JP2021091646A - 癌治療用細胞組成物を製造する方法、それにより製造される癌治療用細胞組成物、及び癌治療用細胞組成物を用いた癌の治療方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)樹状細胞前駆細胞を、GM−CSF及びIL−4を含む培地中で、72〜144時間培養する工程;
(2)前記工程(1)で得られる細胞を、GM−CSF、TNF−α及びキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を含む培地中で、6時間〜48時間培養する工程;
(3)前記工程(2)に、ピシバニールを添加し、さらに3時間〜36時間培養する工程;及び、
(4)前記工程(3)で得られる細胞を、腫瘍関連抗原の存在下で、30分〜240分間インキュベートして、成熟樹状細胞を誘導する工程、
を含む、方法。
[2] 前記工程(3)において、プロスタグランジンE2をさらに添加する、[1]に記載の方法。
(1)樹状細胞前駆細胞を、GM−CSF及びIL−4を含む培地中で、72〜144時間培養する工程;
(2)前記工程(1)で得られる細胞を、GM−CSF、TNF−α及びキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を含む培地中で、6時間〜48時間培養する工程;
(3)前記工程(2)に、ピシバニールを添加し、さらに3時間〜36時間培養する工程;
(4)前記工程(3)で得られる細胞を、腫瘍関連抗原の存在下で、30分〜240分間インキュベートして、成熟樹状細胞を誘導する工程;及び、
(5)前記工程(4)で得られる前記成熟樹状細胞と、リンパ球と、を含む第1細胞群を、IL−2、IL−12、IL−7及びIL−15からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
を含む、方法。
[4] 前記工程(3)において、プロスタグランジンE2をさらに添加する、[3]に記載の方法。
[5] 前記工程(5)が、
(5−1)前記工程(4)で得られる前記成熟樹状細胞と、リンパ球と、を含む第1細胞群を、IL−2及びIL−12を含む培地中で、6〜36時間培養する工程;及び
(5−2)前記工程(5−1)で得られる前記第1細胞群を、IL−2、IL−12、IL−7及びIL−15を含む培地中で、12〜168時間培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
である、[3]又は[4]に記載の方法。
[6] (6)前記工程(5)により得られる前記第1細胞群と、前記工程(4)で得られる前記成熟樹状細胞と、を含む第2細胞群を、IL−2、IL−12、IL−7及びIL−15からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
をさらに含む、[3]〜[5]のいずれか1項に記載の方法。
[7] (7)前記工程(6)により得られる前記第2細胞群と、前記工程(4)で得られる前記成熟樹状細胞と、を含む第3細胞群を、IL−2、IL−12、IL−7及びIL−15からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
をさらに含む、[6]に記載の方法。
[8] 培養することが、刺激応答性培養基材を用いて実施される、[1]〜[7]のいずれか1項に記載の方法。
[10] 前記工程(4)で得られる成熟樹状細胞と併用される、[3]〜[7]のいずれか1項に記載の方法により得られる、癌治療用細胞組成物。
[11] 抗癌剤と併用される、[9]又は[10]に記載の癌治療用細胞組成物。
癌の治療又は予防を必要とする対象に、前記癌治療用細胞組成物を投与する工程、
を含む方法。
[13] 前記投与する工程が、2回以上実施される、[12]に記載の方法。
[14] 前記投与する工程が、前記癌治療用細胞組成物を、前記対象のリンパ節に直接投与する工程である、[12]又は[13]に記載の方法。
[15] 前記対象が、抗癌剤が投与された、放射線療法、及び/又は手術に供された対象である、[12]〜[14]のいずれか1項に記載の方法。
一実施態様において、本発明は、成熟樹状細胞を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法であって、
(1)樹状細胞前駆細胞を、GM−CSF及びIL−4を含む培地中で、72〜144時間培養する工程;
(2)前記工程(1)で得られる細胞を、GM−CSF、TNF−α及びキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を含む培地中で、6時間〜48時間培養する工程;
(3)前記工程(2)に、ピシバニールを添加し、さらに3時間〜36時間培養する工程;及び、
(4)前記工程(3)で得られる細胞を、腫瘍関連抗原の存在下で、30分〜240分間、インキュベートして、成熟樹状細胞を誘導する工程、
を含む、方法を提供する。
一実施態様において、本発明は、成熟樹状細胞を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法であって、
(1)樹状細胞前駆細胞を、GM−CSF及びIL−4を含む培地中で、72〜144時間培養する工程;
(2)前記工程(1)で得られる細胞を、GM−CSF、TNF−α及びキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を含む培地中で、6時間〜48時間培養する工程;
(3)前記工程(2)に、ピシバニールを添加し、さらに3時間〜36時間培養する工程;
(4)前記工程(3)で得られる細胞を、腫瘍関連抗原の存在下で、30分〜240分間インキュベートして、成熟樹状細胞を誘導する工程;及び、
(5)前記工程(4)で得られる前記成熟樹状細胞と、リンパ球と、を含む第1細胞群を、IL−2、IL−12、IL−7及びIL−15からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
を含む、方法を提供する。
(5−1)前記工程(4)で得られる前記成熟樹状細胞と、リンパ球と、を含む第1細胞群を、IL−2及びIL−12を含む培地中で、6〜36時間、好ましくは12時間〜30時間(例えば、約24時間)培養する工程;及び
(5−2)前記工程(5−1)で得られる前記第1細胞群を、IL−2、IL−12、IL−7及びIL−15を含む培地中で、12〜168時間、好ましくは24時間〜108時間(例えば、約96時間)培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
である。
(6)前記工程(5)により得られる前記第1細胞群と、前記工程(4)で得られる前記成熟樹状細胞と、を含む第2細胞群を、IL−2、IL−12、IL−7及びIL−15からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
をさらに含んでもよい。
(7)前記工程(6)により得られる前記第2細胞群と、前記工程(4)で得られる前記成熟樹状細胞と、を含む第3細胞群を、IL−2、IL−12、IL−7及びIL−15からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
をさらに含んでもよい。
上記の成熟樹状細胞を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法」及び「樹状細胞誘導キラーリンパ球を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法」によって、癌治療用細胞組成物が得られる。本発明の癌治療用細胞組成物は、例えば、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤、免疫促進剤、及びアジュバント剤等の医薬上許容される担体又は溶媒などを含むことができる。
一実施態様において、本発明は、癌治療用細胞組成物を用いた、癌の治療方法であって、
癌の治療又は予防を必要とする対象に、前記癌治療用細胞組成物を投与する工程、
を含む方法を提供する。
1.細胞の調製
[1日目]
(1)各被験体より採取された末梢血単核球を、X−VIVO(商標)15(Lonza、MD、USA)に懸濁し、T−175フラスコまたはT175フラスコ型UpCell(登録商標)(セルシード、日本)に入れた。
(3)インキュベータよりT−175フラスコを取り出し、タッピング及びピペッティングにて、非接着細胞(リンパ球)を回収し、1〜5×107個/mlになるようにケーエムバンカーII(コスモバイオ、日本)に加え懸濁し、クライオンチューブに分注し−80℃以下に冷凍保存した。
・1000IU/ml GM−CSF(Bayer HealthCare、Germany);及び
・1000IU/ml IL−4(CellGenix、Germany)
を含むDC培養用培地(CellGro(登録商標)DC;CellGenix、Germany)を加えた。
(6)以下:
・1000IU/ml GM−CSF(Bayer HealthCare、Germany)
・50ng/μl TNF−α(CellGenix、Germany);及び
・25μg/ml Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH)(Merck Milliopore Darmstadt、Germany)、
を含むDC培養用培地(CellGro(登録商標)DC;CellGenix、Germany)を、前記T−175フラスコに加えた。
(8)各T−175培養フラスコにピシバニール(OK432、中外製薬、日本)を0.1KE/mlずつ加えた。
(9)37℃ 5%CO2インキュベータにて、6時間〜翌朝まで培養した。
(10)前記T−175培養フラスコから接着細胞を回収した。
(12)細胞浮遊液を100μmセルストレーナーでろ過し、遠心した(300g、4℃、5分)。
(13)225mlコニカルチューブにCellGro(登録商標)DCを加えて懸濁した。
・HLA−A*24:02陽性被験体用:
HLA−A*24:02拘束性RNF43ペプチド(RNF43−A24−9−721、アミノ酸配列:NSQPVWLCL)
・HLA−A*02:01陽性被験体用:
HLA−A*02:01拘束性RNF43ペプチド(RNF43−A02−10−11、アミノ酸配列:ALWPWLLMAT)
[7〜8日目]
(16−2)以下を混合した培地を調製した:
・X−VIVO(商標)10(Lonza、MD、USA) 19ml;
・自己血清 1ml;
・IL−2(100IU/μl)(Novartis、Switzerland)20μl;及び
・IL−12(500pg/μl)(R&D Systems、Minneapolis、USA) 16μl
上記の1日目に保存したリンパ球(非接着細胞)を融解して洗浄し、1×108個のリンパ球と、5×106個の腫瘍抗原パルス樹状細胞(上記の(15)により得られた細胞)を、上記で調製した培地20mLとともにT75フラスコに加え、37℃、5%CO2インキュベータにて培養した。
(17)以下:
・X−VIVO(商標)10 19ml;
・自己血清 1ml;
・IL−2(100IU/μl) 40μl;
・IL−12(500pg/μl) 16μl;
・IL−7(50ng/μl)(R&D Systems、Minneapolis、USA) 20μl;及び
・IL−15(50ng/μl)(Thermo Fisher Scientific、MA、USA) 20μl
を(19)のT75培養フラスコにさらに加え、37℃、5%CO2インキュベータにて培養した。
(18)前記T75培養フラスコから、細胞懸濁液40mlを50mlコニカルチューブに回収し、遠心(300×g、4℃、5分)行った。上清を除去し、以下の組成を含む培地:
・X−VIVO(商標)10 19ml
・自己血清 1ml
・IL−2(100IU/μl) 40μl
・IL−12(500pg/μl) 16μl
・IL−7(50ng/μl) 10μl
・IL−15(50ng/μl) 10μl
を加えて懸濁し、元のT75フラスコに戻しインキュベータにて培養した。
(19)前記T−75培養フラスコをよくタッピング及びピペッティングした後、細胞懸濁液を50mlコニカルチューブに回収した。X−VIVO(商標)10 10mlで先のT75培養フラスコをリンスして先のコニカルチューブに回収した。遠心し(300×g、4℃、5分)上清を捨てた。
(20−1)生理食塩水30mlに懸濁し遠心した(300×g、4℃、5分)。これを2回繰り返した。2mLの自己血清を添加した100mLの生理食塩水ボトル(2%自己血清/生理食塩水)を作製した。作製した2%自己血清/生理食塩水 20mLで上記ペレットを懸濁し、100μmセルストレーナーでろ過した。ろ過した細胞浮遊液を先の生理食塩水100mlボトルに入れて投与用DAKを調製した。
(20−2)(19)のペレットを、X−VIVO10 10mlで懸濁し、新しいT75フラスコに加えた。凍結保存したDC(上記(18−1))5×106個を37℃のCellGro(登録商標)DC 9mlまたはX−VIVO(商標)10 9ml+自己血清1mlに融解し、遠心した(120×g、20℃、10分)。上清を捨て、X−VIVO(商標)10 20mlで懸濁し、再度遠心した(120×g、20℃、10分)。上清を捨て、X−VIVO(商標)10で2〜5×106個/2〜5mlに調整し、先のT75フラスコに加えX−VIVO(商標)10を全体量20mlになるように加えた(可能であれば、リンパ球数は0.8〜1.2×108個が望ましい。)。
(22)X−VIVO(商標)10 47.5ml+自己血清2.5ml+IL−2(100IU/μl)80μl+IL−12(500pg/μl)32μl+IL−7(50ng/μl)20μl+IL−15(50ng/μl)20μlを作製した。前記T−75培養フラスコをよくタッピング及びピペッティングした後、細胞を新しいT−175フラスコに移した。先のT−75培養フラスコを先の培地10mlで洗浄後、前記新しいT−175フラスコに加えた。この作業をもう一回繰り返した。残り30mlの培地を加え、37℃、5%CO2インキュベータにて培養した。
(23)前記のT−175培養フラスコから細胞混濁液50ml(できるだけ上清)を50mlコニカルチューブに回収し、遠心した(300×g、4℃、5分)。上清を捨てX−VIVO(商標)10 28.5ml+自己血清1.5ml+IL−2(100IU/μl)60μl+IL−12(500pg/μl)24μl+IL−7(50ng/μl)15μl+IL−15(50ng/μl)15μlを加えて懸濁し、元のT−175培養フラスコに戻し、37℃、5%CO2インキュベータにて培養した。
(24)前記T−175培養フラスコをよくタッピング及びピペッティングした後、細胞懸濁液を50mlコニカルチューブに回収した。X−VIVO(商標)10 20mlで先のT175培養フラスコをリンスして、先のコニカルチューブに回収し、遠心して(300×g、4℃、5分)、上清を捨てた。
(25−1)生理食塩水30mlに懸濁し遠心した(300×g、4℃、5分)。これを2回繰り返した。作製した2%自己血清/生理食塩水 20mLで上記ペレットを懸濁し、100μmセルストレーナーでろ過した。ろ過した細胞浮遊液を先の生理食塩水100mlボトルに入れて投与用DAKを調製した。
(25−2)(24)のペレットを、X−VIVO(商標)10 10mlで懸濁し、新しいT75フラスコ2個に分注した(可能であれば、リンパ球数は0.8〜1.2×108個/フラスコが望ましい。)。凍結保存したDC(上記(18−1))5×106個2本それぞれを、37℃のCellGro(登録商標)DC 9mlまたはX−VIVO(商標)10 9ml+自己血清1mlに融解し、遠心した(120×g、20℃、10分)。上清を捨て、X−VIVO(商標)10 20mlでそれぞれ懸濁し、再度遠心した(120×g、20℃、10分)。上清を捨て、X−VIVO(商標)10で2〜5×106個/2〜5mlに調整し、先のT75フラスコに加えX−VIVO(商標)10を全体量20mlになるように加えた。
DAKの継代
(27)T−75フラスコの細胞懸濁液を各々T−175フラスコに移しX−VIVO10 47.5ml+自己血清2.5ml+IL−2(100IU/μl)80μl+IL−12(500pg/μl)32μl+IL−7(50ng/μl)20μl+IL−15(50ng/μl)20μlを加えた。
(28)前記の2つのT−175培養フラスコから細胞懸濁液40mlを50mlコニカルチューブに回収し、遠心した(300×g、4℃、5分)。培地X−VIVO(商標)10 38ml+自己血清2ml+IL−2(100IU/μl)80μl+IL−12(500pg/μl)32μl+IL−7(50ng/μl)20μl+IL−15(50ng/μl)20μlで懸濁し、元のT−175培養フラスコに戻した。
(29)前記2つのT−175培養フラスコをよくタッピング及びピペッティングした後、細胞懸濁液を6つの50mlコニカルチューブに回収した。X−VIVO(商標)10 20mlで先のT175培養フラスコをリンスして先のコニカルチューブに回収した。遠心し(300×g、4℃、5分)、上清を捨て、生理食塩水30mlでペレットを懸濁し、6本分の細胞を2本にまとめて遠心し(300×g、4℃、5分)、上清を捨てた。再度生理食塩水30mlで懸濁し、遠心し(300×g、4℃、5分)、上清を捨てた。
(30)2mLの自己血清を添加した100mLの生理食塩水ボトル(2%自己血清/生理食塩水)を作製した。作製した2%自己血清/生理食塩水 20mLで上記ペレットを懸濁し、100μmセルストレーナーでろ過した。ろ過した細胞浮遊液を先の生理食塩水100mlボトルに入れて投与用DAKを調製した。
上記1の(16−1)で得られた成熟樹状細胞の細胞表面分子の発現について、Hijikata Y.ら(PLoS One.2018 Jan 2;13(1):e0187878)に記載のフローサイトメーターを用いた方法によって解析した。
上記1の方法によって、10例の癌患者(直腸結腸癌、肺小細胞癌、食道癌、子宮頸癌)のそれぞれから得た末梢血単核球より作製した成熟DC及びDAKを、図5のスケジュールに沿って投与した。具体的には、以下のスケジュールで実施した。
(1)Day1:低用量のシクロフォスファミド(300mg/m2)を投与
(2)Day6:DAKを静脈内投与
(3)Day6、13、20:成熟DC 1×107個を皮下投与
1.細胞の調製
以下に記載の手順以外は、基本的には実施例1と同様の手順を実施した。
(8)各T−175培養フラスコにピシバニール(OK432、中外製薬、日本)を2ml(0.1KE/ml)加え、さらにプロスタグランジンE2(PGE2、ナカライテスク、日本)を終濃度1μg/mLとなるように添加した。
(9)37℃ 5%CO2インキュベータにて、3時間〜24時間培養した。
実施例1の方法で作製された成熟DCは、遊走能を示す表面マーカーCCR7の発現が低い(図7及び8)。一般的な成熟DCの投与ルートである皮下接種では所属リンパ節に移動できるDCが、わずか数%程度しかなく非効率的である。そのためアフェレーシスで大量の成分採血を行ってDC細胞数を極端に増やして(平均1×107個)投与し、所属リンパ節にたどり着けるDC数を補う方法がとられる。
2).表在リンパ節が小さく穿刺注入できない患者にはPGE2を添加して遊走能を高め、DCを皮下接種し所属リンパ節に移動できるようにする。
患者腫瘍組織からDNA、RNAを抽出し次世代シーケンサによる解析(Whole exome sequencingとRNA sequencing)で変異タンパク質の同定とHLAタイピングを行う。
Claims (15)
- 成熟樹状細胞を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法であって、
(1)樹状細胞前駆細胞を、GM−CSF及びIL−4を含む培地中で、72〜144時間培養する工程;
(2)前記工程(1)で得られる細胞を、GM−CSF、TNF−α及びキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を含む培地中で、6時間〜48時間培養する工程;
(3)前記工程(2)に、ピシバニールを添加し、さらに3時間〜36時間培養する工程;及び、
(4)前記工程(3)で得られる細胞を、腫瘍関連抗原の存在下で、30分〜240分間インキュベートして、成熟樹状細胞を誘導する工程、
を含む、方法。 - 前記工程(3)において、プロスタグランジンE2をさらに添加する、請求項1に記載の方法。
- 樹状細胞誘導キラーリンパ球を含む、癌治療用細胞組成物を製造する方法であって、
(1)樹状細胞前駆細胞を、GM−CSF及びIL−4を含む培地中で、72〜144時間培養する工程;
(2)前記工程(1)で得られる細胞を、GM−CSF、TNF−α及びキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を含む培地中で、6時間〜48時間培養する工程;
(3)前記工程(2)に、ピシバニールを添加し、さらに3時間〜36時間培養する工程;
(4)前記工程(3)で得られる細胞を、腫瘍関連抗原の存在下で、30分〜240分間インキュベートして、成熟樹状細胞を誘導する工程;及び、
(5)前記工程(4)で得られる前記成熟樹状細胞と、リンパ球と、を含む第1細胞群を、IL−2、IL−12、IL−7及びIL−15からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
を含む、方法。 - 前記工程(3)において、プロスタグランジンE2をさらに添加する、請求項3に記載の方法。
- 前記工程(5)が、
(5−1)前記工程(4)で得られる前記成熟樹状細胞と、リンパ球と、を含む第1細胞群を、IL−2及びIL−12を含む培地中で、6〜36時間培養する工程;及び
(5−2)前記工程(5−1)で得られる前記第1細胞群を、IL−2、IL−12、IL−7及びIL−15を含む培地中で、12〜168時間培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
である、請求項3又は4に記載の方法。 - (6)前記工程(5)により得られる前記第1細胞群と、前記工程(4)で得られる前記成熟樹状細胞と、を含む第2細胞群を、IL−2、IL−12、IL−7及びIL−15からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
をさらに含む、請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。 - (7)前記工程(6)により得られる前記第2細胞群と、前記工程(4)で得られる前記成熟樹状細胞と、を含む第3細胞群を、IL−2、IL−12、IL−7及びIL−15からなる群から選択されるサイトカインを含む培地中で培養し、樹状細胞誘導キラーリンパ球を誘導する工程、
をさらに含む、請求項6に記載の方法。 - 培養することが、刺激応答性培養基材を用いて実施される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法により得られる、癌治療用細胞組成物。
- 前記工程(4)で得られる成熟樹状細胞と併用される、請求項3〜7のいずれか1項に記載の方法により得られる、癌治療用細胞組成物。
- 抗癌剤と併用される、請求項9又は10に記載の癌治療用細胞組成物。
- 請求項9又は10に記載の癌治療用細胞組成物を用いた、癌の治療方法であって、
癌の治療又は予防を必要とする対象に、前記癌治療用細胞組成物を投与する工程、
を含む方法。 - 前記投与する工程が、2回以上実施される、請求項12に記載の方法。
- 前記投与する工程が、前記癌治療用細胞組成物を、前記対象のリンパ節に直接投与する工程である、請求項12又は13に記載の方法。
- 前記対象が、抗癌剤が投与された、放射線療法、及び/又は手術に供された対象である、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
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