能が改善すると、肌状態が改善する。肌の防御機能は、例えば皮膚バリア機能である。
すなわち、オクルーディンの発現が促進されると、肌状態が改善する。
したがって、本発明に係るオクルーディン発現促進成分のスクリーニング方法は、好ましくは肌状態改善成分のスクリーニング方法である。具体的には、肌状態改善成分は、皮膚バリア機能向上成分とすることができる。

本発明の好ましい形態では、上記肌状態改善成分が、皮膚バリア機能向上成分である。
本発明によれば、ＧＬＵＴ１の発現量を指標として、皮膚バリア機能を向上させる成分をスクリーニングすることができる。

インボルクリン発現促進成分をスクリーニングする方法及びオクルーディン発現促進成分をスクリーニングする方法において、被験対象とする物質及びその入手方法、具体的なスクリーニングの手法、並びにインボルクリン及びオクルーディンの発現量の測定方法については、上記の事項を適用することができる。

２．抗老化剤
本発明の抗老化剤は、上記「１．スクリーニング方法」で述べた何れかのスクリーニング方法によってスクリーニングされた、抗老化成分を、有効成分として配合する。
上記の通り、本発明でスクリーニングされた抗老化成分は、ＧＬＵＴ１の発現量を増加させるので、抗老化効果を有する。

好ましくは、上記抗老化剤は、アドバンスド・グリケーション・エンドプロダクツの産生を抑制するためのものである。
上記の通り、皮膚組織中のＡＧＥｓの産生を抑制することは、抗老化に有効である。

好ましくは、上記抗老化剤は、コラーゲンの産生を促進するためのものである。
上記の通り、皮膚組織中のコラーゲンの産生を促進することは、抗老化に有効である。

また好ましくは、上記抗老化剤は、アドバンスド・グリケーション・エンドプロダクツの産生を抑制し、コラーゲンの産生を促進するためのものである。
アドバンスド・グリケーション・エンドプロダクツの産生の抑制と、コラーゲン産生の促進の両方に有効な抗老化剤は、より抗老化に有効である。

本発明の抗老化剤は、製剤化に用いられる任意の成分と適宜組み合わせて、経口剤や皮膚外用剤の形態をとることができる。
経口剤とする場合、上記抗老化成分を、有効成分として含む食品用組成物の形態とすることが好ましい。具体的には、一般食品、錠剤、顆粒剤、ドリンク剤等の剤形を有するサプリメントの形態とすることが好ましい。

経口剤における、上記抗老化成分の含有量は、剤形に応じて、１回あたりの摂取量が抽出物の乾燥質量として、通常、０．１ｍｇ以上、好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上である。
また、通常、２０００ｍｇ以下、好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。
上記範囲とすることで、効果的にＧＬＵＴ１の発現量を増加させることができる。

皮膚外用剤とする場合、例えば化粧料、医薬部外品、皮膚外用医薬等の形態を例示することができる。また、それらの剤形は特に限定されない。
例えば、化粧料とする場合には、化粧水、美容液、乳液、クリーム、ジェル、サンケア品等の形態が好ましい。

皮膚外用剤における、上記抗老化成分の含有量（抽出物の場合は乾燥重量）は、通常、０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。
また、通常８０質量％以下、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下である。
上記範囲とすることで、効果的にＧＬＵＴ１の発現量を増加させることができる。

上記抗老化成分を、化粧料に配合する場合、抗老化効果を損ねない範囲で、美白成分、しわ改善成分、抗炎症成分、動植物由来の抽出物、有効成分以外に通常化粧料で使用される成分を、任意成分として配合してもよい。
これらの任意成分は、市販されているものを入手して配合してもよく、公知の方法で合成したものを配合してもよい。

美白成分としては、一般的に化粧料で用いられている成分を、特に制限なく使用することができる。ただし、ＧＬＵＴ１の発現促進以外のメカニズムで美白効果を有する成分を用いることが、各成分の作用効果を存分に生かす観点から好ましい。
例えば、４−ｎ−ブチルレゾルシノール、アスコルビン酸グルコシド、３−О−エチルアスコルビン酸、トラネキサム酸、アルブチン、１−トリフェニルメチルピペリジン、１−トリフェニルメチルピロリジン、２−（トリフェニルメチルオキシ）エタノール、２−（トリフェニルメチルアミノ）エタノール、２−（トリフェニルメチルオキシ）エチルアミン、トリフェニルメチルアミン、トリフェニルメタノール、トリフェニルメタン及びアミノジフェニルメタン、Ｎ−（ｏ−トルオイル）システイン酸、Ｎ−（ｍ−トルオイル）システイン酸、Ｎ−（ｐ−トルイル）システイン酸、Ｎ−（ｐ−メトキシベンゾイル）システイン酸、Ｎ−ベンゾイル−セリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−エチルベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−メトキシベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−フルオロベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−トリフルオロメチルベンゾイル）セリン、Ｎ−（２−ナフトイル）セリン、Ｎ−（４−フェニルベンゾイル）セリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）セリン メチルエステル、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）セリン エチルエステル、Ｎ−（２−ナフトイル）セリン メチルエステル、Ｎ−ベンゾイル−Ｏ−メチルセリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）−Ｏ−メチルセリン、Ｎ−（ｐ−メチルベンゾイル）−Ｏ−アセチルセリン、Ｎ−（２−ナフトイル）−Ｏ−メチルセリン等が挙げられる。

化粧料における美白成分の含有量は、通常０．０００１〜３０質量％であり、０．００１〜１０質量％が好ましく、０．０１〜５質量％がより好ましい（抽出物の場合は乾燥質量）。

しわ改善成分としては、一般的に化粧料で用いられている成分を、特に制限なく使用することができる。ただし、ＧＬＵＴ１の発現促進以外のメカニズムでしわ改善効果を有する成分を用いることが、各成分の作用効果を存分に活かす観点から好ましい。
例えば、ビタミンＡ又はその誘導体としてレチノール、レチナール、レチノイン酸、トレチノイン、イソトレチノイン、レチノイン酸トコフェロール、パルミチン酸レチノール、酢酸レチノールが挙げられる。また、ウルソール酸ベンジルエステル、ウルソール酸リン酸エステル、ベツリン酸ベンジルエステル、ベンジル酸リン酸エステルが挙げられる。

化粧料におけるしわ改善成分の含有量は、通常０．０００１〜３０質量％であり、０．００１〜１０質量％が好ましく、０．０１〜５質量％がより好ましい（抽出物の場合は乾燥質量）。

抗炎症成分としては、例えば、クラリノン、グラブリジン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、パントテニルアルコール等が挙げられ、グリチルリチン酸及びその塩、グリチルレチン酸アルキル及びその塩、並びに、グリチルレチン酸及びその塩が好ましく挙げられる。
化粧料中における抗炎症成分の含有量は、通常０．０１〜３０質量％であり、０．１〜１０質量％が好ましく、１〜５質量％がより好ましい（抽出物の場合は乾燥質量）。

動植物由来の抽出物としては、例えば、アケビエキス、アスナロエキス、アスパラガスエキス、アボガドエキス、アマチャエキス、アーモンドエキス、アルニカエキス、アロニアエキス、アンズエキス、イチョウエキス、ウイキョウエキス、ウドエキス、エゾウコギエキス、エンメイソウエキス、オウバクエキス、オタネニンジンエキス、オドリコソウエキス、カキョクエキス、カッコンエキス、カモミラエキス、カロットエキス、カワラヨモギエキス、カンゾウエキス、キウイエキス、キューカンバーエキス、グアバエキス、クチナシエキス、クマザサエキス、クルミエキス、黒米エキス、クロレラエキス、クワエキス、ケイケットウエキス、ゲットウヨウエキス、ゲンチアナエキス、コメエキス、コメ発酵エキス、コメヌカ発酵エキス、コメ胚芽油、サルビアエキス、サボンソウエキス、ササエキス、サンシャエキス、サンショウエキス、シイタケエキス、ジオウエキス、シコンエキス、シソエキス、シナノキエキス、シモツケソウエキス、ショウキョウエキス、ショウブ根エキス、スギナエキス、ステビアエキス、ステビア発酵物、セイヨウノコギリソウエキス、セイヨウハッカエキス、セージエキス、ゼニアオイエキス、センキュウエキス、センブリエキス、ソウハクヒエキス、ダイオウエキス、ダイズエキス、タイソウエキス、タンポポエキス、チョウジエキス、トウガラシエキス、トウキエキス、トウキンセンカエキス、トウニンエキス、トマトエキス、納豆エキス、ニンジンエキス、ニンニクエキス、ハイビスカスエキス、バクモンドウエキス、ハスエキス、パセリエキス、バーチエキス、ハマメリスエキス、ヒキオコシエキス、ヒノキエキス、ビワエキス、フキタンポポエキス、フキノトウエキス、ブクリョウエキス、ヘチマエキス、ペパーミントエキス、ボダイジュエキス、マツエキス、ミズバショウエキス、メリッサエキス、モズクエキス、モモエキス、ヤグルマギクエキス、ユーカリエキス、ユリエキス、ヨクイニンエキス、ヨモギエキス、ラベンダーエキス、リンゴエキス、ルイボス茶エキス、レイシエキス、レタスエキス、レンギョウエキス、レンゲソウエキス、ローズマリーエキス、ローマカミツレエキス、ワレモコウエキス等のエキスが好ましいものとして挙げられる。

化粧料中における前記任意の動植物由来抽出物の含有量（乾燥質量）は、通常０．０１〜３０質量％であり、０．１〜１０質量％が好ましく、０．３〜３質量％がより好ましい。

有効成分以外に通常化粧料で使用される成分としては、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、２，４−ヘキシレングリコール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール等のポリオール、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２−オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック（登録商標）型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類、表面処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、表面処理されていても良い、酸化コバルト、群青、紺青、酸化亜鉛の無機顔料類、表面処理されていても良い、酸化鉄二酸化チタン焼結体等の複合顔料、表面処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類、レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類、ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類、ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩，ビタミンＢ６トリパルミテート，ビタミンＢ６ジオクタノエート，ビタミンＢ２又はその誘導体，ビタミンＢ１２，ビタミンＢ１５又はその誘導体等のビタミンＢ類、α−トコフェロール，β−トコフェロール，γ−トコフェロール，ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類が挙げられる。

本発明はまた、インボルクリン発現促進剤及びオクルーディン発現促進剤にも関する。

本発明のインボルクリン発現促進剤は、上記「１．スクリーニング方法」で述べたインボルクリン発現促進成分のスクリーニング方法によってスクリーニングされた、インボルクリン発現促進成分を、有効成分として配合する。
上記スクリーニング方法でスクリーニングされた成分は、インボルクリンの発現量を増加させる。

好ましくは、上記インボルクリン発現促進剤は、皮膚バリア機能向上剤である。
本発明によれば、皮膚バリア機能向上剤を提供することができる。

本発明のオクルーディン発現促進剤は、上記「１．スクリーニング方法」で述べたオクルーディン発現促進成分のスクリーニング方法によってスクリーニングされた、オクルーディン発現促進成分を、有効成分として配合する。
上記スクリーニング方法でスクリーニングされた成分は、オクルーディンの発現量を増加させる。

好ましくは、上記オクルーディン発現促進剤は、皮膚バリア機能向上剤である。
本発明によれば、皮膚バリア機能向上剤を提供することができる。

インボルクリン発現促進剤及びオクルーディン発現促進剤において、剤型、インボルクリン発現促進成分及びオクルーディン発現促進成分の含有量、並びに、任意成分及びその含有量については、上記の事項を適用することができる。

３．抗老化方法
本発明の抗老化方法は、上記「１．スクリーニング方法」で述べた何れかのスクリーニング方法によりスクリーニングされた、抗老化成分を、皮膚組織に適用する。
ここで、「抗老化成分を、皮膚組織に適用する」とは、本発明の方法でスクリーニングされた抗老化成分が、使用者の皮膚組織においてＧＬＵＴ１発現促進効果を発揮できるようにすることを指す。例えば、肌への塗布や、貼付剤の貼付などが挙げられる。
なお、本発明における抗老化方法は、非治療的方法であり、好ましくは美容方法、さらに好ましくは皮膚の美容方法である。

好ましくは、上記「２．抗老化剤」で述べた何れかの抗老化剤を、皮膚に塗布する。
上記「２．抗老化剤」で述べた抗老化剤は、皮膚組織において、ＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分を含み、高い抗老化効果を有する。
また、皮膚に塗布することにより、抗老化効果を十分に発揮することができる。

本発明は、また、インボルクリン発現促進方法及びオクルーディン発現促進方法にも関する。

本発明のインボルクリン発現促進方法は、上記「１．スクリーニング方法」で述べた何れかのスクリーニング方法によりスクリーニングされた、インボルクリン発現促進成分を、皮膚組織に適用する。

好ましくは、上記「２．抗老化剤」で述べたインボルクリン発現促進剤を、皮膚に塗布する。
上記「２．抗老化剤」で述べたインボルクリン発現促進剤は、皮膚組織において、ＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分を含み、高いインボルクリン発現促進効果を有する。
また、皮膚に塗布することにより、インボルクリン発現促進効果を十分に発揮することができる。

また、本発明のオクルーディン発現促進方法は、上記「１．スクリーニング方法」で述べた何れかのスクリーニング方法によりスクリーニングされた、オクルーディン発現促進成分を、皮膚組織に適用する。

好ましくは、上記「２．抗老化剤」で述べたオクルーディン発現促進剤を、皮膚に塗布する。
上記「２．抗老化剤」で述べたオクルーディン発現促進剤は、皮膚組織において、ＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分を含み、高いオクルーディン発現促進効果を有する。
また、皮膚に塗布することにより、オクルーディン発現促進効果を十分に発揮することができる。

なお、上記インボルクリン発現促進方法及びオクルーディン発現促進方法は、非治療的方法であり、好ましくは美容方法、さらに好ましくは皮膚の美容方法である。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、以下の実施形態に限定されない。

＜試験例１＞皮膚組織におけるＧＬＵＴ１発現量の測定
（Ｉ）表皮層におけるＧＬＵＴ１発現量の測定
ドナー年齢の異なる正常ヒト表皮角化細胞における、ＧＬＵＴ１の発現量を測定した。
（１）ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績株式会社製）を用い、３０代及び５０代のドナーより採取した正常ヒト表皮角化細胞を、４８ウェルプレートに３．０×１０^４個／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で、２４時間培養した。
（２）培養後、培地を除去し、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２培地（倉敷紡績株式会社製）を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で、さらに２４時間培養した。
（３）培養後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のプロトコルに従って、培養した正常ヒト表皮角化細胞の回収、及び、ｍＲＮＡの抽出を行った。
（４）ＧＬＵＴ１のｍＲＮＡ発現量を、リアルタイムｑＰＣＲ法で測定した。また、内在性コントロールであるβ−アクチンのｍＲＮＡ発現量も、同時に測定した。
測定には、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いた。またプライマーは、Ｈｓ＿ＳＬＣ２Ａ１＿１＿ＳＧ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。
（５）各年代のドナー細胞における、ＧＬＵＴ１のｍＲＮＡ発現量を、β−アクチンのｍＲＮＡ発現量で補正した。３０代ドナー細胞におけるＧＬＵＴ１の補正後のｍＲＮＡ発現量を１とした場合の、５０代ドナー細胞におけるＧＬＵＴ１の補正後のｍＲＮＡ発現量を算出した。結果を図１に示す。

（ＩＩ）真皮層におけるＧＬＵＴ１発現量の測定
ドナー年齢の異なる正常ヒト真皮線維芽細胞における、ＧＬＵＴ１の発現量を測定した。
ここで、ドナーは１０代及び５０代である。また、各ドナーより採取した正常ヒト真皮線維芽細胞は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）で、２４ウェルプレートに１．５×１０^５個／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間培養した。培養後、培地を除去し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を加え、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間培養した。培養後は、（Ｉ）（３）以降の手順に従って、ＧＬＵＴ１の発現量を算出した。結果を図１に示す。

図１に示した通り、正常ヒト表皮角化細胞及び正常ヒト真皮線維芽細胞において、加齢と共にＧＬＵＴ１の発現量が減少することが、明らかになった。

＜試験例２＞表皮層においてＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分のスクリーニング
正常ヒト表皮角化細胞において、ＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分をスクリーニングした。
（１）ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績株式会社製）を用い、正常ヒト表皮角化細胞を、２４ウェルプレートに５．０×１０^４個／ウェルになるように播種し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間培養した。
（２）培養後、培地を除去し、被験対象の植物エキス又は溶媒対照を０．５％含むＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２培地（倉敷紡績株式会社製）を加え、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で、２４時間培養した。以下、被験対象の植物エキスを含む培地を加えた細胞を植物エキス添加群、溶媒対照を含む培地を加えた細胞を溶媒対照群とする。
（３）培養後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のプロトコルに従って、培養した正常ヒト表皮角化細胞の回収、及び、ｍＲＮＡの抽出を行った。
（４）ＧＬＵＴ１のｍＲＮＡ発現量を、リアルタイムｑＰＣＲ法で測定した。また、内在性コントロールであるβ−アクチンのｍＲＮＡ発現量も、同時に測定した。
測定には、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いた。またプライマーは、Ｈｓ＿ＳＬＣ２Ａ１＿１＿ＳＧ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。
（５）植物エキス添加群及び溶媒対照群におけるＧＬＵＴ１のｍＲＮＡ発現量を、β−アクチンのｍＲＮＡ発現量で補正した。溶媒対照群におけるＧＬＵＴ１の補正後のｍＲＮＡ発現量を１とした場合の、植物エキス添加群におけるＧＬＵＴ１の補正後のｍＲＮＡ発現量を算出した。結果を図２に示す。

図２に示すように、ユキノシタエキス、タイムエキス、及びオトギリソウエキスは、正常ヒト表皮角化細胞において、ＧＬＵＴ１の発現量を増加させることがわかった。
以上より、本発明のスクリーニング方法によれば、表皮層においてＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分をスクリーニングすることができることが示された。

＜試験例３＞真皮層においてＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分のスクリーニング
正常ヒト真皮線維芽細胞において、ＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分をスクリーニングした。
（１）１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用い、正常ヒト真皮線維芽細胞を、２４ウェルプレートに７．０×１０^４個／ウェルになるように播種し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間培養した。
（２）培養後、培地を除去し、被験対象の植物エキス又は溶媒対照を０．５％と１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を加え、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で、２４時間培養した。以下、被験対象の植物エキスを含む培地を加えた細胞を植物エキス添加群、溶媒対照を含む培地を加えた細胞を溶媒対照群とする。
以降は、上記＜試験例２＞の（３）以降と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞におけるＧＬＵＴ１の発現量を算出した。結果を図３に示す。

図３に示すように、ローヤルゼリーエキスは、正常ヒト真皮線維芽細胞において、ＧＬＵＴ１の発現量を増加させることがわかった。
以上より、本発明のスクリーニング方法によれば、真皮層においてＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分をスクリーニングすることができることが示された。

試験例２、及び３でスクリーニングされた成分を有効成分として配合することにより、本発明の抗老化剤を得ることができる。
また、本発明の抗老化方法は、例えば、試験例２、及び３でスクリーニングされた成分を有効成分として配合した抗老化剤を、肌に塗布する。

＜試験例４＞ＧＬＵＴ１の発現量と、インボルクリンの発現量及びオクルーディンの発現量の関係
ＧＬＵＴ１の発現量と、インボルクリンの発現量及びオクルーディンの発現量の関係を試験した。

（Ｉ）細胞の培養
細胞はヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ）とヒト角化細胞（ＮＨＥＫ）を用いた。それぞれの細胞種において若齢ドナー由来（１８才及び２８才）及び高齢ドナー由来（５４才）を試験に用いた。
各細胞は、それぞれメーカー推奨方法にて培養を行った。
細胞培養用フラスコ２５０（住友ベークライト ＃ ＭＳ−２１２５０）に播種し、６０−９０％コンフルエントに達した細胞はトリプシン中和液（ＫＵＲＡＢＯ ＃ＨＫ−３２２０）を用い剥離し、継代した。
継代数は、ヒト線維芽細胞については、Ｐ＋２−８、ヒト角化細胞については、Ｐ＋２−５とした。

（ＩＩ）ｓｉＲＮＡの導入によるＧＬＵＴ１発現遺伝子のノックダウン
（１）プレートに細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で、一晩下記表１に示す完全培地にて培養し、７０−９０％コンフルエントにした（Ｎ＝３−４）。なお、２４ウェルプレートにおいては、１ウェルあたり６．０−７．０×１０^４個／５００μＬになるように細胞を播種し、４８ウェルプレートにおいては、１ウェルあたり３．０−３．５×１０^４個／２５０μＬになるように細胞を播種した。表１に、使用細胞と、これを培養する際に使用した培地の組み合わせを示す。

（２）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、各細胞に対応する専用培地（上記表１に記載）に混和し、１〜２：５０の割合で希釈した。
（３）導入するｓｉＲＮＡは、ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ ｐｌｕｓ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）試薬を用い、専用培地及びＰＢＳにて希釈（細胞最終添加濃度２５ｎＭ）し、希釈済みＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔと１：１の割合で混和した。その後、室温で１５分間インキュベートし、ｓｉＲＮＡ複合導入試薬を作成した。
なお、ｓｉＲＮＡは、下記表２に記載のものを使用した。

（４）培養細胞の培地を除去し、培地と等量のＰＢＳで１回洗浄した。
（５）１ウェルあたり２００−４００μＬの専用培地を添加した後、上記（３）で調製したｓｉＲＮＡ複合導入試薬を５０−１００μＬ添加し、プレートを穏やかに揺すり、細胞毒性がないことを顕微鏡下で確認した後に、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で、８−４８時間培養した。

（ＩＩＩ）細胞からのＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成及びｑＰＣＲ
（１）上記（ＩＩ）（５）で培養した培養細胞について、培地を除去した後、除去した培地と等量のＰＢＳで１回洗浄した。氷上にて、１ウェルあたり３５０μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴで懸濁し、細胞懸濁液を回収した。
（２）上記（１）で得た細胞懸濁液はＱＩＡｃｕｂｅ（ＱＩＡＧＥＮ ＃９００１２９３）にてＲＮＡを抽出した。溶出量は、１サンプル当たり３０μＬとした。
（３）ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ ＃１１７５４２５０）を用い、サーマルサイクラー（ＢＩＯ ＲＡＤ ＃Ｔ１００）にて、メーカー推奨プロトコルにてｃＤＮＡを合成した。サンプルＲＮＡ（インボルクリン及びオクルーディンのＲＮＡ）の濃度は２０−５０ｎｇ／２０μＬ、スタンダード用ＲＮＡの濃度は５０−１００ｎｇ／２０μＬ使用した。
（４）リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５）にて、スタンダード法によりｑＰＣＲを行い、β−アクチン、インボルクリン及びオクルーディンのｍＲＮＡ発現量を測定した。各サンプルは、イオン交換水：２．５μＬ、プライマー：０．５μＬ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ：５μＬ，１０−３０倍希釈ｃＤＮＡサンプル又は５−３０倍希釈スタンダードｃＤＮＡサンプル：２μＬで調製した。また、サイクル数は４５−５０とした。
プライマーは、下記表３に示すＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ ＃２４９９００）を用いた。

（５）インボルクリン又はオクルーディンのｍＲＮＡの発現量を、β−アクチンのｍＲＮＡの発現量で除算した。
上記測定は３回行い、３回の平均値を算出した。
結果を表４及び図４〜６に示す。

表４及び図４に示されるように、何れの遺伝子もノックダウンしてない群（ｓｉＲＮＡとしてｓｉ ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇを使用した群）と比較して、ＧＬＵＴ１（ＳＬＣ２Ａ１）遺伝子をノックダウンした群（ｓｉＲＮＡとしてｓｉ ＧＬＵＴ１を使用した群）においては、ＧＬＵＴ１のｍＲＮＡの発現量が減少していた。
そして、ＧＬＵＴ１（ＳＬＣ２Ａ１）遺伝子をノックダウンした群においては、インボルクリンのｍＲＮＡの発現量及びオクルーディンのｍＲＮＡの発現量が、ノックダウンしていない群と比較して、減少していた（表４、図５及び図６）。
以上より、皮膚組織において、ＧＬＵＴ１の発現量が減少すると、インボルクリンの発現量及びオクルーディンの発現量が減少することが、明らかになった。

上記結果から、ＧＬＵＴ１の発現量を指標として、インボルクリン又はオクルーディンの発現を促進する成分をスクリーニングすることができることが、明らかになった。
具体的には、上記試験例２、及び試験例３の方法で試験した場合に、ＧＬＵＴ１の発現を促進する成分を、インボルクリンの発現を促進する成分（インボルクリン発現促進成分）として、決定することができる。
また、本発明のインボルクリン発現促進方法は、例えば、試験例２、及び３でスクリーニングされた成分を有効成分として配合したインボルクリン発現促進剤を、肌に塗布する。

また、上記試験例２、及び試験例３の方法で試験した場合に、ＧＬＵＴ１の発現を促進する成分を、オクルーディンの発現を促進する成分（オクルーディン発現促進成分）として、決定することができる。
また、本発明のオクルーディン発現促進方法は、例えば、試験例２、及び３でスクリーニングされた成分を有効成分として配合したオクルーディン発現促進剤を、肌に塗布する。

本発明は、皮膚組織においてＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分をスクリーニングすることができる。
また、皮膚組織においてＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分を有効成分として含む抗老化剤、及び、該抗老化剤を使用する抗老化方法を提供することができる。

また本発明は、皮膚組織においてインボルクリン又はオクルーディンの発現量を増加させる成分をスクリーニングすることができる。
また、皮膚組織においてインボルクリンの発現量を増加させる成分を有効成分として含む、インボルクリン発現促進剤、及び、該インボルクリン発現促進剤を使用するインボルクリン発現促進方法を提供することができる。
また、皮膚組織においてオクルーディンの発現量を増加させる成分を有効成分として含む、オクルーディン発現促進剤、及び、該オクルーディン発現促進剤を使用するオクルーディン発現促進方法を提供することができる。

Claims (22)

1. 皮膚組織におけるＧＬＵＴ１の発現量を指標として、抗老化成分をスクリーニングする、スクリーニング方法。
2. 前記ＧＬＵＴ１の発現量を増加させる成分を、前記抗老化成分として選出することを特徴とする、請求項１に記載のスクリーニング方法。
3. 前記皮膚組織が、表皮層及び／又は真皮層であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
4. 前記抗老化成分が、前記皮膚組織中のアドバンスド・グリケーション・エンドプロダクツの産生を抑制する成分であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
5. 前記抗老化成分が、前記皮膚組織中のコラーゲン産生を促進する成分であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
6. 請求項１〜５の何れか一項に記載のスクリーニング方法によりスクリーニングされた抗老化成分を、有効成分として配合する、抗老化剤。
7. 請求項４に記載のスクリーニング方法によりスクリーニングされた抗老化成分を、有効成分として配合する、アドバンスド・グリケーション・エンドプロダクツの産生を抑制するための、請求項６に記載の抗老化剤。
8. 請求項５に記載のスクリーニング方法によりスクリーニングされた抗老化成分を、有効成分として配合する、コラーゲンの産生を促進する、請求項６又は７に記載の抗老化剤。
9. 請求項１〜５の何れか一項に記載のスクリーニング方法によりスクリーニングされた抗老化成分を、皮膚組織に適用する、抗老化方法。
10. 請求項６〜８の何れか一項に記載の抗老化剤を、皮膚に塗布することを特徴とする、請求項９に記載の抗老化方法。
11. 皮膚組織におけるＧＬＵＴ１の発現量を指標として、インボルクリン発現促進成分をスクリーニングする、スクリーニング方法。
12. 前記インボルクリン発現促進成分が、肌状態改善成分である、請求項１１に記載のスクリーニング方法。
13. 前記肌状態改善成分が、皮膚バリア機能向上成分である、請求項１１又は１２に記載のスクリーニング方法。
14. 請求項１１〜１３の何れか一項に記載のスクリーニング方法によりスクリーニングされた成分を有効成分として配合する、インボルクリン発現促進剤。
15. 請求項１１〜１４の何れか一項に記載のスクリーニング方法によりスクリーニングされた成分を、皮膚組織に適用する、インボルクリン発現促進方法。
16. 請求項１４に記載のインボルクリン発現促進剤を、皮膚に塗布することを特徴とする、請求項１４に記載のインボルクリン発現促進方法。
17. 皮膚組織におけるＧＬＵＴ１の発現量を指標として、オクルーディン発現促進成分をスクリーニングする、スクリーニング方法。
18. 前記オクルーディン発現促進成分が、肌状態改善成分である、請求項１７に記載のスクリーニング方法。
19. 前記肌状態改善成分が、皮膚バリア機能向上成分である、請求項１７又は１８に記載のスクリーニング方法。
20. 請求項１７〜１９の何れか一項に記載のスクリーニング方法によりスクリーニングされた成分を、有効成分として配合する、オクルーディン発現促進剤。
21. 請求項１７〜２０の何れか一項に記載のスクリーニング方法によりスクリーニングされた成分を、皮膚組織に適用する、オクルーディン発現促進方法。
22. 請求項２０に記載の抗老化剤を、皮膚に塗布することを特徴とする、請求項１９に記載のオクルーディン発現方法。

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